JPH04360682A

JPH04360682A - 細胞培養用担体

Info

Publication number: JPH04360682A
Application number: JP3134758A
Authority: JP
Inventors: Mitsuyuki Katsu; 進勝圓; Takumi Ikeda; 巧池田; Ryohei Yamamoto; 良平山本; Toyokazu Nishino; 豊和西野
Original assignee: Kurabo Industries Ltd; Kurashiki Spinning Co Ltd
Current assignee: Kurabo Industries Ltd; Kurashiki Spinning Co Ltd
Priority date: 1991-06-06
Filing date: 1991-06-06
Publication date: 1992-12-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、細胞培養用担体、特
に、マイクロキャリアー法による接着性細胞の大量培養
に好適な担体に関する。

【０００２】

【従来の技術】培養細胞は、細胞が産生する有用な生理
活性物質（例えば、抗体ホルモン、酵素、核酸等）の生
産手段として有用であるが、該生理活性物質を大量生産
するためには、大量に細胞を培養しなければならない。この場合、浮遊性細胞は培地中に懸濁した状態で増殖す
るので、比較的容易に大量培養をおこなうことが可能で
あるが、接着性細胞は、培養容器の器壁等に付着して単
層で増殖するために、大量培養をおこなうためには培養
系の表面積を大きくする必要があり、従来から種々の方
法が提案されている。

【０００３】この種の方法としては、スパイラルフィル
ム法、マルチプレート法、ホロファイバー法およびマイ
クロキャリアー法等が例示されるが、なかでも、マイク
ロキャリアー法、即ち、培養容器中に、細胞が付着可能
な粒径１００μｍ以上のビーズを多量に浮遊させ、培養
液と共に穏やかに撹拌して細胞を浮遊培養する方法は、
培養容積に対する表面積が大きく、接着性細胞の大量培
養法とし好適な方法とされている。

【０００４】このマイクロキャリアー法においては、粒
状担体に対する細胞の接着を容易にして増殖を効果的に
おこなうために、該担体表面を高分子材料、特に蛋白質
を用いる被覆することが通常おこなわれている。この目
的のために、従来から使用されている蛋白質は、コラー
ゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ラミニン、レク
チン、フィブリン、フィブリノーゲンおよびトロンボス
ポンジン等である。

【０００５】しかしながら、従来から使用されているこ
れらの蛋白質には、一般に、精製分離に複雑な操作や特
殊な装置および高価な試薬等を必要とするために、最終
製品をコスト高にするだけでなく、洗浄や滅菌処理等の
加熱処理に対する耐熱性に欠ける等の難点がある。

【０００６】例えば、コラーゲンを細胞培養用にまで精
製するには、かなりの段階を必要とするばかりでなく、
精製度も十分であるとは言えず、コラーゲン中の不純物
が細胞の産生する生理活性物質に対するコンタミネーシ
ョンの原因となっている。また細胞が産生する酵素はコ
ラーゲンを分解するものが数多くあり、これもコンタミ
ネーションの一因となっている。品質面でもロットによ
り不純物の差が大きいなどの問題点がある。また、耐熱
性も悪い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、複雑な操
作や特殊な装置および高価な試薬等を必要とすることな
く、簡易な方法で精製分離できる耐熱性に優れた蛋白質
で被覆した細胞培養用担体を提供するためになされたも
のである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】即ちこの発明は、粒状基
体をケラチンで被覆して成る細胞培養用担体に関する。

【０００９】従来、天然資源からケラチンを工業的規模
で効率よく分離精製する技術は全く知られていなかった
ので、ケラチンはほとんど市販されておらず、また、細
胞培養用担体の被覆剤として利用できる物性まで加工す
ることは困難であった。このため、細胞培養用担体の被
覆剤として種々の蛋白質が用いられていたにもかかわら
ず、ケラチンを被覆剤として用いる技術は当該分野にお
いては全く考慮されていなかった。一方、本件出願人は
先に、複雑な操作や特殊な装置を必要とすることなく、
効率よくケラチンを分離精製し得る獣毛の酸化分解法に
係わる出願をおこなった（特願平２−２４８４５６号参
照）。該調製法によれば、後処理が容易で、有害成分を
ほとんど含有せず、優れた安定性を有するケラチンを工
業的規模で得ることが可能である。

【００１０】従って、本発明においては、上記調製法に
よって得られるケラチンを用いるのが、最も好ましい態
様であるが、被培養細胞の種類やその使用目的等によっ
ては、該調製法に準ずる獣毛の溶解加工法、例えば、蛋
白質分解酵素を用いる酵素法や還元剤を用いる還元法等
によって得られるケラチンを用いてもよい。

【００１１】上記の獣毛の酸化分解法によって得られる
ケラチンはそのまま使用してもよいが、被培養細胞の種
類や使用目的等によっては、さらに、溶媒による分画、
塩析、ｐＨ処理またはクロマトグラフィー等の手段を用
いる分離精製処理に付した後、使用に供してもよい。こ
の場合、目的に応じて、特定の分画成分を分離して使用
してもよい。

【００１２】本発明に使用する粒状基体の材質は特に限
定的ではなく、従来から細胞浮遊培養法においてマイク
ロキャリアーとして用いられているもの、例えば、各種
の合成ポリマー（アクリル系ポリマー、ポリスチレン、
ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リウレタン等）、無機物（ガラス、シリカ、アルミナ等
）、天然ポリマー（アガロース、セルロース等）、等を
適宜利用すればよいが、特に好適なポリマーは、（ｉ）
親水性が大きい、（ｉｉ）十分な機械的強度を有する、
（ｉｉｉ）適度な柔軟性を有する、（ｉｖ）塩濃度の変
化による体積変化がない、（ｖ）水酸基等の活性な反応
基を有するので、粒子表面の多様な化学修飾、例えば、
エポキシ化、アミノ化、ホルミル化またはカルボキシル
化等が可能である、等の点で、特開平１−９８６０６号
公報に開示されているポリマー、即ち、次式（Ｉ）：

【数１】（式中、Ｒは水素原子またはメチル基を示し、ｎは０〜
３０の数を示し、ｍは０〜３０の数を示す（但し、ｎ＋
ｍ≧１））で表わされるトリス（２−メタクリロイルオ
キシエチル）リン酸を重合成分の少なくとも一部として
含むモノマー成分の重合によって得られるポリマーであ
る。

【００１３】本発明に使用する粒状基体の粒径は特に限
定的ではなく、１００μｍ〜５ｍｍの比較的大きいもの
から、１００μｍ以下の小さなものまで、広範囲に選定
可能であるが、培養容器内での高密度で均一な細胞浮遊
培養を可能にするためには、１００μｍ〜２５０μｍに
するのが好ましい。

【００１４】上記の粒状基体にケラチンを被覆する一般
的な方法は浸漬法、即ち、アルカリ金属の水酸化物もし
くは塩化物等の水溶液に適当量のケラチンを溶解させた
浸漬液に該粒状基体を浸漬し、引き上げて乾燥処理に付
す方法であるが、その他、噴霧法等を利用してもよい。この場合、活性反応基を有するポリマー微粒子、例えば
、前述のトリス（２−メタクリロイルオキシエチル）リ
ン酸を重合成分の少なくとも一部として含むモノマー成
分を重合して得られるポリマー微粒子を粒状基体として
使用することによって、ケラチンが化学的に固定された
細胞培養用担体が得られる。

【００１５】本発明による細胞培養用担体に被覆するケ
ラチン量は特に限定的ではないが、通常は１０〜２５０
ｍｇ／ｗｅｔ　ｍｌ、より好ましくは３０〜１５０ｍｇ
／ｗｅｔ　ｍｌである。

【００１６】上記の細胞培養用担体は通常は、十分に水
洗した後、適当なバッファー液で洗浄し、次いで滅菌処
理に付し、さらに、使用する培地で洗浄した後、細胞浮
遊培養に供される。該担体は培地、例えば、ＭＥＭ培地
やＤＭＥ培地等の培養液中において、穏やかな撹拌によ
って被培養細胞と共に浮遊し、この浮遊状態において、
細胞は担体のケラチン被覆層に効率よく接着し、良好な
増殖がおこなわれる。この場合、粒径が１００μｍ以上
、特に１００μｍ〜２５０μｍの担体を使用すると、細
胞の増殖はより高密度でおこなわれ、また、該担体は軽
量であるために、通常の穏やかな撹拌条件下においては
、浮遊細胞よりも優先的に沈降することはなく、細胞の
接着増殖はより一層均一におこなわれる。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例によって説明する。実施例１（細胞培養用担体の調製）（ｉ）還流冷却器、撹拌器、サーモスタットを取り付け
た２リットルの四口セパラブルフラスコに、トリス（２
−メタクリロイルオキシエチル）リン酸１０ｇｒ、エチ
レングリコールジメタクリレート９０ｇｒ、２−ヒドロ
キシエチルメタクリレート１００ｇｒ、１−ブタノール
２８０ｇｒ、α，α’−アゾイソブチロニトリル４ｇｒ
を加え、続いてヒドロキシエチルセルロース６ｇｒ、塩
化ナトリウム２５０ｇｒを溶解させた蒸留水７５０ｇｒ
を加え、３３５ｒｐｍの回転数で撹拌をおこないながら
６０℃で１時間、さらに７５℃で８時間加熱撹拌した。生成した粒子を十分に水洗し、さらにメタノール洗浄、
水洗後、湿式分級をおこなって、７５〜１５０μｍの粒
子を得た。

【００１８】（ｉｉ）５０ｍｌの三角フラスコに、前記
（ｉ）で得た合成高分子粒子５ｗｅｔｇｒ、５Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液８ｍｌ、エピクロロヒドリン６ｍｌを
加え、恒温振盪器で６０℃、１時間振盪した後、粒子を
十分に水洗し、エポキシ基導入量の定量をおこない、２
７７μｍｏｌ／ｄｒｙｇｒのエポキシ基が導入されたエ
ポキシ活性化粒子を得た。

【００１９】（ｉｉｉ）５０ｍｌの三角フラスコに、前
記（ｉｉ）で得たエポキシ活性化粒子５ｗｅｔｇｒ、ア
ンモニア水１０ｍｌを加え、恒温振盪器で４０℃、９０
分間振盪した後、粒子を十分に水洗し、アミノ活性化粒
子を得た。

【００２０】（ｉｖ）５０ｍｌの三角フラスコに、前記
（ｉｉｉ）で得たアミノ活性化粒子５ｗｅｔｇｒ、２５
％グルタールアルデヒド水溶液７．５ｍｌ、水素化ホウ
素シアノナトリウム０．３ｇｒを加え、恒温振盪器で４
０℃、２時間振盪した後、粒子を十分に洗浄し、ホルミ
ル活性化粒子を得た。

【００２１】（ｖ）５０ｍｌのトーメビーカーに、ｐＨ
メーターを備え付け、前記（ｉｉｉ）で得たアミノ活性
化粒子５ｗｅｔｇｒ、０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液１
０ｍｌを加え、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で粒子の懸
濁液のｐＨを６付近に保ちながら、無水こはく酸０．６
ｇｒを少しずつ加え、ゆっくり撹拌させた。すべて無水
こはく酸を加えた後、恒温振盪器で室温、５時間ゆっく
り振盪した後、粒子を十分に水洗し、カルボキシル活性
化粒子を得た。

【００２２】（ｖｉ）（ａ）羊毛１００ｇに３５％過酸
化水素水５００ｍｌを加え、アンモニア水を用いてｐＨ
を８．３に調製した。これを室温で１時間放置し、羊毛
が可溶化されたのを確認後、酢酸でｐＨを下げた。この
溶液にアルコールを加え一晩放置した。次いで、上清を
捨て、沈澱として回収された羊毛タンパク質をアルコー
ルで更に洗浄した。最後にアセトンで洗浄し風乾した。この操作により約７０ｇの極淡黄色、無味無臭の粉末（
羊毛の可溶化因子）を得た。（ｂ）前記（ａ）で調製した羊毛の可溶化因子（ケラチ
ン）を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で２ｍｌに溶解して
５％水溶液とし、さらにｐＨを１０に調製して、エポキ
シ活性化粒子１ｗｅｔｍｌを加え、恒温振盪器で４０℃
、２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。ケラチ
ンの固定化量は固定化終了後のケラチン溶液上清の吸光
度を測定し、あらかじめ求めた検量線よりケラチン量を
算出した後、使用したケラチン総量から差し引いて求め
た。その結果、３５ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが化学
的に固定化された粒子を得た。

【００２３】（ｖｉｉ）前記（ｖｉ）（ａ）で調製した
羊毛の可溶化因子（ケラチン）をｐＨ６に調製した０．
５Ｍ塩化ナトリウムを含む純水２ｍｇ／ｗｅｔｍｌに溶
解して５％水溶液を調製し、アミノ活性化粒子１ｗｅｔ
ｍｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩７５ｍｇを加え、恒温振盪器で
２５℃、２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。上記方法でケラチンの固定化量を求めた結果、５４ｍｇ
／ｗｅｔｍｌのケラチンが化学的に固定化された粒子を
得た。

【００２４】（ｖｉｉｉ）前記（ｖｉ）（ａ）で得た羊
毛の可溶化因子（ケラチン）をｐＨ７に調製した０．１
Ｍリン酸バッファー２ｍｌに溶解して５％水溶液を調製
し、ホルミル活性化粒子１ｗｅｔｍｌ、水素化シアノホ
ウ素ナトリウム７５ｍｇを加え、恒温振盪器で２５℃、
２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。前記（ｖ
ｉ）（ｂ）の方法でケラチンの固定化量を求めた結果、
４１ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが化学的に固定化され
た粒子を得た。

【００２５】（ｉｘ）前記（ｖｉ）（ａ）で得た羊毛の
可溶化因子（ケラチン）をｐＨ６に調製した０．５Ｍ塩
化ナトリウムを含む純水２ｍｌに溶解して５％水溶液を
調製し、カルボキシル活性化粒子１ｗｅｔｍｌ、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩７５ｍｇを加え、恒温振盪器で２５℃、２４
時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。前記（ｖｉ）
（ｂ）の方法でケラチンの固定化量を求めた結果、４１
ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが化学的に固定化された粒
子を得た。

【００２６】（ｘ）５０ｍｌ三角フラスコに、前記（ｉ
）で得た合成高分子粒子５ｗｅｔｇｒ、５Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液５ｍｌ、４Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍｌ
、塩酸２−ジエチルアミノエチルクロリド２．５ｇｒを
加え、恒温振盪器で９０℃、４０分振盪した後、粒子を
十分に水洗してジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基が
導入されたＤＥＡＥ陰イオン交換体粒子を得た。次いで
、前記（ｖｉ）（ａ）で得た羊毛の可溶化粒子（ケラチ
ン）をｐＨに調製した０．０１Ｍトリス−塩酸バッファ
ー４ｍｌに溶解して１０％水溶液を調製し、ＤＥＡＥ陰
イオン交換体粒子１ｗｅｔｍｌを加え、恒温振盪器で２
５℃、２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。前
記（ｖｉ）（ｂ）の方法でケラチンの固定化量を求めた
結果、１２９ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが物理的に吸
着された粒子を得た。

【００２７】実施例２（細胞浮遊培養）上記実施例１に
おいて調製したケラチン被覆細胞培養用担体を用いて各
種細胞の浮遊培養をおこなった。（ｉ）マウス繊維芽細胞株３Ｔ３の培養それぞれの細胞
培養用担体を十分に水洗した後、ＰＢＳバッファーで３
回洗浄し、オートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）を
行った。次いで、ＭＥＭ培地（牛胎児血清１０％を含む
）で５回繰り返し洗浄し、Ｔ−２５培養フラスコに０．
１ｗｅｔｍｌ加えた。さらに、Ｔ−２５培養フラスコに
３Ｔ３細胞を１．０〜２．０×１０５個加え、最終的に
Ｔ−２５培養用フラスコの培地容量が２ｍｌになるよう
に培地を追加し、３７℃に設定したＣＯ２インキュベー
ター内で細胞培養をおこなった。この間、３０分〜１時
間ごとにＴ−２５培養用フラスコを軽く振った。

【００２８】（ｉｉ）ヒトニューロブラストーマ細胞株
ＳＫ−Ｎ−ＭＣの培養上記（ｉ）と同様の方法でヒトニューロブラストーマ細
胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣの培養をおこなった。培地はＤＭＥ
（７％牛胎児血清を含む）を用いた。

【００２９】（ｉｉｉ）ヒトグリオブラストーマ細胞株
Ｕ２５１−ＭＧの培養上記（ｉ）と同様の方法でヒトグリオブラストーマ細胞
株Ｕ２５１−ＭＧの培養をおこなった。培地はＤＭＥ（
７％牛胎児血清を含む）を用いた。

【００３０】（ｉｖ）ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２の培養
上記（ｉ）と同様の方法でヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２の
培養をおこなった。培地はＭＥＭ（５％牛胎児血清を含
む）を用いた。

【００３１】（ｖ）ラット正常表皮細胞の培養上記（ｉ
）と同様の方法でラット正常表皮細胞の培養をおこなっ
た。培地はＫＧＭ（倉敷紡績（株）製）を用いた。

【００３２】（ｖｉ）ラット肝実質細胞の培養上記（ｉ
）と同様の方法で肝実質細胞の培養をおこなった。培地
はＷＥ（１０％血清を含む）を用いた。

【００３３】上記の細胞浮遊培養（ｉ）〜（ｖｉ）にお
いて、光学顕微鏡で細胞の接着、増殖状態を観察したと
ころ、１時間後にはすべての細胞培養用担体に細胞が接
着し、２４時間後には、細胞の均一な増殖が観察された
。この中でアミノ活性化担体、ホルミル活性化担体、Ｄ
ＥＡＥ陰イオン交換担体にケラチンをコーティングした
細胞培養用担体を用いた場合、細胞の接着、増殖が特に
良好であった。

【００３４】

【発明の効果】本発明による細胞培養用担体は、複雑な
操作や特殊な装置および高価な試薬等を必要とすること
なく、簡易な方法で精製分離できる耐熱性に優れたケラ
チンで被覆されているので、特に、マイクロキャリアー
法によって種々の接着性細胞を低コストで大量に培養す
るのに好適な担体である。従って、本発明による細胞培
養用担体を利用することによって、各種の細胞が産生す
る有用な種々の生理活性物質等の低コストでの大量生産
が可能となる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　粒状基体表面をケラチンで被覆して成
る細胞培養用担体。
【請求項２】　　ケラチンが獣毛の酸化分解によって得
られる可溶化因子である請求項１記載の細胞培養用担体
。
【請求項３】　　粒状基体が、トリス（２−メタクリロ
イルオキシエチル）リン酸を重合成分の少なくとも一部
として含むモノマー成分を重合して得られるポリマー微
粒子である請求項１記載の細胞培養用担体。
【請求項４】　　粒状基体とケラチンが化学的に結合し
た請求項１〜３いずれかに記載の細胞培養用担体。
【請求項５】　　ケラチンが、獣毛の酸化分解法によっ
て調製されたものである請求項１〜４いずれかに記載の
細胞培養用担体。