JP5200888B2

JP5200888B2 - パターン細胞培養用器具

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Publication number: JP5200888B2
Application number: JP2008298376A
Authority: JP
Inventors: 秀志服部; 正敏黒田; 拓矢岡崎
Original assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2028-11-21
Also published as: JP2010119370A

Description

本発明は、細胞生物学研究、医学研究、臨床検査等、細胞培養を伴う技術分野に用いられる、パターン細胞培養用器具に関するものである。

従来から細胞生物学の分野では細胞培養が不可欠である。近年、幹細胞研究や再生医療研究が盛んになるに伴い、ますます細胞培養の技術開発の重要性が高まっている。

また、近年、マイクロテクノロジーやナノテクノロジー等の微細加工技術を応用して細胞の性質を制御しようとする研究が世界中で盛んである。この研究分野では、微細加工技術を応用した培養用のツールを作った後に、細胞培養実験によって、そのツールの効果を調べる。たとえば、特許文献１には細胞をパターン状に配列して培養する容器とその細胞パターンの形成を促す装置について記載されている。また、特許文献２には、細胞配列用マイクロチャンバーアレイと電極を備えた培養用ツールとその応用技術が開示されている。また、特許文献３には、微細パターン培養用ツールを応用した機能性の培養細胞構築物とその応用について記載されている。最近では、細胞をパターン培養し、さらにその細胞を転写する機能も備えた培養用ツールが、特許文献４に開示されている。さらに、特許文献５には、微細パターン培養を応用した試験法が開示されている。

微小パターンを有する細胞培養器具を用いた研究は比較的歴史が浅いため、実験は、これまで主に科学者や技術者によって実験室の中で手作業によって行われてきた。そのために、実用上は重要であるが科学的には重要でない技術課題には、全く注意が払われてこなかったといっても過言ではない。

特開平７−９９９６２号公報特開２００４−８１０８５号公報国際公開第２００３／０１０３０２パンフレット特開２００７−３１２７３６号公報特開２００８−１１８９００号公報特開２００４−３４４０２５号公報

パターン細胞培養のための、細胞接着性領域のパターンは非常に微細であるため、目視が事実上不可能である。微細パターンの向き、位置等の情報は実験上重要であるにも関わらず、従来のパターン細胞培養用基板ではこれらの情報を目視で確認することができなかった。更に、パターン細胞培養用器具を工業的に生産する場合にも、これらの情報が目視により容易に確認できないため、パターンの方位や位置が適切でない不具合品が発生するなどして生産歩留まりが悪化するという問題があった。ところが、これらの利便性に関する課題に対する解決策は従来皆無であった。

そこで本発明は、パターン細胞培養用の微細パターンの向き、位置等について簡単に目視で確認することができるパターン細胞培養用器具を提供することを目的とする。

本発明は以下の発明を包含する。
（１）細胞接着性領域のパターンが表面上に形成された基板を備えるパターン細胞培養用器具であって、前記パターンの方位及び／又は位置を目視により判別するための判別手段を備えていることを特徴とするパターン細胞培養用器具。
（２）前記判別手段が、前記基板の周縁に形成された切欠部であることを特徴とする（１）記載のパターン細胞培養用器具。
（３）前記基板が設置される部材を更に備える、（１）又は（２）記載のパターン細胞培養用器具。
（４）前記基板の表面上において、前記細胞接着性領域が、前記表面上の他の領域である細胞接着阻害性領域に対して窪んでおり、前記細胞接着性領域の表面と、前記細胞接着阻害性領域の表面との平均高低差が３オングストローム以上３０オングストローム以下であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載のパターン細胞培養用器具。
（５）前記基板に透明電極が形成されていることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載のパターン細胞培養用器具。
（６）以下の第１工程からｎ工程（ｎは２以上の整数）を行うことを特徴とする、細胞接着性領域のパターンが表面上に形成された、前記パターンの方位及び／又は位置を目視により判別するための判別手段を備えたパターン細胞培養用器具の製造方法。
第一工程：判別手段を有する基板に細胞接着性領域のパターンを形成して第一次基板を得る工程。
第二工程：第一次基板が有する判別手段を参照して、第一次基板から、各々に同一の判別手段が設けられた同一形状の複数の第二次基板を切り出す工程。
第ｎ工程：第ｎ−１次基板が有する判別手段を参照して、第ｎ−１次基板から、各々に同一の判別手段が設けられた同一形状の複数の第ｎ次基板を切り出す工程。

本発明によれば、パターン細胞培養用の細胞接着性領域の微細パターンの向き、位置等について簡単に目視で確認することが可能となる。特に微細パターンの高低差が、位相差顕微鏡で観察できないおよそ２０ナノメートルよりも小さいものである場合に、本発明は優れた効果を発揮する。

１．パターン細胞培養用器具
本発明のパターン細胞培養用器具は、細胞接着性領域のパターンが表面上に形成された基板を少なくとも備える。基板を構成する材料としては、金属、ガラス、セラミック、プラスチック、エラストマー等やこれらの複合材を用いることができるがこれらには限定されない。特に透明な材料が望ましい。細胞の顕微鏡観察を容易にするからである。金等の蒸着層も厚さ50nm程度なら光透過性を有するので好適に用いることができる。

パターン細胞培養用器具の形状は、基板を構成する部分を有している限り特に限定されない。基板は板状又はフィルム状とすることができる。細胞接着性パターンが形成された基板上の領域が容器の内底面となるように、当該領域の周囲から側壁が立設されていることが好ましい。側壁と基板とは一体に形成されていてもよいし、側壁を構成する部材と基板とを別に形成した後に組み合わせてもよい。

本発明の好ましい実施形態としては、基板と、側壁を構成する部材とを別に形成し、次いで接着剤等を用いて接着する形態が挙げられる。例えば図１に示すように、底部に貫通孔を有する培養皿と、後述する切欠部が周縁に形成された微細パターンを有する基板とを用意し、基板の微細パターン側の面が培養皿の内底面となるように基板を培養皿に貼り合わせて本発明のパターン細胞培養用器具とする形態や、図２に示すように、底なしのマルチウェルプレートと、切欠部が周縁に形成された微細パターンを有する一枚の基板とを用意し、基板の微細パターン側の面が各ウェルの内底面となるように貼り合わせて本発明のパターン細胞培養用器具とする形態が考えられる。このように少なくとも１つの貫通孔を有する、側壁を構成する部材などの、基板と組み合わされる部材を本発明では「基板が設置される部材」と称する。図１及び図２では描写していないが、培養皿又はマルチウェルプレートの裏面上の、貫通孔の周縁領域に接着剤が塗布され、裏面上の貫通孔の周縁領域と基板の微細パターン側面とが気密に接着される。

細胞接着性領域とは、細胞接着性が良好な領域を意味する。細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合があるため、基板上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性領域が２水準以上存在する場合もある。基板上の細胞接着性以外の領域は細胞が実質的に接着しない領域（本発明では「細胞接着阻害性領域」という）である。本発明では、細胞培養中に細胞が全く接着しない領域、或いは、細胞は少数接着するがその接着細胞は全くあるいはほとんど伸展せず、その結果、それら細胞は全くあるいはほとんど増殖しない領域を細胞が実質的に接着しない領域（細胞接着阻害性領域）と定義する。このような表面であれば、細胞パターンを全くあるいはほとんど乱すことが無くパターン培養することができる。細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化された基板上に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しないため、細胞がパターン状に配列される。本発明は、細胞接着性領域が、細胞接着阻害性領域に対して窪んでおり、細胞接着性領域の表面と、細胞接着阻害性領域の表面との平均高低差が３オングストローム以上２０ナノメートル未満、好ましくは３オングストローム以上１０ナノメートル未満、特に好ましくは３オングストローム以上３０オングストローム以下であるような、位相差顕微鏡では観察できない程度の平均高低差の微細パターンが基板上に形成されている場合に特に有用である。

細胞接着性領域の微細パターンは、特許文献４に記載されているように、基板上に親水性の被膜（細胞接着阻害性）を形成した後に、酸化処理および／または分解処理を部分的に施して疎水性領域（細胞接着性領域）のパターンを形成する方法により作成できる。酸化処理および／または分解処理の方法としては、親水性膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。部分的に酸化処理および／または分解処理する場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりするとよい。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。

細胞接着性領域の微細パターンは特許文献６に記載されている方法により形成することも可能である。特許文献６の第３実施態様では、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層を基材上に備えるパターン形成体用基材を用意し、該パターン形成体用基材と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、前記細胞接着性変化材料層と前記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射することにより、前記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する。特許文献６に記載されているように、所望の細胞接着性変化パターンを形成するためには、光触媒含有層側基板において光触媒含有層をパターン状に形成するか、光触媒含有層側基板にパターン状に遮光部を設けることにより光触媒が作用する領域をパターン状に制限するか、或いは、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いることにより、細胞接着性変化材料層の細胞接着性を部分的に変化させる。細胞接着性変化材料は、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する材料であれば特に限定されない。細胞接着性変化材料としては、特許文献４に記載された材料の他に、例えば主骨格が光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような有機置換基を有するものが好ましく、例えば、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）撥水牲や撥油性に優れた反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。有機置換基としては、フルオロアルキル基、炭素数８以上のアルキル基等を挙げることができる。細胞接着性変化材料はバインダとともに基材上に層状に適用されることが好ましい。

２．判別手段
本発明のパターン細胞培養用器具は、微細パターンの方位及び／又は位置を目視により判別するための判別手段を備えていることを特徴とする。

判別手段は基板の一部に形成されていることが好ましい。好ましい判別手段は基板の周縁に形成された切欠部であって、基板の裏表、上下、左右を判別可能にするもの（例えば、基板を垂直方向からみたときの基板の外郭形状を、基板の平面に沿った全ての軸に関して非対称の形状とする切欠部）が挙げられる。このような切欠部としては、例えば図３及び図４に示すものが挙げられる。図３及び４ではaとbとは目視により認識できる程度に異なる長さである。切欠部は、パターン細胞培養用器具の製造工程において溶けたり剥がれたりすることがないため好ましい。判別手段の他の形態としては、基板上に配置されたマークであって、基板を垂直方向からみたときの外観から、基板の裏表、上下、左右を判別可能にするもの（例えば非対称形状のマーク、文字）が挙げられる。

なお、切欠部は一箇所とは限らず、必要に応じて異なるサイズや形状の切欠部を基板に複数箇所設けてもよい。

３．基板の製造方法
上記の判別手段を備えた基板は以下の第１工程から第ｎ工程（ｎは２以上の整数）を行うことにより製造することが好ましい。第一工程は、上記判別手段を有する基板に細胞接着性領域の微細パターンを形成して第一次基板を得る工程である。第二工程は、第一次基板が有する判別手段を参照して、第一次基板から、各々に同一の判別手段が設けられた同一形状の複数の第二次基板を切り出す工程である。第ｎ工程（ｎは２以上の整数）は、第ｎ−１次基板が有する判別手段を参照して、第ｎ−１次基板から、各々に同一の判別手段が設けられた同一形状の複数の第ｎ次基板を切り出す工程である。この方法により、従来大量生産が困難であった細胞接着性領域の微細パターンを有する基板を、効率的かつ均質に製造することが可能となる。

図５は、第１工程〜第三工程により、判別手段を備えた微細パターンを有する基板を製造する方法の一実施形態を模式的に示す図である。第一工程では、切欠部（判別手段）５１１を有する原基板５００に細胞接着性領域の微細パターン５１２を形成して第一次基板５１０を得る。第二工程では、第一次基板５１０が有する切欠部５１１を参照して、第一次基板５１０から、各々に同一の切欠部５２１が設けられた同一形状の複数の第二次基板５２０を切り出す。第三工程では、第二次基板５２０が有する切欠部５２１を参照して、第二次基板５２０から、各々に同一の切欠部５３１が設けられた同一形状の複数の第三次基板５３０を切り出す。細胞培養のための微細パターンの形状、基板の形状、判別手段の種類、判別手段が切欠部である場合の形状や数、各工程における操作、工程数などに関しては、図５に示す実施形態には限定されない。例えば、図５では第二工程及び第三工程において１枚の基板から４枚の基板が切り出される例が示されるが、これには限定されない。１枚の基板から切り出される基板の数は工程毎に異なっていてもよい。
実施例

（微細パターン培養用基板の作製）
厚さが0.17mmで、大きさがひとつの角の部分を縦3mm、横5mmのサイズで切り落とした100mm角のオリエンテーションフラット（オリフラ）付きガラス基板を触媒量のトリエチルアミンを加えたエポキシシランのトルエン溶液に浸漬し、室温で20時間反応させた。反応後、乾燥しないように注意しながらトルエンとエタノールで基板を洗浄し、次いで数分間、基板を純水で超音波洗浄し、最後に基板を乾燥させた。接触角計を用いて測定した表面の水接触角の平均値は52.2°だった。

触媒量の硫酸を含むテトラエチレングリコールに上記のエポキシシラン修飾ガラス基板を浸漬し、80℃で1時間反応させた。反応後、基板を純水でよく洗浄し、最後に基板を乾燥させた。これにより、細胞接着阻害性コーティングが施されたオリフラ付きガラス基板が完成した。表面の水接触角の平均値は30.0°だった。

次いで、真空紫外線ランプと様々なピッチおよび線幅のラインパターンが描画された石英フォトマスクを用いて、上記コーティングをマイクロパターニングし、細胞接着性領域の微細パターンを形成した。パターニング時には、オリフラ位置を右上に配置したガラス基板表面に対してラインパターンが前後方向になるようアライメントをとってフォトマスクを対向させた。光干渉式三次元プロファイラーを用いて計測した細胞接着阻害性領域と細胞接着性領域の間の平均段差は13オングストロームだった。

（微細パターン培養用ツールの作製）
ガラススクライバーを用いて、上記の100mm角オリフラ付きマイクロパターニングガラスから16枚の20mm角オリフラ付きマイクロパターニングガラスを作製した。この際、100mm角オリフラ付きガラスは、そのオリフラ位置が右上になるようスクライバーのステージ上に配置した。次いで、20mm角オリフラ付きマイクロパターニングガラスのオリフラ位置が、100mm角の基板のオリフラの位置と同じく右上になるようスクライブした。オリフラは、ひとつの角の部分を縦3mm、横4mmのサイズで切断して形成した。別途、市販の35mm組織培養ディッシュ（コーニング）の底に直径14mmの貫通穴が形成された部材を用意した。上記20mm角オリフラ付きマイクロパターニングガラスと接着剤（信越シリコーンKE45T）を用いて、上記貫通穴に蓋をした。その際、マイクロパターニング面がディッシュの内面側になるようにした。

以上により、オリフラ付きマイクロパターニングガラスを有するガラスボトムディッシュが完成した。オリフラが付いているので、ラインパターンがどの方向に形成されているのか容易に判別することができる。

（微細パターン培養用基板の作製）
微細パターン培養用９６穴マルチウェルプレートを作るために、厚さが0.1mmで大きさが110mm×75mmのオリフラ付きガラス基板に対して、実施例１と同じ手順で細胞接着阻害性コーティングを施した。オリフラは、コーティングされたガラス表面に相対して右上に形成されている。

次いで、真空紫外線ランプと石英フォトマスクを用いて、上記コーティングをマイクロパターニングし、細胞接着性領域の微細パターンを形成した。石英フォトマスクには次のパターンが設けられている。すなわち、マルチウェルプレートの第１列に相当する部分は全面遮光部、第２列に相当する部分は全面開口部、第３列から第１２列に相当する部分には、ピッチ600μmで直径300μmの円形の開口部のパターンが設けられている。パターニング時には、オリフラ位置を右上に配置したガラス基板表面に対して左端が全面遮光部になるようアライメントをとってフォトマスクを対向させた。光干渉式三次元プロファイラーを用いて計測した細胞接着阻害性領域と細胞接着性領域の間の平均段差は11オングストロームだった。

（微細パターン培養用ツールの作製）
市販の底無し９６穴マルチウェルプレート用の部材（ヌンク）を用意した。この部材のＡ行１２列の部分に上記110mm×75mmマイクロパターニングガラスのオリフラが位置するように配置し、接着剤（信越シリコーンKE45T）で貼り付けた。これにより、９６穴マルチウェルの第１列が全面細胞接着阻害性、第２列が全面細胞接着性、第３列から第１２列が微細パターン培養のウェルであるマルチウェルプレートが完成した。

（微細パターン培養用基板の作製）
厚さ0.7mmで大きさ50mm角のＩＴＯ（インジウムスズ酸化物）ラインパターン形成済みオリフラ付きガラスを用意した。ＩＴＯ面に相対してオリフラ位置を右上にしたときに、ＩＴＯラインパターンは左右に平行に形成されている。ＩＴＯラインパターンは線幅0.1mmでピッチ0.4mmである。このＩＴＯ透明電極付き基板に実施例１と同様の手順で細胞接着阻害性コーティングを設けた。次いで実施例１で用いたフォトマスクを使って、実施例１と同様の配置でパターニングを行い、ＩＴＯラインパターンと細胞接着性ラインパターンが直交した微細パターン培養用基板を作製した。

（微細パターン培養用ツールの作製）
市販の35mm組織培養ディッシュ（コーニング）の底に直径27mmの貫通穴が形成された部材を用意した。上記の50mm角微細パターン培養用基板を培養面が上になり且つオリフラ位置が右上にくるように配置し、その中央に上記27mm貫通穴つき部材を接着剤（信越シリコーンKE45T）で貼り付けた。これにより、透明電極付き微細パターン培養用ツールが完成した。

（微細パターン培養用基板の作製）
厚さ１５０μｍ、大きさ１００ｍｍ角のポリエステルフィルムを用意し、ＣＶＤチャンバー内の真空度を４．０×１０^−３Ｐａに減圧し、電極に９０ｋＨｚの周波数を有する電力（投入電力３００Ｗ）を印加した。その後、ヘキサメチルジシロキサン、酸素ガス、ヘリウムガスをそれぞれ所定量投入し、真空度が３０ＭＰａとなるように制御した。これにより、プラズマ気相成長法（ＣＶＤ法）による酸化珪素系薄膜（中間層）が、厚さ約１００ｎｍで形成された。フルオロアルキルシランＸＣ９８−Ｂ２４７２（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈したコーティング剤をスピンコーティングにより塗布した。続いて、１５０℃で１０分間乾燥させた。この時点での表面静止水接触角は１０１．８°であった。続いて、あらかじめ光触媒が塗布されたフォトマスクを用いて、フォトマスクの光触媒面とフルオロアルキルシランが塗布されたフィルムのシラン面とを対向させ、フォトマスク側から水銀ランプにより１０Ｊ／ｃｍ^２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、細胞接着阻害領域と細胞接着領域がマイクロパターニングされた微細パターン培養用基板が完成した。光干渉式三次元プロファイラーを用いて計測した細胞接着阻害性領域と細胞接着性領域の間の平均段差は1５オングストロームだった。

（微細パターン培養用ツールの作製）
カムシステムハンドプレスＦＫ−ＨＰ５００を用いて、上記の１００ｍｍ角マイクロパターニングフィルムから１６枚の２０ｍｍφマイクロパターニングフィルムを作製した。次いで、切欠位置が右上になるようはさみで切断し、切欠部付きマイクロパターニングフィルムを作製した。別途、市販の３５ｍｍφ組織培養ディッシュ（コーニング）の底に直径１４ｍｍφの貫通穴が形成された部材を用意した。上記２０ｍｍφオリフラ付きマイクロパターニングフィルムと接着剤（信越シリコーンＫＥ４５Ｔ）を用いて、上記貫通穴に蓋をした。その際、マイクロパターニング面がディッシュの内面側になるようにした。

（微細パターン培養用基板の作製）
厚さ０．１２ｍｍ、大きさ１００ｍｍ角の切欠部付きガラス基板を用意し、実施例４と同様の方法により厚さ約１００ｎｍの珪素系酸化物を蒸着させたあと、デシルメトキシシランをスピンコートした。表面の静止水接触角は９９．７°であった。その後、光触媒付きフォトマスクと紫外線照射装置を用いて、実施例４と同様の手法でマイクロパターニングを実施した。光干渉式三次元プロファイラーを用いて計測した細胞接着性阻害領域と細胞接着性領域の間の平均段差は１０オングストロームであった。

（微細パターン培養用ツールの作製）
ガラススクライバーを用いて、上記の切欠部付き１００ｍｍ角マイクロパターニングガラスから１６枚の２０ｍｍ角オリフラ付きマイクロパターニングガラスを作製した。この際、１００ｍｍ角オリフラ付きガラスは、そのオリフラ位置が右上になるようスクライバーのステージ上に配置した。次いで、２０ｍｍ角オリフラ付きマイクロパターニングガラスのオリフラ位置が、１００ｍｍ角の基板のオリフラの位置と同じく右上になるようスクライブした。別途、市販の３５ｍｍ組織培養ディッシュ（コーニング）の底に直径１４ｍｍの貫通穴が形成された部材を用意した。上記２０ｍｍ角オリフラ付きマイクロパターニングガラスと接着剤（信越シリコーンＫＥ４５Ｔ）を用いて、上記貫通穴に蓋をした。その際、マイクロパターニング面がディッシュの内面側になるようにした。
以上により、オリフラ付きマイクロパターニングガラスを有するガラスボトムディッシュが完成した。

（微細パターン培養用基板の作製）
厚み２００μｍ、大きさ１００ｍｍ角のセルロースフィルム（東レ）を調達し、熱湯で１５分間煮沸した。室温で１時間乾燥させたあと、触媒量のトリエチルアミンを加えたエポキシシランのトルエン溶液に浸漬し、室温で１８時間反応させた。反応後、乾燥しないように注意しながらトルエンとエタノールで基板を洗浄し、次いで数分間、基板を純水で超音波洗浄し、最後に基板を乾燥させた。接触角計を用いて測定した表面の水接触角の平均値は５１．０°だった。

触媒量の硫酸を含むテトラエチレングリコールに上記のエポキシシラン修飾ガラス基板を浸漬し、８０℃で１時間反応させた。反応後、基板を純水でよく洗浄し、最後に基板を乾燥させた。これにより、細胞接着阻害性コーティングが施されたセルロースフィルムが完成した。表面の水接触角の平均値は３０．０°だった。

次いで、光触媒付きフォトマスクと紫外線照射装置を用いて実施例４と同様の手法でマイクロパターニングを実施した。

（微細パターン培養用ツールの作成）
カムシステムハンドプレスＦＫ−ＨＰ５００を用いて、上記の１００ｍｍ角マイクロパターニングセルロースフィルムから１６枚の２０ｍｍφマイクロパターニングセルロースフィルムを作製した。次いで、切欠部の位置が右上になるようはさみで切断し、切欠部付きマイクロパターニングセルロースフィルムを作製した。別途、市販の３５ｍｍφ組織培養ディッシュ（コーニング）の底に直径１４ｍｍφの貫通穴が形成された部材を用意した。上記２０ｍｍφオリフラ付きマイクロパターニングセルロースフィルムと接着剤（信越シリコーンＫＥ４５Ｔ）を用いて、上記貫通穴に蓋をした。その際、マイクロパターニング面がディッシュの内面側になるようにした。

（微細パターン培養用基板の作製）
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、最終濃度２０重量％になるようにイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に溶解させた。市販の易接着性ポリエチレンテレフタレートフィルム（三光産業社より入手、透明５０−Ｆセパ１０９０）を調達し、これを１０ｃｍ角に切断した。ここに前記溶液を、易接着ＰＥＴの易接着面に展開し、ミヤバーでコーティングした。電子線照射装置（岩崎電気社製）を用いて該サンプル上に電子線照射を行い、該溶液をグラフト重合した。このときの電子線照射線量は３００ｋＧｙであった。メタクリロキシシラン（モメンティブパフォーマンスマテリアルズ社より入手、ＴＳＬ８３７０）を用意し、これをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で０．１重量％になるように希釈した。前記で得られたフィルムを、０．７ｍｍ厚ガラスにテープで固定し、スピンナー（ミカサ製）を用いて、メタクリロキシシランをコーティングし、シラン処理を行った。このときのスピンナー方の条件は７００ｒｐｍ×３秒であった。次いで、ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３００、アルドリッチ社より入手）が最終濃度５０重量％になるように、純水で希釈し、ここに、重合開始剤として、２−ヒドロキシ−４‘−（２−ヒドロオキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（アルドリッチ社より入手）を最終濃度１重量％になるように加えた。この溶液をスターラーで１５分間攪拌した。これをシラン処理したフィルム上に１ｍＬ展開し、１５０μｍ厚ＰＥＴフィルム（東レ株式会社製）を用いて所望のパターン形状が形成されるように、マスキングした。次いで、フォトマスクをマスキングフィルム上からギャップ２００μｍ離してセットし、５００ｍＷマルチライト（ウシオ電機社製）を用いて、１０秒間光照射した。光照射条件は、波長、３６５ｎｍで、照度は７５ｍＷ／ｃｍ^２であった。その後、マスキングフィルムを剥離し、シラン処理基材上にポリエリレングリコールジアクリレートが固定化された。

（微細パターン培養用ツールの作成）
カムシステムハンドプレスＦＫ−ＨＰ５００を用いて、上記の１００ｍｍ角マイクロパターニングフィルムから１６枚の２０ｍｍφマイクロパターニングフィルムを作製した。次いで、切欠位置が右上になるようはさみで切断し、切欠部付きマイクロパターニングフィルムを作製した。別途、市販の３５ｍｍφ組織培養ディッシュ（コーニング）の底に直径１４ｍｍφの貫通穴が形成された部材を用意した。上記２０ｍｍφ切欠部付きマイクロパターニングフィルムと接着剤（信越シリコーンＫＥ４５Ｔ）を用いて、上記貫通穴に蓋をした。その際、マイクロパターニング面がディッシュの内面側になるようにした。以上により、切欠部付きマイクロパターニングフィルムを有するディッシュが完成した。切欠部が付いているので、ラインパターンがどの方向に形成されているのか容易に判別することができる。

（微細パターン培養用基板の作製）
厚さ0.12mmで大きさひとつの角の部分を縦3mm、横5mmのサイズで切り落とした100mm角のオリフラ付きカバーガラス基板上に、フルオロアルキルシランＸＣ９８−Ｂ２４７２（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈したコーティング剤をスピンコーティングにより塗布した。続いて、１５０℃で１０分間乾燥させた。この時点での表面静止水接触角は１０１．１°であった。続いて、あらかじめ光触媒が塗布されたフォトマスクを用いて、フォトマスクの光触媒面とフルオロアルキルシランが塗布されたカバーガラスのシラン面とを対向させ、フォトマスク側から水銀ランプにより３Ｊ／ｃｍ^２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、細胞接着阻害領域と細胞接着領域がマイクロパターニングされた微細パターン培養用基板が完成した。

（微細パターン培養用ツールの作成）
ガラススクライバーを用いて、上記の100mm角オリフラ付きマイクロパターニングガラスから16枚の20mm角切欠部付きマイクロパターニングガラスを作製した。この際、100mm角オリフラ付きガラスは、そのオリフラ位置が右上になるようスクライバーのステージ上に配置した。次いで、20mm角切欠部付きマイクロパターニングガラスの切欠部位置が、100mm角の基板のオリフラの位置と同じく右上になるようスクライブした。切欠部は、ひとつの角の部分を縦3mm、横4mmのサイズで切断して形成した。別途、市販の35mm組織培養ディッシュ（コーニング）の底に直径14mmの貫通穴が形成された部材を用意した。上記20mm角切欠部付きマイクロパターニングガラスと接着剤（信越シリコーンKE45T）を用いて、上記貫通穴に蓋をした。その際、マイクロパターニング面がディッシュの内面側になるようにした。以上により、切欠部付きマイクロパターニングガラスを有するガラスボトムディッシュが完成した。切欠部が付いているので、ラインパターンがどの方向に形成されているのか容易に判別することができる。

（微細パターン培養用基板の作製）
大きさ110mm角の薄板ガラスD263T（ショット製）にクロム蒸着を全面に施し、次いでスピンコーティングによりネガ型フォトレジスト膜をクロム層の上に形成した。パターン方位判別マーク形成用５インチフォトマスクを別途用意した。このマスクは、線幅100μmで長さ1mmの矢印状の開口部とその矢印の先端近傍にサイズが1mmで線幅100μmの文字UとL（Upper Left、左上、の頭文字）のセットをピッチ19mmで25箇所有している。薄板ガラスの辺とマスク上の開口部（矢印）の向きを揃えて配置し、アライナーを用いてレジスト膜を露光し、レジストを現像、洗浄し、最後に乾燥した。次いで露出したクロム部を酸でエッチングし、洗浄した。最後に矢印部に残った光硬化したレジストを剥離し、矢印と文字付き薄板ガラスを作製した。クロム面を上にして見るとULは左右反転して見える。

上記クロム矢印と文字付きガラスの、クロム面とは逆の面を細胞培養に使うことを想定して、上記ガラスに実施例１と同様の方法で細胞接着阻害性コーティングを施した。次いで、実施例１で用いたフォトマスクとパターニング方法により、クロム面を下側にして（この場合、上から見るとULは反転して見えない）、矢印の向きとフォトマスクのラインパターンの向きを一致させて配置し、フォトリソグラフィーによりマイクロパターニングガラスを作製した。

（微細パターン培養用ツールの作製）
ガラススクライバーを用いて微細文字ULと微細矢印を左上隅に有する一辺19mmの正方形のマイクロパターニングガラスを25枚作製した。このマイクロパターニングガラスと実施例１で用いた貫通孔つきディッシュと接着剤を用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。

底部に貫通孔を有する培養皿の裏面に、切欠部が周縁に形成された微細パターンを有する基板を接着させて得られるパターン細胞培養用器具の構造を説明するための図である。底なしのマルチウェルプレートの裏面に、切欠部が周縁に形成された微細パターンを有する一枚の基板を接着させて得られるパターン細胞培養用器具の構造を説明するための図である。周縁に切欠部（３２）が形成された基板（３１）を基板の垂直方向から見た図を示す。周縁に切欠部（４２）が形成された基板（４１）を基板の垂直方向から見た図を示す。図５は第１工程〜第三工程により、判別手段を備えた微細パターンを有する基板を製造する方法の一実施形態を模式的に示す図である。

符号の説明

３１、４１・・・基板
３２、４２・・・切欠部
５００・・・原基板
５１０・・・第一次基板
５１１・・・切欠部（判別手段）
５１２・・・細胞接着性領域の微細パターン
５２０・・・第二次基板
５２１・・・切欠部（判別手段）
５３０・・・第三次基板
５３１・・・切欠部（判別手段）

Claims

複数の細胞接着性領域のラインパターンが表面上に平行に配列して形成された基板を備えるパターン細胞培養用器具であって、
前記基板は、前記ラインパターンが配列する方位に平行な辺と、前記ラインパターンが配列する方位に直交する辺とを有する矩形状の外郭形状を有し、
前記基板の角部に、前記ラインパターンが配列する方位を目視により判別するための切欠部を備え、
前記切欠部は、前記矩形状の基板の直交する２辺が、目視により認識できる程度に異なる長さ分だけ切欠かれていることを特徴とするパターン細胞培養用器具。
少なくとも１つの貫通孔を有する、側壁を構成する部材をさらに備え、前記基板の前記ラインパターン側の面が前記部材の内底面となるように基板を部材に貼り合わせてなる、請求項１記載のパターン細胞培養用器具。
前記基板が、透明な材料で構成されることを特徴とする請求項１又は２記載のパターン細胞培養用器具。
前記基板の表面上において、前記細胞接着性領域が、前記表面上の他の領域である細胞接着阻害性領域に対して窪んでおり、前記細胞接着性領域の表面と、前記細胞接着阻害性領域の表面との平均高低差が３オングストローム以上３０オングストローム以下であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のパターン細胞培養用器具。
前記基板に透明電極が形成されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のパターン細胞培養用器具。