JP2007300853A - 培養容器および自動培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の自動的に培養する。
【解決手段】培養容器１０は、上面が開口した、細胞を培養する容器本体１１と、容器本体１１の上面を閉塞する蓋１２とを備え、蓋１２には、外部から所定の物質を注入または排出するための孔１２ａ〜１２ｃが開口されるとともに、この蓋１２の表面には、画像処理により孔１２ａ〜１２ｃの位置を算出するための指標１３が形成されている。この培養容器１０の上面を撮像装置５０により撮像し、撮像された指標１３の画像に基づき孔１２ａ〜１２ｃの位置を算出し、算出された孔１２ａ〜１２ｃの位置に基づき容器１０内にノズル６５〜６７の先端を挿入する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞を培養する培養容器および自動培養装置に関する。

細胞を培養する培養容器に位置決め機構を設け、ウェル内に培養容器を位置決めして支持するようにしたものが知られている（例えば特許文献１参照）。

特開平６−２３７７５８号公報

しかしながら、位置決め機構には多少のがたつきがあるため、単に位置決め機構を設けただけでは培養容器の位置を精度良く特定することができず、細胞を自動的に培養することが困難である。

本発明による培養容器は、上面が開口した、細胞を培養する透明材料からなる容器本体と、外部から所定の物質を注入または排出するための孔が開口され、容器本体の上面を閉塞する透明材料からなる蓋とを備え、容器本体あるいは蓋の表面には、画像処理により孔の位置を算出するための指標が形成されていることを特徴とする。
指標は、細胞の観察範囲外に形成されることが好ましい。
容器本体の周面にねじ部を設け、蓋をねじ部に螺合することもできる。
容器本体に複数の収容部を設け、各収容部を、上面を閉塞する蓋により独立した閉塞空間としてもよい。
指標を、蓋から分離して形成される部材として構成し、蓋の表面に凹部を設け、この凹部に指標を嵌合することもできる。
また、本発明による自動培養装置は、上述した培養容器と、培養容器の上面を撮像する撮像装置と、撮像された指標の画像に基づき、孔の位置を算出する位置算出装置と、算出された孔の位置に向けて、所定の物質を注入または排出するノズル装置とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、培養容器の位置を精度良く算出することができ、細胞を自動的に培養することが可能である。

−第１の実施の形態−
図１〜図６を参照して本発明による培養容器の第１の実施の形態について説明する。
図１（ａ）は第１の実施の形態に係る培養容器の上面図、図１（ｂ）は図１（ａ）のｂ−ｂ線断面図、図１（ｃ）は培養容器の底面図である。培養容器１０は、樹脂成形により形成された容器本体１１と蓋１２とを有する。容器本体１１は、上面が開口され、底面が閉塞された略円筒形状を呈し、容器本体１１の上面を蓋１２で覆われる。容器本体１１の上部外周面にはねじ部１１ａが設けられ、このねじ部１１ａに蓋１２が螺合して容器内が閉塞される。容器内の細胞は、後述の自動培養装置（図４，５）内で培養されて観察される。この観察を可能にするため、容器本体１１の底面と蓋１２の少なくとも中央部は、透明な樹脂またはガラスにより形成されている。なお、容器本体１１の外周面には位置決め用の凸部１２ｂが設けられている。

蓋１２には、後述するノズルを挿入するための小径の孔１２ａ〜１２ｃが開口されている。これらの孔１２ａ〜１２ｃは、細胞の観察の際に邪魔にならないように蓋１２の中央部よりも外周側に寄った位置に開口されている。蓋１２の上面の孔１２ａ〜１２ｃの外周側には、略円環形状の画像処理用の黒色のパターン１３が印刷されている。パターン１３は孔１２ａ〜１２ｃの位置を示すための指標であり、パターン１３の内周部に切り欠き１３ａ〜１３ｃが設けられ、切り欠き１３ａ〜１３ｃを基準にして孔１２ａ〜１２ｃの位置が決定されている。なお、孔１２ａは培地注入用、孔１２ｂはトリプシン注入用、孔１２ｃは培地吸込用およびトリプシン吸込用の孔である。

パターン１３のある箇所とない箇所の明暗の差は顕著である。したがって、後述するように蓋１２の表面の画像を取得して画像処理することでパターン１３の形状、つまり切り欠き１３ａ〜１３ｃの位置を把握することができ、これにより孔１２ａ〜１２ｃの位置を算出することができる。なお、パターン１３を印刷するのではなく図２に示すように略リング状の成型品１４により形成することもできる。この場合、蓋１２の上面に凹部１２ｄを設けて、パターン１４を凹部１２ｄに嵌合し、接着すればよく、これにより蓋１２の上面に容易かつ精度よくパターン１４を形成することができる。

このように構成された培養容器１０はホルダ２０にセットされる。図３（ａ）はホルダ２０の平面図であり、図３（ｂ）はホルダ２０に複数（図では５個）の培養容器１０をセットした状態を示す平面図、図３（ｃ）は図３（ｂ）のｃ−ｃ線断面図である。ホルダ２０は浅い皿状の容器であり、ホルダ内にはテンプレート２１が載置され、テンプレート２１に設けられた略円形状の開口部２１ａに、各培養容器１０がそれぞれ保持されている。ホルダ２０の底面のうち、培養容器１０が収容される領域は、ホルダ２０にセットした状態で容器内の細胞を観察できるように透明な樹脂またはガラスで形成されている。

ホルダ２０の側端面には、自動培養装置のステージ上におけるホルダ２０の位置を規定するための位置決め部２０ｂが設けられている。ホルダ２０の底面にはピン２０ｃが突設され、ピン２０ｃを介してホルダ２０に対するテンプレート２１の位置が規定されている。また、容器本体１１の凸部１１ｂ（図１）に対応してテンプレート２１の開口部２１ａに凹部（不図示）が設けられ、テンプレート２１に対する容器本体１１の位置が規定されている。これにより位置決め部２０ｂ、ピン２０ｃ、および凸部１１ｂを介してステージ上の容器本体１１の位置が規定される。なお、容器本体１１に対する孔１２ａ〜１２ｃの位置は蓋１２のねじ込み量により左右され、孔１２ａ〜１２ｃの位置は容器ごとに異なっている。

以上のようにホルダ２０にセットした培養容器１０を用いて、細胞を自動的に培養する。図４、５は、それぞれ自動培養装置の全体構成を示す正面図および側面図であり、図６は、自動培養装置の制御構成を示すブロック図である。

ホルダ２０は、温度、湿度、ＣＯ２濃度等が管理されたインキュベータ３０内のストッカ３１に収納、保存され、所定の培養環境の下で細胞が培養される。ストッカ３１は複数段の棚により構成され、ストッカ内は全体が同一の培養環境に設定されている。なお、ストッカ内を各段ごとに異なる培養環境に設定することもできる。各培養容器１０には、それぞれ固有の識別番号が付与され、識別番号により培養容器１０の収納場所、すなわち培養容器１０が収容されたホルダ２０の収納場所と、そのホルダ内における培養容器１０の位置情報が管理されている。

ホルダ２０は、搬送装置によりステージ上に搬送される。搬送装置は、ホルダ２０を保持可能なアームを有する搬送用テーブル３２と、テーブル３２を水平方向および高さ方向に移動する複数の搬送用モータ３３（図６では１つにまとめて示す）とを有し、搬送用モータ３３はコントローラ４０からの指令により駆動される。コントローラ４０は種々の態様により搬送用モータ３３の動作を制御する。

例えばオペレータが操作部４１の操作により任意の培養容器１０の識別番号を入力すると、モータ３３の駆動によりテーブル３２が移動し、その識別番号の付与された培養容器１０を含むホルダ２０がストッカ３１から取り出され、ステージ上に搬送される。ステージ３５は、複数のステージ用モータ３４（図６では１つにまとめて示す）の駆動により水平方向に移動可能であり、ステージ３５の上方に撮像装置５０、照明装置５１、およびノズル装置６０が設けられている。

撮像装置５０はＣＣＤカメラであり、ＣＣＤカメラ５０は照明装置５１を支持する支柱の側壁に取り付けられている。コントローラ４０は、ステージ用モータ３４に制御信号を出力し、ステージ３５をＣＣＤカメラ５０の真下の所定の撮像位置に移動する。そして、この状態でＣＣＤカメラ５０によりホルダ２０の上面全体を撮像し、ＣＣＤカメラ５０からの信号に基づき、ホルダ２０の上面の模様、すなわち各培養容器１０の蓋１２に描かれたパターン画像１３を取得する。

コントローラ４０には、例えばＣＣＤカメラ５０の撮影画面上の原点に対応したステージ上の座標位置、および蓋１２に印刷されたパターン１３と各孔１２ａ〜１２ｃの位置との関係（例えば切り欠き１３ａ〜１３ｃを基準にした孔１２ａ〜１２ｃの相対座標）が記憶されている。これによりコントローラ４０は、ＣＣＤカメラ５０で撮像された画像に基づいてステージ上のパターン１３の座標を演算し、ステージ３５上の培養容器１０の位置情報を取得するとともに、孔１２ａ〜１２ｃの位置情報を取得する。

撮像位置での撮像が終了すると、コントローラ４０は、取得した培養容器１０の位置情報に基づきステージ用モータ３４に制御信号を出力し、培養容器１０を照明装置５１の真下の観察位置に移動する。観察位置の下方には顕微鏡５２が設置され、照明装置５１からはステージ上の培養容器１０に向けて照明光が照射される。顕微鏡５２で拡大された画像は顕微鏡用のＣＣＤカメラ５３により撮像され、モニタ５４（図６）に表示される。

この場合、蓋１２、容器本体１１の底面、およびホルダ２０の底面はそれぞれ透明な樹脂またはガラスで形成されているため、モニタ５４には培養容器内の細胞が拡大して表示される。使用者は、モニタ５４に表示された細胞状態を観察することで、培養容器内の溶液の交換、すなわち培地交換や、培養容器内の一部の細胞を取り出して他の培養容器１０へ移し換える、すなわち継代の必要があるか否かを判定する。なお、図４，５では倒立顕微鏡を示しているが、正立顕微鏡を用いることもできる。顕微鏡５２の倍率等もコントローラ４０からの信号により調整可能である。

ノズル装置６０は、照明装置５１を支持する支柱の側壁に取り付けられたガイドレール６１と、ガイドレール６１を介して昇降可能に支持されたベース部材６２と、ベース部材６２を昇降させる昇降用モータ６３と、ベース部材６２に支持されたノズル支持台６４と、ノズル支持台６４に取り付けられたノズル６５〜６７とを有する。ノズル６５〜６７は、新しい培地を注入する培地注入用ノズル６５、継代を行う際にトリプシンを注入するトリプシン注入用ノズル６６、および古い培地やトリプシンを吸い込む吸込用ノズル６７であり、これら３本のノズル６５〜６７の中から切換モータ６８の駆動によりノズルの選択を切り換え、選択したノズルのみを昇降可能となっている。

例えば培地交換を行う際、コントローラ４０は切換モータ６８の駆動により吸込用ノズル６７を選択するとともに、撮像位置で取得した孔位置情報に基づきステージ用モータ３４に制御信号を出力し、培地吸込用の孔１２ｃの位置が吸込用ノズル６７の真下にくるようにステージ３５を移動する。次いで、昇降用モータ６３に制御信号を出力して吸込用ノズル６７を下降し、吸込用ノズル６７の先端を孔１２ｃを介して培養容器内に挿入する。この状態でポンプ６９（図６）を駆動し、古い培地を廃液用タンクに吸い込む。なお、ポンプ６９は培地の吸込用および注入用を別々に備えるが、図６では１つにまとめて示す。

培地の吸込が終了すると、吸込用ノズル６７を初期位置まで上昇させた後、培地注入用ノズル６５を選択する。次いで、培地注入用の孔１２ａの位置が培地注入用ノズル６５の真下にくるようにステージ３５を移動した後、培地注入用ノズル６５を下降してノズル６５の先端を培養容器内に挿入する。この状態で、ポンプ６９を駆動し、培地貯蔵用のタンクから新しい培地を注入する。なお、培地交換を行うときは２本のノズル６５，６７を用いるが、継代を行うときは３本のノズル６５〜６７を用いる。この場合のノズル６５〜６７の選択、昇降の動作は、上述したのと同様であり、説明を省略する。

第１の実施の形態によれば以下のような作用効果を奏することができる。
（１）培養容器１０の蓋１２にノズル６５〜６７を差し込むための孔１２ａ〜１２ｃを開口するとともに、この孔位置に対応付けて蓋１２の上面に所定形状のパターン１３を印刷するようにした。これにより画像処理によりパターン形状を把握することで、孔位置を正確に算出することができ、細胞を容易に自動培養することができる。
（２）培養容器１０の蓋１２、容器本体１１の底面、およびホルダ２０の底面をそれぞれ透明な樹脂等により形成し、顕微鏡５２で拡大して得られた画像をモニタ５４に表示するようにしたので、インキュベータ３０内から培養容器１０を取り出さなくても、細胞の状態を観察することができる。
（３）パターン１３を蓋１２の外周部近傍に印刷するとともに、パターン１３の近傍にノズル挿入用の孔１２ａ〜１２ｃを開口したので、容器中央部の細胞を支障なく観察することができる。
（４）容器本体１１に蓋１２を螺合するので、ステージ３５を移動する際に容器本体１１から蓋１２がすれることがなく、孔１２ａ〜１２ｃに精度よくノズル６５〜６７を挿入することができる。
（５）培地交換や継代の際に容器本体１１から蓋１２を外す必要がなく、培養容器内への異物の混入を防ぐことができる。

−第２の実施の形態−
図７〜図９を参照して本発明による培養容器の第２の実施の形態について説明する。
第１の実施の形態では、略円筒形状の複数の培養容器１０をテンプレート２１を介してホルダ２０内に収容したが、第２の実施の形態では、ウェルプレートにより培養容器を構成する。なお、図１〜図６と同一の箇所には同一の符号を付し、以下では第１の実施の形態との相違点を主に説明する。

図７（ａ）は、第２の実施の形態に係る培養容器、すなわちウェルプレート７０の構成を示す平面図であり、図７（ｂ）は、図７（ａ）のｂ−ｂ線断面図である。なお、図７（ａ）はウェルプレート７０の容器本体７１とテンプレート８１を、図７（ｂ）は容器本体７１と蓋７２とテンプレート８１を示している。略矩形状の容器本体７１には、仕切壁７１ａにより複数（図では１２個）の収容部７０ａが形成され、各収容部７０ａの上面を覆うように容器本体７１に蓋７２が被されている。容器本体７１と蓋７２の側端部には溝７１ｂ，７２ｂが設けられ、この溝７１ｂ，７２ｂに係合したバンド７４により、蓋７２が容器本体７１に固定され、各収容部７０ａはそれぞれ独立した空間とされている。

図８は、容器本体７１に蓋７２を取り付けた状態を示す平面図である。蓋７２の表面および容器本体７１の底面は、収容部７０ａ内の細胞を顕微鏡で観察できるように全体が透明な樹脂またはガラスにより形成されている。蓋７１には、各収容部７０ａごとにそれぞれノズル挿入用の孔７２ａ〜７２ｃが開口され、蓋７１の上面には、孔位置の指標となるパターン７３が形成されている。図では、パターン７３は略十字形状であり、例えば十字の交差する点を基準にした各孔７２ａ〜７２ｃの相対座標が予め記憶されている。なお、細胞の観察の邪魔にならないように、パターン７３は収容部７０ａを避けて形成されている。

図９（ａ）はウェルプレート７０をテンプレート８１を介してホルダ２０にセットした状態を示す平面図であり、図９（ｂ）は図９（ａ）のｂ−ｂ線断面図である。テンプレート８１ａには略矩形状の開口部８１ａが設けられ、この開口部８１ａにウェルプレート７０が嵌合している。これによりウェルプレート７０の蓋７２は、ピン２０ｃおよび開口部８１ａを介してホルダ２０に対して位置決めされている。ウェルプレート７０が収容されたホルダ２０は、自動培養装置のインキュベータ３０内に収容される。そして、第１の実施の形態と同様、蓋７２のパターン７３をＣＣＤカメラ５０で撮像し、このＣＣＤカメラ５０からの信号に基づき収容部７０ａの位置および孔７２ａ〜７２ｃの位置情報を取得した後、必要に応じて培地交換や継代が行われる。

このように第２の実施の形態では、ウェルプレート７０の蓋７２に孔位置の基準となるパターン７３を形成するようにしたので、第１の実施の形態と同様、画像処理により蓋７２の孔位置を算出することができ、細胞の自動培養化が可能である。複数の収容部７０ａの上面を蓋７２によって一度に覆うことができ、効率がよい。バンド７４を介して蓋７２を容器本体７１に固定するので、蓋７２の着脱も容易である。蓋７２がねじ込み式でないため、図９に示すように蓋７２に孔７２ａ〜７２ｃを規則的に配列することができ、パターン形状を簡素化できる。

なお、蓋７２に設けた複数の孔７２ａ〜７２ｃの中から予め基準の孔を設定するとともに、この孔を基準にした他の孔の相対座標を記憶しておき、基準の孔の位置をパターン７３の画像から求め、この基準の孔の位置と予め記憶した基準の孔からの相対座標とにより、他の孔の位置を算出することもできる。これによれば基準の孔位置さえ画像処理によってわかればよいので、蓋全体を撮影する必要がない。

上記実施の形態では、培養容器１０の蓋１２あるいはウェルプレート７０の各収容部７０ａの上面の蓋７２に、それぞれ３カ所の孔１２ａ〜１２ｃ，７２ａ〜７２ｃを開口するようにしたが、図９に示すように１カ所だけ開口したのでもよい。この場合、選択されたノズル６５〜６７に応じてステージ３５を移動し、１つの孔１２ａ，７２ａに全てのノズル６５〜６７を挿入可能とすればよい。

上記実施の形態では、ホルダ２０に対して培養容器１０，７０の位置決めをするようにしたが、ＣＣＤカメラにより孔１２ａ〜１２ｃ，７２ａ〜７２ｃの位置を算出できるため、位置決め機構はなくてもよい。第１の実施の形態では、容器本体１１に蓋１２を螺合するようにしたが、蓋１２の固定方法はこれに限らない。孔位置を算出するための指標であるパターン１３，７３の形状は上述したものに限らない。培養容器１０，７０の上面を撮像する撮像装置としてＣＣＤカメラ５０を用いたが、他の撮像装置を用いることもできる。撮像された指標の画像に基づき孔位置を算出するのであれば、コントローラ４０における処理は如何なるものでもよい。なお、容器のパターン１３に対し細胞の位置を記憶させることもでき、これにより特定の細胞を継続的に観察することが可能になり、細胞の生育過程が記録できる。

本発明は、培養容器内に培地、トリプシン以外の種々の物質を注入または排出するものにも同様に適用できる。したがって、ノズル装置６０も上述したものに限らない。すなわち、本発明の特徴、機能を実現できる限り、本発明は実施の形態の培養容器に限定されない。なお、以上の説明はあくまで一例であり、発明を解釈する際、上記実施形態の記載事項と特許請求の範囲の記載事項の対応関係になんら限定も拘束もされない。

（ａ）は第１の実施の形態に係る培養容器の上面図、（ｂ）は図１（ａ）のｂ−ｂ線断面図、（ｃ）は底面図。 図１の変形例を示す図。 （ａ）は第１の実施の形態に係るホルダの平面図、（ｂ）はホルダに培養容器をセットした状態を示す平面図、（ｃ）は図３（ｂ）のｃ−ｃ線断面図。 第１の実施の形態に係る自動培養装置の全体構成を示す正面図。 第１の実施の形態に係る自動培養装置の全体構成を示す側面図。 第１の実施の形態に係る自動培養装置の制御構成を示すブロック図。 （ａ）は第２の実施の形態に係る培養容器の平面図（蓋を外した状態）、（ｂ）は図７（ａ）のｂ−ｂ線断面図。 第２の実施の形態に係る培養容器の平面図（蓋を付けた状態）。 （ａ）は図８の培養容器をホルダにセットした平面図、（ｂ）は図９（ａ）のｂ−ｂ線断面図。 本発明の変形例を示す図。

符号の説明

１０ 細胞容器
１１ 容器本体
１１ａ ねじ部
１２ 蓋
１２ａ〜１２ｃ 孔
１３ パターン
１４ 成型品
４０ コントローラ
５０ ＣＣＤカメラ
６０ ノズル装置
７０ ウェルプレート
７０ａ 収容部
７１ 容器本体
７２ 蓋
７２ａ〜７２ｃ 孔
７３ パターン

Claims (6)

1. 上面が開口した、細胞を培養する透明材料からなる容器本体と、
   外部から所定の物質を注入または排出するための孔が開口され、前記容器本体の上面を閉塞する透明材料からなる蓋とを備え、
   前記容器本体あるいは前記蓋の表面には、画像処理により前記孔の位置を算出するための指標が形成されていることを特徴とする培養容器。
2. 請求項１に記載の培養容器において、
   前記指標は、細胞の観察範囲外に形成されることを特徴とする培養容器。
3. 請求項１または２に記載の培養容器において、
   前記容器本体の周面にはねじ部が設けられ、前記蓋は前記ねじ部に螺合されることを特徴とする培養容器。
4. 請求項１または２に記載の培養容器において、
   前記容器本体には複数の収容部が設けられ、前記各収容部は、上面を閉塞する蓋により独立した閉塞空間とされることを特徴とする培養容器。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養容器において、
   前記指標は、前記蓋から分離して形成される部材であり、前記蓋の表面に凹部が設けられ、この凹部に前記指標が嵌合されることを特徴とする培養容器。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養容器と、
   前記培養容器の上面を撮像する撮像装置と、
   前記撮像された指標の画像に基づき、前記孔の位置を算出する位置算出装置と、
   前記算出された孔の位置に向けて、所定の物質を注入または排出するノズル装置とを備えることを特徴とする自動培養装置。

Images