JP7377842B2 - 胚培養用ディッシュ - Google Patents

Description

本開示は、胚培養に用いられるディッシュおよびこのディッシュを用いた染色体解析用胚培養液の採取方法に関する。

不妊治療に対する社会的要請が高まっており、受精処置された処置卵や胚（以下、総称して胚という）を培養する技術およびこれに伴う検査などの手法が種々提案されている（例えば特許文献１）。特に近年、培養中の胚の染色体解析のニーズが高まっており、胚を培養している培養液中に存在する胚から遊離したＤＮＡを解析し、胚の染色体異数性などを解析する手法も提案されてる。こうした検査には、所定量の培養液が必要となる。現状では、数μｌから数十μｌ程度の培養液を吸い上げて検査に用いる。

特表２０１４－５０７６６４号公報

しかしながら、近年、胚培養装置で一度に培養する胚の数を増やしており、一つのディッシュに設けられた複数、例えば５×５＝２５個のマイクロウエルのそれぞれに胚を収容して、培養することが行なわれており、こうしたマイクロウエルでは検査に必要な量の培養液を吸い上げることができない。人の卵子の場合、その直径は１５０－２００μｍ程度あるため、例えば直径が３００μｍ程度のマイクロウエルでは、吸い上げ可能な培養液は僅かしかない。この状態で、必要量の培養液を吸い上げると胚の培養環境が大きく変化してしまう可能性があり、好ましくない。また、胚を収容するウエルの容量を単に大きくしたのでは、隣接するウエルとの距離が遠くなり、種々の課題を生じ得る。例えば、培養中の胚を撮影するタイムラプス機能を搭載した胚培養装置では、一度に撮像できるウエルの数が減り、撮影装置の構造が複雑化する懸念がある。また、ウエル間で胚の移し替えをする距離が大きくなり、移し替えの際のミスを誘発する可能性なども高まってしまう。

本開示は、以下の形態又は適用例として実現することが可能である。本開示の一つの態様は、胚を培養液と共に収容する複数個のウエルを備える胚培養用ディッシュとしての態様である。この胚培養用ディッシュは、前記複数個のウエルに、それぞれ前記胚を収容可能な単一のマイクロウエルを備え、前記複数個のウエルは、当該胚培養用ディッシュの底部に、隣接かつ独立して配置して配列され、前記複数個のウエルの各々に、前記ウエルと共に前記培養液を保持可能な凹部を対応付けて前記底部に形成し、前記ウエルと前記凹部との間に、前記培養液の流通は許可し、前記胚の移動は阻害する移動阻害部を設け、前記移動阻害部と、前記ウエルに前記移動阻害部を介して接続された前記凹部とは、前記ウエルの配列方向と交差する方向に配列され、前記ウエルとともに、前記ウエル毎に独立した収容部を構成し、前記収容部は、当該胚培養用ディッシュを水平にした状態で、前記凹部内の前記培養液を全て吸い上げても、前記マイクロウエル内には、前記胚が浸かる高さまで前記培養液が残る形状とされた。

かかる胚培養用ディッシュによれば、複数のウエルが隣接しているので、これを胚培養装置などに使用すると、複数のウエル間の距離が短く、取り扱いが容易である上、胚の染色体の異数性検査のために培養液を吸い上げる処理を、培養中の胚への影響を抑制して、行なうことができる。複数のウエル間の距離が短ければ、ウエル内の胚の移動が容易となり、また移し替え時のミスを低減できる。更に、タイムラプス胚培養装置に使用すれば、複数のウエルを一度に撮像することが可能となる。このため、胚に対する非侵襲の染色体の異数性検査が容易となり、また検査対象の胚に影響を与えることもほとんどなく、異数性検査の結果を踏まえた胚移植の成功率（患者の妊娠率）を高めることも期待できる。

第１実施形態としての胚培養装置の平面図。 培養室内に配置された胚培養用ディッシュを例示する平面図。 図２におけるＩＩＩ－ＩＩＩ矢視図。 胚培養装置の電気的な構成を示す説明図。 胚培養用ディッシュにおける第１収容部第１収容部と第２収容部の配置の一例を示す平面図。 図５におけるＶＩ－ＶＩ矢視図。 第１収容部第１収容部と第２収容部に培養液が満たされた状態を示す説明図。 第１収容部第１収容部と第２収容部の培養液を吸い出した状態を示す説明図。 染色体解析用胚培養液の採取・検査処理の内容を示す工程図。 染色体の異数性検出器の表示画面の一例を示す説明図。 第２実施形態の胚培養用ディッシュの形状を示す平面図。 第２実施形態の胚培養用ディッシュの変形例を示す平面図。 第１収容部第１収容部と第２収容部の他の実施形態を示す説明図。 胚の培養・保存・移植処理の概要を示す工程図。 胚培養用ディッシュを手で持つ場合の状態を示す説明図。

Ａ．第１実施形態：
（Ａ－１）ハードウェア構成：
図１は、胚培養装置（インキュベータとも呼ぶ）１０の平面図、図２は、胚培養装置１０の１つの培養室内に配置された胚培養用ディッシュを模式的に示す説明図、である。この胚培養装置１０は、体外受精の処置がなされた卵子（以下、処置卵という）を一定期間、所定の培養環境、即ち恒温・恒湿度で培養するためのものである。処置卵は、必ずしも受精卵とは限らないため、胚培養装置１０において所定の期間培養される。なお、体外受精の処置は顕微鏡下で行なわれる顕微授精の場合もあれば、卵子と精子を所定の容器内で一緒にして行なわれる通常の体外受精の場合も有り得る。培養する処置卵の受精の手法は問わない。

この胚培養装置１０は、図１に示したように、胚培養を行なう合計９個の培養ユニットを備え、下段に培養ユニット１１～１５の５つ、上段に培養ユニット２１～２４の４つ、配列している。以下、培養ユニットに関連する部材については、まとめて呼ぶ場合は、培養ユニット１１～２４のように表記する。もとより、培養ユニットの数は問わない。各培養ユニット１１～２４は、培養室Ｒ１１～Ｒ２４と、各培養室Ｒ１１～Ｒ２４のそれぞれを密閉する蓋部１７と、スイッチＳＷ１１～ＳＷ２４とを備える。スイッチＳＷ１１～ＳＷ２４を操作することで、対応する培養ユニット１１～２４の蓋部１７が、図示しない駆動機構によって開閉される。もとより、培養ユニット１１～２４は、手動で開け閉めする構造であっても差し支えない。蓋部１７の培養室Ｒ１１～Ｒ２４側には、シリコンゴムのシール部が設けられており、蓋部１７が閉まると、培養室Ｒ１１～Ｒ２４内は、このシール部により、気密状態に保たれる。

胚培養装置１０には、外部のガスボンベから二酸化炭素ガス（ＣＯ_２ ）と窒素ガス（Ｎ_２ ）とが供給される。これらのガスが供給されガスポート１８，１９が、胚培養装置１０の背面に設けられている。また、胚培養装置１０の背面にはフィルタ２７が取り付けられるフィルタポート２８，２９も設けられている。このフィルタ２７は、図示しない内蔵ポンプにより取り込む外気中の塵などの異物を取り除くためのものである。胚培養装置１０内では、ガスポート１８、１９から入力した二酸化炭素ガスＣＯ_２ 、窒素ガスＮ_２ 、およびフィルタ２７を介して入力した空気を、所定の割合に混合して混合気を生成する。混合気における各ガスの割合は、図示しないセンサにより測定され、常時おなじ割合に保たれる。

ケース本体２０には、表面にディスプレイ７０が設けられている。ディスプレイ７０の表面はタッチパネルになっており、表示されたボタンなどをタップすることにより、種々の情報を表示させることができる。また、ケース本体２０には、ＵＳＢ－Ｃやサンダーボルト（登録商標）などの汎用コネクタ２６が設けられており、ここにキーボードなどの入力機器やマウスなどのポインティングデバイスなどを接続することにより、様々な情報を入力することも可能である。ディスプレイ７０における表示例や汎用コネクタ２６に他の機器を接続する場合については、後で説明する。

図２は、培養ユニット１１において、蓋部１７が開かれた状態を示している。各培養ユニット１１～２４には、培養室Ｒ１１～Ｒ２４が用意されている。各培養室Ｒ１１～Ｒ２４の構造は同一なので、以下、培養ユニット１１の培養室Ｒ１１を例に挙げて説明する。培養室Ｒ１１には、ディッシュ１９１を載置する保持枠１８０が設けられている。培養室Ｒ１１～２４の底面には、供給口４３と排気口４４とが設けられている。供給口４３は、混合気を培養室Ｒ１１に供給するための開口である。また排気口４４は、混合気を還流するための開口である。排気口４４は、保持枠１８０に覆われる位置に設けられている。既述したように、培養室Ｒ１１は、蓋部１７が閉じられるとほぼ気密にされるので、内部のガス環境は一定に保たれるが、培養室Ｒ１１内の温度分布を一様なものにするために、混合気は供給口４３から供給され、排気口４４から排気される。

培養室Ｒ１１には、その側壁および底面に、図示しないパネルヒータが設けられている。パネルヒータにより、培養室Ｒ１１内は一定の温度に保たれる。なお、説明は省略するが、培養室Ｒ１１～Ｒ２４には、ヒータの他、図示しない温度センサやガス濃度センサ、更には湿度センサなどが設けられており、培養室Ｒ１１内の温度、ガス濃度、湿度を検出することができる。これらのセンサからの信号をフィードバックすることにより、結果的に、培養室Ｒ１１内は、恒温・恒湿度に保たれ、かつそのガス濃度も一定に保たれる。なお、培養室Ｒ１１内の温度等を検出する代わりに、供給口４３から供給される混合気の温度、湿度、ガス濃度などを一定に保つことで、培養室Ｒ１１内の環境を一定に保つものとしても良い。

培養室Ｒ１１の保持枠１８０は、胚が収容されたディッシュ１９１が配置される。図２に示したディッシュ１９１は、外周壁１９４に取り囲まれた略長方形状をしており、更に底部１９６の中心部に、壁１９２で取り囲まれて、胚を収容する収容部２００を５個×２列、合計１０個備える。収容部２００の詳細な構成は、後述する。ディッシュ１９１の外周壁１９４の一箇所には、凹所１９７が設けられており、この凹所１９７を保持枠１８０に設けられた凸部１８２に合わせて、ディッシュ１９１を保持枠１８０にセットすることで、ディッシュ１９１を正しい位置に配置できる。ここで、正しい位置とは、収容部２００に設けられた後述するマイクロウエル１９５を撮像する適切な位置という意味である。

ディッシュ１９１を底部１９６の側から撮像する構成について、図２のＩＩＩ－ＩＩＩ矢視図である図３を用いて説明する。図において、符号Ｈ１１は、培養室Ｒ１１を形成している一続きの側壁および底部を示している。図示するように、ディッシュ１９１の直上には、蓋部１７の内側に設けられた照明ユニット１７０が配置される。また、培養室Ｒ１１の底部Ｈ１１には、ディッシュ１９１の中心部に対応する位置の直下に、開口１９８が設けられ、ケース本体２０に取り付けられたカメラモジュール５１およびレンズモジュール５２が配置される。ディッシュ１９１は、蓋部１７に設けられた照明ユニット１７０により照光され、収容部２００に収容された胚２５は、カメラモジュール５１により撮像される。なお、図示するように、収容部２００には、培養液ＣＳが満たされており、胚２５は、この培養液ＣＳに浸されている。更にこの状態で、壁１９２に囲まれた領域には、培養液ＣＳの蒸発を防ぐためにミネラルオイルＯＬが流し込まれ、収容部２００を覆っている。

次に、胚培養装置１０において行なわれる処理について説明する。図４は、胚培養装置１０の電気的な構成を示す説明図である。図示する様に、胚培養装置１０には、制御部６０が設けられている。制御部６０は、周知のＣＰＵ６１、ＲＯＭ６２、ＲＡＭ６３の他、メモリカード６５とのデータのやり取りを行なうためのメモリインタフェース６４、外部の機器との信号をやり取りする汎用Ｉ／Ｏインタフェース６６、培養室Ｒ１１～Ｒ２４内の環境を制御するための信号をやり取りする培養室インタフェース６７、カメラモジュール５１との間で撮像指示や撮像された画像の取得などを行なうカメラインタフェース６８，ディスプレイ７０に画像を表示するビデオインタフェース（ビデオＩ／Ｆと略記）６９等を備える。

ＣＰＵ６１は、後述する画像に基づく受精判定などを高速に処理するＤＳＰとしての機能や、ニューラルネットワーク等による判定処理を行なうためのベクトル演算機能などを内蔵する高速プロセッサを用いた。ＲＯＭ６２には、後述するタイムラプス制御処理を含む胚培養装置１０における処理を実現するプログラムが格納されている。ＣＰＵ６１は、ＲＯＭ６２からこうしたプログラムを適宜読み出してＲＡＭ６３に展開して実行することにより、必要な処理や制御を実現する。メモリカード６５には、カメラモジュール５１により撮像された画像の他、各培養室Ｒ１１～Ｒ２４の温度など、培養環境に関する情報が記録される。メモリカード６５に代えて、ハードディスクなどの磁気記憶媒体やＳＳＤなどの半導体記憶媒体などを用いてもよい。また、ネットワークを介して接続された、いわゆるクラウドに保存するものとしてもよい。

ディスプレイ７０は、表面にタッチパネルが併設されており、ディスプレイ７０に触れることで、ディスプレイ７０に表示されたボタンなどを選択できる。ディスプレイ７０は、本実施形態では、胚培養装置１０と一体に設けられているが、胚培養装置１０とは別体に設け、有線または無線により接続するものとしてもよい。あるいは、ネットワーク等を介して、胚培養装置１０とコンピュータとを接続し、コンピュータのディスプレイをディスプレイ７０として利用してもよい。あるいは、携帯電話やタブレットなどの携行性の高い端末をディスプレイ７０として用いてもよい。

汎用Ｉ／Ｏインタフェース６６は、胚培養装置１０に設けられたスイッチＳＷ１１～ＳＷ２４や、蓋部１７の開閉を行なう駆動装置７１、警告音を発生する警告装置７２、混合気を調整する混合気調整装置７３等に接続されている。混合気調整装置７３は、ガスポート１８，１９に供給される二酸化炭素ガスや窒素ガスなどの圧力を調整する圧力調整弁や、フィルタ２７を介して大気を取り込むためのポンプや、培養室Ｒ１１～Ｒ２４に混合気を送り込むポンプなどを含む。培養室インタフェース６７には、各培養室Ｒ１１～Ｒ２４に設けられたパネルヒータや、混合気の供給量を制御する制御弁Ｖ１１～Ｖ２４などが接続されている。制御弁Ｖ１１～Ｖ２４は、混合気を供給する混合気供給配管８４から培養室Ｒ１１～Ｒ２４に至る配管に設けられている。

汎用Ｉ／Ｏインタフェース６６には、汎用コネクタ２６を介してコンピュータ（以下、ＰＣと略記する）９０が接続されている。ＰＣ９０は、ディスプレイ９１や図示しないキーボードなどに加えて、回転型のコントロールデバイス９５を備える。コントロールデバイス９５は、略円形のベース部９７上に、これにより小径のダイヤル９６を備え、ダイヤル９６を左右に回転することにより、ディスプレイ９１に表示された多数のタイムラプス画像を時系列的に前後に移動して表示するといった使い方が可能である。こうしたデバイスは、回転型セレクタとも呼ばれる。ダイヤル９６は、左右に回転するだけでなく、押し込むことができ、現在表示されている画像の１つを選択する際に、マウスボタンによる操作と同様に「決定」の操作を実現する。もとより、ベース部９７に、専用のボタンを設けて、決定や選択の操作を割り当てるようにしてもよい。タイムラプス画像は、例えば１０分おきに２４時間撮像すれば、１つの胚毎に６×２４＝１４４枚になる。こうした多数枚の画像を素早く参照して、受精の判断の確認などを行なう際、こうした回転型のポインティングデバイスは有用である。

（Ａ－２）ディッシュの詳細：
図５は、ディッシュ１９１のうち、壁１９２に囲まれた部位の拡大図であり、図６は、図５におけるＶＩ－ＶＩ断面図である。図示するように、壁１９２に囲まれた略長方形状の範囲には、５個×２列の収容部２００が、図示上下対称に配列されている。１０個の収容部２００の外側、壁１９２の近くには、洗浄用の培養液ＣＳを配置するドロップ配置部１８６が複数設けられている。ドロップ配置部１８６は、底部１９６上は単に培養液ＣＳのドロップを置くだけでもよいが、底部１９６に凹みを設けたり、親水性領域を設けたりして、培養液ＣＳが配置されやすいようにしてもよい。

各収容部２００は、図示するように、ほぼ円形の第１収容部２１０と、高さ方向に長い台形形状の第２収容部２２０とを、連接した形状に形成されている。この第１収容部２１０がウエルに相当し、第２収容部２２０が凹部に相当する。第１収容部２１０の中央には、胚２５より大径のマイクロウエル１９５が更に形成されている。このため、１０個のマイクロウエル１９５は、近接して配置されることになり、ディッシュ１９１の下方に配置されたカメラモジュール５１の一撮像エリアＰＡに収まっている。つまり、１回の撮像で、全てのマイクロウエル１９５の存在領域を撮影することができ、マイクロウエル１９５に胚２５が収容されていれば、その状態を一度に撮像できる。撮影した画像は、それぞれの胚２５の画像に分割してメモリカード６５などに保存される。

第１収容部２１０と第２収容部２２０とは、図６に示したように、接続部分を介して連接している。この部位が、通路部分である。その通路部分には、移動阻害部として、第２収容部２２０の底面より僅かに高い間仕切部２３０が形成されている。この間仕切部２３０は、連接部の幅方向両側から中心部に向けてせり出すように設けられ、両側からせり出した間仕切部２３０は、連接部の中央、つまりＶＩ－ＶＩ切断線が通過している位置で、僅かの隙間を残して対向している。この隙間は、胚２５の想定される最小径より小さく、本実施形態では、約５０μｍである。このため、マイクロウエル１９５に収容された胚２５は、各収容部２００に培養液ＣＳを満たしても、培養液ＣＳの動きなどにより、第２収容部２２０側に移動することがない。

収容部２００への培養液ＣＳの充填と吸引について説明する。図７は、収容部２００にピペット２４０を用いて培養液ＣＳを充填する様子を示している。培養液ＣＳは、収容部２００の上限近くまで充填する。収容部２００の容積は予め定められており、本実施形態では、後で説明する吸引する培養液の容量を３０μｌとしている関係で、収容部２００の容積を約５０μｌとしているで、ピペット２４０に４０μｌの培養液ＣＳを吸ってから、収容部２００にこれを移せばよい。もとより、吸引する培養液の容量が更に小さくなれば、収容部２００の容積もこれに合わせて設定すればよい。その後、ミネラルオイルＯＬにより培養液ＣＳを覆ってから、ガラスキャピラリを、マイクロウエル１９５上部に配置し、マイクロウエル１９５内部に胚２５を配置する。

本実施形態では、胚２５の培養を継続した後、収容部２００の培養液ＣＳを吸引して、染色体の異数性検出を行なう。その場合には、図８に示すように、ピペット２４０を用いて、培養液ＣＳを収容部２００から吸い上げる。図８では、第２収容部２２０の底にまだ培養液ＣＳが残っているが、実際には、間仕切部２３０の隙間を介して、第１収容部２１０と第２収容部２２０とは連通しているので、第２収容部２２０の培養液ＣＳを全て吸い上げると、第１収容部２１０内の培養液ＣＳの水位は、第２収容部２２０の底部と一致する。この状態でも、胚２５は、培養液ＣＳに浸かった状態となっている。また、第１収容部２１０内の培養液ＣＳが、ピペット２４０の吸い上げに伴って、第２収容部２２０に移動しても、間仕切部２３０間の隙間は、胚２５の径に対して十分に狭いので、培養液ＣＳの流れによって、胚２５がマイクロウエル１９５から第２収容部２２０へと流出することはない。

（Ａ－３）胚の培養・検査：
次に、このディッシュ１９１を用いて培養する胚の検査について説明する。図９は、染色体解析用胚培養液の採取・検査処理ルーチンを示すフローチャートである。本実施形態では、受精処置した処置卵を、胚培養装置１０により培養するが、培養の途中で、培養中の胚の染色体の異数性検査を行なう。この検査は、着床前染色体異数性検査（ＰＧＴ－Ａ）と呼ばれる。着床前染色体異数性検査は、培養中の胚盤胞などの胚生検、つまり胚盤胞の栄養外胚葉から６～１０個程度の細胞を採取して行なわれることが多いが、本実施形態では、胚が浸されていた培養液を用いる。培養液には、培養中の胚から遊離したＤＮＡが存在し、これを遺伝子シーケンサにかけることで、染色体の異数性検査を行なうことができる。

この処理を開始すると、まずディッシュ１９１に設けられた１０個の収容部２００の一つ一つに４０μｌの培養液を充填する（ステップＳ３００）。培養液ＣＳとしては、本実施形態では、フェノールレッドを添加したシングルメディウム（one-step型培養液）を用いた。収容部２００は、容積が５０μｌとされているので４０μｌの培養液ＣＳを充填しても、培養液ＣＳが収容部２００から溢れることはない。１０個全ての収容部２００に培養液ＣＳを充填した後、ミネラルオイルＯＬを壁１９２の内側に充填し、培養液ＣＳが充填された各収容部２００をミネラルオイルＯＬで覆う（ステップＳ３１０）。

この状態で、次に、各収容部２００のマイクロウエル１９５に胚２５を収容する（ステップＳ３２０）。このとき、必要があれば、培養液ＣＳ内に存在する気泡を除去する処置を行なう。一つのマイクロウエル１９５に一つの胚２５を収容し、これを全てのマイクロウエル１９５について完了するまで繰り返す（ステップＳ３２５）。

全てのマイクロウエル１９５に胚２５を収容すると、次にこのディッシュ１９１を胚培養装置１０の培養ユニット１１～２４の培養室Ｒ１１～Ｒ２４のいずれかにセットする（ステップＳ３３０）。具体的には、いずれかの培養室の蓋部１７を開けて、保持枠１８０に合わせて、ディッシュ１９１を配置する。その上で、蓋部１７を閉めて、培養を開始する。

胚培養装置１０は、既に説明したように、培養室Ｒ１１内の環境を、培養に適した状態に保ち、ディッシュ１９１を下から撮影するカメラモジュール５１により、所定のインターバルでディッシュ１９１の各収容部２００のマイクロウエル１９５に収容された胚２５を撮像しながら、胚を培養するタイムラプス培養処理（ステップＳ３４０）を行なう。このタイムラプス培養処理は、所定時間として定めた培養開始から７２時間経過後まで継続される（ステップＳ３４５）。

培養開始から７２時間が経過すると、蓋部１７を開けて、ディッシュ１９１を培養室Ｒ１１から取り出し（ステップＳ３５０）、各収容部２００から培養液ＣＳを吸い上げる処理を行なう（ステップＳ３６０）。具体的には、図８に示したように、ピペット２４０の先端を、各収容部２００が充填された第２収容部２２０に差し入れ、培養液ＣＳを吸い上げる。このとき、第２収容部２２０内の培養液ＣＳを全て吸い上げる。第２収容部２２０内の培養液ＣＳを全て吸い上げると、これに連通する第１収容部２１０内の培養液ＣＳも吸い出されるが、第１収容部２１０の底部のマイクロウエル１９５は第２収容部２２０の底部より深い位置に設けられているので、マイクロウエル１９５内の培養液ＣＳは吸い出されない。このため、第２収容部２２０にピペット２４０を挿入して、第２収容部２２０内の培養液ＣＳを全て吸い出しても、胚２５は、なお培養液ＣＳに浸された状態に維持される。なお、ピペット２４０により培養液ＣＳを吸い出すとき、培養液ＣＳの分量が３０μｌとなるように、計測しながら培養液ＣＳを吸い出してもよい。吸い出した培養液ＣＳは、個別に、後述する遺伝子シーケンサの解析用試料ケースに入れられる。

マイクロウエル１９５に残った胚２５は、新たな培養液ＣＳを第２収容部２２０から充填して、更に培養を継続してもよいし、一旦、マイクロウエル１９５から取り出し、移植に備えて冷凍保存してもよい。上記の例では、培養開始から７２時間後に培養液ＣＳを吸い上げたが、胚培養装置１０がタイムラプス胚培養装置であることの利点を生かして、胚の観察を継続し、胚盤胞の完成を俟って、培養液ＣＳを吸い上げるようにしてもよい。この場合、培養開始から約１２０時間前後になることが多い。なお、胚盤胞の完成は、撮影した画像を、予め教師付きの機械学習を行なったＡＩにより判断させればよい。

こうした処理を、一つのディッシュ１９１の全ての収容部２００について繰り返し、収容部２００の全てから、培養液ＣＳを吸い出して、解析用試料ケースに移し替えると（ステップＳ３６５）、解析用試料ケースを遺伝子シーケンサにセットし、遺伝子シーケンサによる異数性検査を行なう（ステップＳ３７０）。本実施形態では、遺伝子シーケンサとして、Illumina, Inc社製、「MiSeq 」を用いた。以上で「ＥＮＤ」に抜けて、本処理ルーチンを終了する。

解析用試料ケースに入れられた培養液ＣＳには、培養中の胚から遊離したＤＮＡの断片が含まれる。ＤＮＡの断片は、もともと２３対の遺伝子から分離したものであり、元の遺伝子の情報を含んでいる。このため、解析用試料ケースに含まれる培養液を、ヒトの正常な遺伝子のサンプルを用いて調製したテンプレートを半導体チップにセットしたＮＧＳ法が利用できるシーケンサ（いわゆる次世代型シーケンサ）で分析すると、２３対の遺伝子に対して、過不足分を容易に解説できる。こうした次世代型シーケンサとしては、例えばIiiumina, Inc 社製、「NextSeq550」やIon Torrent社製、「Ion GneStudio GX5 」等も利用可能である。

図１０に、解析の結果の一例を示す。図示するように、解析器としての次世代型シーケンサ３００には、解析用試料ケースを収容する収容部３１０や、テンプレート調製などの作業や解析の開始などを指示する操作部３２０、解析結果を表示する表示部３３０などが設けられている。テンプレート調製などの準備を済ませた次世代型シーケンサ３００の収容部３１０に、各胚２５を培養していた培養液ＣＳをそれぞれ移した解析用試料ケースをセットして、解析の開始を指示すると、数時間から十数時間後には、図１０に例示するように、培養液ＣＳに含まれていた遺伝子の数が表示される。

図示した例では、１０番目の遺伝子対が、２個ではなく、３個見つかっており、１０番目の染色体が過剰であること、つまり解析対象となった胚には染色体異数性があることが分かる。この解析結果を利用して、胚培養装置１０で培養中の胚のうち、異数性が見いだされなかった胚を、患者への移植に用いることで、不妊治療の治療、つまり妊娠率を高めることができる。染色体に異数性がある胚の場合、移植しても着床しないか、着床しても妊娠初期の流産の可能性が高いことが知られているからである。しかも、この方法では、胚２５に対して非侵襲で検査を行なうことができる。胚盤胞から栄養外胚葉（Trophectderm: TE）の細胞を数個取り出して、染色体の異数性検査を行なう方法と比べて、胚への影響が小さく、しかも胚２５は培養液ＣＳに浸かった状態にまま、異数性解析ができるので、胚に対する影響を極力小さくできる。

以上説明したように、本実施形態のディッシュ１９１によれば、胚２５を培養していた培養液ＣＳを用いた異数性検査を行なう際、培養液ＣＳを吸い上げても、胚２５が収容されたマイクロウエル１９５内の培養液ＣＳは確実に残るので、培養液ＣＳの吸い上げによる影響を抑えることができる。また、本実施形態のディッシュ１９１は、５個×２列のマイクロウエル１９５を近接配置しているので、マイクロウエル１９５内の胚２５の移動が容易となり、また移し替え時のミスを低減できる。本実施形態のディッシュ１９１は、タイムラプス胚培養装置に用いる際、各マイクロウエル１９５内の胚２５の状態を一度に撮像できる。このため、一つのディッシュ１９１に複数のマイクロウエル１９５を設けながら、カメラモジュール５１を移動することなく、タイムラプス胚培養における撮影回数を減らすことができる。

本実施形態では、第２収容部２２０の底部は、第１収容部２１０と同様、中心に向かって丸く形成されているので、培養液ＣＳを吸い上げる際、第２収容部２２０内の培養液ＣＳを、余すことなく、効率的に吸い上げることができる。しかも、第２収容部２２０の培養液ＣＳをピペット２４０により全て吸い上げても、間仕切部２３０において底部が隆起しているので、第１収容部２１０内の培養液ＣＳの液位は、この底部より下がることがない。従って、胚２５が存在するマイクロウエル１９５内の培養液ＣＳが誤って汲み出されてしまうと言うことがない。

Ｂ．第２実施形態：
（Ｂ－１）ディッシュの形状：
次に、ディッシュの第２実施形態について説明する。第２実施形態では、図１１に示すように、ディッシュ１９１Ａの形状が異なるが、これ以外、つまり染色体解析用胚培養液の採取・検査処理ルーチンなどは、第１実施形態と同様である。第２実施形態のディッシュ１９１Ａは、第１実施形態と同様の形状の収容部２００を用いる。その数や第１収容部２１０および第２収容部２２０の形状も同様である。但し、第２実施形態では、１０個の収容部２００の第１収容部２１０を、第１実施形態より近接配置している。第１収容部２１０を近接配置するために、各収容部２００は、外側ほど、更に外方に開くように配置される。このため、各列の第１収容部２１０の列方向の間隔Ｌ１は、第１収容部２１０に対応して設けられた第２収容部２２０の列方向の間隔Ｌ２より狭い。間隔Ｌ２は、第２収容部２２０の面積中心間の距離である。この結果、第２実施形態のディッシュ１９１Ａでは、１０個の第１収容部２１０を一度に撮像するための撮像範囲ＰＡ２が、第１実施形態の撮像範囲ＰＡ１より、狭くできる。このため、カメラモジュール５１によって撮像された各マイクロウエル１９５内の胚２５の解像度を高めることも可能となる。なお、撮像範囲ＰＡ２の大きさを第１実施形態と同じ大きさとして、収容部２００の数を、例えば６個×２列のように増やしてもよい。

この第２実施形態のディッシュ１９１Ａよれば、複数個の各マイクロウエル１９５の撮像範囲を狭くでき、しかも染色体の異数性検査のための培養液ＣＳを貯留する収容部２００の大きさを十分に確保できる。その他の作用効果は、第１実施形態と同様である。

（Ｂ－２）変形例１：
第２実施形態のディッシュ１９１Ａの変形例であるディッシュ１９１Ｂを、図１２に示した。この例では、第１収容部２１０を近接配置したことにより生じた第１収容部２１０の並びの方向両側の空間に、培養液ＣＳの追注用平衡化ドロップ２５１、２５２を配置する補充液収容部を設けている。このドロップは、補充用培養液であって、培養液ＣＳを収容部２００から吸い上げたとき、更に培養を継続するために培養液ＣＳを追加で収容部２００に注入するために準備される。培養中、ディッシュ１９１Ｂ上にミネラルオイルＯＬに覆われた状態で置かれているため、蒸発することがなく、また収容部２００内の培養液ＣＳと同じ環境（温度・湿度など）に置かれていたので、吸い上げた培養液ＣＳの代わりに追注しても、追加された培養液ＣＳは、それまで胚２５が接していた培養液と何ら変わるところがなく、好適である。

上記の第１，第２実施形態では、収容部２００の容積を５０μｌとし、４０μｌの培養液を充填し、検査のために３０μｌの培養液を吸い出すものとして説明したが、ここに示した容積、容量は、一例に過ぎない。染色体の異数性検査に必要な培養液の容量が小さくなって、吸い出す培養液ＣＳの容量が、例えば１０μｌ程度になれば、収容部２００の容積を２０μｌ程度とし、充填する培養液ＣＳを１５μｌ程度としても差し支えない。一般に、収容部２００の容積を、Ｖ200 、充填する培養液ＣＳの容量をＶcs、検査用に吸い出す培養液ＣＳの容量をＶout とすれば、
Ｖout ＜Ｖcs≦Ｖ200
との関係を満たせばよい。また、マイクロウエル１９５の容積をＶmwとして、
Ｖout ＋Ｖmw≦Ｖcs
とすれば、培養液ＣＳを吸い出した場合に、マイクロウエル１９５内に培養液が残ることになり、好適である。

（Ｂ－３）変形例２：
収容部２００の配置の他の例を、図１３に示した。この例では、収容部２００の第１収容部２１０を更に多数近接配置している。この例では、収容部２００は、円周上に配置され、各マイクロウエル１９５を備えた第１収容部２１０を内周側に８個、外周側に８個、計１６個設けている。この場合でも、第２実施形態と同様の作用効果を奏する上、多数のマイクロウエル１９５を撮像するために必要な撮像範囲ＰＡ３を小さくできる。

Ｃ．胚の培養・保存・移植の処置：
上述した実施形態では、培養液ＣＳを吸い上げたあとの胚の取り扱いについては、特に説明しなかったが、移植に向けた胚の取り扱いについて、一例を説明する。図１４は、胚の培養・保存・移植の処置について説明する工程図である。図９に示した処理ルーチンの終了後、まず各収容部２００に培養液ＣＳを追注する処理を行なう（ステップＳ４００）。全ての収容部２００に追注が完了するまで行なう（ステップＳ４０５）。

全ての収容部２００への追注が完了すると、ディッシュ１９１を、胚培養装置１０の培養室Ｒ１１に戻す処理を行なう（ステップＳ４１０）。培養室Ｒ１１の蓋部１７を閉めると、培養が再開され、胚の培養が継続される（ステップＳ４２０）。培養が再開され、約４０時間が経過するまで待ち（ステップＳ４２５）、４０時間が経過すると、染色体の異数性検査の結果を、次世代型シーケンサの結果から読み取る（ステップＳ４３０）。その結果を見て、染色体の異数性の検査を行なった対象の複数の胚の中から、正常胚を選択する（ステップＳ４４０）。

検査した胚の中に染色体の異数性が確認された胚があれば、これを正常胚でないとし、正常でないと判断された胚以外の胚（以下、正常胚という）を冷凍保存し、患者が移植に適した状態となるのを俟って、冷凍保存した胚を解凍し、これを患者に移植する（ステップＳ４５０）。以上で、胚の培養・保存・移植処置を終了する。

こうしたディッシュ１９１の培養室Ｒ１１からの取り出しや（図９、ステップＳ３３０、Ｓ３５０）、培養室Ｒ１１への戻し（図１４、ステップＳ４１０）の際に、使用者は、その手指ＨＤでディッシュ１９１を直接把持し、操作する。この様子を、図１５に例示した。上述した各実施形態で用いるディッシュ１９１は略長方形状をしており、これを親指とこれに対抗する中指等の対抗指で挟んで保持する。ディッシュ１９１の外周壁１９４には、把持補助構造としての窪み４００が設けられている。このため、手指ＨＤでディッシュ１９１を把持すると、外周壁１９４の窪み４００に指がフィットし、ディッシュ１９１をしっかりと保持できる。なお、窪み４００は、略長方形状のディッシュ１９１の４辺のうち、少なくとも１辺に設けられている。親指と対抗指とが接する２箇所に窪み４００を設けてもよい。窪み４００に代えて、外周壁１９４の外側表面に細かい凹凸を設けてもよい。この場合は、窪み４００の場所のみ凹凸を設けてもよいが、外周壁１９４の外側を広く凹凸面としてもよい。凹凸は、ディッシュ１９１の形成時に、成形用型の表面を凸凹にすることで、形成しもよく、後からサンドブラストなどの手法で表面を荒らすことで形成してもよい。なお、図では、凹所１９７の図示を省略した。

Ｄ．他の形態：
（１）本開示の胚培養用ディッシュは、胚を培養液と共に収容する複数個のウエルを備える胚培養用ディッシュとして実施可能である。この胚培養用ディッシュは、前記複数のウエルを、当該胚培養用ディッシュの底部に、独立かつ隣接して配置し、前記ウエル毎に、前記ウエルと共に前記培養液を保持可能な凹部を、他の凹部とは独立に、前記底部に形成し、前記ウエルと前記凹部との間に、前記培養液の流通は許可し、前記胚の移動は阻害する移動阻害部を設け、前記凹部の容積を、前記ウエルで培養される胚の染色体の異数性検査のために吸い上げる培養液の容量以上としてよい。

かかる胚培養用ディッシュによれば、複数のウエルが隣接しているので、これを胚培養装置などに使用すると、複数のウエル間の距離が短く、取り扱いが容易である上、胚の染色体の異数性検査のために培養液を吸い上げる処理を、培養中の胚への影響を抑制して、行なうことができる。しかも、ウエルと凹部との間には移動阻害部が設けられているので、ウエル内で培養される胚をウエル内に留め置いたまま、胚の周りの培養液も吸い上げることができる。また、複数のウエル間の距離が短ければ、ウエル内の胚の移動が容易となり、また移し替え時のミスを低減できる。更に、タイムラプス胚培養装置に使用すれば、複数のウエルを一度に撮像することが可能となる。このため、胚に対する非侵襲の染色体の異数性検査が容易となり、また検査対象の胚に影響を与えることもほとんどなく、異数性検査の結果を踏まえた胚移植の成功率（患者の妊娠率）を高めることも期待できる。

胚培養用ディッシュ当たりのウエルの数は、複数個とであればよく、最小で２個、ウエルを隣接させて収容部を配設できれば、何個でもよい。ウエルは、収容される胚の形状に合わせて、半球形状してもよいし、平面視長円形状でもよく、鉛直方向断面が放物線形状などであっても差し支えない。また、複数のウエルは必ずしも同一形状である必要はなく、個々に異なる形状であってもよい。こうすれば、顕微鏡視野でどのウエルの胚を操作しようとしているか、視覚的に認識することも可能となる。

（２）こうした構成において、前記複数個のウエルの少なくとも一部は、２列に並べて配置され、一方の列に配置されたウエルに対応して設けられる前記凹部の各々は、他方の列のウエルに対応して設けられる前記凹部とは、前記ウエルを挟んで反対側に設けられ、対応する前記ウエルから外側に向けて所定の長さに亘る形状を有するものとしてよい。こうすれば、複数後のウエルを隣接させ、かつ十分な大きさの収容部を配置するのが容易となる。収容部の大きさ、特に収容する培養液の液量に合わせて、所定の長さを調整すればよい。収容部は、長方形状としてもよく、ウエルから遠ざかるにつれて横方向の長さが長くなる台形形状としてもよい。もとより、平面視楕円形や長円形状としてもよい。また、深さ方向には、収容部全体で、その深さを均一としてもよいし、ウエルと同様、中心部ほど深くなる曲面形状としてもよい。後者の場合は、培養液を吸い上げるとき、培養液が最深部に集まるので、収容部内の培養液を効率的に吸い上げることができる。

（３）こうした構成において、前記各列のウエルの列方向の間隔は、前記ウエルに対応して設けられた前記凹部の前記列方向の間隔より狭いものとしてよい。こうすれば、更に効率的にウエルを配置でき、胚培養用ディッシュに設けるウエルの数を増やすことができる。このため、この胚培養用ディッシュをタイムラプス胚培養装置等に用いれば、一度に撮像できるウエルの数を増やすこともできる。

（４）こうした構成において、当該胚培養用ディッシュにおける全ての前記ウエルは、当該胚培養用ディッシュが収容されるタイムラプス胚培養装置に設けられたカメラが当該胚培養用ディッシュに対して相対的に移動することなく撮像可能な範囲に配置されているものとしてよい。こうすれば、タイムラプス胚培養装置に設けられたカメラで、一度に全てのウエルを撮像することができ、胚培養用ディッシュに対してカメラを移動する必要がない。もとより、一つの胚培養用ディッシュに、複数のウエルと凹部とからなるセットを複数設け、カメラを移動して順次撮像するようにしても差し支えない。

（５）こうした構成において、記移動阻害部は、前記ウエルと前記凹部とを接続する通路部分であって、前記ウエルの深さより浅い通路部分を備えるものとしてよい。こうすれば、凹部の培養液をピペット等で全て吸い上げても、移動阻害部の深さがウエルの深さより浅いので、ウエル内の培養液の液位は、この通路部分より下がることがない。従って、培養される胚が存在するウエルの培養液が誤って汲み出されてしまうと言うことがない。もとより、移動阻害部は、胚がウエルから移動することを阻害できればよく、移動阻害部の深さがウエルの深さと同程度としても差し支えない。この場合は、ウエル内の培養液を残らず吸い上げることも可能だが、胚の回りの培養液を残す必要があれば、吸い上げ量を調整すればよい。例えば、培養液を吸い上げる際に用いるピペットの先端に、凹部の底部から所定距離だけ離間させるアダプタを設ければよい。こうすれば、ピペットで培養液を吸い上げると、凹部の底部から所定の高さの培養液を残すことができる。

（６）こうした構成において、前記移動阻害部は、前記ウエルと前記凹部との接続部分に設けられて、前記培養液が流通する隙間を有する通路部分を備え、前記通路部分の前記隙間が、前記ウエルに収容される前記胚の最小径より狭いものとしてよい。こうすれば、ウエル内の胚の移動を容易に阻害できる。通路は、単に胚の大きさより狭い隙間として形成されてもよい。この場合、通路の幅それ自体を狭くしてもよいし、幅の広い通路に柵やメッシュを設けて、胚の移動を阻害するようにしてもよい。

（７）こうした構成において、前記ウエルは、前記ウエルの底部に、前記ウエルの外形より小さく、前記収容する胚の外形より大きなマイクロウエルを備えるものとしてよい。こうすれば、胚の位置をマイクロウエル内にでき、撮像される胚の位置を限定できる。また、培養中の胚の移動を制限でき、胚の培養にとっても望ましい。もとより、マイクロウエルはなくてもよい。ウエルの底部に、例えば胚の直径より若干小さい径のリング状の隆起部を設けるといった構造により、ウエル内の胚の移動を制限することも可能である。

（８）こうした構成において、前記凹部に前記培養液を補充するための補充用培養液が収容される補充液収容部を、当該胚培養用ディッシュの底面に備えるものとしてよい。こうすれば、培養中の環境に慣らした平衡化培養液を容易に補充できる。

（９）こうした構成において、外周を区画する外周壁を備え、前記外周壁の外側表面は、当該胚培養用ディッシュを把持する際に使用者の手指による把持を補助する把持補助構造を備えるものとしてよい。こうすれば、胚培養用ディッシュの取り扱いを容易にできる。

（１０）こうした構成において、上記の胚培養用ディッシュの前記ウエルと前記凹部に前記培養液を充填し、前記培養液が充填された前記ウエルに、培養する胚を収容し、前記培養液を充填した前記ウエルと前記凹部とを、前記培養液の蒸発を抑制するオイルで覆い、前記ウエルに前記胚を収容してから所定時間後に、前記凹部から、予め定めた容量の前記培養液を吸い上げ、前記吸い上げた培養液を、前記培養液に含まれるＤＮＡを用いて染色体異数性解析可能な解析器の解析に供するものとしてもよい。こうすれば、胚に対する染色体の異数性検査を非侵襲性にでき、検査対象の胚に影響を与えることがほとんどない。従って、異数性検査の結果を踏まえた胚移植の成功率（患者の妊娠率）を高めることも期待できる。

本開示は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態中の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。

本開示は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。例えば、上記実施形態においてハードウェアにより実現した構成の一部は、ソフトウェアにより実現することができる。

１０…胚培養装置、１１～２４…培養ユニット、１７…蓋部、１８…ガスポート、２０…ケース本体、２５…胚、２６…汎用コネクタ、２７…フィルタ、２８…フィルタポート、４３…供給口、４４…排気口、５１…カメラモジュール、５２…レンズモジュール、６０…制御部、６１…ＣＰＵ、６２…ＲＯＭ、６３…ＲＡＭ、６４…メモリインタフェース、６５…メモリカード、６６…汎用Ｉ／Ｏインタフェース、６７…培養室インタフェース、６８…カメラインタフェース、７０…ディスプレイ、７１…駆動装置、７２…警告装置、７３…混合気調整装置、８４…混合気供給配管、９１…ディスプレイ、９５…コントロールデバイス、９６…ダイヤル、９７…ベース部、１７０…照明ユニット、１８０…保持枠、１８２…凸部、１８６…ドロップ配置部、１９１，１９１Ａ，１９１Ｂ…ディッシュ、１９２…壁、１９４…外周壁、１９５…マイクロウエル、１９６…底部、１９７…凹所、１９８…開口、２００…収容部、２１０…第１収容部、２２０…第２収容部、２３０…間仕切部、２４０…ピペット、２５１…追注用平衡化ドロップ、３００…次世代型シーケンサ、３１０…収容部、３２０…操作部、３３０…表示部、ＨＤ…手指

Claims (8)

1. 胚を培養液と共に収容する複数個のウエルを備える胚培養用ディッシュであって、
   前記複数個のウエルは、それぞれ前記胚を収容可能な単一のマイクロウエルを備え、
   前記複数個のウエルは、当該胚培養用ディッシュの底部に、隣接かつ独立して配置して配列され、
   前記複数個のウエルの各々に、前記ウエルと共に前記培養液を保持可能な凹部を対応付けて前記底部に形成し、
   前記ウエルと前記凹部との間に、前記培養液の流通は許可し、前記胚の移動は阻害する移動阻害部を設け、
   前記移動阻害部と、前記ウエルに前記移動阻害部を介して接続された前記凹部とは、前記ウエルの配列方向と交差する方向に配列され、前記ウエルとともに、前記ウエル毎に独立した収容部を構成し、
   前記収容部は、当該胚培養用ディッシュを水平にした状態で、前記凹部内の前記培養液を全て吸い上げても、前記マイクロウエル内には、前記胚が浸かる高さまで前記培養液が残る形状とされた、
   胚培養用ディッシュ。
2. 前記複数個のウエルの少なくとも一部は、２列に並べて配置され、一方の列に配置されたウエルに対応して設けられる前記凹部の各々は、他方の列のウエルに対応して設けられる前記凹部とは、前記ウエルを挟んで反対側に設けられ、対応する前記ウエルから外側に向けて所定の長さに亘る形状を有する、請求項１に記載の胚培養用ディッシュ。
3. 前記各列のウエルの列方向の間隔は、前記ウエルに対応して設けられた前記凹部の前記列方向の間隔より狭い、請求項２記載の胚培養用ディッシュ。
4. 当該胚培養用ディッシュにおける全ての前記ウエルは、当該胚培養用ディッシュが収容されるタイムラプス胚培養装置に設けられたカメラが当該胚培養用ディッシュに対して相対的に移動することなく撮像可能な範囲に配置されている、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の胚培養用ディッシュ。
5. 前記移動阻害部は、前記ウエルと前記凹部とを接続する通路部分であって、前記ウエルの深さより浅い通路部分を備える、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の胚培養用ディッシュ。
6. 前記移動阻害部は、前記ウエルと前記凹部との接続部分に設けられ、前記培養液が流通する隙間を有する通路部分を備え、
   前記通路部分の前記隙間が、前記ウエルに収容される前記胚の最小径より狭い、
   請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の胚培養用ディッシュ。
7. 前記凹部に前記培養液を補充するための補充用培養液が収容される補充液収容部を、当該胚培養用ディッシュの底面に備える、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の胚培養用ディッシュ。
8. 請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の胚培養用ディッシュであって、
   外周を区画する外周壁を備え、
   前記外周壁の外側表面は、当該胚培養用ディッシュを把持する際に使用者の手指による把持を補助する把持補助構造を備える、胚培養用ディッシュ。

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