JP4765934B2 - 血管細胞培養用パターニング基板 - Google Patents
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Description
上記血管細胞接着阻害部が、上記血管細胞接着部に上記血管細胞を付着させた際、上記血管細胞接着阻害部に隣接する2つの上記血管細胞接着部上の細胞どうしが擬足を介して接触しないような表面距離に形成されていることを特徴とする血管細胞培養用パターニング基板を提供する。
2 … 血管細胞接着部
3 … 血管細胞接着阻害部
まず、本発明の血管細胞培養用パターニング基板について説明する。本発明の血管細胞培養用パターニング基板は、基材と、上記基材上に少なくとも2本以上のライン状に実質的に平行に形成され、血管を形成する血管細胞と接着性を有する血管細胞接着部と、上記基材上の隣接する2つの上記血管細胞接着部間に形成され、上記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害部とを有する血管細胞培養用パターニング基板であって、
上記血管細胞接着阻害部が、上記血管細胞接着部に上記血管細胞を付着させた際、上記血管細胞接着阻害部に隣接する2つの上記血管細胞接着部上の細胞どうしが擬足を介して接触しないような表面距離に形成されていることを特徴とするものである。
以下、本発明の血管細胞培養用パターニング基板の各構成ごとに詳しく説明する。
まず、本発明の血管細胞培養用パターニング基板の血管細胞接着部について説明する。本発明における血管細胞接着部は、後述する基材上に形成されるものであり、血管を形成する血管細胞と接着性を有する領域である。本発明においては、この血管細胞接着部は血管細胞培養用パターニング基板上に、少なくとも2本以上の実質的に平行なライン状に形成されるものである。なお、ここでいう実質的に平行とは、完全に平行な場合だけでなく、実質的な平行、すなわちある領域において2本のラインが交差していなければよく、例えばジグザグ状のライン等、ラインが交わらずに存在する状態も含まれるものとする。また、上記実質的に平行には、例えば網状構造のような交差している構造のうちの交差していない部分についても含まれることとする。
次に、本発明における血管細胞接着阻害部について説明する。本発明における血管細胞接着阻害部は、後述する基材上の、隣接する上記血管細胞接着部間に形成され、上記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有するものであり、かつ上記血管細胞接着部に上記血管細胞を付着させた際、血管細胞接着阻害部に隣接する2つの血管細胞接着部上の血管細胞どうしが擬足を介して接触しないような上記表面距離に形成されているものであれば特に限定されるものではない。この血管細胞接着阻害部は、平坦な領域であってもよく、また上述したように凸状に形成されたもの等であってもよい。
次に、本発明に用いられる基材について説明する。本発明に用いられる基材は、平坦なものであってもよく、また上述した血管細胞接着阻害部とされる領域が凸状となるように形成されたもの等であってもよい。また、上述したように、基材が血管細胞接着性を有するものであってもよく、また血管細胞接着阻害性を有するもの等であってもよい。
本発明の血管細胞培養用パターニング基板は、基材と、上述した血管細胞接着部および血管細胞接着阻害部とを有するものであれば、特に限定されるものではなく、例えば必要に応じて適宜他の部材等が形成されているものであってもよい。
まず、第1の態様としては、少なくとも血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層が形成されており、上記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着材料が分解または変性されているものである。
まず、本態様に用いられる血管細胞接着層について説明する。本態様に用いられる血管細胞接着層は、少なくとも血管細胞との接着性を有する血管細胞接着材料を有する層であり、一般的に血管細胞との接着性を有する層として用いられる層を用いることができる。
本態様の血管細胞接着層に含有される血管細胞接着材料は、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性されるものであれば、その種類等は特に限定されるものではない。ここで、血管細胞と接着性を有するとは、血管細胞と良好に接着することをいい、血管細胞との接着性が血管細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする血管細胞と良好に接着することをいう。
YnSiX(4−n)
(ここで、Yはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基もしくはエポキシ基、またはこれらを含む有機基であり、Xはアルコキシル基、アセチル基またはハロゲンを示す。nは0〜3までの整数である。)
で示される珪素化合物の1種または2種以上の加水分解縮合物もしくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでYで示される有機基の炭素数は1〜20の範囲内であることが好ましく、また、Xで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
まず、本態様に用いられる光触媒を含有する光触媒含有層を有する光触媒含有層側基板について説明する。本態様に用いられる光触媒含有層側基板としては、通常、光触媒を含有する光触媒含有層を有するものであり、通常、基体と、その基体上に光触媒含有層が形成されているものである。この光触媒含有層側基板は、例えばパターン状に形成された光触媒含有層側遮光部やプライマー層等を有していてもよい。以下、本態様に用いられる光触媒含有層側基板の各構成について説明する。
まず、光触媒含有層側基板に用いられる光触媒含有層について説明する。本態様に用いられる光触媒含有層は、光触媒含有層中の光触媒が、近接する血管細胞接着層中の血管細胞接着材料を分解または変性させるような構成であれば、特に限定されるものではなく、光触媒とバインダとから構成されているものであってもよく、光触媒単体で製膜されたものであってもよい。また、その表面の特性は特に親液性であっても撥液性であってもよい。
光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が50nm以下であることが好ましく、20nm以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
次に、光触媒含有層側基板に用いられる基体について説明する。通常、光触媒含有層側基板は、少なくとも基体とこの基体上に形成された光触媒含有層とを有するものである。この際、用いられる基体を構成する材料は、後述するエネルギーの照射方向や、得られるパターン形成体が透明性を必要とするか等により適宜選択される。
本態様に用いられる光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部が形成されたものを用いても良い。このように光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板を用いることにより、エネルギー照射に際して、フォトマスクを用いたり、レーザ光による描画照射を行う必要がない。したがって、光触媒含有層側基板とフォトマスクとの位置合わせが不要であることから、簡便な工程とすることが可能であり、また描画照射に必要な高価な装置も不必要であることから、コスト的に有利となるという利点を有する。
次に、本態様の光触媒含有層側基板に用いられるプライマー層について説明する。本態様において、上述したように基体上に光触媒含有層側遮光部をパターン状に形成して、その上に光触媒含有層を形成して光触媒含有層側基板とする場合においては、上記光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成してもよい。
また、プライマー層の膜厚は、0.001μmから1μmの範囲内であることが好ましく、特に0.001μmから0.1μmの範囲内であることが好ましい。
次に、本態様における血管細胞接着阻害部の形成方法について説明する。本態様においては、例えば図6に示すように、基材1上に形成された血管細胞接着層8と、光触媒含有層側基板13の光触媒含有層12とを、所定の間隙をおいて配置し、例えばフォトマスク5等を用いて、エネルギー6を所定の方向から照射する(図6(a))。これにより、エネルギー照射された領域の血管細胞接着材料が分解または変性されて、血管細胞と接着性を有しない血管細胞接着阻害部9が形成されるのである(図6(b))。この際、血管細胞接着阻害部は、例えば上記血管細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、血管細胞接着阻害部中にはその血管細胞接着材料が少量含有されている、または血管細胞接着材料の分解物等が含有されている、もしくは血管細胞接着層が完全に分解除去されて基材が露出すること等となる。また、上記血管細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、血管細胞接着阻害部中にはその変性物等が含有されていることとなる。
またさらに、第2の態様としては、上記基材上に、少なくとも血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害層を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着阻害材料を含有する血管細胞接着阻害層が形成されており、上記血管細胞接着部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着阻害材料が分解または変性されているものである。
次に、本発明の血管の製造方法について説明する。本発明の血管の製造方法は、上述した血管細胞培養用パターニング基板を用いて、血管細胞を培養して血管を製造する方法である。
(光触媒含有層を有するフォトマスクの形成)
ガラス開口部40μm、金属遮光部500μmのストライプパターンを有する石英フォトマスクを作成した。続いてトリメトキシメチルシランTSL8114(GE東芝シリコーン)5gと0.5規定塩酸2.5gとを混合し、8時間攪拌した。これをイソプロピルアルコールにより10倍に希釈し、プライマー層用組成物とした。上記プライマー層用組成物をフォトマスクのパターン面上にスピンコーティング法により塗布し、その基板を150℃の温度で10分間乾燥することにより、プライマー層を有するフォトマスクを得た。
次に、イソプロピルアルコール30gとトリメトキシメチルシランTSL8114(GE東芝シリコーン)3gと光触媒無機コーティング剤ST-K03(石原産業)20gとを混合し、100℃で20分間攪拌した。これをイソプロピルアルコールにより3倍希釈し、光触媒含有層用組成物とした。
前記光触媒含有層用組成物を、プライマー層が形成されたフォトマスク基板上にスピンコーターにより塗布し、150℃で10分間の乾燥処理を行うことにより、透明な光触媒含有層を有するフォトマスクを形成した。
オルガノシランTSL-8114(東芝シリコーン)5.0g、フルオロアルキルシランTSL-8233(東芝シリコーン)1.5g、0.005N塩酸2.36gを混合し、24時間攪拌した。この溶液をイソプロピルアルコールで100倍希釈の上、スピンコーティング法により予めアルカリ処理をしたソーダガラス基板に塗布し、その基板を150℃の温度で10分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、膜厚0.2μmの血管細胞接着阻害層を有するパターニング用基板を得た。
次に、このパターニング用基板の細胞接着阻害層と前述の光触媒含有層を有するフォトマスクの光触媒含有層を対向させ、フォトマスク越しに水銀ランプにより6J/cm2のエネルギー量で紫外線露光を行い、未露光部が血管細胞接着阻害性で露光部が血管細胞接着性にパターン化された血管細胞接着性表面を有する血管細胞培養用パターニング基板を得た。次いで、血管細胞培養用パターニング培養基板を15mm×25mmのサイズに切断した。この際、上記血管細胞接着部のラインパターンが血管細胞培養用パターニング培養基板の長軸に合うように切断した。
10%ウシ胎児血清を加えたDMEM培地中に基板を浸漬し、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) を2×105個/mlの濃度となるように播種した。37℃,5%二酸化炭素環境下で24時間培養し、血管細胞を血管細胞接着部に接着した。
基板に接着した血管細胞を観察し、血管細胞が血管細胞接着部中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事、血管細胞接着部間に擬足の接触が無い事を確認した。
更にDMEM培地を、bFGF(シグマ社) 10ng/mlの濃度で加えたものに交換、37℃,5%二酸化炭素環境下で24時間培養を継続し、血管細胞が連続した血管組織を形成した事を確認した。
実施例1と同様の実験を、フォトマスクを血管細胞接着部40μm/血管細胞接着阻害部150μmのストライプパターンに交換し行ったところ、培養24時間後、血管細胞は血管細胞接着部に伸展形状で接着しているが、血管細胞接着阻害部の一部に血管細胞から発生した擬足が伸びている事が確認された。
更にDMEM培地に実施例1と同様にbFGFを加え、血管細胞の組織化を行ったところ、血管の形成は行われたが、実施例1と比較し、血管はところどころで途切れ、その長さは短く、更に隣接した血管どうしが癒着し、組織形成が不完全である事を確認した。
比較例1と同様に基板を作成、更に基板の血管細胞接着阻害部の中央に高さ幅50μm、高さ5μmのポリテトラフルオロエチレン板を接着した。この基板に対し、実施例1と同様の手順で血管細胞を播種した。
基板に接着した血管細胞を観察し、血管細胞が血管細胞接着部中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事、血管細胞接着部間に擬足の接触が無い事を確認した。
更にDMEM培地を、bFGF(シグマ社) 10ng/mlの濃度で加えたものに交換、37℃,5%二酸化炭素環境下で24時間培養を継続し、血管細胞が連続した血管組織を形成した事を確認した。
(血管細胞接着阻害部を形成するためのフォトマスクの形成)
開口部の幅が500μm、遮光部の幅が200μmで、アライメントマークを有する5インチ石英フォトマスクを作製した。
前記フォトマスクのアライメントマークと対応するアライメントマークと、前記フォトマスクの開口部ラインに対応する遮光部と、前記フォトマスクの遮光部ラインに対応する位置にラインに沿って形成された、血管細胞接着補助部を有する血管細胞接着部用の開口パターンとを有する5インチ石英フォトマスクを作製した。上記開口パターンは、遮光部/開口部がそれぞれ幅4.5μm/35.5μmのパターン状に形成されており、遮光パターンが血管細胞接着補助部のパターンとされた。続いて、このフォトマスクに実施例1と同様の方法で光触媒含有層を形成した。
ポリエチレングリコールジアクリレート(アルドリッチ)に1%の重合開始剤2,2−ジメトキシ−2−フェニルアセトフェノンを溶かした。この溶液を、予めγ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン(GE東芝シリコーン)の脱水トルエン溶液(濃度3%)に2時間浸漬して表面処理したガラス基板上に、スピンコーティングで塗布した。続いて、前記血管細胞接着阻害部形成用フォトマスクを使って紫外線露光工程と水現像工程を実施し、幅500μm、厚さ0.8μmのポリエチレングリコールゲルから成る凸状の血管細胞接着阻害部を形成した。
血管細胞接着阻害性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されて血管細胞接着性を発現するシランカップリング剤XC98−B2472(GE東芝シリコーン)をイソプロピルアルコールで10倍希釈し、ここに1,3−ブタンジオールを濃度10%になるよう添加して攪拌し、血管細胞接着部および血管細胞接着補助部を形成するためのコーティング剤を調製した。上記凸状の血管細胞接着阻害部を形成したガラス基板を120秒間UV洗浄し、直後に、前記コーティング剤をスピンコーティングにより塗布し、60℃で24時間乾燥した。その後、よく水洗し再び乾燥した。
前記の血管細胞接着補助部のパターン、および光触媒含有層を有するフォトマスクを、光触媒含有層が凸状の前記血管細胞接着阻害部を有する基板面と対向するようにアライメントマークで位置あわせして配置した。次に光触媒含有層付きフォトマスクの裏面側から紫外線を6J/cm2照射した。これにより、血管細胞接着補助部を有する血管細胞接着部が作製された。この基板を実施例1と同様に15mm×25mmの大きさに切断した。
培養ディッシュに基板を配置し、6×105個/mlの濃度となるようHUVECを播種した。培養ディッシュをシーソーシェーカーの上に配置し、実施例1と同様に24時間培養し、血管細胞を血管細胞接着補助部を有する血管細胞接着部に接着した。この間、シェーカーはゆっくりとシーソーのように動作し、基板のラインパターンと同一方向に培地の流れが生じるよう調整された。
24時間の培養後、培地を注意深く吸引除去し、次いで新しい培地としてbFGF(シグマ社)を10ng/mlの濃度で加えたマトリゲル(ベクトンディッキンソン社)を基板上に0.5ml与え、ゲル化させてから0.5%のウシ胎児血清を含むDMEM培地を加え培養した。37℃、5%二酸化炭素環境下で24時間培養を継続し、血管細胞が連続した血管組織を形成したことを確認した。
Claims (3)
- 基材と、前記基材上に少なくとも2本以上のライン状に実質的に平行に形成され、血管を形成する血管細胞と接着性を有する血管細胞接着部と、前記基材上の隣接する2つの前記血管細胞接着部間に形成され、前記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害部とを有する血管細胞培養用パターニング基板であって、
前記血管細胞接着阻害部が、前記血管細胞接着部に前記血管細胞を付着させた際、前記血管細胞接着阻害部に隣接する2つの前記血管細胞接着部上の細胞どうしが擬足を介して接触しないような表面距離に形成されていることを特徴とする血管細胞培養用パターニング基板。 - 前記血管細胞接着阻害部が、凸状に形成されていることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の血管細胞培養用パターニング基板。
- 請求の範囲第1項または請求の範囲第2項に記載の血管細胞培養用パターニング基板を用いて、血管細胞を培養することを特徴とする血管の製造方法。
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