JP2002306161A

JP2002306161A - 動物細胞の凍結方法

Info

Publication number: JP2002306161A
Application number: JP2001112659A
Authority: JP
Inventors: Kanehisa Yokoyama; 兼久横山
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2001-04-11
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2002-10-22

Abstract

(57)【要約】【課題】製造工程における培養期間の短縮と培養に要
するスペースを少なくし、解凍後ウェル間の細胞の数お
よび状態のばらつきを抑えることができる細胞付培養器
製造できる凍結方法を提供する。【解決手段】非細胞接着性を有する培養器ウェル内底
面に底面の形状に等しく裁断された細胞接着性を有する
不織布シートを固定し、動物細胞分散液を分注し、即座
に0〜１０℃で放置した後冷却して細胞を凍結する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞が付与さ
れた細胞培養器の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、動物細胞の凍結保存の形態は、ア
ンプルなどの容器中に凍結保護剤を含有する培養液中に
細胞浮遊液の形で凍結されたものが一般的である。この
ように、凍結保存された動物細胞を用いた実験や評価を
行うには、実際の実験作業の他に、細胞の再播種などの
細胞の準備に時間と手間を必要とする。実験に用いるま
での培養の時間と手間を削減する方法として、培養基質
上に培養された状態で、凍結用培地と共に培養基質ごと
凍結されている足場依存性動物細胞が特開平１−１６５
８１号公報に開示されている。

【０００３】また、解凍してそのまま細胞を培養できる
凍結方法として、不織布に細胞を付着させ動物細胞を凍
結保存する方法が特開平６−２０９７６７号公報に公開
されている。何れの場合も細胞を培養器の培養面や不織
布に付着させるために、凍結前に数日間の培養が必要と
なる。

【０００４】凍結された細胞を解凍し、培養細胞を用い
た試験に用いる場合、先の特開平１−１６５８１号公報
の方法では、解凍時細胞が非常に剥離し易くなってお
り、解凍し培養を再開する際の凍結用の培養液から培養
用の培養液に交換する際、細胞が剥離し細胞が吸引され
て細胞数が減少したり、剥離した細胞が吸引されるのを
抑制する手段を施しても細胞の剥離は生じその剥離の度
合いは、培養面により異なり、複数のウェルを有するプ
レート内ではウェル間で細胞の伸展の状態が異なってい
る。細胞の接着伸展の状態は、細胞の増殖性や細胞のス
トレスに対する応答性に影響を及ぼすことがある。その
ため、解凍後、細胞を健全な状態に戻すためには、１〜
２日の回復のための培養が必要である。

【０００５】特開平６−２０９７６７号公報に公開され
ている不織布に付着させる方法においては、実施例に記
載してあるように、培養器内に不織布を置き、細胞を播
種後暫く放置したあと、別の培養器に移し数日間培養す
る方法が記載されているが、この方法でも不織布に細胞
を付着させるために凍結前に数日間の培養期間を必要と
している。また、細胞の形態は不織布内に接着している
場合と、培養器の培養面に接着している場合では細胞の
接着伸展の度合いが異なり、先述したように細胞の接着
および伸展の状態は、細胞のストレス応答性や細胞機能
の発現に影響を及ぼすことになる。

【０００６】培養器の培養面へ細胞が到達し接着してし
まう要因としてまず、培養器ウェル側壁と不織布の隙間
がある。不織布の比重は培地と比較して大きくないた
め、ただ不織布をウェル内に置いただけでは、不織布は
浮き上がり不織布内に納まる細胞数が大きくばらつく要
因となる。不織布の浮き上がりを防止するには、不織布
形状をウェルの形状に合わせれば容易に解決できるが、
さらに不織布の繊維密度の問題がある。

【０００７】不織布は製造方法上、繊維に密度にはバラ
ツキが生じやすく、培養プレートのウェルの底面積が小
さいほど、ウェル内に納められる不織布は小さく裁断さ
れたもの使用することとなり、不織布の繊維密度のバラ
ツキはウェル間の不織布の繊維密度のバラツキとして大
きく影響する。

【０００８】不織布の単位体積あたり密度が高い場合
は、培養面までの細胞の落下は抑えられるが、細胞を播
種した際、細胞は不織布の上面部のみに局在することに
なり、不織布内に細胞が存在する利点を活かすことが出
来なくなる。また、単位体積あたりの繊維密度が疎な場
合は、多くの細胞が培養面まで達して培養面で接着伸展
し、この場合も不織布内に細胞が存在する利点を活かす
ことが出来なくなる。

【０００９】不織布の繊維密度を疎な状態にし、不織布
の厚さを厚くすれば、培養面への細胞の到達を抑えるこ
とができるが、不織布を厚くすると培地交換や、試験液
の分注の際、不織布内には古い培養液が貯留して試験液
の不織布内への拡散に時間を要し、細胞の薬物への応答
性を鈍くすることになる。また、薬物毒性の判定手段と
してニュートラルレッド法などが用いられるが不織布が
厚いとこれら判定試薬の不織布底面側への到達に時間が
かかることとなり、正確な細胞の生死の状態も把握でき
ない。よって、不織布の厚みは薄くかつ構成繊維の密度
適度のバラツキが少ないものが必要である。しかし、細
胞培養に用いることが出来る繊維密度のものでかつ、耐
水性のある素材において、このような不織布を入手する
ことは困難である。

【００１０】以上のように従来の方法では、培養器内に
細胞を保持したかたちで足場依存性動物細胞が凍結保存
されている細胞付培養器を供給するにあたり、製造過程
では凍結前の培養に時間とスペースを必要とし、使用に
おいては培養器間やプレート内のウェル間での細胞数の
バラツキや応答性のバラツキが大きかった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、動物
細胞が培養器中に凍結保存された細胞付培養器の製造に
おいて、培養期間の短縮と培養スペースを少なくし、解
凍後ウェル間の細胞の数および状態のばらつきを抑える
ことができる細胞付培養器製造できる凍結方法を提供す
ることにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】発明者は上記のような従
来の問題点を解決するため鋭意検討した結果、細胞接着
性を有する不織布と非細胞接着性を有する培養面を組み
合わせることを見い出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本は発明は、非細胞接着性を有する培養器ウェル
内底面に底面の形状に等しく裁断された細胞接着性を有
する不織布シートを固定し、凍結保護剤を含有する培養
液中に動物細胞を分散させた細胞分散液をウェルに分注
し、0〜１０℃で放置したあと、冷却して細胞を凍結す
ることを特徴とする動物細胞の凍結方法である。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明に用いることができる動物細胞は、上皮系
や繊維芽細胞系の株化細胞および初代培養された血管内
皮細胞など、培養面に接着し伸展する細胞である。これ
らの代表例として、HeLa、Hep G2、A-431、V79、Veroな
どがあげられる。

【００１４】本発明の培養器に使用する培養器の形態と
してはシャーレ、複数のウェルを有する細胞培養用のプ
レートである。中でも本発明の適用において最も有用な
のは９６ウェルプレートなどのウェル数の多いプレート
類である。

【００１５】本方法に用いる培養器の培養面は非細胞接
着性を有するものを用いる。一般のポリスチレン製の細
胞培養器は動物細胞用に培養表面に親水化処理が施され
ているが、親水化処理を施さなければ細胞の接着は起こ
らずそのまま使用できる。また、細胞によってはポリ−
ＨＥＭＡなどをウェル内底面にコートするなどして細胞
非接着性を付与する。

【００１６】不織布は、耐水性を有し水中内に浸漬され
てもある程度の剛性を有する必要があることから、プラ
スチックの繊維よりなるものを選択するのがよく、さら
に細胞の接着性を有することが必要であるため、ナイロ
ンなどの親水性を有するものを選択するか、材質として
親水性を有しない場合は、親水化処理を施すことによっ
て、不織布を構成する繊維表面に親水性を付与する。さ
らに、細胞によっては、コラーゲンなどの細胞外マトリ
ックスで繊維表面をコートすることにより細胞接着性を
付与する。

【００１７】不織布の形状は、不織布が納められるウェ
ルの底面の形状に合わせ裁断され大きさとしてはウェル
底面より０．５〜１割程度大きめとする、このことによ
り接着剤などを必要とすることなくウェル底面に密着し
たかたちで不織布をウェル内に固定することができる。
不織布の厚さは０．２〜０．５ｍｍの範囲が望ましく、
この範囲より薄いと細胞の保持が十分できなくなり、こ
れより厚いと先に記述した通り、不織布内の培地の拡散
に時間を要することになる。構成繊維の太さは、最終的
に細胞が接着できる太さであることが必要で太めのもの
を用いる必要があり、１０〜１００デニールのものを用
いるのが好ましく、不織布の繊維密度は０．０１〜０．
１ｇ／ｃｍ³の範囲にあることが望ましい。

【００１８】本発明の培養器の凍結手順について説明す
る。まず、目的とする細胞を培養面積の大きな細胞増殖
用培養器中で増殖させる。細胞増殖用の培養器は培養器
十分に細胞が増殖したところでトリプシン処理などで細
胞を剥離させ、凍結する細胞を調製する。凍結用細胞を
凍結保護剤を含有する培養液中に分散する。細胞の播種
は、細胞分散液の細胞濃度を５×１０⁴個／ｍｌ〜２×
１０⁵個ｍｌに調製し、９６ウェルプレートでは１ウェ
ルあたり１００μｌ分注するのが適当である。

【００１９】凍結保護剤として種々のものが用いられて
いるが、安価で凍結保護剤としての効果が高いのはDMSO
（ジメチルスルフォキシド）であり、培地に約１０％の
濃度でDMSOを添加し凍結用培養液として用いるのが好ま
しい。

【００２０】細胞を播種したら、そのまま即座に培養器
を０〜１０℃まで冷却し静置するのが好ましい。冷却の
方法は、冷蔵庫中に入れて、氷上に置いても良い。放置
時間は３０分から1時間程度とする。この間に大部分の
細胞は不織布の繊維間隙中に捕獲され、一部の細胞はウ
ェル底面まで達している、冷却下での放置のため細胞は
不織布には接着しておらず、もちろんウェル底面にも接
着しておらず浮遊状態に近い状態を保っている。

【００２１】最後にディープフリーザーなどにより徐冷
凍結する。冷却スピードは１分間あたり０．５〜１．５
℃が理想であり、わた等に培養器をくるんだり、発泡ス
チロールの箱の中に培養器を収納し、ディープフリーザ
ー中で、−８０℃程度まで冷却する。ここまで、凍結手
順について記載した通り、本発明では凍結する培養器に
細胞を播種しそのまま凍結を行なうため、細胞播種後の
培養期間を省くことができ、凍結する培養器のための培
養スペースを必要としない。

【００２２】最後に、細胞の解凍およびその後の培養に
ついて記載する。細胞の解凍は、−８０℃のディープフ
リーザーより取り出し、発明者が現在公開中であるが、
水分の透過性のない袋中に凍結した培養器を納め３７℃
の温水中に浸漬するなどして解凍を行なう。解凍におい
ては培養器ウェル内培養液が完全に解けるまで加温を止
めてはいけない、途中で加温を中断すると細胞の再凍結
が起こることとなり、細胞を死滅させることとなる。本
発明の凍結方法では、細胞が分散した状態で凍結されて
いるため解凍時の細胞の生存率を高く保つことができ
る。

【００２３】解凍が終了したら、凍結保護剤を含有する
培養液から培養用の培養液への培地交換を行なう。この
段階では細胞は不織布内で不織布繊維に接着はしていな
いが繊維の間隙に保持されており、凍結保護剤を含有す
る培地を除去する際に過度に急激に培養液を吸引しなけ
れば、不織布内に貯留する培養液と共に細胞は不織布内
に保持される。

【００２４】その後、培養用の培養液を分注し、３７℃
の温度で培養を開始する。培養時間の経過とともに、動
物細胞は不織布の繊維に接着し、培養面まで到達してし
まった細胞も、培養面は細胞接着性を有していないた
め、細胞接着性を有する不織布の繊維に移動接着し、培
養器ウェル内の殆どの細胞は不織布内に付着するように
なる。解凍し、2日ほど培養すれば動物細胞は不織布内
で回復および十分増殖し、細胞毒性試験に使用すること
ができる。

【００２５】以上のように、解凍後の培養に要する手間
は従来の方法で培養器ごと凍結した場合と同じであり、
培養器間やウェル間の細胞の伸展状態のバラツキを小さ
く抑えることができるため、薬物などストレスに対する
応答性のバラツキを抑えることができる。

【００２６】

【実施例】（実施例１）５０デニールのポリエステル繊
維よりなる平均の繊維密度が約０．０５ｇ／ｃｍ³厚さ
０．３ｍｍの不織布にコロナ放電処理により親水性を付
与し、直径６．５ｍｍに裁断し、ガンマー線滅菌を施し
た。この不織布を浮遊培養用９６ウエルプレート（住友
ベークライト（株）製品番MS-８0０９６R）のウェル
内に1枚ずつ置き、直系６ｍｍの円柱状の棒により押し
込み固定した。

【００２７】このプレートの各ウェルに、ＨｅＬａ細胞
をＤＭＳＯ１０％、仔牛血清５％を含有するＭＥＭ培地
中に１×１０⁵個／ｍｌの濃度で分散させた細胞浮遊液
を１００μｌ分注し、即座に室内温度を４℃に設定した
冷蔵庫中で６０分放置した後、大きさ２２×１７ｃｍの
ポリエチレン製の袋中に納めシールし、発泡スチロール
製の箱の中に納め−８０℃のディープフリーザー中で凍
結した。

【００２８】凍結後−８０℃で保存した。保存の後、デ
ィープフリーザーよりプレートを取り出し、プレートを
ポリエチレンの袋ごと３７℃の温水中に浸漬し完全に解
凍した、解凍に要した時間は約４分であった。即座に凍
結用の培地を静かに吸引除去し、仔牛血清５％を含有す
るＭＥＭ培地をウェルあたり１００μｌ加え、３７℃Ｃ
Ｏ₂インキュベーター中で培養を開始した。

【００２９】(比較例１)細胞培養用９６ウェルプレート
（住友ベークライト（株）製品番MS-８0０９６Ｆ）の
各ウェルに、ＨｅＬａ細胞を仔牛血清５％を含有するＭ
ＥＭ培地中に１×１０⁵個／ｍｌの濃度で分散させた細
胞浮遊液を１００μｌ分注し、３７℃炭酸ガスインキュ
ベーター中で２日間培養をおこなった後、細胞とともに
培養器ごと凍結した。凍結の手順は次の通り行った。培
養してきた培養液を除去し、ＤＭＳＯ１０％、仔牛血清
５％を含有するＭＥＭ培地を各ウエルに１００μｌ分注
し、大きさ２２×１７ｃｍのシポリエチレン製の袋中に
納め、シールし、発泡スチロール製の箱の中に納め−８
０℃のディープフリーザー中で凍結し、凍結後−８０℃
で保存した。

【００３０】保存の後、ディープフリーザーよりプレー
トを取り出し、プレートをポリエチレンの袋ごと３７℃
の温水中に浸漬し完全に解凍した。解凍に要した時間は
約４分であった。即座に凍結用の培地を静かに吸引除去
し、仔牛血清５％を含有するＭＥＭ培地をウェルあたり
１００μｌ加え、３７℃ ＣＯ₂インキュベーター中で
培養を開始した。

【００３１】（細胞解凍時の細胞生存率）実施例１およ
び比較例１のプレートを解凍して即座に強めのピペッテ
ィングによりプレート各ウェルから凍結用培養液と共に
細胞を吸引し、９６個のＶ字状の底のウェルを有するプ
レートに移し、遠心により凍結用培養液を除去する操作
を行なった後、０．２％のトリパンブルーを含有するＭ
ＥＭ培地を２０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、よく混合し、細
胞培養用９６ウェルプレート（住友ベークライト（株）
製品番ＭＳ−８０９６Ｆ）の各ウェルに移し、顕微鏡
写真を各ウェルについて撮影を行い、これら写真につい
て画像処理により、トリパンブルーにより染まった死細
胞と染まらない生細胞数をカウントし、各ウェルの生細
胞率およびウェル間の生細胞率のばらつきを算出した。
ばらつきは、変動係数（ＣＶ値）で比較した。平均の生
細胞率およびＣＶ値を表１に示す。

【００３２】（細胞解凍後の９６ウェルプレートでの細
胞活性のウェル間のばらつきの比較）解凍後２時間、１
日、２日培養した時点で、ミトコンドリアの活性により
生細胞数を確認する試薬（WST-１（同仁））を各ウェル
に１０μｌ加え、３７℃インキュベーター中で２時間培
養し、新たな細胞培養用９６プレートの各ウェルに８０
μｌづつ移し、ミトコンドリア活性および生細胞数に応
じて生成されるホルマザン量をプレートリーダーにより
波長４５０nmでの吸光度を測定することによりプレート
内での各ウェル間の細胞活性のばらつきをみた。ばらつ
きは、変動係数（ＣＶ値）で比較した。結果を表２に示
す。

【００３３】

【表１】

【００３４】

【表２】

【００３５】

【発明の効果】本発明の細胞付細胞培養器では、製造工
程における培養期間が短くかつ培養に要するスペースが
少なく済み、解凍後は細胞の生存率が高く培養器間ある
いはウェル間の細胞の数および状態のばらつきを低く抑
えることができ、足場依存性動物細胞付の細胞培養器の
製造方法として有益である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非細胞接着性を有する培養器ウェル内底
面に底面の形状に等しく裁断された細胞接着性を有する
不織布シートを固定し、凍結保護剤を含有する培養液中
に動物細胞を分散させた細胞分散液をウェルに分注し、
0〜１０℃で放置したあと、冷却して細胞を凍結するこ
とを特徴とする動物細胞の凍結方法。