JPWO2015098919A1 - 細胞の剥離方法、細胞支持用基材、並びに、細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

接着性細胞を支持体から剥離する際に、穏やかな条件で剥離できる技術を提供することを課題とする。支持体たる基材１の表面に接着した細胞２を基材１から剥離する細胞２の剥離するにあたり、基材１は、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、基材１に光を照射して発生させたガスの気泡７を細胞２に接触させることにより、細胞２を基材１から剥離する。本発明の方法によれば、細胞２の表面に与える負担が小さく、細胞２を無傷に近い状態で剥離及び回収することができる。細胞２をコロニーの状態で剥離することもできる。光応答性ガス発生剤を含む細胞支持用基材も提供される。

Description

本発明は、細胞の剥離方法、細胞支持用基材、並びに、細胞の培養方法に関する。本発明は、ｉＰＳ細胞等の培養、回収、選別、分析などに有用なものである。

従来より、支持体上で増殖させた接着性細胞を剥離する場合に、トリプシン処理がよく行われている。すなわち、支持体に接着した細胞をトリプシン溶液に晒して細胞表面を処理し、細胞を剥離する。トリプシン処理により、細胞が支持体から剥離するとともに、細胞同士の接着も壊され、基本的に個々の細胞が独立して懸濁した状態（single cell suspension）となる。

一方、トリプシン処理によって細胞に与えられる損傷が問題視されている。例えば、細胞がトリプシンに晒されることにより、細胞表面の受容体が損傷を受けることがある。そのため、細胞の生存率が下がってしまう。したがって、基材に接着した細胞を回収する場合において、細胞表面にできるだけ損傷を受けていない細胞を回収したいという要望がある。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を継代等する場合には、シングルセルではなく、コロニーの状態で行うことが好ましいとされている。そのため、細胞間結合がある程度保持されるような穏やかな条件で、細胞の剥離を行いたいという要望がある。

トリプシンを用いずに支持体から細胞を剥離する技術として、例えば、特許文献１に記載の技術がある。特許文献１には、光ファイバに付着させた細胞に紫外線等の光を当てて、光ファイバから細胞を取り除く技術が開示されている。しかし、この技術は不要な細胞を除去するためのものであり、剥離した細胞の損傷については考慮されていない。

また、細胞の集団から特定の細胞を効率的に選別したいという要望がある。例えば、細胞の集団を分画した後、所望の細胞が含まれる分画を特定し、当該分画から細胞を回収したい場合がある。この場合には、細胞の集団全体ではなく、特定の細胞（群）のみを支持体から剥離することが好ましい。特許文献１に記載の技術では、光ファイバごとに細胞の剥離が可能な構成とされている。

国際公開第２００８／１１４８２８号

しかし、特許文献１に記載の技術は複数の光ファイバを必要とし、構成が複雑である。そこで本発明は、より簡単な構成をもって、穏やかな条件で支持体から細胞を剥離する技術を提供することを目的とする。

本発明の１つの様相は、支持体たる基材の表面に接着した細胞を前記基材から剥離する細胞の剥離方法であって、前記基材は、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、前記基材に光を照射して発生させたガスの気泡を前記細胞に接触させることにより、前記細胞を前記基材から剥離することを特徴とする細胞の剥離方法である。

本様相の細胞の剥離方法では、支持体たる基材が光応答性ガス発生剤を含んでいる。そのため、基材に光を照射することにより、基材からガスを発生させることができる。そして本様相では、前記基材に光を照射して発生させたガスの気泡を前記細胞に接触させることにより、前記細胞を前記基材から剥離する。本様相では、ガスの気泡を利用して細胞を剥離するので、剥離が穏やかに行われ、細胞表面に与える負担が小さい。そのため、トリプシン処理のような細胞表面に過度の負担を与えることがなく、例えば、細胞表面の受容体等を損傷することがない。さらに、剥離の条件が穏やかであるゆえ、細胞間結合がある程度保持されるから、コロニーの状態で細胞を剥離及び回収することが容易である。一方、シングルセルの回収に際しても、細胞表面に大きな負担を受けていない細胞を回収することができる。

好ましくは、前記基材の一部であって、剥離対象となる細胞が接着している部位に対して選択的に光を照射する。

この好ましい様相によれば、所望の細胞のみを効率的に剥離させることができる。例えば、同一平面上に一様に接着している複数の細胞のうち、特定の細胞（群）のみを狙って剥離することができる。

好ましくは、光を集光させるレンズを用いて前記部位に対して選択的に光を照射する。

好ましくは、前記基材は複数の区画を有し、剥離対象の細胞が含まれる区画のみに光を照射する。

この好ましい様相によれば、特定の区画内に存在する細胞のみを効率的に剥離させることができる。

好ましくは、前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されている。

本発明の他の様相は、表面に細胞を接着させて支持するための細胞支持用基材であって、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、前記光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を前記細胞に接触させることが可能であることを特徴とする細胞支持用基材である。

本様相の細胞支持用基材は、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含んでいる。そのため、基材に光を照射することによりガスを発生させることができる。さらに、本様相では、光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を細胞に接触させることが可能である。そのため、基材表面に接着した細胞を穏やかに剥離することができる。

好ましくは、複数の区画を有し、各々の区画内で細胞を支持可能である。

好ましくは、前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されている。

好ましくは、前記ガス発生剤は、アゾ化合物又はアジド化合物からなる。

本発明の他の様相は、上記の細胞支持用基材に細胞を接着させて、前記細胞を培養することを特徴とする細胞の培養方法である。

本様相によれば、培養された細胞を穏やかな条件で剥離及び回収することができる。

本発明によれば、細胞表面に大きな負担を与えることなく細胞を剥離及び回収することができる。さらに、コロニーの状態で細胞を回収することが容易であり、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の回収に有用である。

本発明の一実施形態に係る細胞の剥離方法を模式的に表す説明図であり、（ａ）は光照射前の状態、（ｂ）は光照射後の状態を表す。 本発明の他の実施形態に係る細胞の剥離方法を模式的に表す説明図である。 実施例で行った実験結果を表す顕微鏡写真であり、（ａ）は光照射前の細胞の様子、（ｂ）は光照射後の細胞の様子を表す。

以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の細胞の剥離方法は、光応答性ガス発生剤を含む基材の表面に接着した細胞を、該光応答性ガス発生剤から発生させたガスの気泡を利用して剥離するものである。まず、図１に示す本発明の実施形態を参照しつつ、本発明の基本概念を説明する。図１は本発明の一実施形態を模式的に表したものである。

図１（ａ）は細胞を剥離する前（光を照射する前）の基材（細胞支持用基材）１と細胞２の状態を表している。剥離前において、基材１の表面には複数の細胞２が一様に接着している。細胞２は培地等の液体８に浸っている。
基材１は光応答性ガス発生剤を含むものである。本実施形態では、基材１は、光応答性ガス発生剤を含むガス発生フィルム３と、光透過性のガスバリア層５とが積層された構造を有する。そして、ガス発生フィルム３が上側、ガスバリア層５が下側となる姿勢で使用され、細胞２はガス発生フィルム３の表面に接着している。光応答性ガス発生剤の詳細については後述する。
ガスバリア層５の裏側には、光非透過性のフォトマスク６が設けられている。そして、フォトマスク６により、ガスバリア層５の一部が覆われている。逆に言えば、ガスバリア層５の裏側は、フォトマスク６に覆われていない部分のみが露出している。

図１（ａ）に示す状態から細胞２を剥離する場合には、基材１の裏側、すなわちガスバリア層５側から光を照射する。このとき、基材１におけるフォトマスク６で覆われていない部分のみに選択的に光が照射される（矢印参照）。照射された光はガスバリア層５を通過して、ガス発生フィルム３に到達する。
ガス発生フィルム３において光が照射された領域で、ガスが発生する。発生したガスは気泡７となり、主に細胞２における基材１との接着面に供給され、細胞２に当たる（接触する）。これにより、図１（ｂ）に示すように、細胞２が基材１から浮き上がり、基材１から剥離する。
ここで、本実施形態ではガスの発生が光照射された領域に限られるので、光を照射した領域に位置する細胞２のみが剥離する。逆に言えば、フォトマスク６で覆われた領域にはガスは発生せず、同領域に位置する細胞２は剥離しない。

本実施形態によれば、ガスの気泡を細胞に接触させることによって細胞を剥離するので、細胞表面に与える負担が小さい。そのため、細胞表面の受容体等を破壊するおそれがなく、無傷により近い細胞を回収することができる。また、トリプシン処理等と比べて剥離条件が穏やかであるので、細胞間結合がある程度保持され、細胞をコロニーの状態で容易に回収できる。
また本実施形態では、光の照射域を限定することにより、特定の領域のみにガスを発生させている。そのため、同一平面上に接着している複数の細胞（群）のうち、所望の細胞（群）のみを効率的に剥離することができる。

上記した実施形態では、フォトマスク６を用いて所望部位に対して光を選択的に照射している。しかし、所望部位に対して光を選択的に照射する方策はこれに限定されない。例えば、図２に示す実施形態では、レンズ１０を用いて所望部位に対して光を集中させ、選択的に照射している。レンズ１０は凸レンズであり、入射した光を集光させるものである。本実施形態によれば、フォトマスク６を必要としないので、より簡単な構成をもって細胞剥離を行うことができる。本実施形態においては、レンズ１０を１個のみ用いてもよいし、複数個用いてもよい。

ガスバリア層５を構成する材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ガラス、石英ガラス及びパイレックスガラス等が挙げられる。

基材に光を照射する際に用いる光源としては、細胞に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定はないが、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることができる。その他の光源としては、レーザー、エレクトロルミネッセンス素子（ＥＬ素子）、プラズマ発光素子、外部電極形蛍光ランプ（ＥＥＦＬ）、マイクロハロゲンランプ、光ファイバ、並びに光セレクタの組み合わせにより取り出すことができる光源、などが挙げられる。

上記した実施形態では、ガス発生フィルムを用いて「光応答性ガス発生剤を含む基材」を構成しているが、光応答性ガス発生剤を含有させる態様はこれに限定されない。例えば、光応答性ガス発生剤を含有させた樹脂成型物で基材の一部又は全部を構成してもよい。

細胞が接着する基材表面を区画しておくことにより、一部の細胞のみを剥離したい場合に、光照射すべき領域を容易に特定することができる。区画の態様としては、例えば、同一平面上に複数の細胞を接着させた場合、視認可能な格子状の目印を該平面に付与することが挙げられる。この場合には、格子の繰り返し単位である正方形又は長方形の領域が、区画となる。

平板上に設けられた複数の凹部（窪み、ウェル）によって前記区画を構成することもできる。この場合には、各区画（凹部）は各々独立しているから、特定の区画に対する光照射及び剥離した細胞の回収が特に容易である。例えば、公知の細胞培養用マイクロタイタープレートのように、円筒形の複数のウェルを有する板体を、前記基材として用いることができる。この場合には、ウェルの底面を光応答性ガス発生剤を含む材料で構成すればよい。当該ウェルのサイズとしては、例えば、直径２〜３５ｍｍ程度、深さ１０〜１２ｍｍ程度、底面積０．１〜５ｃｍ²程度とすることができる。

さらに、マイクロアレイチップをもって前記基材を構成することもできる。例えば、１又は複数の細胞を収容可能なマイクロチャンバーを複数備えたマイクロアレイチップを、光応答性ガス発生剤を含む材料で作製することにより、複数の区画を備えた前記基材を構成することができる。この態様によれば、蛍光分析等によってマイクロアレイチップ上で所望の細胞を容易に特定することができる。そしてその後、所望の細胞が収容されたマイクロチャンバーにのみ光を照射して、所望の細胞又は所望の細胞が含まれる細胞群を剥離し、回収することができる。本発明をマイクロアレイチップに適用することにより、ＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）検査等の細胞解析が容易となる。
前記マイクロチャンバーのサイズや形状としては、例えば、直径２０〜１０００μｍ程度、深さ７〜２０００μｍ程度の円筒形とすることができる。

本発明の細胞支持用基材は、光応答性ガス発生剤を含むものであり、光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を、支持している細胞に接触させることが可能なものである。

本発明の細胞支持用基材としては、例えば、上記した実施形態に係る基材をそのまま採用することができる。すなわち、図１に示すように、ガス発生フィルム３を用いて細胞支持用基材を構成することができる。さらに、複数の区画を設け、特定の細胞（群）のみを容易に剥離できる構成としてもよい。複数の凹部（窪み、ウェル）を平板上に設けてもよい。上記したマイクロアレイチップも本発明の細胞支持用基材となり得る。

本発明の細胞支持用基材を、細胞培養用基材として用いることができる。例えば、接着性細胞の培養に通常用いられているプレート、シャーレ、フラスコ等の細胞接着面を、光応答性ガス発生剤を含む材料で構成することにより、前記細胞培養用基材とすることができる。具体的には、上記した構成のガス発生フィルムをシャーレやフラスコの底面に設置することにより、前記細胞培養用基材とすることができる。

本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材に細胞を接着させて、当該細胞を培養する細胞の培養方法を包含する。また本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材に細胞を接着させて、当該細胞を支持する細胞の支持方法を包含する。

本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材の、細胞支持用基材のための使用を包含する。また本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材の、細胞培養用基材のための使用を包含する。

本発明の対象となる細胞としては特に限定はなく、接着性細胞であれば全てが対象となり得る。一例として、上述したｉＰＳ細胞やＥＳ細胞が挙げられる。これらの細胞はコロニーの状態で継代することが好ましいので、本発明の細胞の剥離方法が特に好適に用いられる。その他の細胞としては、ヒト子宮頸がん由来のＨｅｌａ；ヒト乳腺癌由来のMCF-7；胎児細胞由来の有核赤血球や胎児白血球；Ｔ細胞白血病由来のJurkat、HD-Mar2、SKW-3；Ｂ細胞白血病由来のNALM-6；白血病由来のHL-60；ラット副腎髄質由来ＰＣ１２；アフリカミドリザル腎臓由来COS-1やCOS-7；チャイニーズハムスター卵巣由来CHO/HGPRT、などの細胞が挙げられる。

続いて、本発明で用いられる光応答性ガス発生剤について説明する。該光応答性ガス発生剤を構成する化合物としては、アゾ化合物、アジド化合物、ポリオキシアルキレン化合物等が挙げられる。このうちアゾ化合物又はアジド化合物が、ガス発生効率が高いため好適に用いられる。

該アゾ化合物としては、２，２’−アゾビス−（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）、２，２’−アゾビス（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）、２，２’−アゾビス（Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド）、等が挙げられる。また該アジド化合物としては、３−アジドメチル−３−メチルオキセタン、グリシジルアジドポリマー、等が挙げられる。これらのアゾ化合物やアジド化合物については、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記光応答性ガス発生剤は、バインダー樹脂に含まれていてもよい。該バインダー樹脂は、光応答性ガス発生剤を固定したり、光応答性ガス発生剤を含む材料に粘着性を持たせたり、種々の機能を付加する役割を果たす。例えば、光応答性ガス発生剤をバインダー樹脂に分散させたり、バインダー樹脂に相溶させたりすることができる。バインダー樹脂の使用により、ガス発生剤を含む材料を所望の形状に加工することが容易である。例えば、フィルム状などの形状に、容易に成形することができる。

該バインダー樹脂の好ましい例としては、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また該バインダー樹脂自体が、光の照射によりガスを発生する性質を有していてもよい。該バインダー樹脂は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

さらに該バインダー樹脂は粘着性を有するものであってもよく、例えば、粘接着剤樹脂を含んでいてもよい。かかる構成により、例えば、フィルム状等の形状（ガス発生フィルム等）として用いる際に、取扱いが容易となる。なお、粘接着剤樹脂は、光の照射により粘着性が低下しない性質を有することが好ましい。この場合には、ガス発生剤に対して光照射が開始された後でも、高い粘接着性を維持可能である。また、粘接着剤樹脂は、例えば、光照射により架橋しない性質を有することが好ましい。

上記粘接着剤樹脂としては、例えば、ゴム系粘接着剤樹脂、（メタ）アクリル系粘接着剤樹脂、シリコーン系粘接着剤樹脂、ウレタン系粘接着剤樹脂、スチレン−イソプレン−スチレン共重合体系粘接着剤樹脂、スチレン−ブタジエン−スチレン共重合体粘接着剤樹脂、エポキシ系粘接着剤樹脂及びイソシアネート系粘接着剤樹脂、等が挙げられる。

光応答性ガス発生剤を含む基材には、さらにアミン化合物を含めてもよい。かかる構成により、基材表面の正電荷が増強され、細胞の接着がより確実となる。該アミン化合物としては特に限定はなく、１級、２級、又は３級の各種アミン化合物を用いることができる。

光応答性ガス発生剤を含む基材には、さらに光増感剤を含めてもよい。該光増感剤としては、チオキサントン、ベンゾフェノン、アセトフェノン類及びポルフィリン等が挙げられる。

光応答性ガス発生剤を含む基材には、必要に応じて、種々の添加剤をさらに含めてもよい。該添加剤としては、カップリング剤、可塑剤、界面活性剤、粘着付与剤、架橋剤、安定剤、等が挙げられる。他の添加剤としては、多孔質体、フィラー、金属箔、マイクロカプセル等の粒子が挙げられる。ガス発生剤を含む基材にこれらの粒子が分散されていると、ガスの拡散がより一層早くなる。

以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

図１で模式的に示した細胞の剥離方法について、細胞と光応答性ガス発生フィルムを用いて実際に実験を行った。

アクリル基板（５０ｍｍ×１００ｍｍ×２ｍｍ）に直径７ｍｍの３６個のウェル（貫通穴）作製し、底面にガス発生フィルムを貼り付けて、細胞支持用基材を作製した。ガス発生フィルムは、グリシジルアジドポリマーとアクリルポリマーとチオキサントンを含むものをＰＥＴフィルム（厚み５０μｍ）上にキャストし、乾燥後の厚みが５０μｍとなるようにして作製した。

各ウェルに乳ガン細胞（１×１０⁶個／ｍＬ）を含む培地４０μＬを加え、ＣＯ₂インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）に２０分間静置し、フィルム表面に細胞を接着させた。図３（ａ）は、この時点におけるフィルム上の細胞を表す顕微鏡写真である。
次に、ガス発生フィルムの裏側の一部をフォトマスクで覆った後、ＬＥＤを用いて光を１０秒間照射し、ガスを発生させた。ガスの発生量は約２μＬであった。ガス発生後の細胞の様子を図３（ｂ）に示す。すなわち、光照射前にはガス発生フィルムに一様に接着していた細胞が、光照射により、ガス発生フィルムから剥離した。また、フォトマスクで覆った部分の細胞はガス発生フィルムに接着したままであり、光を照射した部分の細胞のみが剥離された。

以上より、光ガス応答性ガス発生剤を含む基材に光を照射してガスを発生させることにより、基材表面の細胞を剥離することができた。また、光の照射範囲を限定することにより、所望の領域に位置する細胞のみを剥離することができた。

１ 基材（細胞支持用基材）
２ 細胞
３ ガス発生フィルム
７ 気泡
１０ レンズ

Claims (9)

1. 支持体たる基材の表面に接着した細胞を前記基材から剥離する細胞の剥離方法であって、
   前記基材は、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、
   前記基材に光を照射して発生させたガスの気泡を前記細胞に接触させることにより、前記細胞を前記基材から剥離することを特徴とする細胞の剥離方法。
2. 前記基材の一部であって、剥離対象となる細胞が接着している部位に対して選択的に光を照射することを特徴とする請求項１に記載の細胞の剥離方法。
3. 光を集光させるレンズを用いて前記部位に対して選択的に光を照射することを特徴とする請求項２に記載の細胞の剥離方法。
4. 前記基材は複数の区画を有し、剥離対象の細胞が含まれる区画のみに光を照射することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞の剥離方法。
5. 前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞の剥離方法。
6. 表面に細胞を接着させて支持するための細胞支持用基材であって、
   光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、
   前記光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を前記細胞に接触させることが可能であることを特徴とする細胞支持用基材。
7. 複数の区画を有し、各々の区画内で細胞を支持可能であることを特徴とする請求項６に記載の細胞支持用基材。
8. 前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されていることを特徴とする請求項６又は７に記載の細胞支持用基材。
9. 請求項６〜８のいずれかに記載の細胞支持用基材に細胞を接着させて、前記細胞を培養することを特徴とする細胞の培養方法。

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