TW201529854A - 細胞之剝離方法、細胞支持用基材、與細胞之培養方法 - Google Patents

Abstract

本發明之目的在於提供一種於將附著性細胞自支持體剝離時，可於和緩之條件下剝離之技術。 於進行將附著於作為支持體之基材1之表面之細胞2自基材1剝離的細胞2之剝離時，基材1係含有藉由照射光而產生氣體之光響應性氣體產生劑者，藉由使對基材1照射光而產生之氣體之氣泡7接觸於細胞2而將細胞2自基材1剝離。根據本發明之方法，對細胞2之表面造成之負擔較小，可將細胞2於接近無損傷之狀態下剝離及回收。亦可將細胞2於菌落之狀態下剝離。本發明亦提供一種含有光響應性氣體產生劑之細胞支持用基材。

Description

細胞之剝離方法、細胞支持用基材、與細胞之培養方法

本發明係關於一種細胞之剝離方法、細胞支持用基材、與細胞之培養方法。本發明係對iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞)等之培養、回收、篩選、分析等有用者。

自先前以來，於將在支持體上增殖之附著性細胞剝離之情形時，通常進行胰蛋白酶處理。即，將附著於支持體之細胞暴露於胰蛋白酶溶液而對細胞表面進行處理，從而將細胞剝離。藉由胰蛋白酶處理，而使細胞自支持體剝離，並且細胞彼此之附著亦被破壞，基本上成為各個細胞獨立地懸浮之狀態(單細胞懸浮液(single cell suspension))。

另一方面，因胰蛋白酶處理而對細胞造成之損傷被視為問題。例如，有因將細胞暴露於胰蛋白酶而導致細胞表面之受體受到損傷之情況。因此，細胞之存活率降低。因此，有於回收附著於基材之細胞之情形時，欲回收細胞表面儘可能未受到損傷之細胞之期望。又，於對iPS細胞或ES細胞(embryonic stem cell，胚胎幹細胞)進行繼代等之情形時，較佳為以菌落而並非單細胞之狀態進行。因此，有欲於如可使細胞間結合保持於某種程度之和緩之條件下進行細胞之剝離之期望。

作為不使用胰蛋白酶而將細胞自支持體剝離之技術，例如有專利文獻1中記載之技術。專利文獻1中揭示有對附著於光纖之細胞照射 紫外線等光而將細胞自光纖去除之技術。但是，該技術係用以去除不需要之細胞者，並未考慮經剝離之細胞之損傷。

又，有自細胞之群落中有效率地篩選特定之細胞之期望。例如，有對細胞之群落進行劃分後，特定出包含所需之細胞之區間，欲自該區間回收細胞之情形。於該情形時，較佳為僅將特定之細胞(群)而並非細胞之群落整體自支持體剝離。專利文獻1中記載之技術中，設為針對每種光纖均可實現細胞之剝離之構成。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2008/114828號

但是，專利文獻1中記載之技術需要複數種光纖，構成較為複雜。因此，本發明之目的在於提供一種以更簡單之構成且於和緩之條件下將細胞自支持體剝離之技術。

本發明之一態樣係一種細胞之剝離方法，其特徵在於：其係將附著於作為支持體之基材之表面之細胞自上述基材剝離者，且上述基材係含有藉由照射光而產生氣體之光響應性氣體產生劑者，藉由使對上述基材照射光而產生之氣體之氣泡接觸於上述細胞而將上述細胞自上述基材剝離。

本態樣之細胞之剝離方法中，作為支持體之基材含有光響應性氣體產生劑。因此，藉由對基材照射光，可自基材產生氣體。並且，本態樣中，藉由使對上述基材照射光而產生之氣體之氣泡接觸於上述細胞而將上述細胞自上述基材剝離。本態樣中，由於利用氣體之氣泡將細胞剝離，故而和緩地進行剝離，對細胞表面造成之負擔較小。因 此，不會如胰蛋白酶處理般對細胞表面造成過度之負擔，例如不會損傷細胞表面之受體等。進而，因剝離之條件和緩而可使細胞間結合保持於某種程度，因此容易於菌落之狀態下將細胞剝離及回收。另一方面，即便於回收單細胞時，亦可回收細胞表面未受較大負擔之細胞。

較佳為，對上述基材之一部分即附著有成為剝離對象之細胞之部位選擇性地照射光。

根據該較佳態樣，可僅將所需之細胞有效率地剝離。例如，可於均勻地附著於同一平面上之複數個細胞中，僅瞄準特定之細胞(群)而將其剝離。

較佳為，使用使光聚集之透鏡對上述部位選擇性地照射光。

較佳為，上述基材具有複數個區間，僅對包含剝離對象之細胞之區間照射光。

根據該較佳態樣，可僅將存在於特定之區間內之細胞有效率地剝離。

較佳為，上述氣體產生劑含有於具有黏著性之黏合劑樹脂中。

本發明之另一態樣係一種細胞支持用基材，其係用以使細胞附著於表面而支持細胞者，且含有藉由照射光而產生氣體之光響應性氣體產生劑，可使自上述光響應性氣體產生劑產生之氣體之氣泡接觸於上述細胞。

本態樣之細胞支持用基材含有藉由照射光而產生氣體之光響應性氣體產生劑。因此，可藉由對基材照射光而產生氣體。進而，本態樣中，可使自光響應性氣體產生劑產生之氣體之氣泡接觸於細胞。因此，可將附著於基材表面之細胞和緩地剝離。

較佳為，上述細胞支持用基材具有複數個區間，可於各個區間內支持細胞。

較佳為，上述氣體產生劑含有於具有黏著性之黏合劑樹脂中。

較佳為，上述氣體產生劑包含偶氮化合物或疊氮化合物。

本發明之另一態樣係一種細胞之培養方法，其特徵在於：其係使細胞附著於上述之細胞支持用基材而對上述細胞進行培養。

根據本態樣，可將經培養之細胞於和緩之條件下剝離及回收。

根據本發明，可在不對細胞表面造成較大負擔之情況下將細胞剝離及回收。進而，容易於菌落之狀態下將細胞回收，對iPS細胞或ES細胞之回收有用。

1‧‧‧基材(細胞支持用基材)

2‧‧‧細胞

3‧‧‧氣體產生膜

5‧‧‧阻氣層

6‧‧‧光罩

7‧‧‧氣泡

8‧‧‧液體

10‧‧‧透鏡

圖1係模式性地表示本發明之一實施形態之細胞之剝離方法的說明圖，(a)表示光照射前之狀態，(b)表示光照射後之狀態。

圖2係模式性地表示本發明之另一實施形態之細胞之剝離方法的說明圖。

圖3係表示實施例中進行之實驗結果之顯微鏡照片，(a)表示光照射前之細胞之樣態、(b)表示光照射後之細胞之樣態。

以下，對本發明之實施形態進行說明。

本發明之細胞之剝離方法係將附著於含有光響應性氣體產生劑之基材之表面之細胞利用自該光響應性氣體產生劑產生之氣體之氣泡而剝離者。首先，一面參照圖1所示之本發明之實施形態，一面對本發明之基本概念進行說明。圖1係模式性地表示本發明之一實施形態者。

圖1(a)表示剝離細胞之前(照射光之前)之基材(細胞支持用基材)1與細胞2之狀態。在剝離前，於基材1之表面均勻地附著有複數個細胞2。細胞2係浸漬於培養基等液體8中。

基材1係含有光響應性氣體產生劑者。於本實施形態中，基材1 具有積層有含有光響應性氣體產生劑之氣體產生膜3及光透過性之阻氣層5之構造。並且，以氣體產生膜3成為上側、阻氣層5成為下側之姿態使用，細胞2附著於氣體產生膜3之表面。關於光響應性氣體產生劑之詳情，下文將進行說明。

於阻氣層5之背面側設置有光不透過性之光罩6。並且，藉由光罩6覆蓋阻氣層5之一部分。反而言之，阻氣層5之背面側僅露出未被光罩6覆蓋之部分。

於自圖1(a)所示之狀態將細胞2剝離之情形時，自基材1之背面側、即阻氣層5側照射光。此時，僅對基材1之未被光罩6覆蓋之部分選擇性地照射光(參照箭頭)。所照射之光通過阻氣層5而到達氣體產生膜3。

於氣體產生膜3中經光照射之區域產生氣體。所產生之氣體成為氣泡7，主要供給至細胞2之與基材1之附著面而碰觸(接觸)於細胞2。藉此，如圖1(b)所示，細胞2自基材1浮升而自基材1剝離。

此處，本實施形態中，由於氣體之產生限於經光照射之區域，故而僅位於經光照射之區域之細胞2剝離。反而言之，於被光罩6覆蓋之區域不產生氣體，位於該區域之細胞2不剝離。

根據本實施形態，由於藉由使氣體之氣泡接觸於細胞而將細胞剝離，故而對細胞表面造成之負擔較小。因此，無破壞細胞表面之受體等之虞，可回收更接近無損傷之細胞。又，由於與胰蛋白酶處理等相比剝離條件較為和緩，故而可使細胞間結合保持於某種程度，可將細胞於菌落之狀態下容易地回收。

又，本實施形態中，藉由限定光之照射區域，而僅使特定之區域產生氣體。因此，附著於同一平面上之複數個細胞(群)中，可僅將所需之細胞(群)有效率地剝離。

上述實施形態中，使用光罩6對所需部位選擇性地照射光。但 是，對所需部位選擇性地照射光之方法並不限定於此。例如，圖2所示之實施形態中，使用透鏡10使光集中於所需部位而選擇性地照射。透鏡10為凸透鏡，係使入射之光聚集者。根據本實施形態，由於無需光罩6，故而可以更簡單之構成進行細胞剝離。本實施形態中，可僅使用1個透鏡10，亦可使用複數個。

作為構成阻氣層5之材料，可列舉：聚對苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚對苯二甲酸丁二酯、玻璃、石英玻璃及派熱司玻璃(Pyrex glass)等。

作為對基材照射光時所使用之光源，只要為不會對細胞造成不良影響者，則無特別限定，例如可使用發光二極體(LED)。作為其他光源，可列舉：雷射、電致發光元件(EL元件)、電漿發光元件、外部電極型螢光燈(EEFL)、微型鹵素燈、光纖、與可藉由光選擇器之組合而出射之光源等。

上述實施形態中，使用氣體產生膜構成「含有光響應性氣體產生劑之基材」，但含有光響應性氣體產生劑之態樣並不限定於此。例如，亦可以含有光響應性氣體產生劑之樹脂成型物構成基材之一部分或全部。

於藉由對細胞附著之基材表面進行劃分而欲僅將一部分之細胞剝離之情形時，可容易地特定出應光照射之區域。作為劃分之態樣，例如於使複數個細胞附著於同一平面上之情形時，可列舉對該平面賦予可視認之格子狀之記號。於該情形時，作為格子之重複單元之正方形或長方形之區域成為區間。

亦可藉由設置於平板上之複數個凹部(凹坑、凹孔)構成上述區間。於該情形時，各區間(凹部)各自獨立，因此對特定之區間之光照射及經剝離之細胞之回收特別容易。例如，可將如公知之細胞培養用微量滴定盤般具有複數個圓筒形凹孔之板體用作上述基材。於該情形 時，只要由含有光響應性氣體產生劑之材料構成凹孔之底面即可。作為該凹孔之尺寸，例如可設為直徑2~35mm左右、深度10~12mm左右、底面積0.1~5cm²左右。

進而，亦可以微陣列晶片構成上述基材。例如，可藉由以含有光響應性氣體產生劑之材料製作具備複數個可收容一個或複數個細胞之微腔之微陣列晶片，而構成具備複數個區間之上述基材。根據該態樣，可藉由螢光分析等而於微陣列晶片上容易地特定出所需之細胞。並且，其後可僅對收容有所需之細胞之微腔照射光，而將所需之細胞或包含所需之細胞之細胞群剝離、回收。藉由將本發明應用於微陣列晶片，而使CTC(Circulating Tumor Cell，循環腫瘤細胞)檢查等細胞解析變得容易。

作為上述微腔之尺寸或形狀，例如可設為直徑20~1000μm左右、深度7~2000μm左右之圓筒形。

本發明之細胞支持用基材係含有光響應性氣體產生劑者，可使自光響應性氣體產生劑產生之氣體之氣泡接觸於所支持之細胞。

作為本發明之細胞支持用基材，例如可直接採用上述實施形態之基材。即，如圖1所示，可使用氣體產生膜3構成細胞支持用基材。進而，亦可設為設置複數個區間，可僅將特定之細胞(群)容易地剝離之構成。亦可於平板上設置複數個凹部(凹坑、凹孔)。上述微陣列晶片亦可成為本發明之細胞支持用基材。

可將本發明之細胞支持用基材用作細胞培養用基材。例如，可藉由以含有光響應性氣體產生劑之材料構成附著性細胞之培養中通常所使用之培養盤、培養皿、燒瓶等之細胞附著面，而製成上述細胞培養用基材。具體而言，可藉由將上述構成之氣體產生膜設置於培養皿或燒瓶之底面，而製成上述細胞培養用基材。

本發明包含一種細胞之培養方法，其係使細胞附著於含有光響 應性氣體產生劑之基材而對該細胞進行培養。又，本發明包含一種細胞之支持方法，其係使細胞附著於含有光響應性氣體產生劑之基材而支持該細胞。

本發明包含一種基材之用途，其係將含有光響應性氣體產生劑之基材用作細胞支持用基材。又，本發明包含一種基材之用途，其係將含有光響應性氣體產生劑之基材用作細胞培養用基材。

作為成為本發明之對象之細胞，並無特別限定，只要為附著性細胞則均可成為對象。作為一例，可列舉上述iPS細胞或ES細胞。該等細胞較佳為於菌落之狀態下進行繼代，因此可尤佳地使用本發明之細胞之剝離方法。作為其他細胞，可列舉：源自人類子宮頸癌之Hela；源自人類乳腺癌之MCF-7；源自胎兒細胞之有核紅血球或胎兒白血球；源自T細胞白血病之Jurkat、HD-Mar2、SKW-3；源自B細胞白血病之NALM-6；源自白血病之HL-60；源自大鼠腎上腺髓質之PC12；源自非洲綠猴腎臟之COS-1或COS-7；源自中國倉鼠卵巢之CHO/HGPRT等細胞。

繼而，對本發明中所使用之光響應性氣體產生劑進行說明。作為構成該光響應性氣體產生劑之化合物，可列舉偶氮化合物、疊氮化合物、聚氧伸烷基化合物等。其中，可較佳地使用偶氮化合物或疊氮化合物，其原因在於氣體產生效率較高。

作為該偶氮化合物，可列舉：2,2'-偶氮雙-(N-丁基-2-甲基丙醯胺)、2,2'-偶氮雙(N-丁基-2-甲基丙醯胺)、2,2'-偶氮雙(N-環己基-2-甲基丙醯胺)等。又，作為該疊氮化合物，可列舉：3-疊氮甲基-3-甲基氧雜環丁烷、縮水甘油基疊氮聚合物等。關於該等偶氮化合物或疊氮化合物，可僅使用1種，亦可併用2種以上。

上述光響應性氣體產生劑可含有於黏合劑樹脂中。該黏合劑樹脂發揮固定光響應性氣體產生劑，或使含有光響應性氣體產生劑之材 料具有黏著性，或附加各種功能之作用。例如，可使光響應性氣體產生劑分散於黏合劑樹脂，或可相溶於黏合劑樹脂。藉由使用黏合劑樹脂，容易將含有氣體產生劑之材料加工成所需之形狀。例如，可容易地成形為膜狀等形狀。

作為該黏合劑樹脂之較佳例，可列舉丙烯酸系樹脂、環氧系樹脂等，但並不限定於該等。又，該黏合劑樹脂本身亦可具有藉由光之照射而產生氣體之性質。該黏合劑樹脂可僅使用1種，亦可併用2種以上。

進而，該黏合劑樹脂亦可為具有黏著性者，例如亦可包含黏接著劑樹脂。藉由此種構成，例如於以膜狀等形狀(氣體產生膜等)使用時，變得容易操作。再者，黏接著劑樹脂較佳為具有黏著性不會因光之照射而降低之性質。於該情形時，即便在對氣體產生劑開始光照射後，亦可維持較高之黏接著性。又，黏接著劑樹脂例如較佳為具有不會因光照射而發生交聯之性質。

作為上述黏接著劑樹脂，例如可列舉：橡膠系黏接著劑樹脂、(甲基)丙烯酸系黏接著劑樹脂、聚矽氧系黏接著劑樹脂、胺基甲酸酯系黏接著劑樹脂、苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯共聚物系黏接著劑樹脂、苯乙烯-丁二烯-苯乙烯共聚物黏接著劑樹脂、環氧系黏接著劑樹脂及異氰酸酯系黏接著劑樹脂等。

含有光響應性氣體產生劑之基材亦可進而含有胺化合物。藉由此種構成，可增強基材表面之正電荷，使細胞之附著變得更確實。作為該胺化合物，並無特別限定，可使用一級、二級、或三級之各種胺化合物。

含有光響應性氣體產生劑之基材亦可進而含有光增感劑。作為該光增感劑，可列舉：9-氧硫、二苯甲酮、苯乙酮類及卟啉等。

含有光響應性氣體產生劑之基材亦可視需要進而含有各種添加 劑。作為該添加劑，可列舉：偶合劑、塑化劑、界面活性劑、黏著賦予劑、交聯劑、穩定劑等。作為其他添加劑，可列舉：多孔質體、填料、金屬箔、微膠囊等粒子。若使該等粒子分散於含有氣體產生劑之基材，則會使氣體之擴散變得更快。

以下，以實施例更具體地說明本發明，但本發明並不限定於實施例。

[實施例]

針對圖1中模式性地表示之細胞之剝離方法，使用細胞及光響應性氣體產生膜實際地進行實驗。

於丙烯酸基板(50mm×100mm×2mm)製作直徑7mm之36個凹孔(貫通孔)，於底面貼附氣體產生膜，而製作細胞支持用基材。氣體產生膜係將包含縮水甘油基疊氮聚合物、丙烯酸系聚合物、及9-氧硫 者澆鑄於PET(polyethylene terephthalate，聚對苯二甲酸乙二酯)膜(厚度50μm)上，以乾燥後之厚度成為50μm之方式製作。

於各凹孔中添加包含乳腺癌細胞(1×10⁶個/mL)之培養基40μL，於CO₂培養箱(37℃、5%CO₂)中靜置20分鐘，使細胞附著於膜表面。圖3(a)係表示該時間點之膜上之細胞之顯微鏡照片。

繼而，以光罩覆蓋氣體產生膜之背面側之一部分後，使用LED照射光10秒，使之產生氣體。氣體之產生量為約2μL。將氣體產生後之細胞之樣態示於圖3(b)。即，在光照射前均勻地附著於氣體產生膜之細胞藉由光照射而自氣體產生膜剝離。又，以光罩覆蓋之部分之細胞保持附著於氣體產生膜之狀態，僅經光照射之部分之細胞被剝離。

根據以上內容，藉由對含有光氣體響應性氣體產生劑之基材照射光而產生氣體，可將基材表面之細胞剝離。又，藉由限定光之照射範圍，可僅將位於所需之區域之細胞剝離。

1‧‧‧基材(細胞支持用基材)

2‧‧‧細胞

3‧‧‧氣體產生膜

5‧‧‧阻氣層

6‧‧‧光罩

7‧‧‧氣泡

8‧‧‧液體

Claims (11)

1. 一種細胞之剝離方法，其特徵在於：其係將附著於作為支持體之基材之表面之細胞自上述基材剝離者，且上述基材係含有藉由照射光而產生氣體之光響應性氣體產生劑者，藉由使對上述基材照射光而產生之氣體之氣泡接觸於上述細胞而將上述細胞自上述基材剝離。
2. 如請求項1之細胞之剝離方法，其中對上述基材之一部分即附著有成為剝離對象之細胞之部位選擇性地照射光。
3. 如請求項2之細胞之剝離方法，其中使用使光聚集之透鏡對上述部位選擇性地照射光。
4. 如請求項1至3中任一項之細胞之剝離方法，其中上述基材具有複數個區間，僅對包含剝離對象之細胞之區間照射光。
5. 如請求項1至3中任一項之細胞之剝離方法，其中上述氣體產生劑含有於具有黏著性之黏合劑樹脂中。
6. 如請求項4之細胞之剝離方法，其中上述氣體產生劑含有於具有黏著性之黏合劑樹脂中。
7. 一種細胞支持用基材，其特徵在於：其係用以使細胞附著於表面而支持細胞者，且含有藉由照射光而產生氣體之光響應性氣體產生劑，可使自上述光響應性氣體產生劑產生之氣體之氣泡接觸於上述細胞。
8. 如請求項7之細胞支持用基材，其具有複數個區間，可於各個區間內支持細胞。
9. 如請求項7或8之細胞支持用基材，其中上述氣體產生劑含有於 具有黏著性之黏合劑樹脂中。
10. 一種細胞之培養方法，其特徵在於：其係使細胞附著於如請求項7或8之細胞支持用基材而對上述細胞進行培養。
11. 一種細胞之培養方法，其特徵在於：其係使細胞附著於如請求項9之細胞支持用基材而對上述細胞進行培養。