JP5217220B2 - 細胞分離装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞、あるいは細胞塊（スフェロイド）を含む組織、組織様構造物の形成方法、回収方法に関するものであり、例えば再生医療等に有用なスフェロイド形成方法、および形成したスフェロイドに流速を与える機構、および与えられた流速により剥離してきたスフェロイドを回収する容器に関する。

細胞培養実験はこれまで二次元平面の培養ディッシュの中で行われるのが一般的であり、そこで得られた知見をもとに細胞培養技術が今日までに大きく発展してきた。しかしながら、多細胞生物における細胞や組織は、それぞれが互いに接しているだけではなく、それらを支える基底膜や細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）という生体高分子の複雑な集合体（網目構造）にも接している。すなわち、細胞や組織は生体内では三次元構造の中に存在しているのである。そこで、このような生体内環境を模した細胞培養系であるマトリジェル、あるいは、コラーゲンゲル内部に細胞を埋め込んで培養する方法等が開発された。中でも、マトリジェルはコラーゲンなどのＥＣＭからの抽出物を含有する基底膜マトリックスを可溶化した構造物であり、がん細胞の浸潤アッセイモデルや、血管内皮細胞を用いた血管新生解析モデル等に用いられ、培養ディッシュのような単純な二次元平面での培養系では得られなかった多くの知見をもたらし、この分野の発展に大きく貢献した。また、遺伝子発現に関しても、二次元平面よりも三次元環境で培養することにより、in vivoでの発現状況により近い結果が得られることも知られている。

近年、ナノインプリント技術の微細加工技術を応用し、細胞培養、あるいは組織培養の足場材料に用いる動きがある。これまでに、直径がナノスケールで高さが直径の数十倍ある突起部を複数有する「ナノピラーシート」が開発されている（例えば特許文献１）。ナノピラーシートは、位置、底面積、高さを制御できる有機ポリマー製の柱状微小突起群を備えた機能性基盤であり、半導体デバイス、あるいは光学部品、ストレージデバイス等の分野への応用が進められている。さらにこのナノピラーシートを細胞培養容器として応用する報告もある（例えば、特許文献２）。ナノピラー細胞培養シートの特長は、人工的に設計した微細な立体構造を足場材料として用いることにより前出のマトリジェルでの問題点を解決し、三次元培養用デバイスとしての効果が期待できる点にあり、実際にナノピラーが細胞に対して一定の影響を与えているという知見を得ている（例えば、非特許文献１）。

一方、スフェロイド培養系は生体外における優れた細胞培養系として様々な重要な報告がなされており、肝細胞などの細胞種に適用された例が存在する（例えば、非特許文献２）。このように、スフェロイド培養系は優れた培養系ではあるが、簡便にスフェロイドを形成させる方法、あるいは形成されたスフェロイドを簡便に回収する方法が確立されていないことが問題となっている。これまでに、細胞非接着性基材表面上に、マイクロメートルオーダーで細胞接着性ドメインが存在する細胞培養基材で形成したスフェロイドを形成し、それらを非侵襲的に回収する方法が提案されているが（例えば、特許文献３）、形成時には細胞接着性ドメインの塗布、回収時には二価金属イオンを含まないPBSを用いて培養という煩雑な操作が必要となっている。

特開２００４−１７０９３５ 特開２００５−３１２３４３ 特開２００６−６７９８７ 日本再生医療学会雑誌 5:91-95 (2006) Biochem. Byophys. Res. Comm. 322:684-692 (2004)

培養細胞・組織の臨床応用を考えた場合、簡便な方法によってスフェロイドを形成させることができるならば、その利用価値は非常に大きい。また、形成されたスフェロイドを化学的な標識を行ったり、物理的なダメージを与えることなく回収できる手法があればさらにその利用価値は高まると考えられる。

マトリジェルについては、非常に効果的な実験系ではあったが、バッチによって製品にばらつきがある、目的の実験毎にカスタマイズできない。

上記、非特許文献２記載の方法はスフェロイド培養系を肝細胞に適用した例であり、平面培養の場合は、4日後にはアルブミン生成量が減少したのに比較して、スフェロイド培養をした場合には、アルブミン生成量が最初の6日間は上昇し続け、その後も産生を維持し続けたというものである。しかしながら、こうして得られたアルブミン生成活性をもつスフェロイドを利用しようとしたときには、その回収方法が開発されていない。

また、特許文献３記載の方法はスフェロイドの生成方法と回収方法について記述されているものであるが、細胞接着性ドメインを塗布した基板を利用してスフェロイドの生成、回収時には二価金属イオンを含まないPBSを用いた培養という煩雑な操作が必要となる。

一方で、本発明者らはナノピラーシートの低接着性に依存して、スフェロイドが形成されやすいことを見出した。

これらの理由から、本発明は、ナノピラー細胞培養シートを用いることにより、物理的な作用のみでスフェロイドの生成と回収を行うことを目的としている。さらには、スフェロイドを形成する機構、形成したスフェロイドに流速を与える機構、与えられた流速により剥離してきたスフェロイドを非標識で回収する機構を提供することを目的としている。

本発明者らは、ナノピラーシート上において細胞がスフェロイドを形成しやすくなることを見出した。複数の柱状微小突起を持つナノピラーシートに細胞またはスフェロイドを生成させ、このナノピラーシートを内部に保持する容器に、液流を発生させる駆動部、制御部、シリンジポンプおよび吐出口からなる流速発生部を連結させ、吐出口から流速を与えることによって細胞またはスフェロイドをナノピラーシートから剥離させ、スフェロイド回収部にスフェロイドを回収する構成を提供する。

本発明に係る装置は、一例として、複数の柱状微小突起部を具備する突起部材と、前記突起部材と液体とを収める容器と、前記容器の内部で、前記液体の液流を発生させる制御部と有する。

ナノピラーシート上で簡便にスフェロイドを形成させ、その後に物理的作用のみという非常に簡便な方法で、生成したスフェロイドを回収できる。従来必要であった、スフェロイド形成促進剤のような薬剤や、あるいは細胞培養ディッシュ底面の処理などが必要ない。また、これにより、スフェロイドへのダメージも少ない。さらに、回収されるスフェロイドの大きさによってスフェロイドを分離できる。つまり、径の大きいスフェロイド、または径の小さいスフェロイドを選択的に回収して再生医療分野等へ適用することが可能になる。

以下、本発明の実施例を説明する。なお、実施例ではスフェロイドの培養に関する例を記載するが、本発明はスフェロイドを形成しない細胞、あるいはスフェロイドを含む組織、組織様構造物などにも適用しうるものである。

本発明の一実施例を、図１を用いて説明する。図１(a)、(b)は装置を横から見た図であり、(c)は装置を上から見た図である。図１(a)は培養時を、図１(b)、(C)は回収時を示す。本装置は、スフェロイドを形成させる基盤のナノピラーシート部（１０１）を持っている。以下、ナノピラーシートとは、図７に一例として示す通り、熱可塑性の有機ポリマーから構成される基体１と、基体から延伸した柱状微小突起部の群２を有する突起部材をいう。特に、該柱状微小突起群を構成する突起は、相当直径が１０ｎｍから５００μｍ、高さが５０ｎｍから５０００μｍであってもよい。ナノピラーシート部（１０１）は正方形であっても良いし、長方形であっても良い。また、ナノピラーシート部１０１は基体の端部（１０１’）が柱状微小突起群よりも高さが高い壁状となっている。柱状微小突起群は四方をこの壁に囲まれており、液体培地を保持できる構造になっている。ここで細胞培養を行い、培養時には蓋（１０２）をする。このナノピラーシート部は、容器（１０３）の中に配置されている。

形成されたスフェロイドを回収する際、蓋（１０２）をはずし、ナノピラーシート部を保持する容器（１０１）の外に、液流を発生させる制御部（１０４）、駆動部（１０５）、シリンジポンプ（１０６）が配置される。液流はシリンジポンプ（１０６）からチューブを通して吐出口（１０７）よりナノピラーシート部（１０１）に与えられ、ナノピラーシート部（１０１）に形成されたスフェロイドに液流を与えて回収する。制御部（１０４）および駆動部（１０５）で液体の流速を規定できる。吐出口（１０７）の下には、液流を実質的に均一にナノピラーシート部に与えるための第1板状部材（拡散板）（１０８）が備えられている。第1板状部材は、ナノピラーシート部に対して0度よりも大きい角度をもって配置される。液流を受けたスフェロイドの一部は、ナノピラーシート部から溢れ出し、ナノピラーシート部に対して0度よりも大きい角度をもって配置される第２板状部材（傾斜板）（１０９）を通して、スフェロイド回収部（１１０）に集められる。スフェロイド回収部（１１０）は、ナノピラーシート部に隣接して、液流方向でナノピラーシート部より下流位置に配置される。

一方、液流を受けてもあふれ出ないスフェロイドはナノピラーシート部（１０１）に留まっている。スフェロイド回収部は中央が凹んでいる構造のため、溢れ出たスフェロイドはこの部分に集積し、容易に回収することができる。

図１で示した装置を用いた、実験例を示す。材料にはチャイニーズハムスター肺繊維芽細胞様セルラインであるＶ７９を用いた。ピラー径が０．５μｍ、１．０μｍ、２．０μｍのナノピラーシート部（１０１）に１．０x１０^５cells/mlで播種し、７２時間培養した。培養には、ＦＢＳ（ＩＣＮ社）を終濃度１０％になるように添加したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）を使用した。スフェロイドが形成されたことを確認後、１７３μｌ／ｓ、２４６μｌ／ｓ、４９２μｌ／ｓの液流をシリンジポンプ（１０６）を通して拡散板（１０８）上の吐出口（１０７）から与え、スフェロイド回収操作を行った。

その結果、スフェロイドの一部がスフェロイド回収部（１１０）に回収され、残りのスフェロイドはナノピラーシート部に留まっていたことが示された。回収操作後に、スフェロイド回収部に回収されたスフェロイドと、ナノピラーシート部に留まっているスフェロイドの直径を比較した。結果を図２に示す。スフェロイド回収部（１１０）に回収されたスフェロイドの直径の平均値が流速によらず８０μｍであったのに対し、ナノピラーシート部に留まっていたスフェロイドの平均値は１００μｍを越えていた。本結果の模式図を図３に示す。(a)が分離操作前、(b)が分離操作後の様子を示す。形成されたスフェロイド（３０１）のうち、より大きなものはナノピラーシート上に留まったのに対し、より小さなスフェロイドはスフェロイド回収部に分離された様子を示している。このことから、スフェロイドの直径の違いにより分離できることが示された。

また、回収操作後にナノピラーシート上に留まっていたスフェロイドと、ナノピラーシートから剥離して回収されたスフェロイドをそれぞれトリプシン溶液によって処理し、細胞をばらばらにして培養ディッシュに播種し直し、４日間培養して細胞の増殖能を検証した。結果を図４に示す。培養開始時（図４、start）の細胞数と比較した結果、流速によらず、ナノピラーシートに留まっていたスフェロイドを構成する細胞(図４、on pillar)も、ナノピラーシートから剥離してきたスフェロイドを構成する細胞(図４、overflowed)も共に単位時間当たりの増殖能の差は検出されなかった（図４）。このことから、本発明の分離操作による細胞へのダメージはないことが示された。

本発明の他の実施例を、図５を用いて説明する。図５(a)、(c)、(d)は各々の装置例を横から見た図であり、(b)は上から見た図である。この装置は、スフェロイドを形成させる基盤のナノピラーシート部（５０１）を持っている。ナノピラーシート部（５０１）は正方形であっても良いし、長方形であっても良い。また、容器（５０２）の中に配置されているため、液体培地を保持できる構造になっており、ここで細胞の培養を行う。蓋は５０３にて示す（図５(a)、(c)、(d)は蓋がついている様子を、図５(b)は蓋をはずした様子を示す。）ナノピラーシート部を保持する容器（５０２）の外には液流を発生させる制御部（５０４）、駆動部（５０５）、シリンジポンプ（５０６）が配置され、液流はシリンジポンプ（５０６）からチューブを通して吐出口（５０７）からナノピラーシート部（５０１）に与えられ、ナノピラーシート部（５０１）に形成されたスフェロイドに液流を与えて回収する。制御部（５０４）および駆動部（５０５）で液体の流速を規定できる。

液流によってスフェロイドはスフェロイド回収部（５０８）に回収されるが、その際、吐出口（５０７）とは反対側の仕切り（５０９）を取り外さなくてはならない。その機構は、仕切りを切断して回収路を確保した、ナノピラーシート部と接さないように配置される板状部材でも良いし（５０９１）、スフェロイド形成時には仕切り下部を接合部材（ここではゴムパッキン）で固定していて、そのゴムパッキンを剥がすことにより回収路を確保する方法でも良いし（図５(c)５０９２）、あるいは仕切りが上下移動することにより回収路を確保する方法でも良い（図５(c)５０９３）。液流を受けたスフェロイドの一部は、ナノピラーシート部から溢れ出し、スフェロイド回収部（５０８）に集められる。一方、液流を受けても溢れ出ないスフェロイドはナノピラーシート部（５０１）に留まっている。スフェロイド回収部（５０８）は中央が凹んでいる構造のため、溢れ出たスフェロイドはこの部分に集積し、容易に回収することができる。

このように液流路を設置しうる仕切りをナノピラーシート部とスフェロイド回収部との間に設けることにより、ナノピラーシートの領域を容器内に多く設けながら、スフェロイドを育成段階と回収段階での液体配置制御を容易に行うことができる。本実施例では、スフェロイドがスフェロイド回収部に至る過程で、従来のナノピラーシートには存在した壁を越える必要がないため、より効率的にスフェロイドを回収できる。

本発明の実施例を、図６を用いて説明する。図６(a)(c)は装置を横から見た図であり、(b)は上から見た図である。この装置は、スフェロイドを形成させる実質的に円形のナノピラーシート部（６０１）を持ち、その実質的な中央には実質的に円錐形の構造（円錐部：６０２）を保持している。細胞培養時(a)には、ねじつきの蓋（６０３）で締めることによって液体培地を保持できる構造になっており、ここで細胞培養を行う。ここに細胞懸濁液を添加するために、フタ中央部に穴（６０４）が開いている。培養時、この穴はゴムパッキン（６０５）で塞ぐことができる。これらの基盤は、これを収める容器（６０６）の中に配置されている。スフェロイドを回収する際（(b)に図示）には、このフタを取り除く。ナノピラーシート部を保持する容器（６０６）の外には液流発生を行う制御部（６０７）、駆動部（６０８）、シリンジポンプ（６０９）が配置されている。ナノピラーシート部上部のシリンジポンプ（６０９）液流から円錐部（６０２）の頂点もしくはその近傍に液体が滴下されることにより液流が発生し、ナノピラーシート部（６０１）に同心円状に液流が与えられる。与えられた液流によってスフェロイドはスフェロイド回収部（６１０）に回収される。スフェロイド回収部（６１０）に至る過程には、傾斜が設けてあるため、剥離してきたスフェロイドは、その傾斜によってスフェロイド回収部（６１０）に集積し、容易に回収することができる。

これまで細胞培養は二次元平面上での単層培養が主流であったが、生体内環境は三次元であり、この環境を模した細胞培養系および三次元構造を持った細胞群の生成が不可欠である。本発明は、このような三次元構造をもった細胞塊であるスフェロイドの形成が容易であるだけでなく、スフェロイドを回収することも簡便に行うことができ、特に再生医療分野での産業可能性を有する。

実施例１に示す装置構成。 分離操作後のスフェロイド径平均値。 分離操作前後のイメージ図。 分離操作後にナノピラー上に留まっていたスフェロイドと剥離回収されたスフェロイドをトリプシン処理後に播種して４日間培養した時点での細胞数。 実施例２に示す装置構成。 実施例３に示す装置構成。 ナノピラーシートの例。

Claims (11)

1. 複数の柱状微小突起部を具備し、当該柱状微小突起部において細胞を保持できる突起部材と、当該突起部材を内部に備え、液体培地を保持できる基体と、
   前記基体内の前記突起部材に対して液流を供給する突出口を有する液流発生手段と、を備え、
   前記突出口から前記突起部材に向かう前記液流の進路上に、拡散部材を備えることを特徴とする細胞分離装置。
2. 前記液流方向で前記突起部材より下流位置に配置され、前記細胞を回収する回収部をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
3. 前記基体は、熱可塑性の有機ポリマーから構成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
4. 前記基体は、前記突起部材を囲う様に構成され、当該基体の端部の高さが前記柱状微小突起部よりも高いことを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
5. 前記拡散部材は、前記突出口と前記突起部材との間に、前記突起部材に対して0度よりも大きい角度をもって配置された第1板状部材であることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
6. 前記拡散部材は、前記突出口と前記突起部材との間に配置された円錐部であり、
   前記突起部材は、当該円錐部を囲むように配置されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
7. 前記突起部材と前記回収部との間に、前記突起部材に対して0度よりも大きい角度をもって配置される第２板状部材をさらに有する請求項２に記載の細胞分離装置。
8. 前記液流発生手段は、前記液流を発生させる制御部と、駆動部とポンプを備え、
   前記ポンプからチューブを介して前記突出口より前記液流が突出することを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
9. 前記制御部は、前記突起部材に前記液流を均一に与えるように制御をすることを特徴とする請求項８に記載の細胞分離装置。
10. 前記突起部材と前記回収部との間に配置される、液流路を設置しうる仕切りをさらに有することを特徴とする請求項２に記載の細胞分離装置。
11. 前記基体と前記突起部材と、前記回収部と前記拡散部材とを内部に配置できる容器を備えることを特徴とする請求項２に記載の細胞分離装置。

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