JP2005237376A - パターニング用基板および細胞培養基板 - Google Patents

パターニング用基板および細胞培養基板 Download PDF

Info

Publication number
JP2005237376A
JP2005237376A JP2005020345A JP2005020345A JP2005237376A JP 2005237376 A JP2005237376 A JP 2005237376A JP 2005020345 A JP2005020345 A JP 2005020345A JP 2005020345 A JP2005020345 A JP 2005020345A JP 2005237376 A JP2005237376 A JP 2005237376A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell adhesion
photocatalyst
cell
substrate
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2005020345A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4826092B2 (ja
Inventor
Hideyuki Miyake
秀之 三宅
Shuji Hattori
秀志 服部
Hironori Kobayashi
弘典 小林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dai Nippon Printing Co Ltd
Original Assignee
Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dai Nippon Printing Co Ltd filed Critical Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority to JP2005020345A priority Critical patent/JP4826092B2/ja
Publication of JP2005237376A publication Critical patent/JP2005237376A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4826092B2 publication Critical patent/JP4826092B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings

Landscapes

  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

【課題】 本発明は、基材上に細胞を高精細なパターン状に接着し、培養させるために用いられる細胞培養用パターニング基板や、細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等を提供することを主目的としている。
【解決手段】 上記目的を達成するために、本発明は、基材と、前記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層とを有することを特徴とするパターニング用基板を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞を高精細なパターン状に接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板や、その細胞培養用パターニング基板の形成に用いられるパターニング用基板、そのパターニング用基板を形成するために用いられるパターニング用基板用コーティング液、および細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板に関するものである。
現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
一部の細胞、特に多くの動物細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にしたり、細胞の形態に影響を与えることが知られている。
一方、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
例えば、特許文献１には、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用している。また、特許文献２では、細胞接着阻害性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。
さらに、特許文献３では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
しかしながら、このような細胞培養部位のパターニングは、用途によっては高精細であることが要求される場合がある。上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体高分子等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。また、フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。
さらに、高精細な細胞接着性材料のパターンの形成方法として、マイクロ・コンタクトプリンティング法が、ハーバード大学のジョージ Ｍ，ホワイトサイズ(George M. Whitesides)により提唱されている（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７等）。しかしながら、この方法を用いて工業的に細胞接着性材料のパターンを有する細胞培養基材を製造することは難しいといった問題があった。
特開平２−２４５１８１号公報 特開平３−７５７６号公報 特開平５−１７６７５３号公報 米国特許第５，５１２，１３１号公報 米国特許第５，９００，１６０号公報 特開平９−２４０１２５号公報 特開平１０−１２５４５号公報
そこで、基材上に細胞を高精細なパターン状に接着し、培養させるために用いられる細胞培養用パターニング基板や、細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等の提供が望まれている。
本発明は基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層とを有することを特徴とするパターニング用基板を提供する。
本発明によれば、上記細胞接着層が上記細胞接着材料を含有することから、上記細胞接着層に例えば光触媒を含有する光触媒含有層等を用いて、エネルギーをパターン状に照射することにより、細胞接着材料が分解または変性されて細胞との接着性を有しない領域と、細胞接着材料が残存し、細胞との接着性が良好な領域とを形成することが可能なパターニング用基板とすることができる。
上記発明においては、上記基材上に遮光部が形成されているものとすることができる。これにより、例えば上記細胞接着層と光触媒を含有する光触媒含有層等とを対向させて、基材側からエネルギーを照射することにより、遮光部の形成されていない領域のみにエネルギーを照射し、細胞接着材料を分解または変性させることが可能となるからである。
また本発明は、上記パターニング用基板の上記細胞接着層が、パターン状に上記細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の領域である細胞接着部とを有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板を提供する。
本発明によれば、上記細胞接着材料が分解または変性されて細胞との接着性が低い細胞接着阻害部と、上記細胞接着材料が分解または変性されずに、細胞との接着性が良好な細胞接着部とを有することから、複雑な工程や、細胞に悪影響を及ぼすような処理液等を用いることなく、細胞接着部のみに高精細に細胞を接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板とすることができる。
本発明はまた、上記細胞培養用パターニング基板の、上記細胞接着部上に、細胞が接着していることを特徴とする細胞培養基板を提供する。
本発明によれば、上記細胞培養用パターニング基板には、細胞との接着性が良好な細胞接着部と、細胞との接着性が低い細胞接着阻害部とが形成されていることから、容易に細胞接着部上にのみ細胞を接着することができ、高精細なパターン状に細胞が接着した細胞培養基板とすることができる。またこの際、細胞培養基板内に光触媒が含有されている必要がないことから、経時で光触媒が細胞に影響を及ぼす可能性もないものとすることができる、という利点も有する。
また本発明は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料と、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有する材料とを含有することを特徴とするパターニング用基板用コーティング液を提供する。
本発明によれば、上記パターニング用基板用コーティング液を基板等の上に塗布して層を形成することにより、上記細胞接着材料により、細胞との接着性が良好な層とすることができる。また、この層に、例えば光触媒を含有する光触媒含有層等を用いてエネルギーを照射することによって上記細胞接着材料を分解または変性することができ、さらに上記細胞接着阻害材料が含有されていることから、細胞との接着性を低いものとすることができる。したがって、容易に細胞との接着性が良好な領域と、細胞との接着性が低い領域とを形成することが可能なパターニング用基板用コーティング液とすることができる。
またさらに本発明は、基材上に、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層を形成する細胞接着層形成工程と、
上記細胞接着層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成するエネルギー照射工程と
を有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板の製造方法を提供する。
本発明によれば、上記細胞接着層形成工程により形成された細胞接着層に細胞接着材料が含有されていることから、上記エネルギー照射工程において、上記光触媒含有層側基板を用いてパターン状にエネルギーを照射することにより、容易に細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、エネルギーが照射されていない細胞との接着性が良好な細胞接着部とが形成された細胞培養用パターニング基板とすることができるのである。また本発明によれば、上記光触媒含有層側基板を用いることから、細胞培養用パターニング基板中に光触媒が含有される必要がなく、例えば上記細胞接着部上に細胞が接着した場合であっても、経時で光触媒が細胞に影響を与えること等のない、高品質な細胞培養用パターニング基板とすることができるのである。
また、本発明は、上記細胞培養用パターニング基板の製造方法により製造された細胞培養用パターニング基板の上記細胞接着部上に、細胞を接着させる細胞接着工程を有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法を提供する。
本発明によれば、上記細胞培養用パターニング基板上には、細胞との接着性が良好な細胞接着部と、細胞との接着性が低い細胞接着阻害部とが形成されていることから、細胞が容易に細胞接着部上にのみ高精細に接着された細胞培養基板を製造することができるのである。
またさらに本発明は、基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料およびバインダを含有する細胞接着層と、上記細胞接着層上にパターン状に形成された細胞とを有し、上記細胞接着層は、上記細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部、および上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部を有しており、上記細胞が上記細胞接着部上に形成されている細胞培養基板の製造方法であって、
上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、上記細胞接着阻害部に、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板を、上記細胞接着層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる細胞維持工程を有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法を提供する。
本発明によれば、上記細胞接着工程により細胞接着部上に細胞を接着させた後、上記細胞維持工程において、上記光触媒含有層側基板を用いて上記細胞培養基板の細胞接着阻害部にエネルギーを照射することにより、細胞接着阻害部に接着した細胞等を除去することが可能となり、細胞接着部のみに高精細なパターン状に細胞が接着した細胞培養基板とすることができる。
本発明によれば、上記細胞接着材料を含有する細胞接着層を有することから、上記細胞接着層に、例えば光触媒を含有する光触媒含有層等を用いてエネルギーをパターン状に照射することにより、細胞接着材料が分解または変性されて細胞との接着性を有しない領域と、細胞接着材料が残存する細胞との接着性が良好な領域とを形成することが可能なパターニング用基板とすることができる、という効果を奏する。
本発明は、細胞を高精細なパターン状に接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板や、その細胞培養用パターニング基板の形成に用いられるパターニング用基板、そのパターニング用基板を形成するために用いられるパターニング用基板用コーティング液、および細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等に関するものである。以下、それぞれについてわけて説明する。
Ａ．パターニング用基板用コーティング液
まず、本発明のパターニング用基板用コーティング液について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料と、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害材料とを含有するものである。
本発明のパターニング用基板用コーティング液は、上記細胞接着材料を含有していることから、パターニング用基板用コーティング液を例えば基材等の上に塗布して層を形成した場合に、細胞との接着性が良好なものとすることができる。また、その層に例えば光触媒を含有する光触媒含有層等を対向させてエネルギーを照射した場合には、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着材料が分解または変性され、細胞との接着性を低いものとすることができる。またこの際、パターニング用基板用コーティング液中には上記細胞接着阻害材料が含有されていることから、この細胞接着阻害材料の細胞接着阻害性によって、細胞との接着性をより低いものとすることができる。したがって、本発明によれば、上記パターニング用基板用コーティング液を塗布した層の、エネルギーが照射されていない領域のみ、高精細なパターン状に細胞を接着させることが可能なものとすることができる。
以下、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる各構成について説明する。
１．細胞接着材料
まず、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着材料について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着材料は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性されるものであれば、その種類等は特に限定されるものではない。ここで、細胞と接着性を有するとは、細胞と良好に接着することをいい、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞と良好に接着することをいう。
本発明に用いられる細胞接着材料は、このような細胞との接着性を有しており、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性されて、細胞との接着性を有しなくなるものや、細胞との接着を阻害する細胞接着阻害性を有するものに変化するもの等が用いられる。
ここで、上記のような細胞と接着性を有する材料には、物理化学的特性により細胞と接着性を有する材料と、生物化学的特性により細胞と接着性を有する材料との２種類がある。
物理化学的特性により細胞と接着性を有する材料の、細胞との接着性を決定する物理化学的な因子としては、表面自由エネルギーや、静電相互作用等が挙げられる。例えば細胞との接着性が材料の表面自由エネルギーにより決定される場合には、材料が所定の範囲内の表面自由エネルギーを有すると細胞と材料との接着性が良好となり、その範囲を外れると細胞と材料との接着性が低下することとなる。このような表面自由エネルギーによる細胞の接着性の変化としては、例えば資料ＣＭＣ出版 バイオマテリアルの最先端 筏 義人（監修）ｐ．１０９下部に示されるような実験結果が知られている。このような因子により細胞との接着性を有する材料としては、例えば親水化ポリスチレン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の表面の官能基が置換等されたり、分解されること等によって、表面自由エネルギーが変化し、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
また、静電相互作用等により細胞と材料との接着性が決定される場合、例えば材料が有する正電荷の量等によって細胞との接着性が決定されることとなる。このような静電相互作用により細胞との接着性を有する材料としては、例えばポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物およびそれらを含む縮合物等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記材料が分解または変性されることによって、例えば表面に存在する正電荷量を変化させることができ、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
また、生物学的特性により細胞と接着性を有する材料としては、特定の細胞と接着性が良好なもの、または多くの細胞と接着性が良好なもの等が挙げられ、具体的には、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の構造の一部を破壊したり、主鎖を破壊すること等によって、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
このような細胞接着材料は、材料の細胞接着能により適宜最適化されるものであるが、パターニング用基板用コーティング液中に通常０．０００１重量％〜３０重量％、中でも０．００１重量％〜１０重量％含有されていることが好ましい。これにより、細胞接着材料を含有する領域を細胞との接着性が良好な領域とすることができるからである。
２．細胞接着阻害材料
次に、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着阻害材料について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着阻害材料は、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有するものである。ここで、上記細胞接着阻害性とは、パターニング用基板用コーティング液が塗布されて層が形成された際に、エネルギーが照射された領域に細胞が接着することを阻害する性質をいうこととする。また、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞との接着を阻害する性質を有することをいう。
本発明においては、このような細胞接着阻害性を少なくともエネルギー照射された後に有するものであれば、特にその材料等は限定されるものではなく、例えばエネルギー照射される前から、細胞接着阻害性を有するものであってもよく、またエネルギー照射される前は細胞接着阻害性を有しておらず、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞との接着性が低くなり、細胞接着阻害性を発揮するもの等であってもよい。
本発明においては、特にエネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着阻害性を有するものとなる細胞接着阻害材料を用いることが好ましい。これにより、エネルギー照射される前の領域においては、上記細胞接着材料の細胞との接着性を阻害することがなく、エネルギー照射された領域のみを、細胞との接着性が低いものとすることができるからである。
このような細胞接着阻害材料として用いられる材料としては、例えば主骨格が光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような有機置換基を有するものが好ましく、例えば、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）撥水牲や撥油性に優れた反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
上記の（１）の場合、一般式：
ＹｎＳｉＸ（４−ｎ）
（ここで、Ｙはアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基を示し、Ｘはアルコキシ基、アセチル基またはハロゲンを示す。ｎは０〜３までの整数である。）
で示される珪素化合物の１種または２種以上の加水分解縮合物もしくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでＹで示される基の炭素数は１〜２０の範囲内であることが好ましく、また、Ｘで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
また、上記の（２）の反応性シリコーンとしては、下記一般式で表される骨格をもつ化合物を挙げることができる。
Figure 2005237376
ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｒ１，Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜２０の置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、アリールあるいはシアノアルキル基であり、モル比で全体の４０％以下がビニル、フェニル、ハロゲン化フェニルである。また、Ｒ１、Ｒ２がメチル基のものが表面エネルギーが最も小さくなるので好ましく、モル比でメチル基が６０％以上であることが好ましい。また、鎖末端もしくは側鎖には、分子鎖中に少なくとも１個以上の水酸基等の反応性基を有する。上記のような材料を用いることによって、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、エネルギー照射された領域の表面を高い親水性を有するものとすることができる。これにより、細胞との接着が阻害され、エネルギー照射された領域には細胞が接着しないものとすることができるからである。
上記材料を細胞接着阻害材料として用いる場合、エネルギーが照射される前の水との接触角が１５°〜１２０°、中でも２０°〜１００°の範囲内となるものであることが好ましい。これにより、上記細胞接着材料の細胞との接着性を阻害することのないものとすることができるからである。
また、この細胞接着阻害材料にエネルギーが照射された場合には、水との接触角が１０°以下となるものであることが好ましい。上記範囲とすることにより、高い親水性を有するものとすることができ、細胞との接着性を低いものとすることができるからである。
なお、ここでいう水との接触角は、水、もしくは同等の接触角を有する液体との接触角を接触角測定器（協和界面科学（株）製ＣＡ−Ｚ型）を用いて測定（マイクロシリンジから液滴を滴下して３０秒後）し、その結果から、もしくはその結果をグラフにして得たものである。
また、上記のオルガノポリシロキサンとともに、ジメチルポリシロキサンのような架橋反応をしない安定なオルガノシリコン化合物をバインダに混合してもよい。
また、本発明においては、エネルギーが照射された領域の濡れ性の変化を起こさせること等により、細胞との接着性が低下する、もしくはそのような変化を補助する分解物質等を上記細胞接着阻害材料とともに用いてもよい。
このような分解物質としては、例えばエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解等されて、親水性となること等により、細胞との接着性が低下する界面活性剤等を挙げることができる。具体的には、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることができ、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
また、界面活性剤の他にも、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ベタイン構造を有する両性イオン材料、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチル）フォスフォリルコリンなどのリン脂質含有材料、ポリ（２−メトキシエチル）アクリレート、不飽和ポリエステル、アクリル樹脂、ポリエチレン、ジアリルフタレート、エチレンプロピレンジエンモノマー、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、メラミン樹脂、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、スチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ナイロン、ポリエステル、ポリブタジエン、ポリベンズイミダゾール、ポリアクリルニトリル、エピクロルヒドリン、ポリサルファイド、ポリイソプレン等のオリゴマー、ポリマー等を挙げることができる。
本発明においては、このような細胞接着阻害材料は、パターニング用基板用コーティング液中に０．００１重量％から６０重量％、中でも０．０１重量％〜４０重量％、特に０．１重量％〜２０重量％の範囲内含有されることが好ましい。
３．パターニング用基板用コーティング液
次に、本発明のパターニング用基板用コーティング液について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液は、上記細胞接着材料と、上記細胞接着阻害材料とを含有するものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜バインダ等の成分を含有しているものであってもよい。バインダを含有させることにより、パターニング用基板用コーティング液を、例えば基材等の上に塗布する際の塗工が容易なものとすることや、形成された層に強度や耐性を付与する等、様々な特性を付与することが可能となるからである。このようなバインダとしては、パターニング用基板用コーティング液が必要とされる目的に応じて適宜選択される。なお、本発明においては、このバインダとしての役割を、上記細胞接着阻害材料が果たすものとすることが好ましい。
また、本発明のパターニング用基板用コーティング液には、光触媒が含有されていないことが好ましい。これにより、例えばパターニング用基板用コーティング液が塗布された層上に、細胞を接着した場合に、経時で光触媒が細胞に影響を及ぼす可能性のないものとすることが可能となるからである。
Ｂ．パターニング用基板
次に、本発明のパターニング用基板について説明する。本発明のパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層とを有するものである。
本発明のパターニング用基板は、例えば図１に示すように、基材１上に、上記細胞接着材料およびバインダを含有する細胞接着層２が形成されている。本発明によれば、この細胞接着層中に、上記細胞接着材料が含有されていることから、例えば光触媒を含有する光触媒含有層等を上記細胞接着層と対向させて、エネルギーを照射することにより、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって細胞接着材料を分解または変性させることができ、細胞との接着性を有しないものとすることができる。また、エネルギーが照射されていな領域においては、細胞接着材料が残存することから、上記細胞接着材料の細胞との接着性により、細胞と接着性を有するものとすることができる。したがって、特別な装置や複雑な工程等を必要とせず、パターン状に上記光触媒含有層等を用いてエネルギーを照射することによって、細胞との接着性が良好な領域と、細胞との接着性が低い領域とを形成することが可能な細胞培養用パターニング基板を形成することができるのである。
ここで、本発明のパターニング用基板は、例えば図２に示すように、基材１上に遮光部３が形成されているものであってもよい。このような遮光部が形成されている場合には、例えば光触媒を含有する光触媒含有層等を細胞接着層と対向させて、基材側等から全面にエネルギーを照射することによって、遮光部が形成されていない領域上の細胞接着層中に含有される細胞接着材料のみが分解または変性されることとなる。これにより、例えばフォトマスク等を用いることなく、パターン状にエネルギーを照射することができ、容易に細胞が接着する領域と、細胞が接着しない領域とを形成することが可能となる。
以下、本発明のパターニング用基板の各構成について説明する。
１．細胞接着層
まず、本発明に用いられる細胞接着層について説明する。本発明に用いられる細胞接着層は、後述する基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有するものであれば、特に限定されるものではない。
このような細胞接着層としては、例えば細胞と接着性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料およびバインダを含有するコーティング液等を用いて、層を形成したもの等とすることができる。具体的には、「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」の項で説明したような細胞接着材料および細胞接着阻害材料をバインダとして含有するパターニング用基板用コーティング液を用いて、層を形成したものとすることが好ましい。これにより、細胞接着層にエネルギーが照射された際に、エネルギーが照射された領域の細胞との接着性をより低いものとすることができ、エネルギーが照射されていない領域のみに、高精細なパターンで細胞を接着させることができるからである。
このような細胞接着層を形成する方法としては、上記パターニング用基板用コーティング液等を一般的な塗布方法により塗布すること等によって形成することができ、塗布方法として具体的には、スピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法、ロールコート法、ビードコート法等を用いることができる。また、吸着法も好適に用いることができる。
また、例えば後述する基材に凹部が形成されている場合には、上記基材の凹部にパターニング用基板用コーティング液等を滴下し、乾燥させて細胞接着層とするキャスト法や、上記基材の凹部にパターニング用基板用コーティング液等を滴下し、所定時間後、洗浄する吸着法等も用いることができる。
本発明における細胞接着層に用いられる細胞接着材料や細胞接着阻害材料等については、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略する。
上記細胞接着層の膜厚としては、パターニング用基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．００１〜１μｍ程度、中でも０．００５〜０．１μｍ程度とすることができる。
なお、本発明における細胞接着層中には、光触媒が含有されてないことが好ましい。これにより、例えば細胞接着層上に細胞が接着等された場合に、経時で光触媒が細胞に影響を与えることを防ぐことができ、高品質なものとすることができるからである。なお、このような細胞接着層の上記細胞接着材料を分解または変性させる方法としては、例えば光触媒を含有する光触媒含有層を対向させてエネルギーを照射することにより、行うことができる。
２．基材
次に、本発明に用いられる基材について説明する。本発明に用いられる基材は、上記細胞接着層を形成可能な層であれば、特に限定されるものではなく、例えば金属、ガラス、シリコン等の無機材料、およびプラスチックで代表される有機材料等を用いることができる。
ここで、基材の可撓性等はパターニング用基板の種類や用途等によって適宜選択される。また、上記基材の透明性は、パターニング用基板の種類や、上記細胞接着材料を分解または変性させるために照射されるエネルギーの照射方向等によって、適宜選択され、例えば基材が遮光部等を有しており、上記エネルギーの照射が、基材側から行われる場合等には、基材が透明性を有するものとされる。
なお、本発明においては、基材が平坦なものであってもよいが、基材に凹部が形成されていてもよい。このような基材としては、例えば図１３（ａ）に示すように、１つの凹部が形成されているものであってもよく、また例えば図１３（ｂ）に示すように、複数の凹部が形成されているものであってもよい。
またこの際、上記凹部を有する基材の側壁に上記細胞接着層が形成されないように処理が施されたものであってもよい。このような処理としては、例えばマスク等を用いてＣＶＤ法により上記側壁のみに撥液性を有する材料を付着させる方法や、上記凹部全面に撥液性を有する材料を付着させた後、筒状のマスク等を用いて紫外線処理やプラズマ処理等を行い、上記凹部の底面のみ、親液化させる方法等が挙げられる。
ここで、本発明において、上記基材は、アルカリ洗浄等の薬液洗浄されたものであってもよく、また酸素プラズマ処理や紫外線処理等のドライ洗浄が行われたものであってもよい。この場合、上記パターニング用基板用コーティング液等の濡れ性が向上する。またさらに表面に反応性の官能基が配置されることとなることから、細胞接着層の密着性が向上する、という利点を有する。
ここで、本発明の基材には、上述したように、遮光部が形成されていてもよい。本発明に用いることが可能な遮光部としては、パターニング用基板に照射されるエネルギーを遮断することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、例えばスパッタリング法、真空蒸着法等により厚み１０００〜２０００Å程度のクロム等の金属薄膜を形成し、この薄膜をパターニングすることにより形成されてもよい。このパターニングの方法としては、スパッタ等の通常のパターニング方法を用いることができる。
また、樹脂バインダ中にカーボン微粒子、金属酸化物、無機顔料、有機顔料等の遮光性粒子を含有させた層をパターン状に形成する方法であってもよい。用いられる樹脂バインダとしては、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ゼラチン、カゼイン、セルロース等の樹脂を１種または２種以上混合したものや、感光性樹脂、さらにはＯ／Ｗエマルジョン型の樹脂組成物、例えば、反応性シリコーンをエマルジョン化したもの等を用いることができる。このような樹脂製遮光部の厚みとしては、０．５〜１０μｍの範囲内で設定することができる。このような樹脂製遮光部のパターニングの方法は、フォトリソ法、印刷法等一般的に用いられている方法を用いることができる。
なお、上記遮光部は、基材の上記細胞接着層が形成される側の面に形成されるものであってもよく、また反対側の面に形成されるものであってもよいが、精度が良好となる点から、図２に示すように基材１の、細胞接着層２が形成される側の面に遮光部３が形成されることが好ましい。
３．パターニング用基板
次に、本発明のパターニング用基板について説明する。本発明のパターニング用基板は、上述した基材上に細胞接着層が形成されたものであれば、特に限定されるものではなく、例えば必要に応じて他の層が積層されたもの等であってもよい。
Ｃ．細胞培養用パターニング基板
次に、本発明の細胞培養用パターニング基板について説明する。本発明の細胞培養用パターニング基板は、上記パターニング用基板の上記細胞接着層が、パターン状に上記細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の領域である細胞接着部とを有するものである。
本発明の細胞培養用パターニング基板は、例えば図３に示すように、基材１とその基材１上に形成された細胞接着層を有するものであり、その細胞接着層に含有される細胞接着材料が分解または変性して、細胞との接着性を有しない細胞接着阻害部４と、その細胞接着阻害部以外の細胞との接着性が良好な細胞接着部２´とを有するものである。
本発明によれば、細胞接着部と細胞接着阻害部とを有することから、容易に細胞接着部上にのみ細胞を接着させることができ、例えば細胞接着層の全面に細胞を塗布した場合であっても、細胞接着部上のみに、高精細に細胞を接着させることが可能となるのである。
また、本発明によれば、細胞接着部上に細胞を接着させた後、例えば上記細胞接着層と光触媒を含有する光触媒含有層等を対向させて配置し、基材側から全面にエネルギーを照射すること等によって、細胞が接着した細胞接着部の細胞接着材料を分解または変性させることができ、細胞との接着性が低いものとすることができる。これにより、細胞接着部上に接着した細胞を剥離することができ、パターン状に形成された細胞を得ることができるのである。なお、この際照射されるエネルギーは細胞に影響を与えない程度のエネルギーとされる。
ここで、本発明においては、例えば図４に示すように、上記細胞接着層２の細胞接着部２´と同じパターン状に、基材１に遮光部３が形成されていてもよい。このような遮光部が形成されていることにより、例えば、上述した「Ｂ．パターニング用基板」で説明したパターニング用基板を形成し、光触媒を含有する光触媒含有層を細胞接着層と対向させて配置し、基材側からエネルギーを照射することによって、遮光部が形成されていない領域上のみの細胞接着材料を分解または変性させることができ、上記細胞接着阻害部が容易に形成されたものとすることができるからである。
また、本発明の細胞培養用パターニング基板の細胞接着部上に細胞を接着した後、上記光触媒含有層等を細胞接着層と対向させて基材側からエネルギーを照射することによって、細胞接着阻害部のみにエネルギーを照射することができる。これにより、細胞接着阻害部に細胞が付着した場合等であっても、このエネルギーの照射により、細胞接着阻害部上の細胞を除去することができ、高精細なパターンを保つことが可能となる。
ここで、上記細胞接着部とは、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する領域であり、目的とする細胞との接着性が良好な領域である。ここで、細胞との接着性を有するとは、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」の項で説明したような物理化学的細胞接着性や生物学的細胞接着性を有することとする。
一方、細胞接着阻害部とは、上記細胞接着材料が分解または変性された領域であり、細胞との接着性が低い領域である。上記細胞接着材料が分解または変性されているとは、上記細胞接着材料が含有されていない、もしくは上記細胞接着部に含有される細胞接着材料の量と比較して、細胞接着材料が少ない量含有されていることをいう。例えば上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、細胞接着阻害部中にはその細胞接着材料が少量含有されている、または細胞接着材料の分解物等が含有されている、もしくは細胞接着材料層が完全に分解除去されてバインダのみが含有されること等となる。また、上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、細胞接着阻害部中にはその変性物等が含有されていることとなる。本発明においては、上記細胞接着阻害部に、細胞との接着を阻害するような細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害材料が含有されていることが好ましい。これにより、細胞接着阻害部の細胞との接着性をより低いものとすることができ、上記細胞接着部のみに、高精細に細胞を接着させることが可能となるからである。
ここで、本発明の細胞培養用パターニング基板に用いられる基材、および細胞接着層については、上述したパターニング用基板の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略し、以下、上記細胞接着部および上記細胞接着阻害部を有する細胞接着層の形成方法について説明する。
まず、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」で説明したパターニング用基板用コーティング液等を用いて、例えば図５に示すように、少なくとも細胞接着材料およびバインダを含有する細胞接着層２を基材１上に形成する（図５（ａ））。次に、基体１１と、その基体１１上に形成された少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層１２を有する光触媒含有層側基板１３を準備し、この光触媒含有層１２と上記細胞接着層２とを対向させて配置する（図５（ｂ））。続いて、細胞接着阻害部を形成するパターン状に、例えばフォトマスク５等を用いてエネルギー６を照射する（図５（ｂ））。これにより、細胞接着層２中に含有される細胞接着材料が、光触媒含有層１２中に含有される光触媒の作用により分解または変性されて、細胞との接着性が低い細胞接着阻害部４と、エネルギーが照射されず、細胞接着材料が分解されないことから細胞との接着性が良好な細胞接着部２´とが形成される（図５（ｃ））。なお、上記細胞接着層の形成方法等については、上記「Ｂ．パターニング用基板」で説明した方法と同様であるので、ここでの説明は省略し、このような細胞接着阻害部の形成に用いられる光触媒含有層を有する光触媒含有層側基板、およびエネルギー等について、以下説明する。
（光触媒含有層側基板）
まず、光触媒を含有する光触媒含有層を有する光触媒含有層側基板について説明する。本発明に用いられる光触媒含有層側基板としては、通常、光触媒を含有する光触媒含有層を有するものであり、通常、基体と、その基体上に光触媒含有層が形成されているものである。この光触媒含有層側基板は、例えばパターン状に形成された光触媒含有層側遮光部やプライマー層等を有していてもよい。以下、本工程に用いられる光触媒含有層側基板の各構成について説明する。
ａ．光触媒含有層
まず、光触媒含有層側基板に用いられる光触媒含有層について説明する。本発明に用いられる光触媒含有層は、光触媒含有層中の光触媒が、近接する細胞接着層中の細胞接着材料を分解または変性させるような構成であれば、特に限定されるものではなく、光触媒とバインダとから構成されているものであってもよく、光触媒単体で製膜されたものであってもよい。また、その表面の特性は特に親液性であっても撥液性であってもよい。
本発明において用いられる光触媒含有層は、例えば図５（ｂ）に示すように、基体１１上に全面に形成されたものであってもよいが、例えば図６に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２がパターン上に形成されたものであってもよい。
このように光触媒含有層をパターン状に形成することにより、細胞接着阻害部を形成するためにエネルギーを照射する際に、フォトマスク等を用いるパターン照射をする必要がなく、全面に照射することにより、細胞接着層に含有される細胞接着材料が分解または変性されたパターンを形成することができる。
この光触媒含有層のパターニング方法は、特に限定されるものではないが、例えばフォトリソグラフィー法等により行うことが可能である。
また、実際に光触媒含有層に面する細胞接着層上の部分のみの、細胞接着材料が分解または変性されるものであるので、エネルギーの照射方向は上記光触媒含有層と細胞接着層とが面する部分にエネルギーが照射されるものであれば、いかなる方向から照射されてもよく、さらには、照射されるエネルギーも特に平行光等の平行なものに限定されないという利点を有するものとなる。
本発明で使用する光触媒としては、光半導体として知られる例えば二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化タングステン（ＷＯ３）、酸化ビスマス（Ｂｉ２Ｏ３）、および酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）を挙げることができ、これらから選択して１種または２種以上を混合して用いることができる。
本発明においては、特に二酸化チタンが、バンドギャップエネルギーが高く、化学的に安定で毒性もなく、入手も容易であることから好適に使用される。二酸化チタンには、アナターゼ型とルチル型があり本発明ではいずれも使用することができるが、アナターゼ型の二酸化チタンが好ましい。アナターゼ型二酸化チタンは励起波長が３８０ｎｍ以下にある。
このようなアナターゼ型二酸化チタンとしては、例えば、塩酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（石原産業（株）製ＳＴＳ−０２（平均粒径７ｎｍ）、石原産業（株）製ＳＴ−Ｋ０１）、硝酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（日産化学（株）製ＴＡ−１５（平均粒径１２ｎｍ））等を挙げることができる。
光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が５０ｎｍ以下であることが好ましく、２０ｎｍ以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
本発明における光触媒含有層は、上述したように光触媒単独で形成されたものであってもよく、またバインダと混合して形成されたものであってもよい。
光触媒のみからなる光触媒含有層の場合は、細胞接着層中の細胞接着材料の分解または変性に対する効率が向上し、処理時間の短縮化等のコスト面で有利である。一方、光触媒とバインダとからなる光触媒含有層の場合は、光触媒含有層の形成が容易であるという利点を有する。
光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。真空製膜法により光触媒含有層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒含有層とすることが可能であり、これにより細胞接着層中の細胞接着材料の分解または変性を均一に行うことが可能であり、かつ光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に細胞接着材料を分解または変性させることが可能となる。
また、光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法の他の例としては、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基体上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。ここで用いられる無定形チタニアとしては、例えば四塩化チタン、硫酸チタン等のチタンの無機塩の加水分解、脱水縮合、テトラエトキシチタン、テトライソプロポキシチタン、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトラブトキシチタン、テトラメトキシチタン等の有機チタン化合物を酸存在下において加水分解、脱水縮合によって得ることができる。次いで、４００℃〜５００℃における焼成によってアナターゼ型チタニアに変性し、６００℃〜７００℃の焼成によってルチル型チタニアに変性することができる。
また、バインダを用いる場合は、バインダの主骨格が上記の光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものが好ましく、例えばオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
このようにオルガノポリシロキサンをバインダとして用いた場合は、上記光触媒含有層は、光触媒とバインダであるオルガノポリシロキサンとを必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を基体上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディッブコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。
また、バインダとして無定形シリカ前駆体や界面活性剤等を用いることができる。このような材料は、特開２０００−２４９８２１号公報に記載されているものと同様のものを用いることが可能である。
ｂ．基体
次に、光触媒含有層側基板に用いられる基体について説明する。本発明においては、図５（ｂ）に示すように、光触媒含有層側基板は、少なくとも基体１１とこの基体１１上に形成された光触媒含有層１２とを有するものである。この際、用いられる基体を構成する材料は、後述するエネルギーの照射方向や、得られるパターン形成体が透明性を必要とするか等により適宜選択される。
また本発明に用いられる基体は、可撓性を有するもの、例えば樹脂製フィルム等であってもよいし、可撓性を有しないもの、例えばガラス基板等であってもよい。これは、エネルギー照射方法により適宜選択されるものである。
なお、基体表面と光触媒含有層との密着性を向上させるために、基体上にアンカー層を形成するようにしてもよい。このようなアンカー層としては、例えば、シラン系、チタン系のカップリング剤等を挙げることができる。
ｃ．光触媒含有層側遮光部
本発明に用いられる光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部が形成されたものを用いても良い。このように光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板を用いることにより、エネルギー照射に際して、フォトマスクを用いたり、レーザ光による描画照射を行う必要がない。したがって、光触媒含有層側基板とフォトマスクとの位置合わせが不要であることから、簡便な工程とすることが可能であり、また描画照射に必要な高価な装置も不必要であることから、コスト的に有利となるという利点を有する。
このような光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板は、光触媒含有層側遮光部の形成位置により、下記の二つの態様とすることができる。
一つが、例えば図７に示すように、基体１１上に光触媒含有層側遮光部１４を形成し、この光触媒含有層側遮光部１４上に光触媒含有層１２を形成して、光触媒含有層側基板とする態様である。もう一つは、例えば図８に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２を形成し、その上に光触媒含有層側遮光部１４を形成して光触媒含有層側基板とする態様である。
いずれの態様においても、フォトマスクを用いる場合と比較すると、光触媒含有層側遮光部が、上記光触媒含有層と細胞接着層との配置部分の近傍に配置されることになるので、基体内等におけるエネルギーの散乱の影響を少なくすることができることから、エネルギーのパターン照射を極めて正確に行うことが可能となる。
ここで、本発明においては、図８に示すような光触媒含有層１２上に光触媒含有層側遮光部１４を形成する態様である場合には、光触媒含有層と細胞接着層とを所定の位置に配置する際に、この光触媒含有層側遮光部の膜厚をこの間隙の幅と一致させておくことにより、上記光触媒含有層側遮光部を上記間隙を一定のものとするためのスペーサとしても用いることができるという利点を有する。
すなわち、所定の間隙をおいて上記光触媒含有層と細胞接着層とを対向させた状態で配置する際に、上記光触媒含有層側遮光部と細胞接着層とを密着させた状態で配置することにより、上記所定の間隙を正確とすることが可能となり、そしてこの状態でエネルギーを照射することにより、細胞接着層と遮光部とが接触している部分の細胞接着層は、細胞接着材料が分解または変性されないことから、細胞接着阻害部を精度良く形成することが可能となるのである。
このような光触媒含有層側遮光部の形成方法は、特に限定されるものではなく、光触媒含有層側遮光部の形成面の特性や、必要とするエネルギーに対する遮蔽性等に応じて適宜選択されて用いられ、「Ｂ．パターニング用基板」で説明した基材上に設けられる遮光部と同様のものとすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。
なお、上記説明においては、光触媒含有層側遮光部の形成位置として、基体と光触媒含有層との間、および光触媒含有層表面の二つの場合について説明したが、その他、基体の光触媒含有層が形成されていない側の表面に光触媒含有層側遮光部を形成する態様も採ることが可能である。この態様においては、例えばフォトマスクをこの表面に着脱可能な程度に密着させる場合等が考えられ、細胞接着阻害部のパターンを小ロットで変更するような場合に好適に用いることができる。
ｄ．プライマー層
次に、本発明の光触媒含有層側基板に用いられるプライマー層について説明する。本発明において、上述したように基体上に光触媒含有層側遮光部をパターン状に形成して、その上に光触媒含有層を形成して光触媒含有層側基板とする場合においては、上記光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成してもよい。
このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成することにより、プライマー層は光触媒の作用による細胞接着材料の分解または変性を阻害する要因となる光触媒含有層側遮光部および光触媒含有層側遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、光触媒含有層側遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、高感度で細胞接着材料の分解または変性の処理が進行し、その結果、高精細に形成された細胞接着阻害部を得ることが可能となるのである。
なお、本発明においてプライマー層は、光触媒含有層側遮光部のみならず光触媒含有層側遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた光触媒含有層側遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。
本発明におけるプライマー層は、光触媒含有層側基板の光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。
このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。
（エネルギー照射）
次に、上記細胞接着阻害部を形成する際のエネルギー照射について説明する。エネルギー照射は、上記細胞接着層と、上記光触媒含有層側基板における光触媒含有層とを、所定の間隙をおいて配置し、所定の方向からエネルギーを照射することにより行うことができる。
上記の配置とは、実質的に光触媒の作用が細胞接着層表面に及ぶような状態で配置された状態をいうこととし、実際に物理的に接触している状態の他、所定の間隔を隔てて上記光触媒含有層と細胞接着層とが配置された状態とする。この間隙は、２００μｍ以下であることが好ましい。
本発明において上記間隙は、パターン精度が極めて良好であり、光触媒の感度も高く、したがって細胞接着層中の細胞接着材料の分解または変性の効率が良好である点を考慮すると特に０．２μｍ〜１０μｍの範囲内、好ましくは１μｍ〜５μｍの範囲内とすることが好ましい。このような間隙の範囲は、特に間隙を高い精度で制御することが可能である小面積の細胞接着層に対して特に有効である。
一方、例えば３００ｍｍ×３００ｍｍ以上といった大面積の細胞接着層に対して処理を行う場合は、接触することなく、かつ上述したような微細な間隙を光触媒含有層側基板と細胞接着層との間に形成することは極めて困難である。したがって、細胞接着層が比較的大面積である場合は、上記間隙は、１０〜１００μｍの範囲内、特に５０〜７５μｍの範囲内とすることが好ましい。間隙をこのような範囲内とすることにより、パターンがぼやける等のパターン精度の低下の問題や、光触媒の感度が悪化して細胞接着材料を分解または変性させる効率が悪化する等の問題が生じることなく、さらに細胞接着材料の分解または変性にムラが発生しないといった効果を有するからである。
このように比較的大面積の細胞接着層をエネルギー照射する際には、エネルギー照射装置内の光触媒含有層側基板と細胞接着層との位置決め装置における間隙の設定を、１０μｍ〜２００μｍの範囲内、特に２５μｍ〜７５μｍの範囲内に設定することが好ましい。設定値をこのような範囲内とすることにより、パターン精度の大幅な低下や光触媒の感度の大幅な悪化を招くことなく、かつ光触媒含有層側基板と細胞接着層とが接触することなく配置することが可能となるからである。
このように光触媒含有層と細胞接着層表面とを所定の間隔で離して配置することにより、酸素と水および光触媒作用により生じた活性酸素種が脱着しやすくなる。すなわち、上記範囲より光触媒含有層と細胞接着層との間隔を狭くした場合は、上記活性酸素種の脱着がしにくくなり、結果的に細胞接着材料を分解または変性させる速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。また、上記範囲より間隔を離して配置した場合は、生じた活性酸素種が細胞接着層に届き難くなり、この場合も細胞接着材料の分解または変性の速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。
このような極めて狭い間隙を均一に形成して光触媒含有層と細胞接着層とを配置する方法としては、例えばスペーサを用いる方法を挙げることができる。そして、このようにスペーサを用いることにより、均一な間隙を形成することができると共に、このスペーサが接触する部分は、光触媒の作用が細胞接着層表面に及ばないことから、このスペーサを上述した細胞接着部と同様のパターンを有するものとすることにより、スペーサの形成されていない部分のみの細胞接着材料を分解または変性させることができ、高精細に細胞接着阻害部を形成することができるのである。また、このようなスペーサを用いることにより、光触媒の作用により生じた活性酸素種が拡散することなく、高濃度で細胞接着層表面に到達することから、効率よく高精細な細胞接着阻害部を形成することができる。
本発明においては、このような光触媒含有層側基板の配置状態は、少なくともエネルギー照射の間だけ維持されればよい。
ここで、本発明でいうエネルギー照射（露光）とは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着材料を分解または変性させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、光の照射に限定されるものではない。
通常このようなエネルギー照射に用いる光の波長は、４００ｎｍ以下の範囲、好ましくは３８０ｎｍ以下の範囲から設定される。これは、上述したように光触媒として用いられる好ましい光触媒が二酸化チタンであり、この二酸化チタンにより光触媒作用を活性化させるエネルギーとして、上述した波長の光が好ましいからである。
このようなエネルギー照射に用いることができる光源としては、水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、エキシマランプ、その他種々の光源を挙げることができる。
上述したような光源を用い、フォトマスクを介したパターン照射により行う方法の他、エキシマ、ＹＡＧ等のレーザを用いてパターン状に描画照射する方法を用いることも可能である。また、上述したように、基材が細胞接着部と同じパターン状に遮光部を有する場合には、基材側からエネルギーを全面に照射することにより、行うことができる。また、光触媒含有層上に、細胞接着部と同じパターン状に遮光部を有する場合には、どの方向からでもエネルギーを全面に照射することにより、行うことができる。これらの場合、フォトマスク等が必要なく、位置あわせ等の工程が必要ない、という利点を有する。
ここで、上述したように、上記基材が凹部を有しており、上記凹部内に上記細胞接着層が形成されている場合、上述した方法により全面にエネルギー照射を行ってもよい。また、例えば上記凹部が複数形成されている場合には、例えば各凹部ごとにそれぞれ異なるパターン状に露光を行ってもよい。このように各凹部ごとにそれぞれ露光を行う方法としては、例えば１つ１つの凹部に異なるマスクを配置し、上記光触媒含有層側基板を用いてエネルギー照射する方法や、例えば光ファイバの先に、クロムマスクやステンシルマスク等と上記光触媒含有層側基板とを配置し、エネルギー照射する方法等が挙げられる。
なお、上記凹部の側壁にエネルギーが照射されないように、例えば筒状のマスク等を用い、上記凹部の底面のみ露光を行う方法を用いてもよい。
また、エネルギー照射に際してのエネルギーの照射量は、光触媒の作用によって細胞接着材料が分解または変性されるのに必要な照射量とする。
この際、光触媒含有層を加熱しながらエネルギー照射することにより、感度を上昇させることが可能となり、効率的に細胞接着材料を分解または変性させることができる点で好ましい。具体的には３０℃〜８０℃の範囲内で加熱することが好ましい。
また本発明におけるフォトマスクを介して行うエネルギー照射の方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および光触媒含有層側基板のいずれの方向からエネルギー照射を行っても良い。一方、基材が不透明な場合は、光触媒含有層側基板側からエネルギー照射を行う必要がある。
３．細胞培養用パターニング基板
次に、本発明の細胞培養用パターニング基板について説明する。本発明の細胞培養用パターニング基板は、上記基材上に、上記細胞接着部および細胞接着阻害部を有する細胞接着層が形成されているものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜他の層が形成されているもの等であってもよい。
また本発明においては、上記細胞接着阻害部を形成した後、上記細胞培養用パターニング基板の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けたもの等を細胞培養用パターニング基板としてもよい。
Ｄ．細胞培養基板
次に、本発明の細胞培養基板について説明する。本発明の細胞培養基板は、上述した細胞培養用パターニング基板における細胞接着部上に、細胞が接着したものである。
本発明の細胞培養基板は、例えば図９に示すように、上記細胞接着層２の細胞接着部２´上にのみ細胞７が接着し、細胞接着阻害部４上には、細胞７が接着していないものである。
本発明によれば、上記細胞培養用パターニング基板上には、細胞との接着性が良好な細胞接着部と、細胞との接着性を有しない細胞接着阻害部とが形成されていることから、例えば細胞を細胞培養用パターニング基板の全面に塗布した場合であっても、細胞接着部のみに細胞を接着させて、細胞接着阻害部上の細胞を容易に除去することができる。これにより、複雑な工程や細胞に悪影響を及ぼす処理液等を用いることなく、容易に形成されたものとすることができるのである。また、上記細胞培養用パターニング基板中には、光触媒が含有されている必要がないことから、経時で光触媒が細胞に影響を及ぼす可能性のないものとすることもでき、高品質な細胞培養基板とすることができるのである。
ここで、本発明によれば、例えば上記光触媒含有層側基板の光触媒含有層を、細胞接着層と対向させて配置し、上記細胞培養基板の全面にエネルギーを照射することによって、細胞が接着した細胞接着部の細胞接着材料を分解または変性させることができ、細胞との接着性を低いものとすることができる。これにより、細胞接着部上に接着した細胞等を容易に剥離することができ、パターン状に形成された細胞のみを得ることができるのである。なお、この際照射されるエネルギーは細胞に影響を与えない程度のエネルギーとされる。
また、上述したように、細胞接着部と同じパターン状に基材上に遮光部が形成されている場合には、例えば光触媒含有層側基板と対向させて、必要に応じて基材側から全面にエネルギーを照射することにより、細胞接着阻害部上に付着した細胞を除去することが可能となり、細胞が細胞接着部に接着したパターンを高精細に保つことができるのである。
なお、上記遮光部が形成されていない場合には、上記光触媒含有層側基板と細胞接着層とを対向させて、細胞接着阻害部と同じパターン状に開口部が形成されたフォトマスク等を用いてエネルギーを照射することにより、高精細なパターンを保つことができる。
以下、本発明の細胞培養基板に用いられる細胞について説明する。ここで、細胞培養用パターニング基板については、上記「Ｃ．細胞培養用パターニング基板」で説明したものであるので、ここでの説明は省略する。
（細胞）
本発明の細胞培養基板に用いられる細胞としては、上記細胞培養用パターニング基板の細胞接着部上に接着するものであり、細胞接着阻害部上には接着しないものであれば特に限定されるものではない。
本発明に用いられる細胞としては例えば、神経組織、肝臓、腎臓、膵臓、血管、脳、軟骨等、血球系等の非接着性細胞以外なら、生体に存在するあらゆる組織とそれに由来する細胞とすることができる。また一般的に非接着性の細胞についても、近年、接着固定を行う為に細胞膜を修飾する技術が考案されており、必要に応じてこのような技術を用いる事で本発明に用いることが可能である。
ここで、上述したような各組織は種々の機能をもつ細胞により形成されていることから、所望する細胞を選択し、使用する必要がある。例えば肝臓の場合、肝実質細胞以外にも上皮細胞、内皮細胞、クッパー細胞、繊維芽細胞、脂肪摂取細胞等から形成されることとなる。なおこの場合、細胞の種類により細胞接着材料に対する接着性が異なる為、細胞種に応じて、上記細胞接着部に用いられる細胞接着材料やその組成比の選択が必要となる。
また、細胞を細胞接着部に接着させる方法としては、上記細胞接着部と細胞接着阻害部とを有する上記細胞培養用パターニング基板の上記細胞接着部のみに細胞を接着させることが可能な方法であれば特に限定されるものではない。例えばインクジェットプリンタやマニピュレータ等で細胞を接着させる方法等であってもよいが、細胞懸濁液を播種して上記細胞接着部に細胞を接着させた後、不要となった細胞接着阻害部上の細胞をリン酸バッファで洗浄し、細胞を除去する方法が一般的に用いられる。このような方法としては、例えば参考文献”Spatial distribution of mammalian cells dicated by material surface chemistry”,Kevin E.Healy 他,Biotech.Bioeng．(1994) p.792等に記載されている方法を用いること等ができる。
Ｅ．細胞培養用パターニング基板の製造方法
次に、本発明の細胞培養用パターニング基板の製造方法について説明する。本発明の細胞培養用パターニング基板の製造方法は、基材上に、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層を形成する細胞接着層形成工程と、上記細胞接着層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成するエネルギー照射工程とを有するものである。
本発明の細胞培養用パターニング基板の製造方法は、例えば図５に示すように、基材１上に細胞接着性材料およびバインダを含有する細胞接着層を形成する細胞接着層２を形成する細胞接着層形成工程（図５（ａ））と、基体１１および光触媒を含有する光触媒含有層１２とを有する光触媒含有層側基板１３を準備し、この細胞接着層２および光触媒含有層１２を対向させて配置し、例えばフォトマスク５等を用いてエネルギー６を照射し（図５（ｂ））、エネルギーが照射された領域の細胞接着層２中に含有される細胞接着材料を分解または変性さた細胞接着阻害部４と、エネルギー照射されておらず、細胞との接着性が良好な細胞接着部２´とを形成するエネルギー照射工程（図５（ｃ））とを有するものである。
本発明によれば、上記光触媒含有層側基板を用いてエネルギー照射することにより、容易に上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料を分解または変性させることができ、高精細なパターン状に細胞接着部および細胞接着阻害部を形成することが可能となるのである。また、上記細胞接着層中に光触媒が含有される必要がないことから、経時で光触媒が影響を及ぼすことのない、高品質な細胞培養用パターニング基板とすることができる。
以下、本発明の各工程について説明する。
１．細胞接着層形成工程
まず、本発明の細胞接着層形成工程について説明する。本発明の細胞接着層形成工程は、基材上に、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層を形成する工程である。本発明においては、上記細胞接着材料およびバインダを含有する塗工液等を用いて、基材上に塗布することにより行うことができ、その塗布方法やその材料等については、特に限定されるものではないが、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害材料がバインダとして用いられることが好ましい。これにより、後述するエネルギー照射工程において、エネルギー照射された領域である細胞接着阻害部の細胞との接着性が低いものとすることができ、高精細なパターン状に細胞を接着することが可能な細胞培養用パターニング基板とすることができるからである。
なお、本工程に用いられる細胞接着材料、バインダ、細胞接着阻害材料、および基材や、細胞接着層の形成方法については、上述した「Ｂ．パターニング用基板」の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略する。
２．エネルギー照射工程
次に、本発明におけるエネルギー照射工程について説明する。本発明におけるエネルギー照射工程においては、上記細胞接着層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成する工程である。
本工程は、上述した細胞接着層形成工程により形成された細胞接着層と、上記光触媒含有層側基板の光触媒含有層とを対向させてエネルギーをパターン状に照射し、細胞接着層中の細胞接着材料が分解または変性されて細胞との接着性が低い細胞接着阻害部が形成されるものであれば、その方法等は特に限定されるものではない。
ここで、本工程に用いられる光触媒含有層側基板や、エネルギー照射の方法については、上述した「Ｃ．細胞培養用パターニング基板」の項で説明したようなものを用いることが可能であるので、ここでの詳しい説明は省略する。
Ｆ．細胞培養基板の製造方法
次に、本発明の細胞培養基板の製造方法について説明する。本発明の細胞培養基板の製造方法には、２つの実施態様がある。以下、それぞれの実施態様ごとに説明する。
１．第１実施態様
まず、本発明の細胞培養基板の第１実施態様について説明する。本実施態様における細胞培養基板の製造方法は、上述した「Ｅ．細胞培養用パターニング基板の製造方法」で説明した細胞培養用パターニング基板の製造方法により製造された細胞培養用パターニング基板の細胞接着部上に、細胞を接着させる細胞接着工程を有するものである。
本実施態様によれば、上記細胞培養用パターニング基板には、細胞接着層上に細胞との接着性を有する細胞接着部と、細胞との接着性を有しない細胞接着阻害部とが形成されていることから、この細胞接着層上に、細胞を塗布等することにより、容易に細胞接着部上にのみ細胞が接着した細胞培養基板を製造することができるのである。また、上記細胞培養用パターニング基板中に、光触媒が含有されている必要がないことから、経時で光触媒が細胞に影響を及ぼす可能性のないものとすることができ、高品質な細胞培養基板とすることができるのである。
ここで、本実施態様における細胞接着工程は、上記細胞接着部上に細胞を付着させることが可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、上述した「Ｄ．細胞培養基板」の項で説明したような方法とすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。
２．第２実施態様
次に、本発明の細胞培養基板の製造方法の第２実施態様について説明する。本実施態様の細胞培養基板の製造方法は、基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料およびバインダを含有する細胞接着層と、上記細胞接着層上にパターン状に形成された細胞とを有し、上記細胞接着層は、上記細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とを有しており、上記細胞が上記細胞接着部上に形成されている細胞培養基板の製造方法であって、
上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、上記細胞接着阻害部に、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる細胞維持工程を有するものである。
本実施態様の細胞培養基板の製造方法は、例えば図１０に示すように、基材１と、その基材１上に形成され、細胞接着部２´および細胞接着阻害部４を有する細胞接着層２と、上記細胞接着部２上に形成された細胞７とを有する細胞培養基板の製造方法である。本実施態様においては、上記細胞接着部２´上に細胞７を接着させる細胞接着工程を行った後、基体１１と、その基体１１上に光触媒含有層１２が形成された光触媒含有層側基板１３を準備し、この光触媒含有層１２と細胞接着層２とを対向させて配置し、例えばフォトマスク５等を用いて細胞接着阻害部４のみにエネルギー６を照射する細胞維持工程を有するものである。これにより、細胞が細胞接着阻害部上に付着した場合であっても、上記光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着阻害部上のたんぱく質、有機物、細胞等を除去することが可能となり、細胞接着部上にのみ高精細に細胞が接着された細胞培養基板とすることができるのである。
以下、本実施態様の細胞培養基板の製造方法における細胞維持工程について説明する。
（細胞維持工程）
本実施態様の細胞培養基板の製造方法における細胞維持工程は、上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、上記細胞接着阻害部に、光触媒含有層側基板を用いてエネルギー照射を行うことにより、上記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる工程であり、細胞接着部上の細胞のパターンを高精細に維持することが可能であれば、そのエネルギーの照射方法等は特に限定されるものではない。
本実施態様においては、例えば図１０に示すように、光触媒含有層側基板１３における光触媒含有層１２と細胞接着層２とを対向させて配置した後、細胞接着阻害部のパターン状に開口部を有するフォトマスク５等を用いてエネルギー６を照射する方法等が挙げられる。また、例えば図１１に示すように、光触媒含有層側基板１３に遮光部１４が設けられており、この光触媒含有層側基板１３における光触媒含有層１２と細胞接着層２とを対向させて配置した後、全面にエネルギー６を照射する方法等であってもよい。また例えば図１２に示すように、基材１上に遮光部３が、細胞接着部２´と同じパターン状に形成されている場合には、細胞接着層２と光触媒含有層１２とを対向させた後、基材１側から全面にエネルギー６を照射することにより、細胞接着阻害部４のみにエネルギー６を照射する方法等とすることができる。
この際、照射するエネルギーは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着阻害部上に接着した細胞を除去することが可能なエネルギーであれば特に限定されるものではなく、具体的には、「Ｃ．細胞培養用パターニング基板」の細胞接着層の形成方法として説明したものと同様のものとすることができる。また、上記光触媒含有層側基板や、この光触媒含有層側基板の配置位置等についても「Ｃ．細胞培養用パターニング基板」の細胞接着層の形成方法として説明したものと同様のものとすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。
また、本工程を行う時期としては、細胞接着部上に細胞を接着した細胞接着工程直後に行われるものであってもよく、また細胞接着部上の細胞を所定の期間培養した場合に、細胞接着阻害部上に細胞が付着し、パターンが太くなる等といった不具合がないように、細胞の種類や状態に合わせて適宜行われるものであってもよい。また、本工程は繰り返し行われるものであってもよい。
なお、上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程については、上述した第１実施態様の細胞接着工程と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。
（その他）
本実施態様の細胞培養基板の製造方法においては、上記エネルギー照射工程および細胞接着工程以外に、例えば光触媒および細胞接着材料を含有するパターニング用基板用コーティング液を基材上に塗布して細胞接着層を形成する工程や、その細胞接着層に光触媒含有層側基板を用いてエネルギーを照射し、細胞接着部と細胞接着阻害部とを有する細胞接着層を形成する工程等、必要に応じた工程を有するものであってもよい。
なお、本実施態様の細胞培養基板の製造方法に用いられる細胞接着材料、基材、および光触媒含有層側基板や、上記細胞接着層の形成方法等については、上述した「Ｅ．細胞培養用パターニング基板の製造方法」で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略する。
また、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
［実施例１］
（細胞接着層の形成）
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）０．４ｇ、およびアミノプロピルトリエトキシシラン０．４ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。この溶液をスピンコーティング法により予めアルカリ処理を施した厚さ０．７ｍｍのガラス基板に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、膜厚が約８０ｎｍの、アミノ基を含むオルガノポリシロキサン層を基板上に形成し、パターニング用基板とした。
（パターニング用基板のパターニング）
光触媒層が形成されたフォトマスクを、光触媒層と上記パターニング用基板の細胞接着層が相対するように静置し、フォトマスク越しに水銀ランプにより１５Ｊ／ｃｍ２(波長２５４ｎｍ)の紫外線照射を行い、未露光部が細胞接着性で、露光部が細胞接着阻害性にパターン化された細胞接着性表面を有する細胞培養用パターニング基板を得た。
（細胞接着工程）
各種組織に由来する細胞の培養実験手順については、例えば泊g織培養の技術 第三版 基礎編・ 日本組織培養学会編,朝倉書店等にその詳細が述べられている。
本出願においては、ラット肝実質細胞を用いて基板を評価した。
まず、ラットより摘出した肝臓をシャーレに移してメスで5ｍｍ大に細分し、２０ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えてピペットで軽く懸濁した後、細胞濾過器で濾過した。得られた粗分散細胞浮遊液を５００〜６００ｒｐｍで９０秒間遠心処理し、上清を吸引して除去した。残留した細胞に新たにＤＭＥＭ培地を加えて再び遠心処理した。この操作を３回繰り返すことにより、ほぼ均一な肝実質細胞を得た。得られた肝実質細胞に、ＤＭＥＭ培地２０ｍｌを加えて懸濁し、肝実質細胞懸濁液を調製した。
次にWaymouth MB752／1培地（L-グルタミン含有、ＮａＨＣＯ３非含有） (ギブコ) １４．１２ｇに蒸留水９００ｍｌを添加した。これにＮａＨＣＯ３ ２．２４ｇ、アンホテリシンＢ液（ＩＣＮ）１０ｍｌ、ペニシリンストレプトマイシン液（ギブコ）１０ｍｌを加えて攪拌した。これをｐＨ７．４に調整した後、全量を１０００ｍｌとし、０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌したものをWaymouth MB752／1培地液とした。
先に作成した肝実質細胞懸濁液を、同じく作成したWaymouth MB752／1培地液に懸濁した上で、細胞接着部と細胞接着阻害部を有する、上述した細胞培養用パターニング基板上に播種した。この基板を３７℃，５％ＣＯ２付与したインキュベータ内に２４時間静置し、基板上全面に肝実質細胞を接着させた。この基板をＰＢＳで２回洗浄することで非接着細胞や死細胞を除去した後、新しい培地液と交換した。培地液を交換しながら４８時間まで細胞の培養を続け光学顕微鏡で細胞を観察したところ、細胞が細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に沿いながら接着している事を確認した。
［実施例２］
市販の直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（コーニング社製）の底面の中央部に、直径１４ｍｍの穴をあけた。続いて、厚さ約０．１ｍｍのガラス基板を用いて上記実施例１と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、切断された細胞培養用パターニング基板のガラス基板を、上記プラスチックディッシュに、接着剤ＫＥ４５Ｔ（信越シリコーン社製）を用いて貼りつけた。
（細胞の接着）
上記プラスチックディッシュを、７０％エタノールで滅菌し、ＰＢＳで洗浄した後、ＤＭＥＭ培地で洗浄した。その後、実施例１と同様に、細胞を培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら接着している事を確認した。
本発明のパターニング用基板の一例を示す概略断面図である。 本発明のパターニング用基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養用パターニング基板の一例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養用パターニング基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養用パターニング基板における細胞接着阻害部の形成方法の一例を示す工程図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の一例を示す概略断面図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養基板の一例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程の一例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程の他の例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程の他の例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養用パターニング基板に用いられる基材を説明するための概略断面図である。
符号の説明
１ … 基板
２ … 細胞接着層
２´… 細胞接着部
３ … 遮光部
４ … 細胞接着阻害部
５ … フォトマスク
６ … エネルギー
１１… 基体
１２… 光触媒含有層
１３… 光触媒含有層側基板

Claims (8)

  1. 基材と、前記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層とを有することを特徴とするパターニング用基板。
  2. 前記基材上に遮光部が形成されていることを特徴とする請求項１に記載のパターニング用基板。
  3. 請求項１または請求項２に記載のパターニング用基板の前記細胞接着層が、パターン状に前記細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、前記細胞接着阻害部以外の領域である細胞接着部とを有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板。
  4. 請求項３に記載の細胞培養用パターニング基板の、前記細胞接着部上に、細胞が接着していることを特徴とする細胞培養基板。
  5. 細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料と、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害材料とを含有することを特徴とするパターニング用基板用コーティング液。
  6. 基材上に、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料、およびバインダを含有する細胞接着層を形成する細胞接着層形成工程と、
    前記細胞接着層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、前記細胞接着層と前記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、前記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、前記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成するエネルギー照射工程と
    を有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板の製造方法。
  7. 請求項６に記載の細胞培養用パターニング基板の製造方法により製造された細胞培養用パターニング基板の前記細胞接着部上に、細胞を接着させる細胞接着工程を有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
  8. 基材と、前記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料およびバインダを含有する細胞接着層と、前記細胞接着層上にパターン状に形成された細胞とを有し、前記細胞接着層は、前記細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部、および前記細胞接着阻害部以外の細胞接着部を有しており、前記細胞が前記細胞接着部上に形成されている細胞培養基板の製造方法であって、
    前記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、前記細胞接着阻害部に、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板を、前記細胞接着層と前記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、前記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる細胞維持工程を有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
JP2005020345A 2004-01-28 2005-01-27 パターニング用基板および細胞培養基板 Expired - Fee Related JP4826092B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005020345A JP4826092B2 (ja) 2004-01-28 2005-01-27 パターニング用基板および細胞培養基板

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004020254 2004-01-28
JP2004020254 2004-01-28
JP2005020345A JP4826092B2 (ja) 2004-01-28 2005-01-27 パターニング用基板および細胞培養基板

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2005237376A true JP2005237376A (ja) 2005-09-08
JP4826092B2 JP4826092B2 (ja) 2011-11-30

Family

ID=35019756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005020345A Expired - Fee Related JP4826092B2 (ja) 2004-01-28 2005-01-27 パターニング用基板および細胞培養基板

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP4826092B2 (ja)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002184752A (ja) * 2000-12-14 2002-06-28 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体の製造方法
JP2002274077A (ja) * 1997-08-08 2002-09-25 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体およびパターン形成方法
JP2003228172A (ja) * 2001-11-20 2003-08-15 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体の製造方法
JP2003295428A (ja) * 2001-03-29 2003-10-15 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体の製造方法およびそれに用いるフォトマスク
JP2003339373A (ja) * 2002-05-24 2003-12-02 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 細胞の分別法
JP2004000051A (ja) * 2002-05-31 2004-01-08 Ecodevice Co Ltd 細胞培養容器及び培養細胞の製造方法
WO2005038011A1 (ja) * 2003-10-17 2005-04-28 Dai Nippon Printing Co., Ltd. 人工細胞組織の作成方法、及びそのための基材

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002274077A (ja) * 1997-08-08 2002-09-25 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体およびパターン形成方法
JP2002184752A (ja) * 2000-12-14 2002-06-28 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体の製造方法
JP2003295428A (ja) * 2001-03-29 2003-10-15 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体の製造方法およびそれに用いるフォトマスク
JP2003228172A (ja) * 2001-11-20 2003-08-15 Dainippon Printing Co Ltd パターン形成体の製造方法
JP2003339373A (ja) * 2002-05-24 2003-12-02 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 細胞の分別法
JP2004000051A (ja) * 2002-05-31 2004-01-08 Ecodevice Co Ltd 細胞培養容器及び培養細胞の製造方法
WO2005038011A1 (ja) * 2003-10-17 2005-04-28 Dai Nippon Printing Co., Ltd. 人工細胞組織の作成方法、及びそのための基材

Also Published As

Publication number Publication date
JP4826092B2 (ja) 2011-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5077449B2 (ja) 細胞培養用パターニング基板およびその製造方法
US8497117B2 (en) Method for manufacturing cell culture substrate
JP4247231B2 (ja) 人工細胞組織の作成方法、及びそのための基材
US9034648B2 (en) Artificial tissue construct and method for producing the same
US20080213857A1 (en) Patterning substrate and cell culture substrate
JP4554913B2 (ja) パターニング用基板および細胞培養基板
JP4401153B2 (ja) パターニング用基板および細胞培養基板
JP4456393B2 (ja) 細胞培養基板の製造方法および細胞培養基板製造装置
US20050266319A1 (en) Patterning substrate and cell culture substrate
US20060019390A1 (en) Patterning substrate and cell culture substrate
JP4797396B2 (ja) 細胞培養基板の製造方法
JP4589012B2 (ja) 細胞培養用パターニング基板
US20060183219A1 (en) Patterning substrate and cell culture substrate
JP4765934B2 (ja) 血管細胞培養用パターニング基板
JP4858166B2 (ja) 血管細胞培養用パターニング基板
JP4862261B2 (ja) パターニング用基板および細胞培養基板
JP4742598B2 (ja) パターニング用基板および細胞培養基板
JP4742599B2 (ja) パターニング用基板および細胞培養基板
JP4826092B2 (ja) パターニング用基板および細胞培養基板

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070928

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20100416

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100427

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100628

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100914

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101112

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20110308

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110607

A911 Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20110623

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110816

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110829

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140922

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees