KR20210094583A - 세포의 미세액적 검출을 위한 장치 및 방법 - Google Patents

세포의 미세액적 검출을 위한 장치 및 방법 Download PDF

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톰 아이삭
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Abstract

생물학적 시료에서 세포 유형의 하나 이상의 특성을 조작 및/또는 결정하기 위한 장치, 시스템 및 관련 방법이 제공된다. 특히, 세포-함유 미세액적을 빈 미세액적으로부터 세포-함유 제1 미세액적 집단으로 분리하도록 구성된 분류부; 실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 제1 미세액적을 조작하도록 구성된 미세액적 조작부; 및 하나 이상의 검출창을 통해 병합된 미세액적으로부터 광학 신호를 검출하도록 구성된 광학 검출 시스템을 포함하는 장치 그 사용방법이 제공된다.

Description

세포의 미세액적 검출을 위한 장치 및 방법
본 발명에 따르면 세포의 신속한 식별, 조작 및 선별을 위한 장치 및 관련 방법이 제공된다. 본 발명은 특히 불사화 세포(immortalised cell) 배양 시료 또는 조직 시료 유래의 포유동물 세포 조작에 특히 유용하다. 본 발명은 또한 특히 감염 증거를 포함하는 것으로 생각되는 환자 시료를 신속하게 병렬로 스크리닝하는 데 특히 유용하다.
액적 또는 자성비드(magnetic beads)를 조작하기 위한 장치는 예를 들어 US6565727, US20130233425 및 US20150027889에서 보듯이 당업계에 이미 공지되어 있다. 액적의 경우, 이러한 성과는 일반적으로, 예를 들어 비혼화성 분산매(carrier fluid)의 존재 하에 액적이 카트리지의 두 개의 대향 벽 또는 미세유체 튜브에 의해 정의된 미세유체 공간을 통해 이동하게 함으로써 달성될 수 있다. 이들 벽 중 하나 또는 둘 모두에는 유전층으로 피복된 미세전극이 내장되어 있으며, 미세전극 각각은 유전층의 전계 특성을 변경하기 위하여 간격을 두고 빠르게 온/오프될 수 있는 A/C 바이어싱 회로에 연결된다. 이는 미세전극 근처에, 하나 이상의 주어진 경로를 따라 액적을 조종하는 데 사용될 수 있는 국부적인 방향성 모세관력을 발생시킨다. 이하에서 그리고 본 발명과 관련하여 "실제" 전기습윤 전극으로 지칭되는 것을 사용하는 이러한 장치는 EWOD(Electrowetting on Dielectric) 장치라는 약어로 당업계에 공지되어 있다.
전기습윤력이 광학적으로 매개되고 당업계에서 광전기습윤으로 알려져 있으며 이하 상응하는 약어가 OWEOD인 이 접근법의 변형이 예를 들어 US20030224528, US20150298125, US20160158748, US20160160259 및 Applied Physics Letters 93 221110(2008)에 개시되어 있다. 특히, 이들 세 개의 특허 출원 중 첫 번째는 제1 및 제2 벽에 의해 정의된 미세유체 공동을 포함하고, 이때 제1 벽은 복합 구조이며, 기판, 광전도층 및 절연(유전)층을 포함하는 다양한 미세유체 장치를 개시한다. 이 단면(single-sided) 실시예에서, 광전도체층과 절연층 사이에는 전기적으로 서로 절연되고, 광활성층과 연결되며, 절연층 상에 상응하는 전기습윤 전극 위치를 생성하는 기능을 하는 전도성 셀의 어레이가 배치된다. 상기 위치에서 액적의 표면장력 특성은 전술한 바와 같이 전기습윤계에 의해 변경될 수 있다. 전도성 셀은 이후 광전도층에 충돌하는 빛에 의해 일시적으로 켜질 수 있다. 이 접근법은 전극의 배열에 의해 여전히 유용성이 어느 정도 제한되지만, 스위칭이 훨씬 쉽고 빠르다는 장점이 있다. 더욱이, 액적이 이동할 수 있는 속도와 실제 액적 경로가 변경될 수 있는 정도에 대한 제한이 있다.
후자의 접근 방식인 양면(double-sided) 실시예는 Pei의 University of California at Berkeley 학위논문 UCB/EECS-2015-119에 개시되어 있다. 일 실시예에서, 전기적으로 편향된 비정질 실리콘 상에 광패턴을 사용하여 유전층 위에 증착된 테프론 AF의 표면에 걸친 광전기습윤을 사용하여 100-500 μm 크기 범위의 상대적으로 큰 액적을 조작할 수 있는 셀이 기술된다. 그러나 예시된 장치에서 유전층은 얇고(100 nm), 광활성층을 포함하는 벽에만 배치된다.
전체가 본원에 참고로 포함되는 본 발명자의 공개된 출원 WO 2018/234445에서, 본 발명자들은 구동력을 제공하기 위해 광전기습윤을 사용하는 미세 액적을 조작하기 위한 장치를 개시하였다. 상기 광학적으로 매개되는 전기습윤(OEWOD) 장치에서 미세액적은 격납 벽(예를 들어, 그 사이에 미세유체 공간을 갖는 한 쌍의 평행한 판)에 의해 경계가 지어진 미세유체 공간을 통해 이동된다. 적어도 하나의 격납 벽은 내부에 매립된 반도체 층의 영역을 선택적으로 광조사으로써 생성되는, 이하에서 "가상" 전기습윤 전극 위치로 지칭되는 것을 포함한다. 별도의 광원으로부터 해당 층에 빛을 선택적으로 광조사함으로써, 가상 전기습윤 전극 위치의 가상 경로가 일시적으로 생성될 수 있으며, 이를 따라 미세액적이 이동할 수 있다.
그 전체가 본원에 참고로 포함되는 본 발명자들의 해당 공개특허 WO 2018/234448에서, 핵산 시퀀서의 작동 부분으로서 이 장비의 사용이 기술된다.
본 발명자들은 본 발명자들이 이전에 설명한 시퀀서와 유사하게, 세포를 포함하는 생물학적 시료의 신속한 스크리닝 및 조작에 미세액적 방법을 적용하기 위한 장치를 개발하였다.
따라서, 본 발명에 따르면 생물학적 시료 내에 포함된 분석대상 세포의 하나 이상의 특성을 조작 및/또는 결정하기 위한 장치로서,
빈 미세액적으로부터 세포-함유 미세액적을 세포-함유 제1 미세액적 집단으로 분리하도록 구성된 분류부;
제1 미세액적을 광학 검사를 위한 어레이로 배열하고, 선택적으로 미세액적 병합수단에 의해 각각의 제1 미세액적에 리포터 시스템을 도입하도록 구성된 제1 구역,
제1 구역 내에 또는 제1 구역과 인접하여 위치하고 하나 이상의 검출창에서 병합된 미세액적을 검출하도록 구성된 제 2 구역, 및
선택적으로 추후 기기로부터 회수하기 위해 미세액적이 세분되고 단리될 수 있는 제3 구역,을 포함하는,
실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 제1 미세액적을 조작하도록 구성된 미세액적 조작부; 및
하나 이상의 검출창을 통해 병합된 미세액적으로부터 광학 신호를 검출하도록 구성되며, 이때, 병합된 미세액적에 대해, 신호는 리포터 시스템과 세포 또는 그 발현산물 사이의 상호작용으로부터 발생하는 것인 광학 검출 시스템;
을 포함하는 장치가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 생물학적 시료에서 세포 유형의 하나 이상의 특성을 조작 및/또는 결정하기 위하여 본 발명에 따른 장치를 사용하는 방법으로서, 생물학적 시료로부터 비혼화성 분산매에서 적어도 이들 중 일부에는 특정 유형의 세포를 함유하는 것으로 생각되는 수성 제1 미세액적을 생성하는 단계; 실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 제1 미세액적을 경로를 따라 적어도 하나의 미세액적 검사 위치로 이동시키는 단계; 및 상기 미세액적 내에 함유된 세포의 세포 형태, 세포 운동성 또는 세포막 무결성 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 특성을 결정하기 위하여 광학 검출 시스템으로 각 미세액적의 내용물을 분석하는 단계;를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 생물학적 시료에서 세포 유형의 하나 이상의 특성을 조작 및/또는 결정하기 위하여 본 발명의 장치를 사용하는 방법으로서, 생물학적 시료로부터 비혼화성 분산매에서 적어도 이들 중 일부에는 특정 유형의 세포를 함유하는 것으로 생각되는 수성 제1 미세액적을 생성하는 단계; 가상 전기습윤 전극을 사용하여 제1 미세액적을 경로를 따라 적어도 하나의 미세액적 병합 위치로 이동시키는 단계; 가상 전기습윤 전극을 사용하여 특성이 조사되는 세포 유형의 리포터 시스템 특성을 포함하는 수성 제2 미세액적을 경로를 따라 미세액적 병합 위치로 이동시키는 단계; 병합된 미세액적을 생성하기 위하여 병합 위치에서 제1 및 제2 미세액적을 병합하는 단계; 및 각각의 병합된 미세 방울의 내용물을 광학 검출 시스템으로 분석하고 세포와 리포터 시스템 사이의 상호 작용의 광학 신호 특성을 검출하는 단계;를 포함하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 초기에 또한 하나 이상의 분류, 배양 및 액적 제조 초기 단계를 포함할 수 있다. 상기 초기 단계는 (a) 세포-함유 및 빈 미세액적을 모두 포함하는 미세액적 집단으로부터 세포-함유 제1 미세액적을 분리하는 단계; (b) 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 세포 성장 및 분열을 야기하는 조건 하에서 미세액적 집단을 배양하는 단계; (c) 전기습윤 신장력을 가하여 생물학적 시료로부터 미세액적을 분리하여 미세액적 집단을 생성하는 단계; 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
초기 단계 (c)의 일부 실시예에서, 미세액적은 오일을 포함하는 비혼화성 분산매로 분리된 성장 배지 성분을 함유하며, 그에 의해 초기 단계 (b)에서 후속 배양될 수 있는 에멀젼을 생성한다. 또 다른 경우에, 공기 또는 다른 기체 혼합물, 예를 들어 이산화탄소와 질소의 혼합물로 미세액적이 분리된 후 서로 흩어져서 배양된다. 일부 실시예에서, 세포 배양에 불리한 기체 분산매를 주기적으로 제거하는 것이 유리할 수 있다.
초기 단계 (b)의 한 실시예에서, 미세액적 집단의 배양은 에멀젼에서 및 탄화수소 또는 불소계 오일(fluorinated oil), 특히 불소계 오일과 같은 비혼화성 분산매의 유동 스트림의 존재 하에 수행된다. 상기 오일은 선택적으로 미세액적의 안정성을 유지하기 위해 계면활성제 및 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 오일은 또한 배양 단계 동안 세포 성장을 유지하는 데 필요한 영양분과 기체를 낮은 수준으로 함유하고 있으며, 이 실시예의 응용은 계면 확산에 의해 미세액적의 영양소 함량이 주기적으로 또는 지속적으로 보충되도록 한다. 또는, 영양분과 기체의 보충은 예를 들어 분산매가 공기이거나 비활성 기체인 경우, 상기 성분을 포함하는 제2 수성 미세액적의 병합에 의해 직접적으로 달성될 수 있다. 다른 실시예에서, 세포에 저산소성 환경을 제공하기 위하여 오일에서 특정 용해 기체를 제거한다.
초기 단계 (b)의 일 실시에에서, 세포 성장을 유지하기 위해서는 미세액적 내에 특정 대기 기체의 최적 수준을 유지할 필요가 있음을 확인하였다. 그렇지 않은 경우, 예를 들어 미세액적 배지의 pH에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서 초기 단계 (b)의 일 실시예에서, 비혼화성 분산매의 유동 스트림은 포화 수준의 질소, 산소 또는 특히 이산화탄소 중 하나 이상을 포함한다.
초기 단계 (b)의 다른 실시예에서, 미세액적의 내용물은 미세액적이 유지되는 위치에서 전기습윤력을 가하여 섞이거나, 교반된다. 적절하게는, 이는 예를 들어 하기 설명된 유형의 OEWOD 구조에 의해 전달된 광학-매개 전기습윤력을 사용하여 달성된다. 상기 접근법 또한 광범위하게 유용하다고 생각되며, 따라서 본 발명의 다른 일반적으로 적용가능한 제2 양태에서, 가상 전기습윤 전극 위치에 미세액적을 위치시키는 단계; 및 상기 위치에 전자기 방사선 소스를 가하여, 상응하는 가상 전기습윤전극을 활성화하고 전자기 방사선 소스가 상기 위치 주위로 이동하여 미세액적의 상응하는 움직임과 그 내용물의 상응하는 뒤섞임 또는 교반을 야기하는 것을 특징으로 하는 관련 전기습윤력을 발생시키는 단계를 포함하는 미세액적 내용물을 섞거나 교반하는 방법이 제공된다:
일부 실시예에서, 상기 생물학적 시료는 하나 이상의 암 및/또는 수 배우자를 포함할 수 있고, 상기 방법은 체외 수정 워크플로우의 일부로서 암 및/또는 수 배우자의 조작 및 검사를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 기기를 사용하여 인간 또는 동물 정자 세포와 같은 수 배우자 세포에 대한 검사, 선별 및 분석 단계를 수행할 수 있다. 하나의 예시적인 절차에서, 정자 세포 시료는 희석된 정액으로부터 제조되고 액적에 캡슐화 된다. 액적은 칩에 로딩된 후 명시야 현미경을 사용하여 검사된다. 배우자가 포함되지 않은 액적은 폐기되고, 포함된 모든 정자 세포는 검사를 위해 보관된다. 분석을 위해 배우자 시료가 선별되면, 정지 화상과 함께 배우자의 동영상이 촬영된다. 광학 검출 시스템의 출력에 적용되는 패턴 인식 알고리즘은 운동성, 신체 형태 및 핵 형태에 대한 배우자의 특성화를 가능하게 한다. 특성화의 결과는 추가 처리를 위해 회수되는 특정 액적에 매핑 될 수 있다. 처리는 리포터 시약의 추가와 같은 온-칩 분석 단계를 포함한다.
다른 예에서, 인간 또는 동물 난자와 같은 암 배우자를 캡슐화함으로써 난자의 수정을 수행할 수 있다. 수 배우자와 유사하게 암 배우자를 액적에 캡슐화하고, 칩에 로딩할 수 있다. 일단 장치에서 세포의 형태적 결함을 검사하고, 리포터 시약으로 분석할 수 있다. 검사 또는 분석 후, 암 배우자 세포는 액적 움직임을 통해 적용된 기계적 전단을 가하거나 또는 추가 시약의 가하여 생식 상피세포를 제거하는 것과 같은 선택적 처리 단계를 거칠 수 있다.
또 다른 예에서, 암 및 수 배우자를 단일 미세유체 장치에 로딩하는 것에 의해 두 배우자를 포함하는 액적을 함께 병합하여, 이들을 결합시킬 수 있다. 예시적인 적용에서 다수의 수 배우자 액적이 단일 난자와 병합된다; 배우자 간의 통상적인 상호작용은 온-칩 수정 및 배반포 생성으로 이어진다. 또 다른 예에서, 단일 선별된 수 배우자와 단일 선별 및 처리된 암 배우자가 온-칩 결합되어 상호 작용하게 된다.
다른 예시적인 적용에서, 양성 배우자는 미세유체 칩으로부터 회수되어, ICSI 또는 IVF와 같은 당업계에 알려진 통상적인 취급 기술을 사용하여 결합된다.
일부 실시예에서, 전술한 방법을 통해 또는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 통해 형성될 수 있는 배반포 역시 액적에 캡슐화되고 온-칩 배양될 수 있다. 온-칩 배양은 하기 설명된 이미징 및 검출 시스템을 사용하여 배반포의 형성 동안 검사를 가능하게 한다. 액적 병합 작업을 사용하면, 완충액, 염, 영양분, 단백질 및 세포외 기질 물질과 같은 추가 물질을 첨가하여 배반포 환경을 제어할 수 있다. 배반포 형성 동안, 많은 경우에 레이저 미세절제술과 같은 기술을 사용하여 배반포에서 세포 시료를 제거하고 추가 분석을 위해 회수하는 것이 바람직하다. 일부 실시예에서, 배반포는 액적 조작 구역으로 운반된다. 이 조작 구역은 미세유체 칩 상에 지주(pillar), 기둥(post), 전기습윤 판 사이의 물리적 제한 또는 개시된 내용이 본원에 참고로 포함되는 PCT/EP2019/062791에 기재된 바와 같은 전기습윤 판 사이의 갭의 쐐기-형 변형과 같은 물리적 형상을 포함할 수 있다. 배반포가 조작 구역에 로딩되면, 효과적으로 움직이지 않는 채 있게 된다. 이후 배반포의 일부를 제거하기 위해 레이저 미세절제술을 진행할 수 있으며, 그 과정은 문헌에 잘 설명되어 있다. 액적의 일부가 절제되면, 본 명세서에 설명된 것과 같은 액적 분할 작업을 사용하여 배반포로부터 시료 부분을 분리할 수 있다. 반복적인 분할 및 재병합 작업과 분할 후 두 액적 간 물질의 분포에 대한 머신-비전 검사를 통해 배반포와 시료 부분이 제대로 분리되었는 지 확인할 수 있다. 분리 후 배반포의 시료 부분은 중합효소 연쇄반응 또는 DNA 시퀀싱을 포함한 유전자 검사와 같은 추가 분석을 위해 회수할 수 있다.
적절하게는, 본 방법에서 사용되는 전자기 방사선의 소스는 하기 설명된 제2 전자기 방사선에 해당하며, 위치의 주변부의 내부 또는 주변에 원형 경로를 그리는 빠르게 깜박이는 회전 광원을 포함한다. 다른 실시예에서, 광원의 움직임은 하나 이상의 측면 이동 경로를 포함할 수 있다. 하나의 소견에서, 상기 위치는 직경이 0.5 마이크론 이상인 영역으로 정의되며, 이동은 원형, 방사형 또는 둘의 혼합이다. 상기 이동은 방사형으로 상응하는 미세액적 내용물의 원심 혼합을 일으킨다.
단계 (4)에서 제1 미세액적으로 도입될 수 있는 리포터 시스템은 원칙적으로 생물학적 시료에서 주어진 세포 유형 또는 세포 행동에 특징적이거나 혹은 그의 존재를 분석하는 데 사용할 수 있는 임의의 시스템일 수 있다. 이러한 리포터 시스템은 예를 들면, 리포터 유전자, 세포-표면 바이오마커 또는 조사대상 세포 유형의 세포에 의해 발현되는 효소, 단백질 또는 항체에 대해 선별적인 리포터 분자를 포함한다. 리포터 시스템의 관련 부류는 조사되는 세포에 의해 발현된 관련 물질의 존재에 응답하는 제2 리포터 세포가 될 수 있다. 이러한 많은 분석법이 공지되어 있고, 사용하기에 적절한 후보는 많은 경우에 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 하나 이상의 제2 미세액적 유형을 병합하는 것에 의해 복수의 서로 다른 리포터 시스템을 제1 미세액적에 도입함으로써, 다양한 특성 및 행동과 관련된 다양한 세포 유형에 대한 병렬 및 동시 검색을 수행할 수 있도록 방법을 다목적화할 수 있음은 당연하다.
본 발명의 방법 및 그 다양한 단계 및 초기 하위 단계는 하기 설명된 유형의 분석 장치를 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 본 방법에 적용할 수 있는 광학 검출 시스템의 예 역시 하기 설명된다. 일부 실시예에서, 본 장치는,
빈 미세액적으로부터 세포-함유 미세액적을 세포-함유 제1 미세액적 집단으로 분리하기 위한 분류부;
미세액적 병합 수단에 의해 각각의 제1 미세액적에 리포터 시스템을 도입하는 수단을 포함하는 제1 구역,
제1 구역 내에 또는 제1 구역과 인접하여 위치하고 하나 이상의 검출창에서 병합된 미세액적이 이후 검출되는 제 2 구역을 포함하며,
실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 제1 미세액적을 후속적으로 조작하기 위한 미세액적 조작부; 및
명시야 현미경, 암시야 현미경, 화학발광 검출 수단, 포스터 공명 에너지 전이 검출 수단 또는 형광 검출 수단으로부터 선택되며, 하나 이상의 검출창을 통해 병합된 미세액적으로부터 리포터 시스템과 세포 또는 그 발현산물 사이의 상호작용으로부터 발생하는 광학 신호를 검출하는 광학 검출 시스템;
을 포함한다.
이러한 실시예에서 사용되는 분류부는 그들 중 일부가 비어있는 더 큰 집단으로부터 하나 이상의 세포를 포함하는 미세액적(이하 '충진된 미세액적')을 분리하기 위한 수단이다. 선택된 분류부의 유형에 따라서 아래로 향하거나, 미세액적이 충진되었는 지 혹은 비었는 지에 따라 두 가지 다른 미세유체 경로 중 하나 또는 수용 위치를 향한다. 일부 실시예에서, 이들 중 하나 또는 다른 하나에 대한 접근은 분배기 또는 분석 창에서 각각의 미세액적의 분석에 반응하여 작용하는 전기 기계적 게이트의 작동에 의해 제어된다. 다른 실시예에서, 분류는 선택된 것들이 고정 영역 또는 어레이로 당겨지도록 분석 창에서 미세액적의 스트림에 반응하여 광학적으로 매개된 전기습윤력을 가하는 것에 의해 수행된다. 채택되지 않은 미세액적은 스트림에 남아 있으며, 이 후 폐기될 수 있다. 다른 실시예에서, 분류 결정은 광학 현상에 기반한다; 예를 들어 명시야 현미경 또는 세포와 관련된 광학적 특성, 예를 들면 형광 태그 또는 마커의 존재을 검출. 다른 실시예에서, 분류는 일시적인 전기장을 분석창에 가하여 각각의 미세액적을 분배기의 양쪽에 있는 두 개의 다른 경로 중 하나를 향해 차례로 편향 시키는 유전영동 방법에 의해 달성될 수 있다. 일 실시예에서, 분류부는 분석 챔버에서 종결되는 제1 미세유체 채널; 분석 챔버에 연결되어 있으며, 이들 중 적어도 하나는 하류에서 제1 미세액적을 운반하는 둘 이상의 제2 미세유체 채널; 분석 챔버를 광조사하기 위한 광원; 분석 챔버에서 각각 광조사된 제1 미세액적으로부터 데이터를 얻기 위한 명시야 현미경 또는 형광 검출기; 두 개의 제2 채널 중 하나의 아래로 미세액적을 유도하도록 작동할 수 있는 하나 이상의 OEWOD 구조; 및 현미경 또는 형광 분석기로부터 수신된 데이터에 적용된 식별 알고리즘의 결과에 응답하여 상기 구조(들)를 작동시키도록 구성된 마이크로 프로세서를 포함한다.
일 실시예에서, 장치는 장치 자체와 일체형이거나 분류부 앞 또는 뒤, 바람직하게는 분류부 뒤에 별도로 위치하는 배양부를 추가로 포함한다. 여기서 미세액적은 세포 분열과 성장을 자극할 수 있도록 내부에 포함된 임의의 세포가 배양되는 동안 유지된다. 적절하게는, 배양부는 미세액적이 최적의 배양 조건(일반적으로 25 ℃(예를 들어 25 ℃ 내지 40 ℃) 이상의 온도에서 1 시간 내지 1 주일) 하에 유지되는 용기 및 미세액적을 주입하기 위한 주입구를 포함한다. 일 실시예에서, 배양부는 자동온도조절 방식으로 제어되는 히터 및 선택적으로 장치의 충진 및 방출 주기를 제어하는 타이머를 추가로 포함한다. 일 실시예에서, 장치의 내용물은 비혼화성 분산매 중의 미세액적 에멀젼을 포함하고, 장치는 비혼화성 분산매가 통과하는 주입구와 배출구를 추가로 포함하여 시간이 지남에 따라 분산매를 교체할 수 있다. 일 실시예에서, 비혼화성 분산매는 HFE7500, HFE7700 또는 FC-40과 같은 탄화불소 오일이다. 이러한 오일은 적절하게는 미세액적의 안정성을 유지하기 위한 계면활성제 및 기타 첨가제와 성장을 유지하기 위해 필요한 낮은 수준의 영양분 및 기체를 추가로 포함한다.
오일에 대한 수성 미세액적의 중량 비가 낮은 특정 유용성의 일 실시예에서, 미세액적은 시간이 지남에 따라 수축하는 경향이 있다; 내부의 반응성을 감소시킬 수 있는 현상. 이 효과를 상쇄시키는 한 가지 방법은 수화된 오일을 사용하는 것이다. 일반적으로 전술한 오일은 물을 잘 용해시키지 않기 때문에, 오일상 내에 미셀 또는 물 또는 수성 완충액의 제2 미세액적을 생성하는 것에 의해 수화가 충분히 달성된다. 이 완충액은 미세액적 자체와 동일하거나 또는 상이한 조성을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 미셀 또는 제2 미세액적은 미세액적 자체의 염 함량의 최대 5 배를 함유할 수 있고, 선택적으로 글리세롤을 함유할 수 있다. 일반적으로 이러한 미셀과 제2 미세액적은 훨씬 더 작다.
일 실시예에서, 용기는 전술한 바와 같이 광학적으로 매개된 전기습윤력을 사용하여 내용물을 교반하기 위해, 미세액적이 위치되고 교반될 수 있는 복수의 위치가 제공되는 표면을 추가로 포함한다.
장치는 장치 자체와 일체형이거나 배양부의 앞에 별도로 위치하며, 생물학적 시료의 분액으로부터 비혼화성 분산매에 미세액적의 에멀젼을 생성하기 위한 수단을 포함하는 시료 준비부를 추가로 포함한다.
시료 준비부는 생물학적 시료에 전기습윤 신장력이 가해지는 적어도 하나의 위치를 포함하는, 생물학적 시료로부터 미세액적을 분산매로 분리하기 위한 분리 수단을 포함한다. 일 실시예에서 분리 수단은,
생물학적 시료를 수용하도록 구성된 제1 전기습윤 위치;
제1 및 제2 전기습윤 전극 위치가 시료로부터 분리된 미세액적이 방향성 전기습윤력을 사용하여 이송될 수 있는 경로를 정의하도록 배열된 하나 이상의 제2 전기습윤 위치;
제1 전기 습윤 위치에 배치되고, 전극과 관련 AC 전기 회로 또는 전자기 광의 충돌에 의해 활성화되는 반도체 구역을 포함하는 AC 구동 회로; 및
제1 전기습윤 위치에 배치되고, 생물학적 시료의 표면을 정전기적으로 충전시키도록 구성된 DC 충전 회로;
를 포함한다.
일 실시예에서, 분리 수단은 추가로 각각 AC 회로 및 DC 회로인 구동 회로와 충전 회로 사이를 스위칭하기 위한 제어회로를 포함한다. 다른 실시예에서, 분리 수단은 생물학적 시료로부터 제조된 각각의 미세액적의 내용물을 분석하기 위한 분석기를 추가로 포함한다. 이와 관련하여, 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 객담, 소변 또는 조직 생검 유래의 물질과 같은 임의의 수성 물질의 형태 일 수 있다. 적절한 분리 수단에 대한 추가 정보는 함께 출원 중인 EP18201162.7에서 확인할 수 있다. 이러한 분리 수단과 관련된 미세액적 분리 방법은 상기 초기 단계 (c)를 수행하는 기반을 형성할 수 있음은 당연하다.
분류부에 의해 생성된 제1 미세액적을 후속적으로 조작하는 데 사용되는 미세액적 조작부를 살펴보면, 미세액적 조작부는 적절하게는 제1 구역, 제2 구역 및 실제 또는 가상 전기습윤 전극을 포함하는 광학 검출 시스템을 포함하는 미세유체 칩으로, 제1 미세액적이 공압 및/또는 전기습윤력에 의해 이를 따라 구동되는 하나 이상의 미세유체 경로에 의해 서로 연결된다. 적절하게는, 전기습윤 전극은 가상이며, 하나 이상의 OEWOD 구조 중의 위치에 설정된다. 일반적으로, 이는 상기 방법에서 미세액적을 조작하는 방법이며, 일 실시예에서 이러한 OEWOD 구조는,
제1 기판,
기판 상의, 두께가 70 내지 250 nm 범위인 투명한 제1 전도층,
투명한 제1 전도체 층 상의, 400~850 nm 파장 범위의 전자기 방사선에 의해 활성화된, 두께가 300~1500 nm 범위인 광활성층, 및
광활성층 상의, 두께가 30~160 nm 범위인 제1 유전층,
을 포함하는 제1 복합벽;
제2 기판,
기판 상의, 두께가 70 내지 250 nm 범위인 제2 전도층, 및
선택적으로 제2 전도층 상의, 두께가 30 내지 160 nm 범위인 제2 유전층,
을 포함하며,
이때, 제1 및 제2 유전층의 노출된 표면은 미세액적을 수용하는 미세유체 공간을 형성하도록 20~180 μm 이격되어 배치되는 제2 복합벽;
제1 및 제2 전도층을 연결하는 제1 및 제2 복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 A/C 소스;
제1 유전층의 표면 상에 상응하는 가상 전기습윤 위치를 유도하기 위해 광활성층에 충돌하도록 구성된, 광활성층의 밴드갭보다 높은 에너지를 갖는 하나 이상의 전자기 방사선 소스; 및
가상 전기습윤 위치의 배치를 변화시켜 미세액적이 이동하게 될 수 있는 적어도 하나의 전기 습윤 경로를 생성하도록 광활성층 상의 전자기 방사선의 충돌 지점을 조작하는 조작수단;
을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 구조의 제1 및 제2 벽은 그 사이에 형성된 미세유체 공간에 대해 투명하다. 다른 실시예에서, 제1 기판과 제1 전도층은 투명하여 전자기 방사선 소스(예를 들어, 다중 레이저빔, 램프 또는 LED)로부터 광이 광활성층에 충돌할 수 있도록 투명하다. 다른 실시예에서, 제2 기판, 제2 전도층 및 제2 유전층은 투명해서 동일한 목적을 달성할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 이러한 모든 층은 투명하다.
적절하게는, 제1 및 제2 기판은 유리 금속 또는 엔지니어링 플라스틱과 같이 기계적으로 강한 재료로 구성된다. 일 실시예에서, 기판은 어느 정도 유연성을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 제1 및 제2 기판은 100-1000 μm 범위의 두께를 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 기판은 실리콘, 용융 실리카 및 유리 중 하나로 구성된다. 일부 실시예에서, 제2 기판은 용융 실리카 및 유리 중 하나로 구성된다.
제1 및 제2 전도층은 제1 및 제2 기판의 일면에 위치하고, 전형적으로 70 내지 250 nm, 바람직하게는 70 내지 150 nm의 두께를 갖는다. 일 실시예에서, 이들 층 중 적어도 하나는 인듐 주석 산화물(ITO: Indium Tin Oxide)과 같은 투명한 전도성 재료, 은과 같은 전도성 금속의 초박막 또는 PEDOT와 같은 전도성 고분자 등으로 구성된다. 이들 층은 연속성 시트 또는 와이어와 같은 일련의 개별 구조로 형성될 수 있다. 또는, 전도층은 전자기 방사선이 메시(mesh)의 틈 사이로 향하는 전도성 물질의 메시일 수 있다.
광활성층은 전자기 방사선 소스에 의한 자극에 응답하여 국부적인 전하 영역을 생성할 수 있는 반도체 재료로 적절하게 구성된다. 예로는 300 내지 1500 nm 범위 두께의 수소화된 비정질 실리콘 층을 포함한다. 일 실시예에서, 광활성층은 가시광선을 사용하여 활성화된다.
제1 벽의 경우 광활성층, 및 선택적으로 제2 벽의 경우 전도층은, 두께가 전형적으로 120 내지 160 nm범위인 유전층으로 코팅된다. 이 층의 유전 특성은 바람직하게는 10^7 V/m 이상의 고유전강도 및 3 이상의 유전상수를 포함한다. 바람직하게는, 유전 파괴를 피하면서 가능한 한 얇다. 일 실시예에서, 유전층은 알루미나, 실리카, 하프니아(hafnia) 또는 얇은 비전도성 고분자 필름으로부터 선택된다.
상기 구조의 다른 실시예에서, 적어도 제1유전층, 바람직하게는 둘 모두는 방오층으로 코팅되어 다양한 전기습윤 위치에서 원하는 미세액적/분산매/표면 접촉각을 형성하도록 보조하며, 추가적으로 액적이 칩을 통하여 이동함에 따라 액적의 내용물이 표면에 흡착되어 감소되는 것을 방지한다. 제2벽이 제2 유전층을 포함하지 않으면, 제2 방오층은 제2 전도층 상에 직접 적용될 수 있다. 최적의 성능을 위해, 방오층은 25 ℃에서 기-액-표면 3점 계면으로 측정할 때 50 ~ 170° 범위의 미세액적/분산매/표면 접촉각을 형성하는 데 도움을 주어야 한다. 일 실시예에서, 이들 층(들)은 두께가 10 nm 미만이며, 통상 단분자층이다. 다른 실시예에서, 이들 층은 메틸 메타크릴레이트와 같은 아크릴레이트 에스테르이거나 알콕시실릴과 같은 친수성기로 치환된 그 유도체의 고분자를 포함한다. 방오층 중 하나 또는 둘 모두는 최적의 성능을 보증하기 위해 소수성이다. 일 실시예에서 화학적으로 화합되는 브릿지를 제공하기 위하여 두께가 20 nm인 실리카의 간극층이 방오코팅과 유전층 사이에 개재될 수 있다.
제1 및 제2 유전체층과, 따라서 제1 및 제2 벽은 폭이 10 μm 이상, 바람직하게는 20~180 μm 범위이며, 미세액적이 수용되는 미세유체 공간을 형성한다. 바람직하게는, 미세액적이 수용되기 전에, 미세액적 자체의 고유 직경은 미세액적 공간의 폭보다 10% 초과, 적절하게는 20% 초과이다. 이러한 수단에 의해, 미세액적은 칩에 들어가면서 압축되어 예를 들어, 더 나은 병합 능력처럼 전기습윤 성능이 향상된다.
일 실시예에서 제1 및 제2 유전층은 플루오로실란과 같은 소수성 코팅으로 코팅된다.
다른 실시예에서, 미세유체 공간은 제1 및 제2 벽을 소정의 양만큼 이격시키기 위한 하나 이상의 스페이서를 포함한다. 스페이서에 대한 선택지는 비드, 지주, 광 패터닝에 의해 생성된 중간 레지스트 층으로부터 만들어지는 융기(ridges)가 포함된다. 또는, 산화규소나 질화규소와 같은 증착물질을 스페이서를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 또는 접착층이 있거나 없는 가요성 플라스틱 필름을 스페이서 층의 형성에 사용할 수 있다. 다양한 스페이서 구조가 좁은 채널, 테이퍼 채널 또는 연속된 지주(pillar)에 의해 정의된 부분적으로 둘러싸인 채널을 형성하는 데 사용할 수 있다. 세심한 설계에 의해, 상기 구조를 사용하여 미세액적의 변형을 돕고, 이어 미세액적을 분할하며, 변형된 미세액적에 대한 작업에 영향을 줄 수 있다. 마찬가지로 이러한 스페이서는 액적 집단간 교차오염을 방지하기 위하여 칩의 구역을 물리적으로 분리하고, 유압 하에서 칩에 로딩할 때 액적이 올바른 방향으로 흐름을 촉진하도록 하는데 사용할 수 있다.
제1 및 제2 벽은 그들 사이에 적절하게는 10 내지 50 볼트 범위의 전압 전위차를 제공하기 위해 전도층에 부착된 A/C 전원을 사용하여 바이어스 된다.
상기 OEWOD 구조는 일반적으로 파장이 400~850 nm 범위, 바람직하게는 660 nm이고, 광활성층의 밴드갭보다 높은 에너지를 갖는 전자기 방사선 소스와 함께 사용한다. 적절하게는, 광활성층은 사용된 방사선의 입사 강도가 0.01 내지 0.2 Wcm-2 범위인 가상 전기습윤 전극 위치에서 광활성층이 활성화될 것이다. 일 실시예에서, 전자기 방사선 소스는 함께 픽셀화 되는 광활성층에 상응하는 광여기된 영역을 생성하도록 픽셀화 된다. 이러한 수단에 의해, 픽셀화된 가상 전기습윤 위치가 제1 유전층 상에 유도된다.
전자기 방사선 소스가 픽셀화 되는 경우, LED 또는 다른 램프로부터의 광에 의해 광조사되는 디지털 미세거울 장치(DMD, Digital Micromirror Device)와 같은 반사 스크린을 사용하여 직접 또는 간접적으로 적절하게 제공된다. 이는 제1 유전층 상에 매우 복잡한 패턴의 가상 전기습윤 전극 위치가 신속하게 생성 및 소멸될 수 있도록 함으로써, 미세하게 조절되는 전기습윤력을 이용하여 미세액적이 임의의 가상의 경로를 따라 정밀하게 조종될 수 있게 한다. 이는 칩에서 수천개의 이러한 미세액적을 복수의 경로를 따라 동시에 조작할 필요가 있을 때 특히 유용하다. 이러한 전기습윤 경로는 제1 유전층 상의 가상 전기습윤 전극 위치의 연속체로부터 구성되는 것으로 간주될 수 있다.
광활성층 상에 전자기 방사선 소스의 충돌 지점은 통상적인 원형 또는 환상을 포함하는 임의의 용이한 형상일 수 있다. 일 실시예에서, 이들 지점의 형태는 상응하는 픽셀화의 형태에 의해 결정되며, 다른 실시예에서는 미세액적 공간으로 들어간 마이크로 액적의 형태에 전적으로 또는 부분적으로 대응한다. 일 실시예에서, 충돌 지점 및 이에 따른 전기습윤 전극 위치는 초승달 모양 일 수 있으며, 미세액적의 의도된 이동 방향으로 지향될 수 있다. 적절하게는 전기습윤 전극 위치 자체는 제1 벽에 부착된 미세액적 표면보다 작고, 액적과 표면 유전체 사잉에 형성된 접족선을 가로질러 최대 전계 강도 구배를 제공한다.
OEWOD 구조의 일 실시예에서, 제2 벽 또한 동일하거나 다른 전자기 방사선 소스에 의해 제2 유전층 상에 가상 전기습윤 전극 위치를 유도할 수 있도록 하는 광활성층을 포함한다. 제2 유전층의 부가는 구조의 상부에서 하부 표면으로 미세액적의 습윤 엣지(edge)를 전이시키고, 각각의 미세액적에 더 많은 전기습윤력을 가할수 있도록 한다.
본 장치의 일부를 형성하는 제1 구역은, 일 실시예에서 제1 미세액적을 도입하기 위한 주입구와 전기습윤 경로에 의해 제2 구역에 연결된 배출구를 포함하는 유지 저장소이다. 제1 구역은 하나의 적절한 실시예에서 제1 미세액적에 함유된 세포의 특성을 확인하기 위하여 설계된 리포터 시스템을 함유하는 제2 수성 미세액적을 도입하기 위한 제2 주입구인 리포터 시스템 도입을 위한 포트를 추가로 포함한다. 일 실시예에서, 저장소는 제2 미세액적이 그 위로 구동되는 동안 제1 미세액적이 유지될 수 있는 위치의 어레이를 추가로 포함하며, 이 과정에서 제1 및 제2 미세액적이 어느 정도 병합된다. 병합된 제1/제2 미세액적(이하 '병합된 미세액적')은 리포터 시스템이 세포와 충분히 상호 작용하여 그후 전기습윤에 의해 제2 구역으로 이송될 때 최적의 광학 신호를 생성하도록 상기 위치에 유지될 수 있다. 어떤 경우에는, 시간-분해 측정을 사용하여 광 신호의 성장을 모니터링하는 것이 바람직할 수 있다. 일 실시예에서, 예를 들어, 위에서 언급 한 병합 위치에서 병합된 미세액적을 검출하는 것처럼 제1 및 제2 구역 모두의 역할을 망라하는 단일 구역이 사용된다.
제2 구역은 적절하게는 이를 통하여 광학 검출 시스템으로 병합된 미세액적을 분석할 수 있는 하나 이상의 검출 창을 포함한다. 일 실시예에서. 제2 구역은 칩의 투명한 부분이다. 다른 실시예에서, 광학 검출 시스템은 미세액적으로부터 리포터 시스템과 세포 또는 이의 발현 산물 사이의 상호 작용으로부터 발생하는 광학 신호를 검출하도록 설계된 것이다. 적절하게는, 광학 검출 시스템은 명시야 현미경, 암시야 현미경, 화학발광 검출 수단, 포스터 공명 에너지 전이 검출 수단 또는 형광 검출 수단으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 검출 시스템은 또한 병합된 미세액적에 광조사하기 위한 광원 및/또는 검출기 중 하나로부터 신호를 수신하고 사용자에게 예를 들어, 시각적 디스플레이 또는 계수의 형태로 데이터를 제공하기 위한 마이크로프로세서를 포함한다. 일 실시예에서, 마이크로프로세서는 분류부의 성능 중 하나 이상을 제어하기 위해 피드백 루프에 의해 추가로 순응된다; 제1 구역으로 제1 미세액적의 도입 속도 및 광학 검출 시스템에 의해 검출된 신호에 대응한 제1 및 리포터 시스템-함유 미세액적의 병합 속도.
액적 조작을 수행하기 위해 oEWOD 구조를 사용하는 기기의 특별한 장점은 시료에 초점을 맞춘 광학 주소지정 시스템이 기기에 내장되어 있다는 것이다. oEWOD 제어에 필요한 조명과 함께 광학 검출에 필요한 여기 및 방출 광을 다중화 및 역-다중화함으로써 많은 광학 기능을 더 간단하고 저렴한 하나의 어셈블리로 통합할 수 있다. 예를 들어, 빛을 조작 컬럼에서 고감도 검출 카메라로 전환하기 위하여 장경사 색선별거울(long-pass dichroic mirror)을 사용하여 어셈블리에서 발광 방출을 역-다중화할 수 있다. 다른 실시예는 램프로부터의 형광 여기 광을 다중화하는 첫 번째 거울과 형광 발광을 역 다중화하는 두 번째 거울인 두 개의 색선별 거울을 사용한다. 시간-분해 포스터 공명 에너지 전이와 같은 보다 복잡한 조명 체계를 필요로 하는 실시예의 경우, 시간 의존적이고 공간적으로 변화하는 조명 패턴을 적용하기 위한 oEWOD 조작 패턴을 다루는 동일 구조의 조명 시스템을 사용하는 것이 유리한다. 이러한 다중화 작업을 위해 색선별 거울을 사용하는 것 뿐 아니라. 분산 필터, 분산 렌즈 또는 회절격자와 같은 요소를 사용할 수 있다. 일부 응용을 위해서는, 여기(excitation) 소스 사이를 빠르게 전환하는데 사용되는 구조화된 조명 시스템에 의해 일시적 다중화를 수행하는 것이 유리한다.
일부 실시예에서, 장치는 제1 및/또는 제2 구역으로부터 미세액적을 회수하기 위한 제3 구역을 추가로 포함한다. 여기에서, 제1 미세액적은 기기로부터 추후 회수하기 위해 세분되고 단리될 수 있다; 예를 들어 더 상세한 또는 확인 분석을 위해. 일 실시예에서, 제3 구역은 임시 저장 용기에 연결된 제2 구역으로부터의 하나 이상의 배출구 포트를 포함한다. oEWOD 전송 메커니즘을 사용하여 제1 및 제2구역을 보충하는 것에 의해, 미세액적을 순차적으로 많이 회수할 수 있으므로 하나의 포트에서 복수의 액적을 개별적으로 회수할 수 있다.
OEWOD 구조에서 유체를 광학 매개로 조작할 뿐 아니라, 장치는 또한 다양한 주입구와 배출구 포트에 선택적으로 유압을 가하는 것에 의해 장치 내부의 흐름을 조작하기 위하여 펌프 및 밸브의 네트워크를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 네트워크는 각각 주입구와 압력소스 세트(예, 펌프)에 연결된 2-위치 밸브, 수집 용기 및 동일한 밸브에 연결된 저장소를 포함한다. 각 밸브의 구성을 변경하는 것에 의해, 저장소 및 수집 용기를 통해 장치 내에 양압 또는 음압을 가할 수 있으며, 따라서 장치의 내부로, 밖으로 또는 안에서 물질을 흐르게 할 수 있다.
전술한 본 발명의 장치 및 관련 방법은 많은 유익한 응용분야가 있다. 몇 가지 예시적 응용과 관련 워크플로우를 하기에 설명한다.
전술한 장치와 방법의 한가지 응용예는 유전적으로 변형된 세포주를 개발하는 것이다.
상기 응용에서, 표적세포는 시료 준비부의 광학적으로 매개된 전기습윤 기반의 분리 수단에 의해 제1 미세액적 내에 캡슐화된다. 예를 들어 변형된 렌티바이러스와 같은 감염 시약은 별도의 제2 미세액적 내에 캡슐화된다.
이후 제1 및 제2 미세액적은 병합 액적을 형성하는 전술한 병합 작업에서 OEWOD 장치 상에 병합되어, 표적세포가 감염 시약에 노출되게 된다. 병합 미세액적에서 세포는 세포 집단이 액적 중으로 분배되는 병합 및 분할 작업의 주기를 거치며, 세포를 둘러싼 배지는 순차 희석을 통해 새로운 배지로 교체되어 액적 내에 고갈된 물질을 보충하고 축적된 세포 노폐물을 제거한다.
예를 들어 분석 중 현미경 관측에 의해 미세액적 집단에서 각 세포의 위치를 추적하면, 공통 조상의 세포를 분류 목적으로 식별할 수 있어 배양된 세포 집단의 단클론성을 보장할 수 있다.
설명된 과정 동안 세포의 생존력을 감소시키는 것으로 알려진 동결-해동, 분배, 수동 처리 또는 반복된 장기 계대 배양의 해로운 단계가 없기 때문에 세포-유지 또한 종래의 세포주 개발 방법에 비해 증가한다. 마찬가지로, 세포를 액적에 캡슐화하여 유지하면 액체 취급 기기 표면으로 클론이 손실될 가능성이 제거된다. 또한, 생존 불가능한 세포가 공정 초반에 발견되어, 그 대신 생존 가능한 세포로 대체될 수 있다.
병합된 미세액적에서 세포가 충분한 시간동안 배양된 것으로 확인되면, 리포터 분석을 포함하는 제3 시약이 OEWOD 장치로 도입되어 표적세포를 포함하는 미세액적과 병합된다. 리포터 분석의 결과는 예를 들어 검출된 형광, 화학발광 또는 포스터 공명 에너지 전이에 따라 측정될 수 있다.
리포터 분석의 결과에 기반하여, 하나 이상의 세포의 제1 하위집단이 폐기될 수 있고, 세포의 하나 이상의 제2 하위집단이 추가로 증식되도록할 수 있다. 시료는 배양된 표적세포 하위집단으로부터 회수되며, 추가적인 오프-칩 분석을 위하여 칩으로부터 예를 들어, 표준 1536 웰-플레이트와 같은 웰-플레이트로 분배된다. 배양된 하위집단의 나머지 전발생세포(progenitor cell)는 추가적인 온-칩 배양을 위해 유지된다.
회수된 시료는 이후 DNA 시퀀싱, RNA 시퀀싱, PCR 분석, 유전자 프로파일 링 및 마이크로-어레이 측정과 같은 하나 이상의 오프-칩 분석의 대상이 된다. 온-칩 세포의 추가 하위집단은 오프-칩 분석의 결과에 기초하여 추가로 선별, 회수 및 배양될 수 있다.
본 발명의 다른 응용 예는 면역 기능성에 대해 세포를 스크리닝하는 것이다.
독소와 같은 항원 또는 질병의 특징적인 바이오마커로 면역화한 후, B-세포, T-세포 또는 수지상 세포와 같은 천연 면역세포 시료를 마우스, 인간 또는 영장류와 같은 유기체로부터 수득할 수 있다. 이후 주변 조직, 림프구, 혈액 세포 및 숙주 유기체 유래의 다른 성분으로부터 분리하기 위하여 상기 세포를 처리하고 정제한다. 이는 절제, 원심분리, 면역침전, 여과 및 투석의 혼합에 의해 달성될 수 있다.
정제된 면역 세포는 미세액적에 캡슐화되어 OEWOD 장치에 로딩된다. 면역 분석 시약, FRET 리포터 또는 리포터 세포주와 같은 시약은 첫 번째 분석에서 표적 세포를 포함하는 미세액적에 도입된다. 이는 전술한 바와 같이 시약의 제2 미세액적을 생성하고 병합 작업을 실행하는 것에 의해 수행할 수 있다.
첫 번째 분석 결과는 항체와 같은 단백질이 면역분석 시약에 반응하여 표적세포로부터 분비되는지 여부를 결정하기 위해 예를 들어 광학 검출 또는 현미경 검사에 의해 조사된다. 첫 번째 분석 결과를 기반으로, 표적세포를 포함하는 미세액적의 하위집단은 장치로부터 폐기될 수 있으며, 다른 하위집단은 추가 검사를 위해 유지된다.
오프-타겟 리포터와 같은 제2 시약이 두 번째 온칩 분석에서 잔존세포 함유 미세액적과 유사한 방식으로 도입될 수 있다. 두 번째 분석 결과는 형광 분광기와 같은 광학 기술로 측정되어, 미세액적 하위집단의 2회차 선별 및 폐기로 이어진다. 상기 과정은 표적 세포의 표적, 비표적 및 부적절한 표적에 대한 반응을 측정하는 일련의 상이한 리포터 분석을 사용하여 표적세포를 조사/스크리닝하기 위해 반복될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표적(on-target)"은 관심대상인 조직 또는 항원을 지칭하고, 표적세포는 그에 대한 반응 항체 등을 생산한다. 예를 들어, 표적은 암 조직일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "비표적(off-target)"은 바람직하지 않은 효과가 관찰되거나 예상되는 조직을 지칭한다. 비표적의 예는 암 조직에 근처의 건강한 조직이거나 암 조직과 연관된 것일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "부적절한 표적(irrelevant target)"은 항체와 생물학적 상호작용이 없을 것으로 예상되지만, 예를 들어 다량의 항체가 유용하지 않은 말단에 결합하거나 측정을 교란시키는 것에 의해 분석 결과의 정확성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 물질을 의미한다.
스크리닝 분석의 측정 결과를 기반으로 세포의 최종 하위집합이 선택된다. 최종 하위집단을 포함하는 잔여 세포-함유 미세액적은 표적세포에서 현재 발현되고있는 유전자 라이브러리를 형성하기 위해 선별된 용해 시약 및 cDNA 합성 시약으로 도입된다. 관심대상 세포는 오프-칩으로 회수되고, 온-칩 표현형 분석에서 관측된 반응을 담당하는 코딩 DNA를 나타내는 유전 분석의 대상이 된다.
본 발명의 다른 응용 예는 면역조절 약물 및 종양 억제 용 약물을 포함하는 약물 기능성 및 효능을 스크리닝하는 것이다.
본 응용에서 약물-표적세포의 패널은 제1 미세액적 내에 캡슐화되고 OEWOD 장치에 로딩된다. 시험을 위한 약물의 패널을 포함하는 제2 미세액적 세트 역시 장치에 로딩된다.
선량측정(dosimetry) 패널은 각 약물 화합물의 다양한 희석액을 포함하는 미세액적 패널을 생성하도록 제2 미세액적에서 수행되는 병합 및 분할 작업에 의해 형성된다. 약물 화합물은 마이크로 비드의 형태이거나, 소포에 캡슐화되거나, 액적에 캡슐화된 생산 세포에 의해 발현될 수 있다.
약물 선량측정 패널은 병합 작업을 통해 표적세포로 도입된다; 미세액적을 포함하는 제1 세포와 약물 선량측정 패널의 미세액적 사이의 포괄적인 쌍방식 조합 공정은 전체 패널이 1반복 실험에서 모든 세포 유형에 노출되도록 한다. 예를 들어 T-살해 세포나 대식세포와 같은 작동세포(effector cell) 역시 약물 패널 및 표적세포와 함께 도입하여, 면역반응을 조절하는 약물의 효과를 테스트하고 다른 조직의 존재 하에 면역 반응을 상세하게 교차비교할 수 있다.
약물 패널에 대한 표적세포의 반응은 예를 들어 현미경 검사, 형광 리포터 염색 또는 리포터 분석을 통해 모니터링할 수 있다. 스크리닝 결과는 다양한 세포 및 작동세포 조건에서 시험 약물의 효능을 알리는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 응용 예는 표적줄기세포의 분화 유도에 있다.
본 응용에서 예를 들어 유도된 다능성 줄기세포, 배아줄기세포, 간엽줄기세포, 조혈줄기세포와 같은 표적줄기세포는 제1 미세액적 내에 캡슐화되고 OEWOD 장치에 로딩된다.
예를 들어 성장인자, 환경 자극제, 세포 대 세포 신호전달 화합물 및 모포겐과 같은 제어시약 화합물 패널은 제2 미세액적 내에 캡슐화되며, 역시 OEWOD 장치에 로딩된다.
제1 미세액적 내에 함유된 줄기세포를 시약에 노출시켜 표적 경로에 따른 줄기세포의 분화를 촉진하기 위하여, 제1 미세액적의 하위집단은 제어시약을 포함하는 제2 미세액적과 병합된다.
줄기세포 분화 공정은 예를 들어 현미경 이미지, 표현형 리포터 화합물 검출 및 리포터 분석을 수행하는 것을 통하여 모니터링된다. 병합된 미세액적 내의 분화된 세포는 추가적인 배양이나 처리를 위하여 분배단계를 통해 OEWOD 장치로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 Eh 다른 응용 예는 오가노이드 구조의 제어 형성에 있다.
본 응용에서 예를 들어 종양 세포, 줄기세포와 같은 오가노이드 전발생세포는 제1 미세액적 내에 캡슐화되고 OEWOD 장치에 로딩된다. 예를 들어 성장인자, 환경 자극제, 세포 대 세포 신호전달 화합물 및 모포겐과 같은 제어시약 화합물 패널은 제2 미세액적 내에 캡슐화되며, 역시 OEWOD 장치에 로딩된다.
제1 미세액적에 함유된 오가노이드 전발생세포 집단의 하위집단은 오가노이드 및 조직 구조의 형성을 촉진하기 위하여 병합 작업을 통하여 제어 시약에 노출된다. 그에 따라 형성된 오가노이드는 OWEOD 장치 상의 전용 영역 온-칩에 저장되며, 액적 병합 작업을 통해 영양분과 성장 배지에 요구되는 것이 공급될 수 있다. 이러한 방법으로 온-칩에 저장된 오가노이드는 상기 응용예와 관련하여 설명한 바와 같이 약물 스크리닝 분석의 대상이 될 수 있다.
본 발명의 다른 응용 예는 CRISPR-Cas9 유전 변형 스크리닝에 있다.
본 응용에서, 표적세포는 제1 미세액적 내에 캡슐화되고 OEWOD 장치에 로딩된다. gRNA-쌍의 패널을 포함하는 제2 미세액적 세트 역시 장치에 로딩된다. gRNA-쌍 패널의 로딩은 장치 표면의 표적 영역에 동결건조된 gRNA를 스팟팅한 후, 패널을 포함하는 영역 위로 미세액적을 통과시켜 해당 영역을 재-수화하는 준비 단계를 포함할 수 있다.
이는 gRNA가 미세비드에 결합되고, 상기 비드가 유체 표면에 스팟팅되어 동결건조되는 비드-준비 단계의 형태일 수 있다.
gRNA는 병합 작업을 통해 표적세포로 도입되며, 이는 표적 세포가 Cas9와 같은 프로그래밍 가능한 제한효소 및 표적세포에서 유전자 변형을 유도하는 데 필요한 시약과 함께 gRNA를 흡수하게 한다.
병합 미세액적에서 세포는 세포 집단이 액적 중으로 분배되는 병합 및 분할 작업의 주기를 거치며, 세포를 둘러싼 배지는 순차 희석을 통해 교체된다.
예를 들어 분석 중 현미경 관측에 의해 미세액적 집단에서 각 세포의 위치를 추적하면, 공통 조상의 세포를 분류 목적으로 식별할 수 있어 배양된 세포 집단의 단클론성을 증가시킬 수 있다. 세포-유지 역시 증가된다.
병합된 미세액적에서 세포가 충분한 시간동안 배양된 것으로 확인되면, 리포터 분석을 포함하는 제3 시약이 OEWOD 장치로 도입되어 표적세포를 포함하는 미세액적과 병합된다. 리포터 분석의 결과는 예를 들어 검출된 형광, 화학발광 또는 포스터 공명 에너지 전이에 따라 측정될 수 있다.
리포터 분석의 결과에 기반하여, 하나 이상의 세포의 제1 하위집단이 폐기될 수 있고, 세포의 하나 이상의 제2 하위집단이 추가로 증식되도록할 수 있다. 시료는 배양된 표적세포 하위집단으로부터 회수되며, 추가적인 오프-칩 분석을 위하여 칩으로부터 예를 들어, 표준 1536 웰-플레이트와 같은 웰-플레이트로 분배된다. 배양된 하위집단의 나머지 전발생세포는 추가적인 온-칩 배양을 위해 유지된다.
회수된 시료는 이후 DNA 시퀀싱, RNA 시퀀싱, PCR 분석, 유전자 프로파일 링 및 마이크로-어레이 측정과 같은 하나 이상의 오프-칩 분석의 대상이 된다. 온-칩 세포의 추가 하위집단은 오프-칩 분석의 결과에 기초하여 추가로 선별, 회수 및 배양될 수 있다.
예시 장치 및 관련 예시 워크플로우를 도 1을 참조하여 설명한다.
유체 주입구 1은 탄화불소 오일 중 빈 제1 미세액적 및 세포-함유 제1 미세액적의 혼합물의 에멀젼 2를 유입시킨다. 상기 제1 미세액적은 OEWOD 구조(미도시)에 의해 광학 수단 또는 전술한 다른 분류 수단에 의해 비어있는 4와 세포를 함유하는 5로 분류되는 분류구역 3으로 이동된다. 그 후, 각각의 세포-함유 미세액적 5는 역시 OEWOD 구조에 의해 병합구역 8로 이동되며, 여기서 이들은 각각 안에서 세포 성장 및 분열을 촉진하는 조건 하에 소정 시간 동안 유지된다. 이 기간이 종료될 때, 제2 주입구 6은 관심대상 세포 유형에 대해 선택적인 형광 리포터 시스템을 포함하는 제2 미세액적 7을 유입시키며, 이는 병합구역 8에서 세포를 함유하는 제1 미세액적 5와 병합하여 병합 미세액적 9를 형성한다. 병합 미세액적 9는 OEWOD 구조에 의해 광학창 10으로 전달되며, 여기서 리포터 시스템의 형광 신호 특성이 LED 광원, 광검출기 및 마이크로프로세서를 포함하는 광학검출기기 11을 사용하여 검출된다. 광학검출기기 11은 광학 조작 프로젝터 12와 부분적으로 결합된다.
도 2는 25 ℃에서의 점도가 5 센티스토크 이하인 탄화수소 오일로 에멀전화되고, 제한되지 않은 상태에서의 직경이 120 μm(예를 들어, 80~120 μm 범위)인 수성 미세액적 2의 빠른 조작에 적합한 oEWOD 구조를 포함하는 예시 장치의 단면도를 보여준다. 이는 130 nm 두께의 전도성 ITO(Indium Tin Oxide) 투명층 15로 코팅된, 각각의 두께가 500 μm인 상단 및 하단 유리판(13 및 14)을 포함한다. 각각의 15는 ITO층과 A/C 소스 16에 연결되며, 14의 ITO 층이 접지된다. 14는 800 nm 두께의 비정질 실리콘 층 17로 코팅된다. 13 및 17은 각각 160nm 두께의 고순도 알루미나 또는 하프니아 층 18 층으로 코팅되며, 그 다음 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸)실란 층을 제공하는 이산화규소의 간극 층 19로 코팅되어 18의 표면을 소수성으로 만든다. 13과 17은 스페이서를 사용하여 80 μm 간격으로 이격되어 미세액적이 장치에 유입될 때 어느 정도 압축된다. LED 광원 20에 의해 광조사되는 반사형 픽셀화된 스크린의 이미지는 일반적으로 14 아래에 배치되고, 0.01 Wcm-2 수준의 가시광선(660 또는 830 nm 파장)이 각 다이오드 21에서 방출되며 14와 15를 통과하여 복수의 상향 화살표 방향으로 전파되어 17에 충돌하게 된다. 다양한 충돌 지점에서, 상응하는 전기습윤 위치 23에서 액체-고체 접촉각 변화를 야기하는 전하의 광여기 영역 22가 17에 생성된다. 이러한 변화된 특성은 미세액적 2를 한 지점 23에서 다른 지점으로 추진하는 데 필요한 모세관력을 제공한다. 20은 사전에 프로그래밍된 알고리즘에 의해 임의의 주어진 시간에 어레이 중 어느 21에 광조사되도록 할지를 결정하는 마이크로 프로세서 24에 의해 제어된다.

Claims (32)

  1. 생물학적 시료 내에 포함된 분석대상 세포의 하나 이상의 특성을 조작 및/또는 결정하기 위한 장치로서,
    빈 미세액적으로부터 세포-함유 미세액적을 세포-함유 제1 미세액적 집단으로 분리하도록 구성된 분류부;
    제1 미세액적을 광학 검사를 위한 어레이로 배열하고, 선택적으로 미세액적 병합수단에 의해 각각의 제1 미세액적에 리포터 시스템을 도입하도록 구성된 제1 구역,
    제1 구역 내에 또는 제1 구역과 인접하여 위치하고 하나 이상의 검출창에서 병합된 미세액적을 검출하도록 구성된 제 2 구역, 및
    선택적으로 추후 기기로부터 회수하기 위해 미세액적이 세분되고 단리될 수 있는 제3 구역,을 포함하는,
    실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 제1 미세액적을 조작하도록 구성된 미세액적 조작부; 및
    하나 이상의 검출창을 통해 병합된 미세액적으로부터 광학 신호를 검출하도록 구성되며, 이때, 병합된 미세액적에 대해, 신호는 리포터 시스템과 세포 또는 그 발현산물 사이의 상호작용으로부터 발생하는 것인 광학 검출 시스템;
    을 포함하는 장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 광학 검출 시스템은 명시야 현미경, 암시야 현미경, 화학발광 검출 수단, 포스터 공명 에너지 전이 검출 수단 및 형광 검출 수단으로부터 선택되는 장치.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    장치와 일체형이거나 분류부의 앞 또는 뒤에 별도로 위치하며, 내부에 포함된 임의의 세포가 배양되는 동안 미세액적을 유지하도록 구성된 세포-배양부를 추가로 포함하는 장치.
  4. 청구항 3에 있어서,
    세포-배양부는 광학적으로 매개된 전기습윤력에 의해 각 미세액적의 내용물을 교반하도록 추가로 구성된 장치.
  5. 청구항 3 또는 4에 있어서,
    세포-배양부에서 미세액적의 온도를 25 내지 40℃ 범위로 조절하도록 구성된 히터와 온도 조절기를 추가로 포함하는 장치.
  6. 선행하는 임의의 청구항에 있어서,
    장치와 일체형이거나 배양부의 앞에 별도로 위치하며, 생물학적 시료로부터 비혼화성 분산매에 미세액적의 에멀젼을 생성하도록 구성된 시료 준비부를 추가로 포함하는 장치.
  7. 청구항 3 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    분류부, 세포-배양부 및 시료 준비부 중 하나 이상은 액적이 그 내부 및/또는 그사이에서 조작될 수 있도록 전기습윤 전극 위치로 구성된 장치.
  8. 청구항 6에 있어서,
    시료 준비부는 생물학적 시료에 전기습윤 신장력이 가해지는 하나 이상의 위치를 포함하며, 생물학적 시료로부터 분산매로 미세액적이 분리되도록 구성된 장치.
  9. 선행하는 청구항 중 임의의 하나에 있어서,
    광학 검출 수단은 하나 이상의 검출창에서 제1 미세액적에 충돌하도록 구성된 제1 전자기 방사선 소스를 포함하고, 미색액적으로부터 방출된 형광을 검출하기 위한 검출기를 추가로 포함하는 장치.
  10. 선행하는 청구항 중 임의의 하나에 있어서,
    상기 미세액적 조작부는,
    제1 기판,
    기판 상의, 두께가 70 내지 250 nm 범위인 투명한 제1 전도층,
    투명한 제1 전도체 층 상의, 400~850 nm 파장 범위의 전자기 방사선에 의해 활성화된, 두께가 300~1500 nm 범위인 광활성층, 및
    광활성층 상의, 두께가 30~160 nm 범위인 제1 유전층,
    을 포함하는 제1 복합벽;
    제2 기판,
    기판 상의, 두께가 70 내지 250 nm 범위인 제2 전도층, 및
    선택적으로 제2 전도층 상의, 두께가 30 내지 160 nm 범위인 제2 유전층,
    을 포함하며,
    이때, 제1 및 제2 유전층의 노출된 표면은 미세액적을 수용하는 미세유체 공간을 형성하도록 20~180 μm 이격되어 배치되는 제2 복합벽;
    제1 및 제2 전도층을 연결하는 제1 및 제2 복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 A/C 소스;
    제1 유전층의 표면 상에 상응하는 가상 전기습윤 위치를 유도하기 위해 광활성층에 충돌하도록 구성된, 광활성층의 밴드갭보다 높은 에너지를 갖는 하나 이상의 전자기 방사선 소스; 및
    가상 전기습윤 위치의 배치를 변화시켜 미세액적이 이동하게 될 수 있는 적어도 하나의 전기 습윤 경로를 생성하도록 광활성층 상의 전자기 방사선의 충돌 지점을 조작하는 조작수단;
    을 포함하는 하나 이상의 OEWOD 구조를 포함하는 장치.
  11. 선행하는 청구항 중 임의의 하나에 있어서,
    제1 구역은 제1 미세액적-유지 위치의 어레이와 리포터 시스템을 함유하는 제2 미세액적을 도입하기 위한 포트를 포함하는 저장소를 포함하며, 제1 구역은 추가로 제2 미세액적이 제1 미세액적-유지 위치를 가로질러 구동되어 제1 및 제2 미세액적이 병합되도록 구성된 장치.
  12. 청구항 11에 있어서,
    하나 이상의 가상 전기습윤 전극의 경로를 거쳐 제2 미세액적이 제1 미세액적-유지 위치를 가로질러 구동되도록 구성된 장치.
  13. 청구항 11에 있어서,
    장치는 미세액적을 연속적인 수류로 포트에 연결된 장치의 제1 영역으로 도입하도록 구성되며, 상기 제1 영역과 중첩된 장치의 제2 영역은 추가적인 작업을 위하여 장치의 제1 영역으로부터 제3 영역으로 미세액적을 전달하도록 구성된 장치.
  14. 청구항 10에 있어서,
    적어도 상기 제1 유전층의 표면은 방오코팅되어 있는 장치.
  15. 선행하는 청구항 중 임의의 하나에 있어서,
    제1 구역으로 제1 미세액적의 도입 속도 및 광학 검출 시스템에 의해 검출된 신호에 대응한 제1 및 리포터 시스템-함유 미세액적의 병합 속도인 분류부의 하나 이상의 성능을 제어하기 위하여 피드백 루프 수단에 의해 순응된 마이크로프로세서를 추가로 포함하는 장치.
  16. 선행하는 청구항 중 임의의 하나에 있어서,
    장치에 광조사하고 장치 내에서 세포를 특징짓는 신호를 검출하도록 구성된 광학 어셈블리를 추가로 포함하는 장치.

  17. 생물학적 시료에서 세포 유형의 하나 이상의 특성을 조작 및/또는 결정하기 위한 선행하는 청구항의 임의의 장치를 사용하는 방법으로서,
    생물학적 시료로부터 비혼화성 분산매에서 적어도 이들 중 일부에는 특정 유형의 세포를 함유하는 것으로 생각되는 수성 제1 미세액적을 생성하는 단계;
    실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 특성이 조사되는 세포 유형의 리포터 시스템 특성을 포함하는 수성 제2 미세액적을 경로를 따라 미세액적 병합 위치로 이동시키는 단계;
    병합된 미세액적을 생성하기 위하여 병합 위치에서 제1 및 제2 미세액적을 병합하는 단계; 및
    각각의 병합된 미세 방울의 내용물을 광학 검출 시스템으로 분석하고 세포와 리포터 시스템 사이의 상호 작용의 광학 신호 특성을 검출하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    제1 미세액적을 생성하는 단계는 세포-함유 및 빈 미세액적을 모두 포함하는 미세액적 집단으로부터 세포-함유 제1 미세액적을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서,
    제1 미세액적을 생성하는 단계는 세포 성장 및 분열을 야기하는 조건 하에서 미세액적 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 청구항 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서,
    세포-함유 제1 미세액적은 광학 검출 시스템으로 세포의 상태를 측정한 결과에 의해 분류되는 방법.
  21. 청구항 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서,
    제1 미세액적을 생성하는 단계는 전기습윤 신장력을 가하여 생물학적 시료로부터 미세액적을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    미세액적은 비혼화성 분산매로 분리되며, 비혼화성 분산매는 탄화수소 또는 실리콘 오일인 방법.

  23. 청구항 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서,
    비혼화성 분산매는 선택적으로 수성 미셀 또는 제2 미세액적으로 수화된 탄화불소 오일인 방법.
  24. 청구항 19에 있어서,
    미세액적 집단을 배양하는 단계는 비혼화성 분산매 중의 미세액적 집단을 세포-배양 영양분 및/또는 용해 기체를 함유하는 분산매의 흐름과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    용해 기체는 산소, 질소 및 이산화탄소의 하나 이상을 포함하는 방법.
  26. 청구항 24에 있어서,
    비혼화성 분산매는 세포를 배양에 불리한 기체가 주기적으로 제거되는 방법.
  27. 청구항 19 내지 26 중 어느 하나에 있어서,
    미세액적 집단을 배양하는 단계는 미세액적이 유지되는 가상 전기습윤 전극 위치에서 광학적으로 매개되는 전기습윤력을 가하여 미세액적을 섞거나 교반하는 것을 포함하는 방법.
  28. 청구항 17 내지 27 중 어느 하나에 있어서,
    리포터 시스템은 리포터 유전자, 세포-표면 바이오마커 또는 조사대상 세포 유형의 세포에 의해 발현되는 효소, 단백질 또는 항체에 대해 선별적인 리포터 분자를 포함하는 방법.
  29. 청구항 17 내지 27 중 어느 하나에 있어서,
    리포터 시스템은 조사대상 세포 유형의 세포에 의해 발현되는 효소 또는 항체의 존재에 대해 선별적으로 반응하는 발광 리포터 세포인 방법.
  30. 청구항 17 내지 27 중 어느 하나에 있어서,
    광학 검출 시스템은 명시야 현미경, 암시야 현미경, 화학발광 검출 수단, 포스터 공명 에너지 전이 검출 수단 또는 형광 검출 수단 중 하나인 방법.
  31. 청구항 17 내지 30 중 어느 하나에 있어서,
    미세액적은 전자기 방사선을 사용하여 가상 전기습윤 전극의 경로를 생성하도록 구성되고 선택적으로 방오 코팅 및/또는 생적합성 코팅된 OEWOD 구조를 사용하여, 장치 상의 위치들 사이에 이동되는 방법.
  32. 생물학적 시료에서 세포 유형의 하나 이상의 특성을 조작 및/또는 결정하기 위한 청구항 1 내지 16 중 임의의 장치를 사용하는 방법으로서,
    생물학적 시료로부터 비혼화성 분산매에서 적어도 이들 중 일부에는 특정 유형의 세포를 함유하는 것으로 생각되는 수성 제1 미세액적을 생성하는 단계;
    실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 제1 미세액적을 경로를 따라 적어도 하나의 미세액적 검사 위치로 이동시키는 단계; 및
    상기 미세액적 내에 함유된 세포의 세포 형태, 세포 운동성 또는 세포막 무결성 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 특성을 결정하기 위하여 광학 검출 시스템으로 각 미세액적의 내용물을 분석하는 단계;
    를 포함하는 방법.
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