JPWO2005085414A1 - 血管細胞培養用パターニング基板 - Google Patents

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Abstract

本発明は、一つの基材上で複数の血管を効率よく形成することが可能な血管細胞培養用パターニング基板を提供することを主目的としている。上記目的を達成するために、本発明は、基材と、前記基材上に少なくとも２本以上のライン状に実質的に平行に形成され、血管を形成する血管細胞と接着性を有する血管細胞接着部と、前記基材上の隣接する２つの前記血管細胞接着部間に形成され、前記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害部とを有する血管細胞培養用パターニング基板であって、前記血管細胞接着阻害部が、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害材料を含有することを特徴とする血管細胞培養用パターニング基板を提供する。

Description

本発明は、血管を形成するための血管細胞の培養に用いられる血管細胞培養用パターニング基板に関するものである。
現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
一部の細胞、特に多くの動物細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にしたり、細胞の形態に影響を与えることが知られている。
一方、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
例えば、特許文献１には、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用している。また、特許文献２では、細胞非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。
さらに、特許文献３では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
このような方法を応用して、血管を形成する血管細胞を培養し血管を形成する場合、ライン状にパターニングされた血管細胞培養部上で血管細胞を培養し、血管を形成することとなる。しかしながらこの場合、複数の血管を一つの基板上で形成すると、隣りあう血管細胞培養部に付着した細胞と細胞の間に細胞擬足の伸展が生じる。したがって血管細胞培養部上で血管細胞を刺激して血管組織を再生する際、隣り合う血管ライン間に擬足が接触して形成した血管組織に癒着が起き、目的とする血管と異なる形に血管が形成されたり、あるいは癒着によるストレスにより血管が途切れてしまう等、目的とする血管が形成できない等の問題があった。また、この問題を解決するために、一つの基板で一つの血管のみ形成する方法では、ライン状パターンに接着した血管細胞間での擬足は生じず、血管どうしの癒着は発生しないものの、製造効率が悪いとの問題があった。
特開平２−２４５１８１号公報 特開平３−７５７６号公報 特開平５−１７６７５３号公報
そこで、一つの基材上で複数の血管を効率よく形成することが可能な血管細胞培養用パターニング基板の提供が望まれている。
本発明は、基材と、上記基材上に少なくとも２本以上のライン状に実質的に平行に形成され、血管を形成する血管細胞と接着性を有する血管細胞接着部と、上記基材上の隣接する２つの上記血管細胞接着部間に形成され、上記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害部とを有する血管細胞培養用パターニング基板であって、
上記血管細胞接着阻害部が、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害材料を含有することを特徴とする血管細胞培養用パターニング基板を提供する。
本発明によれば、上記血管細胞接着部間に形成されている上記血管細胞接着阻害部に、上記血管細胞接着阻害材料が含有されていることから、適切な血管細胞接着阻害部の幅を設定することにより、隣接する血管細胞接着部上の血管細胞が結合することを防止することができ、血管細胞が断裂したりすることなく、目的とする形状に血管細胞を培養することが可能となるのである。
上記発明においては、上記血管細胞接着阻害部の幅が、２００μｍ〜６００μｍの範囲内であることが好ましい。これにより、本発明の血管細胞培養用パターニング基板を用いて形成された血管間に他の細胞を播種して培養した場合、血管を通じて播種された細胞に酸素等を十分に供給することができ、例えば再生組織等を形成することも可能となるからである。また、上記範囲内とすることによって、効率よく一つの基板上で複数の血管を形成することも可能となるからである。
また、上記発明においては、上記基材上に、少なくとも光触媒および、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する光触媒含有血管細胞接着層が形成されており、上記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着材料が分解または変性されているものとすることができる。また上記基材上に、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層および、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層が形成されており、上記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着材料が分解または変性されているものとすることもできる。またさらに、上記基材上に、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層が形成されており、上記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着材料が分解または変性されているものとすることもできる。
上記のいずれの場合においても、上記血管細胞接着部および血管細胞接着阻害部を、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により容易に形成することができ、製造効率やコスト等の面から好ましい血管細胞培養用パターニング基板とすることができる。また上記血管細胞接着部上に血管細胞を付着させて培養する際に、上記血管細胞接着阻害部上にエネルギーを照射することによって、血管細胞接着阻害部に付着した血管細胞等を除去すること等ができ、より高精細なパターン状に血管細胞を培養することが可能となる、という利点も有する。
また、本発明は上記血管細胞培養用パターニング基板を用いて、血管細胞を培養することを特徴とする血管の製造方法を提供する。
本発明によれば、上記細胞培養用パターニング基板を用いることにより、血管を形成する際、隣接する血管間で隣接する血管が癒着したり、この癒着によって血管断裂したりすることのない、高品質な血管を形成することができるのである。
本発明によれば、隣接する血管細胞接着部上に接着した血管細胞から発生した細胞擬足どうしが接着することや、血管細胞接着阻害部に血管細胞が接着し、血管細胞接着阻害部上に付着した血管細胞と、血管細胞接着部上に接着した血管細胞とが接触すること等を防止することができるため、隣接する血管間での癒着や、癒着による血管の断裂等がなく、目的とする形状に血管細胞を培養することが可能となる、という効果を奏するものである。
本発明の血管細胞培養用パターニング基板の一例を示す平面図である。 本発明の血管細胞培養用パターニング基板の血管細胞接着部および血管細胞接着阻害部の形成方法の一例を示す説明図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の一例を示す概略断面図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明の血管細胞培養用パターニング基板の血管細胞接着部および血管細胞接着阻害部の形成方法の他の例を示す説明図である。
符号の説明
１ … 基材
２ … 血管細胞接着部
３ … 血管細胞接着阻害部
本発明は、血管を形成するための血管細胞の培養に用いられる血管細胞培養用パターニング基板、およびその血管細胞培養用パターニング基板を用いた血管の製造方法に関するものである。以下、それぞれについてわけて説明する。
Ａ．血管細胞培養用パターニング基板
まず、本発明の血管細胞培養用パターニング基板について説明する。本発明の血管細胞培養用パターニング基板は、基材と、上記基材上に少なくとも２本以上のライン状に実質的に平行に形成され、血管を形成する血管細胞と接着性を有する血管細胞接着部と、上記基材上の隣接する２つの上記血管細胞接着部間に形成され、上記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害部とを有する血管細胞培養用パターニング基板であって、
上記血管細胞接着阻害部が、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害材料を含有することを特徴とするものである。
本発明の血管細胞培養用パターニング基板は、例えば図１に示すように、基材１と、その基材１上に形成され、血管細胞と接着性を有し、実質的に平行なライン状に少なくとも２本以上形成された血管細胞接着部２と、上記血管細胞接着部２間に形成され、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害部３とを有するものであり、血管細胞接着阻害部３には、血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害材料が含有されているものである。
本発明の血管細胞培養用パターニング基板上の血管細胞接着部上に血管細胞を付着させて培養する際、上記血管細胞接着阻害部中に上記血管細胞接着阻害材料が含有されていることから、血管細胞接着阻害部上には血管細胞が付着し難いものとすることができ、例えば血管細胞接着阻害部に付着した血管細胞と、血管細胞接着部上に付着した血管細胞とが接着すること等を防止することができる。また、隣接する血管細胞接着部上に付着した血管細胞から発生した細胞擬足どうしが接着することも防止することができるため、隣接する血管間での癒着や、その癒着により隣接する血管間で応力がかかり、形成された血管が断裂すること等を防止することができる。したがって、一つの基板上で複数の血管を効率よく形成することができるのである。
本発明においては、この血管細胞接着部間の距離、すなわち血管細胞接着阻害部の幅を、２００μｍ〜６００μｍ、中でも３００μｍ〜５００μｍの範囲内とすることが好ましい。このような幅とすることにより、本発明の血管細胞培養用パターニング基板を用いて血管細胞を培養した際、形成された血管どうしの幅を比較的狭いものとすることができる。したがって、この血管間に他の細胞を播種して組織を形成する際、播種された細胞に血管が酸素等を十分に供給することができ、血管間の細胞を壊死等させることなく、培養することができる。また、このような範囲内の間隙にすることによって、一つの基板上でより多くの血管を効率よく形成することができる、という利点も有する。
以下、本発明の血管細胞培養用パターニング基板の各構成ごとに詳しく説明する。
（血管細胞接着阻害部）
まず、本発明における血管細胞接着阻害部について説明する。本発明における血管細胞接着阻害部は、後述する基材上の、隣接する２つの血管細胞接着部間に形成され、上記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有する領域であり、血管細胞接着阻害材料を含有する領域である。
上記血管細胞接着阻害材料とは、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有するものであり、このような血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害材料としては、例えば水和能の高い材料を用いることができる。水和能の高い材料を血管細胞接着阻害材料として用いた場合には、血管細胞接着阻害材料の周りに水分子が集まった水和層が形成される。通常、このような水和能の高い物質は水分子との親和性の方が血管細胞との親和性より高いことから、血管細胞は上記水和能の高い材料と接着することができず、血管細胞との接着性が低いものとなるのである。ここで、上記水和能とは、水分子と水和する性質をいい、水和能が高いとは、水分子と水和しやすいことをいうこととする。
また、上記血管細胞接着阻害材料として、撥水性または撥油性を有する材料や、超親水性を有する材料も用いることができる。血管細胞接着阻害材料の撥水性や撥油性、または超親水性によって、血管細胞と血管細胞接着阻害材料との間における相互作用を小さいものとすることができ、血管細胞との接着性を低いものとすることができるからである。
ここで、上記血管細胞接着阻害材料は、血管細胞接着阻害部中に０．０１重量％〜９５重量％、中でも１重量％〜１０重量％程度含有されていることが好ましい。これにより、血管細胞接着阻害部間に血管細胞が付着することや、隣接する血管細胞接着部に付着した血管細胞から発生した細胞擬足どうしが接触すること等を防止することができるからである。
上記水和能が高く血管細胞接着阻害材料として用いられる材料としては、例えばポリエチレングリコールや、ベタイン構造等を有する両性イオン材料、リン脂質含有材料等が挙げられる。
上記撥水性または撥油性を有する材料としては、例えば撥水性または撥油性の有機置換基を有するものを用いることができ、具体的にはゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。上記血管細胞接着阻害性を有する材料の撥水性や撥油性としては、通常、水との接触角が８０°以上、中でも１００°〜１３０°範囲内である場合ことが好ましい。このような水との接触角を有することによって、血管細胞と接着することを阻害するものとすることができるからである。
また上記超親水性を有する材料としては、エネルギー照射に伴う光触媒の作用等によって、上記オルガノポリシロキサン等の有機置換基を分解したもの等が挙げられる。血管細胞接着阻害性を発揮する超親水性とは、水との接触角が１０°以下であることが好ましい。このような水との接触角を有することによって、血管細胞と接着することを阻害するものとすることができるからである。
なお、上記オルガノポリシロキサン等が、水との接触角が１５°〜１２０°、中でも２０°〜１００°の範囲内となる場合には、血管細胞と血管細胞接着性を有するものとして用いることができるため、上記オルガノポリシロキサン等の水との接触角の変化に伴う血管細胞との接着性の変化を利用して、後述するように、血管細胞接着阻害部および血管細胞接着部を形成することも可能である。
ここでいう水との接触角は、水、もしくは同等の接触角を有する液体との接触角を接触角測定器（協和界面科学（株）製ＣＡ−Ｚ型）を用いて測定（マイクロシリンジから液滴を滴下して３０秒後）し、その結果から、もしくはその結果をグラフにして得たものである。
ここで、上述した血管細胞接着阻害部の形成方法としては、例えば上記血管細胞接着阻害材料を含有する血管細胞接着阻害層を一般的な印刷法等により印刷する方法や、例えばフォトリソグラフィー法によりパターン状に形成する方法等が挙げられる。また、例えば後述する基材が上記血管細胞接着阻害材料を含有する場合には、基材上を血管細胞接着部として用いてもよい。また、エネルギー照射に伴う光触媒の作用を用いて血管細胞接着阻害部を形成してもよく、これについては、後で詳しく説明する。
（血管細胞接着部）
次に、本発明の血管細胞培養用パターニング基板の血管細胞接着部について説明する。本発明における血管細胞接着部は、後述する基材上に形成されるものであり、血管を形成する血管細胞と接着性を有する領域である。本発明においては、この血管細胞接着部は血管細胞培養用パターニング基板上に、少なくとも２本以上の実質的に平行なライン状に形成されるものである。なお、ここでいう平行とは、完全に平行な場合だけでなく、実質的な平行、すなわちある領域において２本のラインが交差していなければよく、例えば交差しないジグザグ状のライン等、ラインが交わらずに存在する状態も含まれるものとする。また、上記実質的に平行には、例えば網状構造のような交差している構造のうちの交差していない部分についても含まれることとする。
また、上記血管細胞接着部の形状は、ライン状に形成されるものであれば特に限定されるものではなく、目的とする血管の形状に合わせて適宜選択されるが、通常上記血管細胞接着部のラインの幅は、１０μｍ〜５０００μｍ、中でも２０μｍ〜１００μｍ、特に４０μｍ〜６０μｍ程度とされる。ライン幅が１０μｍ未満である場合には、血管細胞が接着しにくくなることから好ましくない。一方、ライン幅が５０００μｍを超える場合には、ほとんど全ての血管細胞が拡がった形態で血管細胞接着部に接着することとなることから、培養された血管細胞を、血管の形状にすることが困難となり、好ましくない。
なお本発明においては、良好な血管を作るために、特に上記血管細胞接着部内に血管細胞接着補助部を有することが好ましい。上記血管細胞接着補助部とは、上記血管細胞接着部に微細なパターン状に形成された、血管細胞と接着性を有しない領域をいうこととする。上記血管細胞接着補助部は、上記血管細胞接着部上に血管細胞を接着させた際、血管細胞接着部内での血管細胞どうしの結合を阻害しない程度、すなわち上記血管細胞接着補助部上でも血管細胞どうしが結合し得る程度、微細なパターン状に形成される。
一般的に血管細胞接着部に血管細胞を付着させて血管細胞を培養し、組織を形成する場合、血管細胞は血管細胞接着部の外側から内側にかけて徐々に配列する。また組織の形成の際には、個々の血管細胞が形態変化をして配列することが必要であり、この血管細胞の形態変化についても、血管細胞接着部の端部から中央部にかけて徐々に行われるものである。そのため、血管細胞接着部の幅が太い場合には、血管細胞接着部の中央部での血管細胞の配列性が悪く、組織が形成されない場合や、血管細胞接着部の中央部に血管細胞が接着しない場合等がある。また、血管細胞接着部の中央部における血管細胞の形態変化性が悪い場合がある。そこで、上記血管細胞接着補助部を形成することにより、血管細胞接着補助部の端部からも血管細胞を配列させたり、形態変化をさせることが可能となるため、欠けや形態変化不良等を生じさせることがなく、血管細胞を培養することができるのである。また、上記血管細胞接着補助部は、血管細胞接着補助部を挟んで隣り合う血管細胞どうしの接着を阻害しないように形成されることから、最終的に培養される血管細胞の幅としては、上記血管細胞接着部の幅と同様の幅とすることができるのである。
上記血管細胞接着補助部は、上記血管細胞接着部内でライン状に形成されることが好ましい。また、ラインの形状は特に限定されるものではなく、例えば直線状、曲線状、点線状、破線状等とすることができる。上記血管細胞接着補助部のライン幅は、０．５μｍ〜１０μｍ、中でも１μｍ〜５μｍの範囲内とすることが好ましい。上記範囲より幅が広い場合は、血管細胞接着補助部を挟んで隣接する血管細胞どうしが血管細胞接着補助部上で相互作用することが困難となるので好ましくないからである。また上記範囲より幅が狭い場合は、血管細胞接着補助部を後述するようなパターン形成技術を用いて形成することが難しいからである。
また、上記血管細胞接着補助部は、例えばジグザグ状等、面内で凹凸パターンを有するように形成されていてもよい。ここで面内とは基材表面またはこれに準じる面をいうこととする。この際、上記凹凸パターンの凹部端から凸部端までの距離の平均値は、前記血管細胞接着部に血管細胞を接着させた際に、血管細胞が血管細胞接着部のライン方向と同様の方向に整列する距離であればよいが、特に０．５μｍ〜３０μｍの範囲内であることが好ましい。なお、上記凹凸を有するパターンの凹部端から凸部端までの距離の平均の測定は、血管細胞接着補助部の端部の長さ２００μｍの範囲における各凹凸の最底部から最頂部までの距離を測定し、その平均を算出した値とする。
ここで、血管細胞接着部が血管細胞と接着性を有するとは、例えば生物化学的特性により血管細胞と接着性を有するものであってもよく、また物理化学的特性により血管細胞と接着性を有するもの等であってもよい。
このような血管細胞接着部としては、例えば血管細胞と接着性を有する血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層を形成して血管細胞接着部としてもよく、また例えば後述する基材が血管細胞と接着性を有する場合には、この基材上を血管細胞接着部として用いてもよい。上記血管細胞接着層を形成する方法としては、一般的な印刷法やフォトリソグラフィー法、またはエネルギー照射に伴う光触媒の作用を利用したパターニングの方法等が挙げられる。
血管細胞と接着性を有し、後述する基材としても用いられる材料としては、各種ガラス、プラズマ処理を施したポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。また、上記血管細胞接着層に用いられる血管細胞接着材料としては、一般的な細胞培養基板等に用いられる細胞接着材料を用いることができ、例えば物理化学的特性により血管細胞と接着する材料としては、例えば親水化ポリスチレン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）や、ポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物およびそれらを含む縮合物等が挙げられる。また、生物化学的に血管細胞と接着性を有する血管細胞接着材料としては、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、およびこれらの混合物、例えばマトリゲル等が挙げられる。
（基材）
次に、本発明に用いられる基材について説明する。本発明に用いられる基材は、特に限定されるものではなく、例えば、血管細胞接着性を有するものであってもよく、また血管細胞接着阻害性を有するもの等であってもよい。
このような基材としては、例えば前述の材料以外にも金属、シリコン等の無機材料、およびプラスチックで代表される有機材料等を用いることができる。
また、基材の可撓性や透明性等は細胞培養用パターニング基板の種類や用途等によって適宜選択される。
（血管細胞培養用パターニング基板）
本発明の血管細胞培養用パターニング基板は、基材と、上述した血管細胞接着部および血管細胞接着阻害部とを有するものであれば、特に限定されるものではなく、例えば必要に応じて適宜他の部材等が形成されているものであってもよい。
ここで、本発明においては、例えばエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性され、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害材料を含有する血管細胞接着阻害層に、血管細胞接着部を形成するパターン状にエネルギーを照射することによって、血管細胞接着阻害材料を分解または変性させて、血管細胞接着部および血管細胞接着阻害部が形成されたものであってもよい。
また本発明においては、血管細胞と接着性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層に、上記血管細胞接着阻害部を形成するパターン状にエネルギー照射することによって、血管細胞接着材料を分解または変性させて、血管細胞接着阻害部を形成する方法を用いてもよい。
これらの方法によれば、上記血管細胞接着部および上記血管細胞接着阻害部の形成が容易となり、製造効率やコスト等の面からも好ましい血管細胞培養用パターニング基板とすることができるからである。
本発明においては、特に後者の方法であることが好ましい。これにより、本発明の血管細胞培養用パターニング基板の血管細胞接着部上に血管細胞を付着させて、血管を製造する際に、血管細胞接着阻害部上にエネルギー照射に伴う光触媒の作用を及ぼして、より血管細胞接着阻害部の血管細胞との接着性を低いものとしたり、光触媒の作用によって、付着した血管細胞を除去したりすること等も可能となるからである。
このようなエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性され、かつ血管細胞と接着性を有する血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層を用いて上記血管細胞接着部および上記血管細胞接着阻害部とを形成する方法について、以下説明する。このような態様としては、以下の３つの態様が挙げられる。それぞれの態様ごとに詳しく説明する。
（１）第１の態様
まず、第１の態様としては、基材上に、少なくとも光触媒および、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する光触媒含有血管細胞接着層が形成されており、上記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着材料が分解または変性されている場合である。
本態様によれば、光触媒含有血管細胞接着層が光触媒と、上記血管細胞接着材料とを含有することから、血管細胞接着阻害部を形成する領域上の光触媒含有血管細胞接着層にエネルギーを照射することによって、光触媒の作用により血管細胞接着材料を分解または変性させて、血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害部とすることができる。一方、エネルギーが照射されていない領域は、血管細胞接着材料が残存していることから、血管細胞との接着性が良好な血管細胞接着部とすることができる。したがって、特別な装置や複雑な工程等を必要とせず、パターン状にエネルギーを照射することにより、上記血管細胞接着部と上記血管細胞接着阻害部とを容易に形成することが可能となる。
以下、本態様に用いられる光触媒含有血管細胞接着層および基材について説明し、さらに血管細胞接着阻害部の形成方法について説明する。
ａ．光触媒含有血管細胞接着層
まず、本態様に用いられる光触媒含有血管細胞接着層について説明する。本態様に用いられる光触媒含有血管細胞接着層は、光触媒と、上記血管細胞接着材料とを少なくとも含有するものであり、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により上記血管細胞接着材料が分解または変性されて血管細胞との接着性を有しない、すなわち血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害層となる層である。
このような光触媒含有血管細胞接着層の形成は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料および光触媒を含有する光触媒含有血管細胞接着層形成用塗工液を基材上に塗布すること等により、行うことができる。この光触媒含有血管細胞接着層形成用塗工液の塗布は、一般的な塗布方法を用いて行うことができ、例えばスピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法、ロールコート法、ビードコート法等を用いることができる。
この際、上記光触媒含有血管細胞接着層の膜厚としては、血管細胞培養用パターニング基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．０１μｍ〜１．０μｍ程度、中でも０．１μｍ〜０．３μｍ程度とすることができる。
以下、本態様に用いられる光触媒含有血管細胞接着層に用いられる各材料について説明する。
（ｉ）血管細胞接着材料
まず、本態様の光触媒含有血管細胞接着層に含有される血管細胞接着材料について説明する。本態様の光触媒含有血管細胞接着層に含有される血管細胞接着材料は、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性されて、血管細胞接着阻害材料となるものであれば、その種類等は特に限定されるものではない。ここで、血管細胞と接着性を有するとは、血管細胞と良好に接着することをいい、血管細胞との接着性が血管細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする血管細胞と良好に接着することをいう。
本態様に用いられる血管細胞接着材料は、このような血管細胞との接着性を有しており、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性されて、血管細胞との接着を阻害する血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害材料に変化するもの等が用いられる。
ここで、上記のような血管細胞と接着性を有する材料には、物理化学的特性により血管細胞と接着性を有する材料と、生物化学的特性により血管細胞と接着性を有する材料との２種類がある。
物理化学的特性により血管細胞と接着性を有する材料の、血管細胞との接着性を決定する物理化学的な因子としては、表面自由エネルギーや、静電相互作用等が挙げられる。例えば血管細胞との接着性が材料の表面自由エネルギーにより決定される場合には、材料が所定の範囲内の表面自由エネルギーを有すると血管細胞と材料との接着性が良好となり、その範囲を外れると血管細胞と材料との接着性が低下し、血管細胞接着阻害性を有することとなる。このような表面自由エネルギーによる細胞の接着性の変化としては、例えば資料ＣＭＣ出版 バイオマテリアルの最先端 筏 義人（監修）ｐ．１０９下部に示されるような実験結果が知られている。このような因子により血管細胞との接着性を有する材料としては、例えば親水化ポリスチレン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の表面の官能基が置換等されたり、分解されること等によって、表面自由エネルギーが変化し、血管細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
また、静電相互作用等により血管細胞と材料との接着性が決定される場合、例えば材料が有する正電荷の量等によって血管細胞との接着性が決定されることとなる。このような静電相互作用により血管細胞との接着性を有する材料としては、例えばポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物およびそれらを含む縮合物等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記材料が分解または変性されることによって、例えば表面に存在する正電荷量を変化させることができ、血管細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
また、生物学的特性により血管細胞と接着性を有する材料としては、特定の血管細胞と接着性が良好なもの、または多くの血管細胞と接着性が良好なもの等が挙げられ、具体的には、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、およびこれらの混合物、例えばマトリゲル等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の構造の一部を破壊したり、主鎖を破壊すること等によって、血管細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
このような血管細胞接着材料は、上記材料の種類等によって異なるものであるが、光触媒含有血管細胞接着層中に通常０．０１重量％〜９５重量％、中でも１重量％〜１０重量％含有されることが好ましい。これにより、血管細胞接着材料を含有する領域を血管細胞との接着性が良好な領域とすることができるからである。
（ii）光触媒
次に、本態様の光触媒含有血管細胞接着層に含有される光触媒について説明する。本態様に用いられる光触媒は、上述した血管細胞接着材料を、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。
ここで、後述するような酸化チタンに代表される光触媒の作用機構は、必ずしも明確なものではないが、光の照射によって生成したキャリアが、近傍の化合物との直接反応、あるいは、酸素、水の存在下で生じた活性酸素種によって、有機物の化学構造に変化を及ぼすものと考えられている。本態様においては、このキャリアが上述した血管細胞接着材料に作用を及ぼすものであると思われる。
本態様に用いられる光触媒として、具体的には、光半導体として知られる例えば二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化タングステン（ＷＯ３）、酸化ビスマス（Ｂｉ２Ｏ３）、および酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）を挙げることができ、これらから選択して１種または２種以上を混合して用いることができる。
本態様においては、特に二酸化チタンが、バンドギャップエネルギーが高く、化学的に安定で毒性もなく、入手も容易であることから好適に使用される。二酸化チタンには、アナターゼ型とルチル型があり本態様ではいずれも使用することができるが、アナターゼ型の二酸化チタンが好ましい。アナターゼ型二酸化チタンは励起波長が３８０ｎｍ以下にある。
このようなアナターゼ型二酸化チタンとしては、例えば、塩酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（石原産業（株）製ＳＴＳ−０２（平均粒径７ｎｍ）、石原産業（株）製ＳＴ−Ｋ０１）、硝酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（日産化学（株）製ＴＡ−１５（平均粒径１２ｎｍ））等を挙げることができる。
光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が５０ｎｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
本態様の光触媒含有血管細胞接着層における光触媒の含有量は、５〜９５重量％、好ましくは１０〜６０重量％、さらに好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。
これにより、光触媒含有血管細胞接着層のエネルギー照射された領域の血管細胞接着材料を分解または変性することが可能となるからである。
ここで、本態様に用いられる光触媒は、例えば高い親水性を有すること等によって、血管細胞との接着阻害性を有するものであることが好ましい。これにより、上述した血管細胞接着材料が分解等されるものである場合に、光触媒を血管細胞接着阻害材料として用いることが可能となるからである。
（iii）その他
本態様においては、光触媒含有血管細胞接着層中に、上記血管細胞接着材料や光触媒だけでなく、必要に応じて例えば、強度や耐性等を向上させるバインダ等を含有するものであってもよい。本態様においては、特にバインダとして、少なくともエネルギー照射された後に、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有する材料が用いられることが好ましい。これにより、エネルギー照射された領域である血管細胞接着阻害部の血管細胞接着阻害性をより高いものとすることができるからである。このような材料としては、例えばエネルギー照射される前から上記血管細胞接着阻害性を有するものであってもよく、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、血管細胞接着阻害性を有するものとなるものであってもよい。
本態様においては、特にエネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、血管細胞接着阻害性を有するものとなる材料をバインダとして用いることが好ましい。これにより、エネルギー照射される前の領域においては、上記血管細胞接着材料の血管細胞との接着性を阻害することがなく、エネルギー照射された領域のみを、血管細胞との接着性が低いものとすることができるからである。
このようなバインダとして用いられる材料としては、例えば主骨格が上記の光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような有機置換基を有するものが好ましく、上述した、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）撥水牲や撥油性に優れた反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
上記の（１）の場合、一般式：
ＹｎＳｉＸ（４−ｎ）
（ここで、Ｙはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基もしくはエポキシ基、またはこれらを含む有機基であり、Ｘはアルコキシル基、アセチル基またはハロゲンを示す。ｎは０〜３までの整数である。）
で示される珪素化合物の１種または２種以上の加水分解縮合物もしくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでＹで示される有機基の炭素数は１〜２０の範囲内であることが好ましく、また、Ｘで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
また、上記の（２）の反応性シリコーンとしては、下記一般式で表される骨格をもつ化合物を挙げることができる。
Figure 2005085414
ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｒ１，Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜２０の置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、アリールあるいはシアノアルキル基であり、モル比で全体の４０％以下がビニル、フェニル、ハロゲン化フェニルである。また、Ｒ１、Ｒ２がメチル基のものが表面エネルギーが最も小さくなるので好ましく、モル比でメチル基が６０％以上であることが好ましい。また、鎖末端もしくは側鎖には、分子鎖中に少なくとも１個以上の水酸基等の反応性基を有する。上記のような材料を用いることによって、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、エネルギー照射された領域の表面を高い親水性を有するものとすることができる。これにより、血管細胞との接着が阻害され、エネルギー照射された領域には血管細胞が接着しないものとすることができるからである。
また、上記のオルガノポリシロキサンとともに、ジメチルポリシロキサンのような架橋反応をしない安定なオルガノシリコン化合物をバインダに混合してもよい。
上記材料を血管細胞接着阻害材料として用いる場合、エネルギーが照射される前の水との接触角が１５°〜１２０°、中でも２０°〜１００°の範囲内となるものであることが好ましい。これにより、上記血管細胞接着材料の血管細胞との接着性を阻害することのないものとすることができるからである。
また、この血管細胞接着阻害材料にエネルギーが照射された場合には、水との接触角が１０°以下となるものであることが好ましい。上記範囲とすることにより、高い親水性を有するものとすることができ、血管細胞との接着性を低いものとすることができるからである。なお、ここでいう水との接触角は、上述した方法により得られるものである。
また、本態様においては、エネルギーが照射された領域の濡れ性の変化を起こさせること等により、血管細胞との接着性が低下する、もしくはそのような変化を補助する分解物質等を含有するものであってもよい。
このような分解物質としては、例えばエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解等されて、親水性となること等により、血管細胞との接着性が低下する界面活性剤等を挙げることができる。具体的には、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることができ、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
また、界面活性剤の他にも、ポリビニルアルコール、不飽和ポリエステル、アクリル樹脂、ポリエチレン、ジアリルフタレート、エチレンプロピレンジエンモノマー、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、メラミン樹脂、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、スチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ナイロン、ポリエステル、ポリブタジエン、ポリベンズイミダゾール、ポリアクリルニトリル、エピクロルヒドリン、ポリサルファイド、ポリイソプレン等のオリゴマー、ポリマー等を挙げることができる。
本態様においては、このようなバインダは、光触媒含有血管細胞接着層中に５重量％〜９５重量％、中でも４０重量％〜９０重量％、特に６０重量％〜８０重量％の範囲内含有されることが好ましい。
ｂ．基材
次に、本態様に用いられる基材について説明する。本態様に用いられる基材としては特に限定されるものではなく、例えば金属、ガラス、シリコン等の無機材料、およびプラスチックで代表される有機材料等を用いることができる。
また、基材の可撓性等は血管細胞培養用パターニング基板の種類や用途等によって適宜選択される。また、上記基材の透明性は、血管細胞培養用パターニング基板の種類や、上記血管細胞接着材料を分解または変性させるために照射されるエネルギーの照射方向等によって、適宜選択され、例えば基材が遮光部等を有しており、上記エネルギーの照射が、基材側から行われる場合等には、基材が透明性を有するものとされる。
ここで、本態様においては、上記基材上の血管細胞接着部を形成する領域に遮光部が形成されていてもよい。これにより、血管細胞接着阻害部を形成する領域にエネルギーを照射して血管細胞接着阻害部を形成する際に、フォトマスク等を用いることなく、全面にエネルギーを照射することにより、上記光触媒含有血管細胞接着層中の血管細胞接着材料を分解または変性させることができるからである。
本態様に用いることが可能な遮光部としては、血管細胞接着阻害部を形成する際に、血管細胞培養用パターニング基板に照射されるエネルギーを遮断することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、例えばスパッタリング法、真空蒸着法等により厚み１０００〜２０００Å程度のクロム等の金属薄膜を形成し、この薄膜をパターニングすることにより形成されてもよい。このパターニングの方法としては、スパッタ等の通常のパターニング方法を用いることができる。
また、樹脂バインダ中にカーボン微粒子、金属酸化物、無機顔料、有機顔料等の遮光性粒子を含有させた層をパターン状に形成する方法であってもよい。用いられる樹脂バインダとしては、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ゼラチン、カゼイン、セルロース等の樹脂を１種または２種以上混合したものや、感光性樹脂、さらにはＯ／Ｗエマルジョン型の樹脂組成物、例えば、反応性シリコーンをエマルジョン化したもの等を用いることができる。このような樹脂製遮光部の厚みとしては、０．５〜１０μｍの範囲内で設定することができる。このような樹脂製遮光部のパターニングの方法は、フォトリソ法、印刷法等一般的に用いられている方法を用いることができる。
ｃ．血管細胞接着阻害部の形成方法
次に、本態様における血管細胞接着阻害部の形成方法について説明する。本態様においては、例えば図２に示すように、基材１上に形成された上記光触媒含有血管細胞接着層４に、例えばフォトマスク５等を用いて、血管細胞接着阻害部を形成するパターン状にエネルギー６を照射することにより（図２（ａ））、エネルギー照射された領域の光触媒含有血管細胞接着層４中の血管細胞接着性材料が分解または変性されて、血管細胞と接着阻害性を有する血管細胞接着阻害部７を形成することができる（図２（ｂ））。この際、血管細胞接着阻害部には、光触媒、および血管細胞接着材料の分解物や変性物、すなわち血管細胞接着阻害材料等が含有されることとなる。
ここで、本態様でいうエネルギー照射（露光）とは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、血管細胞接着材料を分解または変性させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、光の照射に限定されるものではない。
通常このようなエネルギー照射に用いられるエネルギーとしては、４００ｎｍ以下の範囲の紫外光が挙げられる。これは、上述したように光触媒として用いられる好ましい光触媒が二酸化チタンであり、この二酸化チタンにより光触媒作用を活性化させるエネルギーとして、上述した波長の光が好ましいからである。
このようなエネルギー照射に用いることができる光源としては、水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、エキシマランプ、その他種々の光源を挙げることができる。
上述したような光源を用い、フォトマスクを介したパターン照射により行う方法の他、エキシマ、ＹＡＧ等のレーザを用いてパターン状に描画照射する方法を用いることも可能である。また、上述したように、基材が血管細胞接着部と同じパターン状に遮光部を有する場合には、基材側からエネルギーを全面に照射することにより、行うことができる。この場合、フォトマスク等が必要なく、位置あわせ等の工程が必要ない、という利点を有する。
また、エネルギー照射に際してのエネルギーの照射量は、光触媒の作用によって血管細胞接着材料が分解または変性されるのに必要な照射量とする。
この際、光触媒が含有される層を加熱しながらエネルギー照射することにより、感度を上昇させることが可能となり、効率的に血管細胞接着材料を分解または変性させることができる点で好ましい。具体的には３０℃〜８０℃の範囲内で加熱することが好ましい。
本態様におけるフォトマスクを介して行うエネルギー照射の方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および光触媒含有血管細胞接着層側のいずれの方向からエネルギー照射を行っても良い。一方、基材が不透明な場合は、光触媒含有血管細胞接着層側からエネルギー照射を行う必要がある。
なお、本態様を用いて血管細胞培養用パターニング基板を製造し、血管細胞接着部に血管細胞を付着させて血管を製造する場合、上述したエネルギーの照射方法と同様の方法を用いて、血管細胞接着阻害部にエネルギーを照射することにより、血管細胞のパターンを維持する工程を行うことができる。エネルギー照射に伴う光触媒の作用等により、血管細胞接着阻害部上に付着した血管細胞を除去等することができ、高精細なパターン状に血管細胞を培養することができることとなるからである。このようなエネルギー照射は、血管を形成する間中行われるものであってもよく、また必要に応じて適宜行われるもの等であってもよい。
（２）第２の態様
次に、第２の態様としては、上記基材上に、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層および、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層が形成されており、上記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着材料が分解または変性されているものである。
本態様においては、上記血管細胞接着層が、光触媒含有層上に形成されていることから、血管細胞接着阻害部を形成する領域にエネルギーを照射することによって、血管細胞接着層中の血管細胞接着材料が、隣接する光触媒含有層中の光触媒の作用により分解または変性されて、その領域の血管細胞との接着性が低下し、血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害部を形成することが可能となるのである。この際、血管細胞接着阻害部には、例えば上記血管細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、血管細胞接着材料が少量含有されている、または血管細胞接着材料の分解物等が含有されている、もしくは血管細胞接着層が完全に分解除去されて光触媒含有層が露出すること等となる。
また、上記血管細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、血管細胞接着阻害部中にはその変性物等が含有されていることとなる。
以下、本態様の各構成について説明する。なお、本態様に用いられる基材、および本態様における血管細胞接着阻害部の形成方法については、上述した第１の態様と同様であるので、ここでの説明は省略する。
なお、本態様を用いて血管細胞培養用パターニング基板を製造し、血管細胞接着部に血管細胞を付着させて血管を製造する場合にも、上述したエネルギーの照射方法と同様の方法を用いて、血管細胞接着阻害部にエネルギーを照射することにより、血管細胞のパターンを維持する工程を行うことができる。
ａ．血管細胞接着層
まず、本態様に用いられる血管細胞接着層について説明する。本態様に用いられる血管細胞接着層は、少なくとも血管細胞との接着性を有する血管細胞接着材料を有する層であり、一般的に血管細胞との接着性を有する層として用いられる層を用いることができる。
具体的な血管細胞接着材料としては、第１の態様で説明した光触媒含有血管細胞接着層に用いられる血管細胞接着材料と同様のものを用いることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。また、本態様の血管細胞接着層にも、第１の態様で説明した光触媒含有血管細胞接着層で説明した血管細胞接着阻害性を有する材料が含有されていることが好ましい。これにより、エネルギー照射された領域である血管細胞接着阻害部の血管細胞接着阻害性をより高いものとすることができるからである。
また、このような血管細胞接着層の形成は、上記血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層形成用塗工液を、一般的な塗布方法により塗布すること等により行うことができ、第１の態様の光触媒含有血管細胞接着層の形成方法と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。また、一般的に用いられる吸着法も用いることができる。
なお、このような血管細胞接着層の膜厚は、血管細胞培養用パターニング基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．００１μｍ〜１．０μｍ程度、中でも０．０５μｍ〜０．３μｍ程度とすることができる。
ｂ．光触媒含有層
次に、本態様に用いられる光触媒含有層について説明する。本態様に用いられる光触媒含有層は、少なくとも光触媒を含有する層であれば、特に限定されるものではなく、光触媒のみからなる層であってもよく、またバインダ等、他の成分を含有する層等であってもよい。
本態様で使用する光触媒としては、第１の態様における光触媒含有血管細胞接着層に用いられるものと同様とすることができ、本態様においても特に酸化チタンが用いられることが好ましい。
ここで、光触媒のみからなる光触媒含有層を用いた場合には、上記血管細胞接着層中の血管細胞接着材料の分解または変性に対する効率が向上し、処理時間の短縮化等のコスト面で有利である。一方、光触媒とバインダとからなる光触媒含有層を用いた場合には、光触媒含有層の形成が容易であるという利点を有する。
光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。真空製膜法により光触媒含有層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒含有層とすることが可能であり、これにより血管細胞接着材料を均一に分解または変性させることが可能であり、かつ光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に血管細胞接着材料を分解または変性させることが可能となる。
また、光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法の他の例としては、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基材上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。ここで用いられる無定形チタニアとしては、例えば四塩化チタン、硫酸チタン等のチタンの無機塩の加水分解、脱水縮合、テトラエトキシチタン、テトライソプロポキシチタン、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトラブトキシチタン、テトラメトキシチタン等の有機チタン化合物を酸存在下において加水分解、脱水縮合によって得ることができる。次いで、４００℃〜５００℃における焼成によってアナターゼ型チタニアに変性し、６００℃〜７００℃の焼成によってルチル型チタニアに変性することができる。
また、バインダを用いる場合は、バインダの主骨格が上記の光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものが好ましく、例えばこのようなバインダとしては、上述した血管細胞接着層の項で用いられるオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
このようにオルガノポリシロキサンをバインダとして用いた場合は、上記光触媒含有層は、光触媒とバインダであるオルガノポリシロキサンを必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を基材上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。
また、バインダとして無定形シリカ前駆体を用いることができる。この無定形シリカ前駆体は、一般式ＳｉＸ4で表され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
具体的には、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、テトラ−ｎ−プロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラメトキシシラン等が挙げられる。また、この場合には、無定形シリカの前駆体と光触媒の粒子とを非水性溶媒中に均一に分散させ、透明基材上に空気中の水分により加水分解させてシラノールを形成させた後、常温で脱水縮重合することにより光触媒含有層を形成できる。シラノールの脱水縮重合を１００℃以上で行えば、シラノールの重合度が増し、膜表面の強度を向上できる。また、これらの結着剤は、単独あるいは２種以上を混合して用いることができる。
光触媒含有層中の光触媒の含有量は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。また、光触媒含有層の厚みは、０．０５〜１０μｍの範囲内が好ましい。
また、光触媒含有層には上記の光触媒、バインダの他に、上述した血管細胞接着層に用いられる界面活性剤等を含有させることもできる。
ここで、上記血管細胞接着層がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により、完全に分解される層である場合には、血管細胞接着阻害部とされる領域は、光触媒含有層が露出するため、この光触媒含有層中に血管細胞接着阻害材料が含有されていることが必要とされる。なお、この場合光触媒含有層中には、上述したような血管細胞接着阻害材料が含有されていてもよく、また高い親水性を有する光触媒等を、血管細胞接着阻害材料として用いてもよい。
また、本態様においては、上述したように上記光触媒含有層上に遮光部が形成されていてもよい。これにより、上記血管細胞接着層の全面にエネルギーを照射した場合に、遮光部が形成された領域上の光触媒は励起されず、遮光部が形成された領域以外の血管細胞接着層中に含有される血管細胞接着材料を分解または変性させることができるからである。またこの場合、遮光部が形成されている領域の光触媒は励起されないことから、エネルギーが照射される方向が特に限定されない、という利点を有する。
このような遮光部としては、第１の態様で説明したものと同様のものを用いることが可能であるので、ここでの詳しい説明は省略する。
（３）第３の態様
また、第３の態様としては、少なくとも血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層が形成されており、上記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記血管細胞接着材料が分解または変性されているものである。
本態様においては、血管細胞接着層と、上記光触媒含有層とを対向させて配置し、血管細胞接着阻害部を形成するパターン状にエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中の光触媒の作用により、血管細胞接着層中の血管細胞接着材料が分解または変性されて、血管細胞接着阻害部を形成することが可能となるのである。
以下、本態様に用いられる光触媒含有層側基板と、その光触媒含有層側基板を用いて血管細胞接着阻害部を形成する方法について説明する。なお、本態様に用いられる血管細胞接着層については、上述した第２の態様で用いられるものと同様であるので、ここでの説明は省略する。また、上記血管細胞接着層がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により、完全に分解される層である場合には、血管細胞接着阻害部とされる領域は、基材が露出することとなるため、この基材中に上述したような血管細胞接着阻害材料が含有されていることが必要とされる。
ａ．光触媒含有層側基板
まず、本態様に用いられる光触媒を含有する光触媒含有層を有する光触媒含有層側基板について説明する。本態様に用いられる光触媒含有層側基板としては、通常、光触媒を含有する光触媒含有層を有するものであり、通常、基体と、その基体上に光触媒含有層が形成されているものである。この光触媒含有層側基板は、例えばパターン状に形成された光触媒含有層側遮光部やプライマー層等を有していてもよい。以下、本態様に用いられる光触媒含有層側基板の各構成について説明する。
（ｉ）光触媒含有層
まず、光触媒含有層側基板に用いられる光触媒含有層について説明する。本態様に用いられる光触媒含有層は、光触媒含有層中の光触媒が、近接する血管細胞接着層中の血管細胞接着材料を分解または変性させるような構成であれば、特に限定されるものではなく、光触媒とバインダとから構成されているものであってもよく、光触媒単体で製膜されたものであってもよい。また、その表面の特性は特に親液性であっても撥液性であってもよい。
本態様において用いられる光触媒含有層は、基体上に全面に形成されたものであってもよいが、例えば図３に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２がパターン上に形成されたものであってもよい。
このように光触媒含有層をパターン状に形成することにより、血管細胞接着阻害部を形成するためにエネルギーを照射する際に、フォトマスク等を用いるパターン照射をする必要がなく、全面に照射することにより、血管細胞接着層に含有される血管細胞接着材料が分解または変性された血管細胞接着阻害部を形成することができる。
この光触媒含有層のパターニング方法は、特に限定されるものではないが、例えばフォトリソグラフィー法等により行うことが可能である。
また、実際に光触媒含有層に面する血管細胞接着層上の部分のみの、血管細胞接着材料が分解または変性されるものであるので、エネルギーの照射方向は上記光触媒含有層と血管細胞接着層とが面する部分にエネルギーが照射されるものであれば、いかなる方向から照射されてもよく、さらには、照射されるエネルギーも特に平行光等の平行なものに限定されないという利点を有するものとなる。
ここで、本態様で用いられる光触媒含有層については、上述した第２の態様で説明した光触媒含有層と同様のものを用いることが可能であるので、ここでの詳しい説明は省略する。
（ii）基体
次に、光触媒含有層側基板に用いられる基体について説明する。通常、光触媒含有層側基板は、少なくとも基体とこの基体上に形成された光触媒含有層とを有するものである。この際、用いられる基体を構成する材料は、後述するエネルギーの照射方向や、得られるパターン形成体が透明性を必要とするか等により適宜選択される。
また本態様に用いられる基体は、可撓性を有するもの、例えば樹脂製フィルム等であってもよいし、可撓性を有しないもの、例えばガラス基板等であってもよい。これは、エネルギー照射方法により適宜選択されるものである。
なお、基体表面と光触媒含有層との密着性を向上させるために、基体上にアンカー層を形成するようにしてもよい。このようなアンカー層としては、例えば、シラン系、チタン系のカップリング剤等を挙げることができる。
（iii）光触媒含有層側遮光部
本態様に用いられる光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部が形成されたものを用いても良い。このように光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板を用いることにより、エネルギー照射に際して、フォトマスクを用いたり、レーザ光による描画照射を行う必要がない。したがって、光触媒含有層側基板とフォトマスクとの位置合わせが不要であることから、簡便な工程とすることが可能であり、また描画照射に必要な高価な装置も不必要であることから、コスト的に有利となるという利点を有する。
このような光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板は、光触媒含有層側遮光部の形成位置により、下記の二つの態様とすることができる。
一つが、例えば図４に示すように、基体１１上に光触媒含有層側遮光部１４を形成し、この光触媒含有層側遮光部１４上に光触媒含有層１２を形成して、光触媒含有層側基板とする態様である。もう一つは、例えば図５に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２を形成し、その上に光触媒含有層側遮光部１４を形成して光触媒含有層側基板とする態様である。
いずれの態様においても、フォトマスクを用いる場合と比較すると、光触媒含有層側遮光部が、上記光触媒含有層と血管細胞接着層との配置部分の近傍に配置されることになるので、基体内等におけるエネルギーの散乱の影響を少なくすることができることから、エネルギーのパターン照射を極めて正確に行うことが可能となる。
ここで、本態様においては、図５に示すような光触媒含有層１２上に光触媒含有層側遮光部１４を形成する態様である場合には、光触媒含有層と血管細胞接着層とを所定の位置に配置する際に、この光触媒含有層側遮光部の膜厚をこの間隙の幅と一致させておくことにより、上記光触媒含有層側遮光部を上記間隙を一定のものとするためのスペーサとしても用いることができるという利点を有する。
すなわち、所定の間隙をおいて上記光触媒含有層と血管細胞接着層とを対向させた状態で配置する際に、上記光触媒含有層側遮光部と血管細胞接着層とを密着させた状態で配置することにより、上記所定の間隙を正確とすることが可能となり、そしてこの状態でエネルギーを照射することにより、血管細胞接着層と遮光部とが接触している部分の血管細胞接着層は、血管細胞接着材料が分解または変性されないことから、血管細胞接着阻害部を精度良く形成することが可能となるのである。
このような光触媒含有層側遮光部の形成方法は、特に限定されるものではなく、光触媒含有層側遮光部の形成面の特性や、必要とするエネルギーに対する遮蔽性等に応じて適宜選択されて用いられ、第１の態様で説明した基材上に設けられる遮光部と同様のものとすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。
なお、上記説明においては、光触媒含有層側遮光部の形成位置として、基体と光触媒含有層との間、および光触媒含有層表面の二つの場合について説明したが、その他、基体の光触媒含有層が形成されていない側の表面に光触媒含有層側遮光部を形成する態様も採ることが可能である。この態様においては、例えばフォトマスクをこの表面に着脱可能な程度に密着させる場合等が考えられ、血管細胞接着阻害部のパターンを小ロットで変更するような場合に好適に用いることができる。
（iv）プライマー層
次に、本態様の光触媒含有層側基板に用いられるプライマー層について説明する。本態様において、上述したように基体上に光触媒含有層側遮光部をパターン状に形成して、その上に光触媒含有層を形成して光触媒含有層側基板とする場合においては、上記光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成してもよい。
このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成することにより、プライマー層は光触媒の作用による血管細胞接着材料の分解または変性を阻害する要因となる光触媒含有層側遮光部および光触媒含有層側遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、光触媒含有層側遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、高感度で血管細胞接着材料の分解または変性の処理が進行し、その結果、高精細に形成された血管細胞接着阻害部を得ることが可能となるのである。
なお、本態様においてプライマー層は、光触媒含有層側遮光部のみならず光触媒含有層側遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた光触媒含有層側遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。
本態様におけるプライマー層は、光触媒含有層側基板の光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。
このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。
ｂ．血管細胞接着阻害部の形成方法
次に、本態様における血管細胞接着阻害部の形成方法について説明する。本態様においては、例えば図６に示すように、基材１上に形成された血管細胞接着層８と、光触媒含有層側基板１３の光触媒含有層１２とを、所定の間隙をおいて配置し、例えばフォトマスク５等を用いて、エネルギー６を所定の方向から照射する（図６（ａ））。これにより、エネルギー照射された領域の血管細胞接着材料が分解または変性されて、血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害部９が形成されるのである（図６（ｂ））。この際、血管細胞接着阻害部は、例えば上記血管細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、血管細胞接着阻害部中にはその血管細胞接着材料が少量含有されている、または血管細胞接着材料の分解物等が含有されている、もしくは血管細胞接着層が完全に分解除去されて基材が露出すること等となる。また、上記血管細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、血管細胞接着阻害部中にはその変性物等が含有されていることとなる。
上記の配置とは、実質的に光触媒の作用が血管細胞接着層表面に及ぶような状態で配置された状態をいうこととし、実際に物理的に接触している状態の他、所定の間隔を隔てて上記光触媒含有層と血管細胞接着層とが配置された状態とする。この間隙は、２００μｍ以下であることが好ましい。
本態様において上記間隙は、パターン精度が極めて良好であり、光触媒の感度も高く、したがって血管細胞接着層中の血管細胞接着材料の分解または変性の効率が良好である点を考慮すると特に０．２μｍ〜１０μｍの範囲内、好ましくは１μｍ〜５μｍの範囲内とすることが好ましい。このような間隙の範囲は、特に間隙を高い精度で制御することが可能である小面積の血管細胞接着層に対して特に有効である。
一方、例えば３００ｍｍ×３００ｍｍ以上といった大面積の血管細胞接着層に対して処理を行う場合は、接触することなく、かつ上述したような微細な間隙を光触媒含有層側基板と血管細胞接着層との間に形成することは極めて困難である。したがって、血管細胞接着層が比較的大面積である場合は、上記間隙は、１０〜１００μｍの範囲内、特に５０〜７５μｍの範囲内とすることが好ましい。間隙をこのような範囲内とすることにより、パターンがぼやける等のパターン精度の低下の問題や、光触媒の感度が悪化して血管細胞接着材料を分解または変性させる効率が悪化する等の問題が生じることなく、さらに血管細胞接着材料の分解または変性にムラが発生しないといった効果を有するからである。
このように比較的大面積の血管細胞接着層をエネルギー照射する際には、エネルギー照射装置内の光触媒含有層側基板と血管細胞接着層との位置決め装置における間隙の設定を、１０μｍ〜２００μｍの範囲内、特に２５μｍ〜７５μｍの範囲内に設定することが好ましい。設定値をこのような範囲内とすることにより、パターン精度の大幅な低下や光触媒の感度の大幅な悪化を招くことなく、かつ光触媒含有層側基板と血管細胞接着層とが接触することなく配置することが可能となるからである。
このように光触媒含有層と血管細胞接着層表面とを所定の間隔で離して配置することにより、酸素と水および光触媒作用により生じた活性酸素種が脱着しやすくなる。すなわち、上記範囲より光触媒含有層と血管細胞接着層との間隔を狭くした場合は、上記活性酸素種の脱着がしにくくなり、結果的に血管細胞接着材料を分解または変性させる速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。また、上記範囲より間隔を離して配置した場合は、生じた活性酸素種が血管細胞接着層に届き難くなり、この場合も血管細胞接着材料の分解または変性の速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。
このような極めて狭い間隙を均一に形成して光触媒含有層と血管細胞接着層とを配置する方法としては、例えばスペーサを用いる方法を挙げることができる。そして、このようにスペーサを用いることにより、均一な間隙を形成することができると共に、このスペーサが接触する部分は、光触媒の作用が血管細胞接着層表面に及ばないことから、このスペーサを上述した血管細胞接着部と同様のパターンを有するものとすることにより、スペーサの形成されていない部分のみの血管細胞接着材料を分解または変性させることができ、高精細に血管細胞接着阻害部を形成することができるのである。また、このようなスペーサを用いることにより、光触媒の作用により生じた活性酸素種が拡散することなく、高濃度で血管細胞接着層表面に到達することから、効率よく高精細な血管細胞接着阻害部を形成することができる。
本態様においては、このような光触媒含有層側基板の配置状態は、少なくともエネルギー照射の間だけ維持されればよい。
ここで、本態様でいうエネルギー照射（露光）とは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、血管細胞接着材料を分解または変性させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、光の照射に限定されるものではない。
ここで、本態様において照射されるエネルギーの種類等については、上述した第１の態様で説明したものと同様であるので、ここでの詳しい説明は省略する。
なお、本態様におけるフォトマスクを介して行うエネルギー照射の方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および光触媒含有層側基板のいずれの方向からエネルギー照射を行っても良い。一方、基材が不透明な場合は、光触媒含有層側基板側からエネルギー照射を行う必要がある。
また、本態様を用いて血管細胞培養用パターニング基板を製造し、血管細胞接着部に血管細胞を付着させて血管を製造する場合にも、上述した光触媒含有層側基板を用いて、血管細胞接着阻害部にエネルギーを照射することにより、血管細胞のパターンを維持する工程を行うことができる。エネルギー照射に伴う光触媒の作用等により、血管細胞接着阻害部上に付着した血管細胞を除去等することができ、高精細なパターン状に血管細胞を培養することができることとなるからである。
Ｂ．血管の製造方法
次に、本発明の血管の製造方法について説明する。本発明の血管の製造方法は、上述した血管細胞培養用パターニング基板を用いて、血管細胞を培養して血管を製造する方法である。
本発明によれば、上記血管細胞培養用パターニング基板を用いて血管細胞を培養、組織化することによって、血管細胞の培養中または組織化中に、血管細胞接着阻害部に血管細胞が接着することを阻害することができるため、例えば血管細胞接着部上に接着した血管細胞と、血管細胞接着阻害部上に付着した血管細胞とが接着することや、隣接する血管細胞接着部間に接着した血管細胞から発生した細胞擬足どうしが結合することを阻害することができる。これにより、隣接する血管間での癒着や、この癒着により血管が断裂することを防止することができ、目的とする形状に血管を形成することが可能になる。また、本発明によれば、形成された複数の血管間の距離を比較的短くする事ができるため、血管を用いて人工組織の構築を行った際に、血管間の他の細胞に対し血管を通じて酸素や養分を供給したり、あるいは血管間の他の細胞が産生する老廃物を輸送すること等が可能となる。
ここで、上記血管細胞培養用パターニング基板については、上述したものと同様であるので、ここでの詳しい説明は省略し、本発明に用いられる血管細胞について説明する。
本発明に用いられる血管細胞は、培養されて血管を組織する血管細胞であり、各生物、特に動物より得られた血管内皮細胞、ペリサイト、平滑筋細胞、血管内皮前駆細胞、平滑筋前駆細胞を意味し、特に血管内皮細胞等とすることができる。また、血管内皮細胞とペリサイトの共培養や血管内皮細胞と平滑筋細胞の共培養等の複数の種類の細胞の共培養とすることができる。
なお、血管を形成するには、血管細胞接着部上に血管細胞を接着させて培養する際、血管細胞接着部のラインパターンと同じ方向に一軸方向のずり応力を加えることが効果的である。これにより血管細胞の接着形態が長細い紡錘型になり、それぞれの血管細胞が互いに上記一軸方向に配向したように見える状態で接着することが可能となるからである。血管を形成するには、血管細胞接着の際に、血管細胞の接着形態が長細い形で互いに同じ方向を向いているような状態でコンフルエントに接着することが重要である。ここで、上記一軸方向のずり応力を加える方法としては、培養皿をシェーカーや振とう機に置いて培養する方法や培養液を一方向に流しながら培養する方法などが挙げられる。特に幅が５０００μｍを超える血管を作るには、一軸方向のずり応力は不可欠である。
また、通常、上記血管細胞接着部上で目的とするパターン状に形成した後、培地にbFGFやVEGF等の血管細胞の血管化を促す成長因子を追加すること等により、血管とすることができる。このような成長因子から受ける刺激によって、血管細胞は増殖を停止して分化し血管化すると考えられる。血管細胞接着部上にコンフルエントに接着させた血管細胞を血管化する際の培地としては上記のような成長因子を含む液体培地の他、上記のような成長因子を含むゲル状の培地やゲル状の培地と液体培地を組み合わせた上記のような成長因子入り培地を用いることができる。ゲル状の培地としては、コラーゲン、フィブリンゲル、マトリゲル（商品名）、合成ペプチドハイドロゲルなどを用いることができる。
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するもの、およびそれと均等なものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
＜実施例１＞
[血管細胞培養用パターニング基板の作製]
（遮光層および血管細胞接着層を有するパターニング用基板の形成）
血管細胞接着部として金属遮光部が40μｍ、血管細胞接着阻害部としてガラス部が３００μｍのストライプパターンとなるように、ガラス基板上に金属遮光部を形成し、５インチ角の石英フォトマスクを作成した。
次に、イソプロピルアルコール３０ｇとトリメトキシメチルシランTSL8114(ＧＥ東芝シリコーン)３ｇと光触媒無機コーティング剤ST-K03(石原産業)２０ｇとを混合し、１００℃で２０分間攪拌した。これをイソプロピルアルコールにより３倍希釈し、光触媒含有層用組成物とした。上記石英フォトマスクの上記遮光部が形成された側の裏面に、前記光触媒含有層用組成物をスピンコーターにより塗布し、１５０℃で１０分間の乾燥処理を行うことにより、透明な光触媒含有層を形成した。
次にアルキルシランLS-5258（信越化学）０．７ｇ、バインダーとしてオルガノシランTSL-8114（GE東芝シリコーン）５．０ｇ、および０．００５Ｎ塩酸２．３６ｇを混合し、２４時間攪拌した。この溶液をイソプロピルアルコールで１００倍希釈の上、スピンコーティング法により前述の光触媒層上にコーティングし、更に１５０℃の温度で１０分間乾燥することによって、加水分解、重縮合反応を進行させ、膜厚０．２μｍの血管細胞接着層を有するパターニング用基板を得た。
（パターニング用基板のパターニング）
上記パターニング用基板の遮光部側から水銀ランプにより１５Ｊ／ｃｍ2のエネルギー量で紫外線露光を行い、未露光部が血管細胞接着性で露光部が血管細胞接着阻害性となるようにパターン化された血管細胞接着性表面を有する血管細胞培養用パターニング培養基板を得た。次いで、血管細胞培養用パターニング培養基板を１５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに切断した。この際、上記血管細胞接着部のラインパターンが血管細胞培養用パターニング培養基板の長軸に合うように切断した。
［血管細胞の播種、組織化］
10％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ培地中に基板を浸漬し、初代人臍静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）を２×１０５個／ｍｌの濃度となるように播種した。３７℃、５％二酸化炭素環境下で２４時間培養し、血管細胞を血管細胞接着部に接着した。
基板に接着した血管細胞を観察し、血管細胞が血管細胞接着部全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事、血管細胞接着部間に擬足の接触が無い事を確認した。
更にＤＭＥＭ培地を、ｂＦＧＦ(シグマ社) １０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えたものに交換、３７℃、５％二酸化炭素環境下で２４時間培養を継続し、血管細胞が連続した血管組織を形成した事を確認した。
＜比較例１＞
[血管細胞培養用パターニング基板の作製]
（遮光層および血管細胞接着層を有する血管細胞培養用基板の形成）
血管細胞接着部として金属遮光部が４０μｍ、血管細胞接着阻害部としてガラス部が３００μｍのストライプパターンとなるように、ガラス基板上に金属遮光部を形成し、石英フォトマスクを作成した。
次に、イソプロピルアルコール３０ｇとトリメトキシメチルシランTSL8114(GE東芝シリコーン)３ｇと光触媒無機コーティング剤ST-K03(石原産業)２０ｇとを混合し、１００℃で２０分間攪拌した。これをイソプロピルアルコールにより３倍希釈し、光触媒含有層用組成物とした。上記石英フォトマスクの上記遮光部が形成された側の裏面に、前記光触媒含有層用組成物をスピンコーターにより塗布し、１５０℃で１０分間の乾燥処理を行うことにより、透明な光触媒含有層を形成した。
次に、血管細胞接着性材料として、フィブロネクチンF-4759(シグマ)２ｍｇを２００ｍｌの純水に溶かした。上記光触媒含有層を有する石英フォトマスクの光触媒含有層を上に向けた状態で、フィブロネクチン液中に浸漬し、４℃下で２４時間静置した。その後純水で３回洗浄し、窒素ガスで乾燥させ、光触媒含有層と血管細胞接着層とが積層されたパターニング用基板を得た。
（パターニング用基板のパターニング）
上記パターニング用基板の遮光部側から水銀ランプにより１５Ｊ／ｃｍ2のエネルギー量で紫外線露光を行い、未露光部が血管細胞接着性であり、かつ露光部においては上記血管細胞接着材料であるフィブロネクチンは分解されたが、血管細胞接着阻害材料を含有していないパターンを有する血管細胞培養用パターニング基板を得た。
［血管細胞の播種、組織化］
実施例１と同様に、血管細胞を播種し、培養したところ、血管細胞はパターンに沿って接着したが、その配向性は悪く、また、血管細胞は露光部分にも接着した。さらに実施例１と同様に血管細胞の組織化を行ったが、連続した血管組織は形成されなかった。
＜実施例２＞
［血管細胞培養用パターニング基板の作製］
（遮光層および血管細胞接着層を有する血管細胞培養用基板の形成）
血管細胞接着部として金属遮光部が４０μｍ、血管細胞接着阻害部としてガラス部が３００μｍのストライプパターンとなるように、ガラス基板上に金属遮光部を形成し、石英フォトマスクを作成した。
次に、イソプロピルアルコール３０ｇとトリメトキシメチルシランTSL8114(GE東芝シリコーン)４ｇとアルキルシランLS-5258（信越化学）０．５ｇと光触媒無機コーティング剤ST-K03(石原産業)１５ｇとを混合し、１００℃で２０分間攪拌した。これをイソプロピルアルコールにより１０倍希釈し、光触媒含有血管細胞接着層用組成物とした。上記石英フォトマスクの上記遮光部が形成された側の裏面に、前記光触媒含有血管細胞接着層用組成物をスピンコーターにより塗布し、１５０℃で１０分間の乾燥処理を行うことにより、透明な光触媒含有血管細胞接着層を形成した。
（パターニング用基板のパターニング）
この基板の遮光層面側から水銀ランプにより１５J/ｃｍ2のエネルギー量で紫外線露光を行い、未露光部が血管細胞接着性で露光部が血管細胞接着阻害性にパターン化された血管細胞接着性表面を有する血管細胞培養用パターニング基板を得た。
［血管細胞の播種、組織化］
実施例１と同様の手順で基板に対し血管細胞を播種した。基板に接着した血管細胞を観察し、血管細胞が細血管胞培養部中全領域に沿う方向に配向し、さらに伸展形状を示す事、血管細胞接着部間に擬足の接触が無い事を確認した。また、実施例１と同様の手順で血管細胞の組織化を行い、血管細胞が連続した血管組織を形成した事を確認した。
＜実施例３＞
［光触媒含有層側基板の作製］
血管細胞接着部として金属遮光部が４0μｍ、血管細胞接着阻害部としてガラス部が３００μｍのストライプパターンとなるように、ガラス基板上に金属遮光部を形成し、石英フォトマスクを作成した。
トリメトキシメチルシランTSL8114（GE東芝シリコーン）５ｇと０．５規定塩酸２．５ｇとを混合し、８時間攪拌した。これをイソプロピルアルコールにより１０倍に希釈し、プライマー層用組成物とした。上記プライマー層用組成物をフォトマスクのパターン面上にスピンコーティング法により塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、プライマー層を有するフォトマスクを得た。
次に、イソプロピルアルコール３０ｇとトリメトキシメチルシランTSL8114(GE東芝シリコーン)３ｇと光触媒無機コーティング剤ST-K03(石原産業)２０ｇとを混合し、１００℃で２０分間攪拌した。これをイソプロピルアルコールにより３倍希釈し、光触媒含有層用組成物とした。
前記光触媒含有層用組成物を、プライマー層が形成されたフォトマスク基板上にスピンコーターにより塗布し、１５０℃で１０分間の乾燥処理を行うことにより、透明な光触媒含有層を有するフォトマスクを形成した。
［血管細胞培養用パターニング基板の作製］
オルガノシランTSL-8114（GE東芝シリコーン）５．０ｇ、アルキルシランLS-5258（信越化学）０．７ｇ、０．００５Ｎ塩酸２．３６ｇを混合し、２４時間攪拌した。
この溶液をイソプロピルアルコールで１００倍希釈の上、スピンコーティング法により予めアルカリ処理をしたソーダガラス基板に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、膜厚０．２μｍの血管細胞接着層を有する基板を得た。
（基板のパターニング）
この基板の血管細胞接着層と前述の光触媒含有層を有するフォトマスクの光触媒含有層を対向させ、フォトマスク越しに水銀ランプにより１５Ｊ／ｃｍ２のエネルギー量で紫外線露光を行い、未露光部が血管細胞接着性で露光部が血管細胞接着阻害性にパターン化された血管細胞接着性表面を有する血管細胞培養基板を得た。
［血管細胞の播種、組織化］
実施例１と同様の手順で基板に対し血管細胞を播種した。基板に接着した血管細胞を観察し、血管細胞が血管細胞接着部全領域に沿う方向に配向し、さらに伸展形状を示す事、血管細胞接着部間に擬足の接触が無い事を確認した。また実施例１と同様の手順で血管細胞の組織化を行い、血管細胞が連続した血管組織を形成した事を確認した。
＜実施例４＞
[光触媒含有層側基板の作製]
血管細胞接着部としてガラス部が１２０μｍ、血管細胞接着阻害部として遮光部が３５０μｍのストライプパターンとなるように、基板上に金属遮光部を形成し、石英フォトマスクを作製した。光触媒含有層は、実施例３と同様にして形成した。これにより光触媒層含有層側基板を作製した。
[血管細胞培養用パターニング基板の作製]
フッ素系シランカップリング剤XC98-B2742（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈しコーティング液を調製した。このコーティング液を用い、実施例３と同様の手順で、血管細胞接着阻害層を有する基板を作製した。
[基板のパターニング]
実施例３と同様に、光触媒含有層側基板と上記血管細胞接着阻害層が形成された基板とを配置し、６Ｊ／ｃｍ２のエネルギー量で紫外線照射を行い、未露光部が血管細胞接着阻害性で露光部が血管細胞接着性にパターン化された血管細胞接着性表面を有する血管細胞培養用パターニング基板を得た。この血管細胞培養用パターニング基板を実施例１と同様に１５ｍｍ×２５ｍｍの大きさに切断した。
[血管細胞の播種、組織化]
培養ディッシュに基板を配置し、６×１０５個／ｍｌの濃度となるようＨＵＶＥＣを播種した。培養ディッシュをシェーカーの上に配置し、実施例１と同様に３０時間培養して、血管細胞を血管細胞接着部に接着させた。この間、シェーカーはゆっくりとシーソーのように動作し、血管細胞接着部のラインパターンと同一方向に培地の流れが生じるよう調整された。
３０時間の培養後、培地を注意深く吸引除去し、次いで新しい培地としてｂＦＧＦ（シグマ社）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えたマトリゲル（ベクトンディッキンソン社）を基板上に０．４ｍｌ与え、ゲル化してから５％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ培地を加え培養した。３７℃、５％二酸化炭素環境下で２４時間培養を継続し、血管細胞が連続した血管組織を形成したことを確認した。
＜実施例５＞
[光触媒含有層側基板の作製]
血管細胞接着阻害部として遮光部の幅が３５０μｍ、血管細胞接着補助部を有する血管細胞接着部の幅が１２４．５μｍの石英フォトマスクを作製した。なお、上記血管細胞接着部は、開口部／遮光部がそれぞれ４．５μｍ／２５．５μｍのストライプパターンとされ、開口部のパターンが細胞接着補助部のパターンとされた。続いて、光触媒含有層を実施例３と同様にして形成した。これにより光触媒層含有側基板を作製した。
[血管細胞培養用パターニング基板の作製]
フッ素系シランカップリング剤XC98-B2742（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈しコーティング液を調製した。このコーティング液を用い実施例３と同様の手順で、血管細胞接着阻害層を有する基板を作製した。
[基板のパターニング]
実施例３と同様に、光触媒含有層側基板と上記血管細胞接着阻害層が形成された基板とを配置し、６Ｊ／ｃｍ２のエネルギー量で紫外線照射を行い、未露光部が血管細胞接着阻害性で露光部が血管細胞接着性にパターン化された血管細胞接着性表面を有する血管細胞培養用パターニング基板を得た。この血管細胞培養用パターニング基板を実施例１と同様に１５ｍｍ×２５ｍｍの大きさに切断した。
[血管細胞の播種、組織化]
実施例１と同様の手順でＨＵＶＥＣを播種、組織化した。基板に接着した血管細胞を観察し、血管細胞が血管細胞接着部中全領域に沿う方向に配向し、さらに伸展形状を示す事、血管細胞接着部間に擬足の接触が無い事を確認した。

Claims (6)

  1. 基材と、前記基材上に少なくとも２本以上のライン状に実質的に平行に形成され、血管を形成する血管細胞と接着性を有する血管細胞接着部と、前記基材上の隣接する２つの前記血管細胞接着部間に形成され、前記血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害部とを有する血管細胞培養用パターニング基板であって、
    前記血管細胞接着阻害部が、血管細胞と接着することを阻害する血管細胞接着阻害性を有する血管細胞接着阻害材料を含有することを特徴とする血管細胞培養用パターニング基板。
  2. 前記血管細胞接着阻害部の幅が、２００μｍ〜６００μｍの範囲内であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の血管細胞培養用パターニング基板。
  3. 前記基材上に、少なくとも光触媒および、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する光触媒含有血管細胞接着層が形成されており、前記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、前記血管細胞接着材料が分解または変性されていることを特徴とする請求の範囲第１項または請求の範囲第２項に記載の血管細胞培養用パターニング基板。
  4. 前記基材上に、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層および、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層が形成されており、前記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、前記血管細胞接着材料が分解または変性されていることを特徴とする請求の範囲第１項または請求の範囲第２項に記載の血管細胞培養用パターニング基板。
  5. 前記基材上に、血管細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される血管細胞接着材料を含有する血管細胞接着層が形成されており、前記血管細胞接着阻害部は、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、前記血管細胞接着材料が分解または変性されていることを特徴とする請求の範囲第１項または請求の範囲第２項に記載の血管細胞培養用パターニング基板。
  6. 請求の範囲第１項から請求の範囲第５項までのいずれかに記載の血管細胞培養用パターニング基板を用いて、血管細胞を培養することを特徴とする血管の製造方法。
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