JPH037576A - 細胞の配列制御用具の製法 - Google Patents

細胞の配列制御用具の製法

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JPH037576A
JPH037576A JP1141964A JP14196489A JPH037576A JP H037576 A JPH037576 A JP H037576A JP 1141964 A JP1141964 A JP 1141964A JP 14196489 A JP14196489 A JP 14196489A JP H037576 A JPH037576 A JP H037576A
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和彦 井上
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、細胞の配列制御用具、その製法および細胞の
配列制御法に関する。
[従来の技術] 近年、細胞工学、LSI技術、医工学などの急激な進歩
とともに、細胞を用いた超小型バ・イオセンサー、スイ
ッチング素子、バイオリアクタ、ハイブリッド型人工臓
器、さらにはニューロコンピューターなどが注目を集め
、これらの開発が活発に行なわれている。
細胞を望むように配列させ、しかもその機能を維持させ
ておくことは難しく、細胞を用いたデバイス実現の一つ
の障壁となっている。細胞を望むように配列させて回路
網を形成させるというような細胞の配列制御技術は、こ
れらのデバイス実現のための大きなキーテクノロジーと
なりうる。
[発明が解決しようとする課題] 細胞の配列を制御する試みとしては、インクジェットプ
リンターを用いて細胞接着性蛋白質であるフィブロネク
チンを塗布してパターンを形成し、この上で細胞を培養
させた例があるが、解像度がわるく不均一であり、微細
加工には適していない。
また、最近、人工的な凹凸面を用いて神経細胞シナプス
成長の方向制御を試みた例があるが、望むような配列を
形成させるまでには至っていない。
[課題を解決するための手段] 本発明者らは、このような実状に鑑み、細胞の配列を容
易に制御する方法について鋭意研究を重ねた結果、細胞
接着性表面および細胞非接着性表面よりなる配列パター
ンを有する材料表面上で細胞を培養することにより、細
胞の配列が容易に制御できること、細胞接着性表面およ
び細胞非接着性表面よりなる配列パターンを有する細胞
の配列制御用具が、特定の工程を経て容易に製造できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は 細胞接着性表面および細胞非接着性表面よりなる配列パ
ターンを有することを特徴とする細胞の配列制御用具、 細胞接着性表面および細胞非接着性表面よりなる配列パ
ターンが、 (1)感光性を有する細胞非接着性親水性高分子を細胞
接着性表面に塗布もしくは吸着させて存在させる工程、 (2) (1)でえられた表面上に望む配列パターンを
有するフォトマスクを設置してパターン露光する工程お
よび (3)洗浄により現像し、細胞非接着性親水性高分子よ
りなる像を細胞接着性表面に形成させる工程 または (1)感光性を有する細胞接着性親水性高分子を細胞非
接着性表面に塗布もしくは吸着させて存在させる工程、 (2) (1)でえられた表面上に望む配列パターンを
有するフォトマスクを設置してパターン露光する工程お
よび 3)洗浄により現像し、細胞接着性親水性高分子よりな
る像を細胞非接着性表面に形成させる工程 を経て形成されることを特徴とする細胞の配列制御用具
の製法、ならびに 前記細胞の配列制御用具を用いて細胞を培養することを
特徴とする細胞の配列制御法に関する。
[実施例] 本発明の細胞の配列制御用具は、パターン化した細胞接
着性表面と細胞非接着性表面とが本発明の細胞の配列制
御用具となる材料の表面に形成されたものである。
前記細胞接着性表面とは、カルボキシル基やアミノ基な
どの電荷を有する官能基および(または) RGDS(
Arg−Gly−Asp−9er)のような細胞接着性
ペプチドを導入した表面、または細胞接着性を有する高
分子を固定した表面をいう。
前記カルボキシル基やアミノ基などの官能基は、本発明
の配列制御用具となる材料表面をプラズマなどの放射線
で処理することにより導入することができる。この際の
前記材料としてはプラスチック製の培養用皿、フィルム
、チューブなどを利用しうる。
前記細胞接着性を有する高分子の具体例としては、たと
えばポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレンス
ルホン酸、ポリアリルアミンなどの電荷を有する合成高
分子、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキスト
ラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸
、キチンなどの電荷を有する多糖類、コラーゲン、ゼラ
チン、フィブロネクチン、ハイドロネクチンなどの細胞
接着性蛋白質、さらには細胞接着性蛋白質や細胞接着性
ペプチドを固定した合成高分子などがあげられるが、こ
れらに限定されるものではない。これらは単独で用いて
もよく、2種以上を併用してもよい。
また、前記細胞非接着性表面とは、接触角が100度以
上の疎水性表面、または電荷を有さす接触角が50度以
下の親水性表面をいう。
前記疎水性表面の具体例としては、たとえばポリテトラ
フルオロエチレン、シリコーンなどから形成された表面
があげられるが、これらに限定されるものではない。
また、前記接触角が50度以下の親水性表面の具体例と
しては、電荷を持たない親水性高分子よりなる表面、た
とえばポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール
、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、
ポリヒドロキシエチルメタクリレート、さらにはこれら
を構成する単量体の共重合体、セルロースなどがあげら
れるが、これらに限定されるものではない。
さらに、本発明の細胞の配列制御用具を形成しうる素材
としては、たとえば各種プラスチック、ガラス、金属な
どがあげられ、すでにデバイスとして用いられているた
とえば培養用皿、半導体基盤などの材料も利用できる。
つぎに前記細胞の配列制御用具の製法について説明する
まず第1の製法として、 細胞接着性表面および細胞非接着性表面よりなる配列パ
ターンを (1)感光性を有する細胞非接着性親水性高分子を細胞
接着性表面に塗布もしくは吸着させて存在させる工程、 (2)(1)でえられた表面上に望む配列パターンを存
するフォトマスクを設置してパターン露光する工程およ
び (3)洗浄により現像し、細胞非接着性親水性高分子よ
りなる像を細胞接着性表面に形成させる工程 を経て形成する方法を説明する。
第1の製法においては、たとえば細胞非接着性親水性高
分子、好ましくは前記電荷を持たない親水性高分子が、
該高分子と2個以上のアジド基を有する化合物とからな
る組成物を本発明の細胞の配列制御用具となる細胞接着
性表面に存在させたのち、光照射することにより、細胞
接着性表面に容易に固定される。また、前記高分子に直
接アジド基を導入したものを用いることもできるが、ア
ジド基を導入する特別な操作が不要な点および現像時の
未反応物の除去が容易な点で、該高分子と2個以上のア
ジド基を有する化合物よりなる組成物を用いるのが好ま
しい。
前記2個以上のアジド基を有する化合物としては、たと
えば第1表に示すような一般のビスアジド化合物、1分
子中に2個以上のアジド基を導入したアジド化ポリマー
などが利用できるが、これらに限定されるものではない
。上記アジド基には、たとえばカルボニルアジドのよい
芳香族アジドまたはスルホニルアジドが好ましい。また
、より長波長域の光でナイトレンに転化できる点で、ニ
トロ基のような電子吸引性置換基を有する芳香族アジド
、i線またはg緑感光性のビスアジド化合物がさらに好
ましい。
該高分子は、アジド基が光照射により転化したナイトレ
ン基が、細胞接着性表面および該高分子に対して、たと
えば次式に示すような化学反応、すなわち、水素引抜き
反応(1)、二重結合への付加やC−H結合への挿入(
′2J、およびカップリング反応(3)を行なうことに
より固定される。
2R−N・−R−N  −N−R(3)なお、ナイトレ
ン基はきわめて反応性が高いため、上記の反応以外の反
応による結合が生じるばあいもある。また、上記反応が
該高分子間に生じ、架橋が生じるばあいがあるが、これ
により該高分子がより安定的に細胞接着性表面に固定さ
れるばあいがある。さらに、該高分子が前述のごとく細
胞接着性表面に結合していなくても、皮膜として付着し
固定されていてもよい。
該高分子と2個以上のアジド基を有する化合物よりなる
組成物を細胞接着性表面に存在させる方法としては、該
組成物をメタノールのような揮発性有機溶媒に溶解また
は懸濁し、この液を細胞接着性表面に、塗布または噴霧
したのち乾燥し、該組成物の薄層を細胞接着性表面に形
成させる方法、該組成物の水溶液またはコロイド溶液と
細胞接着性表面とを接触させ、細胞接着性表面に吸着さ
せる方法などがある。これらのなかでも均質な薄層がえ
られる点で、揮発性有機溶媒の溶液を用いてキャスト製
膜する方法が好ましい。
また、2個以上のアジド基を有する化合物を細胞接着性
表面に存在させたのち、その上に該高分子を存在させて
もよい。
前記光照射に用いる光源としては、高圧水銀灯、低圧水
銀灯、超高圧水銀灯などの各種水銀灯、エキシマレーザ
−などがあるが、長波長域で感光可能なアジド化合物を
用いるばあいは、フィルターにより短波長域をカットす
ることにより、短波長紫外線による該高分子や材料表面
への影響を軽減することができる。これは蛋白質などの
親水性高分子を用いるばあいとくに好ましい。
また、ナイトレン基の反応は極めて短時間で完了するた
め、露光時間は5分以内でよい。
パターン露光の方法は、パターンを有するフォトマスク
を設置した上より光照射する方法、エキシマレーザ−に
よるリソグラフィーを利用する方法などがある。
一方、細胞の配列制御用具の第2の製法は、前記第1の
製法の(1)の工程において、感光性を有する細胞非接
着性親水性高分子を細胞接着性表面に塗布もしくは吸着
させるかわりに、感光性を有する前記細胞接着性親水性
高分子を細胞非接着性表面に塗布もしくは吸着させるほ
かは、第1の製法と同様にして製造する方法である。
第2の製法によれば、たとえば前記細胞接着性を有する
高分子が、該高分子と2個以上のアジド基を有する化合
物よりなる組成物を本発明の細胞の配列ii制御用具と
なる細胞非接着性表面に存在させたのち、光照射するこ
とにより、細胞非接着性表面に容易に固定される。
前記のごとく製造される細胞の配列制御用具を用い、常
法により細胞を培養することにより、細胞配列を容易に
制御でき、μmオーダーまでの高解像度の微細パターン
を形成することができる。
えられた微細パターンは、超小型バイオセンサー、スイ
ッチング素子、バイオリアクターハイブリッド型人工臓
器などの製造、さらにはニューロコンピューターなどの
開発に有用である。
つぎに実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例I N、N−ジメチルアクリルアミドモノマー(■具入製)
をアセトン中、過酸化ベンゾイルおよびN、N−ジメチ
ル−p−トルイジルをレドックス系開始剤として重合し
、ポリ(N、N−ジメチルアクリルアミド)(以下、P
DMAAという)をえた。
えられたPDMAA 95部(重量部、以下同様)に対
して、ビスアジド化合物である4、4°−ジアジドスチ
ルベン−2,2°−ジスルホン酸ソーダ5部を混合した
ものをメタノールに溶かし、0.1%(重量%、以下同
様)溶液とした。
この溶液を、組織培養用ポリスチレンシャーレ(コーニ
ング(CORNING)社製)上に滴下し、キャスト製
膜して風乾し、厚さ数+flfflの膜を形成したのち
、この上に第3図に示すような開孔部と非開孔部とから
なる一対の幅が250μmであるスリットを有するフォ
トマスクをセットし、高圧水銀灯を用いて30秒間パタ
ーン露光した。
なお、第3図はフォトマスクの写真のスケッチ図である
つぎにメタノール、水で充分洗浄して現像し、PDMA
Aおよびシャーレ表面よりなる微細パターンを形成した
シャーレをえた。
このようにしてえたシャーレに、牛血管内皮細胞を播種
し、15%子牛血清(Fe2)を含むDMEM(Dul
bdcco’s Modlried Eagle’s 
Medium)を培地として用い、37℃のCO2イン
キュベーター内で培養したところ、内皮細胞はPDMA
A非固定部(非露光部)のみに選択的に伸展・増殖し、
第1図および第2図に示す細胞の配列パターンかえられ
た。第1図は染色された細胞の配列パターンの写真(倍
率は第3図のもとになる写真と同じ)のスケッチ図、第
2図は第1図のもとになる写真よりもさらに拡大された
写真のスケッチ図である。
実施例2 実施例1のばあいと同様にして調製したビスアジド化合
物を含むPDMAAの0.1%メタノール溶液を、ポリ
スチレンシャーレ上に滴下し、キャスト製膜して風乾し
てのち、高圧水銀灯を用いて紫外線を照射し、PDMA
Aを光固定したシャーレ(以下、PDMAADMA−と
いう)をえた。
N、N−ジメチルアクリルアミド80部とアクリロキシ
コハク酸イミド(国産化学源)20部よりなる共重合体
とフィブロネクチンとを、リン酸緩衝液(pH8,5)
中で反応させ、フィブロネクチンを固定したN、N−ジ
メチルアクリルアミド共重合体(以下、PN−PDMA
Aという)をえた。
FN−PDMAA 95部に対してビスアジド化合物5
部を混合したものをメタノールに溶かし、0.1%溶液
とした。
えられた溶液をPDMAAシャーレ上にキャスト製膜し
て風乾し、厚さ数十nmの膜を形成したのち、フォトマ
スクをセットし、高圧水銀灯を用いて30秒間パターン
露光した。
つぎにメタノール、水で充分洗浄して現像し、PN−P
DMAAおよびPDMAADMA−表面よりなる微細パ
ターンを形成したシャーレをえた。
このようにしてえたシャーレを用いて実施例1のばあい
と同様にして、牛血管内皮細胞を培養したところ、内皮
細胞は、PN−PDMAA固定部(露光部)のみに選択
的に伸展・増殖し、細胞による配列パターンかえられた
[発明の効果コ 本発明の細胞の配列制御用具は、細胞の付着の有無の選
択性がよく、これを用いることにより、従来の細胞培養
と同様にして培養を行なって容易に精度の高い細胞配列
制御をすることができ、極めて微細かつ高解像度の細胞
配列パターンを容易に形成することができる。
また、本発明の製法により、前記配列制御用具を容易に
製造することができる。
本発明は、各種細胞機能を応用した超小型バイオセンサ
ー、スイッチング素子、ハイブリッド型人工臓器、バイ
オリアクター、ニューロコンピューターなどの開発に大
きく貢献するものである。また、細胞間の情報伝達など
の細胞機能の研究においても応用できるものである。
【図面の簡単な説明】
第1図は染色された細胞の配列パターンの写真のスケッ
チ図、第2図は第1図のもとになる写真よりもさらに拡
大された写真のスケッチ図、第3図はフォトマスクの写
真(倍率は第1図のもとになる写真と同じ)のスケ・ソ
チ図である。 第 図 第 2 図 手続補正書 (自発) 5補正の対象 明細書の 「発明の詳細な説明」 の欄 6補正の内容 明細書17頁2行の r Dulbdcc。 r Dulbecc。 と補正する。 1事件の表示 平成1年特許願第141964号 2発明の名称 細胞の配列制御用具、 その製法および細胞の配列制御法 3捕正をする者 事件との関係  特許出願人 住 所  大阪市北区中之島三丁目2番4号名 称  
(094)鐘淵化学工業株式会社住 所 大阪市中央区谷町2丁目2番22号

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1細胞接着性表面および細胞非接着性表面よりなる配列
    パターンを有することを特徴とする細胞の配列制御用具
    。 2細胞接着性表面および細胞非接着性表面よりなる配列
    パターンが、 (1)感光性を有する細胞非接着性親水性高分子を細胞
    接着性表面に塗布もしくは吸着させて存在させる工程、 (2)(1)でえられた表面上に望む配列パターンを有
    するフォトマスクを設置してパターン露光する工程およ
    び (3)洗浄により現像し、細胞非接着性親水性高分子よ
    りなる像を細胞接着性表面に形成させる工程 または (1)感光性を有する細胞接着性親水性高分子を細胞非
    接着性表面に塗布もしくは吸着させて存在させる工程、 (2)(1)でえられた表面上に望む配列パターンを有
    するフォトマスクを設置してパターン露光する工程およ
    び (3)洗浄により現像し、細胞接着性親水性高分子より
    なる像を細胞非接着性表面に形成させる工程 を経て形成されることを特徴とする細胞の配列制御用具
    の製法。 3請求項1記載の細胞の配列制御用具を用いて細胞を培
    養することを特徴とする細胞の配列制御法。
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