JP2003527615A - 細胞パターニング技術 - Google Patents

細胞パターニング技術

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、表面のあらかじめ決定した領域に細胞を選択的に塗布するためのマスキング系を提供する。マスクは、表面に隣接して配置され、表面のある部分を覆い、一方、表面の他の部分が覆われないままであることを許容する。その後、表面の覆われていない部分に細胞を塗布し、そしてマスクを除去する。あるいは、細胞接着促進剤を表面の覆われていない部分に塗布し、そしてその後、表面からのマスクの除去前または後に、表面に細胞を塗布する。マスキング系は、少なくとも細胞と接触するであろう表面で、細胞接着阻害剤でプレコーティングし、細胞の吸着を妨害し、そしてそれによってマスクが除去される（細胞がマスク除去前に付着する場合）際の細胞損傷を回避することが可能である。パターニングしようとする表面と粘着性に一致して接触するポリマー性エラストマーマスクが使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 基板表面、特にガラスまたはプラスチックなどの細胞培養に用いられる表面上
の細胞接着は、組織工学、バイオセンサーなどのさらなる適用における細胞の研
究のため、多くの場合、必要である。細胞パターニング、すなわち表面の別個の
部分における細胞の配置は、フォトリソグラフィーによって提供されてきている
。フォトリソグラフィー技術は、非常に発展してきているが、いくつかの不都合
な点を示す。フォトリソグラフィーは、細胞自体を破壊する可能性がある過酷な
条件を提示する。クリーンルーム施設および他の複雑な装置もまた必要とされ、
そしてこうした施設および装置は、大部分の生物学者には、容易に入手可能では
ない。フォトリソグラフィーは、多くの洗練された細胞生物学的実験に必要とさ
れる表面の分子特性の調節になじみにくい。さらに、フォトリソグラフィーは、
実験開始時にのみ、表面を修飾する。ひとたび細胞が付着すると、フォトリソグ
ラフィーを使用して、さらなる表面修飾を作成するのは不可能である。
【０００２】 層流（ＦＬＯ）パターニングは、低レイノルド数を持つ、隣接する流体流の層
流を介した表面修飾を伴う。ＦＬＯパターニングは、単純なパターニングに限定
され、そしてしたがって、細胞の環境のパターニングおよび細胞標識に有用であ
る。しかしこの技術は、細胞の形状および大きさのパターニングには適さない。
【０００３】 したがって、細胞を比較的穏やかな条件にさらしながら、容易な方式で細胞を
パターニングする必要性がある。発明の概要 本発明の１つの側面は、細胞をパターニングする方法を提供する。該方法は、
製品表面の第一の部分をマスキング系で遮蔽することを含む。マスキング系は、
製品表面と一致して（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ）接触する粘着性マスクを含む。該方
法はまた、製品表面の第一の部分への剤の塗布を防ぎながら、マスキング系内の
チャネルを通じて、製品表面の第二の部分に剤を塗布することも含む。該方法は
また、細胞を剤の上に塗布することも含む。
【０００４】 本発明の別の側面は、製品表面の第一の部分をマスキング系で遮蔽することを
含む、細胞をパターニングする方法を提供する。マスキング系は、製品表面と一
致して接触する粘着性マスクを含む。該方法は、製品表面の第一の部分への細胞
接着阻害剤の塗布を防ぎながら、マスキング系内のチャネルを通じて、製品表面
の第二の部分に細胞接着阻害剤を塗布することをさらに含む。
【０００５】 本発明の別の側面は、製品表面の第一の部分をマスキング系で遮蔽することを
含む、細胞をパターニングする方法を提供する。マスキング系は、製品表面と一
致して接触する粘着性マスクを含む。該方法は、製品表面の第一の部分への細胞
接着促進剤の塗布を防ぎながら、マスキング系内のチャネルを通じて、製品表面
の第二の部分に細胞接着促進剤を塗布することをさらに含む。
【０００６】 本発明の別の側面は、第一の種類の細胞の第一のパターンを有する製品を提供
することを含む、細胞をパターニングする方法を提供する。該方法はまた、第一
のパターンに近接している、製品表面の部分に剤を塗布することも含む。
【０００７】 本発明の別の側面は、第二の種類の細胞の第二のパターンと近接している第一
の種類の細胞の第一のパターンを含む製品を提供する。 本発明の別の側面は、製品表面の第一の部分をマスキング系で遮蔽することを
含む方法を提供する。該方法は、マスキング系を伴う製品表面の第一の部分への
細胞接着促進剤の塗布を防ぎながら、細胞接着促進剤が製品表面の第二の未遮蔽
部分に塗布されるのを許容することを含む。該方法は、細胞を表面の第二の部分
に塗布することをさらに含む。
【０００８】 本発明の別の側面は、製品表面の第一の部分をポリマー性マスキング系で遮蔽
することを含む、細胞をパターニングする方法を提供する。該方法は、製品表面
の第一の部分への剤の塗布を防ぎながら、マスキング系内のチャネルを通じて、
製品表面の第二の部分に剤を塗布することを含む。該方法は、細胞を剤の上に塗
布することをさらに含む。
【０００９】 模式的であり、そして一定の縮尺で描くことを意図しない、付随する図と組み
合わせて考慮した際、本発明の他の利点、新規特徴、および目的は、本発明の以
下の詳細な説明から明らかとなるであろう。図において、多様な図に例示す同一
のまたはほぼ同一の構成要素各々は、単一の数字で示す。明快にするため、すべ
ての図にすべての構成要素が表示されるわけではないし、また、一般の当業者が
本発明を理解するのを可能にするのに、例示が不要な場合、示される本発明の態
様各々のすべての構成要素が表示されるわけではない。詳細な説明 本発明は、マスキング系を伴う、細胞をパターニングする方法、および所望に
より該系を用いて修飾した表面を提供する。該方法は、多様な細胞パターンがフ
ォトリソグラフィー工程の補助を受けずに提供可能であり、そしてしたがってパ
ターンが比較的単純でそして安価な方式で達成可能であるという点で、特に好適
である。本発明は、細胞培養で日常的に用いられる大部分の素材を含む、広い範
囲の基板上で細胞をパターニングするのに適用可能である。マスキング系は、本
質的にいかなる形状の基板上にもパターニングするための柔軟性を有し、そして
数回再使用するための強剛性を有する。
【００１０】 生じた細胞パターンは、多数の細胞種の細胞増殖および伸展、走化性、走触性
、形態形成の観察、並びにパターニングを含む、多様な適用に使用可能である。
さらに、細胞パターニングは、ヒト器官および創傷の再生、部分的再生または治
癒の研究、すなわち組織工学において、広い範囲の適用を有する可能性がある。
他の適用にはバイオセンサーが含まれる。
【００１１】 本発明の１つの側面は、細胞をパターニングする方法を提供する。１つの方法
は、製品表面の第一の部分をマスキング系で遮蔽することを含む。続いて、マス
キング系の除去前または後に、製品表面の第二の未遮蔽部分を、細胞接着促進剤
、細胞接着阻害剤、または細胞などの剤に曝露する。マスキング系は、ポリマー
性であってもよく、そして１つの態様において、マスキング系は、マスクを表面
に一致させることを許容する柔軟な表面を有するマスクを含む。「一致する」に
より、マスキング系およびパターニングしようとする製品の部分間の、本質的に
連続する接触を定義することを意味する。本態様は、例えば、金属スクリーンま
たは強固なポリマーとは区別されるものであり、該スクリーンまたはポリマーは
各々、マスキングしようとする表面に接触することが可能であるが、表面に一致
して接触するのに十分に柔軟でない可能性がある。マスクの柔軟性は、エラスト
マー性マスクの使用によって提供可能である。マスクは、ポリジメチルシロキサ
ン（ＰＤＭＳ）またはそれに匹敵するものなどのポリマー素材で作成可能である
。１つの態様において、マスクは、表面の選択される部分と接触させることによ
って、これらの部分を遮蔽することが可能である。マスクの柔軟性のため、表面
は、平坦な表面でもまたは平坦でない表面でも、いずれでもよい。
【００１２】 １つの態様において、マスキング系内にチャネルがあり、そして好ましくは、
マスキング系内に複数のチャネルがある。マスキング系は、第一および向かい側
の第二の表面を含んでもよく、この場合、チャネルがマスクを通過し、第一の表
面を第二の表面に連結する。チャネルは、製品表面の特定の部分（第二の部分）
を曝露するよう機能することが可能であり、一方、製品の第一の部分は、マスキ
ング系と製品の一致した接触によって遮蔽される。１つの態様において、第一の
部分は第二の部分と近接する。１つの態様において、マスク内のチャネルは、マ
スクを通じた穴であり、そしてマスクの１つの表面を基板上に置くことによって
、チャネル壁および基板表面によって画定されるウェルが形成される（表面の第
二の部分）。マスクは、これらのウェル内部に、多様な液体または固形剤を含む
ことが可能である。
【００１３】 １つの態様において、マスクはポリマーである。好ましいポリマーは、製品表
面に対して封印を形成可能なポリマー性エラストマーである。「封印」は、この
状況において、マスクが表面と封印されて結合され、そして流体がマスクされた
表面に塗布される場合、流体が、マスクのチャネルと正確に合った（ｉｎ ｒｅ
ｇｉｓｔｅｒ）、マスクされた表面の部分とのみ接触を許容され、そして流体が
マスクまたはパターニングされる表面を分解しない限り、流体はマスク下を通過
せず、そしてマスクの固形部分に被覆される製品表面の遮蔽部分に接触しない（
分解する場合は、流体はマスクおよび／または表面の分解のため、マスク下を通
過可能である）。例えば、封印は、タンパク質溶液が、マスク下に漏れるのを防
ぐことが可能である。「封印すること」は、この状況において、表面と一致して
接触させることが可能であるが、表面に対して封印不能である、他の強固なまた
は柔軟なマスクの作用とは区別されるものとする。本発明のマスクが、いかなる
固定装置または基板表面に向かってマスクに対する力を適用するのに用いる他の
装置の非存在下であっても、基板表面に対して封印を形成可能であるのが、本発
明の特徴である。エラストマー性表面を用い、そしてエラストマー性表面および
マスクしようとする基板表面が、清浄である場合、封印は、有意な圧力の適用な
しに、接触に際して本質的に直ちに発生可能であり、そして封印は、いかなる圧
力の維持も伴わず、維持可能である。この封印は可逆性であり、すなわち、マス
クは、剥離することによって、基板表面から除去可能であり、そして同一または
異なる基板表面に対して、再使用可能である。特定のマスクの再使用可能性は、
マスクの厚みと共に増加する。
【００１４】 マスクを製造する典型的な技術が、Ｊａｃｋｍａｎらにより、１９９９年１０
月２８日に公表され、そして本明細書に援用される、ＰＣＴ公報ＷＯ ９９／５
４３８６、表題「エラストマー性マスク、およびピクセル化されたエレクトロル
ミネッセンスディスプレイを含む装置製造における使用」に記載される。例えば
、柔軟なマスクは、いくつかの重合法によって生成可能である。ＰＣＴ公報ＷＯ
９９／５４７８６に記載される、１つの方法は、円柱状ポストのアレイを有す
る基板表面上に、プレポリマー層をスピンコーティングすることを伴う。
【００１５】 １つの態様において、方法は、チャネルを通じて、剤を塗布することを伴う。
該方法は、製品の遮蔽（第一の）部分への剤の塗布を防ぎながら、剤が製品表面
の曝露（第二の）部分に接触することを許容する。剤は、付着、化学反応、また
はそれらに匹敵するものを介して塗布可能である。例えば、剤が溶液として提供
される場合、付着は、マスク上に、そしてチャネルを通じて、溶液をスプレーす
るかまたは滴らせるか、あるいは全基板およびマスキング系アセンブリを溶液中
に浸すことを伴う可能性がある。１つの態様において、真空を適用し、チャネル
中の溶液内のいかなる空気泡も除去し、最適な表面被覆を確実にすることが可能
である。
【００１６】 １つの態様において、剤は、吸着を介した製品表面への接着を許容する、物理
的および／または化学的特性を有する。剤の塗布は、製品表面および剤の間の共
有またはイオン性相互作用を生じる化学反応を生じる可能性がある。
【００１７】 １つの態様において、剤は、細胞接着促進剤、すなわち細胞の完全性を維持し
ながら、剤への細胞接着を許容する、物理的（「粘着性」素材）および／または
化学的特性を有する可能性がある剤であってもよく、そして方法は、剤の上に細
胞を塗布することを伴う。細胞接着は、特異的または非特異的相互作用によって
、達成可能である。非特異的相互作用を促進する表面は、大部分の細胞に接着す
る。こうした表面の例には、イオン性または荷電表面が含まれる。親水性表面も
また、細胞の非特異的接着を促進する。非特異的相互作用に関与する表面の例に
は、ポリリジンまたは血漿処理ポリスチレンなどの、バイオマテリアルに使用さ
れるポリマー表面が含まれる。細胞特異的相互作用は、一般的に、細胞が特定の
表面を認識する受容体を有する結果、生じる。例えば、哺乳動物細胞は、細胞外
マトリックスタンパク質を認識する受容体を有する。したがって、まず、細胞接
着促進剤を、好ましくはマスキング系を用いて、表面に塗布するか、またはすで
に細胞接着促進性である表面にマスキング系を塗布することによって、本発明の
マスキング系を用いて、表面上に細胞をパターニングすることが可能である。細
胞接着促進剤および細胞接着促進表面はどちらも当該技術分野に公知である（こ
のうちいくつかはすぐ上に記載した）。細胞接着促進剤の例には、ビトロネクチ
ン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン類およびゼラチン類などの細胞外
マトリックスタンパク質が含まれる。あるいは、表面は、特定の細胞受容体を認
識する抗体で修飾してもよい。細胞接着阻害表面および細胞阻害剤もまた、公知
である。細胞接着阻害剤には、ポリエチレングリコールに基づく剤が含まれる。
一般的な当業者は、以下のように、天然細胞接着促進または阻害特性に関して、
表面を、あるいは細胞接着促進または阻害に関して、剤を、容易にスクリーニン
グすることが可能である。多様な未処理表面を研究することが可能であり、また
は多様な剤を表面に塗布し、細胞をこれらの表面に塗布して、そして細胞が表面
に接着する能力を、形態または他の特性を介して研究することが可能である。こ
れは、一般の当業者にとって、日常的である。
【００１８】 １つの態様において、製品または製品表面は、シリカ、アルミナ、石英、ガラ
ス、およびそれらに匹敵するものまたはそれらの誘導体などの酸化金属、あるい
は金、銀および銅などの金属であってもよい。表面は、アミド、カルボン酸、ホ
スホリル基、ヒドロキシル基、アミノ酸、アミン、スルホニル基を含む、官能基
で、誘導体化されていてもよい。オキシ化合物またはプラスチックもまた、本発
明にしたがって、使用可能である。さらなる素材および官能基は、１９９６年４
月３０日に発行され、そして本明細書に援用される、米国特許第５，５１２，１
３１号に見出すことが可能である。１つの態様において、表面は、顕微鏡スライ
ド、ペトリ皿、試験管または他の製品などの、細胞を研究するのに典型的に使用
される製品のものであってもよい。典型的には、これらの製品は、ポリスチレン
、ガラスまたはポリカーボネートで作成する。上に論じた官能基、および他の官
能性は、米国特許第５，５１２，１３１号に記載されるように、自己集合単層で
表面をコーティングすることによって、表面上に提供可能である。自己集合単層
は公知であり、そして典型的には、各々、表面に接着する基、および集合可能で
あるスペーサー部分か、または複数の分子が表面に曝露された際、表面に接着す
る基と共に、表面に対して、そしてスペーサー部分が互いに対してそして表面か
ら伸長して充填される、順序だった方式で、それ自体を方向付けるように、他の
スペーサー分子と充填可能である、スペーサー部分を含む、分子を伴う。これら
の各分子の、または選択された分子の他方の端で、望ましい化学的官能性を持つ
自己集合単層の曝露部分を提供する官能基を提供することが可能である。
【００１９】 図１は、本発明にしたがった、細胞付着と関連する剤をパターニングする一例
の模式図を示す。図１（ａ）は、第一の部分１２および第二の部分１４を持つ表
面１１を有する製品１０を示す。マスキング系は、マスク１６を含むことが可能
である。表面１１の第一の部分１２が遮蔽されるように、マスク１６（横断面で
示す）を製品１０の表面と一致して接触させる。図１（ｂ）は、マスキングチャ
ネル１６のチャネル１８を通じて剤２０を塗布した結果を示す。マスク１６は、
第一の部分１２を遮蔽するため、剤２０は、第二の部分１４にのみ塗布され、そ
して第一の部分１２に塗布されることは妨げられる。剤２０は、細胞接着促進剤
（例えばフィブロネクチン）であってもよい。細胞は、この段階で、第一の部分
１４上の剤２０の上に塗布可能である。しかし、細胞はまた、剤２０にコーティ
ングされたすべての表面にも接着するであろう（例えば図５Ａを参照されたい）
。あるいは、図１（ｃ）に示すように、剤２０上に細胞を塗布する前に、マスク
１６を除去することが可能である。図１（ｃ）において、基板１０は、第二の部
分１４上の剤２０のパターンを有し、一方、第一の部分１２は、剤２０を含まな
い表面を含む（例えば図６Ａを参照されたい）。
【００２０】 図１（ｄ）は、曝露された第一の部分１２に第二の剤２２を添加した結果を示
す。第二の剤２２は、ウシ血清アルブミンなどの細胞接着阻害剤であってもよい
。細胞は細胞接着阻害剤に接着することが不能であるため、細胞接着阻害剤は、
細胞の付着を限局された領域、具体的には部分１４に局在させるよう機能する。
一般的に、細胞は、細胞接着阻害剤を含む表面上では増殖せず、また伸展しない
。細胞２４を図１（ｄ）の表面に添加することによって、図１（ｅ）に示すよう
に、細胞のパターンを、部分１４と正確に合わせて確立可能である（例えば図６
Ｂを参照されたい）。
【００２１】 図１は、本発明の技術を用い、基板に対して、穴を通じて、素材をパターニン
グし、そしてレーザーアブレーション、フォトリソグラフィー、およびシャドウ
マスク法に関与する工程および装置の必要を伴わずに、マスクを除去し、ピクセ
ルのアレイを残すことが可能であることを示す。
【００２２】 以下により完全に論じられるように、１つの態様において、細胞がマスクに接
着しないか、またはプレコーティング処理に供されているならば、マスク１６が
表面１１上にありつつ、細胞を部分１４に付着することが可能である（例えば図
２および考察を参照されたい）。各チャネルに付着する細胞の量は、チャネルの
直径および高さ、または流体懸濁物中の細胞密度などの要因に応じる可能性があ
る。各チャネルは、１つの細胞または数十の細胞を含む可能性がある。本発明の
好適な特徴は、マスク１６が製品１０から除去されるまで、細胞（類）が、チャ
ネルによって画定される空間に制限されることである。付着しようとする細胞の
数に応じて、チャネルまたはマスクの穴は、約１ｍｍ未満、約５００μｍ未満、
約２５０μｍ未満、約１００μｍ未満、約５０μｍ未満、約２５μｍ未満、約１
０μｍ未満、約５μｍ未満、約１．５ミクロン未満までの直径を有する可能性が
ある。
【００２３】 マスクにおいて、チャネル１８のいかなるパターンも用いてもよく、例えば円
形、楕円形、正方形、長方形、およびそれらに匹敵する形であってもよく、そし
てグリッド様アレイ（例示するように）または非アレイ（例えばランダムパター
ン）に配置してもよい、単一のチャネルまたは多数のチャネルによって画定され
るパターンを用いてもよい。
【００２４】 マスクおよびチャネルは多様な寸法のものであってもよい。１つの態様におい
て、マスクは、約１ｍｍ以下、好ましくは約５００μｍ以下、より好ましくは約
２００μｍ以下、好ましくは約１００μｍ以下、より好ましくは約２５μｍ以下
の厚さを有する。１つの態様において、チャネル１８は、約５対１以下、そして
好ましくは約２対１以下のチャネルの長さ対直径比を生成する、マスク２０の厚
さ１７に対応する、好ましい横断面寸法１９を有する。もちろん、チャネルの数
およびチャネルの形状は、一般の当業者に知られるいかなる方法によって、変化
させてもよい。
【００２５】 製品１０とマスク１６の一致した接触は、製品表面上のマスクのすべりを防ぐ
ため、十分に強くなければならないが、剥離過程によって除去可能でなければな
らない。１つの態様において、マスクは、少なくとも約５０μｍの厚さを有する
。この厚さは、いくつかの剥離過程を通じて、マスクの完全性を確実にするのを
補助する。好ましくは、剥離は、パターンの完全性を妨げないものとする。マス
クが粘着性であり、そして単一の単位として表面から除去し、そして再使用する
ことが可能である、すなわちマスクが「乾燥リフトオフ」法を容易にするのが、
本発明の特徴である。マスクを共に保持するマスク内の引力が、表面からマスク
を除去するのに典型的に必要な力より強い場合、マスクは粘着性である。すなわ
ち、付着過程中に、マスクを用いて、表面を封印することが可能であり、その後
、マスクの部分を持ち上げ、その部分が全マスク表面を引っ張ることによって、
マスクを除去することが可能であり、そしてその後、マスクを再使用することが
可能である。これは、フォトレジストマスクなどのリソグラフィーによって生成
したマスクとは区別されるものである。本発明の粘着性マスクの使用は、表面で
、チャネル３２を画定する部分を（リソグラフィーによって生成されるマスクの
生成において、分解するように）分解することなく、マスクしようとする表面上
のマスク形成を可能にする。
【００２６】 あるいは、剤２０は、細胞接着阻害剤であり、そしてマスク１６の除去に際し
て、細胞接着促進剤を裸の表面に塗布し、図１（ｄ）の配置を達成することが可
能である。
【００２７】 特定の例で図１を説明するため、ＰＤＭＳマスク（すなわち別に膜として言及
する、マスキング系１６）を、基板表面への細胞接着促進剤フィブロネクチン（
ＦＮ、細胞外マトリックスタンパク質）の吸着に対するレジストとして用いる。
ＦＮは、膜の孔によって曝露される、基板表面にのみ吸着する（図６を参照され
たい）。表面からのマスクの除去は、ＦＮのパターンを生成する。その後、基板
をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有培地に曝露し、残りの表面が、細胞接着を
妨害するタンパク質にコーティングされることを確実にする。細胞は、懸濁物か
ら、膜の孔によって画定されるパターンでのみ、この基板に接着する（図７を参
照されたい）。図１は、一定の縮尺で描かれておらず、そして図１は、ＢＳＡお
よびＦＮの層が、同じ厚さを有することを意味しない。マスク・フィーチャーは
、スピンコーティングまたは他の過程中のメニスカス形成の結果、上部でカーブ
している可能性がある。
【００２８】 特定の細胞種では、マスクチャネル内に細胞を制限することによって、細胞を
パターニングすることが好ましい可能性がある。マスクチャネルは、包含し、そ
してしたがって細胞の大きさおよび形状、または細胞層の大きさおよび形状の調
節を維持する、物理的バリアを提供する。本態様において、理想的には、マスク
は、表面上に配置され、マスクチャネルおよび表面によって画定されるような特
定のウェルを生成し、そして細胞は、これらのウェル内に付着する。しかし、マ
スク自体が、細胞接着特性を有する可能性があるため、マスクの除去は、ある場
合、特に細胞がマスクおよび基板に同時に接着している場合、細胞壁の断裂を生
じる可能性がある。したがって、細胞のマスクとの接触が、マスク除去に際して
、細胞壁を損傷しないことを確実にするため、１つの態様において、プレコーテ
ィングマスクの使用による細胞パターンが提供される。マスクの少なくとも部分
、好ましくは過程において細胞と接触する可能性がある部分を、ウシ血清アルブ
ミンなどの細胞接着阻害剤である剤で、プレコーティングすることが可能である
。したがって、細胞は、マスクに接着する傾向を持たず、そしてマスクの剥離は
、細胞を損傷しない。
【００２９】 図２は、マスキング系のプレコーティング処理を伴う細胞パターニングの例を
示す。図２（ｃ）は、第一の部分３２および第二の部分３４を含む表面３１を有
する製品３０を示す。マスク３６（横断面で示す）は、第一の部分３２と一致し
て接触することによって、第一の部分３２を遮蔽し、一方、チャネル３８は、第
二の部分３４を曝露する。図２（ｃ）はまた、第一の剤、細胞接着阻害剤４０の
コーティングも示し、該剤は、マスク３６の曝露表面にのみ塗布されており、そ
して製品３０の第二の部分３４の曝露表面には塗布されていない。細胞接着促進
剤などの第二の剤４２の添加は、図２（ｄ）に示すように、製品３０の第二の部
分３４上のコーティングを提供する。好ましくは、剤４０は、剤４２の吸着を妨
害するよう選択する。細胞４３の添加は、剤４２のみに対する細胞接着を生じ、
そして細胞接着は、図２（ｅ）に示すように、剤４０に被覆される表面上では阻
害される（例えば図５Ｂを参照されたい）。図２（ｅ）に示す配置は、製品３０
からマスキング系３６を剥離する際、剤４０でコーティングされた製品３６の表
面の細胞接着阻害性が、マスキング系３６および細胞間のいかなる摩擦も減少さ
せ、したがって、細胞完全性を促進するという利点を提供する（例えば図８を参
照されたい）。
【００３０】 本態様において、製品３６は、図２（ａ）および（ｂ）に示すように、細胞接
着阻害剤４２でプレコーティングしてもよい。図２（ａ）では、マスク３６の第
一の表面３７を、基板４４の表面４６と接触させる。好ましくは、第一の表面３
７は、表面４６と一致して接触される。図２（ｂ）は、マスク３６および基板４
４上の剤４０（細胞接着阻害剤）のコーティングの結果を示す。マスク３６の表
面３７は、剤４０を含まない。基板４４からのマスク３６の除去後の製品３０の
表面３１上へのマスク３６の配置は、剤４０を含まない製品３０の未曝露表面（
第二の部分３４）を生じる。続いて、図２（ｃ）に示すように、マスク３６を用
いて、製品３０の部分を遮蔽することが可能である。
【００３１】 図２（ｆ）は、製品３０からマスク３６を除去し、第一の部分３２を曝露し、
その後、第一の部分３２に剤５０（細胞接着阻害剤または促進剤いずれか）を塗
布した結果を示す。剤５０が細胞接着促進剤である場合、剤４２上に塗布された
細胞が、剤５０上に伸展するのを許容することが可能であり、その結果を図２（
ｈ）に模式的に示す。したがって、本発明は、個々の細胞から細胞群までの、あ
らかじめ決定した領域（すなわち形状および大きさ）の細胞伸展、あるいは走化
性、走触性または形態形成などの他の細胞現象の影響を研究する、新規媒体を提
供する。
【００３２】 本発明の本側面において、パターニングされた束縛内で、接着した細胞を増殖
させる、単純でそして安価な方法のため、方法が提供される。１つの態様におい
て、束縛を解放し、細胞が伸展するのを許容することが可能である。細胞をパタ
ーニングする現在の技術の大部分は、パターニングされた束縛内で細胞を増殖さ
せ、そしてその後、これらの束縛を解放して、細胞の遊走を許容するのに必要な
過程と、直接は適合しない。細胞のパターニングは、例えば、係留依存細胞の振
る舞いを研究し、そして調節するのに有用である可能性がある、実験ツールであ
る。細胞のパターニングは、マイクロコンタクトプリンティングで先に達成され
ている（例えばＣ．Ｓ． Ｃｈｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７， ２７６
， １４２５−１４２８；Ｒ． Ｓｉｎｇｈｖｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９
４， ２６４， ６９６−６９８；Ｐｒｏｇ． １９９８， １４， ３７８−
３８７；Ｇ．Ｐ． Ｌｏｐｅｚら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １
９９３， １１５， ５８７７−５８７８；Ａ． Ｋｕｍａｒら， Ａｐｐｌ．
Ｐｈｙｓ． Ｌｅｔｔ． １９９３， ６３， ２００２−２００４；Ｍ．
Ｍｒｋｓｉｃｈら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９９５， １３，
２２８−２３５を参照されたい）。マイクロコンタクトプリンティングは、実験
的に好適な技術であり、最も単純な立体配置で、単一の細胞のパターニングを許
容するのに十分な解像度を有するが、細胞をパターンから「解放する」のを許容
しない；すなわち、ＳＡＭのパターンがひとたび形成され、フィブロネクチンが
吸着され、そして細胞が接着したら、パターンを変化させるか、またはこのパタ
ーンの境界を越えて細胞が伸展することを許容する、実際的な方法はない。他の
パターニング法は、より複雑な過程を伴う。
【００３３】 別の態様において、剤４２が第一の細胞接着促進剤であり、そして剤５０が第
二の細胞接着促進剤である。本態様は、単一の基板上に、多数の細胞種をパター
ニングする方法を提供し、本態様では、第二の種類の細胞を剤５０上に塗布する
ことが可能である。１つの態様において、第一の細胞接着促進剤は、第一の種類
の細胞４３に特異的であり、そして第二の細胞接着促進剤は、第二の種類の細胞
４５に特異的である（図２（ｇ））。
【００３４】 図２は、特定の例に関して説明可能である。マスク３６を、剤４０、すなわち
ＢＳＡで、その１つの側面上および内部チャネル表面内に、選択的にプレコーテ
ィングし、そしてプレコーティングしたマスクを、ＦＮの吸着中に用いて、基板
表面を清浄にする（図２ｄ）。細胞はＦＮでコーティングした基板表面に接着し
、一方、ＢＳＡでコーティングした膜チャネル壁またはマスク上部への接着は妨
げられる。したがって、剥離に際して、マスクは、膜の穴によって画定されるパ
ターンで、基板表面に付着したままである細胞を損傷しない（図２Ｆ、図８を参
照されたい）。マスクの除去は、細胞のパターンを、表面の隣接する曝露部分に
曝露する。基板の保護領域は、その後、パターニングされた細胞が曝露表面に伸
展するのを許容する、接着タンパク質の吸着によって、修飾可能である。あるい
は、別の細胞種を、表面に接着させてもよい。マスク３６の除去に際して、細胞
完全性は、蛍光アッセイを介して試験可能である。このアッセイでは、細胞を色
素（例えばヨウ化プロピディウム）とインキュベーションし、この色素が損傷さ
れた膜を有する細胞内に拡散し、そしてＤＮＡと複合体化した際、より蛍光とな
る。
【００３５】 あるいは、マスクは、細胞に接着しない素材で調製可能である。したがって、
プレコーティング工程が不要である。非接着マスクの素材は、細胞種に応じる可
能性がある。
【００３６】 製品の多様な部分の調節した遮蔽によって、２より多い細胞種を、単一の表面
上にパターニングすることが可能である。ＰＣＴ公報ＷＯ ９９／５４７８６に
記載されるように、多数のマスクを伴うマスキング系を、異なるオーバーレイ配
置で使用して、表面の望ましい部分への特定の剤または細胞種の塗布を調節する
ことが可能である。
【００３７】 マスク／表面系が、細胞をまず、物理的に束縛されたバリア内に付着させた際
、細胞増殖を観察する方法を提供するのが、本発明の特徴である。細胞は、マス
クチャネルおよび基板表面によって画定されるようなウェル内で増殖させること
が可能である。マスク壁および基板の表面の化学的性質は、細胞を基板上に付着
させ、そして伸展させるが、マスクに付着させない方式で、調節可能である。そ
の後、マスクを除去し、細胞が残りの表面に伸展するのを許容することが可能で
ある。
【００３８】 本発明の別の好適なフィーチャーは、単一の細胞の大きさおよび形状を調節す
るのに十分に小さい大きさのチャネルの提供である。マスクを基板に一致させな
がら、物理的束縛を用いて、細胞増殖を阻害し、そして続いて、基板からのマス
ク除去に際して、細胞増殖を促進することが可能である。細胞伸展および遊走を
研究する既知の技術は、典型的には、細胞が伸展しそして遊走するのを許容する
前に、細胞の形状および大きさを調節することを伴ってきていない。細胞の形状
および大きさは、細胞周期の推移を決定する。細胞増殖は段階の周期を伴うこと
が知られる。細胞は、特定の大きさに到達するまで、次の段階に到達不能である
。細胞の大きさおよび形状は、伸展する能力に影響を及ぼすだけでなく、最終的
に、表面のあちこちを遊走する能力にも影響を及ぼす可能性がある。細胞増殖お
よび遊走を調節する能力は、創傷治癒、細胞死（アポトーシス）および分化の調
節に多くの適用を有する。血管形成（毛細血管増殖）は、ウシ毛細血管内皮細胞
の分化の一例である。チャネルを用いて、細胞を特定の大きさに収縮させること
が可能であり、その後、チャネルを除去すると、細胞増殖、そしてしたがって基
板表面または基板表面の部分の周りの細胞遊走の調節が生じる。
【００３９】 マスキング系を介した遮蔽、剤の塗布および細胞の塗布の工程の順序を変化さ
せて、望ましい結果を得るのが可能であることが理解されるものとする。例えば
、本発明の別の側面は、製品表面の第一の部分を、製品表面と一致して接触する
粘着性マスクを含むマスキング系で遮蔽することを含む、細胞をパターニングす
る方法を提供する。該方法は、製品表面の第一の部分への細胞接着阻害剤の塗布
を妨げながら、マスキング系内のチャネルを通じて、製品表面の第二の部分に細
胞接着阻害剤を塗布することを含む。再び図１を参照すると、本側面は、図１（
ｃ）に関して先に記載したもの、すなわち細胞接着阻害剤が上に塗布された第二
の部分１４および曝露された第一の部分１２と異なる結果を示す。本側面は、図
１（ｄ）に示した結果を得るための異なる方法を説明する。
【００４０】 本発明の別の側面は、第一の種類の細胞の第一のパターンを有する製品を提供
し、そして製品表面の部分に剤を塗布することを含む、細胞をパターニングする
方法を提供する。この部分は、第一の部分と近接していてもよい。１つの態様に
おいて、剤は、第一の種類の細胞の細胞接着阻害剤であってもよい。別の態様に
おいて、剤は、第二の種類の細胞の細胞接着促進剤である。本方法は、異なる細
胞接着促進剤の親和性が、細胞種間を望ましい度合いに区別するのに十分に強く
ない場合に、多数の細胞をパターニングする際、または細胞伸展を許容する方法
のため、好適である。したがって、第二の接着促進剤を表面上に塗布する前に、
第一の種類の細胞を、第一の細胞接着促進剤に接着させることによって、多数の
細胞種の別個のパターンを提供するのに、異なる細胞接着促進剤の非常に異なる
親和性は、それほど必須の必要条件ではなくなる。
【００４１】 多数の細胞種をパターニングする能力は、器官再生に適用を有する。例えば、
特定の器官種が、異なる細胞種の条線化パターンを有することが知られる。例え
ば、表面は、第二の種類の細胞の連続する部分に隣接する第一の種類の細胞の１
つの連続する部分を有する可能性があり、これが次に、第一の種類または第三の
種類の細胞の別の部分に隣接する。連続する部分は、基板表面に平行に走るいか
なる形状の層に似ていてもよい。したがって、第二の種類の細胞に関して、第一
の種類の細胞の配置を調節する必要がある。ある場合では、第一の種類の細胞は
、第二の種類の細胞と、表面接着に関して、非常に異なる親和性を持たない。こ
うした近い親和性は、１つの表面（または表面上の剤）が、どちらの種類の細胞
もかなりの量、吸着可能であるという、戦略的困難を提示する可能性がある。本
発明の柔軟なマスクは、細胞親和性にかかわりなく、基板表面の特定の部分を遮
蔽し、そしてしたがって、細胞−基板親和性を微調整する必要が回避される。上
述の例では、細胞の条線化層は、極端に長い長さであるが、狭い幅を有するよう
成形したチャネルを有するマスクによって、提供可能である。もちろん、チャネ
ルの形状は、規則的な幾何学的形状に似ている必要はないし、そしてコーティン
グ、付着および剥離過程に耐えることが可能な、適切ないかなる形状のものであ
ってもよい。
【００４２】 本発明の別の側面は、第二の種類の細胞の第二のパターンと近接する、第一の
種類の細胞の第一のパターンを含む製品を提供する。本側面は、多数の種類の細
胞のランダムアレイとは区別されるものとする。該製品は、本明細書に記載する
方法を用いることによって、異なる細胞種の２より多いパターンを有することが
可能である。
【００４３】 本発明のこれらのおよび他の態様の機能および利点は、以下の実施例からより
完全に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の利点を例示することを意
図し、本発明の完全な範囲を例示しない。
【００４４】
【実施例】
一般的な条件 材料 ＳＵ−８ ５０フォトレジストは、Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（マサチューセッツ州ニュートン）によって供
給された。フォトリソグラフィー工程のフォトマスクとして、強固なクロムマス
ク（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州ノー
スアンドーバー）または透明フィルム（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｉｅｓ）を用い
た。ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）；Ｓｙｌｇａｒｄ １８４）は、
Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（ミシガン州ミッドランド）から得た。細菌学的および
組織培養等級ペトリ皿は、Ｆａｌｃｏｎから購入した。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ
．（ニューヨーク州コーニング）のＮｏ．２ガラススライドは、受け取ったまま
用いた。シリコンウェハー＜１１０＞は、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｓｅｎｓｅ Ｉｎｃ
．（ニューハンプシャー州ナシュア）から得て、そしてやはり、受け取ったまま
用いた。リン酸緩衝生理食塩水パケットは、Ｓｉｇｍａから購入し、そして蒸留
水で望ましい濃度（１５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）に希釈した。ダルベッコの修飾
イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＢＳＡ（フラクションＶ）、およびフィブロネクチ
ンは、Ｇｉｂｃｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロッ
クビル）より購入した；培地に５μＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、カンザス州レネクサ）を添加した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
は、Ｂｉｏ Ｒａｄ（カリフォルニア州ハーキュルス）から購入した。ゼラチン
はＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ミシガン州デトロイト）から購入し
た。パラホルムアルデヒドは、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ（ペンシルバニア州フォートワシントン）から購入した。
【００４５】 基板 ペトリ皿、ＰＤＭＳ、ガラススライド、シリコン（＜１１０＞、天然酸
化物）の表面上に、細胞をパターニングした。別に明記しない限り、常に基板と
してペトリ皿を用いる。
【００４６】 実施例１：マスキング系の製造 パターニングしたフォトレジスト構造および膜の製造 図３に関連し、標準的
フォトリソグラフィー技術および強固なクロムマスクを用いて、シリコンウェハ
ー６２上に、フォトレジスト６０の円柱状ポストのアレイを製造した。正方形の
フィーチャーのアレイは、フォトマスクとして透明フィルムを用いて製造した。
当該技術分野に公知の方法を用いて、５０μｍの高さのフィーチャーを製造した
。
【００４７】 マスキング系の製造 エラストマー性ポリマー膜は、Ｊａｃｋｍａｎら（Ｊａ
ｃｋｍａｎら， Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ｖｏｌ．１５， ｐｐ．２９７３−２９
８４（１９９９））に記載される方法を用いて、製造した。ＰＤＭＳプレポリマ
ー６４（架橋触媒を用いて、１０：１の比で混合）を、フォトレジストのフィー
チャーの高さより薄いフィルムを産生するのに知られるパラメーターを用いて、
パターニングしたフォトレジストの浅浮き彫り（ｂａｓ−ｒｅｌｉｅｆ）上にス
ピンコーティングした。５０μｍより高いフィーチャーに関しては、３０００ｒ
ｐｍで６０秒間、ＰＤＭＳプレポリマーをスピンコーティングして、およそ４５
μｍ厚のフィルムを生成した。ＰＤＭＳフィルムは、６０℃で２時間、養生（ｃ
ｕｒｅ）した。ＰＤＭＳプレポリマーの厚い層を、一滴ずつ膜の縁に添加した；
養生後、このＰＤＭＳ層は、基板を支持するであろう枠を提供した；典型的には
２ｘ２ｃｍの片を用いた。フィルムは６０℃で一晩、維持した。細胞培養で用い
る前に、ジクロロメタンに１２時間、浸すことによって、膜から低分子量ポリマ
ーを除去した。その後、膜をエタノールに１時間浸し、そしてオーブン中で、６
０℃で１２時間、乾燥させた。膜６６は、ピンセットを用いて基板（シリコン上
の円柱状または正方形のフォトレジストポスト）から除去し、そしてその後、基
板の縁に沿って、望ましい大きさに切断した。図４は、１００μｍの円形穴を持
つ膜の走査型電子顕微鏡写真の写真複写を示す。膜はおよそ５０μｍ厚である。
図１および２中の剥離工程におけるように、膜は表面から除去されながら上方に
湾曲する。この画像は、膜のエラストマー特性を例示する。膜は一般的に、基板
６８と一致して接触するようになる。膜が表面上に平坦でなく、そしてそれ自体
に接着する場合、その上にエタノール滴を置き、平坦な封印の形成を促進した。
エタノールは膜表面を優先的に湿らせ、そして膜が平坦になるのを許容する；エ
タノールが蒸発すると、膜は基板上に平らに残る。膜は、エタノール蒸発後、使
用可能である。
【００４８】 生物学的実験のため、膜をジクロロメタンに数時間（一晩）浸し、その後、６
０℃で数時間（一晩）乾燥させることによって、膜から低分子量有機物質を抽出
することが可能である。その後、膜をペトリ皿上に置き、そして数滴の無水エタ
ノールで覆う。エタノールは、膜が、それ自体に接着する傾向を減少させ、そし
て膜および基板表面間の一致した接触の形成を促進することが可能である。エタ
ノールはまた、膜および基板表面を滅菌する。あるいは、基板での一致した封印
は、膜がＰＢＳ緩衝液の存在下で基板上に配置される場合に、達成可能である。
この緩衝液はまた、ＢＳＡ層の水和維持も提供する。乾燥を許容されているＢＳ
Ａ層は、水和状態で維持されているものほど、細胞の付着に抵抗しない。実施例
において、基板は、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞の懸濁物に曝露される。典
型的には、９６２ｍｍ2の面積を有する皿に２５，０００細胞／ｍｌの懸濁物２
ｍｌを用いる。
【００４９】 細胞培養中で使用した後の膜の洗浄に用いる方法 膜は、室温で３０分間、そ
して９０℃で３０分間、緩衝ＳＤＳ（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ）中
に維持し、その後、脱イオン水およびエタノールで徹底的にリンスした。その後
、膜をジクロロメタンで１２時間抽出し、そして６０℃で１２時間、乾燥させた
。これらの膜もまた（ＰＤＭＳで作成した他の微視的構造同様）、２０分間オー
トクレーブすることが可能である（１２１℃、１１５ｋＰａ）。
【００５０】 実施例２：表面修飾 ａ）細胞接着阻害剤での膜のプレコーティング 層流フード中で、数滴のエタ
ノールと共に、膜を滅菌ペトリ皿表面に置いた。この液体は、細菌を殺すことに
よって、膜を滅菌する。図２に模式的に記載する方式で、ＢＳＡの緩衝溶液（１
％ｗ／ｖ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳまたはＤＭＥＭ中）の滴を膜上に置いて穴を覆
った。液体は、疎水性孔を満たさないため、真空を、２回適用し（〜３０秒間）
そして放出し（〜５００ｍＴｏｒｒ）、孔に捕捉された空気を抽出した。表面に
１５分間、ＢＳＡが吸着するのを許容した。その後、基板をＰＢＳで３回リンス
し；ＰＢＳの存在下で膜を基板から剥がし、そしてペトリ皿上に膜を封印するの
を補助するＰＢＳで覆われた、清浄なペトリ皿に移した。
【００５１】 ｂ）基板上のタンパク質のパターニング 細胞接着促進剤、緩衝フィブロネク
チン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ）またはゼラチン（１．５％ｗ／
ｖ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ）溶液の滴を、基板に接着した膜上に置いた。真空を
、２回適用し（およそ３０秒間）、そして放出し、孔に捕捉された空気を抽出し
た。タンパク質が１時間（フィブロネクチンの場合）または１５分間（ゼラチン
の場合）、表面に吸着するのを許容した。その後、膜および基板のアセンブリを
、緩衝液で３回、リンスした。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む培地の存在下、ピン
セットで表面から膜を除去した。１５分後、皿に新鮮な培地を、その後、細胞懸
濁物を導入した。
【００５２】 吸着ＦＮの免疫蛍光染色 ＦＮでコーティングした基板を、ＰＢＳ緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．４）中の４％（ｖ／ｖ）ＰＦＡに２０分間曝露し、そしてその後、ウサ
ギ抗ヒトフィブロネクチンＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍｌ）の溶液に１時間
浸した。０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００を含むＰＢＳで基板を２回リンスし、そして１００μｌのＴｅｘａｓ Ｒ
ｅｄ（登録商標）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ、５０μｇ／ｍｌ）と接触させて１時間置いた；その後、試料をリ
ンスし、そしてＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）で顕微鏡スライド上に封印した。
【００５３】 実施例３：細胞培養 ａ）増殖および付着 ウシ副腎毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞を、１０％ウシ血
清、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍ
ｌペニシリン、および１ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含
むＤＭＥＭ中のゼラチンでコーティングした細胞培養ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）
上、１０％ＣＯ2下で培養した2。ＭＥＭＰＡＴを用いて調製したパターニング化
基板とインキュベーションする前に、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて、培養プレ
ートから細胞を解離させ、そして１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ（ＢＳＡ／ＤＭＥＭ
）中で洗浄した。細胞の懸濁物（典型的には２５，０００細胞／ｍｌ、２ｍｌ総
体積）を、化学的に定義された培地（１％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍｌ
高密度リポタンパク質、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ塩基性線
維芽細胞増殖因子）中で、基板上に置き、そして１０％ＣＯ2中、３７℃でイン
キュベーションした。
【００５４】 ｂ）細胞の固定および染色 細胞を含む基板を、ＰＦＡで２０分間固定し、そ
してＰＢＳで洗浄した。その後、基板をメタノールで１分間洗浄し、そしてクー
マシーブルー（４０％ｖ／ｖメタノール、１０％ｖ／ｖ酢酸、および５０％ｖ／
ｖ水中、５ｍｇ／ｍｌ）で３０秒間染色し；その後、蒸留水でリンスし、そして
空気乾燥した。
【００５５】 細胞伸展を研究するのに用いる方法 ＢＳＡコーティング膜の穴によって画定
されるゼラチンまたはＦＮのパターンに、細胞が付着するのを許容する。７−２
４時間後、膜、基板、および付着細胞によって定義されるアセンブリを、ＰＢＳ
緩衝液で３回リンスし、溶液からＢＳＡを除去し、そしてアセンブリをその後、
ゼラチンのＰＢＳ溶液（１．５％ｗ／ｖ）に浸した。ピンセットで膜を表面から
穏やかに剥がし、そして基板を１５分間インキュベーションし、膜によって保護
された表面領域上にゼラチンを吸着させる。その後、基板を培地（ＤＭＥＭ）で
１回リンスし、その後、インキュベーターにおよそ４時間置いて、基板の、先に
保護した領域上に細胞が伸展するのを許容した。
【００５６】 細胞への損傷の性質決定 付着細胞を提示する基板から、膜を穏やかに除去し
た。付着細胞を、培地中のヨウ化プロピディウム（１０μｇ／ｍｌ）の溶液で１
５分間インキュベーションした。試料を３７℃の培地で２回リンスした直後に、
蛍光顕微鏡で膜を画像化した。ヨウ化プロピディウムの蛍光強度は、２時間の経
過に渡り、細胞から色素が拡散するにつれ、減少した；培地へのこの拡散はまた
、顕微鏡写真で得られるコントラストも減少させた。
【００５７】 顕微鏡観察 ａ）位相差および蛍光顕微鏡観察は、３５ｍｍカメラを備えたＮ
ｉｋｏｎ Ａｘｉｏｐｈｏｔで行った。現像したネガまたはスライドを、Ｎｉｋ
ｏｎ ＬＳ−４００スライドスキャナーでデジタル形式にスキャンした。全画像
上に均一に操作を行うことによってのみ、画像をプロセシングした；典型的には
、色画像を白黒に変換し、そしてコントラストを増進して、学術誌に印刷する図
の版で、細胞構造の細かい特徴が現れることを確実にした。
【００５８】 ｂ）ＳＥＭ顕微鏡写真は、１５ｋｅＶで操作されるＪＥＯＬ ＪＳＭ−６４０
０走査型電子顕微鏡上で得た。 実施例４：細胞接着阻害剤での非プレコーティングに対するプレコーティング マスキング系の比較 図５Ａおよび５Ｄは、異なるタンパク質での膜のコーティングの結果を示す光
学顕微鏡写真の写真複写を示す。この過程は、細胞が基板および膜、または基板
のみに付着しているかどうか、決定するのを補助する。図５Ａは、マスキング系
の細胞接着阻害剤コーティングの使用を伴わず、上述のようにＦＮでコーティン
グした膜および基板の全アセンブリ上に付着した細胞を示す。図５Ｂは、ＢＳＡ
でプレコーティングした膜を用いて、細胞が、ＦＮでコーティングした基板表面
に選択的に接着することを示す（図２を参照されたい）。細胞は膜に接着しない
。
【００５９】 実施例５ 図６Ａは、上述のマスキング系技術の後、真空の適用および放出を用いて、細
菌学的ペトリ皿上に生成されたＦＮのパターンを示す蛍光画像の写真複写を示す
。１時間のインキュベーション、その後、３回のリンス工程の後、ＢＳＡを含む
培地または他のＢＳＡ含有溶液いずれか（実施例１を参照されたい）の存在下で
、基板から膜を除去する。したがって、膜は、タンパク質吸着後で、そして細胞
付着前に、除去する。この方法は、細胞のパターンを提供し、一方、残りの表面
を、別の剤、例えばタンパク質の吸着のため、曝露する（図７を参照されたい）
。表面上のＦＮパターンを、蛍光顕微鏡観察において、ＦＮを明るい灰色に見え
るようにする蛍光標識抗体とインキュベーションする。図６Ｂは、図６Ａと同じ
方法で調製した、直径５０μｍのＦＮの円形島に接着した細胞のパターンを示す
。
【００６０】 実施例６ 図７Ａおよび７Ｂは、実施例２の技術を用いて生成したＦＮの島を提示する細
菌学的ペトリ皿上にパターニングされた細胞の光学顕微鏡写真の写真複写を示す
。実施例２に記載するように、膜をＢＳＡでコーティングし、そしてその後、清
浄なペトリ皿上に置き、そしてＦＮ溶液（ＰＢＳ中５０ｍｇ／ｍｌ）に曝露する
。膜および基板は、細胞懸濁物で２４時間覆う。膜を除去し、そして細胞を固定
し、そして核および細胞骨格の部分を示すため染色する。パターニングの効率は
、ＭＥＭＰＡＴ（図６を参照されたい）で達成されたものに匹敵する。図７Ａは
、直径１００μｍの円形島上にパターニングされた細胞を示す。図７Ｂは、１０
０μｍの辺を持つ正方形島上にパターニングされた細胞を示す。
【００６１】 実施例７ 図８は、プレコーティングなしに対して、膜除去中、細胞膜への損傷を避ける
ため、ＢＳＡでプレコーティングした膜の結果を示す。膜は、基板表面と一致し
た接触に置き、そして膜および基板表面は、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーテ
ィングする。その後、ＢＣＥ細胞の懸濁物をこうした表面と接触させて置き、そ
して膜を除去する。細胞は、基板に特異的に接着するか、または基板および膜に
接着する。培養２４時間後、両方の種類の試料から膜を除去し、そして基板表面
に付着したままである細胞を、培地に溶解したヨウ化プロピディウム（１０μｇ
／ｍｌ）と１５分間インキュベーションする；この蛍光剤は、損傷細胞の膜のみ
を貫通する。試料は、培地でリンスした後、画像化する。
【００６２】 図８の左側の顕微鏡写真は、位相差顕微鏡観察によって得る。図８の右側の顕
微鏡写真は、蛍光顕微鏡観察によって得る。蛍光顕微鏡写真のため、膜を除去し
た後、細胞をヨウ化プロピディウムとインキュベーションする。
【００６３】 図８Ａおよび８Ｃは、実施例２の方法を用いてＢＳＡでプレコーティングした
膜を通じて、基板上にパターニングしたＢＣＥ細胞を示す。膜を除去した後、細
胞をヨウ化プロピディウムとインキュベーションした。図８Ａは、２５０μｍの
直径を有するフィーチャーのパターンを示し、一方、図８Ｃは、１００μｍの直
径のフィーチャーを有するパターンを示す。対応する蛍光顕微鏡写真は、蛍光色
素を内部に取り入れた細胞がないことを示し、細胞膜が損傷されなかったことを
示す。
【００６４】 図８Ｂおよび８Ｄは、実施例１に記載するように、膜をＢＳＡでプレコーティ
ングしなかった場合、フィブロネクチンでコーティングした膜および基板の結果
を示す。図８Ｂは、直径２５０μｍのフィーチャーを有するパターンを示し、一
方、図８Ｄは、直径１００μｍのフィーチャーを有するパターンを示す。図８Ｂ
および８Ｄにおいて、膜を除去すると、細胞のパターン明示が劣っていることが
示される。多くの接着細胞は、対応する蛍光顕微鏡写真において、損傷されてい
るように見える。
【００６５】 図８Ｅは、膜表面が付着細胞に覆われている場所で、表面から膜を除去した後
の、図８Ｂで用いた膜の表面を示す。多くの細胞は、穴の壁にも接着する。膜の
蛍光顕微鏡写真によって、穴に付着した細胞の多くは、損傷した膜を示すことが
明らかになった。
【００６６】 実施例８ 本実施例は、本発明の技術が、細胞伸展の研究を許容する証明を提供する。実
施例２に記載するように、ＢＳＡコーティング膜を用いて、細胞をペトリ皿上に
パターニングする。細胞が膜チャネルによって曝露される全領域を覆うまで、６
−２０時間、膜と一致した接触で、細胞が基板上に伸展するのを許容した。ゼラ
チン溶液（すべてのＢＳＡを含まない）の存在下で、基板から膜を除去し、そし
て２０分間インキュベーションした。この方法は、先に、接着タンパク質層を含
む膜によって覆われていた、基板領域をコーティングする。ゼラチン溶液を培地
で置き換えた後、細胞をインキュベーションした。７時間から１１時間の期間に
渡る多様な間隔で、そして実験の開始からの各々示される時点で、１つの試料を
固定し、そして染色する。図９Ａ−Ｄは、全試料の典型である領域を示す、走査
型電子顕微鏡写真画像の写真複写を示す。図９Ａは、細胞の分離したパターンを
示す。細胞が図９Ｂおよび９Ｃに示すように伸展するのを許容するにつれ、最終
的には、細胞は、図９Ｄに示すように、基板の全部分上に伸展する。
【００６７】 当業者は、本明細書に列挙するすべてのパラメーターが、例であることを意味
され、そして実際のパラメーターは、本発明の方法および装置を用いる特定の適
用に応じるであろうことを容易に認識するであろう。したがって、前述の態様が
例としてのみ提示され、そして付随する請求項およびその同等物の範囲内で、本
発明は、具体的に記載するのと別の方式で、実施可能であることが理解されるも
のとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明にしたがった製品表面上に細胞をパターニングす
る、リフトオフ膜（マスキング系）パターニングの模式図を示す。
【図２】 図２は、本発明にしたがった、プレコーティングしたマスキング
系を伴うリフトオフ膜パターニングの模式図を示す。
【図３】 図３は、本発明で使用するためのマスキング系製造の模式図を示
す。
【図４】 図４は、約１００μｍの直径を有する穴として成形されたチャネ
ルを有する、本発明に使用するためのマスキング系の走査型電子顕微鏡写真の写
真複写を示す。
【図５】 図５Ａは、基板を細胞接着タンパク質で完全にコーティングし、
その後、全アセンブリ上に細胞を添加した比較結果を示す、蛍光顕微鏡写真の写
真複写を示す。 図５Ｂは、基板表面に選択的に接着した細胞の蛍光顕微鏡写真の写真複写を示
す。
【図６】 図６Ａは、本発明の方法において、マスキング系を剥がした後の
フィブロネクチンのパターンを示す蛍光顕微鏡写真の写真複写を示す。 図６Ｂは、図６Ａのフィブロネクチン円形島に接着した細胞のパターンを示す
蛍光顕微鏡写真の写真複写を示す。
【図７】 図７Ａは、本発明にしたがった、約１００μｍの直径を有する円
形島上にパターニングした細胞の光学顕微鏡写真の写真複写を示す。 図７Ｂは、本発明にしたがった、約１００μｍの辺の長さを有する正方形島上
にパターニングした細胞の光学顕微鏡写真の写真複写を示す。
【図８】 図８Ａは、本発明の方法において、２５０μｍの直径を有するフ
ィーチャーに関する、ＢＳＡプレコーティング膜を用いてパターニングした細胞
の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真の写真複写を示す。 図８Ｂは、２５０μｍの直径を有するフィーチャーに関する、ＢＳＡプレコー
ティング膜を用いずにパターニングした細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微
鏡写真の写真複写を示す。 図８Ｃは、１００μｍの直径を有するフィーチャーに関する、ＢＳＡプレコー
ティング膜でパターニングした細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真を
示す。 図８Ｄは、１００μｍの直径を有するフィーチャーに関する、ＢＳＡプレコー
ティング膜を用いずにパターニングした細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微
鏡写真を示す。 図８Ｅは、図８Ｂの方法から除去した膜表面の、付着した細胞を示す、位相差
顕微鏡写真を示す。
【図９】 図９Ａ−Ｄは、（ａ）７ｈ、（ｂ）８．２ｈ、（ｃ）９．５ｈ、
および（ｄ）１１ｈ後の細胞伸展の結果を示す走査型電子顕微鏡写真の写真複写
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ケーン，ラヴィ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02140， ケンブリッジ，コグスウェル・アベニュー 32，ナンバー ３ (72)発明者 ダフィー，デーヴィッド・シー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02140， ケンブリッジ，フォレスト・ストリート 18，ナンバー ４ (72)発明者 ジャックマン，レベッカ・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114， ボストン，グローヴ・ストリート 38，ナ ンバー ２ (72)発明者 ホワイトサイズ，ジョージ・エム アメリカ合衆国マサチューセッツ州02158， ニュートン，グラスミア・ストリート 124 Ｆターム(参考） 2G045 BB11 BB20 CB01 HA14 4B065 AA90X BB19 BB40 BC01 BC41 BC45 CA46 4G075 AA01 AA39 BB05 BB10 CA51 DA02 EB01 EE13 FA01 FA05

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 製品表面の第一の部分を、製品表面と一致して（ｃｏｎｆ
    ｏｒｍａｌ）接触する粘着性マスクを含むマスキング系で遮蔽し； 製品表面の第一の部分への剤の塗布を防ぎながら、マスキング系内のチャネル
    を通じて、製品表面の第二の部分に剤を塗布し；そして 細胞を剤の上に塗布する ことを含む、細胞をパターニングする方法。
  2. 【請求項２】 マスキング系が、第一の表面および向かい側の第二の表面
    を含む柔軟なマスクを含み、そしてチャネルがマスクを通過し、そして第一の表
    面を第二の表面に連結する複数のチャネルの１つである、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 製品表面からマスキング系を除去することをさらに含む、
    請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 剤が細胞接着促進剤である、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 細胞を剤の上に塗布する工程の前に、製品表面からマスキ
    ング系を除去することをさらに含む、請求項２の方法。
  6. 【請求項６】 剤が第一の剤であり、そして方法が、表面の第一の部分に
    第二の剤を添加することをさらに含む、請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 第一の剤が細胞接着促進剤である、請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 第一の剤がタンパク質である、請求項７の方法。
  9. 【請求項９】 タンパク質がフィブロネクチンである、請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 第二の剤が細胞接着阻害剤である、請求項６の方法。
  11. 【請求項１１】 製品表面の第一の部分が第二の部分と近接している、請
    求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 剤が第一の剤であり、そして方法が、遮蔽工程の前に、
    マスキング系の少なくとも部分を第二の剤でプレコーティングすることを含む、
    請求項２の方法。
  13. 【請求項１３】 プレコーティング工程が： マスキング系の第一の表面を基板と接触させ；そして 第二の剤を第二の表面およびマスキング系の複数のチャネル上にコーティング
    し、マスキング系の第一の表面が、第二の剤を含まない ことを含む、請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 遮蔽工程が： 基板からマスキング系を除去し；そして マスキング系の第一の表面を、製品表面の第一の部分と一致して接触させる ことを含む、請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 第一の剤が細胞接着促進剤である、請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 第二の剤が細胞接着阻害剤である、請求項１５の方法。
  17. 【請求項１７】 細胞を第一の剤の上に塗布する前に、製品表面からマス
    キング系を除去することをさらに含む、請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 製品表面からマスキング系を除去することをさらに含む
    、請求項１６の方法。
  19. 【請求項１９】 製品表面の第一の部分に第三の剤を添加することをさら
    に含む、請求項１８の方法。
  20. 【請求項２０】 第一の剤に塗布された細胞が第三の剤の上に伸展するの
    を許容することをさらに含む、請求項１９の方法。
  21. 【請求項２１】 第一の剤が第一の細胞接着促進剤であり、そして第三の
    剤が第二の細胞接着促進剤である、請求項１９の方法。
  22. 【請求項２２】 第三の剤に、第二の種類の細胞を添加することをさらに
    含む、請求項２１の方法。
  23. 【請求項２３】 チャネルが単一の細胞の増殖を調節する寸法（ｄｉｍｅ
    ｎｓｉｏｎ）を有する、請求項１の方法。
  24. 【請求項２４】 製品表面の第一の部分を、製品表面と一致して接触する
    粘着性マスクを含むマスキング系で遮蔽し； 製品表面の第一の部分への細胞接着阻害剤の塗布を防ぎながら、マスキング系
    内のチャネルを通じて、製品表面の第二の部分に細胞接着阻害剤を塗布する ことを含む、細胞をパターニングする方法。
  25. 【請求項２５】 製品表面からマスキング系を除去することをさらに含む
    、請求項２４の方法。
  26. 【請求項２６】 細胞接着促進剤を第二の部分に塗布することをさらに含
    む、請求項２５の方法。
  27. 【請求項２７】 細胞接着促進剤上に細胞を付着させることをさらに含む
    、請求項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 製品表面の第一の部分を、製品表面と一致して接触する
    粘着性マスクを含むマスキング系で遮蔽し； 製品表面の第一の部分への細胞接着促進剤の塗布を防ぎながら、マスキング系
    内のチャネルを通じて、製品表面の第二の部分に細胞接着促進剤を塗布する ことを含む、細胞をパターニングする方法。
  29. 【請求項２９】 製品表面からマスキング系を除去することをさらに含む
    、請求項２８の方法。
  30. 【請求項３０】 製品表面の第一の部分に剤を添加することをさらに含む
    、請求項２９の方法。
  31. 【請求項３１】 剤が細胞接着阻害剤である、請求項３０の方法。
  32. 【請求項３２】 細胞接着促進剤が第一の細胞接着促進剤であり、そして
    剤が第二の細胞接着促進剤である、請求項３０の方法。
  33. 【請求項３３】 第二の細胞接着促進剤上に、第一の種類の細胞を付着さ
    せ、そして第一の細胞接着促進剤上に、第二の種類の細胞を付着させることをさ
    らに含む、請求項３２の方法。
  34. 【請求項３４】 遮蔽工程の前に、マスキング系を細胞接着阻害剤でプレ
    コーティングすることをさらに含む、請求項２８の方法。
  35. 【請求項３５】 第一の種類の細胞の第一のパターンを有する製品を提供
    し；そして 第一のパターンに近接している、製品表面の部分に剤を塗布する ことを含む、細胞をパターニングする方法。
  36. 【請求項３６】 剤が第一の種類の細胞の細胞接着阻害剤である、請求項
    ３５の方法。
  37. 【請求項３７】 剤が第二の種類の細胞の細胞接着促進剤である、請求項
    ３５の方法。
  38. 【請求項３８】 第二の種類の細胞を剤の上に塗布することをさらに含む
    、請求項３７の方法。
  39. 【請求項３９】 提供工程が： マスキング系を製品表面の部分と一致して接触させ；そして マスキング系内のチャネルを通じて、細胞接着促進剤を塗布する ことを含む、請求項３５の方法。
  40. 【請求項４０】 提供工程が、マスキング系を製品表面と一致して接触さ
    せる工程の前に、マスキング系を細胞接着阻害剤でプレコーティングすることを
    さらに含む、請求項３９の方法。
  41. 【請求項４１】 第二の種類の細胞の第二のパターンと近接している第一
    の種類の細胞の第一のパターン を含む、製品。
  42. 【請求項４２】 製品表面の第一の部分をマスキング系で遮蔽し； マスキング系を伴う製品表面の第一の部分への細胞接着促進剤の塗布を防ぎな
    がら、細胞接着促進剤が製品表面の第二の未遮蔽部分に塗布されるのを許容し； 細胞を表面の第二の部分に塗布する ことを含む方法。
  43. 【請求項４３】 表面からマスキング系を除去した後、表面の第二の部分
    に細胞を塗布することを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 表面からマスキング系を除去する前に、表面の第二の部
    分に細胞を塗布することを含む、請求項４２に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 製品表面の第一の部分をポリマー性マスキング系で遮蔽
    し； 製品表面の第一の部分への剤の塗布を防ぎながら、マスキング系内のチャネル
    を通じて、製品表面の第二の部分に剤を塗布し；そして 細胞を剤の上に塗布する ことを含む、細胞をパターニングする方法。
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