WO2023149068A1 - 細胞培養方法及びマスキングシート - Google Patents

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WO2023149068A1
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masking sheet
cells
cell
adhesive layer
culture
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宥佑 笠井
孝浩 大場
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富士フイルム株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the disclosed technology relates to cell culture methods and masking sheets.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Publication No. 2003-527615
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Publication No. 2003-527615
  • a method of patterning cells comprising applying a cell adhesive to a second portion of the article surface through channels in a mask while preventing application of the cell adhesive and applying the cells onto the cell adhesive.
  • Pattern culture technology in which a desired pattern is applied to cells adherently cultured on a culture surface, enables cells or cell aggregates to be compartmentalized into desired shapes and sizes, and cultured or evaluated for each cell compartment unit. do. Compartmentalization makes it possible to quantify or normalize the state of the cells in each compartment, which in turn contributes to the stability of the evaluation system. Simple pattern culture technology is expected to lead to accelerated development in the field of life sciences, such as drug discovery screening and regenerative medicine dealing with adherent cells.
  • Patent Document 1 describes that pattern culture is performed using an adhesive mask.
  • the adhesive mask described in this document is composed of a sufficiently flexible polymeric elastomer to enhance adhesion to the culture surface.
  • a highly flexible mask has a problem in handleability, and is difficult to handle in the working process of pattern culture. For example, when applying a mask to a substrate having a surface that serves as a culture surface, it is not easy to keep the mask free from folds or wrinkles. Furthermore, there is concern about deformation of the pattern due to expansion and contraction of the mask. Thus, the use of highly flexible masks is a factor in lowering productivity in pattern culture.
  • the disclosed technology has been made in view of the above points, and aims to improve productivity in pattern culture by improving the handling of masks used in pattern culture.
  • a cell culture method includes attaching a masking sheet having openings to a culture surface and forming cells or cell aggregates in the exposed portions of the culture surface at the openings.
  • the masking sheet includes an adhesive layer adhered to the culture surface, and a support layer laminated on the adhesive layer and supporting the adhesive layer.
  • a cell culturing method comprises the steps of applying a cell adhesive to a culture surface using a masking sheet as a mask, seeding cells on the culture surface after applying the cell adhesive, and applying the cell adhesive. and peeling off the masking sheet from the culture surface after and before or after seeding the cells.
  • the masking sheet according to the disclosed technology is a masking sheet for patterning cells or cell aggregates formed on a culture surface, comprising an adhesive layer adhered to the culture surface, A support layer supporting the layers and openings through the adhesive layer and support layer corresponding to the pattern of cells or cell clumps.
  • the Young's modulus of the support layer is preferably higher than that of the adhesive layer, preferably 0.2 GPa or more and 200 GPa or less.
  • the Young's modulus of the adhesive layer is preferably 1 MPa or more and 100 MPa or less.
  • the thickness of the support layer is preferably 10 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, and the thickness of the adhesive layer is preferably 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less.
  • the masking sheet may have a plurality of openings of the same size arranged at intervals.
  • the opening may be formed by laser processing.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an example of a configuration of a masking sheet according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line 2-2 in FIG. 1;
  • 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a cell culture method according to an embodiment of technology disclosed herein;
  • FIG. 4 is a micrograph showing a pattern of openings in a masking sheet according to an embodiment of the disclosed technique;
  • 1 is a photomicrograph of fluorescently stained vitronectin according to an embodiment of the disclosed technology.
  • the upper row is a micrograph showing the opening pattern of the masking sheet, the middle row is a micrograph showing the pattern of vitronectin, and the lower row is a micrograph showing the patterned iPS cells.
  • 4 is an appearance photograph of a masking sheet according to another embodiment of the disclosed technology.
  • FIG. 11 is a micrograph of patterned vitronectin according to another embodiment of the disclosed technique;
  • FIG. 4 is a micrograph of patterned iPS cells according to another embodiment of the disclosed technology;
  • FIG. 1 is a perspective view showing an example of a configuration of a masking sheet 10 according to an embodiment of technology disclosed.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view along line 2-2 in FIG.
  • the masking sheet 10 is a sheet-like member used for patterning cells or cell aggregates to be cultured on the culture surface.
  • the masking sheet 10 includes an adhesive layer 11 and a support layer 12.
  • the adhesion layer 11 is a layer adhered to the surface (culture surface) of a substrate (not shown) used for adhesion culture of cells.
  • the adhesive layer 11 preferably has sufficient flexibility to ensure adhesion to the culture surface. Therefore, the Young's modulus of the adhesive layer 11 is preferably 1 MPa or more and 100 MPa or less. Moreover, the thickness of the adhesive layer 11 is preferably 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less. By setting the Young's modulus and thickness of the adhesive layer 11 within the above ranges, it is possible to ensure adhesion to the culture surface.
  • the adhesive layer 11 is preferably made of a material that has corrosion resistance to water, no toxicity to cells, and is suitable for thin film processing. Rubber members such as silicone rubber (VMQ, PVMQ, FVMQ), isoprene rubber (IR), and fluororubber (FKM) can be suitably used as the material of the adhesive layer 11 .
  • Rubber members such as silicone rubber (VMQ, PVMQ, FVMQ), isoprene rubber (IR), and fluororubber (FKM) can be suitably used as the material of the adhesive layer 11 .
  • the support layer 12 is laminated on the adhesive layer 11 .
  • the support layer 12 has a function of supporting the adhesive layer 11 having high flexibility. Therefore, the Young's modulus of the support layer 12 is preferably higher than the Young's modulus of the adhesive layer 11, preferably 0.2 GPa or more and 200 GPa or less. Moreover, the thickness of the support layer 12 is preferably 10 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less. By setting the Young's modulus and thickness of the support layer 12 within the above ranges, the support layer 12 can ensure the rigidity necessary to support the adhesive layer 11 .
  • the support layer 12 is preferably made of a material that has corrosion resistance to water, no toxicity to cells, and is suitable for thin film processing.
  • materials for the support layer 12 include polyimide, PET (polyethylene terephthalate), PC (polycarbonate), PP (polypropylene), PCV (polyvinyl chloride), PVA (polyvinyl alcohol), PE (polyethylene), PS (polystyrene), and A resin member such as hard rubber can be suitably used.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PC polycarbonate
  • PP polypropylene
  • PCV polyvinyl chloride
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PE polyethylene
  • PS polystyrene
  • a resin member such as hard rubber can be suitably used.
  • the material of the support layer 12 it is possible to use aluminum, stainless steel, copper, silver, gold, platinum, titanium, chromium, cobalt, nickel, glass and ceramics.
  • the masking sheet 10 has a plurality of openings 13 penetrating the support layer 12 and the adhesive layer 11 .
  • the number, shape, and size of openings 13 and the spacing between adjacent openings 13 can be determined arbitrarily.
  • Cells or cell aggregates to be subjected to pattern culture are formed on the culture surface with a pattern corresponding to the pattern of the openings 13 of the masking sheet 10 .
  • the masking sheet 10 may have a plurality of openings 13 of the same shape and size arranged at intervals. According to such a pattern of openings 13, cells or cell clusters can be uniformly compartmentalized, and culture or evaluation can be performed for each compartmental unit of cells. In addition, it becomes possible to quantify or normalize the state of cells in each compartment.
  • the opening 13 can be formed by laser processing, for example. That is, the opening 13 is formed by irradiating the sheet in which the adhesive layer 11 and the support layer 12 are laminated with a laser beam. According to laser processing, for example, minute openings 13 on the order of several tens of microns can be formed easily and with high accuracy. Note that the pattern of the openings 13 may be formed by mold molding.
  • FIG. 3A to 3G are diagrams showing an example of a cell culture method for performing pattern culture using the masking sheet 10.
  • FIG. First a substrate 20 and a masking sheet 10 are prepared (FIG. 3A). .
  • the surface of the substrate 20 constitutes the culture surface.
  • a commercially available cell culture dish can be used as the substrate 20 .
  • the masking sheet 10 may be cut into the same shape as the substrate 20 (circular in the example shown in FIG. 3A).
  • the masking sheet 10 is attached to the surface (culture surface) of the substrate 20 (Fig. 3B). Specifically, after the adhesive layer 11 of the masking sheet 10 is brought into contact with the surface (culture surface) of the substrate 20 , a load is applied to the masking sheet 10 to bring the masking sheet 10 into close contact with the substrate 20 .
  • the flexibility of the adhesive layer 11 ensures high adhesion, and the masking sheet 10 can be attached to the substrate 20 without generating air bubbles between the masking sheet 10 and the substrate 20 .
  • the surface (culture surface) of the substrate 20 is exposed at the openings 13 of the masking sheet 10 .
  • the diameter of masking sheet 10 is preferably about the same as the diameter of substrate 20 . As a result, the adhesion area of the cell adhesive 30 and the adhesion area of the cells 40 outside the opening 13 are reduced.
  • the cell adhesive 30 is applied to the surface (culture surface) of the substrate 20 (Fig. 3C). As a result, the cell adhesive 30 adheres to the surface (culture surface) of the substrate 20 exposed at the openings 13 of the masking sheet 10 . As a result, a pattern of the cell adhesive 30 corresponding to the pattern of the openings 13 of the masking sheet 10 is formed on the culture surface.
  • Cell adhesives 30 can be extracellular matrix proteins such as vitronectin, laminin, fibronectin, collagens and gelatins.
  • the masking sheet 10 is peeled off from the culture surface (Fig. 3D).
  • a patterned cell adhesive 30 is maintained on the surface (culture surface) of the substrate 20 .
  • a blocking agent is applied to the surface (culture surface) of the substrate 20 .
  • This treatment is a blocking treatment for inhibiting non-specific cell adhesion in areas other than the area to which the cell adhesive 30 adheres on the culture surface.
  • a blocking agent for example, a bovine serum albumin solution prepared to a predetermined concentration can be used.
  • Cells 40 may be adhesive cells, such as iPS cells (induced pluripotent stem cells), ES cells (Embryonic Stem Cells), stem cells such as mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells, lung cells, gastric cells, and hepatocytes.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells Embryonic Stem Cells
  • stem cells such as mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells, lung cells, gastric cells, and hepatocytes.
  • somatic cells such as kidney cells, intestinal cells, nerve cells, eye cells, vascular endothelial cells, cardiomyocytes and bone cells, lung cancer cells, stomach cancer cells, colon cancer cells, breast cancer cells, leiomyosarcoma cells, fibrosarcoma cells and Cancer cells such as osteosarcoma cells and established cell lines such as HEK293 cells (human embryonic kidney cells) and Vero cells (African green monkey kidney cells) can be used.
  • Cells can be used.
  • Cells derived from animals other than humans specifically, mice, rats, rabbits, pigs, dogs, monkeys, cows, horses, sheep, chickens, etc. may also be used.
  • the masking sheet 10 is peeled off from the culture surface after the cell adhesive 30 is applied and before the cells 40 are seeded. and the masking sheet 10 may be peeled off from the culture surface after the cells 40 are seeded.
  • the masking sheet 10 is used for patterning cells or cell aggregates formed on a culture surface.
  • the masking sheet 10 includes an adhesive layer 11 to be adhered to the culture surface, a support layer 12 laminated on the adhesive layer 11 to support the adhesive layer 11, and a masking sheet 10 that penetrates the adhesive layer 11 and the support layer 12 to form cells or cell aggregates. It has openings 13 corresponding to the pattern of .
  • the cell culture method according to the embodiment of the disclosed technology is a method of attaching the masking sheet 10 to the culture surface and forming cells or cell aggregates on the exposed portions of the masking sheet 10 at the openings 13 of the culture surface.
  • the masking sheet 10 has not only the adhesive layer 11 but also the support layer 12 that supports the adhesive layer 11 . Rigidity is imparted to the masking sheet 10 by providing the support layer 12 to the masking sheet 10 . As a result, compared to a masking sheet composed only of the adhesive layer 11 having high flexibility, the handling property is improved, and the handling in the work process of pattern culture can be facilitated. For example, when the masking sheet 10 is attached to the substrate 20, it is easy to maintain the masking sheet 10 in a state without bending or wrinkling. Furthermore, pattern deformation due to expansion and contraction of the masking sheet 10 can be suppressed. That is, according to the masking sheet 10 and the cell culture method using the masking sheet 10 according to the embodiment of the disclosed technology, the handling of the mask used for pattern culture is improved, and productivity in pattern culture can be increased.
  • a masking sheet was prepared in which the adhesive layer was composed of a silicone-based adhesive and the support layer was composed of Kapton (registered trademark), which is a type of polyimide film. Apertures in the masking sheet were formed by laser machining. Twenty types of masking sheets 10 having different combinations of opening line width (50 ⁇ m, 100 ⁇ m, 200 ⁇ m, 300 ⁇ m or 400 ⁇ m) and opening space width (100 ⁇ m, 200 ⁇ m, 300 ⁇ m or 400 ⁇ m) were prepared (see FIG. 4). . All of the openings are square in shape. The line width is the length of one side of the opening, and the space width is the distance between adjacent openings.
  • Kapton registered trademark
  • a masking sheet was attached to the surface of a commercially available 35 mm dish (manufactured by Falcon). Specifically, after the adhesive layer of the masking sheet was brought into contact with the surface of the dish, the masking sheet was brought into close contact with the surface of the dish by applying a load to the masking sheet.
  • a 2.5ug/ml vitronectin solution which is a cell adhesive
  • a pattern of the cell adhesive was formed on the surface of the dish corresponding to the pattern of the openings of the masking sheet.
  • the masking sheet was removed from the surface of the dish.
  • FIG. 5 is a photomicrograph of fluorescently stained vitronectin. As shown in FIG. 5, it was confirmed that the pattern of vitronectin was maintained on the dish surface for all of the 20 types of patterns described above.
  • a cell suspension of human-derived iPS cells adjusted to a concentration of 0.1 Mcells/mL was seeded in a dish and statically cultured for 24 hours.
  • the dishes were housed in an incubator maintained at 37° C. and 5% CO 2 concentration. After that, the medium was exchanged to remove floating cells. This formed a pattern of cells on the surface of the dish.
  • the lower part of FIG. 6 is a micrograph of iPS cells patterned by pattern culture using a masking sheet with opening line widths of 100 ⁇ m, 200 ⁇ m, and 300 ⁇ m and a space width of 100 ⁇ m.
  • the upper part of FIG. 6 is a micrograph showing the corresponding opening pattern of the masking sheet
  • the middle part of FIG. 6 is a micrograph showing the corresponding pattern of vitronectin. As shown in FIG. 6, it was confirmed that a cell pattern corresponding to the pattern of the openings of the masking sheet was formed.
  • FIG. 7A is an appearance photograph of a masking sheet according to another embodiment of the disclosed technology.
  • FIG. 7B is a micrograph of a cell adhesive, vitronectin, patterned using the masking sheet shown in FIG. 7A.
  • FIG. 7C is a micrograph of iPS cells patterned using the masking sheet shown in FIG. 7A. As shown in FIGS. 7A to 7C, according to the disclosed technique, formation of more complicated cell patterns can be achieved with high productivity.

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Abstract

マスキングシートは、培養面上に形成される細胞又は細胞凝集塊のパターニングを行うために用いられる。マスキングシートは、培養面に接着される接着層と、接着層に積層され、接着層を支持する支持層と、接着層及び支持層を貫通し、細胞又は細胞凝集塊のパターンに対応する開口部を有する。

Description

細胞培養方法及びマスキングシート
　開示の技術は細胞培養方法及びマスキングシートに関する。
　培養面上に培養される細胞にパターニングを施す技術として下記の技術が知られている。例えば、特表２００３－５２７６１５号公報（特許文献１）には、製品表面の第一の部分を、製品表面と一致して接触する粘着性マスクで遮蔽し、製品表面の第一の部分への細胞接着剤の塗布を防ぎながら、マスク内のチャネルを通じて、製品表面の第二の部分に細胞接着剤を塗布し、細胞を細胞接着剤の上に塗布することを含む、細胞をパターニングする方法が記載されている。
　培養面上に接着培養される細胞に所望のパターニングを施すパターン培養技術は、細胞又は細胞凝集塊を所望の形状及びサイズに区画化し、細胞の区画単位ごとに培養又は評価を行うことを可能とする。区画化により、各区画における細胞の状態を定量化又は規格化することが可能となり、ひいては評価系の安定に貢献することが可能となる。簡便なパターン培養技術は、接着細胞を取り扱う創薬スクリーニング及び再生医療などのライフサイエンス分野の加速的な発展にも繋がるものと期待されている。
　上記の特許文献１には、粘着性マスクを用いてパターン培養を行うことが記載されている。この文献に記載される粘着性マスクは、培養面への密着性を高めるために、十分に柔軟なポリマー性エラストマーで構成される。しかしながら、このような高い柔軟性を有するマスクはハンドリング性に問題があり、パターン培養の作業工程における取り扱いが難しい。例えば、培養面となる表面を有する基板にマスクを貼り付ける際に、マスクを、折れ曲がり又は皺のない状態に維持することが容易ではない。更に、マスクの伸縮によるパターンの変形も懸念される。このように、柔軟性の高いマスクの使用は、パターン培養における生産性を低下させる要因となる。
　開示の技術は、上記の点に鑑みてなされたものであり、パターン培養に用いるマスクのハンドリング性を改善することにより、パターン培養における生産性を高めることを目的とする。
　開示の技術に係る細胞培養方法は、開口部を有するマスキングシートを培養面に貼り付け、培養面の開口部において露出した部分に細胞又は細胞凝集塊を形成することを含む。マスキングシートは、培養面に接着される接着層と、接着層に積層され、接着層を支持する支持層と、を含む。
　開示の技術に係る細胞培養方法は、マスキングシートをマスクとして培養面に細胞接着剤を塗布するステップと、細胞接着剤を塗布した後に、培養面に細胞を播種するステップと、細胞接着剤を塗布した後であり、且つ細胞を播種する前又は細胞を播種した後にマスキングシートを培養面から剥離するステップと、を含んでいてもよい。
　開示の技術に係るマスキングシートは、培養面上に形成される細胞又は細胞凝集塊のパターニングを行うためのマスキングシートであって、培養面に接着される接着層と、接着層に積層され、接着層を支持する支持層と、接着層及び支持層を貫通し、細胞又は細胞凝集塊のパターンに対応する開口部を有する。
　支持層のヤング率は、接着層のヤング率よりも高いことが好ましく、０．２ＧＰａ以上２００ＧＰａ以下であることが好ましい。接着層のヤング率は、１ＭＰａ以上１００ＭＰａ以下であることが好ましい。
　支持層の厚さが１０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましく、接着層の厚さが１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。
　マスキングシートは、間隙を隔てて配列された互いに同じサイズの複数の開口部を有していてもよい。開口部はレーザ加工によって形成されたものであってもよい。
　開示の技術によれば、パターン培養に用いるマスクのハンドリング性を改善し、パターン培養における生産性を高めることが可能となる。
開示の技術の実施形態に係るマスキングシートの構成の一例を示す斜視図である。 図１における２－２線に沿った断面図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。 開示の技術の実施例に係るマスキングシート開口部のパターンを示す顕微鏡写真である。 開示の技術の実施例に係る蛍光染色されたビトロネクチンの顕微鏡写真である。 上段はマスキングシートの開口部パターンを示す顕微鏡写真であり、中段はビトロネクチンのパターンを示す顕微鏡写真であり、下段はパターニングされたｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。 開示の技術の他の実施例に係るマスキングシートの外観写真である。 開示の技術の他の実施例に係るパターニングされたビトロネクチンの顕微鏡写真である。 開示の技術の他の実施例に係るパターニングされたｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。
　以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は省略する。
　図１は、開示の技術の実施形態に係るマスキングシート１０の構成の一例を示す斜視図である。図２は、図１における２－２線に沿った断面図である。マスキングシート１０は
、培養面上に培養される細胞又は細胞凝集塊のパターニングを行うために用いられるシート状の部材である。
　マスキングシート１０は、接着層１１及び支持層１２を含んで構成されている。接着層１１は、細胞の接着培養に用いられる基板（図示せず）の表面（培養面）に接着される層である。接着層１１は、培養面に対する密着性を確保するために十分な柔軟性を有していることが好ましい。このため、接着層１１のヤング率は１ＭＰａ以上１００ＭＰａ以下であることが好ましい。また、接着層１１の厚さは、１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。接着層１１のヤング率及び厚さが上記の範囲とされることで、培養面に対する密着性を確保することが可能となる。
　また、接着層１１は、水に対する耐食性を有し、細胞に対する毒性がなく、薄膜加工に適した材料によって構成されることが好ましい。接着層１１の材料として、例えばシリコーンゴム（ＶＭＱ、ＰＶＭＱ、ＦＶＭＱ）、イソプレンゴム（ＩＲ）及びフッ素ゴム（ＦＫＭ）などのゴム部材を好適に用いることが可能である。
　支持層１２は、接着層１１に積層されている。支持層１２は、高い柔軟性を有する接着層１１を支持する機能を有する。従って、支持層１２のヤング率は、接着層１１のヤング率よりも高いことが好ましく、０．２ＧＰａ以上２００ＧＰａ以下であることが好ましい。また、支持層１２の厚さは、１０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。支持層１２のヤング率及び厚さが上記の範囲とされることで、支持層１２において、接着層１１を支持するために必要な剛性を確保することが可能となる。
　また、支持層１２は、水に対する耐食性を有し、細胞に対する毒性がなく、薄膜加工に適した材料によって構成されることが好ましい。支持層１２の材料として、例えばポリイミド、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタラート）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＣＶ（ポリ塩化ビニル）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＳ（ポリスチレン）及び硬質ゴムなどの樹脂部材を好適に用いることができる。また、支持層１２の材料として、アルミニウム、ステンレス、銅、銀、金、プラチナ、チタン、クロム、コバルト、ニッケル、ガラス及びセラミックスを用いることも可能である。
　マスキングシート１０は、支持層１２及び接着層１１を貫通する複数の開口部１３を有する。開口部１３の数、形状、サイズ及び隣接する開口部１３間の間隔は、任意に定めることが可能である。パターン培養の対象となる細胞又は細胞凝集塊は、マスキングシート１０の開口部１３のパターンに対応したパターンを有して培養面上に形成されることとなる。マスキングシート１０は、間隙を隔てて配列された互いに同じ形状及びサイズの複数の開口部１３を有していてもよい。このような開口部１３のパターンによれば、細胞又は細胞塊を均一に区画化し、細胞の区画単位ごとに、培養又は評価を行うことが可能となる。また、各区画における細胞の状態を定量化又は規格化することが可能となる。
　図１及び図２には、互いに同じサイズを有する複数の矩形の開口部１３がマトリクス状に配置された構成が例示されている。開口部１３は、例えばレーザ加工によって形成することが可能である。すなわち、接着層１１及び支持層１２を積層したシートにレーザ光を照射することにより開口部１３が形成される。レーザ加工によれば、例えば数十ミクロンオーダの微細な開口部１３を容易且つ高精度で形成することができる。なお、開口部１３のパターンを鋳型成型によって形成してもよい。
　図３Ａ～図３Ｇは、マスキングシート１０を用いてパターン培養を行う細胞培養方法の一例を示す図である。初めに、基板２０及びマスキングシート１０を用意する（図３Ａ）
。基板２０の表面が培養面を構成する。基板２０として、市販の細胞培養ディッシュを用いることが可能である。マスキングシート１０は、基板２０の形状（図３Ａに示す例では円形）と同じ形状にカットされていてもよい。
　次に、マスキングシート１０を基板２０の表面（培養面）に貼り付ける（図３Ｂ）。具体的には、マスキングシート１０の接着層１１を基板２０の表面（培養面）に接触させた後、マスキングシート１０に荷重を加えることにより、マスキングシート１０を基板２０に密着させる。接着層１１の柔軟性により高い密着性が確保され、マスキングシート１０は、基板２０との間に気泡を生じることなく基板２０に貼り付けられる。マスキングシート１０の開口部１３において基板２０の表面（培養面）が露出する。マスキングシート１０の直径は基板２０の直径と同程度であることが好ましい。これにより、開口部１３以外での細胞接着剤３０の付着領域および細胞４０の接着領域が低減される。
　次に、マスキングシート１０をマスクとして、基板２０の表面（培養面）に細胞接着剤３０を塗布する（図３Ｃ）。これにより、基板２０の表面（培養面）の、マスキングシート１０の開口部１３において露出した部分に細胞接着剤３０が付着する。これにより、マスキングシート１０の開口部１３のパターンに対応した細胞接着剤３０のパターンが培養面上に形成される。細胞接着剤３０として、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン類およびゼラチン類等の細胞外マトリックスタンパク質を用いることが可能である。
　次に、細胞接着剤３０をリン酸緩衝液に置換した後、マスキングシート１０を培養面から剥離する（図３Ｄ）。基板２０の表面（培養面）にはパターニングされた細胞接着剤３０が維持される。次に、基板２０の表面（培養面）にブロッキング剤を塗布する。この処理は、培養面の細胞接着剤３０が付着した領域以外の領域における、非特異的細胞接着を阻害するためのブロッキング処理である。ブロッキング剤として、例えば所定濃度に調製されたウシ血清アルブミン溶液を用いることが可能である。
　次に、基板２０の表面（培養面）に所定の濃度に調整された細胞４０を播種する（図３Ｅ）。細胞４０は、接着性細胞であればよく、例えば、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）、ＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell）、間葉系幹細胞及び造血幹細胞等の
幹細胞、肺細胞、胃細胞、肝細胞、腎細胞、腸細胞、神経細胞、眼細胞、血管内皮細胞、心筋細胞及び骨細胞等の体細胞、肺がん細胞、胃がん細胞、大腸がん細胞、乳がん細胞、平滑筋肉腫細胞、線維肉腫細胞及び骨肉腫細胞等のがん細胞、並びにＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞）及びＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）等の株化された細胞を用いることができ、典型的には、ヒト由来のｉＰＳ細胞を用いることが可能である。また、ヒト以外の動物（具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリなど）由来の細胞を用いてもよい。
　その後、細胞４０の静置培養を行う。培養期間中、細胞４０が播種された基板２０は、適切な温度及びＣＯ２濃度に維持されたインキュベータ内に収容される。細胞４０は、基板２０の表面（培養面）の、細胞接着剤３０が付着した領域に接着する（図３Ｆ）。
　所定のタイミングで培地交換を行いながら培養を継続する。これにより、細胞４０は、基板２０の表面（培養面）の、細胞接着剤３０が付着した領域内で増殖する。その結果、マスキングシート１０の開口部１３のパターンに対応したパターンの細胞又は細胞凝集塊（コロニー）を得ることができる（図３Ｇ）。なお、本実施形態においては、細胞接着剤３０を塗布した後であり、且つ細胞４０を播種する前にマスキングシート１０を培養面から剥離する場合を例示したが、細胞接着剤３０を塗布した後であり、且つ細胞４０を播種した後にマスキングシート１０を培養面から剥離してもよい。
　以上のように、開示の技術の実施形態に係るマスキングシート１０は、培養面上に形成される細胞又は細胞凝集塊のパターニングを行うために用いられる。マスキングシート１０は、培養面に接着される接着層１１と、接着層１１に積層され、接着層１１を支持する支持層１２と、接着層１１及び支持層１２を貫通し、細胞又は細胞凝集塊のパターンに対応する開口部１３を有する。また、開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法は、マスキングシート１０を培養面に貼り付け、培養面の、マスキングシート１０の開口部１３において露出した部分に細胞又は細胞凝集塊を形成する方法であって、マスキングシート１０をマスクとして培養面に細胞接着剤３０を塗布するステップと、細胞接着剤３０を塗布した後に、培養面に細胞を播種するステップと、細胞接着剤３０を塗布した後であり、且つ細胞を播種する前又は細胞を播種した後にマスキングシート１０を培養面から剥離するステップと、を含む。
　マスキングシート１０は、接着層１１のみならず、接着層１１を支持する支持層１２を有する。マスキングシート１０が支持層１２を備えることで、マスキングシート１０に剛性が付与される。これにより、高い柔軟性を有する接着層１１のみで構成されたマスキングシートと比較して、ハンドリング性が改善され、パターン培養の作業工程における取り扱いを容易にすることができる。例えば、基板２０にマスキングシート１０を貼り付ける際に、マスキングシート１０を折れ曲がり又は皺のない状態に維持することが容易である。更に、マスキングシート１０の伸縮によるパターンの変形も抑制することができる。すなわち、開示の技術の実施形態に係るマスキングシート１０及びこれを用いた細胞培養方法によれば、パターン培養に用いるマスクのハンドリング性が改善され、パターン培養における生産性を高めることが可能となる。
[実施例]
　以下、開示の技術を実施例によりさらに詳細に説明するが、開示の技術は以下の実施例に限定されない。
＜マスキングシートの作製＞
　粘着層がシリコーン系粘着剤によって構成され、支持層が、ポリイミドフィルムの一種であるカプトン（登録商標）によって構成されたマスキングシートを作成した。マスキングシートの開口部を、レーザ加工によって形成した。開口部のライン幅（５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ又は４００μｍ）及び開口部のスペース幅（１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ又は４００μ）の組み合わせが互いに異なる２０種類のマスキングシート１０を作成した（図４参照）。開口部の形状はいずれも正方形である。なお、ライン幅は開口部の一辺の長さであり、スペース幅は互いに隣接する開口部間の間隔である。
＜パターン培養＞
　市販の３５ｍｍディッシュ（Falcon製）の表面にマスキングシートを貼り付けた。具体的には、マスキングシートの接着層をディッシュの表面に接触させた後、マスキングシートに荷重を加えることにより、マスキングシートをディッシュの表面に密着させた。
　次に、マスキングシートをマスクとして、ディッシュの表面に細胞接着剤である濃度2.5ug/mlのビトロネクチン溶液を塗布し、１時間静置した。これにより、ディッシュの表面に、マスキングシートの開口部のパターンに対応した細胞接着剤のパターンが形成された。
　次に、ビトロネクチン溶液をリン酸緩衝液に置換した後、マスキングシートをディッシュの表面から剥離した。
　次に、ディッシュの表面にブロッキング剤である３％ウシ血清アルブミン溶液を塗布した。この処理は、培養面の細胞接着剤が付着した領域以外の領域における、非特異的細胞接着を阻害するためのブロッキング処理である。処理時間を３０分とした。その後、ブロッキング剤をリン酸緩衝液に置換し、リン酸緩衝液のアスピレーションを行った。この段階において、ディッシュの表面に細胞接着剤であるビトロネクチンのパターンが維持されていることを確認するために、ビトロネクチンの蛍光観察を行った。図５は、蛍光染色されたビトロネクチンの顕微鏡写真である。図５に示すように、上記した２０種類全てのパターンについて、ディッシュの表面においてビトロネクチンのパターンが維持されていることが確認された。
　次に、濃度を0.1Mcells/mLに調整したヒト由来のｉＰＳ細胞の細胞懸濁液をディッシュに播種し、２４時間の静置培養を行った。培養期間中、ディッシュを３７℃、ＣＯ２濃度５％に維持されたインキュベータ内に収容した。その後、培地交換を行い、浮遊している細胞を除去した。これにより、ディッシュの表面に細胞のパターンが形成された。
　図６の下段は、開口部のライン幅を１００μｍ、２００μｍ及び３００μｍとし、スペース幅を１００μｍとしたマスキングシートを用いたパターン培養によってパターニングされたｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。図６の上段は、対応するマスキングシートの開口部パターンを示す顕微鏡写真であり、図６の中段は、対応するビトロネクチンのパターンを示す顕微鏡写真である。図６に示すように、マスキングシートの開口部のパターンに対応した細胞パターンが形成されていることが確認された。
　図７Ａは、開示の技術の他の実施例に係るマスキングシートの外観写真である。図７Ｂは、図７Ａに示すマスキングシートを用いてパターニングされた細胞接着剤であるビトロネクチンの顕微鏡写真である。図７Ｃは、図７Ａに示すマスキングシートを用いてパターニングされたｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。図７Ａ～図７Ｃに示すように、開示の技術によれば、より複雑な細胞パターンの形成を高い生産性で実現することが可能である。
　日本出願特願２０２２－０１５６７９号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (17)

  1. 　開口部を有するマスキングシートを培養面に貼り付け、前記培養面の前記開口部において露出した部分に細胞又は細胞凝集塊を形成する細胞培養方法であって、
    　前記マスキングシートが、
    　前記培養面に接着される接着層と、
    　前記接着層に積層され、前記接着層を支持する支持層と、
    　を含む
    　細胞培養方法。
  2. 　前記支持層のヤング率は、前記接着層のヤング率よりも高い
    　請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 　前記支持層のヤング率は、０．２ＧＰａ以上２００ＧＰａ以下である
    　請求項１又は請求項２に記載の細胞培養方法。
  4. 　前記接着層のヤング率は、１ＭＰａ以上１００ＭＰａ以下である
    　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  5. 　前記支持層の厚さが１０μｍ以上１０００μｍ以下である
    　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  6. 　前記接着層の厚さが１μｍ以上１００μｍ以下である
    　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  7. 　前記マスキングシートは、間隙を隔てて配列された互いに同じサイズの複数の開口部を有する
    　請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  8. 　前記開口部はレーザ加工によって形成されたものである
    　請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  9. 　前記マスキングシートをマスクとして前記培養面に細胞接着剤を塗布するステップと、
    　前記細胞接着剤を塗布した後に、前記培養面に細胞を播種するステップと、
    　前記細胞接着剤を塗布した後であり、且つ前記細胞を播種する前又は前記細胞を播種した後に前記マスキングシートを前記培養面から剥離するステップと、
    　を含む
    　請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  10. 　培養面上に形成される細胞又は細胞凝集塊のパターニングを行うためのマスキングシートであって、
    　前記培養面に接着される接着層と、
    　前記接着層に積層され、前記接着層を支持する支持層と、
    　前記接着層及び前記支持層を貫通し、細胞又は細胞凝集塊のパターンに対応する開口部を有する
    　マスキングシート。
  11. 　前記支持層のヤング率は、前記接着層のヤング率よりも高い
    　請求項１０に記載のマスキングシート。
  12. 　前記支持層のヤング率は、０．２ＧＰａ以上２００ＧＰａ以下である
    　請求項１０又は請求項１１に記載のマスキングシート。
  13. 　前記接着層のヤング率は、１ＭＰａ以上１００ＭＰａ以下である
    　請求項１０から請求項１２のいずれか１項に記載のマスキングシート。
  14. 　前記支持層の厚さが１０μｍ以上１０００μｍ以下である
    　請求項１０から請求項１３のいずれか１項に記載のマスキングシート。
  15. 　前記接着層の厚さが１μｍ以上１００μｍ以下である
    　請求項１０から請求項１４のいずれか１項に記載のマスキングシート。
  16. 　間隙を隔てて配列された互いに同じサイズの複数の開口部を有する
    　請求項１０から請求項１５のいずれか１項に記載のマスキングシート。
  17. 　前記開口部はレーザ加工によって形成されたものである
    　請求項１０から請求項１６のいずれか１項に記載のマスキングシート。
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