JP2004267167A

JP2004267167A - 老化上皮幹細胞の取得方法

Info

Publication number: JP2004267167A
Application number: JP2003065920A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Yasumoto; 茂安本
Original assignee: Kanagawa Prefecture
Current assignee: Kanagawa Prefecture
Priority date: 2003-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2004-09-30

Abstract

【課題】長期生存細胞の中でも特に発がんとの関連性が深いと予測される細胞を取得する手段を提供する。
【解決手段】以下の（１）〜（３）の工程を含む老化上皮幹細胞の取得方法。
（１）上皮細胞の懸濁液を、細胞外接着物質で被覆された培養容器中に滴下し、上皮細胞を培養容器に付着させる工程
（２）上皮細胞の付着した培養容器内に培地を加え、上皮細胞を培養する工程
（３）培養により産生する分化ケラチノサイトが死滅した後、残存している細胞を採取する工程
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、老化上皮幹細胞及び不死化老化上皮幹細胞の取得方法、並びに前記方法により取得された細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のＣＴやＮＭＲなどの機器の進歩により微少初期がんの発見が可能になり、がんの早期発見率は向上している。しかしながら、がんが顕在化するまでには長期の潜伏期間（通常１５〜２０年）が存在し、この間のがん細胞（前がん細胞）を特定し、その悪性化の指標を同定すればがんを阻止または予防する手段が提供される。
【０００３】
がん細胞の検出方法としては、抗体によるがん関連抗原の検出方法等がすでに利用されている。しかし、これらの方法は、がんに対する感度および特異性が必ずしも高くないという問題がある。例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）やα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）などががんのマーカーとして知られているが、いずれも限定されたがんで６割程度の疾患感度しかなく、がん以外の疾患でも非特異的に陽性を呈する等の問題がある。また疾患関連性遺伝子においても限られた症例で検出されるだけで普遍的ながんを検出するマーカーには至っていない。
【０００４】
一方、幹細胞は発生過程における形態形成や成体における各組織、臓器の恒常性、生殖細胞の維持に働く一群の細胞であり、長年にわたる多くの科学者の研究により、成体哺乳類動物の造血系、皮膚、腸管系等に存在し、血液、皮膚、腸管粘膜の再生に寄与していることが知られている。この幹細胞は、複数の違った種類の細胞に分化する多分化能および対称的あるいは非対称的な分裂を行い新たな幹細胞を生み出す自己再生能を持ち合わせており、通常は組織の特定の場所に位置し、ごくゆっくり増殖しているかあるいは細胞分裂休止状態にあるが、組織の再生維持に関与する特異的な増殖刺激や創傷、炎症などによる物理科学的刺激などの特定条件下では素早く増殖を誘導することができる。
【０００５】
本発明者らはこのような幹細胞を含む長期生存細胞には、発がんの起源細胞を含むことを提唱し、さらに長期生存細胞は低親和性神経成長因子受容体（以下、これを「ＮＧＦＲ^ｐ７５」と称することがある。）、インテグリンβ４あるいはｂｃｌ−２の発現を指標として同定できることを開示している（特開２０００−４９００号公報）。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−４９００号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、長期生存細胞の中でも特に発がんとの関連性が深いと予測される細胞を取得する手段を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上皮組織中の細胞群からＩＶ型コラーゲンに高い親和性を有する細胞群を至適濃度０．１〜０．５ｍＭのＣａ^２＋、牛脳下垂体抽出物または塩基性ＦＧＦ、牛胎児血清０．５％以下の存在下で長期間培養すると、１）明確な細胞死を起こさず、２）分裂を促す増殖因子にも反応せず、３）テロメアが短鎖化している細胞（老化上皮幹細胞）を分離できることを見出した。また、ウィルス腫瘍遺伝子を導入した上皮細胞を長期間培養すると、テロメレースが活性化しており、かつ他の細胞に比べテロメアが短い（但し、その後テロメアは長鎖化する場合がある）細胞（不死化老化上皮幹細胞）が得られることを見出した。本発明は、以上の知見から完成されたものである。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（３）の工程を含む老化上皮幹細胞の取得方法である。
（１）上皮細胞の懸濁液を、細胞外接着物質で被覆された培養容器中に滴下し、上皮細胞を培養容器に付着させる工程
（２）上皮細胞の付着した培養容器内に培地を加え、上皮細胞を培養する工程
（３）培養により産生する分化ケラチノサイトが死滅した後、残存している細胞を採取する工程
また、本発明は、上記の方法により取得された老化上皮幹細胞である。
【００１０】
更に、本発明は、以下の（１）〜（３）の工程を含む不死化老化上皮幹細胞の取得方法である。
（１）上皮細胞の懸濁液を、細胞外接着物質で被覆された培養容器中に滴下し、ヒト上皮細胞を培養容器に付着させる工程
（２）上皮細胞の付着した培養容器内に培地を加え、上皮細胞を培養する工程
（３）上皮細胞にウイルス腫瘍遺伝子を導入した後、細胞集団倍加数が９０以上の細胞を分離する工程。
（４）テロメレース活性を有する細胞を選択する工程
更に、本発明は、上記の方法により取得された不死化老化上皮幹細胞である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の老化上皮幹細胞は、以下の（Ａ−１）〜（Ａ−３）の工程により取得される。
【００１３】
工程（Ａ−１）では、上皮細胞の懸濁液を、細胞外接着物質で被覆された培養容器中に滴下し、上皮細胞を培養容器に付着させる。
【００１４】
上皮細胞としては、ヒト表皮角化細胞、ヒト子宮上皮細胞、ヒト食道上皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、ヒト角膜上皮細胞、ヒト血管内皮細胞、ヒト神経細胞などを例示することができる。これらの上皮細胞は、常法に従って採取することができる。
【００１５】
懸濁液中の細胞密度は一定の密度を維持するのがよく、１×１０^２〜１×１０^４個／μｌとするのが好ましい。細胞密度が１×１０^２個／μｌ未満では、幹細胞が含まれない可能性が大きく細胞同士の相互作用も弱くなる。但し、純化した幹細胞を用いる場合は１個／μｌの培養も可能である。また、逆に１×１０^４個／μｌを超えると、細胞密度が高くなり過ぎ細胞の接着過程で増殖活性の高い細胞の基質への接着が阻害されることが起こり、いずれの場合も良好な上皮培養シートが形成され難く培養効率が低下する。
【００１６】
細胞外接着物質としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン等を例示することができる。
【００１７】
培養容器は、上皮細胞を付着及び培養させることができるものであれば特に限定されず、例えば、培養皿、培養フラスコ、カバーグラスなどを使用することができる。
【００１８】
懸濁液の滴下は、市販のマイクロピペッター等の器具を用いて行うことができる。滴下量は、上皮細胞を培養容器に付着させることのできる範囲内であれば特に限定されないが、１０〜５０μｌが適当である。
【００１９】
懸濁液を滴下した後、５０〜９０分程度保温することにより、懸濁液中の上皮細胞を培養容器に付着させることができる。この過程は基底層基質に親和性を持つ増殖能力の高い幹細胞を含む細胞を選択し、一方基質への接着が低下した分化細胞を排除する。そのことにより増殖能力が活発な高密度培養が可能になる。（特開２０００−６０５４２）
【００２０】
工程（Ａ−２）では、上皮細胞の付着した培養容器内に培地を加え、上皮細胞を培養する。
【００２１】
培地は、上皮細胞を培養することのできるものであればどのようなものでもよく、例えば、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＣＤＢ１５２培地、ＭＣＤＢ１７０培地、ＨａｍＦ１２培地などを使用することができる。
【００２２】
培養条件は特に限定されないが、培養温度３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％とするのが好ましい。
【００２３】
工程（Ａ−３）では、培養により産生する分化ケラチノサイトが死滅した後、残存している細胞を採取する。
【００２４】
工程（Ａ−２）の培養により、培養容器に付着した上皮細胞からケラチノサイトが分化してくるが、この分化ケラチノサイトはやがて死滅する。分化ケラチノサイトが死滅した時点で残存している細胞を採取することにより、老化上皮幹細胞を得ることができる。
【００２５】
分化ケラチノサイトが死滅するまでの期間は、通常３ヶ月程度であるが、細胞の種類によって異なるので、老化上皮幹細胞の採取時期は、分化ケラチノサイトの死滅を指標として判断するのが望ましい。
【００２６】
以上により取得される老化上皮幹細胞は、少なくと一つの老化の指標となる性質と、少なくとも一つの上皮幹細胞の指標となる性質を示す。ここで、老化の指標となる性質としては、テロメアの短鎖化、又はβ−ガラクトシダーゼ、ｐ１６、ｐ１５、ＩＧＲ−ｂｐ３、ＣＥＡ、ｍｉｄｋｉｎｅ、Ｅ２Ｆ４、若しくはｃｄｃ４８（ＨＡＭ）の発現などを例示することができる。上皮幹細胞の指標となる性質としては、ｐ７５^ＮＴＲ、インテグリンβ４、ｂｃ１−２，の発現などを例示することができる。なお、「テロメアの短鎖化」とは、テロメアの長さが、他の細胞のテロメアの５０％以下の長さ、好ましくは３０％以下の長さ、更に好ましくは１５％以下の長さになることを意味し、具体的には、テロメアの長さが５ｋｂ以下になることをいう。
【００２７】
本発明の不死化老化上皮幹細胞は、以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）の工程により取得される。
【００２８】
工程（Ｂ−１）では、ヒト上皮細胞の懸濁液を、細胞外接着物質で被覆された培養容器中に滴下し、ヒト上皮細胞を培養容器に付着させる。この工程は、工程（Ａ−１）と同様に行うことができる。
【００２９】
工程（Ｂ−２）では、ヒト上皮細胞の付着した培養容器内に培地を加え、ヒト上皮細胞を培養する。この工程は、工程（Ａ−２）と同様に行うことができる。
【００３０】
工程（Ｂ−３）では、上皮細胞にウイルス腫瘍遺伝子を導入した後、細胞集団倍加数（ＰＤＬ）が９０以上の細胞を分離する。ウイルス腫瘍遺伝子としては、ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルス１６型遺伝子等を例示することができる。ウイルス腫瘍遺伝子の導入は、トランスフェクション等の常法に従って行うことができる。
【００３１】
工程（Ｂ−４）では、テロメレース活性を有する細胞を選択する。テロメレース活性の測定法としては、例えば、ＴＲＡＰ法（Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｐｅａｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌ；Ｋｉｍ，Ｎ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，２０１１（１９９４））や、それを改変した方法（Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，４３３（１９９６）；Ｋｕｎｉｍｕｒａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７，１８７（１９９８））を用いることができる。
【００３２】
以上により取得される不死化老化上皮幹細胞は、少なくとも一つの不死化の指標となる性質と、少なくとも一つの老化の指標となる性質と、少なくとも一つの上皮幹細胞の指標となる性質を示す。ここで、不死化の指標となる性質としては、テロメレースの活性化などを例示することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３４】
〔実施例１〕上皮幹細胞及び不死化上皮幹細胞の調製およびテロメア長の解析
（１）上皮幹細胞の調製
重度の子宮筋腫患者から外科的に子宮頸部を切除し、ヒト正常上皮組織標本を調製した（Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，４３３（１９９６））。ケラチノサイト初代培養は、子宮頸部上皮組織片を０．０３ｍＭＣａ^２＋を含むＭＣＤＢ１５３培養液を基本培地とするＤＭＥＭ混合培地（混合比：２５％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ、Ｃａ^２＋濃度０．２３ｍＭ）中で培養することにより行った（Ｏｈｔａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，９９，６４４（１９９７））。
【００３５】
得られた子宮上皮組織標本をＩＶ型コラーゲンをコートした培養皿（ＩＷＡＫＩ社製）上で下記培養液により２週間培養した後、０．０１％のＥＤＴＡおよび０．１％のトリプシンを含むＣａ^２＋、Ｍｇ^２＋を含まないリン酸緩衝液（以下、これを「ＰＢＳ（−）」と称することがある）３７℃で５分間反応させた。０．０１％のＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で４℃、１５分処理し、子宮上皮細胞を回収した。回収された細胞は０．０３ｍＭＣａ^２＋、０．５％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌインシュリン、５ｍｇ／ｍｌ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、２００ｎＭハイドロコーテイゾン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．５μＭホスホエタノールアミン、０．５μＭエタノールアミン、６．２５μｇ／ｍｌ牛脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）、を添加したＭＣＤＢ１５３培地で５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。また、液摘培養に用いられるまで液体窒素中で保存した。
【００３６】
（２）上皮幹細胞の培養
得られた子宮上皮細胞は、５〜２０μｌの４℃に冷却した培養液（上記ＭＣＤＢ１５３培地）中に１×１０^３個／μｌとなるように懸濁し、これをＩＶ型コラーゲンをコートした３５ｍｍ培養シャーレの中心に液摘し（３７℃、１００％以上高湿度の炭酸ガス培養器中で５０分〜９０分保温し、細胞接着を促す。）、５０％以上細胞接着後（１）で示した０．２３ｍＭＣａ^２＋、２５％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ混合培地培養液２ｍｌを加えで湿度１００％のＣＯ_２インキュベーター中で培養を継続した。この培養により培養シャーレの底面に付着した上皮細胞は、３日間以内に増殖を開始した。この培養を３ヶ月以上継続し、細胞分裂の限界に至るまで培養した。上記の液摘による培養により上皮細胞は多層の上皮細胞シートを形成することにより構造が維持されている。この上皮細胞シートの上層にある細胞は分化度が進行したケラチノサイトで培養の継続により自然と剥離したが、最下層の細胞は増殖と分化のホメオスタシス（定常）的なバランスを取りながら生存し続け、分化ケラチノサイトを産生した。３ヶ月の培養により、上皮細胞シートにより産生されてくる分化ケラチノサイトはほとんど全てが死滅し、底面の細胞のみが生存していた（図１）。これらの残った細胞群は明確な細胞死を起こさず、また分裂を促する増殖因子にも反応せず、１０ヶ月以上も生存し続けた（図２）。
【００３７】
（３）老化上皮幹細胞中のβガラクトシダーゼ発現の解析
上記（２）で得られた底面に付着した長期生存細胞を、ＰＢＳで洗浄し、３％ホルムアルデヒド（固定液）で室温、５分間反応させ固定した。ＰＢＳで固定液を洗浄した後、βガラクトシダーゼ反応液（１ｍｇ／ｍｌ：５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌβ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、４０ｍＭ：クエン酸、４０ｍＭ：リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５ｍＭ：フェロシアンカリウム、５ｍＭ：フェリシアンカリウム、１５０ｍＭ：塩化ナトリウム、２ｍＭ：塩化マグネシウム）中で３７℃、５〜１２時間反応させた。この結果を図３に示す。図から明らかなように、（２）で得られた細胞は、老化の指標となるβ−ガラクトシダーゼが発現しており、全ての長期生存細胞で老化の進行が認められた。
【００３８】
（４）長期生存上皮細胞のテロメア長の測定
ここで得られた底面に付着した長期生存細胞を０．１％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡにより剥離し、該細胞からｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ−ＳＤＳ法及びフェノール／クロロフォルム法により高分子ゲノムＤＮＡ（２５ｋｂ以上）を精製した。取得したＤＮＡを、過剰量（ＤＮＡ１μｇ当たり１０〜２０ユニット）のＨＩｎｆＩ（５〜１０Ｕ）とＲｓａＩ（５〜１０Ｕ）を添加し、ＤＮＡが完全に消化されるまで３７℃で数時間反応させた。消化されたＤＮＡ１μｇを０．５％のアガロースゲルにより電気泳動して分離した。上記の制限酵素により完全に消化されたことは、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色して確認した。次にこのアガロースゲルを真空乾燥機で６０℃、３０分間乾燥させた。乾燥したアガロースシートを０．１ＭのＮａＯＨ溶液に１５分間浸し、ＤＮＡを変性させて、その後１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和した。
【００３９】
ハイブリダイゼーション用のプローブは、配列番号１に示す塩基配列、^３２Ｐ−（ＴＴＡＧＧＧ）_３を有するものを委託して合成した。このプローブの５’末端をポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ）を用いて^３２Ｐで標識し、加熱吸引（６０℃、３０分）乾燥したアガロースシートと３７℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行った。反応後、該シートを０．１×ＳＳＣ（ＮａＣｌ−Ｃｉｔｒｉｏｃａｃｉｄ）−０．０５％ＳＤＳにより１５分間、３回洗浄し、増感紙（ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇｓｃｒｅｅｎ）に転写しシグナルをイメージングアナライザー又はオートラジオグラフィーにより解析した。この結果を図４に示す。図より明らかなように、正常上皮細胞（図４左）が約９．５ｋｂのテロメアを有しているのに対し、底面で長期間生存する細胞のテロメアは４．５ｋｂと短鎖化していた（図４右）。
【００４０】
〔実施例２〕ウィルス腫瘍遺伝子を導入した細胞のテロメレース活性およびテロメア長の解析
実施例１と同様にしてヒト上皮初代培養細胞をＩＶ型コラーゲンをコートした培養皿で液摘培養を行い、培養開始２〜３日目に通常のトランスフェクション法によってＳＶ４０腫瘍遺伝子（大型Ｔ）、又はヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）ＤＮＡを導入し長期継代可能な細胞集団を作製し、継代中の早い段階（８０ＰＤＬ以前）、及び遅い段階（８０ＰＤＬ以降）から細胞を調製した（Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，４３３（１９９６））。各細胞は１ｘ１０ ^６個／ｍｌの割合で低調緩衝液（１０ｍＭ：ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ：塩化カリウム、１ｍＭ：塩化マグネシウム、１ｍＭ：ＤＴＴ、０．１ｍＭ：ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ：
ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２μｇ／ｍｌ：ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、０．５％：ＭＥＧＡ−９、１０Ｕ／ｍｌ：ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞のデブリスを低温遠心で除いた後、その上清に最終濃度０．１Ｍの塩化ナトリウムを加え、４℃で２０分間穏やかに混和した。さらに１００，０００Ｇの遠心分離により得られた上清に１／４容量のグリセロールを添加して細胞抽出液として用いた。
【００４１】
この細胞抽出液１−５μｌにテロメア伸長用プライマー（０．０５μｇＴＳ：文献Ｙａｓｕｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，４３３（１９９６））を含むポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）反応液を用いて、２０℃／３０分×１サイクル、９４℃／４５秒−５０℃／４５秒−７２℃／３分×３１サイクルのＰＣＲを行った。この反応液の１／５を１×Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒｉｃ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）に溶解した８％ポリアクリルアミド非変性ゲルを用いた電気泳動により分離した。ゲルを乾燥させ、Ｓｔｏｒｍ８６０（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてテロメレース活性の解析を行った。この結果を図５に示す。図から明らかなようにテロメレースの活性はＳＶ４０を導入し９０ＰＤＬ以上培養した細胞にのみ見られ（図５Ａ）、それ以前の細胞には見られなかった。しかし、９０ＰＤＬ以前の細胞について限界希釈法により細胞をクローニングして同様の解析を行ったところ、６５ＰＤＬ培養細胞にＳＶ−４０を導入した細胞についても約１０００細胞中１細胞でテロメレース活性が見出された（図５Ｂ）。
【００４２】
上記でテロメレース活性が見られた細胞について、実施例１と同様にしてテロメア長を解析したところ、テロメレース活性化による不死化成立初期段階では平均して４ｋｂｐであった（図６）。これらのことから、テロメレース活性化が伴う細胞の不死化はＳＶ４０が導入され分裂老化に到達した幹細胞系列で成立したものと推測される。不死化成立後のテロメア長は伸長（長鎖化）する傾向を示し、必ずしも短鎖化状態を維持しなかった。不死化によるテロメア長の不安定化は染色体異常、例えば染色体重複、染色体末端融合及びリング形成など（文献：Ｈａｓｈｉｄａ＆ＹａｓｕｍｏｔｏＪ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ（１９９１））を高い頻度で出現する時期に相当する。
【００４３】
【発明の効果】
老化上皮幹細胞及び不死化老化上皮幹細胞は、発がんと密接な関連を持つと推測されるので、制がん剤などのスクリーニングに利用することができる。
【００４４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】分化ケラチノサイト死滅後も生存していた細胞（老化上皮幹細胞）のコロニーの写真。
【図２】生存細胞の累積数と培養期間との関係を示す図（Ｎ＋はヒト上皮細胞の増殖様式が幹細胞の特性を表していることを示す。）。
【図３】長期生存した老化上皮幹細胞のコロニーの写真（すべての細胞で老化の指標であるβ−ガラクトシダーゼの活性化が認められた。）。
【図４】ヒト老化上皮幹細胞及び初代培養正常上皮細胞のテロメア長の解析結果を示す図（老化上皮幹細胞では、著しいテロメア配列の短縮化が認められた。）。
【図５】ＳＶ４０−腫瘍遺伝子（ＬＴ）を導入後分裂寿命の延長が誘発された上皮細胞のＰＤＬとテロメレースの活性化との関係を示す図。
【図６】老化上皮幹細胞及び不死化老化上皮幹細胞のテロメア長の解析結果を示す図（ＡはＳＶ４０−ＬＴによる細胞老化の促進過程とテロメレース活性化によるテロメア長の伸長過程を示す。Ｂは同様のことが別のヒト腫瘍ウイルス（ＨＰＶ１６）によっても誘発されることを示す。すなわち、細胞の癌化のプロセスは幹細胞の老化促進から始まることを示している。）。

Claims

以下の（１）〜（３）の工程を含む老化上皮幹細胞の取得方法。
（１）上皮細胞の懸濁液を、細胞外接着物質で被覆された培養容器中に滴下し、上皮細胞を培養容器に付着させる工程
（２）上皮細胞の付着した培養容器内に培地を加え、上皮細胞を培養する工程
（３）培養により産生する分化ケラチノサイトが死滅した後、残存している細胞を採取する工程
請求項１記載の方法により取得された老化上皮幹細胞。
以下の（１）〜（３）の工程を含む不死化老化上皮幹細胞の取得方法。
（１）上皮細胞の懸濁液を、細胞外接着物質で被覆された培養容器中に滴下し、ヒト上皮細胞を培養容器に付着させる工程
（２）上皮細胞の付着した培養容器内に培地を加え、上皮細胞を培養する工程
（３）上皮細胞にウイルス腫瘍遺伝子を導入した後、細胞集団倍加数が９０以上の細胞を分離する工程。
（４）テロメレース活性を有する細胞を選択する工程
請求項３記載の方法により取得された不死化老化上皮幹細胞。