CN114591900B - 一种提高干细胞分化能力的体外培养方法及培养基和应用 - Google Patents

一种提高干细胞分化能力的体外培养方法及培养基和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种经过改良的干细胞培养基及利用该培养基获得具有高分化能力和扩增效率的间充质干细胞的方法，属于细胞培养技术领域，所述培养基含有：胎牛血清、聚乙烯吡咯烷酮和维生素C磷酸酯镁。本发明提供的培养基适用于干细胞的体外培养，其优势在于血清以极低的浓度存在，但是在维持干细胞特性和增殖效率方面具有显著优于10％血清培养的效果，与现有技术相比取得了显著的进步。

Description

一种提高干细胞分化能力的体外培养方法及培养基和应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高干细胞分化能力的体外培养方法及其采用的培养基和应用。
背景技术
间充质干细胞在再生医学中具有巨大的潜力，在临床上可被用于治疗各种疾病。目前国内外培养间充质干细胞基本采用体积分数为10％胎牛血清的基础培养基DMEM/F12培养基。血清能够维持干细胞成活并且促进其增殖和分化，不同的血清浓度对干细胞的增殖和分化产生不同的影响，这与血清中存在的多种细胞生长因子有关，多个研究表明，细胞生长因子对细胞增殖、分化的影响存在一定的量效的关系。如宋亮等研究了不同血清浓度(0％、5％、10％、20％、30％)对大鼠髓核间充质干细胞(NPMSC)生物学特性的影响，研究结果显示，随着血清浓度的增加，OD值增大，NPMSC的凋亡率降低，细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9基因的mRNA表达增加[1]。此外，李云剑等比较了不同培养基血清浓度(0％、5％、10％、15％、20％)对人表皮干细胞增殖分化的影响，结果表明，表皮干细胞在各种血清浓度的培养基中均能形成克隆，且增殖良好，但高血清浓度(15％、20％)培养基中细胞较低浓度血清(0％、5％)培养基中细胞先表现出K14、K10蛋白的表达[2]。但是未见研究不同血清浓度对人脐带间充质干细胞在体外增殖和分化的影响。
[1]宋亮.不同浓度胎牛血清对大鼠髓核间充质干细胞生物学特性影响[D].山西医科大学,2014.
[2]李云剑,林樾,燕辛,周宏礽,谭谦.培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响[J].现代生物医学进展,2010,10(20):3831-3833.
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于体外培养间充质干细胞，特别是脐带间充质干细胞的培养基和应用该培养基培养得到具有高分化能力的间充质干细胞的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种改良的干细胞培养基，含有：胎牛血清、聚乙烯吡咯烷酮和维生素C磷酸酯镁。
进一步地，所述胎牛血清以较低的浓度存在。现有研究表明，血清中细胞生长因子对细胞增殖、分化的影响存在一定的量效的关系。但是发明人意外发现，在某些成分存在下，当血清以较低的浓度存在也仍然具有促进间充质干细细胞在体外生长的作用，这些成分在本发明中列举为聚乙烯吡咯烷酮和维生素C磷酸酯镁。本发明的优势在于，仅仅利用了较低浓度的血清即得到较好的培养效果，与10％血清培养的效果相比，分化能力和增殖速率有明显地提高。
上文所述“较低的浓度”是指在所述培养基中，胎牛血清的浓度为1～5v/v％。
作为本发明进一步的实施方案，在所述培养基中，胎牛血清的浓度为1～3v/v％。
作为本发明进一步的实施方案，在所述培养基中，胎牛血清的浓度可以为1～5v/v％之间的任意值；1～4v/v％或1～3v/v％或1～2v/v％之间的任意值。具体在某些实施例中，在所述培养基中，胎牛血清的浓度可以为1v/v％、1.5v/v％、2v/v％、3v/v％、4v/v％、5v/v％。在实现了最优效果的某些实施例中，胎牛血清的浓度为1v/v％、1.5v/v％、2v/v％和3v/v％。
作为本发明进一步的实施方案，在所述培养基中，还包括基础培养基。所述基础培养基包括但不限于DMEM培养基、DMEM/F12培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：1～5v/v％胎牛血清、5～20μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、5～30μg/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：1～3v/v％胎牛血清、5～15μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、5～20μg/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：1v/v％胎牛血清、10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、15μg/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：1.5v/v％胎牛血清、15μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、20μg/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：2v/v％胎牛血清、5μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、10μg/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：3v/v％胎牛血清、8μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、12g/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：4v/v％胎牛血清、5μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、20μg/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
作为本发明进一步的实施方案，所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：5v/v％胎牛血清、12μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、5μg/mL维生素C磷酸酯镁和余量的基础培养基。
试验表明，上述含量范围内的胎牛血清、聚乙烯吡咯烷酮和维生素C磷酸酯镁适用于在体外培养间充质干细胞，特别是脐带间充质干细胞，特别有利于提高间充质干细胞生长及维持其高分化能力。
作为本发明进一步的实施方案，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
另外，本发明还提供一种提高干细胞体外分化能力的培养方法，包含以下步骤：
将干细胞组织块置于所述改良的干细胞培养基中培养，培养条件为：37℃、5％CO2。
作为本发明进一步的实施方案，所述干细胞为可以为胚胎干细胞或间充质干细胞，优选为间充质干细胞；所述间充质干细胞包括但不限于：人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞。
作为本发明进一步的实施方案，本发明经过改良的培养基优选用于体外培养人脐带间充质干细胞，经试验表明，采用本发明经改良的培养基进行传代扩增培养，在多次传代后，仍然能够很好的维持干细胞特性。
另外，本发明还提供一种提高干细胞体外分化能力的试剂盒，其包含所述改良的干细胞培养基。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种经过改良的培养基，该培养基适用于干细胞的体外培养，其优势在于血清以极低的浓度存在，但是在维持干细胞特性和增殖效率方面具有优于10％血清培养的效果，与现有技术相比取得了显著的进步。
附图说明
图1为1#～9#、10％血清培养基培养的间充质干细胞各代次扩增数量。
注：图1中从左到右依次为培养基1#～9#、10％血清组。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
试验例一、不同血清浓度对维持人脐带间充质干细胞特性及体外扩增效率的影响
1试验方法：
1.1人脐带间充质干细胞的分离与扩增培养：取经血管剥离和清洗处理后的脐带组织块分别接种于含不同血清浓度的样本培养基中进行细胞原代培养(培养条件为：37℃、5％CO2)。样本培养基分别为：
培养基1#(DMEM/F12培养基中添加1v/v％血清+10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮、15μg/mL维生素C磷酸酯镁)；
培养基2#(DMEM/F12培养基中添加1.5v/v％血清+10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮+15μg/mL维生素C磷酸酯镁)；
培养基3#(DMEM/F12培养基中添加2v/v％血清+10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮+15μg/mL维生素C磷酸酯镁)；
培养基4#(DMEM/F12培养基中添加3v/v％血清+10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮+15μg/mL维生素C磷酸酯镁)；
培养基5#(DMEM/F12培养基中添加4v/v％血清+10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮+15μg/mL维生素C磷酸酯镁)；
培养基6#(DMEM/F12培养基中添加5v/v％血清+10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮+15μg/mL维生素C磷酸酯镁)；
培养基7#(DMEM/F12培养基中添加10v/v％血清+10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮+15μg/mL维生素C磷酸酯镁)；
培养基8#:与培养基3#相比，不含聚乙烯吡咯烷酮；
培养基9#与培养基3#相比，不含维生素C磷酸酯镁；
10％血清组：DMEM/F12培养基中添加10v/v％血清。
14d后进行消化传代培养，将消化获得的脐带间充质干细胞以1×104/cm2分别接种于含有上述样本培养基的培养皿中，行连续传代培养(培养条件为：37℃、5％CO2)。
1.2指标观察
1.2.1细胞形态学观察：在倒置显微镜下观察各组P5代细胞的形态，并记录结果。
1.2.2细胞表面抗原测定：流式检测各组P5代细胞表面标记物，具体方法：收集第5代细胞，调整细胞浓度为1×106/cm2，洗涤，过滤，固定，标记荧光抗体，洗涤，上样，检测各组细胞表面抗原的表达率，记录结果。
1.2.3细胞诱导分化能力测定：①成脂能力测定：取各组P3代细胞，以1×104/cm2的密度接种于24孔板，待细胞融合度达到100％时全量更换成成脂诱导试剂，每隔3天更换新鲜诱导剂，14d后性油红O染色；②成骨能力测定：取各组P5代细胞，以1×104/cm2的密度接种于24孔板，待细胞融合度达到80％时全量更换成成骨诱导试剂，每隔3天更换新鲜诱导剂，28d后性茜素红染色；记录结果。
1.2.4细胞体外扩增效率测定：将原代培养获得的各组人脐带间充质干细胞以1×104/cm2的密度接种于上述样本培养基进行传代培养，以1×104/cm2的密度每隔4d传代，将每次过程过程中消化获得的细胞进行计数，比较各组培养基人脐带间充质干细胞的扩增效率。
1.3统计学分析结果：采用SPSS统计学软禁进行t检验。
2结果
2.1不同血清浓度对细胞形态学的影响：经各组不同血清浓度培养后，除培养基8#～9#，其余各组培养基培养的第5代细胞融合率均能达到90％以上，细胞形态良好。
2.2不同血清浓度对细胞表面标记物表达的影响：表1结果可知，经培养基1～7#培养传代至第5代后，所有细胞均呈现典型的间充质干细胞表面标志物表达特征，即CD90、CD105、CD44和CD73的阳性表达率均＞95％，而低表达CD34、CD45、HLA-DR和CD19(＜2％)。
表1:不同血清浓度对P5代细胞表面标记物表达的影响(％)
Figure BDA0003554551180000071
2.3不同血清浓度对细胞诱导分化能力的影响：经油红O染色后，经含较低浓度血清(1～5％)培养基培养的细胞脂滴分布较高浓度血清培养基(7#)明显密集，表现出明显高于高浓度血清培养基(7#)的成脂诱导能力，说明，在培养基中含有聚乙烯吡咯烷酮和维生素C磷酸酯镁的情况下，血清以较低浓度存在获得的培养效果更好，且培养效果优于10％血清；8#和9#培养基培养的细胞表现出明显低于3#培养基的成脂诱导能力(P＜0.01)；结果如表2所示。
经茜素红染色后，经含较低浓度血清(1～5％)培养基(1#～6#)培养的细胞出现明显大片红染的钙结节，组间差异不明显，但红染面积与10％血清组相比明显增加，其中以2％血清浓度组效果差异最明显(P＜0.01)；而8#和9#培养基培养的细胞钙结节面积明显降低，显示其成骨诱导效率较低，与3#培养基相比存在明显差异。
表2：不同血清浓度对细胞成脂、成骨分化的影响
Figure BDA0003554551180000072
Figure BDA0003554551180000081
注：与10％血清组相比，*P＜0.05；**P＜0.01，与3#培养基相比，#P＜0.05；##P＜0.01。
2.4不同血清浓度对细胞增殖能力的影响：结果如图1所示，2～5#组培养基培养的各代次细胞均表现出高于10％血清组相应细胞代次的扩增数量；而1#、6#～9#各代次细胞扩增数量显著低于10％血清。
结论：由上述试验结果可看出，本发明特定低浓度血清培养基在间充质干细胞的传代扩增培养中能够维持间充质干细胞的干性，分化潜能稳定，且体外扩增效率显著高于10％血清培养。
实施例1～5、经过改良的培养基(在DEME/F12培养基中添加以下成分)
Figure BDA0003554551180000082
Figure BDA0003554551180000091
培养基的制备：
在室温下将各组分进行混合，搅拌均匀，即得。
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种提高干细胞体外分化能力的培养方法，其特征在于，包含以下步骤：
将干细胞组织块置于改良的干细胞培养基中培养，培养条件为：37℃、5%CO2；所述改良的干细胞培养基为在基础培养基中添加以下成分：3~4v/v%胎牛血清、10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮和15μg/mL维生素C磷酸酯镁；所述基础培养基为DMEM/F12培养基；所述干细胞为脐带间充质干细胞。
2.一种提高干细胞体外分化能力的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述改良的干细胞培养基。
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