JP4854174B2 - NF−κBの受容体活性化剤のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングアッセイ法 - Google Patents
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- G01N33/5073—Stem cells
Description
本出願は、全体が本明細書に参照として援用される2000年9月22日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願60/235,157から、優先権の利益を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、NF−κBの受容体活性化剤(RANK)に関連するアゴニストおよび/またはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関するものである。
【0003】
発明の背景
NF−κBの受容体活性化剤の頭字語であるRANKは、腫瘍懐死因子(TNF)受容体スーパーファミリーのメンバーであるタイプI膜タンパク質であり、そして、誘発されたときに転写因子NF−κBを活性化する(Andersonら、Nature390:175−179(1997);Andersonら、米国特許第6,017,729号)。ヒトRANK(616アミノ酸)はシグナルペプチド(28アミノ酸)、N末の細胞外ドメイン(184アミノ酸)、短い膜貫通ドメイン(21アミノ酸)、および大きいC末の細胞質ドメイン(383アミノ酸)を有しており、そして、マウスRANKも同様に配列される(Andersonら、1997)。RANKの細胞外ドメインは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの特徴である4つのシステインに富むシュードリピート、および2つのN−グリコシル化部位を含む。RANKは、CD40と40%の相同性を有しており(Andersonら、1997)、T細胞、樹状細胞、および破骨細胞において発現する(Andersonら、1997;Hofbauerら、J Bone Min Res15:2−12(2000))。
【0004】
RANKの細胞質ドメインは、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6を含む、TNF受容体関連因子(TRAFs;BakerおよびReddy,Oncogene12:1(1996))のいくつかと細胞内で結合する(Galibertら、J.Biol Chem273:34120−27(1998))。これらのTRAF結合部位は、RANK細胞質内末端において2つの異なったドメインに集中している。TRAF(群)は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーによって、しばしばシグナル伝達を仲介する細胞質タンパク質であり、これらは、例えば免疫応答および炎症応答の制御において重要である。RANKは、TRAF結合部位を含む事象のカスケードを通じて、その生物学的活性のいくらか、またはすべてを仲介する(例えば、Galibertら、1998を参照されたい)。
【0005】
膜結合型または可溶性のRANK−Lとの接触によることなどで、RANKを誘発する結果、RANKを仲介した細胞性応答が刺激される。これらの細胞性応答は、免疫系の細胞において広く用いられる遍在した転写因子である、転写因子NF−κBの活性化、またはJunキナーゼの活性化(JNK;例えばGalibertら、1998を参照されたい)を含むこともあり得る。破骨前駆細胞におけるRANK活性化は、前駆細胞を誘導して成熟した破骨細胞(osteoclast)に分化させる。この分化工程に付随して、染色によって検出可能な特異化された構造である「F−アクチンリング」へのアクチンの再構成が生じる(Lakkakorpi、P.およびVaananen,J.Bone Min Res 6:817−826(1991))。c−srcチロシンキナーゼ活性のレベルが高められるのも、RANKの活性化と関連している(Wongら、Molecular Cell 4:1041−1049(1999))。
【0006】
RANKリガンド(RANK−L)は,RANKを結合し活性化する細胞表面タンパク質である(Andersonら、米国特許第6,017,729号)。このタンパク質は、TRANCE、ODFまたはOPGリガンドとしても知られている(Wongら、1999)。RANK−Lは、タイプ2膜貫通タンパク質であり、約50またはそれより短いアミノ酸の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および約240−250アミノ酸の細胞外ドメインを有する。RANK−Lの細胞外ドメインはRANK結合部位を含む。RANK−Lは、それが属するTNFファミリーの他のメンバーと同様に、膜貫通ドメインと受容体結合ドメインとの間に、受容体の結合に不必要な「スペーサー」領域を有する。
【0007】
骨においてRANK−Lは、破骨細胞の分化を刺激し、成熟した破骨細胞の活性を高め、そして破骨細胞のアポトーシスを阻害し、それにより活性化された破骨細胞のプールを広げる(例えば、Hsuら,Proc Nat’l Acad Sci USA.96:3540−45(1999)を参照されたい)。破骨細胞は、骨髄において造血前駆細胞から形成される、大きな、食作用を示す多核細胞である。破骨細胞は、骨組織間充質の分離、および骨組織の塩の可溶化を促進し、そして骨組織の適切な発生および成長に必要とされる。
【0008】
RANKノックアウトマウスは、重い骨石化症(osteopetrotic)であり、かつ末梢リンパ節を欠失している(Dougallら,Gene Dev. 13:2412−24(1999))。RANKおよびRANK−L活性の調節は、例えば骨粗鬆症(osteoporosis)、パジェット病、高カルシウム血症などを含む、骨減少症(osteopenia)または骨石化症(osteopetrosis)を含む様々な障害を治療するための手段として提案されてきた(例えば,PCT国際公報WO 98/46751およびWO 99/58674を参照されたい)。
【0009】
RANKおよびそのリガンドは、免疫応答、炎症応答、破骨細胞の活性化を通じた骨組織再構築など、生物系の広範囲の制御において不可欠な役割を果たす。生物系の広範囲の制御におけるRANKの重要性を考えると、RANK活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングするための方法が必要である。
【0010】
発明の概要
本発明は、RANK活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングするための方法を提供する。
【0011】
本発明の1つの態様において、RANKアゴニストまたはアンタゴニストのアッセイ法は、候補分子存在下における半固形培地においてRANK応答性細胞を培養し、そして、対照培地と比較してコロニー形成率またはコロニー成長率が、候補分子と接触させた細胞において高められまたは低められたかどうかを判定することを含む。このアッセイ法において、「テスト細胞」とも呼ばれる接触細胞において、コロニー形成率またはコロニー成長率が、候補分子と接触させない対照のリファレンス細胞におけるコロニー形成率または成長率と比較して高められる場合は、候補分子がRANKアンタゴニストとして同定され、その率が比較上低められる場合は、RANKアゴニストとして同定される。候補分子との接触を除いて、参照のリファレンス細胞はそのほか、テスト培地と同様の方法で培養され、かつ取り扱われる。
【0012】
本発明の1つの側面において、使用された半固形培地は、メチルセルロースであるが、一方、軟寒天、軟アガロースなども使用しうる。
【0013】
望ましいならば、候補分子は、このアッセイ法のために、群にされてもよい(can be batched)。この方法においては、複数の候補分子がテスト培地に加えられる。RANK活性の調節が当該培地において観察されるならば、当該バッチの各候補分子は、独立に試験され、そしてアンタゴニストまたはアゴニストが個別に同定されることも可能である。
【0014】
半固形培地アッセイ法を使用して、RANK活性にアンタゴナイズする分子をスクリーニングする場合、RANKは、テスト細胞を候補分子に曝す前、曝す間、および/または、曝した後に、RANK応答性細胞において誘発される。本明細書において使用されるものとして、RANKの誘発(triggering)は、RANKタンパク質を刺激して、それが発現されている細胞にシグナルを伝達する事象を意味する。本発明のこの最初の側面において有用な細胞は、RANKタンパク質を発現し、半固形培地においてコロニーを形成することが可能であり、そして、一つ以上のRANKを仲介した細胞シグナル経路の作用によって刺激され、半固形培地においてコロニーを形成できない細胞型へ分化する。
【0015】
RANK活性が、本発明の半固形培地アッセイ法のために、RANK応答性細胞において刺激されるとき、好ましい刺激方法は、:RANK応答性細胞を、配列番号6のアミノ酸162−317または配列番号8のアミノ酸161−316を含むRANK−Lポリペプチドなどの、RANK−Lポリペプチドと接触させること;RANK応答性細胞をアゴニスト性(agonistic)抗RANK抗体と接触させること;RANK応答性細胞をRANK−Lポリペプチドを発現する一つ又はそれより多くの細胞と接触させること;RANK応答性細胞においてRANKを過剰発現させること;および、RANK応答性細胞において、RANK−Lの不存在下における通常のRANK発現レベルのRANKシグナリングを誘導するRANKの変異型を発現させることを含む。RANKの後者の型の例は、FEO RANK(配列番号9および10)である。
【0016】
RANK活性を刺激するRANK−Lポリペプチドの例は、細胞表面で発現する内因性RANK−Lなどの天然のRANK−L、可溶性RANK−L、RANK−Lのロイシンジッパー融合体、およびRANK−LのFLAG(登録商標)ポリHis融合体を含む。対象のアッセイ法のためにRANK活性を刺激する別の方法は、RANK応答性細胞をアゴニスト性抗RANK抗体と接触させることである。この目的のためのアゴニスト性抗RANK抗体の例は、ヒトRANK向けのM330抗体およびM331抗体の両抗体、およびマウスRANK向けのM395およびM396抗体の両抗体を含む。
【0017】
本発明の1つの側面において、半固形培地におけるコロニー形成率またはコロニー成長率は、細胞が候補分子に曝された後、プレートの視覚的検査により判定される。コロニーの数または観察されるコロニーの大きさは、候補分子に曝されるプレートと、候補分子に曝されない同様の培地に関して比較される。
【0018】
RANK応答性細胞を候補分子と接触させる1つの手段は、候補核酸分子または候補タンパク質分子をコードするDNA分子を、テスト細胞に導入することを含む。例えば、導入DNAは、単一のタンパク質をコードするcDNA分子、または試験されるタンパク質群をコードするcDNAライブラリーでもよい。このDNAは、細胞へ導入された後、RANK応答性細胞のゲノムに組み込まれても、組み込まれなくてもよい。安定なトランスフェクション、および一時的なトランスフェクションのための技術は公知であり、いずれかの型の技術を使用することも可能である。ある場合において、コードされた候補分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイム活性を有するRNAなどの核酸分子ある。本発明の1つの側面において、RANKアゴニストまたはアンタゴニストをコードすると判定されるcDNAは、半固形培地において成長しているテスト細胞のコロニーから単離かつ精製される。
【0019】
RANK応答性細胞を候補分子と接触させる他の手段は、プレートに注ぐ前にそれを培地と混合することにより、または注がれたプレートを候補分子含む培地の層と重ねることにより、候補分子を半固形培地に直接的に加えることを含む。例えば、候補分子がタンパク質または小さい有機分子であるときに、前述の方法が用いられてもよい。望ましいならば、複数のタンパク質またはテスト分子がテスト培地に加えられてもよい。
【0020】
本発明の1つの側面において、欠損したRANK分子を発現するRANK応答性細胞が用いられ、そして、この欠損RANK分子を相補するアゴニストがスクリーニングされる。この目的のための欠損RANKの1つの例は、ヒトRANKΔ340−421である。
【0021】
上記のアッセイ法のための適したRANK応答性細胞は、骨髄、脾臓、胎児の肝臓または末梢血由来の造血前駆細胞、および骨髄、脾臓、胎児の肝臓または末梢血由来であり破骨細胞前駆体に富んでいる初代造血細胞などの、初代造血細胞を含む。本発明の他の側面において、RANK応答性細胞は細胞株である。適した細胞株は、RAW264.7細胞、C7細胞、およびBCL−X1/タグ細胞を含む。
本発明の別の側面は、酒石酸抵抗性ホスファターゼ(TRAP)遺伝子(配列番号12)またはMMP−9遺伝子(配列番号11)由来のプロモーター配列が、RANK誘発で生じるシグナル伝達に直接的に応答する能力を利用する。好ましい態様において、MMP−9プロモーターは、配列番号11のヌクレオチド1769−3591を含む。本発明は、TRAPまたはMMP−9がレポータータンパク質をコードする核酸分子と機能可能なように連結された組換えDNAコンストラクトを用いることにより、RANKアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法を提供する。この目的に適したレポータータンパク質は、例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、または抗体結合法により検出可能である異種(heterologous)表面タンパク質を含む。後者の例は、ヒトIL−2受容体、マウスIL−4受容体、ヒトCD2タンパク質、ヒトCD4タンパク質、およびヒトCD8タンパク質を含む。
【0022】
これらのアッセイ法のために、本明細書に記載されたレポーター/プロモーターコンストラクトは、培養されたRANK応答性細胞に導入される。適したRANK応答性細胞は、造血細胞を含む。適した造血細胞の例は、RAW264.7細胞を含む。この手法を使用してRANKアンタゴニストをスクリーニングするために、コンストラクトがテスト細胞に導入される。テスト細胞は、細胞においてRANKを誘発しそれによりコンストラクトのプロモーター活性を活性化してレポーター遺伝子の発現をもたらす、可溶性RANK−LなどのRANK活性アゴニストで処理される。候補アンタゴニスト分子を、誘発された細胞と接触させ、RANKが仲介されたこのレポーター遺伝子発現を抑制する能力を試験する。RANKが誘発する工程の前、間、または後に、テスト細胞を候補アンタゴニストと接触させる。
【0023】
候補分子は、例えば培養培地に加えられてもよい。本発明の1つの態様において、候補分子はタンパク質であり;別の態様においては小さい有機分子である。
【0024】
本発明の1つの側面において、候補分子は、細胞がRANKトリガーに曝される前にテスト細胞に導入されたcDNAによってコードされるタンパク質またはタンパク質の群である。一般的には、cDNAは、RANKを誘発する前、少なくとも48時間に導入される。cDNAは、レポーター遺伝子発現のレベルの変化を示す細胞から単離されてもよい。
【0025】
上記のレポーター/プロモーターコンストラクトアッセイ法においてRANKを誘発するのに適した方法は、表面においてRANK−Lを発現する細胞にテスト細胞を曝すこと、可溶性RANK−Lにテスト細胞を曝すこと、テスト細胞においてRANKを過剰発現させること、テスト細胞においてヒトRANKΔ340−42を発現すること、またはRANKタンパク質に特異的なアゴニスト抗体にテスト細胞を曝すことを含む。本発明の1つの側面において、RANKは、配列番号6のアミノ酸162−317または配列番号8のアミノ酸161−316を含むRANK−Lポリペプチドと接触させることにより、RANK応答性細胞において誘発される。
【0026】
RANKが誘発されたテスト細胞は、候補分子と接触され、そして細胞が解析されて、この接触の結果としてレポータータンパク質発現のレベルが高められ、または低められるかが判定される。レポーター発現のレベルは、蛍光に基づくアッセイ法、比色アッセイ法、固相法、放射性化合物を用いたアッセイ法などの、いずれかの適したアッセイ法により判定される。レポーター遺伝子産物のレベルを判定する一つの手段は、慣用法を用いて、レポーター分子を発現している細胞を蛍光に基づくセルソーティングにより物理的に単離することである。テスト細胞におけるレポータータンパク質発現の増加または減少は、テスト細胞におけるレポータータンパク質発現のレベルを、候補分子と接触させない対照培地における発現のレベル比較することによって判定される。候補分子がRANKアンタゴニストであるならば、レポーター発現のレベルは、比較上低められるであろう。
【0027】
上記のコンストラクトは、RANKアゴニストをスクリーニングするためにも用いられる。この場合においては、RANKがテスト細胞において意図的に誘発されることはないが、一方で、候補分子がRANKを誘発する能力に関して評価される。本発明のこの側面において有用な細胞は、RANKタンパク質を発現し、そしてRANKの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。ある場合において、アゴニストは、候補タンパク質アゴニストをコードするcDNAを細胞に導入することにより、または複数の候補タンパク質アゴニストをコードするcDNAライブラリーを導入することにより、アゴニストを細胞と接触させる。当該例において、アゴニストは、レポーター遺伝子発現が高められることを示すコロニーからcDNAを回収かつ精製することにより単離されてもよい。さらに、慣用の技術を使用して、精製された候補分子が実際にRANKと相互作用することを証明してもよい。
【0028】
本発明の1つの側面において、レポーター/プロモーターコンストラクトを使用して、欠損型RANK分子を発現する細胞を用いることによりRANKアゴニストを同定し、そして欠損型RANK活性を相補するアゴニストをスクリーニングする。例えば、ヒトRANKΔ340−42を発現する細胞がこの目的のために用いられてもよい。
【0029】
本発明の別の側面において、RANK活性のアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニングは、候補分子を、RANKの誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能なRANK応答性細胞と接触させることを含む。RANKアンタゴニストをスクリーニングするために、細胞においてRANKを誘発させ、細胞を候補アンタゴニストに曝し、そして、c−src活性またはF−アクチン形成のレベルを、候補分子と接触させないリファレンスRANK応答性細胞におけるc−src活性またはF−アクチン形成のレベルと比較して観察する。候補分子がアンタゴニストであるならば、c−src活性化率およびF−アクチンリング形成率が、比較上低められるであろう。候補分子がRANKアゴニスト活性に関してスクリーニングされたものならば、RANK誘発の工程が省略され、そして、陽性の結果は、c−src活性およびF−アクチン形成が高められる観察からなるであろう。
【0030】
本発明のさらに別の側面において、候補RANKアゴニストまたはアンタゴニストは、候補分子を該細胞におけるRANKの誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能なRANK応答性細胞と接触させ、細胞においてRANKを誘発し、そしてCaPO4のフィルム上で細胞を培養することにより、スクリーニングされる。分化した破骨細胞は、そのすぐ周辺においてCaPO4を吸収し、そしてフィルム上にピットを生成するであろう。そして、接触させ培養された細胞により生じるフィルムのピット数を、RANKが誘発されるが候補分子と接触させないリファレンスRANK応答性細胞により生じる同様のフィルムのピット数を比較する。そして、候補分子で処理された細胞により生じるピット数が、リファレンス細胞よりも大きいならば、候補分子をRANKアゴニストとして同定し、処理細胞により生じるピット数が対照細胞により生じる数よりも小さいならば、RANKアンタゴニストとして同定する。
【0031】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、RANK活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングする方法を提供する。RANKのアンタゴニストおよびアゴニストを検出するための様々なアッセイ法が当技術分野において公知であるが(例えば、米国特許第6,017,729号を参照されたい)、本明細書に記載しているスクリーニング戦略は、以前に記載されているものではない。
【0032】
本明細書で用いられるものとして、用語「RANKアゴニスト」、またはその文法的に同等なものは、RANKを誘発する分子など、RANK活性を刺激する分子を意味する。RANKアゴニストは、RANKと直接的に相互作用してもよく、または間接的にRANK活性を高めてよい。例えば、RANK−LはRANKアゴニストと考えられるであろう。また、RANKに特異的に結合する抗体も、しばしばRANK活性のアゴニストとして作用する。
【0033】
本明細書において用いられるものとして、用語「RANKアンタゴニスト」、またはその文法的に同等なものは、RANK活性を阻害する分子を意味する。RANKアンタゴニストは、直接的または間接的にRANKと相互作用する。RANK:Fc(米国特許第6,017,729号に記載されている)およびオステオプロテゲリン(米国特許第6,015,938号)がRANKアンタゴニストの例であり、前者は、免疫グロブリンのFc領域と融合されたRANKの細胞外ドメインを含む融合タンパク質であり、そして後者は、自然発生のタンパク質である。これらの2つのタンパク質は、RANK−Lを結合することによりRANKにアンタゴナイズし、それによりRANK−LがRANK応答性細胞と結合するのを妨げる。
【0034】
本明細書で用いられるものとして用語「RANK」は、NF−κBを活性化する能力またはTRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、もしくはTRAF6と結合する能力を有するタンパク質、並びに、配列番号2または配列番号4に示しているアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するタンパク質を意味する。本発明のRANKタンパク質は、配列番号2または配列番号4に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体と結合可能である。
【0035】
用語「RANK−L」は、RANKを結合して活性化するタイプ2膜貫通型タンパク質である、RANKリガンドの頭字語である。代表的なRANK−Lタンパク質をコードする2つの核酸分子の配列は、配列番号5(ヒトRANK−L)および配列番号7(マウスRANK−L)において示し、そして、これらの2つの核酸配列によりコードされるRANK−Lタンパク質の配列は、それぞれ配列番号6および配列番号8に示す。本明細書において用いられるものとして「RANK−L」は、完全長RANK−Lタンパク質、並びにRANK−Lの部分を含むキメラ分子および多量体RANK−L分子などの、膜結合型もしくは可溶型のRANK−Lタンパク質の、両方を含む。
【0036】
RANKおよびRANK−Lは、骨吸収に関する初期細胞型である、成熟破骨細胞の形成の制御に関与している。骨吸収率の増加(骨形成率を超える)は、集合的に骨減少症群(osteopenias)を意味し、骨粗鬆症、骨髄炎、高カルシウム血症、外科手術もしくはステロイド投与によりもたらされる骨減少症、パジェット病、骨懐死、関節リュウマチによる骨喪失、歯周の骨喪失、人工装具の喪失もしくは緩み、および骨溶解性転移を含む、様々な骨障害を誘導することもあり得る。RANKのアゴニストおよびアンタゴニストは、破骨細胞の形成を調節するために用いられ、また、骨障害の患者に投与されて病状を改善することもあり得る。
【0037】
さらに、多くの癌は、骨に転移し、そして通常の骨再構成を局所的に崩壊させることにより、骨の崩壊を誘導する。当該癌は、高カルシウム血症をもたらす、破骨細胞数の増加および破骨細胞の骨組織吸収量の増加と関連していることがあり得る(例えば、Guiseら、Endocrine Reviews,19(1):18−54,1998を参照されたい)。他の癌は、必ずしも骨に転移しないが、高カルシウム血症および骨喪失をもたらす(例えば、扁平上皮細胞癌)。RANKのアゴニストおよびアンタゴニストは、限定されるわけではないが、乳ガン、多発性骨髄腫、黒色腫、肺ガン、前立腺癌、血液の癌、頭および首の癌、並びに腎癌などの、癌に苦しむ患者に投与されてその症状を改善してもよい。RANK/RANKL相互作用のアンタゴニストは、特に癌の治療に有用である。
【0038】
加えて、本スクリーニングアッセイ法により同定されたRANKアンタゴニストまたはアゴニストは、心疾患、および動脈石灰化により特徴づけられる他の病状を予防または治療するために用いられてもよい。また、本明細書において同定されたRANKのアンタゴニストおよびアゴニストは、毒性もしくは敗血性ショック、または移植片対宿主反応など、免疫疾患および/または炎症疾患を(NF−κB活性化の抑制を通じるなどして)治療するにおいて有用である。RANKの誘発はT細胞の活性を刺激するので、本明細書において同定されたRANKアゴニストはワクチンアジュバントとしても有用である。
【0039】
腫瘍細胞は、NF−κBが阻害されたとき放射線に対して応答性が増す;このようにRANKシグナリングのアンタゴニストは、RANKを発現する新生細胞により特徴づけられる疾患に関する付属の治療法として有用であろう。反対に、RANKのアゴニストは、RANKを仲介した細胞応答を刺激するために有用と思われ、そして、あるRANKアゴニストは、不活性なRANK変異体を相補可能であることがあり得る。
【0040】
RANKアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して試験される候補分子:
候補分子の例はまた、本明細書において「テスト分子」として言及され、RANKアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して試験され、
限定されるわけではないが、炭水化物、小分子(通常は有機分子またはペプチド)、タンパク質、および核酸分子(典型的に8から30の核酸残基からなるオリゴヌクレオチド断片など)を含む。試験されるペプチドは、典型的に5から25アミノ酸残基からなる。また、候補核酸分子は、アンチセンス核酸配列であってもよく、そして/または、リボザイム活性を有していてもよい。望ましいならば、アンチセンスまたはリボザイムRNAは、アンチセンスまたはリボザイムRNAをコードするDNA分子を細胞に導入することにより、標的細胞に導入されてもよい。
【0041】
本明細書において記載しているスクリーニングアッセイ法を用いてスクリーニングされる小分子は、典型的には、経口により、または注射されることによりそれを必要とする患者に投与されてもよい。経口により投与されることも可能な小分子は、特に好ましい。本発明の小分子は、好ましくは、それらが薬学的物質として有効であるために必要とされる量で、毒性が無いと思われるものであり、またそれらは、好ましくは、迅速な酵素的または化学的分解により生じるであろう活性の喪失などの、体内における活性の迅速な喪失を受けない。加えて、薬学的に有用な小分子は、好ましくは免疫原性ではない。
【0042】
本発明の方法は、RANK依存細胞応答を仲介する一つ又はそれより多くのタンパク質をコードする一つ又はそれより多くのmRNA分子の機能的な発現で干渉することによりRANK活性を阻害するアンチセンス分子をスクリーニングするために、使用されてもよい。アンチセンス核酸分子は、宿主細胞において発現する標的の核酸と相補的であり、そして標的と二本鎖を形成することにより標的が機能するのを妨げる。アンチセンス核酸は、遺伝子をコードするDNA鎖と二本鎖を形成することにより、または標的遺伝子の発現を制御する制御領域と二本鎖を形成することにより、標的遺伝子の転写を阻止することもあり得る。または、それはmRNAと二本鎖形成し、その翻訳を妨げまたは阻止する。アンチセンス核酸分子は、標的遺伝子の発現に干渉可能なものとして提供される複数の異なる方法で作成されてもよい。スクーリングされる典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、長さが20−50ヌクレオチドであり、また、より好ましくは長さが30−40ヌクレオチドである。アンチセンス核酸分子は通常、ヌクレオチド配列において標的遺伝子の一本鎖と実質上同一であるであろう。最小の同一性は、典型的には約65%より大きいであろうが、同一性がより高いならば、内因性の配列の発現の抑制をより有効に行うことも可能だろう。従って、約80%より実質的に大きい同一性が好ましく、一方で約95%から完全な同一性がもっとも好ましい。
【0043】
候補核酸分子は、リボザイム活性を有することがあり得る。従って、本発明の方法は、RANK依存性細胞応答を仲介する一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上のmRNA分子の機能的な発現を阻害するリボザイム分子のスクリーニングに使用されることも可能である。リボザイムは、完全または部分的にリボザイムの配列に相同な配列を有する核酸分子を切断することも可能である触媒のRNA分子である。標的RNAと特異的に組み合わされ、そして特異的な領域においてリン酸ジエステルバックボーンを切断し、それにより標的RNAを機能的に不活性化する、RNAリボザイムをコードするリボザイム導入遺伝子を設計することも可能である。この切断の実行において、リボザイムそれ自体は変化されず、かつ、他の標的RNA分子を切断し続けることが可能である。アンチセンスRNA内のリボザイム配列の包含は、それらについてのRNA切断活性を与え、それによりアンチセンスコンストラクトの活性を増大させる。
【0044】
標的のRNA特異的リボザイムの設計および使用は、Haseloffら(Nature,334:585−591(1988))(米国特許第5,646,023号も参照されたい)に記載され、両出版物は、参考文献として本明細書に援用される。Tablerら(Gene108:175(1991))は、アンチセンスRNAの利益、および単一コンストラクトにおけるリボザイム技術を組み合わせることにより、触媒のRNAのコンストラクションを大きく単純化した。リボザイムの触媒作用に必要とされるのは、より小さい相同性領域であり、そのためこれは、切断部位が保存されているならば大きい遺伝子ファミリーの異なるメンバーの抑制を促進させることも可能である。
【0045】
RANKおよびRANK−L分子
一般的に、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ法は、RANKまたはRANK−Lタンパク質を含む。
【0046】
RANKおよびその結合相手RANK−L、並びにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当技術分野において知られており、また、それらの物理的特性、細胞内における性質の点、並びに、RANKとRANK−Lの結合と関連している多くの生物活性の点で、良く特徴づけられてきた。マウスおよび/またはヒトRANKの例、並びにマウスおよび/またはヒトRANK−Lの例は、米国特許第6,017,729号、米国特許第5,843,678号(本明細書においてマウスRANK−Lとして記載している「オステオプロテゲリン結合タンパク質」を開示している)、PCT国際公報WO 98/25958(本明細書においてマウスRANK−Lとして記載している「488E9」を開示している);WO 98/44751(本明細書においてマウスRANKとして言及しているマウス「ODAR」を開示している);および欧州特許第0 911 342号(本明細書においてマウスRANK−Lとして言及している「OCIF結合分子」を開示している)に開示されている。他のものもRANK−Lを開示しており、それを「TRANCE」として言及している(例えば、Wongら、Molec Cell 4:1041−49(1999)を参照されたい)。これらのRANKおよびRANK−L分子のいずれも、本明細書に記載されたアッセイ法において使用されてよい。
【0047】
代表的なRANKタンパク質をコードする2つの核酸分子の配列は、配列番号1(ヒトRANK)および配列番号3(マウスRANK)に示され、そして、これらの核酸分子によってコードされるアミノ酸配列がそれぞれ配列番号2および4に示される。ヒトおよびマウスのRANK−L配列の例は、配列番号6および8に示され、そして配列番号5および7にこれらのタンパク質をコードする核酸が示される。また一方で、当該技術分野において公知のRANKおよびRANK−L分子、またはRANKのRANK−Lへの結合もしくはこの結合から通常にもたらされるRANKの誘発に影響を与えないアミノ酸相違を有する変異体など、前記の例において示されたもの以外の他のRANKおよびRANK−L変異型が、本明細書において開示されたアッセイ法において用いられてもよい。
【0048】
天然のRANKおよびRANK−Lポリペプチドの配列変異体は、アッセイ法に必要とされるいずれかの生体活性を有する限り、天然のRANKまたはRANK−Lポリペプチドが利用されるいずれかの例において、本発明の実施に有用である。通常これらのアッセイ法に適したRANK変異体は、RANK−Lを結合し、それによりRANK活性を刺激するであろう、そして、適したRANK−Lの変異体は、RANKに結合し、それによりRANK活性を刺激するであろう。当該変異体において存在する変異は、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および挿入を含む。RANKおよびRANK−Lのアリル型または突然変異型は、例えば、部位特異的突然変異導入、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入など、当該技術分野で公知の様々な技術を用いることにより、これらのアッセイ法における使用のために得ることも可能である。
【0049】
開示された方法に有用なRANK分子は、野生型RANKおよびRANKの変異型を含む。変異体は、アミノ酸配列において配列番号2または4のRANK分子と異なっているかもしれないが、NF−κBの活性化など、野生型RANKの誘発と関連した生体シグナルの少なくとも一つを導入する能力を維持するであろう。適した変異体(variant)は、自然発生するアリル変異体(allelic variants)、RANKの突然変異型(mutated form)(例えばFEO RANK)、またはDNA組換え技術を用いて作成された変異体を含む。
【0050】
RANKを誘発するために有用な、RANK−Lの可溶型を含むRANK−Lタンパク質は、分子の細胞外領域に含まれるRANK結合ドメインを含むであろう。ヒトRANK−Lに関しては、細胞外ドメイン
が、タンパク質のカルボキシ末端に約249アミノ酸を含み(配列番号6のアミノ酸69−317)、そしてマウスRANK−Lに関しては、タンパク質のカルボキシ末端に約247アミノ酸を含む(配列番号8のアミノ酸70−316)。RANKを誘導するための可溶性RANK−Lは、細胞外領域全体を含んでいてもよく、またはRANK結合ドメインを含むRANK−Lの部分のみを含んでいてもよい。RANK結合ドメインは、ヒトRANK−Lに関して、配列番号6のアミノ酸69−317を有する断片、もしくはより好ましくは配列番号6のアミノ酸162−317を有する断片で見られ、または、マウスRANK−Lに関して、配列番号8のアミノ酸70−316を有する断片、もしくはより好ましくは配列番号8のアミノ酸161−316を有する断片で見られる。
【0051】
RANKを誘発するための可溶性RANK−Lはさらに、可溶性タンパク質の分泌を導くシグナルペプチドを含んでもよく、そしてまたさらに、例えば、存在下において可溶性RANK−L融合タンパク質の多量体化を刺激すると思われるポリペプチドなどの、第2のポリペプチドを含んでもよい。可溶性RANK−Lを作成するためのRANK−L断片は、公知の組換え技術を用いて調製され、細胞外領域の望ましい部分を単離してもよい。RANKを誘発するための様々なRANK−L誘導体は、組換え培地における合成によるN末もしくはC末の融合体としてなど、タンパク質もしくはその断片と他のタンパク質もしくはポリペプチドとの、共有結合性もしくは集合性の結合を含む。例えば、結合されたペプチドは、細胞膜または細胞壁の外側において、タンパク質の合成場所から機能場所までの運搬を、翻訳と共にまたは翻訳後に導くタンパク質のN末領域におけるシグナル(またはリーダー)ポリペプチド配列(例えば、酵母α−因子リーダー)であってもよい。または、RANK−Lは、ある場合において、米国特許第6,017,729号において記載されたように、ポリHisまたはFLAG(登録商標)タグと結合されてもよい。
【0052】
一般的に、RANK−LがRANKを誘発するために用いられる場合、RANK−LはRANKが由来する種と同種(例えば、ヒト)由来である。一方で、マウスRANK−Lは、ヒトRANKを誘発することも可能であり、またヒトRANK−LはマウスRANKを誘発することも可能である。
【0053】
本発明の実施において有用なRANKタンパク質は、典型的には、配列番号2または4に示した天然のRANKアミノ酸配列の全体もしくは部分と、少なくとも80%の同一性、もしくは少なくとも85%の同一性、または好ましくは少なくとも90%の同一性であるアミノ酸配列を有する。本発明の実施において有用なRANK−Lタンパク質は、典型的には、配列番号6または8に示した天然のRANK−Lアミノ酸配列の全体もしくは部分と、少なくとも80%の同一性、もしくは少なくとも85%の同一性、または好ましくは少なくとも90%の同一性であるアミノ酸配列を有する。本発明のRANKタンパク質は、誘発されたときにNF−κB活性を活性化することが可能である。
【0054】
同一性のパーセントは、以下のように判定される。アミノ酸配列の同一性は、配列番号2,4,6,もしくは8に示したアミノ酸残基の、これらと同一性がある他のタンパク質配列の部分もしくは全体(より大きなタンパク質配列の部分でありうる)との、配列を並べ、必要ならば最大の比率の同一性が達成されるようにギャップを導入した後の、パーセントとして定義される。異なる長さのアミノ酸配列を比較するためには、同一性のパーセントは、2つの配列のより小さい方に基づいて計算される。同一性のパーセントは、コンピュータプログラム、例えば、Devereuxら(Nucl.Acids Res 12:387,1984)により記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ(UWGCG)から入手可能なGAPコンピュータプログラム、または、2つ以上のアミノ酸配列を並べて比較可能な、いずれかの他の適したコンピュータプログラムを用いて判定されてもよい。GAPプログラムを用いるときは、比較を行うための好ましいデフォルトパラメータは:(1)アミノ酸に関する単項の(unary)比較行列(同一に関して1の数字、不同一に関して0の数字を含む)、並びにSchwartzおよびDayhoff、編、Atlas of Protein Sequence and Structure、National Biomedical Reserch Foundation,pp.353−358,1979により記載されたように、GribskovおよびBurgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986の加重された比較行列;(2)各ギャップに3.0のペナルティ、および各ギャップでの各符号にさらなる0.10のペナルティ;並びに(3)末端ギャップにペナルティ無しであることを含む。同一性のパーセントを判定するために有用な他のプログラムは、BESTFITプログラムでありまた、GCGコンピュータパッケージの一部として、ウィスコンシン大学から入手可能である。BESTFITプログラムを用いたデフォルトパラメータは、GAPプログラムを用いた上述のものと同様である。
【0055】
本発明のある態様は、RANKタンパク質の突然変異型を用いる。このRANK突然変異型の1つの例は、骨のパジェット病に類似性を有する稀な常染色体優性の骨組織形成不全症である「家族性膨張性骨溶解症(familial expansile osteolysis)」(FPO)として知られる病状の患者から単離したRANKの突然変異型である。これらの疾患は、増加した骨組織再構成の焦点領域により特徴づけられる。FEO遺伝子および家族性パジェット病と関連する遺伝子は、RANK遺伝子を含む同じ領域である染色体18q21にマッピングされる。FEO RANK DNAの例は、Hughesら、Nat Genet 24:45−48(2000)に記載されている。
【0056】
RANKの突然変異型は、RANKのこの型を発現する細胞において欠損を相補することが可能である分子を同定するために設計されたアッセイ法において特に有用であり、なぜならそのような分子は、RANK変異と関連する疾患を治療するための治療剤として役立つことがあり得るからである。本明細書において記載されたアッセイ法は、FEO RANK遺伝子においてRANK欠損を相補する能力を有する分子をスクリーニングするために有用である。FEO RANKの配列は、配列番号9および10で与えられる。この能力を有する分子は「FEO RANKアゴニスト」であり、そして、FEO、パジェット病、もしくは関連する疾患に苦しむ患者を治療するため、またはこの目的に使用される剤を開発するために有用である。RANK突然変異体は、FEOおよびパジェット病以外の骨疾患においても機能を果たすことが発見されるであろうことが予想される。RANKのこれらの突然変異型をコードするDNAは、疾患の治療を同定するために、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ法で単離され、そして試験されるであろう。
【0057】
RANK活性化
本明細書に記載されたアッセイ法の多くは、RANK応答性細胞の使用を含む。本明細書において用いられるものとして「RANK応答性細胞」の語句は、RANK−Lと結合することによりRANKタンパク質が誘発されるとき、またはある他の手段によりRANKが誘発されるときに、細胞内シグナルを伝達し、もしくは細胞における識別可能な(例えば、一つの細胞型と別の細胞型との差異)生体応答を刺激することが可能な膜結合型RANKタンパク質を発現する細胞を意味する。
【0058】
本明細書で用いられるものとして「RANK活性」の語句は、RANKそれ自身が活性化を受けた後に、すなわちRANKが「誘発され」た後に、生じる細胞における生体活性を意味する。一般的に「RANK活性」は、RANKを誘発することにより起こされ、また、このRANK活性は、誘発された野生型RANKタンパク質により直接的または間接的に特徴的に誘導される、一つ又はそれより多くの生体応答を評価することにより検出される。RANKが誘発されたとき、細胞膜のすぐ近傍において他のRANK分子と多量体化する。例えば、RANK特異的なアゴニスト抗体が、RANKを誘発するために用いられるならば、抗体は2つのRANK分子をすぐ近傍に運び、そしてこれらの二量化を可能にし、それによってRANK活性を誘発する。RANKが誘発されたときに、2つより多くのRANK分子が多量体化すると考えることも可能である。おそらく、多量体化は、RANKタンパク質の細胞質末端における構造変化を刺激し、それにより識別可能な生体応答をもたらす事象の連鎖を開始させる。
【0059】
RANKの誘発は、特にRANKアンタゴニストをスクリーニングすることが望まれる場合に、本明細書に記載している多くのスクリーニングアッセイ法のために必要な工程である。これは、RANK結合ドメインを有するRANK−Lタンパク質に曝すことなどの、多くの異なった方法により達成されうる。膜結合型RANK−Lなどの完全長RANK−L、または上記のものなどの可溶性RANK−L分子を用いてもよい。少なくとも、RANK−Lポリペプチドは、RANKに結合できなければならず、そしてこの能力を有するRANK−L細胞外領域の部分を有しなければならない。RANK活性を刺激するために有用なRANK−Lの型の1つの例は、米国特許第6,017,729号に記載されたRANK−Lのロイシンジッパー融合体、またはその参考文献もしくは他のものに記載された他のロイシンジッパーコンストラクトなどの、RANK−Lのロイシンジッパー融合体である。
【0060】
RANK活性を刺激するために有用なRANK−Lの型の別の例は、米国特許出願第6,017,729号に記載されたRANK−LのFLAG(登録商標)ポリ−His融合体などの、RANK−LのFLAG(登録商標)ポリ−His融合体である。
【0061】
RANKの誘発は、限定されるわけではないが、細胞におけるRANKの過剰発現;RANKおよびRANK−Lの同じ細胞における共発現;膜結合型RANKを発現する細胞を可溶性RANK−Lと接触させること;RANK発現細胞を膜結合型RANK−Lを発現する細胞と接触させること;並びに、RANKを発現する細胞にRANK向けのアゴニスト抗体を加えることなど、様々な方法で誘発されることが可能である。前記のものに加えて、RANKを誘発するいくらかの他の望ましい方法が、本明細書において開示されるアッセイ法において用いられてもよい。
【0062】
ある好ましいRANK誘発方法は、アゴニスト性抗RANK抗体、すなわち、RANKと結合してRANK活性を刺激する抗体と、RANK応答性細胞を接触させることである。アゴニスト性抗RANK抗体の例は、抗ヒトM330抗体、抗ヒトM331抗体、抗マウスM395抗体、および抗マウスM396抗体を含む。
【0063】
RANK応答性細胞においてRANK活性を刺激するさらにもう一つ方法は、表面にRANK−Lを発現する細胞もしくは可溶性RANK−Lタンパク質を分泌する細胞などのRANK−Lを発現する一つ又はそれより多くの細胞型と、RANK応答性細胞を接触させるものである。例えば、RANK応答性細胞は、RANK−Lを発現する一つ又はそれより多くの細胞株とともに、液体もしくは半固形培地において共培養されてもよい。RANK−Lを発現する細胞型の代表的な例は、トランスフェクトされた細胞によりRANK−Lの機能的発現が可能になる条件下(一時的または安定的に)で、RANK−LcDNAをコードする核酸分子がトランスフェクトされた任意の細胞型を含む。RANK−Lを発現する細胞型のさらなる例は、初期T細胞(抗CD3抗体で活性化される)、B細胞(例えば70z3細胞株)、およびマウス胸腺腫細胞株EL−4(Andersonら、Nature 390:175−179(1997))を含む。加えて、ST2(Yasudaら、Proc.Nat‘l.Acad.Sci USA 95:3597−3602(1998))、およびMC3T3−E1,hMS(Hofbauerら、J.Bone Min.Res.15:2−12,2000)、並びに骨肉腫細胞株ROSおよびMG−63(Hofbauerら、2000)など、ヒト起源およびマウス起源両方の、複数の破骨細胞および骨髄ストローマ細胞は、RANK−Lを発現する。RANK−Lの発現は、グルココルチコイド、1,25−ジヒドロキシビタミンD3、インターロイキン1(IL−1)、IL−6、IL−17、TNFα、プロスタグランジンE2、またはパラチロイドホルモンなどの骨吸収因子を用いて、これらの前述の細胞型において上昇制御させることも可能である(Hofbauerら、2000を参照されたい)。
【0064】
また、可溶性RANK−Lを発現する細胞は、培養ウェルの個体表面上およびRANK応答性細胞において培養され、半固形培地において再懸濁され、そしてRANK−L発現細胞の上端で重ねられてもよい。これらのRANK応答性細胞におけるRANKは、半固形培地において分泌かつ拡散されたRANK−Lと接触させることにより誘発される。
【0065】
ある態様においては、RANK−Lを発現する細胞は、分子の可溶型を分泌する。可溶性RANK−Lを分泌する細胞型の代表的な例は、抗CD3および/または抗CD28抗体で活性化された初期T細胞(Kongら、Nature402:304−309(1999))、並びにRANK−Lをコードする核酸分子をトランスフェクトしたヒト293繊維芽細胞(Laceyら、Cell93:165−178(1998))を含む。
【0066】
RANK応答性細胞において、RANK活性を刺激するもう一つの方法は、例えば、強力で構成的なプロモーターの制御下でRANKをコードする核酸配列を含むDNAコンストラクトで、RANK応答性細胞を遺伝学的に形質転換することにより、RANK応答性細胞においてRANKを過剰発現することである。例えば、外来的に加えられるRANK−L不存在下において、発現ベクター(pDC409−hRANK)をトランスフェクトされた293/EBNA細胞は、RANKを過剰発現する結果として、NF−κB活性(前記Andersonら、1997を参照されたい)およびNF−κB応答性プロモーター−レポーターを活性化する(Galibertら、J.Biol.Chem.273:34120−27(1998)を参照されたい)。RANKを過剰発現する細胞の膜におけるRANKの濃度は、非常に高いので、RANKは自発的にこれらの膜で多量体化し、それによりRANK活性を誘発する。RANKの過剰発現を誘導するためのコンストラクトの使用に適したRANK核酸は、配列番号2および4(当該DNAは、配列番号1および3に示した核酸配列により例示される)に示したRANKタンパク質をコードすることが可能であるDNA、または、配列番号2もしくは4に関するタンパク質と少なくとも85%のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質をコードするその変異体であって、該タンパク質がさらに細胞において過剰発現されたときRANK活性を誘発する能力を維持しているものを含む。
【0067】
RANKを過剰発現するために用いることが可能である発現ベクターの代表的な例は、限定されるわけではないが:pDC400系列ベクター(Giriら、EMBO J.13:2822−2830(1994));pDC300系列ベクター;モロニーの長い末端反復(LTR)プロモーターを利用したレトロウイルスベクターpBMNZ(KinsellaおよびNolan、Human Gene Therapy 7:1405−1413(1996))、またはClontech(1020 East Meadow Circle、カリフォルニア州パロアルト94303−4230、USA)から入手可能なハイブリドテトラサイクリン誘導領域(pREVTRE)を含むレトロウイルスベクターなどを含む。これらの同じベクターは、該DNAの導入が本発明の他の側面に必要とされることがあり得る場合に、RANKもしくはRANK−LのDNAを細胞に導入するために用いられてもよい。
【0068】
RANK活性を誘発する別の方法は、FEO RANK(配列番号10)のように、RANK応答性細胞において通常のレベルで発現するとき、RANK−Lを結合することなく一つ以上のRANKを仲介したシグナリング経路を活性化するRANKタンパク質の型を、RANK応答性細胞において発現させることである。
【0069】
NF−κBの活性化に加えて、RANKの誘発よりもたらされる検出可能な生体応答は、例えば、c−srcキナーゼの活性化、JNKの活性化、破骨細胞前駆体の破骨細胞への分化、T細胞の活性化などを含む。c−srcは、適切な破骨細胞の機能において重要である(例えば、Loweら、Proc Natl Acad Sci USA 90:4485−89(1993)を参照されたい)。本発明の1つの側面において、RANK活性は、レポーター遺伝子がRANK応答性プロモーターに機能可能なように連結されているプロモーター/レポーター コンストラクトにより、発現されるレポータータンパク質の量もしくはレベルを評価することにより判定される。
【0070】
本明細書において用いられるものとして「機能可能なように連結されている」の用語は、互いに機能的に関係し、そして、好ましくは単一の核酸鎖において連続的に位置する、核酸配列を意味する。例えば、制御核酸配列が、(それ自身により、または一つ以上の他の制御核酸配列とともによるどちらかで)コーディング配列の転写を制御するならば、制御核酸配列は、コーディング配列(例えば、レポータータンパク質をコードする配列)に機能的に可能なように連結されている。典型的には、機能可能なように連結されている核酸配列は、同じ核酸分子において連続的であるが、ある例においては、制御配列は、「トランス作用」であり、異なる核酸分子上に存在していてもよい。
【0071】
RANKアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングアッセイ法:
半固形培地アッセイ法
本発明の1つの態様において、提供される方法は、以下の:(a)RANK応答性細胞を候補分子と接触させ,RANK応答性細胞は半固形培地において培養される;そして(b)半固形培地においてRANK応答性細胞を接触させることにより、候補分子と接触させない一つ又はそれより多くのリファレンスRANK応答性細胞と比較し、コロニー形成率が高められ、または低められるのを観察する、工程を含む。本発明のこの側面の方法は、RANK活性にアンタゴナイズする分子をスクリーニングするために用いられる場合において、さらに、RANK応答性細胞におけるRANK活性を刺激する工程を含む。
【0072】
本明細書において記載されるものとして、用語「半固形培地」は、細胞が付着可能な固形基質を与えることなく、そして、半固形培地に加えられる細胞がそこにおいて懸濁され、かつそれにより半固形培地において沈み、半固形培地が配合された容器の内表面に接触し付着することが予防されるくらい、十分な粘性を有している、細胞成長培地を意味する。本発明の実施において有用な半固形培地は、典型的には、液体培地に0.1%から5%(w/v)の量で溶解されたゲル化薬剤(例えば、寒天またはメチルセルロース)を含む。
【0073】
本発明のこの態様において、RANK応答性細胞は、半固形培地において、RANK活性を調節する能力に関して試験するための一つ又はそれより多くの分子の存在下で広げられる。本発明のこの態様の実施において用いられる細胞は、RANKを発現し、半固形培地においてコロニーを形成することが可能であり、RANKの活性化により刺激されて、半固形培地においてゆっくり成長する細胞型、あるいは半固形培地において成長できない細胞型に分化する。半固形培地に広げられる前もしくは同時に、または広げられた後に、テスト分子を細胞と接触させることも可能である。
【0074】
これらのアッセイ法において、RANK応答性細胞は半固形培地に懸濁され、そして、細胞が懸濁された半固形培地より高濃度のゲル化剤を含む半固形培地の層の表面に注がれてもよい。例えば、RANK応答性細胞は、濃度が0.3%(w/v)である寒天を含む半固形培地に懸濁されることも可能である。また、懸濁された細胞は、寒天をより高濃度で、例えば0.5%(w/v)の濃度で含む半固形培地の層上に広げられてもよい。
【0075】
アンタゴニストを検出するアッセイ法はより典型的には、アンタゴニストの存在下にでは、測定される応答が失われることが予定されるのに対し、RANKアンタゴニストを検出するための、この半固形培地方法の珍しい特徴は、アンタゴニストが存在するときに陽性の応答(すなわち、コロニー形成および/またはコロニー成長)が高められる点である。さらに、本アッセイ法は、アンタゴニストに応答している細胞の再生を可能にし、テスト分子が組換えcDNAライブラリーの形式で細胞に供給されたときに特に有用な特徴を可能にする(以下を参照されたい)。
【0076】
半固形培地アッセイ法を用いることにより、RANKをアゴナイズするテスト分子の能力は、RANK応答性細胞をテスト分子と接触させ、そして、半固形培地におけるコロニー形成率またはコロニー成長率が、テスト分子を接触させない同じRANK応答性細胞のリファレンス培地におけるコロニー形成率と比較して減少するのを観察することにより、検出される。RANKアゴニストを検出するために望ましいならば、陽性対照培地を用いて、リファレンス細胞をRANK−Lまたはアゴニスト性抗RANK抗体などの公知のRANKアゴニストと接触させる比較のリファレンスを提供してもよい。
【0077】
半固形培地を含むアッセイ法に有用な細胞は、一般的に、半固形培地におけるコロニー形成が可能であり、また、RANKの誘発で刺激されることにより半固形培地におけるコロニー形成が不可能な細胞型に分化する、RANKを発現する任意の細胞が含まれる。一般的に、これらの細胞は、RANKが誘発されるときに破骨細胞に分化する。本発明のこの側面の実施において有用な細胞の代表的な例は、RAW264.7細胞株(ATCC寄託番号TIB−51)、任意の哺乳動物種の脾臓、末梢血液、または骨髄細胞から入手可能な未分化造血細胞、破骨細胞特異的酵素マーカーであると一般的に思われている、TRAPを発現する破骨細胞に分化することが可能であるBCL−X1/タグ細胞株(Hentunenら、J.Clin.Invest.102:88−97(1998))、およびマウスマクロファージ様破骨細胞前駆細胞株C7(Nakagawaら、Biochem.Biophys.Res.Comm.253:395−400(1998))を含む。RAW264.7細胞(マウスマクロファージ細胞株)は、RANK−Lを加えることにより刺激され、多核の破骨細胞(半固形培地においてコロニーを形成することが不可能である)に分化する。
【0078】
コロニー形成は、テスト分子と接触させた培地におけるコロニーの大きさおよび/または数を、RANKの潜在的アゴニストまたはアンタゴニストと接触させていない同じRANK応答性細胞の対照培地において存在するリファレンスコロニーの大きさおよび/または数と、視覚的に比較することにより評価される。コロニーの大きさおよび/または数は、例えばRANK応答性細胞をテスト分子と接触させた後1日から10日、またはより好ましくは、細胞をテスト分子と接触させた後5日から10日といった望ましい期間の後に、評価される。培地の視覚的比較は、例えば、光学顕微鏡または位相差顕微鏡を用いてなされることも可能である。
【0079】
再度例示としては、分光光度法で測定される可視光伝達の変化を用いて、一つの培養ウェル内におけるコロニー形成率を測定することも可能である。加えて、半固形培地における成長の前に重要な蛍光染色を用いて細胞を標識するならば、コロニー形成率は、蛍光分析的に測定されることも可能である。また、培養ウェルにおける細胞のDNA含有物が、コロニー形成率を評価する標準的な手段を用いて測定されることも可能である。
【0080】
前述の半固形培地手法が、RANKアンタゴニストを検出するために用いられるならば、アッセイ法は、細胞におけるRANKの活性化を含む工程を含むであろう。細胞は、RANK活性化工程の前、間、または後にテスト分子(すなわち、推定上のRANKアンタゴニスト)と接触される。RANK活性化は、例えば細胞においてRANKを過剰発現することにより、または細胞をアゴニスト性抗RANK抗体もしくはRANK−Lと接触させることにより、達成されることも可能である。一方で、誘発は、RANK応答性細胞においてRANK−Lを共発現させ、可溶性RANK−LとしてRANK−Lを培地に加えることにより、達成されることも可能であり、または、それは本明細書に記載される他の手段により提供されてもよい。テスト分子がRANKアンタゴニストであるならば、細胞は、テスト分子が加えられない同様の培地のものよりも多く分裂するであろう。RANKアンタゴニストであるテスト分子が、RANKの誘発の前に加えられるならば、テスト分子と接触させる培地におけるコロニーが、テスト分子と接触させない培地におけるコロニーよりも、多く現れるであろう。アゴニストがコロニー形成の後に加えられるならば、アゴニストに曝されたコロニーは、アゴニストに曝されていない対照培地におけるコロニーよりも、大きく成長するであろう。
【0081】
前記の細胞を用いて、RANKアゴニストとして機能するテスト分子の能力は、RANK応答性細胞をテスト分子と接触させ、そして、半固形培地におけるコロニー形成率をテスト分子と接触させない同様のRANK応答性細胞の対照培地におけるコロニー形成率と比較して低められているのを観察することにより、検出される。本アッセイ法において、RANKアゴニストは、細胞を刺激して、半固形培地におけるコロニー形成が不可能である細胞型に分化させるであろう。これらのアッセイ法のために典型的に用いられる細胞は、RANKアゴニストであるテスト分子に曝されるとき、破骨細胞に分化するであろう。これらのアッセイ法に用いることが可能である対照のRANKアゴニストは、膜結合型のRANK−Lおよび可溶型のRANK−Lを含む。
【0082】
半固形培地アッセイ法の1つの変形において、この戦略は、RANK活性にアンタゴナイズするまたはアゴナイズする能力がスクリーニングされる候補タンパク質分子の群をコードするcDNAライブラリーなどの、核酸ライブラリーをスクリーニングするために用いられる。cDNAライブラリーは、任意の当該技術分野で認識された手段、例えばトランスフェクションまたは形質転換により、さらに詳しくは下記のように、RANK応答性細胞の群に導入される。RANKアンタゴニストが求められているならば、cDNA分子が導入された細胞は半固形培地において培養され、また、RANKは、本明細書に記載された方法の一つにより、または別の適した方法により、細胞において誘発される。懸濁され遺伝学的に修飾された細胞におけるコロニー形成率またはコロニー成長率は、対照のDNA以外のDNAが導入されていない同様の細胞のものと比較される。適した対照細胞は、例えば、cDNAライブラリーの代わりにベクターDNAを受け入れることも可能である。遺伝学的に修飾された群におけるコロニーで、対照の群におけるコロニーより顕著に早く成長しているものを単離し、またさらに研究することも可能である。そのようなコロニーから外来DNAを回収し、コロニーの高められた成長の原因であるRNAKアンタゴニストを同定し、単離することもできる。例えば、導入される核酸分子は、速く成長しているコロニーから単離されることも可能であり、また、それぞれの核酸配列が決定されることも可能である。単離され配列決定された核酸分子によりコードされるタンパク質は、発現および/または化学的に合成し、そして、RANK活性にアンタゴナイズする能力を確認し研究することも可能である。
【0083】
RANKのアゴニストは、このアッセイ法において、上記のようにアッセイを行うことによるがRANKを誘導することなしに、認識される;RANKアゴニストをコードするcDNAを含む細胞は、よりゆっくり成長し、またはコロニー形成が不可能であろう。RANKアゴニストをコードするcDNAは、上記のゆっくり成長するものから回収される。
【0084】
哺乳類遺伝子を運搬し発現するベクターは、RANK活性を調節する能力に関して上記の半固形培地アッセイ法において試験されるタンパク質をコードするcDNAライブラリーを導入するのに適している、多数の異なる型のものが開発されている(MillerおよびCalos、編、「哺乳類細胞のための遺伝子運搬ベクター」Current Comm. Biol.,Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク1987)。裸のDNAは、多数の技術のいずれか一つ、限定されるわけではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション(Bermanら、Proc.Natl.Acad.USA81:7176,1984);DEAEデキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合体(Deansら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA81:1292,1984);エレクトロポレーション、リポフェクチン(Felgnerら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA84:7413,1987)、ポリブレントランスフェクション(KawaiおよびNishzawa,Mol.Cell.Biol.4:1172,1984)および細胞膜のレーザーマイクロパンクチャーによる直接的な遺伝子運搬(Taoら、Proc.Nat‘l.Acad.Sci.USA84:4180,1987)などを用いたトランスフェクションにより、哺乳類細胞に物理的に導入されることも可能である
加えて、遺伝子運搬のために、組換え体の感染性ウイルス粒子を利用する様々な感染技術が開発されている。この方法において用いられてきたウイルスのベクターは、シミアンウイルス40由来のウイルスベクター(SV40;Karlssonら、Proc.Nat‘l.Acad.Sci.USA82:158,1985);アデノウイルス(Karlssonら、EMBO J.5:2377,1986);アデノ関連ウイルス(LaFaceら、Virology162:483,1988)およびレトロウイルス(Coffin、1985、Weissら(監修),RNA Tumor Viruses、第2編、2巻.Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨークのp17−71)を含む。これらの同じウイルスベクターは、該DNAの導入が本発明の他の側面に必要とされるかもしれない場合に、RANKまたはRANK−LのDNAを細胞に導入するために用いられてもよい。
【0085】
遺伝子の運搬および発現の方法は、数多く、そして哺乳類細胞において遺伝物質を導入し発現するために本質的に機能する。いくらかの上記の技術、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション(Bermanら、上記、1984);プロトプラスト融合(Deansら、上記、1984);エレクトロポレーション(Cannら、Oncogene 3:123,1988)並びに、組換えアデノウイルス(Karlssonら、上記;Ruetherら、Mol.Cell Biol.6:123,1986);アデノ関連ウイルス(LaFaceら、上記);および、レトロウイルスベクター(Overellら、Oncogene 4:1425,1989)での感染などは、造血性またはリンパ球の細胞を形質転換するために用いられている。初期Tリンパ球は、エレクトロポレーション(Cannら、上記、1988)およびレトロウイルス感染(Nishiharaら、Cancer Res48:4730,1988;Kasidら、上記、1990)によりうまく形質転換されている
前記の半固形培地スクリーニング戦略を含むアッセイ法は、小さい有機分子またはペプチドのライブラリーなどの、分子の収集物(collection)をスクリーニングするために下記のとおり有効である。マイクロタイタープレート、例えば96ウェルマイクロタイタープレートを用いることも可能であり、そして、異なった候補のRANK活性アゴニストまたはアンタゴニストを各ウェルに、RANK応答性細胞の半固形培地のアリコートとともに入れる。このアッセイ法に用いられる細胞は、RANKの誘発に応答して分化し、そして、分割を停止するものと通常思われる細胞である(適した細胞の記載に関しては、上記を参照されたい)。RANKアゴニスト活性を有する分子を検出することが望ましいならば、培地に加えることも可能であり、または本明細書に記載したある他の手段により提供されることも可能であるRANK−Lなどの、RANKを誘発する刺激物が提供される。再度例示としては、候補分子を溶解し、そして半固形培地全体にくまなく分配する、あるいは半固形培地の上表面に注ぎ、かつくまなく拡散することも可能である。
【0086】
望ましいならば、RANK応答性細胞に導入された核酸分子は、RANK応答性細胞ゲノムに安定的に組み込まれてもよい。例えば、レトロウイルスベクターにおいて作成されたcDNAライブラリーを、RANK応答性細胞株をトランスフェクトするために利用してもよい。導入DNA分子をRANK応答性細胞のゲノムに安定的に組み込む利点は、連続的で高いレベルの遺伝子発現が典型的に得られることである。本明細書における実施例2は、RAW264.7細胞およびレトロウイルス発現ライブラリーを用いて、RANKシグナリングのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするための代表的なプロトコールを開示する。
【0087】
本発明の方法の別の応用は、欠損RANKシグナルを相補する分子(例えばcDNA、タンパク質、およびペプチド)をスクリーニングすることである。例えば、TRAF6結合部位が欠落している、ヒトRANKの型(用語を「RANKΔ340―421」とする)は、造血前駆細胞からの破骨細胞形成を刺激することが不可能である。RANKのこの型は、Galibertら、J.Biol.Chem.273:34120,1998に記載されており、ヒトRANK(配列番号2)のその型に対応するアミノ酸配列を有するが、TRAF6結合部位(配列番号2のアミノ酸340−421)を欠失している。本発明の方法は、よって、RANKΔ340−421シグナリング変異を相補し、そして、それにより造血前駆体細胞からの破骨細胞形成も可能になる、分子のスクリーニングに用いられうる。本明細書における実施例3は、RANKΔ340−421を発現するRANK応答性細胞株の調製を記載する。
【0088】
MMP−9またはTRAPプロモーターを用いたプロモーター/レポーターアッセイ法
本発明のさらなる側面において、本明細書において、プロモーターが機能可能なように連結された配列をコードするタンパク質の発現が高められることにより、RANK活性に対して応答可能であることが以前に公知ではないプロモーターを用いたプロモーター/レポーターコンストラクトを用いるスクリーニングアッセイ法が提供される。特に、本プロモーター/レポーターコンストラクトは、TRAP遺伝子由来またはMMP−9遺伝子由来のプロモーターを用いる。本明細書における実施例4は、ヒトIL−2α受容体に融合されたマウスMMP−9プロモーター(Satoら、J.Biol.Chem.268:23460−68(1993);SatoおよびSeiki、Oncogene8:395−405(1993))のコンストラクトを記載する。ヒトMMP−9プロモーターまたはTRAPプロモーター(ヒトまたはマウス;例えばReddyら、Bone16:587−593(1995)を参照されたい)もまた、これらのスクリーニング方法に用いられてもよい。
【0089】
本発明のこの側面に関するアッセイ法は、以下の:(a)培養されたRANK応答性細胞をテスト分子と接触させ、RANK応答性細胞がレポーター分子をコードする核酸分子を含み、核酸分子がRANK応答性制御核酸配列と機能可能なように連結されたレポーター分子である、そして(b)接触させたRANK応答性細胞におけるレポーター分子の発現レベルが、候補分子と接触させない一つ又はそれより多くのリファレンスRANK応答性細胞におけるレポーター分子の発現レベルと比較して、高められ、または低められるのを観察する、工程を含む。RANK活性にアンタゴナイズする分子をスクリーニングするために用いられる場合、本発明のこの側面の方法は、さらにRANK応答性細胞におけるRANK活性を刺激する工程を含む。
【0090】
RANKアゴニストは、この型のアッセイ法において同定され、RANKアゴニストと接触させたRANK応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルが、RANKアゴニストと接触させていない対照のRANK応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルと比較して、増大されるのを観察することにより検出される。対照の細胞は、典型的に、RANKアゴニストと接触させたRANK応答性細胞と同じ型のRANK応答性細胞である。アッセイが、RANKアゴニストの同定に向けられる場合、プロトコールは、例えば意図的に細胞をRANK−Lと接触させるなどの、RANKを誘発する工程を含まない。
【0091】
RANKアンタゴニストの存在は、RANKが誘発され、かつ候補アゴニストと接触させられた、RANK応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルが低められ、または欠如するのを観察することにより検出される。レベルまたはレポーターの発現は、RANK活性化剤と接触させたが、候補RANKアンタゴニストと接触させていない対照RANK応答性細胞におけるレポーター発現のレベルとの比較により評価される。対照の細胞は、典型的には、RANKアンタゴニストと接触させたRANK応答性細胞と同じ型のRANK応答性細胞である。
【0092】
この型のアッセイ法を用いて、RANK活性のアンタゴニストをスクリーニングするとき、RANK活性はRANK応答性細胞において刺激されなければならない。典型的に、RANK活性は、RANK応答性細胞を候補分子(群)と接触させる前または同時に誘発される。ある場合において、RANK応答性細胞を候補分子と接触させた後にRANK活性を刺激することが望ましいかもしれない。RANK活性を刺激する手順には、上記のRANK活性を刺激する手順が利用されてもよい。
【0093】
本発明のこの側面において有用な細胞は、RANKタンパク質を発現し、そして、RANKの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。本発明のこの側面において有用ないくつかの細胞は、天然にRANKタンパク質を発現し、そして、RANKの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。細胞のこの型の例は、RAW264.7細胞、TRAP+破骨細胞に分化させることが可能であるBCL−X1/タグ破骨細胞株(Hentunenら、J.Clin.Invest.102:88−97(1998))、およびマウスマクロファージ様破骨細胞前駆体細胞株C7(Nakagawaら、Bioch.Biophys.Res.Comm.253:395−400(1998))を含む。
【0094】
本発明のこの側面において有用な他の細胞は、遺伝学的に修飾されており、RANKを発現し、かつ/または、RANKの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。この後者の細胞型の例は、293/EBNA細胞を含む。実質的に、培地における成長が可能な任意の細胞型は、遺伝学的に修飾され、これらのアッセイ法の目的のためにRANKを発現することが可能である。細胞にRANKDNAを導入するために適した多数の他の方法は、この明細書の他の場所に記載されており、また、ウイルスベクターおよび他の方法、例えばエレクトロポレーション、リポフェクチンなどを含む。
【0095】
RANK応答性細胞は、例えば、上記のこれらの手順を利用することによる、または他の任意の望ましい方法によるなど、任意の許容可能な方法において1つ又はそれより多くの候補分子と接触させることも可能である。
【0096】
本発明のこの態様において有用であるレポーター分子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および異種タンパク質向けの特異的な抗体などを用いることにより、RANK応答性細胞の表面において検出されることも可能な任意の異種(heterologous)表面タンパク質を含む。有用なヘテロ表面タンパク質の例は、ヒトIL−2受容体、マウスIL−4受容体(mIL−4Rと略する)、ヒトCD2、CD4またはCD8タンパク質を含む。
【0097】
c−src活性またはF−アクチンリングの検出に基づいたアッセイ法
本発明の別の側面において、候補分子がc−srcチロシンキナーゼ活性および/またはF−アクチンリング形成のRANKに仲介された誘導を高め、または阻害する程度を測定することにより、RANK分子およびRANK−Lアンタゴニストをスクリーニングするアッセイ法が提供される。F−アクチンリングは、活性化破骨細胞の特徴である細胞骨格構造である(LakkakorpiおよびVaananen,J.Bone Min.Res.6:817−26(1991)。
【0098】
F−アクチンリングを検出するために、例えば3%パラフォルムアルデヒドに曝すことなどにより細胞を固定し、そしてアクチンと特異的に結合する蛍光プローブで細胞を染色することにより視覚化する。適した蛍光タグは、Molecular Probes、オレゴン州ユージーンから入手可能なファロイジンである。蛍光シグナルは、例えば、標準的な蛍光顕微鏡を使用して検出することができ、そして、F−アクチンリングを有する細胞の数は視覚的に定量化できる。F−アクチンリングは、細胞の周辺におけるF−アクチンの連続リングとして同定され、そしてこれらの明確な構造は、顕微鏡で見ることも可能である。F−アクチンリングは、破骨細胞以外の細胞型には現れない。
【0099】
c−src活性を検出するために、この酵素のリン酸基転移活性は、p34/cdc2ペプチド(KVEKIGTYGVVYK)(配列番号13)などの、酵素の基質として機能する合成基質を用いて、測定される。c−src活性を測定するアッセイ法の例は、実施例8において提供される。
【0100】
本発明のこの側面は、細胞を活性化して、破骨細胞、または、c−src活性を活性化することによりRANK誘発に応答する任意の細胞に、分化させることが可能である、RANKタンパク質を発現する細胞を利用する。本発明のこの側面の好ましい態様において、RANKタンパク質は、細胞が分化している間にc−srcチロシンキナーゼ活性のレベルの上昇、およびF−アクチンリング形成を誘導する。この態様において有用な細胞の例は、RANK誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能であり、そして、c−src活性及びF−アクチン形成を誘導することが可能なRANKの型を発現する任意の細胞である。そのような細胞は、破骨細胞前駆体に富んでいる初期造血細胞、RAW264.7細胞などの細胞株を含む。適した初期造血前駆体は、骨髄細胞、胎児の肝臓、または末梢血液由来であってもよい。適した細胞は、上記の方法を用いて、遺伝学的に修飾されており、RANKを発現する細胞をも含む。
【0101】
この型のアッセイ法に関して、テスト分子は、分化が完成した後、約5日までの間、培養培地に加えられてもよい。c−src活性またはF−アクチンリング形成は、細胞が任意の都合の良い時間、テスト分子に曝された後にアッセイされる。例えば、活性は、曝してから6−12時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、またはより長い期間の後に測定される。テスト分子に曝した後に細胞において検出されたF−アクチンリングの量またはc−src活性が、RANK DNAが導入されていない対照のRANK−/−細胞において観察されるレベルと比較して増大されるならば、テスト分子はRANKアゴニストであるとして同定される。
【0102】
この型のアッセイ法において、テスト分子は、野生型RANKタンパク質に特有な、ある生体活性を相補する能力が評価されてもよい。一般的にこの型のアッセイ法は、野生型RANKタンパク質が、破骨細胞への分化の過程を実行中の細胞においてc−src活性およびF−アクチンリング形成を誘導可能である事実を利用する。しかしながら、RANK活性化が破骨細胞の分化を誘導可能であるためにTRAF6結合ドメインは必要とされない一方、RANKのこれらの2つの活性は、RANKタンパク質からTRAF6結合ドメインを欠失することにより、排除されることも可能である(実施例8を参照されたい)。このように、RANKタンパク質のTRAF6欠失突然変異体が破骨細胞前駆体において発現されるとき、誘導しているRANKは細胞を分化させるであろうが、より高いレベルのc−src活性を発現させることはなく、また、これらの細胞はF−アクチンリングを示すことはないであろう。ヒトRANKタンパク質に関しては、TRAF6結合ドメインは、配列番号2のアミノ酸340−421により規定される領域内に含まれる。従って、該RANK突然変異体が発現する細胞は、突然変異体RANKにおけるTRAF6結合部位の欠失を相補することが可能である分子をスクリーニングするアッセイ法において、用いられることも可能である。テスト分子がこの欠失を相補する能力は、RANK突然変異体を発現している細胞とテスト分子を接触させる場合において、RANKが誘発されるとき、c−src活性化およびF−アクチン形成が起こることを観察することにより検出される。
【0103】
RANKのTRAF6突然変異を有する使用に適した細胞は、RANKノックアウト動物、例えば以前に記載されたRANK−/−マウス由来の初期造血前駆細胞含む(Dougallら、1999)。このアッセイ法を実行するために、RANKノックアウト動物由来の細胞は、TRAF6結合領域を欠落した突然変異体RANKタンパク質をコードしたDNAを導入することにより遺伝学的に修飾される。この目的のためのDNAの例は、TRAF6結合ドメインコーディング配列を欠失したマウスまたはヒトRANKのDNAである。RANK DNAを導入するために適した手段は、タンパク質をコードするDNAが連結されたウイルスベクター(例えばレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター)での感染、または上記のいくらかの他の手段を含む。RANK突然変異体DNAを導入後、上記のRANKを誘発するいくらかの手段、またはRANKを誘発するいくらかの他の望ましい手段を用いて、RANKタンパク質を誘発することにより、細胞を誘導して破骨細胞に分化させる。テスト分子がRANKのこの突然変異型における欠失を相補するかどうかを判定するために、細胞が分化を行っているインキュベーション時間の一部または全体に、分子を培養培地に加える。
【0104】
CaPO 4 の吸収に関するスクリーニングアッセイ法
また、リン酸カルシウムの合成基質のRANK依存性吸収に基づくアッセイ法においてRANKアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法も提供される。野生型RANKタンパク質は、細胞を、リン酸カルシウム(CaPO4)を吸収可能な破骨細胞に分化させることも可能であり、一方でTRAF6結合部位を欠落したRANKタンパク質からのシグナルは、CaPO4吸収を開始させない。このスクリーニングアッセイ法に有用な細胞は、RANKの活性がCaPO4吸収を誘導する任意の細胞、即ち、RANKが誘発されるときに破骨細胞に分化する細胞を含む。このアッセイ法において使用される細胞の例は、初期造血前駆体、初期造血細胞、RAW264.7細胞、または、この活性を維持する型のRANKをトランスフェクトした任意の細胞(例えば、RANK−/−マウス由来の破骨前駆細胞)を含む。
【0105】
本発明の1つの態様において、この方法は、上記のTRAF6欠失突然変異体などの不活性RANK突然変異体を相補する分子をスクリーニングするために用いられる。
【0106】
このアッセイ法を行うために適した手順は、実施例9において示したものによって例示される。一般的に、細胞は、CaPO4で薄く被覆した商業的に使用可能な薄い顕微鏡スライド上で培養される。このように成長したRANK応答性細胞は、CaPO4を吸収する細胞に分化することにより、RANKの誘発に応答するであろう、CaPO4フィルムにおける離散的なピットの形成をもたらす。RANKアンタゴニストを検出するために、テスト分子と接触させたスライド上のピット数を、テスト分子と接触させていないスライド上のピット数と比較する。
【0107】
RANKアゴニストは、この型のアッセイ法において、CaPO4フィルム上で適した細胞を成長させ、かつ、細胞において最初にRANKを誘発することなく細胞をテスト分子と接触させることにより、検出される。
【0108】
以下の実施例は、本発明を実施するために現在意図される最も良い態様(ベストモード)を明らかにするが、その発明に限定されると解釈してはならない。
【0109】
実施例1.
本実施例は、RANK−L刺激の不存在下における内因性c−junキナーゼ(JNK)を活性化する相対能力に関して、ヒトFEORANK(配列番号9)をコードするDNAを含むプラスミドがトランスフェクトされたマウス3T3細胞、および、ヒト野生型RANK(配列番号1)をコードする組換えDNAを発現するマウス3T3細胞の評価を記載する。JNKは、RANKシグナル伝達の結果として活性化されることが公知である。
【0110】
JNKアッセイ法に関して、トランスフェクション後24時間で3T3細胞から全細胞抽出物を調製した。20mM HEPES、pH7.4、2mM EGTA、50mM β−グリセロールリン酸、1mM DTT、1mMナトリウムO−バナジウム、1%Triton−X 100、10%グリセロールおよび、プロテアーゼ阻害因子ロイペプチン、ペプスタチンA、およびPMSFを含む緩衝液に細胞を溶解した。浄化された溶解液を、抗JNK(FL)抗体および抗JNK(C17)抗体(両方ともSanta Cruz Biotechnology Inc.カリフォルニア州サンタクルズより入手可能)それぞれ1μgで免疫沈降した。免疫複合体を溶解緩衝液で3回、洗浄緩衝液(500mM LiCl、100mM Tris、pH7.5、0.1%Triton X−100、1mM DTT)で2回、そしてアッセイ緩衝液(20mM MOPS、pH7.0、2mM EGTA、10mM MgCl2、1mM DTT、0.1%TritonX−100)で3回洗浄した。JNK活性は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼとc−junキナーゼのアミノ酸1−169との融合タンパク質(GST−cJun(1−169))(UBI、ニューヨーク州レイクプラシド)1μg、およびアッセイ緩衝液40μlの基質として[32P]−ATP5μCiを用いて、20分間30℃で免疫複合体アッセイ法によって判定した。反応産物を4−20%SDS/PAGE上で分離し、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
【0111】
JNKは、FEO RANKの発現に応答して活性化されたが、野生型RANKの発現には応答しなかった。
【0112】
実施例2.
本実施例は、半固形培地アッセイ法において、RAW264.7細胞およびレトロウイルス発現ライブラリーを用いたRANKシグナリングのアンタゴニストのスクリーニング法を記載する。
【0113】
レトロウイルスcDNAライブラリーをpBMNZにおいて構築する。好ましくは、破骨細胞を形成しない細胞、すなわちRANK活性のアンタゴニストを発現することが可能な細胞(例えば、GM−CSFまたはIL−10で活性化されたマクロファージ)から単離されたmRNAに対してcDNAを合成する。レトロウイルス粒子は、フェニックス(Phoenix)細胞株(Gary Nolan博士、スタンフォード大学、USAにより提供される)および適切なエンベロープタンパク質(例えば、エコトロピックエンベロープタンパク質、アンフォトロピックエンベロープタンパク質、またはポリトロピックエンベロープタンパク質など)を用いて詰め込まれる。例えば、一時的に産生されたレトロウイルスベクターの場合において、フェニックスパッケージング細胞を、pBMNZレトロウイルスベクターにおいて作成されたコンストラクトでトランスフェクトし、そして、培地の上清をトランスフェクション後48時間で回収する。レトロウイルス粒子は、標準的な技術を用いて単離される。例えば、ウイルス粒子は、0.45マイクロフィルターを通して殺菌濾過することにより、膜断片から精製される。
【0114】
最適な感染を誘導する条件下で、RAW264.7細胞を、封入されたレトロウイルスcDNAライブラリーで感染させる。例えば、最適な感染条件は、テストレトロウイルスコンストラクトから発現されたレポーター遺伝子の発現をモニターすることにより、判定されることも可能である。β−ガラクトシダーゼをコードするレトロウイルスコンストラクト(例えば、pBMNZ/LZRS;KinsellaおよびNolan、1996、上記)は、レトロウイルス粒子を産生するために用いられることも可能である。ウイルスストックの希釈系列での細胞の感染の後、β−ガラクトシダーゼが発現する細胞の数を感染後24時間モニターすることも可能である。様々な条件、例えば、エンベロープタンパク質の選択、感染の重複、感染インキュベーション時間の長さ、細胞周期を促進させるための条件下の細胞の前処理、ポリブレンまたは組換えフィブロネクチン断片などのコファクターなどは、最大量のテストウイルスが細胞に入る条件を判定するために変えられることも可能である。
【0115】
感染細胞におけるcDNAの発現を可能にする適切な時間の後、細胞を半固形培地おいて広げる。感染細胞を広げるための例示的条件は、24ウェルプレートの各ウェルにおいて、細胞密度1X105細胞/mlから1X106細胞/mlで感染させた細胞を含む0.3%(w/v)メチルセルロース培地3mlを広げるものである。RANK−Lの可溶性ロイシンジッパー型(200ng/ml)は、半固形培地に含まれる。
【0116】
5日から8日に渡って細胞を培養し、そして、非感染の対照群由来のコロニーよりも著しく速く成長している感染細胞群由来のコロニーを、さらなる解析のために単離する。例えば、関心のあるコロニーは、細胞数を増大させるためにRANK活性の不存在下において、無菌で単離され、そしてさらに成長させられる。各コロニーの細胞内のcDNAクローンは、当業者に認識された任意の技術、例えば、発現したウイルスの導入遺伝子のRT−PCR、取り込まれたプロウイルスのPCR、またはヘルパーウイルスの組換えおよびウイルス粒子の回収により、回収される。例えば、組み込まれたcDNAの増殖は、Kitamuraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9146−9150(1995)、により記載されている。
【0117】
このアッセイ法の変形は、RAW264.7細胞をRANK−Lに接触させるときに生じる細胞融合および最終的分化を利用する。アッセイ法のこの変形を実行するにあたり、RAW264.7細胞を6ウェル培養プレートにおいて広げ、RANK−Lの可溶性ロイシンジッパー型をウェルに加え、そしてプレートをロイシンジッパーRANK−Lポリペプチドの存在下において、3から5日間インキュベーションする。RANK−Lトリガーに対して陽性に応答する細胞は、大きい多核の分化破骨細胞に融合し、かつ、培地において分裂する能力を失うであろう。望ましいならば、ロイシンジッパーRANK−L以外の他の型のRANK−Lが、このアッセイ法において刺激物として用いられてもよい。RANKにアンタゴナイズする能力に関して様々な剤を試験するためのこのアッセイ法を用いて、RANK−L刺激物に曝す前および/または曝す間に、推定上のアンタゴニストをウェルに加える。候補アンタゴニスト、例えば発現されたcDNAが、RANK−Lに対する細胞の応答性を排除するならば、細胞はこれらの培地において分裂する能力を維持するであろう。培地における成長能力を維持するこれらのプレートからの細胞は、力強いピペッティングにより、またはトリプシン消化により、融合され分化させられた破骨細胞から分離し回収することも可能である。これらの回収された細胞は、RANK−Lの不存在下において通常の成長培地における成長が可能であり、慣用の技術を用いて数え、また増殖させることも可能であろう。上記のように、増殖された細胞内のcDNAは、慣用の技術、例えば、発現したウイルスの導入遺伝子の逆転写PCR、取り込まれたプロウイルスのPCR、またはヘルパーウイルスの組換えおよびウイルス粒子の回収により、回収される。
【0118】
実施例3.
本実施例は、RANKΔ340−421(RANKΔ340−421の記載に関してGalibertら、1998を参照されたい)を発現するRANK応答性細胞株の調製を記載する。
【0119】
3−6週齢のRANK−/−マウス(破骨細胞形成において欠失を有し、かつ骨石化的である)から脾臓細胞を単離し、そして系統を以下の方法で除去した。ビオチン化された抗CD3抗体を用いる免疫吸着によりT細胞を取り除き;ビオチン化された抗Ter−119抗体を用いる免疫吸着により赤血球系細胞を取り除き;そして、ビオチン化された抗GR−1抗体を用いる免疫吸着により顆粒球を取り除いた。ビオチン部分をストレプトアビジンが結合された磁気ビーズに結合させることにより、抗体−細胞複合体を取り除き、金属のMACS除去カラムに通した。
【0120】
系統が除去された細胞を、40ng/ml CSF−1で48時間インキュベートし、そして、40ng/ml CSF−1でさらなる48時間、フィブロネクチン断片(Retronectin、PanVera Corp、ウィスコンシン州マディソン)の存在下、レトロウイルス上清(5MOI)を用いて感染させた。感染後、脾臓細胞を回収して、40ng/mlCSF−1および200ng/mlマウスRANK−Lを含むMEM10%FBSに広げた。5日間これらの条件下で細胞を培養して、破骨細胞の分化を可能にした。
【0121】
トランスフェクションに用いられるレトロウイルスは、RANKΔ340−421をコードするDNAをpBMNZベクターにサブクローニングすることにより調製された(KinsellaおよびNolan、1996、Human Gene Therapy 7:1405−1413)。制限酵素BglIIおよびNotIを用いて、pDC304/RANKΔ340−421(Galibertら、J.Biol.Chem.273:34120,1998)からRANKΔ340−421cDNA全体を切断した。このcDNA挿入断片を、BamHIおよびNotIで消化されたレトロウイルスベクターpBMNZ(KinsellaおよびNolan、1996、上記)に連結した。結果として得られたプラスミドを精製し、DNA配列を確かめ、そしてpBMNZ/RANKΔ340−421と名付けた。293−Eフェニックスパッケージング細胞における感染性のレトロウイルスベクターの作製を記載されたように行った(KinsellaおよびNolan、1996、上記)。
【0122】
実施例4.
本実施例は、ヒトIL−2αレセプターに融合されたマウスMMP−9プロモーター(配列番号11)のプロモーター/レポーター ベクターの調製を記載する。
【0123】
マウスMMP−9遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片は、以下のようにヒトIL−2α受容体をコードするcDNA分子に融合された。4.15kbのマウスMMP−9プロモーター領域(配列番号11)を含むプラスミドは、Roachら、Gene 208:117−122(1998)により記載されたようにルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプロモーター欠失pGL2基本ベクター(Promega,ウィスコンシン州マディソン)にサブクローニングされた。得られたプラスミドをpGB−colNK1と名付けた。プロモーター配列の5’側に位置するMMP−9(配列番号11)を含む約3.5kbのSmaI/EcoRI断片を、pGB−colNK1から切断し、そして、SINレトロウイルスベクターpSIR(Clontech)に、平滑末端にされたBamHI部位でサブクローニングした。
【0124】
ヒトIL−2α受容体をコードするcDNAは、「リンフォカイン:リンフォカインの分子クローニングと解析(Lymphokines:Molecular Cloning and Analysis of Lymphokines)、D.R.WebbおよびD.V.Goeddel(監修)Academic Press,1987、p.109にあるCosman,Dら「ヒトおよびマウスIL−2受容体cDNAのクローニングと発現(Cloning and expression of human and mouse IL−2 receptor cDNAs)」」に記載されているように、CAVNOTにサブクローニングされた。
【0125】
ヒトIL−2α受容体cDNAは、PCRを用いて、5’末端がBglII部位を含むように修飾され、また、3’末端がPflM1部位を含むように変更されるように、CAVNOTコンストラクトから増幅された。この増幅産物をpGEM−Tベクター(Promega)に連結した。ヒトIL−2α受容体cDNAは、BglIIおよびPflM1制限部位を用いてこのプラスミドから切断され、そして、ルシフェラーゼレポーターcDNAを切断するためにBglIIおよびPflM1で消化されたpGL2基本ベクター(Promega)に連結された。このようにヒトIL−2α受容体をpGL2のルシフェラーゼレポーターと置き換え、そして得られたプラスミドをpGL2/hIL−2受容体と名付けた。
【0126】
pGL2/hIL−2受容体は、ヒトIL−2αをコードするcDNAの上流のポリリンカー内のKpnIおよびBglIIで消化された。MMP−9プロモーター(配列番号11)をコードするpGB−colNK1プラスミドから単離された3.5kbKpnI/NheI断片、および、残りのMMP−9プロモーターの隣接するNheIからBglII(653bp)の断片が、3分子ライゲーションでpGL2/hIL−2受容体と連結されて、マウスMMP−9隣接領域の4.15kb5’隣接配列全体がhIL−2α受容体cDNAの上流に直接的に融合され、pGL2−MMP−9/ヒトIL−2受容体と名付けたプラスミドを形成した。このコンストラクトは、RANKに対して応答性を示した。
【0127】
この系を用いて候補分子の阻害活性を試験するため、RANK活性アゴニストを加える前、同時、または後に、候補分子を加えてもよい。表面におけるIL−2α受容体発現のレベルは、RANK活性のレベルの基準である。
【0128】
MMP−9プロモーターのRANK応答性部分の領域は、プロモーターのさらなる切断試験により、もっと狭く同定された。MMP−9プロモーターの5’近接の1822bpを含むPVUII/BGL2制限断片は、pSIRレトロウイルスベクター(Clontech)のマルチクローニング部位において、ヒトIL−2受容体αをコードするBglII/EcoRI制限断片と融合された。pSIR/MMP−9と名付けられた、得られたプラスミドは、RANK応答性であり、またRANKアンタゴニストを同定するアッセイ法において有用である。pSIR/MMP−9に存在するMMP−9プロモーターの領域は、配列番号11のヌクレオチド1769−3591に対応する。
【0129】
pSIR/MMP−9を以下のようにRANK応答性細胞に導入した。pSIR/MMP−9での293/Eパッケージング細胞のトランスフェクション後に、レトロウイルス粒子を調製した。RAW264.7細胞をこれらの粒子で感染させ、そして安定的にレポーターを発現するネオマイシン抵抗性コロニーを単離した。これらの細胞のRANKでの処理は、IL−2Rを検出するための試薬としてマウスmAb(クローン2A3)抗ヒトIL−2αRを用いて、フローサイトメトリーにより検出されたように、細胞表面におけるhIL−2αRの発現の増加を誘導した。hIL−2α受容体の発現は、4時間以内に観察され、そして48時間以内に最大レベルになるのが観察された。
【0130】
ヒトIL−2α受容体の表面の発現を、以下の方法でフローサイトメトリーにより検出する。細胞を回収し、そして、5%標準ヤギ血清を含むPBSの溶液を用いて4℃で30分間、公知の特異的な抗体の結合部位をブロックする。細胞を洗浄し、そして、4℃で1時間、抗体濃度5μg/mlで、抗ヒトIL−2α受容体モノクローナル抗体クローンとともに、インキュベーションする。このインキュベーションの後、細胞を洗浄し、そして、4℃でさらに30分間、蛍光に結合された抗マウスIgG第2抗体を細胞とともにインキュベートする。細胞を洗浄後、FACSスキャン(Becton Dickinson)などのフローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定する。
【0131】
さらに、IL−2α受容体に対する放射性抗体を用いて、ヒトIL−2α受容体の表面の発現を解析してもよい。mIL−4R特異的ラジオイムノアッセイ法に関して、mIL−4Rと反応するマウス抗ヒトIL−2αモノクローナル抗体を、クロラミンT反応法により125Iで標識し;得られる特異的活性は、典型的には1.5X1016cpm/nmolである。48時間後、pGL2−MMP−9/ヒトIL−2受容体でトランスフェクトされた細胞を、培地(DMEM,125%FBS)で一度洗浄した。5%非脂肪ドライミルクを含む前もって暖められた結合培地を加え、そして、1時間、組織培養インキュベーターにおいて37℃/5%CO2でインキュベーションすることにより、非特異的結合部位をブロックした。ブロッキング培地を静かに注ぎ、そして、125I抗mIL−4R(クローンM1;ラットIgG1)を含む結合緩衝液を細胞に加え、そして、1時間室温で振とう培養した。細胞を放射性標識抗体でインキュベーションした後、結合緩衝液(2X)で繰り返し、およびリン酸緩衝液(PBS)で2回、細胞を洗浄した。細胞を0.5M NaOH 1mlに溶解し、そして全放射活性をガンマカウンターで測定した。このアッセイ法を用いて、RANKをコードするDNAが共にトランスフェクトされた293/EBNAは、細胞表面におけるmuIL−4Rの検出により示されるものとして、転写活性が明らかにされる。RANKの過剰発現は、RANK−LによりRANKが誘発されるように、muIL−4Rの転写を生じさせた。RANKがアゴニスト抗体により誘発されるとき、同様の結果が観察される。
【0132】
さらに、表面においてヒトIL−2α受容体を発現する細胞は、例えばAruffoおよびSeep、PNAS 84:8573−8577(1987)により記載された技術といった、パンニング技術を用いて単離されることも可能である。簡潔には、第1抗体を認識する第2抗体を、バクテリアの60ミリメータープレートに固定する。広げられる細胞は、0.5mMEDTAおよび5%FBSを含むPBSにおいて単一の細胞懸濁液として調製される。細胞表面マーカーに対する抗体は、約5μg/mlで加えられた後、30分間氷上でインキュベーションされる。細胞は一度洗浄され、そしてPBS/EDTA/5%FBSにおいて第2抗体で被覆されたプレートに加えられ、そして1−3時間室温でインキュベーションされる。皿に付着しない余分な細胞は、PBS/5%FBSでの穏やかな洗浄により取り除かれる。
【0133】
実施例5.
本実施例は、TRAPプロモーターの活性化を記載する。プラスミドpBL2HT2.2を制限酵素ApaIで消化することにより、ヒトTRAPプロモーターを含む2.6kbDNA断片を得た。ヒトTRAP遺伝子5’領域のクローニング、およびpBL2HT2.2の構築は、Reddyら(Bone 16:587−593(1995))において十分に記載されている。また、マウスTRAPプロモーター(配列番号12)を含むDNA、およびマウスMMP−9プロモーター(配列番号11)を含むDNAも、これらの実験に使用した。プロモーターを含むDNAをルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合した。これらのプロモーター/レポーターコンストラクトは、完全長ヒトRANK(配列番号2)および完全長ヒトRANK−L(配列番号6)をコードする様々な組み合わせの発現ベクターとともに、ヒト293/EBNA細胞にトランスフェクトされた。
【0134】
マウスTRAPプロモーター(配列番号12)に関して、2X105
293/EBNA細胞は、ルシフェラーゼレポーターに融合された約2kbのマウスTRAPプロモーター(配列番号12)をコードするプラスミド40ng、RANK−Lをコードする発現ベクター(配列番号6)の20ng、およびRANKをコードする発現ベクター(配列番号2)0.4ngを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクション後24時間、EG&G/Bertholdルミノメーターを用いて製造者の説明書(Promega)に従って、細胞溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。RANKの発現は、レポーター発現を増大させるのに(約2倍)十分であり、その上RANK(配列番号2)およびRANK−L(配列番号6)の組み合わせは、レポーター発現を約4倍に増大させた。
【0135】
ヒトTRAPプロモーターに関して、ヒトTRAP遺伝子(Reddyら、1995)の上流領域から単離されたプロモーター活性を含む1.9kbApaII断片を、ルシフェラーゼレポーターに融合し、そして293/EBNA細胞にトランスフェクトした(40ng)。ヒトRANK(配列番号2)およびヒトRANK−L(配列番号6)の組み合わせは、レポーター発現を約1.5倍に増大させた。
【0136】
マウスMMP−9プロモーター実験に関して、マウスMMP−9プロモーター(配列番号11)4.1kbをルシフェラーゼレポーターに融合し、そして293/EBNA細胞にトランスフェクトした(40ng)。RANK(配列番号2)単独、またはRANK(配列番号2)およびRANK−L(配列番号6)の組み合わせは、レポーター発現を2.5倍に増大させた。
【0137】
加えて、RAW264.7細胞(6X106細胞)を、15μgの、MMP−9(配列番号11)/ルシフェラーゼ プラスミドDNAで、DEAE/デキストランを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後2時間で、細胞は分裂して2倍量になり、そしてさらに24時間インキュベーションされた。18時間マウスRANK−Lロイシンジッパー型1μg/mlを加えることは、MMP−9(配列番号11)/ルシフェラーゼプロモーターを10−15倍に誘導するのに十分だった。
【0138】
様々な時間、マウスRANKL/LZ(200ng/ml)またはTNFα(20ng/ml)で処理した後のRAW264.7細胞におけるマウスTRAPおよびマウスMMP−9の定量的RT−PCR測定により、TRAPmRNAは、RANK−Lにより250倍よりも大きく高められるが、TNFαによると約2.3倍しか増大されないことが明らかになった。MMP−9mRNAは、RANK−Lにより350倍よりも大きく高められるが、TNFαによると増大されない。この特異性は、RANKシグナル伝達の阻害剤のスクリーニングにおいて有益である。
【0139】
実施例6.
本実施例は、RANK−Lに対するモノクローナル抗体の調製を説明する。精製された組換えRANK−Lの調製物、例えば高いレベルのRANK−Lを発現するトランスフェクトされた細胞は、慣用の技術、例えば本明細書に参照として援用される米国特許第4,411,993号において開示されたものなどを用いて、RANK−Lに対するモノクローナル抗体を生成するために使用される。RANK−LをコードするDNAは、例えば、Immunity 3:165,1995においてPardollおよびBeckerlegにより論評されたように、免疫原として用いられることも可能である。該抗体は、RANK−LもしくはRANK−L活性を診断もしくは研究するアッセイ法の構成要素としてRANK−Lシグナリングへの干渉において、またはRANK−Lの親和性精製において有用である可能性がある(アンタゴニスト抗体またはブロッキング抗体)。
【0140】
齧歯類を免役化するために、アジュバント(例えば、完全もしくは不完全なフロイントのアジュバンド、ミョウバン、またはRibiアジュバントR700(Ribi,Hamilton,Mont.)などの他のアジュバント)でRANK−L免疫原を乳化し、そして、10−100μgの範囲の量で、選択された齧歯類、例えば、BALB/cマウスまたはLewisラットに皮下注射する。DNAは、皮内(Razら、Proc.Nat‘l.Acad.Sci.USA 91:9519,1994)または筋肉内(Wangら、Proc.Nat‘l.Acad.Sci.USA 90:4156,1993)に与えられることも可能であり;生理食塩水は、DNAに基づく抗原に適した希釈剤であることが見出されている。10日から3週間後、免疫化された動物を追加の免疫原で追加免疫し、そして、その後1週間ごと、2週間ごと、または3週間ごとの免疫スケジュールで定期的に追加免疫する。
【0141】
ドットブロットアッセイ法(抗体サンドイッチ法)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ法)、免疫沈降法、またはFACS解析などの他の適したアッセイ法による試験のために、血清試料を眼窩出血または日先端切開により定期的に採取する。適切な抗体力価を検出した後に、陽性動物は、生理食塩水で抗原の静脈注射がされる。3から4日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を回収し、そしてマウス骨髄腫細胞株に融合する(例えば、NS1または好ましくはAg8.653[ATCC CRL 1580])。この手順により産生されたハイブリドーマ細胞株は、非融合細胞、骨髄腫−骨髄腫ハイブリド、および脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリドの増殖を阻害するために選択培地(例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン、またはHATを含むもの)の複数のマイクロタイタープレートに広げられる。
【0142】
このように産生されたハイブリドーマクローンは、RANK−Lとの反応に関して、例えば、Engvallら、Immunochem.8:817(1971)および米国特許第4,703,004号に開示される技術の適応によって、ELISA法によりスクリーニングされることも可能である。好ましいスクリーニング技術は、Beckmanら、J.Immunol.144:4212(1990)により記載された抗体捕捉技術である。次に陽性クローンを同型のネズミの腹膜腔に注入し、高濃度(>1mg/ml)の抗RANKモノクローナル抗体を含む腹水を生産する。得られるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿に続く、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製されることも可能である。あるいはまた、プロテインAまたはプロテインGと抗体との結合に基づく親和性クロマトグラフィーが、RANK−Lタンパク質との結合に基づく親和性クロマトグラフィーとして用いられることも可能である。本明細書において記載された方法を用いてmAbの活性をモニターし、ブロッキング(すなわち、RANK−Lを結合し、かつRANKとの結合を阻害する抗体)と非ブロッキング(すなわち、RANK−Lと結合し、かつRANKとの結合を阻害しない抗体)の両方を単離する。
【0143】
実施例7.
本実施例は、RANKに対するモノクローナル抗体の調製を説明する。精製された組換えRANKの調製物、例えば高いレベルのRANKを発現するトランスフェクトされた細胞は、慣用の技術、例えば本明細書に参照として組み入れられる米国特許第4,411,993号において開示されたものなどを用いて、RANKに対するモノクローナル抗体を生成するために使用される。RANKをコードするDNAは、例えば、Immunity 3:165,1995においてPardollおよびBeckerlegにより論評されたように、免疫原として用いられることも可能である。
【0144】
齧歯類を免役化するために、アジュバント(例えば、完全もしくは不完全なフロイントのアジュバンド、ミョウバン、またはRibiアジュバントR700(Ribi,Hamilton,Mont.)などの他のアジュバント)で、RANK免疫原を乳化し、そして、10−100μgの範囲の量で、選択されたネズミ、例えば、BALB/cマウスまたはLewisラットに皮下注射する。DNAは、皮内(Razら、Proc.Nat‘l.Acad.Sci.USA 91:9519,1994)または筋肉内(Wangら、Proc.Nat‘l.Acad.Sci.USA 90:4156,1993)に与えられることも可能であり;生理食塩水は、DNAに基づく抗原に適した希釈剤であることが見出されている。10日から3週間後、免疫化された動物を追加の免疫原で追加免疫し、そして、その後1週間ごと、2週間ごと、または3週間ごとの免疫スケジュールで定期的に追加免疫する。
【0145】
ドットブロットアッセイ法(抗体サンドイッチ法)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ法)、免疫沈降法、またはFACS解析などの他の適したアッセイ法による試験のために、血清試料を眼窩出血または尾先端切除によって定期的に採取する。適切な抗体力価を検出した後に、陽性動物は、生理食塩水で抗原が静脈注射される。3から4日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を回収し、そしてマウス骨髄腫細胞株に融合する(例えば、NS1または好ましくはAg8.653[ATCC CRL 1580])。この手順により産生されたハイブリドーマ細胞株は、非融合細胞、骨髄腫−骨髄腫ハイブリド、および脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリドの増殖を阻害するために選択培地(例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン、またはHATを含むもの)の複数のマイクロタイタープレートに広げられる。
【0146】
このように産生されたハイブリドーマクローンは、RANKとの反応に関して、例えば、Engvallら、Immunochem.8:817(1971)および米国特許第4,703,004号に開示される技術の適応によって、ELISA法によりスクリーニングされることも可能である。好ましいスクリーニング法は、Beckmanら、J.Immunol.144:4212(1990)により記載された抗体捕捉法である。次に陽性クローンを同型ネズミの腹膜腔に注入し、高濃度(>1mg/ml)の抗RANKモノクローナル抗体を含む腹水を生産する。結果として得られるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿に続くゲル排除クロマトグラフィーにより精製されることも可能である。あるいはまた、プロテインAまたはプロテインGと抗体との結合に基づく親和性クロマトグラフィーが、RANKタンパク質との結合に基づく親和性クロマトグラフィーとして用いられることも可能である。
【0147】
免疫原としてRANK/Fc融合タンパク質を用いて、モノクローナル抗体を産生した。RANKタンパク質に対する反応性を確かめるためにこれらの試薬をスクリーニングした。本明細書に記載された方法を用いてmAbの活性をモニターし、ブロッキング(すなわち、RANKを結合し、かつRANKへのリガンドの結合を阻害する抗体)と非ブロッキング(すなわち、RANKと結合し、かつリガンドの結合を阻害しない抗体)の両方を単離する。
【0148】
実施例8.
本アッセイ法において、RANKと関連する活性を調製することが可能なテスト分子は、テスト分子存在下においてc−srcチロシンキナーゼまたはF−アクチンリング形成の誘導を測定することにより同定される。
【0149】
野生型またはヒトRANK/TRAF6結合突然変異体(RANKΔ340−421)をコードするDNAを、RANK−/−マウスから単離された造血細胞に導入する実験を行った。完全長および突然変異体ヒトRANKDNAを、以前に記載されたようにpBMNZレトロウイルスベクターにサブクローニングした(KinsellaおよびNolen、1996、Human Gene Therapy 7:1405−1413)。RANKを含んだ感染性レトロウイルスを、記載されたように293−Eフェニックスパッケージング細胞において作製した(KinsellaおよびNolan、1996)。これらの細胞からの上清を、感染性ウイルス粒子の供給源として用いた。
【0150】
これらのアッセイ法において用いられるRANK−/−マウスの作製は、以前に記載されている(Dougallら、1999)。3−6週齢のRANK−/−マウスから脾臓細胞を単離し、そして、最初の細胞群から破骨細胞前駆体以外の様々な型を除去することにより、破骨細胞前駆体で富むものとした。この「除去」工程に関して、CD3(T細胞に特異的である)、Ter−119(赤血球に特異的である),およびGR−1(顆粒細胞に特異的である)に対するビオチン化された抗体で細胞をインキュベーションした。抗体が応答性標的細胞に結合した後、ストレプトアビジンが結合された磁気ビーズを培地に加え、そして、細胞の混合液を磁気カラム(MACS除去カラム;MILLTENNYI)に通した。MACSカラムに付着しない細胞は、破骨細胞前駆体に富んでいると考えられ、そして本アッセイ法に用いられた。
【0151】
破骨細胞前駆体に富む細胞を、40ng/mlCSF−1で48時間インキュベーションし、そして、レトロウイルス上清(5MOI)で、40ng/mlCSF−1においてさらなる48時間、組換えフィブロネクチン断片(レトロネクチン、PanVera Corp、ウィスコンシン州マディソン)の存在下において感染させた。細胞およびウイルス粒子の両方ともフィブロネクチンに付着する傾向があり、このためフィブロネクチン断片は、細胞およびウイルス両方の高濃度の局在を作り出すことによって感染率を高める働きをした。感染後、細胞を回収し、そして40ng/mlCSF−1および200ng/mlmRANK−Lを含むMEM10%胎児ウシ血清に広げ、そしてこの培地において5日間インキュベーションした。
【0152】
野生型RANKDNAを受け入れた感染培地に関して、c−srcレベルは、かなり高く以下のように異なっていた。典型的な実験において、野生型RANKを発現する細胞の細胞膜からの抽出液は、RANKを欠失した細胞からの抽出液よりも約15倍多い32Pをc−src特異的基質に取り込む。胎児ウシ血清およびCSF−1の両方とも、c−src活性の基礎レベルに寄与し、この基礎レベルは、10%胎児ウシ血清の代わりに0.5%のもの、および40ng/mlCSF−1の代わりに10ng/mlのものを含むMEMにおいて18時間、次いで0.5%FBSを含みかつCSF−1を含まないMEMにおいて2時間、「飢餓状態である」細胞により低められた。
【0153】
c−srcおよびF−アクチンリングを誘導するために、50mM HEPES(pH7.2)、10%グリセロール、250mM NaCl、および1%TritonX−100を含む緩衝液に細胞を懸濁した後、組換えmRANK−L/ロイシンジッパータンパク質を、1μg/mlの濃度で様々な時間、培地に加えた。モノクローナル抗体GD−11を用いて免疫沈降によりc−srcタンパク質を精製した。商業的に入手可能なアッセイキット(Upstate Biotechnology,ニューヨーク州レイクプラシド)を用いて免疫複合体でのc−src活性をモニターした。簡潔には、c−src活性の測定は、γ標識されたATP、およびc−srcキナーゼの基質を与えるp34/cdc2ペプチド(KVEKIGEGTYGVVYK)(配列番号13)を用いて、ホスホトランスフェラーゼ活性を測定することを要した。10μCiのγ標識されたATP、MnCl2(75mM)、ATP(500μM)、MOPS(20mM)、β−グリセロールリン酸(25mM)、EGTA(5mM)、ナトリウムO−バナジウム(1mM)、およびジチオスレイトール(1mM)を含む緩衝液において10分間30℃で、キナーゼアッセイをインキュベーションした。ホスホセルロース紙を用いて、残存する標識ATPから、リン酸化された基質ペプチドを分離し、そして、シンチレーションカウンターを用いて、標識されたペプチドを定量した。免疫沈降およびインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイ法は、記載されたように行われた(Muschら、J.Biol.Chem.(1999)274:7923−7928)。
【0154】
c−src誘導を上記のようにアッセイした際、完全長RANK導入遺伝子の導入後に細胞を誘導して分化させたときに、細胞が高レベルのc−src活性を含むのが観察された。一方で、c−src活性は、対照ウイルス(lacZをコードする)、またはTRAF6結合ドメイン(RANKΔ340−421)を欠落したRANK DNAのいずれかでの感染後に分化させた細胞の抽出液における背景レベルと、見かけ上異ならなかった。背景レベルは、レトロウイルスで感染させないRANK−/−細胞を用いて判定された。
【0155】
F−アクチンリングを検出する手順を以下のように行った。完全長ヒトRANKcDNAまたはRANK/TRAF6結合変異体(RANKΔ340−421)のいずれかをコードするレトロウイルスコンストラクトで、RANK−/−マウス由来の初期造血細胞を感染させた。#1ホウケイ酸カバーグラスを有するLabTekChamberスライドにおいて、細胞を培養した。10%胎児ウシ血清、40ng/mlCSF−1、および200ng/mlmRANK−Lを含むMEMにおいて5日間インキュベーションした後、培地を吸引し、PBSで2回洗浄し、そして3%パラフォルムアルデヒド溶液で10分間固定し、続いて50mM NH4Clで急冷した。アクチンの蛍光プローブ、ファロイジン(Molecular Probes、オレゴン州ユージーン)で細胞を染色することにより、F−アクチンリングを視覚化した。標準の蛍光顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを検出し、そしてF−アクチンリングを、各細胞の周辺でのF−アクチンの連続的リングとして同定した。
【0156】
蛍光ファロイジンで染色することにより、細胞におけるF−アクチンリングを視覚化した。野生型RANKDNAを感染させた細胞に関して、F−アクチンリングは、50%以上の細胞において検出された。一方で、ヒトRANK/TRAF6結合変異体で細胞をトランスフェクトした場合、全ての細胞がF−アクチン細胞骨格構造を分解しており、またF−アクチンリングは認められなかった。
【0157】
RANK活性のアゴニストをアッセイするために、RANK−Lを曝す工程の間、または分化工程が完了した後、テスト分子を培養培地に加える。テスト分子がRANK活性のアゴニストならば、上記の欠失変異体を感染させた細胞は、F−アクチンリングを発現し、または検出可能なc−src活性を発現し、もしくはその両方を発現するであろう。しかしながら、RANK分子においてTRAF6結合部位の存在を必要とするRANKアゴニストは、RANKTRAF6欠失変異体を感染したRANK−/−細胞において、陽性を示さないであろう。
【0158】
実施例9.
本アッセイ法に基づくCaPO4吸収は、破骨細胞活性の評価であると考えられる。脾臓細胞を、3−6週齢のRANK−/−マウスから単離し、そして実施例9において記載したように処理し、CD3、Ter−119、およびGR−1抗原を発現する細胞を取り除いた。これらの抗原のいずれも発現しない細胞を回収し、そして実施例9に記載したようにRANKの完全長またはTRAF6結合部位欠失変異を含むレトロウイルスベクター粒子で感染させた。
【0159】
感染させた後、脾臓細胞を回収し、そして、CaPO4の薄いフィルムで覆った16ウェルの石英スライド(Osteologic,BD バイオシステムズ)上に40ng/ml CSF−1および200ng/ml mRANK−Lを含んだ10%ウシ胎児血清を含むMEMにおいて広げた。培地において5日間の後、スライドを洗浄し、漂白剤で洗浄することにより細胞を取り除き、そして緩衝液で再度スライドを洗浄した。完全長RANKを感染させた細胞は、CaPO4基質(matrix)を吸収し、位相差顕微鏡により視覚化される多数の明確なピット(吸収孔(resorptive lacunae)とも呼ばれる)により判定された。CaPO4フィルムにおけるピット数は、RANK−Lがスライド上で成長した細胞を誘導して破骨細胞に分化させる度合いの評価である。
【0160】
望ましいならば、CaPO4フィルムは、水での洗浄前に、4から5分間0.5%のアリザリンレッド溶液を用いて染色されてもよい。染色後、吸収孔は、赤の背景上で明確な領域として位相差顕微鏡により視覚化される。
【0161】
完全長RANK導入遺伝子を用いて分化させた細胞は、高いレベルのCaPO4吸収を含んだ。一方で、対照のウイルス(lacZをコードする)、またはTRAF6結合ドメインを欠落したRANKコンストラクト(RANKΔ340−421)のいずれかで、分化させた細胞は、CaPO4吸収のレベルがわずかだった。
【0162】
本発明の好ましい態様が説明および記載された一方で、様々な変化が、発明の精神および範囲から出発することなく、その中においてなされることもあり得ると評価されるであろう。
【配列表】
Claims (24)
- RANK活性を調節する分子をスクリーニングする方法であって、以下の工程:
(a)培養されたRANK応答性細胞を候補分子と接触させ、該RANK応答性細胞がレポータータンパク質をコードする核酸分子を含み、該核酸分子が、MMP−9プロモーターおよびTRAPプロモーターからなる群より選択されるRANK応答性制御核酸配列に機能可能なように連結されており、ここにおいて、該候補分子と接触させる前、間または後に、RANK応答性細胞はRANKトリガーに曝される;
(b)接触させたRANK応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルが、候補分子と接触させないリファレンスRANK応答性細胞の培地におけるレポーター分子発現のレベルと比較して、高められるかまたは低められるかを判定し;そして
(c)接触させた細胞におけるレポーター分子発現のレベルが比較上高められるときは、候補分子をRANKアゴニストとして同定し、接触させた細胞におけるレポーター分子発現のレベルが比較上低められるときは、候補分子をRANKアンタゴニストとして同定する。
を含む、前記方法。 - 以下の(a)−(e):
(a)RANK応答性細胞をRANK−Lポリペプチドと接触させる、ここにおいて、RANK−Lポリペプチドが配列番号6のアミノ酸162−317または配列番号8のアミノ酸161−316を含む;
(b)RANK応答性細胞をアゴニスト性抗RANK抗体と接触させる;
(c)RANK応答性細胞をRANK−Lを発現する細胞と接触させる、ここにおいて、RANK−Lが配列番号6のアミノ酸162−317または配列番号8のアミノ酸161−316を含む;
(d)該RANK応答性細胞においてRANKを過剰発現させる;および
(e)該RANK応答性細胞において、配列番号10において示したアミノ酸配列を有する欠損したRANKポリペプチドを発現させる
からなる群より選択される方法により、RANK応答性細胞においてRANKを誘発する、請求項1の方法。 - 配列番号6のアミノ酸162−317または配列番号8のアミノ酸161―316を含むRANK−Lポリペプチドと細胞を接触させることにより、RANK応答性細胞においてRANKが誘発され、さらに該RANK−Lポリペプチドが、天然のRANK−L、RANK−Lのロイシンジッパー融合体、およびRANK−LのFLAGポリHis融合体からなる群より選択される、請求項2の方法。
- RANK応答性制御核酸がMMP−9プロモーターである、請求項1の方法。
- MMP−9プロモーターが、配列番号11のヌクレオチド1769−3591を含む、請求項4の方法。
- RANK応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、候補核酸分子または候補タンパク質分子をコードする導入DNA分子を該RANK応答性細胞において発現させることを含む、請求項1の方法。
- 該導入DNA分子がcDNA分子である、請求項6の方法。
- 該導入DNA分子が該RANK応答性細胞のゲノムに組み込まれる、請求項6の方法。
- 該導入DNA分子が該RANK応答性細胞のゲノムに組み込まれない、請求項6の方法。
- 該候補分子が導入DNA分子によりコードされるタンパク質である、請求項6の方法。
- 該候補分子が導入DNA分子によりコードされる核酸分子である、請求項6の方法。
- 該核酸分子がリボザイム活性を有する、請求項11の方法。
- さらに該接触RANK応答性細胞より形成されたコロニーから該導入DNA分子を単離することを含む、請求項6の方法。
- RANK応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、候補分子の存在下において該RANK応答性細胞を培養することを含み、そしてさらに該候補分子がタンパク質である、請求項1の方法。
- RANK応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、複数の候補タンパク質の存在下において該RANK応答性細胞を培養することを含む、請求項1の方法。
- 該レポーター分子が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および異種表面タンパク質からなる群より選択される、請求項1の方法。
- レポーター分子が、ヒトIL−2受容体、マウスIL−4受容体、ヒトCD2タンパク質、ヒトCD4タンパク質、ヒトCD8タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される異種表面タンパク質である、請求項16の方法。
- 該RANK応答性細胞が、欠損したRANK分子を発現し、そして該スクリーニングが、該欠損RANK活性を相補するアゴニストに対するものである、請求項1の方法。
- 該RANK応答性細胞が造血細胞である、請求項1の方法。
- 該RANK応答性細胞がRAW246.7細胞である、請求項1の方法。
- さらに、発現するレポーター分子のレベルが比較上高められまたは低められると判定される細胞から候補分子を精製する工程を含む、請求項1の方法。
- さらに、精製された候補分子がRANKと相互作用することを証明する工程を含む、請求項21の方法。
- レポーター分子発現のレベルが、蛍光に基づくアッセイ法、固相アッセイ法、および放射性化合物を使用するアッセイ法からなる群より選択されるアッセイ法により判定される、請求項1の方法。
- 発現するレポーター分子のレベルを判定することが、該レポーター分子を発現している細胞を蛍光に基づくセルソーティングにより物理的に単離することを含む、請求項1の方法。
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