JP2001523456A - 転写的に調節されたｇタンパク質−共役受容体 - Google Patents

転写的に調節されたｇタンパク質−共役受容体

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Abstract

(57)【要約】 Ｇ２Ａと呼ばれる、Ｇタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、その発現はＧ２Ｍチェックポイントで調節され且つ機能して、造血細胞の適切に調節された複製を確実にする。該受容体は、造血細胞および組織中に主に見受けられ、腫瘍サプレッサー因子として機能し、細胞周期の停止を誘導する。この受容体は造血細胞の増殖および分化に重要な役割を果たしているものと思われる。受容体活性の調節は、幾つかの治療的適用を有している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 〔発明の分野〕 本発明は、その発現が造血細胞中で調節され且つＧ２Ｍチェックポイントで機
能して造血細胞の適切に調節された複製を確実にするようなGタンパク質−共役 受容体に関する。
【０００２】 〔発明の背景〕 Gタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ類）のファミリーは少なくとも２５０個 のメンバーを有する（Strader et al. FASEB J., 9:745-754, 1995; Strader et
al. Annu. Rev. Biochem., 63:101-32, 1994）。ヒト遺伝子の１％がＧＰＣＲ 類をコードするかもしれないことが推定されている。ＧＰＣＲ類は、光子、小さ
い生物学的に生ずるアミン類（すなわち、スピネフィリンおよびヒスタミン）、
ペプチド類（すなわち、ＩL−B）から大きい糖タンパク質ホルモン類（すなわち
、パラチロイドホルモン類）にわたる範囲の多種のリガンドと結合する。リガン
ド結合すると、ＧＰＣＲ類はグアニンヌクレオチド−結合タンパク質（Gタンパ ク質）を活性化することにより細胞内信号化経路を調節する。ＧＰＣＲ類は、細
胞増殖および分化、炎症に応答した白血球泳動、並びに光、臭気、神経伝達物質
およびホルモン類に対する細胞応答を包含する多様な細胞プロセスにおいて重要
な役割を果たす（Strader et al., 上記参照）。
【０００３】 興味深いことに、ＧＰＣＲ類はヒトサイトメガロウイルスおよびヘルペスウイ
ルスにおいて機能的類似性を有しており、ＧＰＣＲ類がウイルス疾病発症中に獲
得されているかもしれないことを示唆する（Strader et al., FASEB J., 9:745-
754, 1995; Arvanitakis et al., Nature, 385:347-350, 1997; Murphy, Annu.
Rev. Immunol., 12:593-633, 1994）。
【０００４】 Gタンパク質−共役受容体の重要性はそのファミリー構成員であるケモカイン レセプターＣＸＣＲ４／フシンおよびＣＣＲ５がそれぞれT細胞−属性およびマ クロファージ−属性ＨＩＶウイルス菌株用の共受容体であるという最近の発見に
より、さらに注目を浴びている（Alkhatib et al., Science, 272:1995, 1996;
Choe et al., Cell. 85:1135, 1996; Deng et al., Nature, 381:661, 1996; Do
ranz et al., Cell, 85:1149, 1996; Dragic et al., Natrure, 381:667 （1996
）; Fang et al., Science 272:872, 1996）。これらの受容体の阻止がヒト免疫
不全（ＨＩＶ）ウイルスによる感染症を防止できると考えられる。
【０００５】 細胞周期チェックポイントである細胞の損傷またはそのゲノムとの一体性の損
失を検出しそして修復を行うために成長を分裂停止させる細胞周期における休止
期間がＤＮＡの高度に忠実な複製を確実にする（Paulovich et al., Cell 88:31
5-321, 1997; Hartwell, cell 71:543-548, 1992）。真核細胞周期では、チェッ
クポイントとして同定された３つの別個に規定された時期：Ｇ１／Sトランジシ ョン、S−期遅延およびＧ２Ｍトランジションがある（Nurss, Cell 91:865-867,
1997）。修復に利用できる時間を増加させることによりＧ１／Sチェックポイン
トが活性化されて突然変異したＤＮＡの複製が避けられる。ＤＮＡ複製速度を遅
くすることにより細胞はS期内でＤＮＡ損傷チェックポイントも利用できる。Ｇ ２／Ｍチェックポイントは二本鎖ＤＮＡ分裂の検出で活性化される。さらに、染
色体が分裂紡錘体に結合されていない時に後期進行を抑制する紡錘体チェックポ
イントにより分裂開始がモニターされる（Nicklas, Science 275:632-637, 1997
）。細胞周期チェックポイントは図1にまとめられている。
【０００６】 最近の発見は、GＺ／Mトランジションにおける分子関与体を明らかにした。Ｃ
ｄｃ２およびサイクリンB１が分裂開始を促進しそしてそれらは突然変異促進因 子（ＭＰＦ）の一部である。Ｃｄｃ２５によるＴｈｒ１４およびＴｙｒ１５上の
Ｃｄｃ２の脱リン酸化およびサイクリンB１との核会合と同時に起きるＴｈｒ１ ６１上のリン酸化が急速な突然変異開始をもたらす。サイクリンB１分解または 細胞質への移行およびＷｅｅ１による負の調節部位であるＴｈｒ１４およびＴｙ
ｒ１５上のＣｄｃ２のリン酸化が分裂開始を阻止する。カフェインはＣｄｃ２の
脱リン酸化を刺激することによりＤＮＡ損傷−活性化Ｇ２／Ｍ分裂停止を軽減す
ることができる。これらのデータは、ＭＰＦがG２から分裂へのトランジション の中心的なレギュレーターであることと強い関係がある。
【０００７】 最近の研究はＭＰＦのＧ２／Ｍ分裂停止上流に含まれる信号化経路の理解に広
げられている。ＤＮＡ損傷に対する応答は酵母ｒａｄフェミリーの遺伝子のヒト
相同体である突然変異したアラキス・テランギエクタリア（ＡＴＭ）により検出
される（Mayn, 1995）。ＡＴＭタンパク質はChk１の活性化に関係しており、そ れはＣｄｃ２５をリン酸化して、１４−３−３によるＣｄｃ２５の結合および引
きこもり（sequestering）をもたらす（Sanchez et al., Science 277:1497-150
1, 1997; Peng et al., Science 277:1501-1505, 1997; Furnari, Science 277:
1495-1497, 1997）。これがＣｄｃ２およびＧ２Ｍ分裂停止のリン酸化された（ 不活性）形態の集積をもたらす。Ｃｄｓ１はＷｅｅ１およびＣｄｃ２５の両者を
リン酸化することによりＣｈｋ−１へ過剰作用して両者の遺伝子生成物を不活性
化させることが示された（Boddy et al., Science 280:909-912, 1998; Furnari
et al., 上記参照; Sanchez et al., 上記参照）。ＡＴＭはＭＰＦに直接作用 するタンパク質を活性化しそして細胞周期分裂停止をもたらすように働く。
【０００８】 ＡＴＭはまた、チェックポイント調節に含まれる二次的分子の転写を刺激する
タンパク質と会合し且つ活性化する。ＡＴＭのこれらの下流アクチベーターの１
つは腫瘍インヒビターｐ５３である。ｐ５３の活性化がｐ２１Ｃｉｐおよび１４
−３−３を包含する複数の遺伝子の誘発をもたらす（Levins, Cell 88:323-331,
1997）。１４−３−３遺伝子生成物はＣｄｃ25に結合してそれを細胞質の中に 捕獲することによりＧ２／Ｍ分裂停止に介在する。チロシンキナーゼＡｂｌはＡ
ＴＭ遺伝子生成物と物理的に相互作用する（Shafman, Nature 387:520-523, 199
7; Baskaran, Nature 387:516-519, 1997）。ＤＮＡ損傷によるＡｂｌキナーゼ の活性化はＡＴＭに依存しており、ＤＮＡ損傷チェックポイント調節におけるＡ
ｂｌおよびＡＴＭの機能的関連性を示唆している。Ｇ２Ｍチェックポイントの全
体的な調節は、適切な細胞成長を保証する転写後修飾および転写活性化の両者を
含む複雑な機構である。それ故、既知のＧ２Ｍチェックポイントタンパク質は最
終的にはＣｄｃ２リン酸化およびサイクリンB１の核加入により機能する。
【０００９】 一般的な真核細胞周期調節機構は広範囲の細胞タイプの中で高度に保存される
が、組織−特異的細胞周期レギュレーターに関してはほとんど知られていない。
ＴＧＦ−βおよびＧＡＴＡ−５は発現において制限される抗−増殖性信号化分子
を代表する。これらのレギュレーターの両者は細胞周期をＧ１で制限する。リン
パ球は、それらの成長がそれらの内部成長段階並びに周囲環境に依存して細胞周
期の導入、興奮および再連結の独特な性質により特徴づけられているため、組織
−特異的細胞周期レギュレーターを研究するための興味深いモデルシステムを提
供する。例えば、抗原との相互作用で、休止成熟未使用B細胞がリンパ球発生中 心に集積し、そこでそれらは激しく増殖しそして過剰のB細胞は包含されること により発生中心から死滅する。
【００１０】 腫瘍遺伝子形質転換による細胞成長調節の減少は腫瘍遺伝子から下流の信号化
相手に発する信号に依存しており、そしてしばしば悪性成長に寄与する二次的遺
伝子の転写誘発をもたらす。ＢＣＲ−ＡＢＬは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）お
よび急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の発症に関係する相互染色体転座（９：２２
）（ｑ３４；ｑ１１）により発生するキメラチロシンキナーゼ腫瘍遺伝子である
（Kurzrock, N. Engl. J. Med. 319:990-998, 1988）。このキメラ腫瘍形成はＰ
ｈ１−陽性幹細胞中で見出された。構造および機能分析がその腫瘍形成活性の原
因となるＢＣＲ−ＡＢＬ内の臨界領域を規定した。特に、Ｓｒｃ相同体２（ＳＨ
２）領域の高度に保存されたモチーフ内のＲ５５１Ｌ置換はＢＣＲ−ＡＢＬのキ
ナーゼ活性に影響を与えずにＳＨ２領域をホスホチロシン−含有タンパク質と脱
共役させる。興味深いことに、この突然変異はＢＣＲ−ＡＢＬが軟質寒天中でマ
ウスの繊維芽細胞の足場−非依存性成長を刺激する能力を大きく減少させる（Go
ga, Cell B2:981-988, 1995）。ＳＨ２突然変異体はインビトロで一次骨髄細胞 を形質転換させる能力を依然として保有するが、それはマウスでは減じられた悪
性および白血病発症能力を示す（Goga, 上記参照）。ＳＨ２領域の不活性化がＢ
ＣＲ−ＡＢＬを下流信号化分子と脱共役させるかもしれず、それが白血病発症に
含まれるｉｃａｌ遺伝子の発現を変えるかもしれない。
【００１１】 〔発明の要旨〕 本発明の一態様は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）１または配列番号３に示
された塩基配列を有するGタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａをコードする単離され たポリヌクレオチドである。 本発明の他の態様は、ポリヌクレオチドが６５℃において２×ＳＳＣ、０.１ ％ＳＤＳの中で配列番号１に示された配列を有するポリヌクレオチドの相補体と
ハイブリダイズすることができるGタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａをコードする 単離されたポリヌクレオチドである。 本発明はまた、配列番号２または配列番号４に示されたアミノ酸配列を有する
単離された組換えＧタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａも提供する。好ましくは、タ
ンパク質は配列番号１に示された配列を有するポリヌクレオチドの発現により得
られる。有利には、タンパク質は配列番号３に示された塩基配列を有するポリヌ
クレオチドの発現により得られる。
【００１２】 本発明の他の態様は、６５℃において２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳの中で配列 番号１に示された配列を有するポリヌクレオチドを相補体とハイブリダイズする
ことができるポリヌクレオチドによりコードされた単離されたGタンパク質−共 役受容体Ｇ２Ａである。 本発明はまた、Ｇタンパク質共役受容体Ｇ２Ａを試験化合物と接触させ、化合
物が該Ｇ２Ａと結合しているかどうかを決定し、そして受容体活性の刺激が化合
物がＧ２Ａのアクチベーターであることを示すような受容体活性検定法において
Ｇ２Ａと結合している化合物を試験する段階を含むＧタンパク質共役受容体Ｇ２
Ａを活性化する化合物を同定する方法も提供する。好ましくは、Ｇ２Ａは細胞表
面上で発現される。有利には、受容体活性検定法は繊維芽細胞形質転換、骨髄形
質転換、細胞周期分析、インビボ腫瘍形成またはインビボ白血病発症である。
【００１３】 本発明はまた、Ｇ２Ａを試験化合物と接触させ、化合物がＧ２Ａと結合してい
るかどうかを決定し、そして受容体活性の抑制が化合物がＧ２Ａのインヒビター
であることを示すような受容体活性検定法においてＧ２Ａと結合している化合物
を試験する段階を含むＧ２Ａを抑制する化合物を同定する方法も提供する。好ま
しくは、Ｇ２Ａは細胞表面上で発現される。有利には、受容体活性検定法は繊維
芽細胞形質転換、骨髄形質転換、細胞周期分析、インビボ腫瘍形成またはインビ
ボ白血病発症である。
【００１４】 本発明の他の態様は、細胞をＧ２Ａ受容体を活性化させる化合物と接触させる
ことを含む該細胞中で細胞周期分裂停止を誘発する方法である。好ましい態様の
一面では、細胞周期分裂停止は該細胞周期のＧ２／Ｍトランジションで起きる。
好ましくは、細胞は白血病細胞またはリンパ腫細胞である。 本発明はまた、対照細胞と比較して増加した水準の転写体の存在が細胞が癌細
胞であることを示すような癌細胞がＧ２Ａ転写を発現するかどうかを決定する段
階を含む癌細胞の存在を決定する方法も提供する。好ましくは、決定段階はノー
ザンハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００１５】 本発明のさらに他の態様は、対照細胞に比較して増加した水準のタンパク質の
存在が細胞が癌細胞であることを示すような癌細胞がＧ２Ａ転写を発現するかど
うかを決定する段階を含む癌細胞の存在を検出する方法である。好ましくは、決
定段階は細胞をＧ２Ａタンパク質に特異的な抗体と接触させそして抗体の存在を
検出することを含む。有利には、検出段階が蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を
含む。 本発明はまた、細胞を２０Ｓプロテオゾームのインヒビターと接触させること
を含む細胞中でＧ２Ａ受容体の分解を抑制する方法も提供する。好ましくは、イ
ンヒビターはＮ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルロイシ
ナル（ＡＬＬＮ）またはＮ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−
メチオナル（ＡＬＬＭ）である。
【００１６】 本発明の他の態様は、骨髄を白血病の抑制を必要とする個体から単離し、該骨
髄をＧ２Ａタンパク質をコードする発現構造体とトランスフェクションまたは感
染させ、そして該骨髄を該個体に戻すことを含む白血病発症の抑制を必要とする
個体において白血病発症を抑制する方法である。好ましくは、発現構造体はレト
ロウイルスベクターである。 本発明はまた、白血病発症抑制用のＧ２Ａタンパク質をコードする発現構造体
も提供する。
【００１７】 〔発明の詳細な記載〕 本発明は、チロシンキナーゼ類、ＤＮＡ損傷剤および化学療法薬を包含する種
々の細胞内および細胞外刺激により転写的に調節されるＧ２分裂停止用のＧ２Ａ
と称する新規なＧタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）の同定およびシークエン
シングを記載する。Ｇ２ＡはＤＮＡ損傷および細胞増殖の組織特異的センサーと
して作用するようであり、そしてＧ２／ＭチェックポイントでＤＮＡ損傷後の突
然変異を遅らせるかまたは過剰の成長刺激により引き起こされる脱調節成長を防
止するように機能する。従って、Ｇ２Ａは増殖性信号化および細胞周期チェック
ポイント経路を関連させて、造血細胞の信頼性があり且つ適切に調節される複製
を確実にする。
【００１８】 Ｇ２Ａは腫瘍サプレッサー因子として機能し、有糸分裂中に細胞周期分裂停止
を誘発しそしてヒトの癌において変化したことがしばしば見出されている領域で
あるヒト染色体１４ｑ３２.３で見られる。Ｇ２Ａは、ＢＣＲ−ＡＢＬにより調 節できる細胞遺伝子を研究する間に同定された。再現的示差分析（ＲＤＡ）であ
るＰＣＲをベースにした示差クリーニング技術（Lisitsyn et al., Science 259
:946-951, 1993; Hubank et al., Nucl. Acids Res. 22:5840-5848, 1994; Fig.
2）を使用して、野生型（ＷＴ）ＢＣＲ−ＡＢＬにより形質転換されたマウス骨 髄（プレ−Ｂ）細胞で発現された遺伝子を、ＢＣＲ−ＡＢＬのＳＨ２領域で突然
変異を有する形質転換−欠失突然変異種をこれらの細胞に感染させるために使用
した時に発現されたものと比較した。１２個以上の遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬによ
り上方調節されたことが見出された。これらの異なって発現されたマウスの遺伝
子の１つ（Ｇ２Ａ）は例えば脾臓および胸腺の如き造血組織の中で主として発現
され、そしてＷＴＢＣＲ−ＡＢＬにより誘発されたがＳＨ２突然変異体によって
は誘発されなかった。
【００１９】 マウスＧ２ＡのｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および
配列番号２に示されている。マウスタンパク質のヒト相同体を次にマウスｃＤＮ
Ａをプローブとして使用して単離した。対応するヒトｃＤＮＡおよび推定アミノ
酸配列はそれぞれ配列番号３および配列番号４に示されている。本発明のＧ２Ａ
タンパク質配列は配列番号２および４に示されている配列、または実質的にこれ
らの遺伝子がタンパク質チロシンキナーゼ類により調節される能力を弱体化しな
いようなその配列変種もしくはこれらのタンパク質の機能活性を実質的に弱体化
しないようなその配列変種を有する。配列番号２および４に示されている配列の
種々の位置に１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含有するＧ２Ａタンパク質
も本発明の範囲内であることは認識されるであろう。
【００２０】 多くのアミノ酸置換を本来の配列に対してその機能活性を弱体化させずに行う
ことができる。本発明における使用を意図するこれらのタンパク質配列の変更は
、少量挿入、欠失および置換を包含する。例えば、保存性アミノ酸置換が考えら
れる。そのような置換は、例えば、それらの側鎖の化学的性質と関連するアミノ
酸類のファミリー内で起きるものである。アミノ酸類のファミリーは塩基性アミ
ノ酸類（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸類（アスパラギン酸
、グルタミン酸）、非極性アミノ酸類（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および未
変化極性アミノ酸類（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリ
ン、スレオニン、チロシン）および芳香族アミノ酸類（フェニルアラニン、トリ
プトファン、チロシン）を包含する。特に、ポリペプチドの活性部位外の部分に
おける、イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるア
スパラギン酸の、またはセリンによるスレオニンの、または構造的に関連するア
ミノ酸によるアミノ酸の、単離された置換を含む保存性置換はポリペプチドの性
質に大きな影響を有さないであろうことが一般的に認められている。
【００２１】 マウスタンパク質は、配列整理プログラムを用いて、マウスＴＤＡＧ８タンパ
ク質およびＰ２Ｙプリノセプターを包含する他のＧＰＣＲ類とのその相同性によ
りＧＰＣＲスーパーファミリーの一員であることが決定された。７つの予測され
たトランスメンブラン領域を示すマウスＧ２Ａのスキーム図が図３に示されてい
る。ＧＰＣＲ系統樹が図４に示されている。ヒトＧ２Ａ相同体はヒト脾臓ｃＤＮ
Ａライブラリーを非常に厳しい条件下で（２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６５℃ ）スクリーニングすることにより単離された。マウスおよびヒトＧ２Ａ類はアミ
ノ酸水準で約７０％の同一性を共有し、そして約４２ｋＤａの計算分子量を有す
る。これらのタンパク質は７つのトランスメンブラン領域並びに細胞外および細
胞内ループ中で最高度の同一性（７６％）を共有するが、それらはＮ−末端細胞
外領域（２５％同一性）およびＣ−末端細胞質テイル（５５％同一性）ではそれ
より分散性である。マウスおよびヒトＧ２Ａの両者はＧＰＣＲ類に特徴的なＮ−
末端細胞外領域で推定上のＮ−結合されたグリコシル化部位を含有する。これら
の条件またはそれより厳しくない条件下で配列番号１に示されたＤＮＡ配列をハ
イブリッド形成しうるいずれかのＤＮＡ、並びにそのようなＤＮＡ分子によりコ
ードされるタンパク質は本発明の範囲内である。
【００２２】 複数組織ノーザンブロットを用いる種々のマウス組織サンプルのノーザン分析
は、例えば脾臓、胸腺、肺および心臓の如き造血組織中で約３ｋｂおよび５ｋｂ
の２つのＧ２Ａ転写体を検出したが、正常な骨髄、脳、肝臓、骨格筋または腎臓
では検出しなかった。胸腺細胞が単離されそしてそれらの成長状態に無関係にＧ
２Ａを発現することが半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより示された。ヒト組織のノーザ
ン分析は、ヒトＧ２Ａは脾臓および末梢白血球中でのみ発現されるが心臓、脳、
胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸および
腸粘膜ライニングでは発現されないことを示した。このことは、この遺伝子の造
血作用における役割も示唆する。ヒトＧ２Ａはホルボール１２−ミリステート１
３−アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンまたは抗−ＩｇＭ抗体のいずれ
かによる活性化でＢ細胞中で転写的に活性化される。Ｇ２Ａ転写の活性化はＸ線
照射またはＣＤ４０リガンドによる活性化でもＢ細胞中で観察された。ヒトＧ２
Ａ転写体はＡＬＬ−１およびＫ−５８２白血病細胞系統中にも存在する。
【００２３】 Ｇ２Ａは、ＢＣＲ−ＡＢＬおよびアベルソンマウス白血病ウイルス中で見出さ
れたタンパク質チロシンキナーゼ腫瘍遺伝子であるｖ−Ａｂｌにより転写的に活
性化される。我々の知る限り、これはＧＰＣＲがタンパク質キナーゼにより転写
的に調節されうることの最初の発表である。興味深いことに、腫瘍遺伝子能力を
欠く突然変異体形態のＢＣＲ−ＡＢＬ（ＳＨ２領域に突然変異体を有する）はＧ
２Ａを転写的に活性化できなかった。さらに、形質転換用のＢＣＲ−ＡＢＬ突然
変異を相補することができる重要な細胞周期レギュレーターであるサイクリンＤ
１（Afar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9540-9544, 1995）はＧ ２Ａの発現を復元した。これらのデータは、このＧＰＣＲがＢＣＲ−ＡＢＬおよ
び他のチロシンキナーゼ信号化経路による形質転換用のマーカーでもあることを
示唆する。
【００２４】 図６は、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＥＬ−ＡＢＬ（白血病に関与する腫瘍遺伝子融合
タンパク質）およびｖ−ＡＢＬの領域を示す。ＴＥＬ−ＡＢＬ、Ｇｒｂ−２（Ｂ
ＣＲ−ＡＢＬをＲａｓに共役させるアダプタータンパク質）突然変異体および自
己リン酸化突然変異体はＧ２Ａを活性化しなかった。Ｇ２Ａ受容体はＭＡＰキナ
ーゼを活性化するセリンキナーゼ腫瘍遺伝子であるｖ−Ｍｏｓによっても転写的
に活性化された（Davis, Mol. Reprod. Osv. 42:459-67, 1995）。ｖ−Ｍｏｓ、
ＢＣＲ−ＡＢＬおよびｖ−ＡＢＬは全てＭＡＰキナーゼを活性化させるため（Da
vis,上記参照）、Ｇ２ＡはＭＡＰキナーゼ信号化経路により直接調節されるかも
しれない。従って、Ｇ２Ａも多種のタンパク質キナーゼ類並びにそれらのレギュ
レーターおよびエフェクター類、例えばＲａｓ、Ｍｙｃ、Ｆａｓ、Ｊｕｎおよび
ＢＴＫ、により細胞成長および分化中に活性化されるかもしれないことが考えら
れる。
【００２５】 Ｇ２Ａは脾臓および胸腺中で発現されるが、正常な骨髄細胞中では発現されず
、それがＴおよびＢ細胞成長の中期および後期において重要な役割を演ずるかも
しれないことを示唆する。成長中に、自己−反応性の未熟胸腺細胞が胸腺中でク
ローン欠失され、これはＴ細胞耐性（負の選択）を制定する現象である。胸腺中
の自己−反応性未熟Ｔ細胞の欠失はＴ細胞受容体関与時に細胞消滅により仲介さ
れる。ＧＰＣＲファミリー構成員であるＴＤＡＧ８はＴ細胞受容体活性化時の細
胞消滅中にＴ細胞の中で誘発される（Choi et al., Cell. Immunol., 168:78-84
, 1996）。これは、ＴＤＡＧ８がＴ細胞の負の選択において役割を演ずるかもし
れないことを示唆する。我々が単離したＧ２Ａ類はＴＤＡＧ８と約３０％の相同
性を共有するため、Ｇ２Ａ類がＴ細胞の負の選択において役割を演ずるかもしれ
ないことが確信される。そのファミリー構成員を有するＧ２Ａの配列分析は、そ
れらもＰ２Ｖ受容体であるＡＴＰ用のＧＰＣＲと意義ある相同性を共有すること
を示す。Ｐ２Ｖ受容体がＴ細胞活性化中に転写的に上方調節されることが最近示
された（Koshiba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:831-838, 1997 ）。
【００２６】 Ｇ２Ａは成熟のための脾臓および胸腺の特異的解剖学的区分中へのリンパ球の
泳動を方向指定する際の役割を演ずるかもしれない。造血−特異的ＧＰＣＲであ
るＢＬＲ１に関する以前の研究は、抗原−特異的な免疫応答の開発のためのプレ
条件である脾臓小嚢中へのリンパ球の泳動並びに脾臓のＢ細胞小嚢中への活性化
Ｂ細胞の泳動を方向指定するための重要な役割を演ずることを示唆する（Forste
r et al., Cell, 87:1037-1047, 1996）。造血−特異的組織中でのＧ２Ａの発現
は、それがそれらの成熟のためのリンパ器官中へのリンパ球の泳動を方向指定す
る際に同様な役割を演ずることも示唆する。
【００２７】 ヒトおよびマウスのＧ２Ａはそれらの相補ｃＤＮＡ配列の翻訳に基づくとアミ
ノ酸水準において約７０％の同一性を共有する（図５）。マウスおよびヒトのＧ
２ＡｃＤＮＡクローン類の両者をインシトゥ分析用に使用して、受容体の発現が
脾臓および胸腺のある種の解剖学的領域に制限されるかどうかを試験することが
できる。全長Ｇ２Ａ類をコードするマウスおよびヒトのゲノムクローン類も単離
された。マウスゲノムクローンは相同性組換えによりマウスにおいてＧ２Ａを壊
滅させる標的ベクターを構成するために使用されていた。Ｇ２Ａ−／−マウスは
この受容体の生理学的機能のさらなる評価を可能にするであろう。Ｇ２Ａ−／−
マウスはインビボ白血病発症がＧ２Ａに依存するかどうかの決定を可能にするで
あろう。マウスおよびヒトのゲノムクローン類は造血−特異的遺伝子の転写調節
の分析を可能にするであろうＧ２Ａ類の遠位および近位プロモーターを含有する
かもしれない。マウスおよびヒトのゲノムクローン類の両者はＧ２Ａ類が既知の
遺伝子疾病と関係するかどうかを試験するための細胞遺伝子マップ作成用に使用
することもできる。
【００２８】 イライザ（ELISA）により確認された受容体のＮ−末端部分またはＣ−末端部 分のいずれかと反応性であるウサギ抗血清が製造された。２匹のウサギに受容体
の細胞質テイルに相当する１３アミノ酸ペプチドを注射した。別の２匹のウサギ
にＧ２ＡのＮ−末端細胞外領域を含有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ融合タンパク質であるＧＳＴ−Ｇ２Ａ−Ｎを注射した。両方のウサギから採血
した第二、第三、および第四生成物からの血清はイライザ検定法でわかるように
ペプチドに対する強い免疫応答を示した。抗体はペプチド親和カラムを用いて親
和精製されそしてそれらはＴおよびＢ細胞成長におけるこのＧ２Ａの発現の分析
用に役立つ。これらの抗体を使用してＧ２Ａタンパク質の構造および局在化の決
定を助けた。抗−Ｎ−末端抗体は非透過および透過条件下でＧ２Ａタンパク質を
検出したが、抗−Ｃ−末端抗体は透過条件下でのみＧ２Ａタンパク質を検出した
。これらの結果は、Ｎ−末端タンパク質は細胞外領域でありそしてＣ−末端タン
パク質は既知のＧＰＣＲ類と一致する細胞内領域であることを示唆する。
【００２９】 受容体に対するモノクローン抗体は当業者に既知である従来のハイブリッド形
成技術を用いて生成することもできる。簡単に述べると、３匹のマウスを実施例
９に記載された通りにして製造された２５μｇの組換え受容体で免疫化した。マ
ウスに３週間の間隔で１匹のマウス当たり２０μｇのＧ２Ａを（1/2は皮下にそ して1/2は腹腔内に）接種する。免疫沈澱により測定すると最初の接種後に各動 物から集められた血清はＧ２Ａと反応する。最後の接種から３日後に、マウスを
殺しそして脾臓を回収しそして細胞融合用に準備する。脾臓細胞をポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いてＳｐ２／０ＡＧ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ １５８１）と融合させる。ＰＥＧ融合後に、細胞調合物を９６ウエル板の中
で１ウエル当たり１０５個の細胞の密度で分布させそして１０％胎牛血清および
１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−８を含有するハイポキサンチン／アミノプ
テリン／チミジン（ＨＡＴ）培地の中で選択する。培地を板培養から１０日後に
新しいＨＡＴ培地と交換する。Ｇ２Ａを認識するハイブリドーマ生成ＭＡｂ類を
同定するために、ハイブリドーマ上澄み液を精製した組換え体Ｇ２Ａを免疫沈澱
させるかまたはＧ２Ａを免疫ブロッティングにより検出する能力に関して試験す
る。
【００３０】 Ｇ２ＡのＮ−末端細胞外領域のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）融合タンパク質を作成した。マウスおよびヒトのＧ２Ａ類を当業者に既知で
ある方法によりインビトロおよびインビボでトランスフェクションされた細胞の
中で組換えマウスおよびヒトのＧ２Ａ類の過剰発現を可能にするであろう種々の
真核細胞発現ベクターの中にクローニングした。好ましくは、Ｇ２Ａを含有する
構造体は真核細胞に、より好ましくは哺乳動物細胞に、トランスフェクションさ
れる。或いは、構造体を使用して細菌細胞を形質転換してもよい。
【００３１】 Ｇ２Ａにより誘発される成長分裂停止は、リンパ球の脱調節増殖の場合におけ
る治療用介在の可能性を示す。Ｇ２Ａは細胞増殖に抵抗し、その作用薬は白血病
、リンパ腫および自己免疫疾病を包含する疾病の進行を遅らせるのに有用である
。Ｇ２ＡはＢＣＲ−ＡＢＬにより上方調節されそしてリンパ球および繊維芽細胞
の自然発生成長を抑制できるため（表４Ａ−Ｂ）、Ｇ２Ａを活性化できる抗体、
薬品または天然リガンドをインビトロスクリーニングすることができる。リンパ
球の成長を抑制する抗体、薬品または天然リガンドは上記の疾病の処置に有用で
ある。
【００３２】 逆に、モノクローン抗体をインビボでＧ２Ａ類を阻止しそして正常なリンパ球
の成長を刺激するＧ２Ａ類の特定領域に対して生ずることができる。さらに、イ
ンビトロスクリーニング検定法を使用してＧ２Ａに結合し且つ活性化させるかま
たは活性化させる薬品または天然リガンドを見出すことができる。これらの抗体
、薬品または天然リガンドはリンパ球の成長を刺激することができ、このリンパ
球は先天的免疫不全疾病または後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹っている
患者の症状を治療または軽減できる。例えば、重い合併免疫不全症（ＳＣＩＤ）
、ディジョージ症候群、またはＴ細胞欠失ベアリンパ球症候群の患者、およびＢ
細胞欠失Ｘ−結合された無ガンマグロブリン血症の患者である。抗体、薬品、天
然リガンドをこれらの患者に投与してＧ２Ａを抑制して免疫系におけるＴおよび
Ｂ細胞の成長を刺激することができる。
【００３３】 好ましい態様では、Ｇ２ＡをコードするｃＤＮＡを哺乳動物細胞系統のトラン
スフェクションまたは感染のために真核細胞発現ベクターの中に入れる。ＮＩＨ
３Ｔ３、Ｒａｔ−１、２９３Ｔ、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７およびチャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＤ）細胞を包含する多くのそのような細胞は当該技術で
既知であり、それらのほとんどはミドランド州、ロックヴィルのアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる。多くのそのよう
な発現ベクターは既知でありそして市販されている。好ましい発現ベクターはレ
トロウイルスベクター類、アデノウイルスベクター類およびＳＶ４０をベースと
したベクター類を包含する。ベクターは例えば抗生物質耐性の如き選択可能なマ
ーカーを含有して、受容体を発現する細胞を選択してもよい。或いは、Ｇ２Ａの
発現を調節プロモーターの調節下で行うこともできる。安定なトランスフェクタ
ントを使用して合成または天然化合物の大ライブラリーをスクリーニングしてＧ
２Ａに結合する化合物を同定する。Ｇ２Ａに結合する化合物を次に実施例７、１
０、１１および１２に記載された検定法で試験して、それらがＢＣＲ−ＡＢＬ−
介在Ｇ２Ａ活性化の作用薬または拮抗薬であるかを決定する。
【００３４】 本発明の一つの態様では、試験しようとする化合物を当該技術で既知の方法を
用いて放射線で、比色計でまたは蛍光計で標識をつけそして受容体と共にインキ
ュベーションする。インキュベーション後に、試験化合物が受容体に結合したか
どうかを決定する。そうである場合には、化合物は有効な作用薬または拮抗薬で
ある。機能検定法を行って、受容体活性が活性化されたかまたは抑制されたかを
決定する。これらの検定法は繊維芽細胞および骨髄形質転換検定法、細胞周期分
析およびインビボ腫瘍形成検定法を包含する。タンパク質リン酸化、アデニレー
トサイクラーゼ活性、ホスホイノシチド加水分解、グアニレートサイクラーゼ活
性、イオンフラックス（すなわち、カルシウム）およびｐＨ変化を包含するがそ
れらに限定されない信号形質導入システムを用いて受容体を発現する細胞の中で
応答を測定することもできる。これらのタイプの応答は宿主細胞中に存在するか
または宿主細胞中に受容体と共に導入することもできる。
【００３５】 上記の通りにして単離されたＧ２Ａ受容体を使用して、インビトロおよびイン
ビボの両者において、悪性細胞、特に白血病細胞およびリンパ腫細胞の如き造血
細胞中のＧ２／Ｍトランジションで細胞周期分裂停止を促進させることができる
。Ｇ２Ａはタンパク質チロシンキナーゼ腫瘍遺伝子により誘発されるため、それ
を白血病を包含する多くのタイプの癌用の診断マーカーとして使用することがで
きる。ＤＮＡ配列を、腫瘍形成において同様な役割を演ずるかもしれない別の非
常に関連したフェミリー構成員を探索するためのプローブとして使用することも
できる。
【００３６】 Ｇ２Ａは正常骨髄細胞の中では発現されないが、脾臓では発現される。それ故
、Ｇ２Ａが血液細胞成長を調節することが可能である。（抗体、抑制もしくは刺
激薬、または天然リガンドによる）Ｇ２Ａの活性の調節は例えば器官移植用の免
疫抑制を得るための処置後にまたは細胞毒性癌療法後に起きるもののような抑制
された造血作用を伴う血液細胞集団の正常な数および機能を保つ際に臨床的に有
用である。
【００３７】 心臓内でのＧ２Ａの発現は、この遺伝子が心臓内で生理学的役割を演ずるかも
しれないことを示唆する。抗受容体自己抗体を包含する種々の自己抗体が心筋症
患者に存在することが示された（Fu, Mol. Cell. Biochem. 163:343-7 （1996）
）。心筋症患者は心筋症発症に寄与するＧ２Ａに対する自己抗体を有しているか
もしれない。従って、抗体、薬品、または天然リガンドを中和することによるＧ
２Ａ機能の調節がそのような心筋症患者において症状を軽減するかもしれない。
Ｇ２Ａ類は心血管、高血圧症−関連、心臓機能障害に含まれているかもしれない
。抗体、薬品、または天然リガンドを中和することによるＧ２Ａ機能の調節がそ
のような障害のある患者において症状を軽減するかもしれない。
【００３８】 マウスおよびヒトのＧ２ＡｃＤＮＡ類を使用して他の種からＧ２Ａ相同体を単
離することができる。他の種における相同体の同定が動物の上記疾病の治療法を
もたらすかもしれず、従って動物用薬品における広い用途を有するであろう。マ
ウスおよびヒトのＧ２Ａの高度に保存された領域のアミノ酸配列情報を使用して
、ヒトおよび動物の両者において疾病を処置するために使用できる抗体または薬
品を開発することができる。 下記の実施例はマウスおよびヒトのＷＴＢＣＲ−ＡＢＬ−誘発Ｇ２Ａのクロー
ニングを記載する。
【００３９】 〔実施例１〕 プラスミド構造体、細胞系統、ウイルスストックの製造、抗体の生成 ＷＴｐ１８５ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＳＨ２突然変異体をｐＳＲαＭＳＶベクタ
ー（Muller et al., Mol. Cell. Biol. 11:1785-1792, 1991）の中にこれまでに
記載されたＬＴＲプロモーター（Afar et al., Science 264:424-426, 1994; Pe
ndergast et al., Cell 75:175-185, 1993）の調節下でクローニングした。ｐＳ
ＲαＭＳＶベクターを使用して、Ψパッケージングベクター（Pear et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396, 1993; Afar et al., Science 264
:424-428, 1994）と共に２９３Ｔ細胞のトランジェントトランスフェクションに
よりヘルパーを含まないレトロウイルスストックを製造した。マウスＧ２ＡのＣ
−末端細胞内部分に対応する１３−アミノ酸ペプチド（ＫＤＳＥＥＴＨＬＰＴＥ
ＬＳ；配列番号５）を合成しそして抗体生成（カリフォルニア州、バークレー、
Babco）のためにウサギに注射した。５つの生成ブリードが得られた。マウスＧ ２ＡのＮ−末端細胞外部分に対して抗体を生成するために、ＧＳＴ−Ｍｕ−Ｎ２
Ａ−Ｎ５´およびＧＳＴ−Ｍｕ−Ｎ２Ａ−Ｎ３´プライマーを用いてＰＣＲによ
りＧＳＴ−Ｍｕ−Ｇ２Ａ−Ｎ融合構造体を製造した（表２参照）。
【００４０】 簡単に述べると、２０ｎｇの鋳型、３０μｌの３.３ＸＸＬ緩衝液（コネチカ ット州、ノルウォーク、Perkin Elmer）、６μｌの２５ｍＭ酢酸マグネシウム、
２μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭの各ヌクレオチド）、２０ｐｍｏｌのＧＳＴ−Ｍ
ｕ−Ｎ２Ａ−Ｎ５´およびＧＳＴ−Ｍｕ−Ｎ２Ａ−Ｎ３´プライマー類、並びに
１μｌのｒＴｔｈポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含有する合計１００μｌの反
応混合物の中でＰＣＲを行った。サイクリング条件は、５分間９５℃、３０周期
の０.５分間９４℃による変性、１分間５８℃によるアニーリングおよび１分間 ７２℃による延伸であった。７２℃１０分間にわたるインキュベーション後に、
増幅したＰＣＲ断片を緩衝液Ｂ（１０ｍＭのトリス（Tris）、５ｍＭのＭｇＣｌ 2 、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０、Bo
ehringer Mannheim）中のＢａｍＨｌ（インディアナ州、インディアナポリス、B
oehringer Mannheim）で消化し、そしてアガロースゲル上で分別した。ＤＮＡ断
片を切除し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（商標）（カリフォルニア州、ラジョラ、Bio1
01）を用いて精製し、そしてＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲｌ部位でｐＧＥＸ−２Ｔベク
ター（Pharmacia Biotech）の中にクローニングした。約５０ｎｇのｐＧＥＸ− ２Ｔ ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲｌ断片をＰＣＲ生成物に１：３モル比で１×Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、１０ｍＭのＭ ｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ）およ び１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（マサチュセッツ州、ビバリー、New England Bi
olabs）の中で１０μｌの反応量で１６℃においてオーバーナイトで連結反応さ せた。連結反応物の１０％を１０μｌのＤＨ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞
と氷上で２０分間混合することにより形質転換を行った。４２℃における２分間
にわたる熱ショックおよび氷上での２分間にわたるインキュベーション後に、１
ｍｌのＴＹＥを加えそして形質転換細胞を３７℃において１時間にわたりさらに
インキュベーションした。形質転換混合物をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を
含有するＴＹＥ板上で板培養した。インサートを含有する１つの陽性クローンを
同定した。プラスミドをシークエンスしてマウスＧ２ＡのＮ−末端細胞外部分の
ＧＳＴに対する適切な融合を確認した。
【００４１】 〔実施例２〕 骨髄細胞からのｃＤＮＡの単離 ＷＴｐ１８５ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＳＨ２突然変異種（Goga et al., Cell 82
:981-988, 1995）のいずれかをコードするレトリーバーによりトランスフォーム
された初期マウス骨髄細胞からウルトラスペックＲＮＡ単離システム（テキサス
州、ヒューストンのBiotech Laboratories, Inc.）を用いて全ＲＮＡを単離した
。ポリアデニル化ＲＮＡを全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Coll
aborative Research）を用いて製造業者の指示に従い精製した。ｃＤＮＡをスー
パースクリプト選択システム（メリーランド州、ガイルヘルスブルグ、GibcoBRL
Life Technologies）を用いて製造業者の処方に従い合成した。
【００４２】 〔実施例３〕 再現的示差分析（ＲＤＡ）およびＤＮＡシークエンシング ＷＴｐ１８５ＢＣＲ−ＡＢＬにより異なって調節されるがＳＨ２突然変異種に
よっては調節されない遺伝子を単離するために、ＰＣＲをベースとした消去式ハ
イブリッド形成技術の改変法および再現的示差分析（ＲＤＡ）を使用した。ＲＤ
Ａは、最初は２つの複合ゲノムの間の差を検出するために開発された（Ligitsyn
et al., Science, 269:946-951, 1993）。それをその後にｃＤＮＡと共に使用 することに適合させ、そして種々の系で異なって発現された遺伝子を単離するた
めに使用して成功した（Hubank et al., Nucl. Acids Res. 22:5640-5648, 1994
; Braun et al., Mol. Cell. Biol. 15:4623-4630 （1995））。当該遺伝子を含
有するｃＤＮＡサンプルをテスターと称し、そして消去用に使用されるサンプル
をドライバーと称する。テスターおよびドライバーｃＤＮＡ類の両者を制限酵素
であるＤｐｎｌｌで消化し、次にＰＣＲ増幅用にＲＢｇｌアダプター（ＲＢｇｌ
１２およびＲＢｇｌ２４プライマー類、表２参照）に連結反応させた。ＲＢｇｌ
アダプターを次に除去した。異なって発現された遺伝子を単離するために、増幅
したテスターＤＮＡを新しいアダプターであるＪＢｇｌアダプター（ＪＢｇｌ１
２およびＪＢｇｌ２４プライマー、表１参照）と連結反応させ、そして消去式ハ
イブリッド形成でドライバーＤＮＡと混合する。異なって発現された遺伝子はテ
スター−テスターホモ複製体を形成し、そしてＪＢｇｌ２４プライマーを用いて
ＰＣＲにより優先的に増幅させる。このプロセスを、消去式ハイブリッド形成中
にドライバー対テスターの比を１：１００から１：８００、１：８０００に増加
させながら、３回繰り返す（Lisitsyn et al., 上記参照; Hubank et al., 上記
参照）。この研究では、ＷＴｐ１８５により形質転換されたＨＤＢＭ細胞からの
ｃＤＮＡをテスターとして、そしてＳＨ２突然変異体によるものをドライバーと
して使用して、ＷＴｐ１８５ＢＣＲ−ＡＢＬにより上方調節された遺伝子を単離
した。平行してＳＨ２をテスターとして、そしてＷＴをドライバーとして使用し
てＲＤＡも行い、ＷＴｐ１８５により下方調節された遺伝子を単離した。異なっ
て増幅された遺伝子断片を次にＤｐｎｌｌで消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔクローニングベクター（カリフォルニア州、ラジョラ、Stratagene）のＢａ
ｍＨｌ部位にクローニングした。次にＤＮＡシークエンシングをＡＢＩプリズム
・ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リサーチ・キ
ット（ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Research Kit）（Pe
rkin Elmer）またはシークエナーゼ・バージョン２.０ＤＮＡシークエンシング ・キット（Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit）（オハイオ州、クリー
ブランド、United States Biochemical）を用いて行った。クローンを二方向か らシークエンシングした後に、配列情報を使用してブラスト（BLAST）プログラ ムを用いるデータベースを検索した。タンパク質データベース（非重複の現在ま
でのタンパク質データベース（ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ）およびヌ
クレオチドデータベース（ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ）の両者を検索し
た。部分的なマウスＧ２Ａクローン（Ｎ２Ａ）の３７７塩基対ＤＮＡ断片の配列
分析は、それがデータベースで複数のＧＰＣＲファミリー構成員と相同性のある
新規なＧ２Ａであることを示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】 〔実施例４〕 マウスＧ２ＡｃＤＮＡの単離およびゲノミッククローン ３７７ｂｐＮ２Ａ断片をプローブとして使用してマウス脾臓ｃＤＮＡライブラ
リー（カリフォルニア州、パロアルト、Clontech）を製造業者の指示に従いスク
リーニングした。簡単に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉ１０９０ｒをＴＹＥブロスの中
で１０ｍＭのＭｇＳＯ4および０.２％のマルトースの存在下で一夜にわたり成長
させた。ライブラリーを大腸菌一夜培養物と共にインキュベーションしそして次
にＴＹＥ板の上でＴＹＥ＋２０ｍＭのＭｇＳＯ4中の０.７％アガロースを用いて
板培養した。プラークが直径約１ｍｍとなるまでの３７℃におけるインキュベー
ション後に、板を４℃に１時間冷却し、その後にフィルターを板の上に置いた。
フィルターを次に持ち上げそして１００℃において１分間オートクレーブにかけ
てＤＮＡを変性させた。フィルターを１％のＳＤＳ、２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ
＝３ＭのＮａＣｌ、０.３ＭのＮａＣｉｔｒａｔｅ２Ｈ2Ｏ、７.０までのｐＨ） 、１０％の硫酸デキストラン、５０％のホルムアミド、１×デンハード溶液（５
０×デンハード溶液＝１％のフィコール、１％のポリビニルピロリドンおよび１
％のＢＳＡ、ペンタックスフラクションＶ）および０.２５ｍｇ／ｍｌの鮭精子 ＤＮＡを含有するハイブリッド形成緩衝液の中で４時間にわたりプレハイブリッ
ド形成した。Ｎ２Ａ断片をプライマー−ｌｔｌｌランダム・プライマー・ラベリ
ング・キット（Primer-lt ll Random Primer Labelling Kit）（Stratagene）を
用いて標識付けした。フィルターを４２℃においてハイブリッド形成緩衝液の中
でＮ２Ａプローブを用いてオーバーナイトでハイブリッド形成した。フィルター
を２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳで２回合計１.５時間にわたり洗浄した。１×
１０6個のプラークのスクリーニング後に１個の陽性クローンを同定した。配列 分析は、クローンがＧ２ＡのＣ−末端部分を含有することを示した。５´−ＲＡ
ＧＥを次に使用して５´ＲＡＧＥシステム（GibcoBRL）を用いて製造業者の指示
に従い遺伝子のＮ−末端部分を得た。簡単に述べると、Ｎ２ＡＧＳＰ１プライマ
ー（表２参照）を使用して一本鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングした。一本鎖ｃＤ
ＮＡの精製および３´端部におけるｃＤＮＡに対する末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるｄＣＴＰのホモポリマー付加後に、ネス
ト状プライマーであるＮ２ＡＧＳＰ１の３´に置かれた配列および５´ＲＡＣＥ
アンカープライマー（表２参照）にアニーリングするＮ２ＡＧＳＰ２（表２参照
）をマウスのＧ２ＡのＮ−末端断片のＰＣＲ増殖用に使用した。２０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８.４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ μＭの各ｄＮＴＰ、１００ｎＭのＮ２ＡＧＳＰ２プライマーおよび１００ｎＭの
アンカープライマーを含有する５０μｌの反応混合物の中でＰＣＲが行われた。
ｄＣ−テイルｃＤＮＡを最初に９４℃５分間で変性した。２ユニットのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼの添加後に、３５周期の９４℃０.５分間の変性、６２℃１分 間のアニーリングおよび７２℃３分間の延伸によりＰＣＲを行った。
【００４５】 遺伝子のＮ−末端部分の配列情報を得た後に、ＲＴ−ＰＣＲ（３´ＲＡＣＥシ
ステム、GibcoBRL）によりＷＴＢＣＲ−ＡＢＬにより形質転換された骨髄細胞か
ら単離された全ＲＮＡを使用して全長クローンを得た。全長マウスＧ２Ａ生成用
のプライマーはＮ２Ａ３´ＲＡＣＥ−１（５´プライマー）およびＭｕＮ２Ａ３
´−２（３´プライマー）であった（表２参照）。簡単に述べると、１×ＸＬ緩
衝液、１.５ｍＭの酢酸マグネシウム、１０ｐｍｏｌの各プライマー、２μｌの 一本鎖ｃＤＮＡ合成生成物、０.２ｍＭのｄＮＴＰおよび０.５μｌのｒＴｔｈポ
リメラーゼ（Perkin Elmer）を含有するｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼシステム（
Perkin Elmer）を使用して５０μｌの反応混合物の中でＰＣＲを行った。サイク
リング条件は、３分間９４℃、３５周期の９４℃０.５分間の変性、６２℃１分 間のアニーリング、および３分間７２℃の延伸であった。増殖したＰＣＲ断片を
アガロースゲル上で分別した。全長マウスＧ２ＡｃＤＮＡ（配列番号１）を含有
する約１.３ｋｂの断片を切除し、Geneclean（商標）を用いて精製し、そしてｐ
ＣＲｌｌベクター（カリフォルニア州、サンディエゴ、Invitrogen）の中にサブ
クローニングした。複数のクローンをＮ２ＡＧＳＰ２，Ｎ２Ａｒａｎｄｏｍ、Ｎ
２Ａ５、Ｔ７、およびＭ１３リバースプライマー（M13 Reverse primer）（表２
参照）を用いてシークエンシングした。マウスＧ２Ａのヘマグルチニン（ＨA） ラグ変種を作成するために、ＰＣＲをＭｕＮ２Ａ−ＨＡ−ＮおよびＭｕＮ２Ａ−
ＨＡ−Ｃプライマー（表２参照）を用いて行った。増幅したＰＣＲ断片をｐＣＲ
ｌｌベクター（Invitrogen）の中にサブクローニングした。挿入部を次にＸｈｏ
ｌおよびＮｏｔｌで切除しそしてＸｈｏｌおよびＮｏｔｌ部位でｐＧＤレトロウ
イルス発現ベクターの中にサブクローニングした。複数のＰＣＲクローンを二方
向からシークエンシングして、ｐＧＤ発現ベクターのＮｏｔｌ部位で操作された
ＨＡ−ｔａｇのフレーム融合を確かめた。
【００４６】 マウスＧ２Ａゲノムクローンを得るために、マウスＧ２ＡｃＤＮＡをプローブ
として使用してマウスゲノムライブラリーをスクリーニングした。ライブラリー
をマウス株１２９からのゲノムＤＮＡを用いて製造した。ゲノムＤＮＡをＭｂｏ
ｌで部分的に消化し、サイズ分別し（１７−２１ｋｂ）、そしてＤａｓｈｌｌア
ーム（Stratagene）のＢａｍＨｌ部位に連結反応させた。少なくとも１つの陽性
クローンが単離され、そしてクローンの信頼性をゲノムＤＮＡの直接シークエン
シングおよび遺伝子に特異的なプライマー類を使用するＰＣＲ分析により証明し
た。
【００４７】
【表２】
【００４８】 〔実施例５〕 ヒトＧ２ＡｃＤＮＡおよびゲノミッククローンの単離 マウスＧ２Ａをプローブとして使用してヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（カリ
フォルニア州、パロアルト、ClonTech）をスクリーニングして、ヒト相同体を単
離した。プローブは上記の通りに標識付けされた。ハイブリッド形成はＲａｐｉ
ｄ−ｈｙｂ緩衝液（イリノイ州、アーリントンハイツ、Amersham Life Science ）の中で２時間にわたり６５℃において行われた。フィルターを２×ＳＳＣおよ
び０.１％ＳＤＳで６５℃において合計４０分間で２回洗浄した。１.５×１０6 個のプラークをスクリーニングした後、少なくとも４つの陽性クローン類を単離
した。配列分析は、これらが４２ｋＤの計算分子量を有する３８０個のアミノ酸
のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する複製クロー
ンであることを示した。複数のクローンを二方向からシークエンシングして配列
の精度を確実にした。ＰＣＲを次に使用してヒト脾臓ｃＤＮＡからの全長ヒトＧ
２Ａを遺伝子特異的プライマー類であるＨｕＮ２Ａ＋Ｎ１ＨＡ（５´プライマー
）およびＨｕＮ２ＡＨＡ−Ｃ（３´プライマー）（表３参照）を使用して増幅さ
せた。ヒトＧ２ＡのＨＡ−タグ変種を生成するために、５´プライマーＨｕＮ２
Ａ＋Ｎ１ＨＡおよび３´プライマーＨｕＮ２Ａ＋ＨＡ−Ｃを使用した。全長ヒト
Ｇ２ＡｃＤＮＡ（配列番号３）を含有する増幅したＰＣＲ断片をGeneclean（商 標）を用いて精製し、そしてｐＣＲｌｌベクターの中にクローニングした。複数
のクローンを１７.８ＰＢ、Ｎ２ＡＧＳＰ２，Ｍｕ＋ＨｕＮ２Ａ＋８、ＨｕＮ２ ＡＥ＋２Ａ、ＨｕＮ２ＡＣ−８、およびＨｕＮ２Ａ＋６プライマー（表２）を用
いてシークエンシングして、配列の精度を確実にした。マウスおよびヒトＧ２Ａ
の整列で、それらが互いにアミノ酸レベルで約７０％の同一性であることを示し
た。
【００４９】
【表３】
【００５０】 〔実施例６〕 ノーザン分析 ＲＮＡをUltraspec RNA単離システム（テキサス州、ヒューストン、Biotech l
aboratories, Inc.）を用いて精製した。当該遺伝子の発現レベルを試験するた めに、遺伝子のＤＮＡ断片をプライマー−ｌｔｌｌランダム・プライマー・ラベ
リング・キット（Stratagene）を用いてラベリングした。ノーザンブロッティン
グを上記の通りにして行った（Schneider et al., Cell 54:787-793, 1993）。 簡単に述べると、ＲＮＡサンプルをアガロースゲル（１％のアガロース、２０ｍ
Ｍのホスフェート、ｐＨ７.０、７％のホルムアルデヒド）の中で分別し、ニト ロピュアニトロセルローストランスファーメンブラン（マサチュセッツ州、ウエ
ストボラフ、Micron Separations, Inc.）に２０×ＳＳＣを用いて移した。ブロ
ットを８０℃において２時間にわたりベーキングし、そしてプレハイブリッド形
成緩衝液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×デンハルト、５０ｍＭのフォ
スフェートストック緩衝液および０.２５ｍｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ）の中で４ 時間にわたりプレハイブリッド形成した。ブロットを次に４２℃においてプロー
ブと共に８ｍｌのプレハイブリッド形成緩衝液および２ｍｌの５０％硫酸デキス
トランの中でオーバーナイトでプレハイブリッド形成した。ブロットを２×ＳＳ
Ｃ、０.１％ＳＤＳで室温において３０分間にわたり１回洗浄し、２×ＳＳＣ、 ０.１％ＳＤＳで６０℃において３０分間にわたり１回洗浄した。ブロットをＸ 線フィルムに−７０℃において露光した。
【００５１】 Ｇ２ＡがＢＣＲ−ＡＢＬによる造血細胞形質転換に影響するかどうかを評価す
るために、骨髄形質転換検定法を適用してＧ２Ａの存在下または非存在下でのＢ
ＣＲ−ＡＢＬ介在形質転換の動力学（kinetics）を定量的に測定した。初期マウ
ス骨髄細胞中のＢＣＲ−ＡＢＬのレトロウイルス介在発現は、異常な細胞依存性
プレ−Ｂ培養物の過剰成長をもたらす（McLaughlin et al., 1987）。感染した 骨髄からのプレ−Ｂ細胞の成長速度はチロシンキナーゼ活性の強度に直接依存す
る。異所的に発現されたＧ２Ａのタンパク質水準をモニターするために、その水
準がＦＡＣＳにより定量的に測定できるようなキメラＧ２Ａ−ＧＦＰ融合タンパ
ク質を生成した。検定は以下の実施例に記載されているようにして行われた。
【００５２】 〔実施例７〕 マウス骨髄形質転換検定法および照射マウスの再構成 ３〜４週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスの脛骨および大腿骨からの新鮮な骨髄細胞を 単離し、そしてＷＴＢＣＲ−ＡＢＬｐ１８５をＧ２ＡＧＦＰ融合タンパク質（ｐ
ＭＳＣＶ Ｇ２Ａ−ＧＦＰ ＩＲＥＳ ｐ１８５ＷＴ）と共にまたはコントロール としてのＧＦＰのいずれかをコードするレトロウイルスを感染させた。ＩＲＥＳ
は、発現クローンの収率を改良する内部リボゾーム導入結合部位である。Ｇ２Ａ
−ＧＦＰおよびＧＦＰのアンチ−センス変種もコントロールとして使用された。
細胞を６ｃｍ皿当たり５×１０6個の細胞の密度で１０％の胎牛血清およびβ− メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）を含有する以前に記載されたＲＰＭＩ（
McLaughlin et al., Mol. Cell. Biol. 9:1866-1874, 1989）の中でプレーティ ングした。ウイルスストックを記載されている通りにして製造した（Goga et al
., Cell 82:981-988, 1995）。液体培養物を３回プレートし、そしてプレ−Ｂ細
胞成長に関してモニターした。形質転換されたプレ−Ｂ細胞を感染から種々の日
数後に計数した。Ｇ２Ａ−ＧＦＰおよびＧＦＰの発現がＦＡＣＳ分析により確認
された。
【００５３】 最初の２週間の検定中に、ＢＣＲ−ＡＢＬでのＧ２Ａ発現は、ＢＣＲ−ＡＢＬ
プラスＧＦＰまたはＧ２Ａ−ＧＦＰアンチ−センスコントロールと比べてプレＢ
細胞の過剰成長の誘発を遅らせた。Ｇ２Ａの非存在下でのＢＣＲ−ＡＢＬにより
形質転換された骨髄培養物は１1/2週間内に集密（３ｍｌの培養物当たり>１×１
０7個の細胞）に達したが、Ｇ２Ａの存在下では飽和に達するのに約３週間かか った（図７参照）。３回の独立した実験で同様な結果が得られた。これは、Ｇ２
Ａがリンパ球中でＢＣＲ−ＡＢＬの形質転換プロセスを遅らせることを示す。Ｇ
２ＡはＧＦＰと結合されるため、タンパク質レベルはこれらの培養物の中で、Ｆ
ＡＣＳにより３週間の間に測定することができ、ＧＦＰは単独ではその発現レベ
ルを意義あるほど変化させなかったが、Ｇ２Ａ−ＧＦＰタンパク質レベルは徐々
に減少しそして３週間後にはほぼ検出不能となった（図８）。高レベルのＧ２Ａ
を発現するＢ細胞に対するこの逆選択（counter-selection）は、繊維芽細胞で 見られるようなＧ２Ａの抗−腫瘍形成効果を強く示唆する。
【００５４】 Ｇ２Ａは自然には発現されないが、プレ−Ｂ細胞中でＢＣＲ−ＡＢＬにより誘
発されるため、Ｇ２Ａの発現がＢ細胞成長の異なる状態において調節されたかど
うかが測定された。Ｂリンパ球が造血幹細胞から連続的な分化段階により製造さ
れ、その間に抗原受容体の多様なレパートリーが免疫グロブリン遺伝子トランジ
ションにより製造される。Ｄ−Ｊリアレンジメントの開始は早期プロ−Ｂ細胞中
およびプレ−Ｂ細胞段階で起き、無傷の重鎖が製造される。軽鎖遺伝子は次にリ
アレンジメントを受けて未熟Ｂ細胞の表面で完全なｌｇＭタンパク質の発現をも
たらし、それが次にｌｇＭおよび抗原に応答可能なｌｇＤ−発現成熟Ｂ細胞に分
化する。
【００５５】 〔実施例７Ａ〕 Ｂ細胞中のＧ２Ａの転写調節 Ｇ２Ａの発現を試験するために、マウス骨髄Ｂ細胞をプロ−Ｂ、プレ−Ｂ、未
熟Ｂおよび成熟Ｂ細胞に分別して、リンパ腫細胞中の異なる成長区域におけるＧ
２Ａの発現を試験した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法を使用してＧ２ＡのＲＮＡレ
ベルを測定した。Ｇ２Ａ転写はほとんど、同時的に最高の増殖能力を有し且つ組
換えを受けているプレＢ細胞の中だけに存在する。延伸されたＰＣＲ周期はプレ
−Ｂおよび未熟Ｂ細胞の中で低レベルのＧ２Ａ転写を示した。
【００５６】 ウサギのポリクローナル抗−Ｇ２Ａ抗体を使用して、同じプロ−Ｂ、プレ−Ｂ
、未熟Ｂおよび成熟Ｂ細胞部分におけるＧ２Ａのタンパク質レベルを試験した。
ＦＡＣＳを用いると、高いレベルのＧ２Ａタンパク質がプロ−Ｂ細胞中で検出さ
れたが、Ｂ細胞の他の３部分では非常に弱い染色が存在した（図９）。これらの
結果は、Ｇ２ＡのｍＲＮＡレベルがＧ２Ａタンパク質レベルに対応していること
、並びにＧ２Ａの影響がプロ−Ｂ細胞中で優先的に制限されているかもしれない
ことを示す。
【００５７】 自然刺激がより成熟したＢ細胞の中でＧ２Ａを活性化できたかどうかを決定す
るために、我々はＧ２Ａ発現が基本レベルであるヒトＢ細胞系統（Ｒａｍｏｓ）
をモデルシステムとして使用した。Ｒａｍｏｓ細胞（およびＪｕｒｋａｔ細胞、
ヒトＴ細胞系統）を抗−ｌｇＭ抗体により活性化してＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の
活性化がＧ２Ａ転写を誘発したかどうかを試験した。
【００５８】 〔実施例８〕 ＢおよびＴ細胞活性化中のＧ２Ａ転写の調節 ヒトＢ細胞（Ｒａｍｏｓ）およびＴ細胞（Ｊｕｒｋａ）を１０％の胎牛血清を
含有するＲＰＭｌ１８４０の中で２×１０6個の細胞／ｍｌの密度まで成長させ た。細胞を刺激直前に血清を含まないＲＰＭｌの中で２×１０8個の細胞／ｍｌ の密度で再懸濁させた。抗−ｌｇＭを用いるＲａｍｏｓ細胞の活性化用に、ヤギ
の抗−ｌｇＭを細胞懸濁液（０.５ｍｌ）に１０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた 。３７℃における０分、５分、７時間および２４時間後に、ＲＮＡを単離した。
【００５９】 イオノマイシンおよびＰＭＡによるＲａｍｏｓおよびＪｕｒｋａ細胞の活性化
のために、イオノマイシンおよびＰＭＡを細胞にそれぞれ２μｇ／ｍｌおよび２
０ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるまで加え、そしてＲＮＡを０、３、６、２４およ
び４８時間後に単離した。それぞれ抗−ＣＤ３およびＣＤ２８抗体によるＪｕｒ
ｋａ細胞の活性化用に、各々１０ｃｍプレートに抗−ＣＤ３（６.２５μｇ）お よび抗−ＣＤ２８（１２.５μｇ）抗体（ミズーリ州、セントルイスのSigma）で
コーティングした。Ｊｕｒｋａ細胞を引き続き抗体でコーティングされた板の上
に接種した。細胞を活性化から０、３、６、２４および４８時間後に回収しそし
てＲＮＡを単離した。
【００６０】 ＲＴ−ＰＣＲ用に、５μｇの各サンプルからの全ＲＮＡを使用してSuperscrip
t（商標）プレ増殖システム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを 合成した。一本鎖ｃＤＮＡ合成生成物の１０％を次にＰＣＲ用に使用した。Ｈｕ
Ｎ２Ａ−Ｃ１（配列番号２８）およびＨｕＮ２Ａ＋６（配列番号３３）プライマ
ーをヒトＧ２Ａ断片の増幅用に使用した。プライマーのコントロールセットであ
るヒトおよびマウス用のＧ３ＰＤＨコントロールアンプリマー類（５´−ＡＣＣ
ＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３´；配列番号３８および５´−ＴＣＣ
ＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ；配列番号４０）を使用して、等量の鋳型
が使用されたことを確実にした。１×ＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ８.４、５０ｍＭのＫＣｌ：ＧＩＢＣＯ）、１.５ｍＭのＭｇＣｌ2、０.４
ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、０.５μｌのＴａｑＤＮＡポ リメラーゼ（ＧＩＢＣＯ）および２μｌの一本鎖ｃＤＮＡ合成生成物を含有する
５０μｌの反応混合物の中でＰＣＲが行われた。ｃＤＮＡを９４℃３分間で変性
させた。３５周期の９３℃０.５分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、お よび７２℃２分間の延伸によりＰＣＲが行われた。
【００６１】 Ｇ２Ａ転写は刺激されなかったＲａｍｏｓ細胞ではほとんど検出不能であった
。ヒトＧ２ＡはＢ細胞中では４時間の活性化の間に抗−ｌｇＭ抗体により転写的
に上方調節され、強い細胞受容体架橋結合がＧ２Ａの発現を調節することを示唆
する。Ｇ２Ａ転写の上方調節は細胞内信号化経路の受容体−非依存性活性化に対
する応答でも観察された。それぞれ細胞内カルシウムレベルを高めそしてタンパ
ク質キナーゼＣを活性化させるためのイオノマイシンおよびＰＭＡのＢ細胞への
同時添加は、増加したレベルのＧ２ＡｍＲＮＡを生じる結果となった。Ｇ２Ａ転
写の時間工程分析は、誘発にはこれらのアクチベーターで２〜４時間が必要であ
ることを示した。ＣＤ４０リガンドによるＲａｍｏｓ細胞の活性化もＧ２Ａ転写
を上方調節した。さらに、ＤＮＡ損傷および細胞周期分裂停止を誘発する方法で
あるＲａｍｏｓ細胞のＸ線照射も、Ｇ２Ａの転写を誘発した。しかしながら、Ｊ
ｕｒｋａｔ細胞ではＰＭＡプラスイオノマイシンまたは抗−ＣＤ３プラスＣＤ２
８抗体による活性化でＧ２Ａ転写レベルにおける劇的な変化は観察されなかった
。これらのデータは、ヒトＧ２ＡがＢ細胞活性化中に役割を果たすかもしれない
ことを示唆する。コントロールとして、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＯＨ）コントロールアンプリマーセットを使用して、等
量の鋳型がＲＴ−ＰＣＲ用に使用されたことを確実にした。まとめると、これら
の結果はＧ２ＡがＢ細胞活性化で役割を果たすかもしれないことを示唆する。Ｇ
２Ａの転写活性化は、Ｂ細胞の細胞消滅またはＢ細胞の増殖および／もしくは分
化のいずれかに関与しているかもしれない。
【００６２】 腫瘍サプレッサー因子ｐ５３の転写は電離放射線（ionizing radiation）によ
り誘発できることが示されていた。Ｇ２Ａは腫瘍サプレッサー因子と同様に機能
しそしてその発現は種々の刺激により転写的に調節されるため、多くの腫瘍サプ
レッサー因子を活性化するＤＮＡ損傷剤（damading agent）がＧ２Ａの発現も誘
発するかどうかが決定された。
【００６３】 〔実施例８Ａ〕 ＤＮＡ−損傷剤によるＧ２Ａ発現の誘発 様々な量のＸ線を使用してＲａｍｏｓ細胞を照射し、そして全ＲＮＡサンプル
をオーバーナイトのインキュベーション後に抽出した。Ｇ２Ａ転写は投与量依存
方法で誘発され、そして約９Ｇｙで最大に達した。電離放射線は一本鎖および二
本鎖ＤＮＡを破壊するため、他のＤＮＡ損傷剤がＧ２Ａ転写も活性化するかどう
かが決定された。異なるタイプのＤＮＡ病変を引き起こす広範囲の試薬：チミジ
ン二量体の生成を誘発する紫外線照射；デノボＤＮＡ前駆体合成を抑制する化学
試薬（ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル）；ＤＮＡ合成を直接阻止する
化学試薬（サイトシンアラビナシド、タキソール、エトポシド）；またはＤＮＡ
二重螺旋とインターカレートする試薬（ドキソルビシン）が選択された。Ｇ２Ａ
転写は、試験した全てのＤＮＡ損傷剤に応答して上方調節されることが見出され
、Ｇ２Ａの誘発はＤＮＡ損傷の一般的センサーの活性化によるかもしれないこと
を示唆する。
【００６４】 〔実施例９〕 発現ベクター中へのマウスおよびヒトＧ２Ａの挿入 Ｇ２ＡｃＤＮＡを数種の真核細胞発現ベクターの中に挿入した。これらの構造
体のいずれかを使用して当該技術で既知の方法を用いる組換えＧ２Ａの製造のた
めに真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、をトランスフェクションすることがで
きる。そのような方法は、例えば、Sambrock et al. （Molecular Biology: a L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Ausubal, Current
Protocols in Molecular Biology, 1988）に記載されている。そのような真核細
胞はＲａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７およびＢＨＫ細
胞を包含する。Ｇ２Ａは、当該技術で既知の方法を用いてＳｆ９昆虫細胞を感染
させるために使用されるバクロウイルス発現ベクターの中に挿入することもでき
る。
【００６５】 ｐＣＲｌｌベクター（Invitorogen）中のＮ−末端フラッグ−タグマウスＧ２ ＡをマウスＧ２Ａのインビトロ転写および翻訳用並びにノーザンＳ１またはイン
シトゥ分析用のプローブを製造するために使用した。一本鎖ｃＤＮＡ中へのＲＮ
Ａの逆転写はＷＴＢＣＲ−ＡＢＬで形質転換された骨髄細胞から単離されたＲＮ
Ａを用いて行われた。１×ｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８. ７５、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳO4、２ｍMのＭｇＳＯ4、０. １％のTritonＸ−１００、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）（Sigma）を含有する５ ０μｌの反応混合物の中で１０ｐｍｏｌのＭｕＮ２Ａｆｌａｇ５およびＭｕＮ２
Ａ３´−１プライマー（表２）を用いてＰＣＲが行われた。ｃＤＮＡを最初に９
４℃３分間で変性した。３５周期の０.５分間９４℃の変性、１分間６２℃のア ニーリング、および３分間７５℃の延伸によりＰＣＲが行われた。増幅したＰＣ
Ｒ生成物を製造業者の指示に従いｐＣＲｌｌベクター（Invitrogen）の中にクロ
ーニングした。
【００６６】 ｐＳＲα-Ｆｌａｇ-Ｇ２Ａ ｔｋ Ｎｅｏ発現ベクターは哺乳動物細胞中でのマ
ウスおよびヒトのＧ２Ａの発現用レトロウイルス発現ベクターである。この構造
体では、Ｎｅｏ遺伝子はＧ４１Ｂによる感染細胞選択用の単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの調節下にある。ｐＣＲｌｌ−Ｆｌａｇ
−Ｍｕ−Ｇ２ＡからのＥｃｏＲｌ挿入部を切除し、そしてｐＳＲα−Ｆｌａｇ−
Ｇ２ＡｔｋＮｅｏの中にＴＫプロモーター上流のＥｃｏＲｌクローニング部位で
クローニングした。
【００６７】 ｐＣＲ−Ｆｌａｇ−ＭｕＧ２Ａのタグなし版であるｐＣＲｌｌ−Ｍｕ−Ｇ２Ａ
をインビトロ転写および翻訳用に並びにノーザン、Ｓ１またはインシトゥ分析用
のプローブを製造するために使用した。このベクターの作成のためには、ＲＴ−
ＰＣＲをＭｕＮ２Ａ５´ＥｃｏおよびＭｕＮ２Ａ３´−１（表２）を使用してｐ
ＣＲｌｌ−Ｍｕ−Ｇ２Ａに関して記載された処方を用いて行った。増幅したＰＣ
Ｒ生成物をｐＣＲｌｌベクターの中にクローニングした。インビトロ転写および
翻訳はＴＮＴ−共役網状赤血球溶解物システム（ウィスコンシン州、マジソン、
Promega）を用いて製造業者の指示に従い行われた。Ｍｕ−Ｇ２Ａのインビトロ 転写および翻訳は、マウスＧ２Ａの計算分子量と同様な約４２ｋＤａの分子量を
有するタンパク質生成物を出現させた。
【００６８】 マウスＧ２ＡのＣ−末端ＨＡ−タグ付き版であるｐＣＲｌｌ−Ｍｕ−Ｇ２Ａ−
ＨＡをインビトロ転写／翻訳用に並びにノーザン、Ｓ１またはインシトゥ分析用
のプローブを製造するために使用した。このベクターの作成のためには、ＲＴ−
ＰＣＲをプライマーＭｕＮ２Ａ５´ＥｃｏおよびＭｕＮ２Ａ３´ＨＡを使用して
マウスＧ２ＡのＨＡ−タグ付き版を含有するプラスミドベクターｐＣＤ−Ｍｕ−
Ｇ２Ａ−ＨＡを用いて行った。ＰＣＲ生成物をｐＣＲｌｌベクター（インビトロ
ゲン）の中にクローニングした。
【００６９】 ｐＭｕ−Ｇ２Ａ−ＧＦＰの作成のためには、マウスＧ２ＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１
ベクター（Clontech）の中でＮ−末端緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合させ
た。マウスＧ２ＡをマウスＧ２Ａに特異的なプライマーを用いて増幅させ、そし
てｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターの中でＧＦＰとフレームに合うように融合させた。
Ｍｕ−Ｇ２Ａ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現はＦＡＣＳ分析により確認された。
この融合タンパク質は後の哺乳動物細胞中でのマウスＧ２Ａの発現およびＧ２Ａ
の機能分析に使用できるであろう。同様に、ｐＥＧＦ−Ｈｕ−Ｇ２Ａ−ＧＦＰに
関しては、ヒトＧ２ＡをｐＥＧＦＰベクター中でＮ−末端緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）に融合させた。ヒトＧ２ＡをヒトＧ２Ａに特異的なプライマーを用いて
増幅させ、そしてｐＥＧＦＰベクターの中でＧＦＰとフレームに合うように融合
させた。この融合タンパク質は後の哺乳動物細胞中でのヒトＧ２Ａの発現および
Ｇ２Ａの機能分析において使用できるであろう。
【００７０】 〔実施例１０〕 ＢＣＲ−ＡＢＬによるインビボ白血病発症の促進 再構成の１日前に、重い合併免疫不全称（ＳＣＩＤ）マウスに２７５ｒａｄｓ
の致死量以下で照射した。骨髄全部を単離し、そして上記のレトロウイルスを感
染させた。感染から３時間後に、骨髄をレシピエントＳＣＩＤマウスの尾の静脈
中に静脈内注射した。動物を１２週間の期間にわたり、病気の症状に関してモニ
ターする。病気のマウスを殺し、そして組織をウエスターンブロッティングによ
りＢＣＲ−ＡＢＬ発現に関して分析する。血液および脾臓サンプルを蛍光活性化
細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析する。血液塗抹標本をライト／ギエムサ染色に
より分析する。ＷＴＢＣＲ−ＡＢＬを注射したマウスは、ＳＨ２突然変異体を注
射したマウスより有意に多い白血病発症を示す。
【００７１】 ＢＣＲ−Ａｂｌの腫瘍形成能力に対するＢＣＲ−ＡＢＬ調節された遺伝子の影
響を評価するために、軟質寒天繊維芽細胞コロニー形成検定法を使用した。ＢＣ
Ｒ−ＡＢＬは、げっ歯動物の繊維芽細胞（Ｒａｔ−１）の軟質寒天中でのアンコ
ラージ（anchorage）−非依存性成長を与え、そしてコロニー数はその形質転換 能力を定量的に反映する（Lugo et al., Mol. Cell. Biol. 9:1263-1270, 1989 ）。この検定法を以下に記載する。
【００７２】 〔実施例１１〕 腫瘍サプレッサー因子としてのＧ２Ａ機能 Ｇ２Ａ、Ｇ２Ａ−ＧＦＰ、またはＧ２Ａインディケーター細胞系統をヘルパー
を含まないレトロウイルスによるＲａｔ−１繊維芽細胞の感染により生成し、そ
の後に約１−２週間にわたりＧ４１８（０.４ｍｇ／ｍｌ）の中で選択した。Ｇ ２Ａ−ＧＦＰおよびＧＦＰは、ＦＡＣＳ分析によりＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dic
kinson）を使用して確認した。種々の腫瘍遺伝子による形質転換を上記の軟質寒
天検定法を用いて測定した（Lugo et al., 上記参照）。簡単に述べると、イン ディケーター細胞系統を６×１０4個の細胞／６ｃｍ皿の密度でオーバーナイト で板培養した。感染は３７℃において３時間にわたり８μｇ／ｍｌのポリブレン
を含む１ｍｌのウイルスを用いて行った。感染から２日後に、細胞を回収しそし
て寒天の中で１×１０4個の細胞／６ｃｍ皿の密度で２回板培養した。皿を１週 間にわたり再供給しそしてコロニーを３週間後に計数した。直径が０.５ｍｍよ り大きいコロニーを陽性と評価した。
【００７３】 Ｇ２ＡまたはＮｅｏ−発現Ｒａｔ−１細胞系統もレトロウイルス感染およびＧ
４１８選択により生成し、その後にＢＣＲ−ＡＢＬを発現するレトロウイルスス
トックを過剰感染させた。ＦＡＣＳ分析およびウエスターンブロッティングによ
り示されるように、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するレトロウイルスにより同様なパー
センテージの細胞が感染した。
【００７４】 ＲＤＡスクリーンにより単離された遺伝子のほとんどは、ＢＣＲ−ＡＢＬの腫
瘍形成能力に認められる影響を有していなかった。しかしながら、Ｇ２ＡはＢＣ
Ｒ−ＡＢＬが軟質寒天中でコロニーを形成する能力を強く拮抗した。表４のＡ−
Ｂに挙げられているように、Ｇ２Ａの過剰発現はＢＣＲ−ＡＢＬｐ１８５により
誘発される寒天コロニー数を約５倍ほど抑制した。ＧＦＰを含むＧ２Ａエピトー
プ−タグ付きはＲａｔ−１細胞の中でＢＣＲ−ＡＢＬ介在形質転換を阻止する一
部の能力を保有していた。Ｇ２Ａはブルトンチロシンキナーゼの活性化変種であ
るＧａｇ−ＢＴＫ´および転写因子ＭｙＣにより誘発される寒天コロニーも阻止
した。興味深いことに、Ｇ２Ａはｖ−ＡＢＬまたはセリンキナーゼ腫瘍遺伝子ｖ
−Ｍｏｓにより介在される形質転換を阻止できなかった。ｖ−ＡＢＬおよびｖ−
Ｍｏｓは、細胞をＣＲ−ＡＢＬ、ＭｙＣおよびＧａｇ−ＢＴＫ´とは異なる機構
により形質転換させるかもしれない。ＢＴＫはＢ細胞成長において重要な役割を
果たすことが示されているため（Tsukada et al., Cell 72:279-290, 1993; Raw
lings et al., Immunological. Rev. 138, 1994）、Ｇ２ＡがＧａｇ−ＢＴＫ´ 形質転換を阻止する能力はＧ２ＡがＢ細胞成長中にＢＴＫのレギュレーターであ
るかもしれないことを示唆する。同様に、Ｇ２Ａ遺伝子の過剰発現は骨髄細胞の
形質転換を抑制した。さらに、インビボ腫瘍形成および白血病発症検定法を使用
して種々の有機体により誘発される悪性表現型に対するＧ２Ａの影響を分析する
ことができる。インビトロ、エクスビボおよびインビボでの、Ｇ２Ａをコードす
る発現構造体、好ましくはレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター構造体
、による細胞のトランスフェクションまたは感染が細胞増殖の抑制をもたらす。
本発明の好ましい態様では、骨髄は白血病患者から標準的方法により単離され、
そしてここに記載されているようなＧ２Ａをコードするレトロウイルス構造体を
骨髄細胞に感染させる。骨髄を次に患者に戻す。骨髄細胞中のＧ２Ａの過剰発現
はさらに白血病発症を抑制し、そして有意な臨床的改良をもたらす。
【００７５】
【表４】
【００７６】 Ｒａｔ−１／Ｎｅｏ細胞は、ＢＣＲ−ＡＢＬによる形質転換に典型的な顕著な
延長表現型を示した。Ｇ２Ａは、ＢＣＲ−ＡＢＬによるこの全体的な形態学的変
化を阻止した。これらの同じ細胞集団を寒天の中で板培養した時には、野生型Ｂ
ＣＲ−ＡＢＬだけが３週間後に１,０００個以上のコロニーを生じた。対照的に 、Ｇ２Ａで同時発現されたＢＣＲ−ＡＢＬは５倍も少ないコロニーを生じ、それ
はＧ２ＡがＢＣＲ−ＡＢＬ介在形質転換を拮抗することを示す。回収されそして
液体培養物中で拡大された寒天コロニーのＦＡＣＳ分析による評価は、寒天中で
成長した細胞はＧ２Ａの発現を損うがＢＣＲ−ＡＢＬは損なわなかったことを示
した。それ故、Ｇ２Ａは形質転換に対して抗−増殖効果を有する。
【００７７】 Ｇ２Ａが細胞周期進行の抑制に含まれているかどうかを決定するために、Ｒａ
ｔ−１繊維芽細胞に以下の実施例に記載されている通りにしてＧ２Ａ遺伝子を発
現するレトロウイルスを感染させた。
【００７８】 〔実施例１２〕 Ｇ２Ａが有糸分裂中のＲａｔ−１細胞内で細胞周期分裂停止を誘発する Ｒａｔ−１細胞をＧ４１８（０.４ｍｇ／ｍｌ）で１週間にわたり選択しそし て亜集密（subconfluence）または集密（confluence）となるまで成長させた。 細胞をトリプシン処理により回収しそして遠心により粒状化した。細胞を次にビ
ンデロフステイン（５ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、５ｍＭのＮａＣｌ、０.０５％
のＮＰ−４０、０.０４ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、５μｇ／ｍｌのＲＮ ａｓｅ）の中に再懸濁させそして氷上で１５分間にわたり暗所でインキュベーシ
ョンした。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳｃａｎ（Lysis IIプログラム）
を用いて行った。表５に示されているように、Ｇ２Ａの発現が細胞周期のＧ２／
Ｍ相中の細胞のパーセンテージを増加させる。顕微鏡下でのＧ２Ａを発現するＲ
ａｔ−１細胞の試験は、二または多核を有する細胞の比較的高いパーセンテージ
を示し（約５−１０％対平行Ｒａｔ−１細胞中で観察された１％以下）、Ｇ２Ａ
を発現する細胞は有糸分裂の後期において分裂停止されているようであった。ま
とめると、これらのデータはＧ２Ａが腫瘍サプレッサー因子として機能するかも
しれずそして有糸分裂中の細胞周期分裂停止に含まれることを示唆する。Ｇ２Ａ
の生物学的性質は腫瘍サプレッサー因子であるｐ５３と類似性を共有する。Ｇ２
Ａおよびｐ５３の両者は細胞成長を負に調節しそして細胞周期分裂停止を誘発す
る。興味深いことに、それらの発現は例えばＸ線の如きＤＮＡ損傷誘発剤により
両者とも上方調節される。ある種の腫瘍遺伝子がＧ２Ａの発現を誘発する能力お
よびＧ２Ａがこれらの遺伝子の腫瘍形成能力を阻止する能力は、Ｇ２Ａが細胞が
不運な形質転換表現型に対抗する自己防衛機構を含むかもしれないことを示唆す
る。
【００７９】
【表５】
【００８０】 〔実施例１３〕 Ｇ２ＡがＮＩＨ３Ｔ３細胞中で有糸分裂の進行を阻止する 繊維芽細胞およびリンパ腫細胞中でのＧ２Ａの抗−腫瘍形成効果、並びに細胞
周期分裂停止関連ＤＮＡ損傷剤によるＧ２Ａの誘発は、Ｇ２Ａが細胞周期調節に
含まれるかもしれないことを示唆した。この可能性を検討するために、レトロウ
イルス発現Ｇ２Ａ、Ｇ２Ａ−ＧＦＰ融合タンパク質またはＧＦＰ対照を使用して
容易に感染可能な（>９０％の感染）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させた。Ｇ２Ａレ トロウイルスによる一時的感染は、通常の成長条件（１０％ＦＢＳ）下で約１０
％ほどＧ２／Ｍで細胞の一部を再現可能式に増加させ、Ｇ２ＡがＧ２／Ｍで細胞
を分裂停止させることを強く示した。このパーセンテージの増加はｐ５３の過剰
発現により引き起こされるものと匹敵する。Ｇ２Ａが血清飢餓条件下でＧ２／Ｍ
阻止を与えるかどうかをさらに試験するために、レトロウイルス発現Ｇ２Ａ、Ｇ
２Ａ−ＧＦＰ融合タンパク質またはＧＦＰ対照を０.１％ＦＢＳの存在下で４８ 時間にわたり培養した。細胞を回収しそしてＤＮＡ含有量をＦＡＣＳにより分析
した。血清飢餓から２日後に、ＧＦＰだけを発現する対照細胞の９５％は２Ｎ ＤＮＡを含有しており、これらの細胞がＧ１で成長因子欠失で分裂停止されたこ
とを示唆する。しかしながら、Ｇ２ＡまたはＧ２Ａ−ＧＦＰ融合タンパク質を発
現する細胞は依然として４Ｎ ＤＮＡ含有量（それぞれ、３９％および３４％） を有する大きいパーセンテージの細胞を示し、Ｇ２Ａが成長因子欠失中にＧ２／
Ｍから細胞が出るのを阻止することを示唆する（図１０）。成長因子欠失中に効
果が強められる８Ｎ ＤＮＡ含有量における増加、およびＧ２ＡまたはＧ２Ａ− ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞中での複数核の５−１０％の増加も観察さ
れた（図１０）。これは、Ｇ２Ａを発現する細胞中でのＤＮＡの内部複製がある
ことを示唆するが、これらの細胞は細胞質分裂を受けず、分裂紡錘体チェックポ
イントの撹乱におけるＧ２Ａの可能な追加の役割を示唆する。
【００８１】 Ｇ２Ａ初期配列の試験は、ユビキチンの共役に関する認識モチーフとして作用
するかもしれないサイクリン遺伝子生成物中で最初に見出された「破壊ボックス
」の存在を示す。細胞質ゾル性のユビキチン処理されたサイクリンはマルチサブ
ユニット２６Ｓプロテオゾームにより変性する（Hochstrasser, 1996）。例えば
酵母Ｓｔｅ２の如きある種のＧＰＣＲ類はユビキチン処理され、それはその後の
変性用のそれらのインターナリゼーションに必要であるという証拠がある。より
最近の報告は信号のインターナリゼーション用ＧＰＣＲのユビキチン処理の役割
を示したが、それはプロテアゾームによる変性はしなかった（Terrell et al.,
Molecular Cell 1:193-202, 1998）。Ｇ２Ａ中の「破壊ボックス」の存在がＧ２
Ａをユビキチン処理しそして下方調節するかまたはユビキチン経路を介してイン
ターナリゼーションするかもしれない可能性を高めた。
【００８２】 〔実施例１４〕 ユビキチン経路を介するＧ２Ａの変性 Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルロイシナル（ＡＬ
ＬＮ）は、２０Ｓプロテアゾームを介するユビキチン処理されたタンパク質の変
性を防止する２０Ｓプロテアゾームの有効なインヒビターである。ＡＬＬＮの添
加がＧ２Ａのタンパク質水準を高め、そしてＧ２Ａが介在するＧ２／Ｍ阻止を可
能にするかどうかを決定するために、マウス繊維芽細胞にＧ２Ａ−ＧＦＰまたは
ＧＦＰを発現するレトロウイルスを感染させた。以前の報告で使用されたものよ
り４倍ほど低い投与量のインヒビター（５０μＭ）を用いるオーバーナイトのイ
ンキュベーション後に、細胞を回収しそしてＧＦＰに関してＦＡＣＳにより分析
した。ＡＬＬＮはＧ２Ａ−ＧＦＰのタンパク質水準をｌｏｇ蛍光強度により測定
して４−５倍ほど高めた（図１１）。これらのデータは、２０Ｓプロテアゾーム
活性の部分的抑制がＧ２Ａの全体的なタンパク質水準を安定化させたか、または
高めたことを示唆する。ＡＬＬＮによるＧ２Ａの高められたタンパク質水準がＧ
２／Ｍ阻止を可能にした（４４％から６２％）（図１２）。他の関連ペプチドア
ルデヒドであるＮ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−マチオナ
ル（ＡＬＬＭ）でも同様な結果が得られた。
【００８３】 推定上の「破壊ボックス」の損失がＧ２Ａを安定化させて、タンパク質レベル
または過剰活性Ｇ２Ａに対する細胞逆選択を増加させ、全体的なタンパク質レベ
ルにおける減少をもたらすかもしれない。この突然変異は折り損なった非官能性
受容体をもたらすかもしれず、それはそれがプラズマ膜に局在化する前でも変性
する。破壊ボックスおよびＧ２Ａのユビキチン処理が膜の局在化、リガンド活性
化またはインターナリゼーションの如きその正常な機能にために必要である。さ
らに、ユビキチン突然変異体はより低いタンパク質濃度を生じた。
【００８４】 ｐ５３およびＡｂｌを包含する多数の遺伝子がＧ２／Ｍ調節に考えられていた
。ｐ５３はＣｄｃ２／サイクリンＢ複合体の活性化に必要なＣｄｃ２５の活性化
を防止することによりＧ２／Ｍのトランジションを遅らせることが示されている
。Ｇ２／ＭチェックポイントにおけるＡｂｌの正確な役割は未知であるが、Ａｂ
ｌがＡＴＭと物理的に相互作用しそしてＤＮＡ損傷によるＡｂｌキナーゼ活性の
活性化がＡＴＭに依存することが示された。ノックアウトマウスがリンパ腫症候
群を示すためＡｂｌも興味深く、他の細胞タイプの中より大きいリンパ腫細胞中
での意義ある細胞周期調節役割を示唆する。
【００８５】 〔実施例１５〕 Ａｂｌおよびｐ５３はＧ２ＡによるＧ２／Ｍ阻止に関して調節されない ｐ５３またはＡｂｌがＧ２Ａ−介在Ｇ２／Ｍ分裂停止に含まれるかどうかを決
定するために、我々はＧ２Ａの過剰発現がｐ５３またはＡｂｌを欠いた繊維芽細
胞中でＧ２／Ｍ分裂停止を誘発するかどうかを試験した。Ａｂｌノックアウト細
胞系統では、Ｇ２Ａ−ＧＦＰの過剰発現が細胞のパーセンテージをＮＩＨ３Ｔ３
細胞と比べた時に１０％のＦＢＳの存在下で約１５％ほど高めた（図１３）。Ｇ
２Ａを発現する高いパーセンテージはＧＦＰを発現する細胞と比べて血清飢餓（
０.１％ＦＢＳ）後にＧ２／Ｍ（３９％）で分裂停止されたままであり（図１３ ）、Ａｂｌ発現がＧ２ＡによるＧ２／Ｍ分裂停止にとって機能的に必要ないこと
を示唆する。
【００８６】 同様な実験をｐ５３−／−繊維芽細胞系統に対しても行ってｐ５３がＧ２Ａに
よるＧ２／Ｍ分裂停止にとって必要かどうかを決定した。ｐ５３−／−繊維芽細
胞のＦＡＣＳ分析は細胞周期レギュレーターとしてのｐ５３の意義ある役割と一
致する細胞周期を超えた異常な分布を生じた。ｐ５３の非存在下でのＧ２Ａの過
剰発現は通常の成長条件（１０％ＦＢＳ）下ではＧ２／Ｍで細胞のパーセンテー
ジを意義あるほど高めなかった（図１４）。４８時間にわたる血清飢餓はＧＦＰ
発現細胞（１８％）に比べてＧ２／Ｍ（３３％）で分裂停止されたままの大きい
パーセンテージのＧ２Ａ発現細胞を示し（図１４）、ｐ５３はＧ２ＡによるＧ２
／Ｍに必要ないことを示唆する。
【００８７】 ｐ５３はＤＮＡ損傷の共通センサーであり且つＤＮＡ損傷に応答する多くの遺
伝子（例えばｐ２１、１４−３−３）の発現を誘発する転写因子として作用する
ため、ｐ５３がリンパ球中の電離放射線に応答するＧ２Ａの誘発に必要かどうか
が決定された。骨髄細胞をＷＴおよびｐ５３ノックアウトマウスから単離しそし
てｌＬ−７およびＳＬＦ（スチール因子）と共にインキュベーションしてプレ−
Ｂ細胞の自然発生成長を刺激した。これらのプレ−Ｂ細胞を次に変動する投与量
のＸ線で照射した。照射に続くオーバーナイトのインキュベーション後に、全Ｒ
ＮＡを単離し、そして半定量的ＲＴ−ＰＣＲを上記の通りにして行った。Ｇ２Ａ
転写体のレベルは活性的に成長する照射されなかったプレ−Ｂ細胞では低く、活
性増殖信号はＧ２Ａ発現を誘発するのに充分ではないことも示唆する。ＷＴおよ
びＰｐ５３−／−マウスの両者においてＸ線によりＧ２Ａ転写体が誘発され、ガ
ッマ線によるＧ２Ａの誘発はｐ５３に依存しないことを示唆する。
【００８８】 Ｇ２ＡがＧ２／Ｍでｐ５３およびａｂｌの非存在下で細胞周期を分裂停止する
能力が独特な経路による信号化を示唆した。Ｇ２Ａ介在Ｇ２／Ｍ阻止に応答する
分子機構を理解するために、我々はＧ２Ａ信号が必須成熟促進因子（ＭＰＦ）成
分Ｃｄｃ２を通るかどうかを決定した。カフェインによる正確な作用方式は未知
であるが、カフェインはＣｄｃ２５を活性化しそしてＣｄｃ２の中でＴｈｒ１４
／Ｔｙｒ１５の脱リン酸化をもたらし、Ｃｄｃ２／サイクリンＢ複合体の活性化
をもたらしそして有糸分裂を完成させることを示唆した。
【００８９】 Ｇ２Ａ−ＧＦＰ融合タンパク質またはＧＦＰを発現するレトロウイルスを感染
させたマウス繊維芽細胞を５ｍＭのカフェインの存在下でインキュベーションし
た。細胞をＦＡＣＳ分析用に一夜のインキュベーション後に回収した。Ｇ２Ａ−
発現細胞はカフェインの非存在下ではＧＦＰ−発現細胞と比べてＧ２／Ｍで高い
パーセンテージを示した。５ｍＭのカフェインを用いる一夜のインキュベーショ
ンはＧ２／Ｍの分裂停止を軽減し、Ｇ２Ａ介在Ｇ２／Ｍ阻止がＣｄｃ２の上流で
あることを示唆する（図１５）。
【００９０】 〔実施例１７〕 ヒトＧ２Ａの染色体局在化 蛍光インシトゥハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）をフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）で刺激された末梢血液リンパ球から製造されたヒト中期細胞を使用して行っ
て遺伝子位置を決定した。Ｇ２Ａプローブは、ラムダＤＡＳＨベクター（Strata
gene）中にＳＡｌｌ部位でクローニングされたヒトゲノム断片であった。ＦＩＳ
ＨはRowley et al. （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:9368-9372, 1990）に
より記載されている通りにして行われた。ビオチンで標識が付けられたプローブ
はニック−翻訳によりＢｉｏ−１６−ｄＵＴＰ（Enzo diagnostics）を用いて製
造された。ハイブリッド形成は蛍光共役アビジン（カリフォルニア州、バーリン
ゲームのVector Laboratories）を用いて検出され、そして染色体は４,６−ジア
ミノ−２−フェニルインドール−ジヒドロクロリド（ＤＡＰｌ）による染色によ
り同定された。ヒトＧ２Ａは染色体１４、バンドｑ３２.３に局在化されている ことが見出された。１４ｑ３２.３における染色体異常が広範囲のヒトの癌に関 連することは示されている。例えば、バンド１４ｑ３２.３および１９ｐ１３.３
のトランジションが複数の骨髄性および血漿細胞白血病の患者で見出された（Ta
niwaki et al., Leukemia and Lymphoma 21:25-30, 1996; Fujino et al., Canc
er Res. 55:3246-3249, 1995）。さらに、欠失地図作成分析は１４ｑ３２におけ
る推定腫瘍サプレッサー因子の損失が卵巣、腹腔、直腸および膀胱癌の発症に含
まれるかもしれないことを強く示唆した（Bandera et al., Cancer Res. 57:513
-515）。１４ｑ３２における染色体異常は例えば癒着性移植神経節腫および被膜
細胞リンパ腫の如き他のヒトの疾病でも報告されている（Bergsagel, Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 93:13931-13936, 1996; Vaandrager et al., Blood 88:1
177-1182, 1996）。Ｇ２Ａが腫瘍遺伝子の形質転換表現型を抑制する能力に基づ
き、Ｇ２Ａはその発現の損失がある種の癌の進行に少なくとも部分的に含まれる
かもしれないような腫瘍サプレッサー因子候補である。
【００９１】 本発明は詳細な記述に記載された態様にのみ限定されないことに注意すべきで
ある。本発明の精神を保有するいずれの態様もその範囲内であると考えるべきで
ある。しかしながら、本発明は添付された請求項によってのみ限定される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、哺乳動物の細胞周期チェックポイントを示すスキーム図
である。
【図２】 図２は、再現的示差分析（RDA）による示差的に発現された遺伝 子の単離を描写するスキーム図である。ｍRNA単離およびｃＤＮＡ合成後に、テ スターおよびドライバーｃＤＮＡを制限酵素（ＲＥ）で消化しそしてアダプター
と連結反応させる。ＰＣＲ増幅後に、アダプターをＲＥ分解により除去しそして
新しいアダプターをテスターＤＮＡ断片だけと連結反応させる。テスターＤＮＡ
を過剰のドライバーＤＮＡとハイブリッド形成させる。示差的に発現された遺伝
子からのＤＮＡ断片は新しいアダプターと両端でホモダイマーを形成しそしてＰ
ＣＲにより指数的に増幅させることができる。両方のドラーバー中に存在する断
片が効率的に増幅した。このプロセスを３−４回繰り返しそして示差的に増幅し
たＤＮＡ断片をさらなる分析用にサブクローニングする。
【図３】 図３は、７つの予想されたトランスメンブラン領域を示すマウス
Ｇ２Ａのスキーム図である。
【図４】 図４は、Ｇ２Ａと他のＧＰＣＲファミリーの構成員との関係を示
すＧＰＣＲ類の系統樹である。
【図５】 図５は、マウスおよびヒトＧ２Ａの配列の整列を示す。ヒトおよ
びマウスＧ２Ａはアミノ酸水準で約７０％の同一性を共有する。
【図６】 図６は、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＥＬ−ＡＢＬおよびｖ−ＡＢＬの種
々の領域を示すスキーム図である。ＳＨ３＝ｓｒｃ相同性領域３；ＳＨ２＝ｓｒ
ｃ相同性領域２；ｐＴｙｒ=ホスホチロシン；自己−ＰＯ4＝自己リン酸化部位；
Ｇｒｂ−２＝ＢＣＲ−ＡＢＬをＲａｓに共役させるアダプタータンパク質；ＭＬ
Ｈ＝タンパク質のオリゴマー化およびＡｂｌキナーゼ活性の活性化に含まれるヘ
リックス・ループ・ヘリックス領域。
【図７】 図７は、ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＧ２Ａ−ＧＦＰまたはＢＣＲ−Ａ
ＢＬおよびＧＦＰ（コントロール）をコードするレトロウイルスベクターで翻訳
された骨髄細胞の成長に対するＧ２Ａの影響を示す。
【図８】 図８は、Ｇ２Ａ−ＧＦＰまたはＧＦＰレトロウイルスベクターで
形質転換されたプレ−Ｂ細胞中のＧ２Ａの対抗選択を示すフローサイトメトリー
プロファィルである。
【図９】 図９は、プロ−Ｂ、プレ−Ｂ、未熟Ｂおよび成熟Ｂ細胞における
Ｇ２Ａの発現を示すフローサイトメトリープロフィルである。
【図１０】 図１０は、Ｇ２Ａが血清除去でＧ２／Ｍ転写において細胞を分
裂停止させることを示す。
【図１１】 図１１は、ユビキチンプロテアゾームインヒビターがＧ２Ａタ
ンパク質水準を増加させることを示す、フローサイトメトリープロフィルである
。
【図１２】 図１２は、ユビキチン経路インヒビターがＧ２ＡによるＧ２／
Ｍトランジション阻止を可能にすることを示す。
【図１３】 図１３は、Ｇ２ＡによるＧ２／Ｍ阻止がＡＢＬに非依存性であ
ることを示す。
【図１４】 図１４は、Ｇ２ＡによるＧ２／Ｍ阻止がｐ５３に非依存性であ
ることを示す。
【図１５】 図１５は、カフェインがＢＳＡによるＧ２／Ｍ阻止を軽減する
ことを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ウィッテ，オーウェン，エヌ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 91403 シャーマン オークス サットン スト リート 1427 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA34 AA35 CB01 CB02 DA12 DA13 DA36 DA78 FB01 FB02 FB03 FB12 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 DA03 EA02 GA11 HA01 4B064 AG20 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA14 4C084 AA13 AA17 BA35 DC50 NA14 ZB262 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA50 EA22 EA28 EA50 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Gタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａをコードする単離されたポ リヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号１または配列番号３に
    示された塩基配列を有するポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 Gタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａをコードする単離されたポ リヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが６５℃において２×ＳＳＣ、０
    .１％ＳＤＳ中で、配列番号１に示された配列を有するポリヌクレオチドの相補 体とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 配列番号２または配列番号４に示されたアミノ酸配列を有す
    る、単離された組換えＧタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａ。
  4. 【請求項４】 配列番号１に示された配列を有するポリヌクレオチドの発現
    により得られる、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する請求項３記載のタ
    ンパク質。
  5. 【請求項５】 配列番号３に示された配列を有するポリヌクレオチドの発現
    により得られる、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有する請求項３記載のタ
    ンパク質。
  6. 【請求項６】 ６５℃において２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で、配列番号 １に示された配列を有するポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズすること
    ができるポリヌクレオチドによりコードされた、単離されたGタンパク質−共役 受容体Ｇ２Ａ。
  7. 【請求項７】 Ｇタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａを試験化合物と接触させ、
    該化合物が該Ｇ２Ａと結合しているかどうかを決定し、そして 受容体活性の刺激が該化合物がＧ２Ａのアクチベーターであることを示すような
    受容体活性検定法において該Ｇ２Ａと結合する化合物を試験する 段階を含む、Ｇタンパク質−共役受容体Ｇ２Ａを活性化する化合物を同定する方
    法。
  8. 【請求項８】 前記Ｇ２Ａが細胞表面上で発現される、請求項７の方法。
  9. 【請求項９】 前記受容体活性検定法が高密度骨髄形質転換検定法である、
    請求項７の方法。
  10. 【請求項１０】 Ｇ２Ａを試験化合物と接触させ、 該化合物が該Ｇ２Ａと結合しているかどうかを決定し、そして 受容体活性の抑制が該化合物がＧ２Ａのインヒビターであることを示すような受
    容体活性検定法において、該Ｇ２Ａと結合している化合物を試験する 段階を含む、Ｇ２Ａを抑制する化合物を同定する方法。
  11. 【請求項１１】 前記Ｇ２Ａが細胞表面上で発現される、請求項１０の方法
    。
  12. 【請求項１２】 前記受容体活性検定法が高密度骨髄形質転換検定法である
    、請求項１０の方法。
  13. 【請求項１３】 前記細胞をＧ２Ａ受容体を活性化させる化合物と接触させ
    ることを含む、細胞中で細胞周期分裂停止を誘発する方法。
  14. 【請求項１４】 前記細胞周期分裂停止が該細胞周期のＧ２／Ｍトランジシ
    ョンで起きる、請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞が白血病細胞またはリンパ腫細胞である、請求項
    １３の方法。
  16. 【請求項１６】 癌細胞がＧ２Ａ転写体を発現するかどうかを決定する段階
    を含む癌細胞の存在を決定する方法であって、対照細胞と比較して増加した水準
    の該転写体の存在が該細胞が癌細胞であることを示す方法。
  17. 【請求項１７】 前記の決定する段階は、ノーザンハイブリダイゼーション
    またはポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 癌細胞がＧ２Ａタンパク質を発現するかどうかを決定する
    段階を含む癌細胞の存在を検出する方法であって、対照細胞と比較して増加した
    水準の該タンパク質の存在が該細胞が癌細胞であることを示す方法。
  19. 【請求項１９】 前記の決定する段階は、前記細胞を前記Ｇ２Ａタンパク質
    に特異的な抗体と接触させ、そして該抗体の存在を検出することを含む、請求項
    １８の方法。
  20. 【請求項２０】 前記の決定する段階が蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を
    含む、請求項１２の方法。
  21. 【請求項２１】 細胞を２０Ｓプロテオゾームのインヒビターと接触させる
    ことを含む、細胞中でＧ２Ａ受容体の分解を抑制する方法。
  22. 【請求項２２】 前記インヒビターがＮ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−
    ロイシニル−Ｌ−ノルロイシナル（ＡＬＬＮ）またはＮ−アセチル−Ｌ−ロイシ
    ニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−メチオナル（ＡＬＬＭ）である、請求項２１の方法
    。
  23. 【請求項２３】 骨髄を白血病発症の抑制を必要とする個体から単離し、 該骨髄をＧ２Ａタンパク質をコードする発現構造体でトランスフェクションまた
    は感染させ、そして 該骨髄を該個体に戻す ことを含む、白血病発症を抑制する必要のある個体において白血病発症を抑制す
    る方法。
  24. 【請求項２４】 前記発現構造体がレトロウイルスベクターまたはアデノウ
    イルスベクターである、請求項１７の方法。
  25. 【請求項２５】 白血病発症抑制用のＧ２Ａタンパク質をコードする発現構
    造体。
JP2000521195A 1997-11-13 1998-11-12 転写的に調節されたｇタンパク質−共役受容体 Withdrawn JP2001523456A (ja)

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