WO2006137435A1 - Gタンパク質共役型受容体g2aの作動薬、及びg2a活性調節薬のスクリーニング方法 - Google Patents

Gタンパク質共役型受容体g2aの作動薬、及びg2a活性調節薬のスクリーニング方法 Download PDF

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Takashi Izumi
Hideru Obinata
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Definitions

  • G protein-coupled receptor G2A agonist and G2A activity modulator screening method G protein-coupled receptor G2A agonist and G2A activity modulator screening method
  • the present invention relates to a G2A agonist containing an oxidized fatty acid such as 9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE).
  • the present invention also relates to a screening method for G2A activity modulators (agonists, antagonists and inverse agonists) using acidic fatty acids such as 9-HODE.
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • Non-patent Document 4 Regarding the function of G2A, deficient (knockout) mice developed autoimmune disease (Non-patent Document 4; Patent Document 1), suggesting an involvement in immune functions. In addition, since it is often expressed in arteriosclerotic lesions (Non-patent Document 5), it is suggested to be involved in arteriosclerosis! In addition, it was reported that it works as a proton sensor (pH sensor) (Non-patent Document 6).
  • G2A is expressed in hematopoietic cells and reported to regulate the growth of hematopoietic cells (Patent Document 2), G2A is expressed in lymphocytes, and stimulates proliferation and genotoxicity. A report that expression is induced and various cell signals are transmitted by affecting the cytoskeleton (Patent Document 3), G2A is highly expressed in human malignant tumors such as prostate cancer, ovarian cancer, lung cancer, breast cancer, colon cancer, etc. In other words, there is a report of ⁇ ⁇ (Patent Document 4).
  • Patent Document 1 US Patent Publication No. 2002/0051980 Specification
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No.99 / 25830
  • Patent Document 3 International Publication No. 01/81918 Pamphlet
  • Patent Document 4 Pamphlet of International Publication No. 02/090925
  • Non-Patent Document 1 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol95: pl2334- 9, 1998
  • Non-Patent Document 2 Science, vol293: p702-5, 2001
  • Non-Patent Document 3 Science, vol307: p206, 2005
  • Non-Patent Document 4 Immunity, voll4: p561-71, 2001
  • Non-Patent Document 5 Arterioscler Thromb Vase Biol, vol22: p2049-53, 2002
  • Non-Patent Document 6 J Biol Chem, vol279: p42484-91, 2004
  • G protein-coupled receptor is a receptor present in the cell membrane, and has a role of transmitting external signals into the cell.
  • GPCR activity modulators agonists, antagonists and inverse agonists
  • Typical examples include cold medicines, stomach medicines, antiemetics, and psychotropic drugs.
  • GPCR is important as a target molecule for drug discovery. Genome analysis is almost complete, and many orphan GP CRs with unknown ligands have been found and ligands are being searched for.
  • an object of the present invention is to provide a novel screening method for a novel G2A agonist and a G2A activity modulator.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, it was found that acid fatty acids such as 9-HODE are ligands of G2A, act as G2A agonists, and that by using these oxidized fatty acids, novel G2A activity regulators can be screened.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a G2A agonist comprising one or more selected from 3-hydroxyoctadecadienoic acid, hydroxyeicosatetraenoic acid and ricinoleic acid.
  • a method for evaluating whether or not a test compound has G2A binding ability comprising 9-hydroxytadecadeienic acid, 9-hydroxyperoxydecadedienoic acid, 13-hydroxyoctadecadienoic acid
  • a method comprising evaluating one or more compounds selected from hydroxyeicosatetraenoic acid and ricinoleic acid as control compounds, and evaluating the G2A binding ability of a test compound.
  • (6) one or more selected from 9-hydroxyoctadecadienoic acid, 9-hydroperoxyoctadecadienoic acid, 13-hydroxyoctadecadienoic acid, hydroxyeicosatetraenoic acid and ricinoleic acid
  • a method for screening a G2A activity modulator comprising evaluating the G2A activity-inhibiting ability or G2A activity-inhibiting ability of a test compound using the compound of No. 1 as a control compound.
  • a method for evaluating whether a test compound has G2A activity or ability to inhibit G2A activity which comprises 9-hydroxyoctadecadienoic acid, 9-hydroperoxyoctadeca Dienoic acid, 13-hydroxyoctadecadienoic acid, hydroxyeicosatetraenoic acid and ricinoleic acid power Using one or more selected compounds as control compounds
  • FIG. 1 is a graph showing an increase in intracellular calcium concentration when 9 (S) -HODE is added.
  • CHO-G 2A cells ⁇
  • CHO—G2A—Gqi fist
  • CHO—Gqi mouth
  • Fura—2 and 9 (S) Intracellular calcium concentration was measured using FLEXstation with HODE.
  • the data showed the mean value standard deviation of 4 independent experiments.
  • the parental CHO-K1 cells ( ⁇ ) were also measured.
  • FIG. 2 is a graph showing the ligand specificity of G2A.
  • CHO-Gqi ( ⁇ ) and CHO-G2A-Gqi ( ⁇ ) were each added with 1M each of linoleic acid or acid derivatives of arachidonic acid, and the increase in intracellular calcium concentration was measured using a FLEXstation . The data showed the mean standard deviation of 4 independent experiments.
  • the structure of 9-HODE and 11-HETE is shown in Katsuko. * Indicates that p ⁇ 0.01 (Student's t test) compared to CHO-G qi.
  • FIG. 3 is a diagram showing 9 (S) -HODE-dependent [ 35 S] GTP ⁇ S binding to membrane fractions of G2A-expressing cells.
  • A CHO-K1 cells and CHO-G2A stably expressing cells
  • HEK293 cells transiently expressing G2A and Z or Gi
  • B total binding
  • 20 ⁇ m of the membrane fraction was reduced to 0.5 ⁇ [ 35 S] GTP y S and 9 (S) -HODE and 30 Incubated at ° C for 30 minutes.
  • the specific binding amount was calculated by subtracting the non-specific binding amount from the total binding amount.
  • the data showed the mean value standard deviation of four independent experiments.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of linoleic acid-added potassium on CHO-K1 cells expressing G2A.
  • C HO-K1 ( ⁇ ) and CHO-G2A ( ⁇ ) cells are supplemented with Fura-2, and 1 ⁇ M 9 (S) -HODE, 10 M ricinoleic acid, or 100 / z M ATP is added.
  • Intracellular calcium concentration was measured by FLEXstation.
  • FIG. 5 is a diagram (photograph) showing the effect of G2A overexpression or suppression of G2A expression on foam buds in J774 cells.
  • Mouse macrophage-derived J774 cells were seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 and cultured. Cells were supplemented with lentiviral supernatant containing pLenti6-mG2A or pBlock-iT-mG2A. After 48 hours of incubation, cells were incubated with 50 ⁇ g / ml LDL or acid in medium containing 5% urine fetal serum in the presence or absence of 10 M 9 (S) -HODE. Treated with modified LDL (OxLDL) for 24 hours. Subsequently, the cells were fixed with 4% formaldehyde in PBS ( ⁇ ), and fat droplets accumulated in the cells were stained with On-Red 0.
  • S 10 M 9
  • FIG. 6 is a diagram (photograph) showing the expression of G2A in human skin.
  • A shows the result of fluorescent staining using anti-G2A antibody. Sections from the shoulder skin were incubated with control rabbit IgG or anti-G2A antibody, then with fluorescently labeled anti-rabbit IgG and observed with a fluorescence microscope. The magnification is 400 times and the bar is 20 m.
  • B shows the detection results of mRNA in human cultured keratinocytes NHEK. G2A mRNA was detected by PCR with or without RT
  • the pCXN2.1-G2A vector was used as a positive control.
  • FIG. 7 shows intracellular calcium mobilization induced by 9 (S) -HODE in NHEK cells.
  • Fura-2 / ⁇ was added to the cells, stimulated with 9 (S) -HODE, and analyzed using an RF5300PC spectrofluorometer.
  • FIG. 8 is a diagram showing the secretion of cytoforce-in induced by 9 (S) -HODE in NHEK cells. After incubating NHEK cells with 9 (S) -HODE for 0-24 hours, the culture supernatant was collected, and the concentration of cytodynamic in was measured using Bio-Hex ELISA system.
  • A IL-6;
  • B IL-8;
  • G2A is a G protein-coupled receptor (GPCR) that is mainly expressed in lymphocytes and macrophages and is induced by various DNA damage stimuli, and cell cycle is stopped at G2 phase. It is a receptor that has been reported to cause
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • SEQ ID NOs: 2 and 4 The amino acid sequences of human and mouse G2A are shown in SEQ ID NOs: 2 and 4, respectively, and the nucleotide sequences of the genes encoding them are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively.
  • the G2A used in the evaluation of the G2A agonist of the present invention and the screening method of the present invention is not limited to those of the above sequence, and 9-HODE, As long as it has the property of increasing intracellular calcium concentration in response to ligands such as 13-HODE, HETE, and ricinoleic acid, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the above sequence. It may also be a protein having an amino acid sequence. Here, the number is preferably 2 to 50, more preferably Or 2 to 20, particularly preferably 2 to 10.
  • G2A activity modulators include G2A agonists, G2A antagonists and G2A inverse agonists.
  • Inverse agonists refer to substances that attenuate constitutive receptor activity that is not affected by endogenous ligands.
  • an inverse agonist that suppresses the activity of a mutant receptor is beneficial for these diseases if the G2A mutation always activates the receptor signal without stimulating the endogenous ligand, causing abnormal biological function. Can be expected.
  • the G2A agonists of the present invention include 9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), 9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HPODE), 13-hydroxyoctadedeciedienoic acid (13-H ODE), hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE) (specially [5, 8, 9, 11, 12, 15th position! /, HETE having either hydroxyl group], and ricinoleic acid power) Contains one or more oxidized fatty acids. These acid fatty acids are sometimes called G2A ligands.
  • 9-HODE is octadecadienoic acid in which the 9th carbon is hydroxylated (shown in Figure 2), and 13-HODE is octadecadienoic acid in which the 13th carbon is hydroxylated.
  • 9-HOODE is octadecadienoic acid in which the carbon at the 9-position is peracid-hydrated.
  • HETE is eicosatetraenic acid in which carbons such as 5, 8, 9, 11, 12, and 15 are hydroxylated.
  • Figure 2 shows the structure of 11-HETE.
  • Ricinoleic acid is an oxidized fatty acid having the structure of the following formula (I), and is abundant in plant-derived castor oil. In animals, the glycerol skeleton of castor oil is released by various lipases.
  • the oxidized fatty acids such as 9-HODE, 13-HODE and HETE have (S) and (R) optical isomers, but the oxidized fatty acids contained in the G2A agonist of the present invention are ( S) form, (R) form, or a mixture of both.
  • Acid fatty acids such as 9-HODE bind to G2A and activate G2A to transmit signals such as an increase in intracellular calcium concentration. As a result, it exhibits various medicinal effects. For example, the following medicinal effects are mentioned.
  • G2A is induced by various growth stimuli and DNA damage stimuli, and is known to arrest the cell cycle in the G2 phase.
  • G2A is expressed in hematopoietic cells and reported to regulate the proliferation of hematopoietic cells (WO 99/25830). It is expressed in lymphocytes and is induced by proliferation or genotoxic stimuli.
  • the G2A agonist of the present invention can be used as an anticancer agent against various cancers such as lymphoma and leukemia.
  • G2A-deficient mice developed autoimmune disease (Immunity, 14: 561-71, 2001; US 2002/0051980), suggesting that G2A is involved in immune functions. .
  • G2A ligand induces the production of inflammatory site force-in in peripheral tissues such as skin.
  • G2A activity modulators are used as therapeutic agents for immune diseases and inflammatory diseases.
  • immune diseases include rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases
  • examples of inflammatory diseases include psoriasis, sun dermatitis (sunburn), inflammatory bowel disease, and hepatitis.
  • the liver Since the liver is a central organ for lipid metabolism, it is exposed to stress from oxidized fat in the state of intake of oxidized fat from the diet, viral hepatitis, fatty liver, drug metabolism disorder, hyperlipidemia, and so on. Therefore, G2A activity modulators are used as therapeutic agents for liver diseases such as viral hepatitis, drug-induced hepatitis, alcoholic hepatitis, fatty liver and cirrhosis.
  • the G2A agonist of the present invention is also useful as an immunosuppressant used for bone marrow transplantation.
  • G2A is expressed abundantly in arteriosclerotic lesions! / (Arterioscler Thromb Vase Biol, 22: 2049-53, 2002), which strongly suggests that G2A is involved in arteriosclerosis.
  • the G2A gene was forcibly expressed in J774 cells, which are macrophages, the effect of accumulating G2A was further increased.
  • Drugs for adult diseases such as anti-obesity drugs and diabetes drugs Therefore, it is considered useful.
  • G2A agonists containing oxidized fatty acids such as 9-HODE and G2A activity modulators obtained by screening methods described below (hereinafter sometimes referred to as G2A activity modulators) It can be used as a medicament for treating or preventing the above-mentioned diseases as it is or in combination with a pharmaceutically acceptable pharmaceutical carrier.
  • the acid fatty acid such as 9-HODE can be converted to a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salts include salts of metals such as sodium and potassium.
  • the pharmaceutical preparation form of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose of treatment. Specifically, tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules Examples include suppositories, syrups, suppositories, injections, ointments, patches, eye drops, and nasal drops.
  • suppositories syrups, suppositories, injections, ointments, patches, eye drops, and nasal drops.
  • excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, solvents for injections, etc. that are commonly used in pharmaceuticals as pharmaceutical carriers Additives can be used.
  • a G2A activity modulator and other drugs may be used in combination.
  • the G2A activity modulator of the present invention may be contained in food.
  • food is not particularly limited, edible oils, seasonings, processed foods and the like are exemplified.
  • Foods can be produced by mixing G2A activity regulators with ingredients that are usually used in foods.
  • the amount of the G2A agonist contained in the food of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected.
  • the amount of the G2A activity regulator is 0.1 to 50% by mass, preferably 1 in the food. It should be ⁇ 10% by mass.
  • the food of the present invention may be a health food or a food for specified health that has a preventive or therapeutic effect on the above-mentioned diseases.
  • the food of the present invention may be sold with a label such as “a food containing an ingredient having an effect such as an anticancer action, an anti-inflammatory action, an immunosuppressive action, an anti-arteriosclerosis, or a liver protecting action”. it can.
  • the screening method of the present invention comprises 9-hydroxyoctadecadienoic acid, 9-hydroperoxyoctadecadienoic acid, 13-hydroxyoctadecadienoic acid, hydroxyeicosatetraenoic acid and ricinoleic acid. It is characterized by using more than seeds A screening method for G2A activity modulators.
  • Examples of the screening system using G2A include a system that screens for a compound that binds to G2A and a system that screens for a compound that promotes or inhibits the activity of G2A.
  • 9-HODE which can bind to G2A protein
  • 9-HODE is labeled with a radioisotope as a control compound, and the labeled control compound and G2A protein are mixed in advance and tested
  • a method of adding a compound and selecting a compound capable of binding to the G2A protein by competing with a control compound from test compounds can be mentioned.
  • a test compound is added to and reacted with a solution containing a G2A protein and a labeled control compound bound thereto, and the dissociated control compound and free test substance are removed by washing, and then the G2A protein is converted into a G2A protein. It is possible to determine whether the test substance binds to the G2A protein by measuring the residual radiation dose. That is, when the labeled control compound dissociates from the G2A protein due to competition with the test substance and the radiation dose decreases, it can be determined that the test compound binds to the G2A protein.
  • 9-HODE, 13-HODE, ricinoleic acid, HETE, etc. which have been clearly shown to bind to G2A protein in the present invention, are used.
  • the compounds that bind to G2A obtained by screening are thought to include G2A agonists, antagonists, and even inverse agonists. Therefore, the ability to increase intracellular calcium concentration is examined as described below. It is possible to determine which of these is true.
  • the G2A protein used in this screening system may be a protein produced by gene recombination, or may be a purified product such as a cell. Further, it may be chemically synthesized. Sarako, a partial protein containing the ligand binding site of the G2A protein.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 is linked to an appropriate vector and introduced into a host such as Escherichia coli or animal cells to produce the protein. Can be expressed and purified according to conventional methods.
  • the DNA used in this case encodes a protein that can increase intracellular calcium concentration in response to a ligand such as 9-H ODE, the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 And stringers Even DNA that hybridizes under normal conditions!
  • stringent conditions in the case of column f, at a salt concentration corresponding to 60 ° C, 1 X SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 X SSC, 0.1% SDS, The condition of washing once or more preferably 2-3 times is mentioned.
  • Examples of vectors for genetic recombination in E. coli include pET vectors (Novagen) and pGEX vectors (Amersham Pharmacia). Vectors for gene recombination in animal cells include pcDNA vectors. (Invitrogen).
  • a compound that activates G2A or a compound that inhibits the activity of G2A in a cell line may be screened.
  • the activity of G2A refers to the function of G2A in vivo, such as increasing intracellular calcium concentration in response to ligand.
  • the intracellular cAMP concentration may be used as an index. For example, it can be examined by introducing a gene encoding G2A into a cell such as CHO or HEK293 to express G2A protein, and measuring the change in intracellular calcium concentration when a test substance is added to the cell. it can.
  • G2A ligand such as 9-HODE
  • a substance (G2A agonist) that activates G2A to the same extent or higher than these ligands may be screened, and the G2A ligand and test substance may be screened.
  • a substance (G2A antagonist) that inhibits G2A activity by G2A ligand may be screened.
  • the calcium concentration can be measured by a conventional method, and for example, it can be measured using Fura-2 (Dojinshi).
  • the cAMP concentration can be measured using, for example, an AlphaScreen cAMP assay kit (PerkinElmer).
  • the compound to be screened is not particularly limited, and may be, for example, a low-molecular synthetic compound or a compound contained in a natural product. Moreover, a peptide may be sufficient.
  • For screening use individual test substances, or use a compound library containing these substances.
  • the above method is also used to evaluate the G2A binding ability, G2A activity ability, and G2A activity ability inhibition ability of individual compounds in addition to screening for searching for G2A agonists or antagonists. Can be used.
  • the G2A agonist obtained by the screening method of the present invention can be used for cancer and immunology as described above. It can be used as a therapeutic or prophylactic agent for epidemiological diseases, inflammatory diseases, arteriosclerosis, liver diseases and the like.
  • the G2A antagonist obtained by the screening method of the present invention can be used as a therapeutic or prophylactic for many diseases and pathologies that involve oxidative stress. That is, the epithelial cells of the skin stop cell proliferation in response to oxidized fatty acids such as 9-HODE, which expresses G2A, and release various cytodynamic ins.
  • the skin is in contact with the outside air and is always exposed to certain oxidative stress. In particular, sunburn (UV exposure) increases its acid stress. At this time, acid fatty acids are thought to be produced in the skin.
  • G2A antagonists are thought to be useful as therapeutic agents for diseases associated with oxidative stress, such as various inflammations, tumors, arteriosclerosis, smoking, autoimmune diseases, glucoseuria, and liver diseases. In addition, it can be applied to burn medicines, sun creams and the like.
  • G2A activity modulators are therapeutic agents for UV irradiation, radiation irradiation, particle irradiation, radiation therapy and It is also considered useful as an agent that enhances the action of heavy ion radiotherapy and a protective agent for healthy tissues.
  • HODE Various HODE, HPODE, HETE and cholestery® 9-HODE were purchased from Cayman Chemical. Linoleic acid, arachidonic acid, 1-palmitoyl lysophosphatidylcholine, and 1-palmitoyl-2-linoleoylphosphatidylcholine were purchased from Sigma. [3 3 ⁇ 4] GT ⁇ ⁇ S was purchased from Perkin Elmer Corporation.
  • 5-lipoxygenase was also purified from tubers of potato according to the method described in Proc Natl Acad Sci USA 81, 689-693 (1984). Linolenolic acid was oxidized with 5-lipoxygenase in reaction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 mM diethylenetriaminepentaacetic acid), and then reduced with NaBH. The product is purified by silica column chromatography Separated from unreacted substrate. LC-MS analysis confirmed that the product contained more than 95% 9 (S) -HODE.
  • a gene encoding human G2A with a FLAG epitope added to the N-terminus was amplified by Pyrobest (Takara Bio) using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6.
  • the PCR product was digested with Bam HI and EoRI and inserted into the mammalian cell expression vector pCXN2.1 (Gene, voll08: pl93-200, 1991).
  • the resulting plasmid was named pCXN2.1-G2A.
  • CHO cells Chinese nomstar ovary cells
  • HEK293 cells human embryonic kidney cells 293 cells
  • Ham's F-12 medium Sigma
  • Dulbecco Dulbecco
  • In Eagle's medium Sigma
  • the cells were transfected with each plasmid DNA using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen).
  • PCXN2.1-G2A was transfected into CHO cells using Lipofectamine 2000. Select a clone of 1 mg / ml Geneticin (Invitrogen) and express the expression level of the G2A gene. Bells were confirmed by RT-PCR and flow cytometry.
  • G2A high-expressing clones (CHO-G2A cells) were further transfected with pcDNA3.1 / Gqi, and stable clones resistant to 1 mg / ml Zeocin (Invitrogen) were selected. The expression of Gqi was confirmed by RT-PCR, and CHO-G2A-Gqi cells were obtained. We also obtained CH 0 cells that stably express Gqi (CHO- Gqi cells) 0
  • Hepes- Tyrode's -BSA buffer 25 mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.0 mM CaCl 2, 12 mM NaHCO) containing 1.25 mM probenecid and 0.02% pluronic F127 (BASF) , 5.6 mM D—glucose, 0.37 mM NaH PO, 0.49 mM MgCl,
  • CHO cells were supplemented with 5 ⁇ M Fura-2 AM (Dojin) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing the cells with Hepes-Tyrode's—BSA buffer, change the intracellular calcium concentration using a ligand ⁇ [J Seki, scanning fluorometer system (FLEXstation, Molecular Devices) or RF5300PC spectrofluorometer (Shimazu)]. Was measured.
  • CHO cells in homogenization buffer (20 mM Tris-HC1, pH 7.4, 0.25 M sucrose, 10 mM MgCl, 1 mM EDTA, and Complete protease inhibitor cocktail (Roche))
  • the culture was carried out using Hu Media-KB2 (Kurabo, basal medium) supplemented with NHEK Kuraboi growth supplements (Kurabo, growth medium).
  • a frozen section (6 m thick) of human skin was blocked with 10% BSA for 30 minutes at room temperature, and diluted with primary antibody diluted to 1.7 g / ml with 1% BSA / PBS at 4 ° C. Incubated.
  • primary antibody anti-human G2A antibody (Lifespan) or rabbit IgG (Santa-cruz) was used.
  • the cells were then incubated for 1 hour at room temperature with a secondary antibody (goat anti-rabbit IgG conjugated with Alexa Fluor 488 (Molecular Probes)) diluted to 2 ⁇ g / ml with 1% BSA / PBS, and fluorescence microscopy (Axio skop; Zeiss).
  • RT-PCR consists of QIAquick one step RT-PCR kit (Qiagen), sense primer (5, -GGCTTTGCCATCCCTCTC-3 ,: SEQ ID NO: 7) and antisense primer (5, -GACAGGCACAGAAACACC-3 ,: SEQ ID NO: 8). Used.
  • Hepes Tyrode 's— BSA buffer containing 0.02% pluronic F127 (25 mM Hepes—NaOH, pH 7.4; 140 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 1.0 mM CaCl; 12 mM NaHCO; 5.6 mM D—gl
  • NHEK cells were added with 2.5 ⁇ MFura-2 / ⁇ (Dojin) and incubated at 37 ° C for 1 hour. Cells were washed with Hepes-Tyrode's-BSA buffer, and changes in intracellular calcium concentration when stimulated with 9 (S) -HODE were measured using an RF5300PC spectrofluorometer (Shimazu).
  • G2A was thought to be a G protein coupled receptor. Therefore, the Gqi chimeric protein in which the C-terminal 9 peptide of mouse Gq protein was replaced with the corresponding peptide of mouse Gi protein was evaluated using cells co-expressed with G2A. As shown in Fig. 1, the clone expressing both G2A and Gqi (CHO-G2A_Gqi) showed high reactivity to 9 (S) _HODE. On the other hand, CHO cells expressing only Gqi (CHO-Gqi) did not respond to 9 (S) -HODE.
  • 9 (S) -HODE and 11-HETE strength CHO-G2A-Gqi cells showed the strongest intracellular calcium mobilization activity.
  • the structures of these two types of lipids are shown in FIG. 2A.
  • 9 (S) _Hydroperoctadecadienoic acid (9 (S) -HPODE) has the same activity as 9 (S) -HODE 3 (S) -HODE and 13 (S) -HPODE The activity of was weak.
  • control vectors or pCXN2.1-G2A and pcDNA3.1 / Gi were transiently expressed in HEK293 cells and examined. 24 hours after transfection, membrane fractions were prepared and examined for GTP ⁇ S binding. 9 (S) -HODE-dependent [ 35 S] GTP y S binding was not observed in the membrane fraction of cells transfected with G2A alone (data not shown;). As shown in Figure 3B, 9 (S) -HODE-dependent GTP y S binding was seen when Gi was co-expressed with G2A. On the other hand, 9 (S) -HODE-dependent [ 35 S] GTP y S binding was not observed when only Gi was transfected.
  • Ricinoleic acid was added to CHO-G2A cells, and the intracellular calcium concentration was examined (Fig. 4). As a result, ricinoleic acid was found to cause intracellular calcium mobilization in cells that expressed G2A to the same extent as 9 (S) -HODE. On the other hand, parental CHO-K1 cells did not react with 9 (S) -HODE (1 M) or ricinoleic acid (10 M). ATP is a positive control that causes intracellular calcium mobilization in many cells.
  • RNAi RNA interference
  • Forced expression was performed using a lentiviral expression vector pLenti6 (Invitrogen).
  • expression suppression was performed using a vector for RNAi, pBlock-iT (Invitrogen).
  • RNAi When RNAi was used to suppress G2A expression, very intense foam was observed under all conditions (Fig. 5c, f, i, l) o The effect of oxidized LDL was particularly pronounced (Fig. 5f). 1). The molecular mechanism of these phenomena is unknown. G2A and its ligand, 9-HODE force, may be deeply involved in the pathogenesis of arteriosclerosis. In addition, G2A activity modulators may prove useful as therapeutic agents for arteriosclerosis!
  • monitoring the expression of G2A and the production of oxidized fatty acids such as 9-HODE may be useful for the diagnosis of arteriosclerosis and the determination of therapeutic effects.
  • G2A The expression of G2A in human skin was examined by immunohistochemical staining (Fig. 6A). G2A was less prominent in the epithelium, especially in the basal layer, which is more common in squamous cells and granular layers.
  • the expression of G2A in cultured human keratinocyte NHEK cells was examined by RT-PCR (Fig. 6B). According to this, expression of G2A was also observed in NHEK cells.
  • 9 (S) _HODE also induced intracellular calcium mobilization in NHEK cells expressing endogenous G2A.
  • the reaction with 3 M 9 (S) -HODE became remarkable by the addition of weak force 10 / z M WS HODE.
  • no reaction was induced even when 15 ⁇ M 9 (S) -H ODE was continuously added. This was probably due to receptor desensitization, since cells still reacted with ATP.
  • the G2A agonist of the present invention can be used as an active ingredient of a medicine or food having a therapeutic effect or a preventive effect on diseases such as cancer, immune diseases, inflammatory diseases, arteriosclerosis, and liver diseases. Further, according to the screening method of the present invention, a novel G2A activity modulator can be obtained.

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Abstract

　９－ヒドロキシオクタデカジエン酸、９－ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸、１３－ヒドロキシオクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラエン酸及びリシノール酸から選ばれる１種又は２種以上の酸化脂肪酸をG2A作動薬として用いる。また、これらの酸化脂肪酸をコントロールとして用いて、新規G2A作動薬、逆作動薬又は拮抗薬をスクリーニングする。

Description

明 細 書
Gタンパク質共役型受容体 G2Aの作動薬、及び G2A活性調節薬のスクリ 一二ング方法
技術分野
[0001] 本発明は、 9-ヒドロキシォクタデカジエン酸 (9-HODE)などの酸化脂肪酸を含有す る G2A作動薬に関する。本発明は、また、 9-HODEなどの酸ィ匕脂肪酸を用いた G2A 活性調節薬 (作動薬、拮抗薬および逆作動薬)のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 1998年に、リンパ球に発現している Gタンパク質共役型受容体 (GPCR)の 1つが報告 され、各種 DNA損傷刺激によって誘導され、細胞周期が G2期で停止するという性格 力 G2A (G2 accumulation)と名付けられた。この時点では、 G2Aはリガンドが不明な ォーファン受容体 (孤児受容体)であった (非特許文献 1)。その後、そのリガンドがリゾ リン脂質（リゾホスファチジルコリン（LPC)およびスフインゴシルホスホリルコリン (SPC)) であるとの報告がなされ、炎症、免疫疾患、動脈硬化との関連が指摘された (非特許 文献 2)。し力しながら、放射リガンドの結合実験が再現できないことから、その後、こ の論文は取り下げられたため（非特許文献 3)、依然としてリガンドは不明な状況にあ つた o
[0003] G2Aの機能に関しては、欠損（ノックアウト）マウスが自己免疫疾患を発病したことか ら (非特許文献 4 ;特許文献 1)、免疫機能への関与が示唆されている。また、動脈硬 化巣で多く発現して ヽることから (非特許文献 5)、動脈硬化への関与も示唆されて!ヽ る。その他、プロトンセンサー (pHセンサー）として働くとの報告 (非特許文献 6)もなさ れた。
さらに、 G2Aは造血細胞に発現しており、造血細胞の増殖を制御するという報告 (特 許文献 2)、 G2Aはリンパ球に発現しており、増殖刺激や遺伝子傷害性の刺激によつ て発現誘導され、細胞骨格に影響を及ぼすことによって様々な細胞シグナルを伝え るという報告 (特許文献 3)、 G2Aが前立腺癌、卵巣癌、肺癌、乳腺癌、大腸癌などの ヒト悪性腫瘍に多く発現して ヽると ヽぅ報告などがある (特許文献 4)。 特許文献 1：米国特許公開第 2002/0051980号明細書
特許文献 2 :国際公開第 99/25830号パンフレット
特許文献 3 :国際公開第 01/81918号パンフレット
特許文献 4:国際公開第 02/090925号パンフレット
非特許文献 1 : Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol95:pl2334- 9, 1998
非特許文献 2 : Science, vol293:p702-5, 2001
非特許文献 3 : Science, vol307:p206, 2005
非特許文献 4: Immunity, voll4:p561- 71, 2001
非特許文献 5 :Arterioscler Thromb Vase Biol, vol22:p2049- 53, 2002
非特許文献 6 : J Biol Chem, vol279: p42484- 91, 2004
発明の開示
[0004] Gタンパク質共役型受容体 (GPCR)は細胞膜に存在する受容体で、外界のシグナル を細胞内に伝える役割を持っている。 GPCRの活性調節薬 (作動薬、拮抗薬および 逆作動薬）は治療薬として幅広く使用されており、現在全世界で使われている薬の売 上高トップ 20のうち 8個が GPCRをターゲットとしているとの報告がある。代表的なもの に、感冒薬、胃薬、制吐剤、向精神薬などがある。このように、 GPCRは創薬の標的分 子として重要である。ゲノムの解析がほぼ終了し、リガンド不明の多くのォーファン GP CRが見つかり、リガンド探しが行われている。このような状況の中で、著明な生物活 性を持つ GPCRである G2Aのリガンドを同定し、その生物学的意義を解析することは、 新たな診断法、治療法、治療薬の開発に結びつく可能性がある。すなわち、本発明 は新規 G2A作動薬、並びに G2A活性調節薬の新規スクリーニング方法を提供するこ とを課題とする。
[0005] 本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、 9-HODEなどの 酸ィ匕脂肪酸が G2Aのリガンドであり、 G2A作動薬として働くこと、及びこれらの酸化脂 肪酸を用いることにより、新規な G2A活性調節薬をスクリーニングできることを見出し て本発明を完成するに至った。
[0006] すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 1 3—ヒドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸か ら選ばれる 1種又は 2種以上を含む、 G2A作動薬。
(2) (1)の G2A作動薬を含む、医薬。
(3) (1)の G2A作動薬を含む、食品。
(4) 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 1 3—ヒドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸か ら選ばれる 1種以上の化合物を用いて被検化合物の G2A結合能を評価することを特 徴とする、 G2A活性調節薬のスクリーニング方法。
(5)被検化合物が G2A結合能を有するかどうかを評価する方法であって、 9—ヒドロ キシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 13—ヒドロキシォ クタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸力 選ばれる 1種 以上の化合物を対照化合物として用いて、被検化合物の G2A結合能を評価すること を特徴とする方法。
(6) 9—ヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 1 3—ヒドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸か ら選ばれる 1種以上の化合物を対照化合物として用いて、被検化合物の G2A活性ィ匕 能、または G2A活性ィ匕阻害能を評価することを特徴とする、 G2A活性調節薬のスクリ 一ユング方法。
(7)被検化合物が G2A活性ィ匕能を有するか、または G2A活性ィ匕阻害能を有するか どうかを評価する方法であって、 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォ キシォクタデカジエン酸、 13—ヒドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテト ラエン酸及びリシノール酸力 選ばれる 1種以上の化合物を対照化合物として用いて
、被検化合物の G2A活性ィ匕能または G2A活性ィ匕阻害能を評価することを特徴とする 方法。 図面の簡単な説明
[図 l]9(S)-HODEを添カ卩したときの細胞内カルシウム濃度の増加を示す図。 CHO-G 2A細胞（♦), CHO— G2A— Gqi (拳）、 CHO— Gqi (口）に Fura— 2を添カロし、さらに、 9(S)— HODEをカ卩えて細胞内カルシウム濃度を FLEXstationを用いて測定した。データは 4 回の独立した実験の平均値士標準偏差を示した。親株の CHO-K1細胞 (〇）につ いても測定した。
[図 2]G2Aのリガンド特異性を示す図。（A) CHO-Gqi (□)及び CHO- G2A- Gqi (■) に、リノール酸又はァラキドン酸の酸ィ匕誘導体各 1 Mを添加し、 細胞内カルシウム 濃度の増加を FLEXstationを用いて測定した。データは 4回の独立した実験の平均値 士標準偏差を示した。カツコ内に 9-HODEと 11-HETEの構造を示す。 *は CHO-G qiと比較して、 p < 0.01 (Student' s t test)であったことを示す。（B) CHO- G2A- Gqi 細胞を 9(S)-HODE (參）及び 9(R)-HODE (〇） HODEで処理し、 細胞内カルシウム 濃度の増加を FLEXstationを用いて測定した。データは 4回の独立した実験の平均値 士標準偏差を示した。 *は 9(R)- HODEと比較して p < 0.01 (Student ' s t test)であ つたことを示す。
[図 3]G2A発現細胞の膜画分への 9(S)-HODE依存性の [35S]GTP γ Sの結合を示す図 。 CHO- K1細胞及び CHO- G2A安定発現細胞 (A),あるいは G2A及び Z又は Giを一 過性に発現させた HEK293細胞（B)力も膜画分を調製し、結合バッファ一中、 20 μ Μの非ラベル GTP y Sの存在下 (非特異的結合)又は非存在下 (総結合)、 20 μ の 膜画分を 0.5 ηΜの [35S]GTP y S及び 9(S)- HODEと 30°Cで 30分インキュベートした 。特異的結合量は前記総結合量から非特異的結合量を減ずることで算出した。デー タは 4回の独立した実験の平均値士標準偏差を示した。
[図 4]G2Aを発現させた CHO- K1細胞における、リノール酸添カ卩の影響を示す図。 C HO-K1 (〇）及び CHO- G2A (參）細胞に Fura- 2を添カロし，さらに 1 μ M 9(S)- HODE, 10 Mリシノール酸，又は 100 /z M ATPを加えて、細胞内カルシウム濃度を FLEXs tationによって測定した。
[図 5]J774細胞における G2A過剰発現又は G2A発現抑制の泡沫ィ匕への影響を示す 図（写真）。マウスマクロファージ由来 J774細胞を 24 wellプレートに 5X104で撒き、 ー晚培養した。細胞に pLenti6— mG2Aを含むレンチウィルス上清または pBlock-iT- mG2Aを添カ卩した。 48時間インキュベートした後、 10 Mの 9(S)-HODEの存在下また は非存在下で、 5%ゥシ胎児血清を含む培地中で、細胞を 50 μ g/mlの LDL又は酸 化 LDL (OxLDL)で 24時間処理した。ついで、 PBS (-)中、細胞を 4%ホルムアルデヒド で固定ィ匕し、細胞内に蓄積した脂肪滴を On-Red 0で染色した。
[図 6]ヒト皮膚における G2Aの発現を示す図（写真)。 (A)抗 G2A抗体を用いた蛍光染 色の結果を示す。肩の皮膚由来の切片をコントロールのゥサギ IgGまたは抗 G2A抗体 とインキュベートし、次いで、蛍光標識抗ゥサギ IgGとインキュベートし、蛍光顕微鏡で 観察した。倍率は 400倍でバーは 20 mを示す。 (B)ヒト培養ケラチノサイト NHEKに おける mRNAの検出結果を示す。 G2Aの mRNAを RT有りまたは無しの PCRで検出した
。 pCXN2.1-G2Aベクターをポジティブコントロールとして用いた。
[図 7]NHEK細胞における、 9(S)- HODEによって惹起される細胞内カルシウム動員を 示す。細胞に Fura-2/ΑΜを添加し、 9(S)-HODEで刺激し、 RF5300PCスぺクトロフル ォロメーターを用いて解析した。
[図 8]NHEK細胞における、 9(S)-HODEによって惹起されるサイト力インの分泌を示す 図。 NHEK細胞を 9(S)- HODEで 0〜24時間インキュベートした後、培養上清を回収し 、サイト力インの濃度を Bio- Hex ELISA systemを用いて測定した。（A) IL- 6; (B) IL- 8; (C) GM-CSF0データは平均値士 SD (n = 3)であり、 *は、コントロールに対して p < 0.05 (Student' s t- test)であることを示す。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明において、 G2Aとは、リンパ球やマクロファージなどに主に発現している Gタ ンパク質共役型受容体 (GPCR)であり、各種 DNA損傷刺激によって誘導され、細胞周 期を G2期で停止させると報告された受容体である。ヒト及びマウスの G2Aのアミノ酸配 列をそれぞれ配列番号 2, 4に、それらをコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配 列番号 1, 3に示す。なお、 G2Aのアミノ酸配列は種の違いなどによって異なるため、 本発明の G2A作動薬の評価や、本発明のスクリーニング法に用いる G2Aは、上記配 列のものには限定されず、 9-HODE、 13-HODE、 HETE、リシノール酸などのリガンド に応答して細胞内カルシウム濃度を上昇させる性質を有するものである限り、上記配 列において 1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配 列を有するタンパク質であってもよい。ここで、数個とは、好ましくは 2〜50個、より好ま しくは、 2〜20個、特に好ましくは 2〜10個である。
G2A活性調節薬は、 G2A作動薬、 G2A拮抗薬および G2A逆作動薬を含む。なお、 逆作動薬とは内因性リガンドゃ薬物の影響を受けない構成的受容体活性を減弱させ る物質をいう。例えば、 G2Aの突然変異により内因性リガンドの刺激がなくとも常に受 容体シグナルが活性化され、生体機能異常を引き起こすような場合，変異受容体の 活性を抑える逆作動薬は，これらの病気に有益な効果が期待できる。
本発明の G2A作動薬は、 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸（9- HODE)、 9ーヒドロべ ルォキシォクタデカジエン酸（9- HPODE)、 13—ヒドロキシォクタデカジエン酸（13-H ODE)、ヒドロキシエイコサテトラェン酸（HETE) (特【こ 5、 8、 9、 11、 12, 15位の!/、ず れかに水酸基を有する HETE)、及びリシノール酸力 なる群より選ばれる 1または 2以 上の酸化脂肪酸を含む。なお、これらの酸ィ匕脂肪酸を G2Aリガンドと呼ぶこともある。
9-HODEは、 9位の炭素が水酸ィ匕されたォクタデカジエン酸であり（図 2に構造を示 した）、 13-HODEは、 13位の炭素が水酸化されたォクタデカジエン酸である。また、 9 - HOODEは、 9位の炭素が過酸ィ匕水酸ィ匕されたォクタデカジエン酸である。
HETEは、 5、 8、 9、 11、 12, 15位などの炭素が水酸化されたエイコサテトラェン酸 である。 11- HETEの構造を図 2に示した。
リシノール酸は、下記式 (I)の構造を有する酸化脂肪酸であり、植物由来のヒマシ油 に多く含まれ、動物においては種々のリパーゼによってヒマシ油のグリセロール骨格 力 遊離してくる。
なお、上記 9-HODE、 13-HODE, HETEなどの酸化脂肪酸には、（S)体と（R)体の 光学異性体が存在するが、本発明の G2A作動薬に含まれる酸化脂肪酸は (S)体で あってもよいし、（R)体であってもよいし、両者の混合物でもよい。
[化 1]
Figure imgf000008_0001
[0010] 上記の 9-HODEなどの酸ィ匕脂肪酸は G2Aに結合し、 G2Aを活性ィ匕して細胞内カル シゥム濃度の上昇などのシグナルを伝達する。その結果、様々な薬効を発揮する。 例えば、以下のような薬効が挙げられる。
G2Aは各種増殖刺激や DNA損傷刺激によって誘導され、細胞周期を G2期で停止 させることが知られている。また、 G2Aは造血細胞に発現しており、造血細胞の増殖 を制御するという報告 (WO 99/25830)、リンパ球に発現しており、増殖刺激や遺伝子 傷害性の刺激によって発現誘導され、細胞骨格に影響を及ぼすことによって様々な 細胞シグナルを伝えるという報告 (WO 01/81918)、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、乳腺 癌、大腸癌、皮膚癌などのヒト悪性腫瘍に多く発現しているという報告などがある (W 0 02/090925) oこれらのことから、本発明の G2A作動薬はリンパ腫、白血病など様々 な癌に対する抗癌剤として使用することができる。
[0011] また、 G2A欠損（ノックアウト)マウスが自己免疫疾患を発病したことから（Immunity, 14:561-71, 2001 ; US 2002/0051980)、 G2Aの免疫機能への関与が強く示唆されて いる。さらに、本願の実施例に示すように G2Aリガンドが皮膚などの末梢組織におい て炎症性サイト力インの産生を誘導することが明らかになった。これらのことから G2A 活性調節薬が免疫疾患治療薬及び炎症性疾患治療薬として用いられることが容易 に理解できる。免疫性疾患としては関節リュウマチやその他の自己免疫疾患、炎症 性疾患としては乾癬や日光皮膚炎（日焼け)、炎症性腸疾患、肝炎などが挙げられる 。肝臓は脂質代謝の中心臓器であるため、食事中からの酸化脂肪の摂取、ウィルス 性肝炎、脂肪肝、薬物代謝障害、高脂血症などの状態で酸化脂肪によるストレスに 曝される。従って、 G2A活性調節薬はウィルス性肝炎、薬物性肝炎、アルコール性肝 炎、脂肪肝、肝硬変などの肝疾患治療薬として用いられる。また、本発明の G2A作動 薬は骨髄移植時などに用いられる免疫抑制剤としても有用に用いられる。
[0012] また、 G2Aは動脈硬化巣で多く発現して!/、ることから（Arterioscler Thromb Vase Bi ol, 22:2049-53, 2002)、 G2Aの動脈硬化への関与も強く示唆される。実際に、後述の 実施例に示すように、マクロファージ細胞である J774細胞に G2A遺伝子を強制発現さ せると、脂肪蓄積効果がさらに増大したことからも、 G2A活性調節薬が、動脈硬化治 療薬、抗肥満薬、糖尿病治療薬などの成人病 (メタボリックシンドローム)の治療薬と して有用であると考えられる。
[0013] 9-HODEなどの酸化脂肪酸を含む G2A作動薬、及び後述のスクリーニング法によつ て得られる G2A活性調節薬 (以下、まとめて G2A活性調節薬と呼ぶこともある）は、そ のまま、若しくは製剤学的に許容される製剤担体と組み合わせて、上記のような疾患 を治療または予防するための医薬とすることができる。尚、上記 9-HODEなどの酸ィ匕 脂肪酸は医薬に許容される塩にすることもできる。医薬に許容可能な塩として、ナトリ ゥム、カリウム等の金属の塩が例示される。
[0014] 本発明の医薬の製剤形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具 体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ 剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。製剤化にあた つては製剤担体として通常の医薬に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、 安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用でき る。また、 G2A活性調節薬と、他の医薬とを併用してもよい。
[0015] 本発明の G2A活性調節薬は、食品に含有させることもできる。食品の具体的形態は 特に制限されないが、食用油、調味料、加工食品などが例示される。食品は、 G2A活 性調節薬を、通常食品に用いられる原料と混合することによって製造することができ る。
本発明の食品中に含まれる G2A作動薬の量は、特に限定されず適宜選択すれば よいが、例えば、 G2A活性調節薬の量として、食品中に 0. 1〜50質量％、好ましくは 1〜 10質量％とするのがよい。
また、本発明の食品は、上記のような疾患に対する予防または治療効果を有する 健康食品や特定保健用食品などとすることもできる。本発明の食品は、例えば「抗癌 作用、抗炎症作用、免疫抑制作用、抗動脈硬化、肝臓保護作用などの効果を有す る成分を含有する食品」等の表示を付して販売するもできる。
[0016] < 2 >スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペル ォキシォクタデカジエン酸、 13—ヒドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテ トラェン酸及びリシノール酸力 選ばれる 1種又は 2種以上を用いることを特徴とする 、 G2A活性調節薬のスクリーニング方法である。
[0017] G2Aを用いるスクリーニング系としては、例えば、 G2Aに結合する化合物をスクリー ユングする系及び G2Aの活性ィ匕を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする系 が挙げられる。前者としては、 G2Aタンパク質に結合することのできる 9-HODEなどを 対照化合物として放射性同位体などでラベルし、ラベルされた対照化合物と G2Aタン ノ ク質をあらかじめ混合しておき、そこに被検化合物を添加し、被検化合物の中から 、対照化合物と競合して G2Aタンパク質に結合することのできる化合物を選択する方 法が挙げられる。この方法では、例えば、 G2Aタンパク質とそれに結合した標識対照 化合物を含む溶液に被検化合物を添加して反応させ、解離した対照化合物及び遊 離の被検物質を洗浄により除去した後、 G2Aタンパク質に残存する放射線量などを 測定することによって、被検物質が G2Aタンパク質に結合するかどうかを判定すること ができる。すなわち、被検物質との競合により標識対照化合物が G2Aタンパク質から 解離して放射線量が減少すると、被検化合物が G2Aタンパク質に結合すると判定で きる。対照化合物として、本発明において G2Aタンパク質に結合することが明ら力とな つた 9- HODE、 13- HODE、リシノール酸や HETEなどを用いる。
スクリーニングによって得られた G2Aに結合する化合物には、 G2Aの作動薬、拮抗 薬、さらには逆作動薬が含まれると考えられるため、後述のように細胞内カルシウム 濃度を増加させる力否かを調べることによってこれらのいずれに該当するかを決定す ることがでさる。
[0018] なお、このスクリーニング系で用いる G2Aタンパク質は遺伝子組換えによって生産さ れたタンパク質であってもよいし、細胞など力も精製されたものであってもよい。また、 化学合成されたものであってもよい。さら〖こ、 G2Aタンパク質のリガンド結合部位を含 む部分タンパク質でもよ 、。これらのタンパク質を遺伝子組換えによって生産する場 合は、例えば、配列番号 1または 3の塩基配列を有する DNAを適当なベクターに連 結し、これを大腸菌や動物細胞などの宿主に導入してタンパク質を発現させ、常法に 従って精製することによって得ることができる。なお、この場合に用いる DNAは、 9-H ODEなどのリガンドに応答して細胞内のカルシウム濃度を上昇させることができるタン パク質をコードする限り、配列番号 1または 3の塩基配列を有する DNAとストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAであってもよ!/、。ここでストリンジェントな条件 としては、 f列えば、、 60°C、 1 X SSC, 0. 1%SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0. 1%S DSに相当する塩濃度で、 1回より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。な お、大腸菌で遺伝子組み換えを行うためのベクターとしては pETベクター（Novagen社 )や pGEXベクター（Amersham Pharmacia社）などが挙げられ、動物細胞で遺伝子組 み換えを行うためのベクターとしては、 pcDNAベクター（Invitrogen社）などが挙げられ る。
[0019] また、細胞系で G2Aを活性ィ匕する化合物又は G2Aの活性ィ匕を阻害する化合物をス クリーニングしてもよい。 G2Aの活性ィ匕とは、 G2Aの生体内での機能、例えば、リガン ドに応答して細胞内カルシウム濃度を上昇させたりすることなどをいう。また、細胞内 c AMP濃度を指標にしてもよい。例えば、 CHOや HEK293などの細胞に G2Aをコードす る遺伝子を導入して G2Aタンパク質を発現させ、当該細胞に被検物質を添加したとき の細胞内カルシウム濃度の変化を測定することによって調べることができる。上記 9- HODEなどの G2Aリガンドを陽性対照に用い、これらのリガンドと同程度以上に G2Aを 活性化させる物質 (G2A作動薬)をスクリーニングしてもよ 、し、上記 G2Aリガンドと被 検物質を同時に加えて、 G2Aリガンドによる G2A活性ィ匕を阻害する物質 (G2A拮抗薬 )をスクリーニングしてもよい。
カルシウム濃度は常法によって測定することができ、例えば、 Fura-2 (同仁ィ匕学)な どを用いて測定することができる。また、 cAMP濃度は、例えば、 AlphaScreen cAMP a ssay kit (PerkinElmer)を用いて測定することができる。
[0020] 本発明のスクリーニング方法において、スクリーニングの対象とする化合物としては 特に制限はなぐ例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化 合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検 物質を用いてもょ 、が、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもょ 、。 なお、上記方法は、複数の化合物力も G2A作動薬または拮抗薬を探索するスクリー ユングだけではなぐ個々の化合物の G2A結合能、 G2A活性ィ匕能、 G2A活性ィ匕阻害 能を評価するためにも用いることができる。
[0021] 本発明のスクリーニング方法によって得られる G2A作動薬は、上述したような癌、免 疫性疾患、炎症性疾患、動脈硬化症、肝疾患などの治療薬または予防薬として用い ることがでさる。
一方、本発明のスクリーニング方法によって得られる G2A拮抗薬は、酸化ストレスを 伴う多くの疾患や病態の治療薬はまたは予防薬として用いることができる。すなわち 、皮膚の上皮細胞は G2Aを発現している力 9-HODEなどの酸化脂肪酸に反応して 細胞増殖が止まり、様々なサイト力イン類を放出する。皮膚は、外気と接しており、常 に一定の酸化ストレスに曝されている。特に、日焼け (紫外線曝露）によってその酸ィ匕 ストレスは増大する。この時に酸ィ匕脂肪酸が皮膚で産生されて 、るものと考えられる。 したがって、 G2A拮抗薬は、各種炎症、腫瘍、動脈硬化、喫煙、自己免疫疾患、糖 尿病、肝疾患などの酸化ストレスを伴う疾患の治療薬として有用であると考えられる。 さらに、火傷治療薬、日焼け止めクリームなどへの応用も考えられる。
さらに、 G2Aは放射線によって誘導されることが報告されている（国際公開第 01/81 918号パンフレット)などから、 G2A活性調節薬は UV照射、放射線照射、粒子線照射 の治療薬、放射線治療や重粒子線治療の作用増強剤、健常組織保護剤などとして も有用であると考えられる。 実施例
[0022] 以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記 実施例に限定されるものではな 、。
[0023] 各種 HODE, HPODE, HETE及び cholestery卜 9- HODEは、 Cayman Chemical社か ら購入した。リノール酸，ァラキドン酸， 1-パルミトイルリゾフォスファチジルコリン，及び 1-パルミトイル- 2-リノレオイルフォスファチジルコリンは Sigma社から購入した。 [3¾]GT Ρ γ Sは Perkin Elmer社から購入した。
[0024] 9(S)- HODEの合成
5-リポキシゲナーゼを Proc Natl Acad Sci U S A 81, 689-693 (1984)に記載の方法 に従ってィモの塊茎力も精製した。 5-リポキシゲナーゼを用いて反応バッファー (20 m M Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 mM diethylenetriaminepentaacetic acid)中で,リノ一ノレ酸を 酸化し、次いで、 NaBHで還元した。生成物をシリカカラムクロマトグラフィーによって 未反応基質と分離した。 LC-MS分析により、生成物が 95%以上の 9(S)-HODEを含む ことが確認できた。
[0025] プラスミド構築
FLAGェピトープを N末端に付加したヒト G2Aをコードする遺伝子を、配列番号 5及 び 6のプライマーを用い、 Pyrobest (Takaraバイオ社)により増幅した。 PCR産物を Bam HI及び EoRIで消化し、哺乳類細胞発現ベクター pCXN2.1 (Gene, voll08: pl93-200, 1991)に挿入した。得られたプラスミドを pCXN2.1-G2Aと名づけた。
Gqi (マウス Gqタンパク質の C末端 9ペプチドをマウス Giタンパク質の対応ペプチドと 置換した）の全 ORFを含むプラスミドを pcDNA3.1/Zeo vector (Invitrogen社)にサブク ローンィ匕し、 pcDNA3.1/ Gqiと名づけた。 Gタンパク質の C末端領域は Gタンパク共役 型受容体との相互作用を決定する重要な部位であり、 C末端領域を Giタンパクの対 応領域で置き換えられたこの Gqiキメラタンパク質は Giタンパクと共役する受容体と相 互作用し、 Gq様のシグナルを伝達できることが報告されている（Nature vol363: p274- 6, 1993) oしたがって、 Giと共役する受容体のシグナルを Gqによって伝達されるカル シゥムシグナルとして観察するための有用なツールとなりうる。
[0026] 細胞培養、遺伝遺伝子導入、フローサイトメトリー
チャイニーズノヽムスター卵巣細胞 (CHO細胞)及びヒト胚腎細胞 293細胞 (HEK293細 胞)は、それぞれ、 10%ゥシ胎児血清を含有する、 Ham' s F-12培地 (Sigma)、 Dulbecco ，s modified Eagle' s培地（Sigma社)中、 37°C、加湿した 5% COインキュベーター内で
2
維持した。細胞に Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen社）を用いて各プラスミド D NAのトランスフエクシヨンを行った。
FLAGタグ結合 G2Aタンパク質の膜発現を観察するために、 1% BSAを含む PBS (-) 中、細胞を透過性にすることなぐ lO ^ g/ml M5抗 FLAG抗体 (Sigma社)を加えて室 温で 1時間インキュベートした。 FITC結合抗マウス IgGをカ卩えて室温で 30分インキュべ ートし、 EPICS XL flow cytometer system (Beckman Coulter社)を用いて検出した。
[0027] CHO細胞での G2A遺伝子の安定発現
Lipofectamine 2000を用いて pCXN2.1- G2Aを CHO細胞にトランスフエクシヨンした 。 1 mg/ml Geneticin (Invitrogen社)に而性のクローンを選択し、 G2A遺伝子の発現レ ベルを RT-PCRとフローサイトメトリーによって確認した。
G2A高発現クローン (CHO- G2A細胞)をさらに pcDNA3.1/Gqiでトランスフエクシヨン し、 1 mg/ml Zeocin (Invitrogen社)に耐性を有する安定クローンを選択した。 Gqiの発 現を RT-PCRで確認し、 CHO- G2A-Gqi細胞を得た。また、 Gqiを安定に発現する CH 0細胞も取得した (CHO- Gqi cells)0
[0028] 細胞内カルシウム濃度の測定
1.25 mMプロべネシド及び 0.02% pluronic F127 (BASF社）を含む Hepes- Tyrode ' s -BSAバッファー (25 mM Hepes- NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.0 m M CaCl , 12 mM NaHCO , 5.6 mM D— glucose, 0.37 mM NaH PO , 0.49 mM MgCl ,
2 3 2 4 2
0.01%脱脂 BSA)中で、 CHO細胞に 5 μ M Fura- 2 AM (Dojin社)を添カ卩し、 37°C、 1 時間インキュベートした。 細胞を Hepes-Tyrode' s— BSA bufferで洗浄した後，リガン ト朿 [J激し、 scanning fluorometer system (FLEXstation, Molecular Devices社)又は R F5300PC spectrofluorometer (Shimazu社)を用いて細胞内カルシウム濃度の変化を 測定した。
[0029] GTP y S結合アツセィ
CHO細胞をホモジナイズバッファー (20 mM Tris- HC1, pH 7.4, 0.25 M sucrose, 10 mM MgCl , 1 mM EDTA,及び Complete protease inhibitor cocktail(Roche社)）中で
2
超音波破砕した。破砕物を 12,000 X gで 10分間遠心し、上清を 100,000 X gで 1時間 遠心した。沈殿物 (膜画分)をホモジナイズバッファ一中で再懸濁し、タンパク質濃度 を、 BSAを標準とし、 BCA Protein Assay Reagent (Pierce)によって決定した。 200 μ 1 の結合バッファー (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl , 100 mM NaCl, 1 mM ED
2
TA, 1 mM DTT, 5 μ Μ GDP,及び 0.1% BSA)中、 20 M非標識 GTP y Sの存在下 又は非存在下で、膜タンパク質 (20 g)を 0.5 nM [35S]GTP y S及び各濃度の 9(S)-HO DEとともに 30°Cで 30分間インキュベートした。
GF/C glass-fiber filters (Whatman社)を用いてろ過することにより反応を終結させた 。フィルターを PBS (-)で入念に洗浄し、 50°Cで乾燥させ、 Aquasol II scintillation cock tail (Packard社)に浸した。フィルターの放射能を LS6500 scintillation system (Beckma n社)を用いて測定した。 [0030] 細胞培養
NHEK糸田胞 (Kurabo)iま growth supplements (Kurabo, growth medium)を添カロした Hu Media- KB2 (Kurabo, basal medium)を用いて培養した。
[0031] 免疫組織染色
ヒト皮膚の凍結切片（厚さ 6 m)を 10% BSAを用いて室温で 30分ブロッキングし、 1% BSA/PBSで 1.7 g/mlに希釈した 1次抗体を用いて 4° Cでー晚インキュベートした。 1次抗体は、抗ヒト G2A抗体 (Lifespan)またはゥサギ IgG (Santa-cruz)を用いた。次いで 、 1% BSA/PBSで 2 μ g/mlに希釈した 2次抗体 (Alexa Fluor 488 (Molecular Probes)と 結合したャギ抗ゥサギ IgG)を用いて室温で 1時間インキュベートし、蛍光顕微鏡 (Axio skop; Zeiss)を用いて観察を行った。
[0032] RT-PCR
トータル RNAを、 DNase(Qiagen)で処理した NHEK細胞から RNeasy Mini kit (Qiagen )を用いて抽出した。 RT- PCRは QIAquick one step RT- PCR kit (Qiagen)とセンスプラ イマ一（5， - GGCTTTGCCATCCCTCTC- 3，：配列番号 7)及びアンチセンスプライマ 一 (5， -GACAGGCACAGAAACACC-3，：配列番号 8)を用いて行った。
[0033] NHEK細胞における 9(S)-HODEによる細胞内カルシウム動員
0.02% pluronic F127を含む Hepes— Tyrode' s— BSAバッファー (25 mM Hepes— NaOH, pH 7.4; 140 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 1.0 mM CaCl； 12 mM NaHCO； 5.6 mM D— gl
2 3
ucose; 0.37 mM NaH PO； 0.49 mM MgCl；および 0.01% fatty acid-free BSA)中で、
2 4 2
NHEK細胞に 2.5 μ MFura-2/ΑΜ (Dojin)を加えて 37°Cで 1時間インキュベートした。 細胞を Hepes- Tyrode' s- BSAバッファーで洗浄し、 9(S)- HODEで刺激したときの細 胞内カルシウム濃度の変化を RF5300PC spectrofluorometer (Shimazu)を用いて測定 した。
[0034] サイト力イン濃度の測定
NHEK細胞を 9(S)-HODEで刺激した後、培養上清を回収しサイト力イン濃度を Bio-
Plex ELISA system (Bio- Rad)を用いて測定した。
[0035] [結果] G2Aを発現する CHO細胞において 9(S)-HODEによって惹起される細胞内力 ルシゥム動員 図 1に示されるように， CHO- G2A細胞において、 9(S)-HODEは濃度依存的に細胞 内カルシウム動員を惹起した。 1/2極大活性をもたらす 9(S)-HODE濃度は約 2 μ Μで あった。一方，親株 CHO-K1細胞は 9(S)-HODEに全く反応しなかった。
G2Aは Gタンパク質共役受容体であると考えられた。そこで、マウス Gqタンパク質の C末端 9ペプチドをマウス Giタンパク質の対応ペプチドと置換した Gqiキメラタンパク 質を G2Aと共発現させた細胞を用いて評価した。図 1に示されるように， G2Aと Gqiの 両方を発現するクローン (CHO- G2A_Gqi)は 9(S)_HODEに対して高い反応性を示し た。一方、 Gqiのみを発現する CHO細胞 (CHO- Gqi)は 9(S)-HODEに反応しなかつ た。
[0036] G2Aのリガンド特異性
リノール酸、ァラキドン酸の様々な酸化誘導体をそれぞれ 1 μ Μ添加し、細胞内カル シゥム濃度を測定した（図 2Α)。
その結果、これらの中では、 9(S)- HODE及び 11- HETE力 CHO- G2A- Gqi細胞に ぉ 、て最も強 、細胞内カルシウム動員活性を示した。この 2種類の脂質の構造を図 2 Aのカツコ内に示した。 9(S)_ヒドロペルォキシォクタデカジエン酸 (9(S)-HPODE)は 9( S)- HODEと同等の活性を示した力 3(S)- HODE及び 13(S)- HPODEの活性は弱か つた。これらの結果は ω位からの炭素鎖の長さと水酸基又はヒドロペルォキシ基の 位置が G2Aのリガンド認識に重要であることを示唆している。一方， 9(S)-HODEのコレ ステロールエステル及び 1-パルミトイルリゾフォスファチジルコリンは 10 μ Μでもほと んど活性を示さなかった。また、以前リガンドと報告されたリゾフォスファチジルコリン には反応しなかった。
次に、リガンドの光学特異性について調べた（図 2Β)。その結果、 9(S)- HODEの光学 異性体である 9(R)- HODE (Cayman Chemical社)も、 9(S)- HODEほどではないものの 、カルシウム動員活性を示した。このことから、 9(R)- HODEもリガンドであることがわか つた o
[0037] 9(S)- HODEによる GTP γ S結合の誘導
9(S)- HODEが G aタンパク質の GDP- GTP交換を促進するかどうかについて G2A安 定発現細胞の膜画分を用いて調べた。図 3Aに示されるように， G2A安定発現細胞の 膜画分は 9(S)- HODE依存性の [35S]GTP y S結合を示した。
さらに、 HEK293細胞に、コントロールベクター又は pCXN2.1-G2Aと、 pcDNA3.1/Gi を一過性に発現させて調べた。トランスフエクシヨンの 24時間後、膜画分を調製し、 G TP γ S結合の結合を調べた。 9(S)- HODE依存性の [35S]GTP y Sの結合は G2Aのみを トランスフエタトした細胞の膜画分では観察されな力つた (データは示さな 、；)。図 3B に示すように、 Giを G2Aと共発現させたときに 9(S)- HODE依存性の GTP y S結合が見 られた。一方、 Giのみをトランスフエクシヨンしたときは 9(S)-HODE依存性の [35S]GTP y S結合は観察されなカゝつた。
これらの結果より、 9(S)- HODEは G2Aを介して G aタンパク質を活性ィ匕することが示 唆された。
[0038] データは示さないが、 G2A発現細胞における 9(S)- HODE依存性のカルシウム濃度 上昇反応反応や、 cAMP増加抑制反応は、 Giタンパク質阻害剤である百日咳毒素 (P TX)により阻害されたことから、 G2A受容体が Giタンパク質に共役していることが考え られた。また、 G2Aを安定的に発現した CHO細胞では、 9-HODE刺激によって MAP キナーゼ系のうち、 JNKが活性ィ匕されることがわ力つた。
[0039] リシノール酸による G2Aの活性化
リシノール酸を CHO- G2A細胞に添カ卩し、細胞内カルシウム濃度を調べた（図 4)。 その結果、リシノール酸は 9(S)-HODEと同程度に G2Aを発現した細胞において細胞 内カルシウム動員を引き起こすことがわ力つた。一方、親細胞である CHO- K1細胞は 、9(S)- HODE(l M)やリシノール酸 (10 M)に反応しなかった。なお、 ATPは多くの 細胞に細胞内カルシウム動員を引き起こす陽性対照である。
[0040] マクロファージ細胞における G2Aの役割の解析
マウスのマクロファージ系の細胞である J774細胞において、マウス G2A遺伝子を強 制発現もしくは、 RNA干渉 (RNAi)により発現抑制した。強制発現はレンチウィルス発 現ベクター pLenti6 (Invitrogen社）を用いて行った。一方、発現抑制は RNAi用べクタ 一 pBlock- iT (Invitrogen社）を用いて行った。 RT- PCRで G2AmRNAの発現量を確認 すると、 G2A発現ベクター (pLenti6- mG2A)によって約 4倍に増加しており、 RNAi (pBl ock-iT- mG2A)によって約 5分の 1以下に減少して!/、た（データ略)。 [0041] J774細胞に LDLを添加すると細胞の泡沫ィ匕 (脂肪滴貯留）力起こり（図 5a)、酸化し DL (銅イオン処理により酸ィ匕させた LDL)を添加すると細胞の泡沫ィ匕はさらに進行す る（図 5d)。 J774細胞の泡沫化は、動脈硬化における血管壁の脂肪蓄積のモデルと してよく使われ実験系である。なお、 J774細胞は G2A受容体を通常でも発現している 。これに 9-HODEを作用させておくと LDLの泡沫化は顕著になる（図 5g)。 9-HODE の処理により酸化 LDLの作用はさらに顕著になる（図 ¾)。これに対し、 G2Aを強制発 現させると、 LDLや酸化 LDLの効果が顕著になる（図 5b、 e) Gまた、 G2Aを強制発現 させると、 LDLや酸化 LDLの泡沫ィ匕効果に及ぼす 9-HODEの効果がさらに顕著にな る（図 5h、 k)。
RNAiによって G2Aの発現を抑制すると、いずれの条件下でも、非常に激しい泡沫ィ匕 が観察された（図 5c、 f、 i、 l) o特に、酸化 LDLの効果が顕著となった（図 5f、 1)。 これらの現象の分子機構は不明である力 G2Aおよびそのリガンドである 9-HODE 力 動脈硬化の病態形成に深く関与している可能性を示している。さらに、 G2A活性 調節薬が、動脈硬化治療薬として有用である可能性を示して!/ヽる。
また、 G2Aの発現や 9-HODEなど酸化脂肪酸の産生をモニターすることは、動脈硬 化の診断や治療効果の判定に有用と考えられる。
[0042] ヒト皮膚における G2Aの発現
ヒト皮膚における G2Aの発現を免疫組織染色により調べた（図 6A)。 G2Aは上皮、特 に、扁平上皮細胞及び顆粒層に多ぐ基底層では少なカゝつた。また、培養ヒトケラチ ノサイト NHEK細胞における G2Aの発現を RT-PCRにより調べた（図 6B)。それによると 、 NHEK細胞においても G2Aの発現が認められた。
[0043] NHEK細胞における 9(S)-HODEによる細胞内カルシウム動員
図 7に示されるように、 9(S)_HODEは内因性の G2Aを発現する NHEK細胞において も細胞内カルシウム動員を惹起した。 3 M 9(S)-HODEによる反応は弱力つた力 1 0 /z M WS HODEの添カ卩により反応は顕著になった。一方、連続して 15 μ M 9(S)-H ODEを添カ卩しても反応は惹起されなかった。これは、 ATPとは依然細胞が反応したこ とから、おそらく受容体の脱感作によるものと考えられた。
[0044] NHEK細胞における 9(S)-HODE添カ卩によるサイト力インの誘導 9(S)-HODEで処理された NHEK細胞の上清におけるサイト力インの濃度を Bio-Plex ELISA systemを用いて調べた。その結果、 9(S)- HODEは IL- 6 (図 8A), IL- 8 (図 8B), および GM- CSF (図 8C)を濃度依存的に誘導した。 IL-6と IL-8の誘導は 9(S)-HODE 添加後 4時間で有意に増加し、 GM-CSFの増加は 9(S)- HODE添加後 16時間で有意 に増加した。
産業上の利用可能性
本発明の G2A作動薬は、癌、免疫性疾患、炎症性疾患、動脈硬化症、肝疾患など の疾患に対する治療効果や予防効果を有する医薬または食品の有効成分として用 いることができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、新規な G2A活性調節 薬を得ることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 13—ヒ ドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸力 選 ばれる 1種又は 2種以上を含む、 G2A作動薬。
[2] 請求項 1に記載の G2A作動薬を含む、医薬。
[3] 請求項 1に記載の G2A作動薬を含む、食品。
[4] 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 13—ヒ ドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸力 選 ばれる 1種以上の化合物を用いて被検化合物の G2A結合能を評価することを特徴と する、 G2A活性調節薬のスクリーニング方法。
[5] 被検化合物が G2A結合能を有するかどうかを評価する方法であって、 9ーヒドロキシ ォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 13—ヒドロキシォクタ デカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸力 選ばれる 1種以 上の化合物を対照化合物として用いて、被検化合物の G2A結合能を評価することを 特徴とする方法。
[6] 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォクタデカジエン酸、 13—ヒ ドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン酸及びリシノール酸力 選 ばれる 1種以上の化合物を対照化合物として用いて、被検化合物の G2A活性ィ匕能、 または G2A活性ィ匕阻害能を評価することを特徴とする、 G2A活性調節薬のスクリー- ング方法。
[7] 被検化合物が G2A活性ィ匕能を有するか、または G2A活性ィ匕阻害能を有するかどうか を評価する方法であって、 9ーヒドロキシォクタデカジエン酸、 9ーヒドロペルォキシォ クタデカジエン酸、 13—ヒドロキシォクタデカジエン酸、ヒドロキシエイコサテトラェン 酸及びリシノール酸力 選ばれる 1種以上の化合物を対照化合物として用いて、被 検化合物の G2A活性ィ匕能または G2A活性ィ匕阻害能を評価することを特徴とする方法
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120023729A (ko) * 2009-05-01 2012-03-13 이쿠아텍 리미티드 신경손상을 치료하기 위한 다중불포화 지방산(ｐｕｆａｓ)의 용도

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07291862A (ja) * 1994-04-28 1995-11-07 Tamanoisu Kk 抗腫瘍剤及びその製造法
JP2000505435A (ja) * 1996-02-15 2000-05-09 ヴァイアロセル・インコーポレーテッド 抗ウイルス薬および抗腫瘍薬としてのロイコトリエンｂ▲下４▼またはその類似体の使用
WO2001019985A1 (fr) * 1999-09-10 2001-03-22 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Nouveaux recepteurs et genes codant pour ces memes recepteurs
JP2001523456A (ja) * 1997-11-13 2001-11-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 転写的に調節されたｇタンパク質−共役受容体
JP2002535479A (ja) * 1999-01-29 2002-10-22 ラボラトワール アルコファルマ ヒドロキシオクタデカジエン脂肪酸（ｈｏｄｅ）又はそのエステルが豊富なオイルを、リノール酸又はそのエステルを含む混合物から得る方法
WO2003078466A1 (fr) * 2002-03-19 2003-09-25 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Recepteurs couples a la proteine g et genes correspondants
JP2004049004A (ja) * 2002-05-31 2004-02-19 Japan Science & Technology Corp ５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質及びその遺伝子

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE9012043U1 (ja) * 1990-08-21 1990-11-29 Thoene, Hermann, 6700 Ludwigshafen, De
JPH06247850A (ja) * 1993-02-24 1994-09-06 Suntory Ltd １２−リポキシゲナーゼ阻害剤
US5753702A (en) * 1996-05-22 1998-05-19 University Of Vermont Arachidonic acid metabolite, 16-hete
CA2304906A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-07 1411198 Ontario Limited 13-hode, a regulator of vascular biocompatibility and an inhibitor of cell hyperplasia
AUPS282602A0 (en) * 2002-06-07 2002-06-27 Garvan Institute Of Medical Research Method of inhibiting cell proliferation

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07291862A (ja) * 1994-04-28 1995-11-07 Tamanoisu Kk 抗腫瘍剤及びその製造法
JP2000505435A (ja) * 1996-02-15 2000-05-09 ヴァイアロセル・インコーポレーテッド 抗ウイルス薬および抗腫瘍薬としてのロイコトリエンｂ▲下４▼またはその類似体の使用
JP2001523456A (ja) * 1997-11-13 2001-11-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 転写的に調節されたｇタンパク質−共役受容体
JP2002535479A (ja) * 1999-01-29 2002-10-22 ラボラトワール アルコファルマ ヒドロキシオクタデカジエン脂肪酸（ｈｏｄｅ）又はそのエステルが豊富なオイルを、リノール酸又はそのエステルを含む混合物から得る方法
WO2001019985A1 (fr) * 1999-09-10 2001-03-22 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Nouveaux recepteurs et genes codant pour ces memes recepteurs
WO2003078466A1 (fr) * 2002-03-19 2003-09-25 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Recepteurs couples a la proteine g et genes correspondants
JP2004049004A (ja) * 2002-05-31 2004-02-19 Japan Science & Technology Corp ５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質及びその遺伝子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OBINATA H. ET AL.: "Identification of a 9-Hydroxyoctadecadienoic Acid and Other Oxidized Free Fatty Acids as Ligands of the G Protein-Coupled Receptor G2A", J. BIOL. CHEM., vol. 280, no. 49, 2005, pages 40676 - 40683, XP003005412 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120023729A (ko) * 2009-05-01 2012-03-13 이쿠아텍 리미티드 신경손상을 치료하기 위한 다중불포화 지방산(ｐｕｆａｓ)의 용도
JP2012525362A (ja) * 2009-05-01 2012-10-22 イクウエイテック リミテッド 神経損傷の治療を目的としたｐｕｆａの使用
KR101664518B1 (ko) * 2009-05-01 2016-10-11 이쿠아텍 리미티드 신경손상을 치료하기 위한 다중불포화 지방산(ｐｕｆａｓ)의 용도

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