JP2002502224A

JP2002502224A - 細胞異常を患う個人を同定するための方法

Info

Publication number: JP2002502224A
Application number: JP52127195A
Authority: JP
Inventors: ファン・デア・ブルッゲン，ピエール; スジコーラ，ジャン―ピエール; クーリ，ピエール; ワイルドマン，クロード; ベール，パスカーレ; ブーン―ファラー，ティエリー
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-01-26
Publication date: 2002-01-22
Also published as: NZ282938A; DE69530410D1; ATE237685T1; ES2197196T3; FI963170A; NO963347D0; WO1995021630A1; FI963170A0; CA2182969A1; AU697246B2; DE69530410T2; EP0789591B1; EP0789591A4; EP0789591A1; NO963347L; AU2089995A; PT789591E; DK0789591T3; US6328971B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、異常細胞上におけるＨＬＡ−Ｃ−クローン１０とＭＡＧＥ−１との複合体の同定に関する。この観察の診断上および治療上の派生効果が本発明の課題である。

Description

【発明の詳細な説明】細胞異常を患う個人を同定するための方法関連出願本出願は、１９９３年１月２２日出願の米国出願第０８／００８，４４６号の一部継続出願である１９９４年２月１４日出願の同時係属出願第０８／１９５，１８６号の一部継続出願である。これは、又、１９９４年２月１５日出願の一部継続出願第０８／１９６，６３０号でもある。発明の分野本発明は、ある種の異常細胞が、その表面上に、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１（前にＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と呼ばれていたもの）（ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）他、ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ４４：１（１９９４））と、ＭＡＧＥ− １と呼ばれている分子から派生するペプチドとの複合体を提示するという認識から導かれる種々の治療方法に関する。更に、これは、その異常細胞がこの複合体を提示する細胞異常によって特徴付けられる状態を有すると診断される個人を同定する可能性に関する。背景及び先行技術ほ乳類の免疫システムが外来の又は異質の物質を認識し、これらに対して反応するプロセスは複雑である。このシステムの重要な一面は、Ｔ細胞応答である。この応答は、Ｔ細胞がヒト白血球抗原（”ＨＬＡ”）、又は主要組織適合抗原（ ”ＭＨＣｓ”）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これと相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセッシングされる大きな分子から誘導される。この点に関してはメール（Ｍａｌｅ）他のＡｄｖａｎｃｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｐ．ＬｉｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特にその第６−１０章を参照。前記Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組合せに特異的なＴ細胞を必要とする点で、限定されたものである。たとえ、特定の複合体が存在しても、特異的なＴ細胞が存在しなければＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在しても、特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。このメカニズムは、免疫システムの、自己免疫病状における外来の物質に対する応答や、細胞異常に対する応答に関係している。最近、タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドにプロセッシングされるメカニズムに関し、多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８８０（１９９２）：フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９１９（１９９２）：マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９２７（１９９２）：ラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６４（１９９２）参照。Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは、癌にも関連付けられてきた。例えば、ここに参考文献として添付される１９９２年５月２２日に出願され、１９９２年１１月２６日にＷＯ９２／２０３５６として公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、細胞表面上に発現されるペプチドにプロセッシングされ、特定のＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を可能にする遺伝子の１つのファミリが開示されている。これらの遺伝子は”ＭＡＧＥ”ファミリと呼ばれ、”腫瘍拒絶抗原先駆体”、即ち、”ＴＲＡＰ”分子をコード化するものであると言われており、これらから誘導されるペプチドは、”腫瘍拒絶抗原”、又は”ＴＲＡｓ”と呼ばれている。この遺伝子ファミリの詳細については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏ− ｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５（１９９２）；ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３（１９９１）参照。その開示内容を、ここに参考文献として添付する米国特許出願第９３８，３３４号には、前記ＨＬＡ−Ａ１分子に結合するノナペプチドが教示されている。この参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が既知であれば、特定のペプチドが１つのＨＬＡ分子に結合し、他の分子には結合しないと予期される、と教示している。これは重要である。というのは、保有するＨＬＡ表現型は個体それぞれで異なるからである。その結果、ある特定のペプチドが特異的ＨＬＡ分子のパートナとして同定されることが、様々な診断上または治療上の派生効果を有するとしても、これらはこの特定のＨＬＡ表現型を保有する個体にしか関連性を有していない。細胞異常は１つの特定のＨＬＡ表現型に限られていないので、この分野において更に研究が必要であり、標的治療のためには対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。ブーン‐ファラー（Ｂｏｏｎ‐Ｆａｌｌｅｕｒ）他の名で、１９９２年１２月２２日に出願された、”その異常細胞の一部がＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ派生ペプチドの複合体を提示する細胞異常を患う個人を同定する方法、及び、これらの個人を治療する方法”という名称の特許出願において、この名称中の複合体がある種の細胞異常に関連していることが同定された。しかし、この出願は、その他のＨＬＡ分子が細胞異常に関連しているかもしれないということを示唆するものではない。前述したＨＬＡ−Ａ分子によるＭＡＧＥ−１の従来の提示は、そのタンパク質がタンパク質のＨＬＡ分子によって提示される可能性を示唆するものではない。従って、ＨＬＡ−Ａ１によって提示される、まさにこのＭＡＧＥ分子が、ＨＬＡ −Ｃｗ^*１６０１によって提示されることがここで示されることは、驚くべきことである。従来の研究は、前記現象を理解する上である程度の価値を有するものの、以下の開示内容は当業者にとって新規なものである。図面の簡単な説明図１は、ＣＯＳ−７のＭＡＧＥ−１とＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１をコード化する配列によるトランスフェクションに関する実験を示す。図２Ａは、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４ペプチドで３０分間培養しておいた、エプスタイン・バールウイルス（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒＶｉｒｕｓ）によって感染されたＭＺ２細胞を使用した⁵¹Ｃｒ放出アッセイの結果を示す。ここで、そのエフェクタ細胞はＣＴＬ８１／１２からのものである、図２Ｂは、図２Ａに類似し、そのエフェクタがＣＴＬ８２／３５であることのみが異なる。好適実施例の詳細説明例１次の実験において、種々のメラノーマ細胞系を使用した。これらは、ＭＺ２及びＬＢ７３と同定されたメラノーマ患者から得た。細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．４３、ＭＺ２−ＭＥＬ−３．０及びＭＺ２−ＭＥＬ３．１は、ＭＺ２−ＭＥＬのクローン化副系であり、これらは、その両方の全部を参考文献としてここに添付する、ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．４４：４３４（１９８９）と、更に、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／２０３５６（１９９２年１１月２６日）とに記載されている。細胞系ＬＢ７３−ＭＥＬは、ここに記載された他の細胞系と同様の方法によって患者ＬＢ７３から導出されたものである。単核血液細胞含有サンプルを、患者ＭＺ２から採取した。メラノーマ細胞系ＭＺ２ＭＥＬ．４３のサンプルを照射し、次に、前記単核血液細胞含有サンプルに接触させた。この混合物のメラノーマ細胞系の溶解を観察したところ、この溶解は、ペプチドと前記メラノーマ細胞によって提示されたＨＬＡ分子との複合体に対して、特異的な細胞溶解Ｔ細胞（”ＣＴＬｓ”）がそのサンプル中に存在していることを示した。使用した溶解アッセイは、ここにその開示内容を参考文献として添付するヘライン（Ｈｅｒｉｎ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９：３９０−３９６（１９８７）に従ったクロム放出アッセイであった。但し、このアッセイについてはここに記載しておく。標的メラノーマ細胞を生体外で生育し、次に、これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと３０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中で１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌに再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄と３７℃で４５分間培養した。ラベル化した細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを追加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これらを１０ｍＭのＨｅｐｅｓと１０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中に再懸濁させ、その後、１０³個の細胞を含む１００ｕｌのアリコットを、９６のウェルマイクロプレート中に分布させた。ＰＢＬのサンプルを、１００ｕｌの同じ培地に添加し、同じようにアッセイを行った。プレートを１００ｇで４分間遠心分離し、３７℃で５．５％の二酸化炭素雰囲気中にて４時間培養した。プレートを再び遠心分離し、１００ｕｌの上清のアリコットを採取し、計数した。⁵¹Ｃｒ放出の百分率は以下の式に基づいて計算された。ここで、ＥＲは観察された実験⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは１０³ラベル化細胞を２００ｕｌの媒体中のみで培養することによって測定された自発的放出量、そしてＭＲは、１００ｕｌの０．３％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を標的細胞に添加することによって得られた最大放出量である。高いＣＴＬ活性を示した前記単核血液サンプルを制限希釈によって拡張およびクローン化し、同じ方法を使用して再スクリーニングした。これらの実験によつて、患者ＭＺ２−ＭＥＬ３．１から、ＣＴＬクローン” ８１／１２”を含む複数のＣＴＬクローンが分離された。上記実験を、細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．０とＭＺ２−ＭＥＬ３．１との両方を使用して繰り返した。その結果、クローン８１／１２が、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３とＭＺ２−ＭＥＬ３．０との両方を認識するが、ＭＺ２−ＭＥＬ３．１は認識しないことを示した。８１／１２によって認識される抗原を、以下、”抗原Ｂｂ”という。例２上に要約した従来の研究に鑑みて、患者ＭＺ２のＨＬＡクラス１プロファイルを決定することに興味を持った。この決定は、以下に説明する標準方法によって行った。患者のＨＬＡクラス１分子の遺伝子をコード化するｃＤＮＡクローンを得るため、ここで繰り返すことを避ける周知の技術を使用して、細胞系ＭＺ２− ＭＥＬ．４３から抽出したトータルｍＲＮＡから始めて、ｃＤＮＡライブラリを準備した。このライブラリを、すべてのＨＬＡクラス１遺伝子に共通の下記の配列を含むオリゴヌクレオチド・プローブを使用して、プラスミドｐｃＤ−ＳＲα に挿入した。即ち、このようにして同定された１つのクローンはクローンＩＣ４Ａ７であり、これを配列決定したところ、これは、周知のヒト白血球抗原分子ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１に同じではないが機能的に等価であることが判った。ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１をコード化するＤＮＡの配列は、例えば、シアネッティ（Ｃｉａｎｅｔｔｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏ−ｇｅｎｅｔｉｃｓ２９：８０−９１（１９８９）に記載されており、ここで、ＨＬＡ−Ｃクローン１０と命名された。この配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＨＵＭＭＨＣＡＣＡとして入手可能である。そのアップデートされた配列が、ここにその全部を参考文献として添付するゼモール（Ｚｅｍｍｏｕｒ）他、Ｉｍｍｕｎｏ−ｇｅｎｅｔｉｃｓ３７：２３９−２５０（１９９３）と、前述のシアネッティ他とによって報告されている。前記ゼモールの配列は、ＥＭＢＬ配列バンクからも入手可能である。例３前述の同定されたＨＬＡ分子が、ｍａｇｅ派生腫瘍拒絶抗原を提示するか否か、又、その抗原とＨＬＡ分子との複合体が患者ＭＺ２のＣＴＬクローンによって認識されるか否か、を決定することに興味を持った。この決定を行うために、受容体細胞を、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１をコード化するｃＤＮＡと、ＭＡＧＥ−１，ＭＡＧＥ−２又はＭＡＧＥ−３ｃＤＮＡのいずれか１つとトランスフェクションした。ＭＡＧＥ−１ｃＤＮＡを、プラスミドｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに挿入し、ＭＡＧＥ−２及びＭＡＧＥ−３ｃＤＮＡを、プラスミドｐｃＤ−ＳＲαに挿入した。受容体ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１０％胎児ウシ血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変成Ｅａｇｌｅｓ培地（”ＤＭＥＭ”）中の、組織培養平底ミクロウェル中に、１５，０００細胞／ウェルの割合で接種した。これらの細胞を３７ ℃で一晩培養し、培地を取り除き、これを、１０％のＮｕ血清、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭのクロロキン、１００ｎｇのプラスミド（即ち、１００ｎｇのＩＣ４Ａ７クローンと１００ｎｇのＭＡＧＥ−ｃＤＮＡプラスミド）とを含む、３０μｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地にて置換した。３７℃ の４時間の培養後、前記培地を除去し、１０％のＤＭＳＯを含む５０μｌのＰＢＳによって置換した。この培地を２分後に除去し、１０％のＦＣＳを添加した２００μｌのＤＭＥＭによって置換した。この培地の交換後、ＣＯＳ細胞を３７℃で４８時間培養した。次に培地を廃棄し、１０％のプールされたヒト血清を含有する１００μ ｌのＩｓｃｏｖｅ培地中で、ＣＴＬクローン８１／１２の２０００細胞を添加した。２４時間後に上清を除去し、ここに参考文献としてその開示内容を添付するトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５−１５２（１９９２）に記載されているように、ＴＮＦ含有量をＷＥＨＩ細胞上のアッセイで測定した。その結果は、図１に示すように、ＭＡＧＥ−１から派生した腫瘍拒絶抗原が、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１によって提示され、ＣＴＬクローン８１／１２によって認識されるが、これに対して、ＭＡＧＥ−２とＭＡＧＥ−３との発現によっては、適当な抗原の発現が起こらないことを示している。例４上述した実験の後、更に、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１が提示したペプチドを測定する作業を行った。発現ベクタｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ中のＭＡＧＥ−１ｃＤＮＡを、供給者の指示に従って、先ず制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ１とＳｐｈ１とで消化し、その後、エクソヌクレアーゼＩＩＩで消化した。この処理によって、３’末端から始まって、ＭＡＧＥ−１ｃＤＮＡの一連の漸進的欠失が生じた。上記欠失産生物を、再びｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに結合し、その後、周知の技術を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αＦ’ＩＱにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄした。トランスフェクタント（移入体）を、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）で選択し、６００のクローンが得られた。各クローンからプラスミドＤＮＡを除去し、これをＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１をコード化するベクタとともに、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。使用したプロトコルは、上述したプロトコルによるものである。前記トランスフェクタント（移入体）を、次に、例３で記載したＴＮＦ放出アッセイでテストした。これによって、陽性クローンと陰性クローンとを分離することができた。その比較は、陽性クローンの１つがＭＡＧＥ−１遺伝子からのヌクレオチド１−７３０を含有し、１つの陰性クローンがヌクレオチド１−７０６を含有していることを示した。これらの陽性および陰性クローンを比較したところ、１６のアミノ酸の領域が、抗原性ペプチドを推定的に含有しているものと同定された。この配列は次の通りである。この配列に基づき、第１組の実験を行い、ここでは、合成ペプチドを製造し、その、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１によってトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞を溶解刺激可能にする能力をテストした。陽性１２ｍｅｒは、次のように同定された。即ち、この１２ｍｅｒを裁頭する（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）ことによって、次のノナペプチド溶解を最も良く刺激するものであると同定された。最大の溶解の半分は、ペプチド濃度が１０ｎＭである場合に観察された。ここには提供されないが、ここに参考として添付されている１９９４年２月１５日出願の第０８／１９６，６３０号に記載されている実験において、次のペプチド、も又、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１によって提示され、ＣＴＬ８２／８２等の様々な細胞溶解Ｔ細胞クローンによって溶解されることが判った。例５ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１によって提示される２つの別々のペプチドの同定は、患者におけるＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の発現を測定するためのアッセイの望ましさを示唆するものであった。ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１に対する抗体が入手不能であるので、血清学的なテストは実施可能なオプションではない。しかし、ポリメラーゼ連鎖反応（”ＰＣＲ”）が１つの代替手段を提供した。その後、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマ・システムに基づくＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の発現のための実施可能で有効なＰＣＲアッセイが開発される。ブラウニング（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２８４２（１９９３）に概略記載されているモデルを使用した。この参考文献は、その３’末端がＨＬＡ分子のコード化配列に対して特異性を有するオリゴヌクレオチド・プライマの使用を記載している。この方法を使用して、プライマ、と、とを合成した。この方法をテストするため、患者からの様々なサンプルを使用した。トータルＲＮＡを、ディヴィス（Ｄａｖｉｓ）他、ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８６）、ｐｐ１３０の周知のグアニジン・イソチオシアン酸塩法を使用して、抽出した。ｃＤＮＡ合成のために、２ｕｇのＲＮＡを水と、４ｕｌの５ｘ逆転写酵素緩衝液とで希釈した。２０ｕｌの反応容量に、１０ｍＭのｄＮＴＰと、２ｕｌのオリゴ（ｄＴ）の２０ｕＭ溶液と、２０ＵのＲＮａｓｉｎと、２ｕｌの０．１Ｍジチオトレイトールと、２００ＵのＭｏＭＬＶ逆転写酵素とを、それぞれ添加した。この混合物を、４２℃で６０分間培養した。ｃＤＮＡを増幅するために、１％のｃＤＮＡ反応物に、５ｕｌの１０ｘ熱安定ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、それぞれ１ｕｌの１０ｍＭｄＮＴＰと、それぞれ０．５ｕｌの８０ｕＭのプライマ溶液（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６及び７）と、１ＵのＤｙｎａＺｙｍｅと、水とを、５０ｕｌの最終容積に添加した。このＰＣＲを、３０サイクル行った（９５℃で１分間、６２℃で１分間、７２℃で２分間）。その生成物を、１／５００に希釈した。次に、５ｕｌの１０ｘ熱安定ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、それぞれ１ｕｌの１０ｍＭｄＮＴＰと、それぞれ０．５ｕ１の８０ｕＭのプライマ溶液、及びと、１ＵのＤｙｎａＺｙｍｅとを添加した１ｕｌの希釈ＰＣＲ生成物を使用して第２のＰＣＲを行った。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８及び配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９は、前記第１組のプライマ、即ち、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯＳ）：６及び７に対して内部に位置するヌクレオチドを表す。５０ｕｌに水を添加し、２０サイクルのＰＣＲを行った（９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間）。これらＰＣＲ生成物を、ＴＡＥ緩衝液中にて１．５％のアガロース・ゲル上で細分化した。この方法を、２つの別々の組の実験に使用した。これらの内の第１の実験において、前述の方法で作り、ＨＬＡ分子に対して複合化された配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４又は配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５に対して細胞溶解Ｔ細胞クローンによって溶解されたトランスフェクタント（移入体）をテストした。陽性のトランスフェクタント（移入体）のすべてが、その表面にＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１分子を提示することが判った。ＰＣＲ生成物を産生しなかったすべてのサンプルは、陰性であるとした。これらの陰性サンプルを使用した更に別の実験において、上述したＰＣＲプロトコルを第２回目に使用したが、そのプライマはすべてのＨＬＡ−Ｃ配列に共通の配列に基づくものであった。ここに参考文献として添付するゼモール（Ｚｅｍｍｏｕｒ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：９３７（１９９２）参照。前記陰性サンプルは、異なった、即ち、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１ＨＬＡ−Ｃサブタイプ以外を発現する細胞であることが判った。例６前記第２組の実験において、ＰＢＬ又は腫瘍のいずれかの細胞がＨＬＡ−Ｃｗ^* １６０１を介してペプチドを提示する能力をテストした。これを行うために、患者から採取した細胞をハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）溶液中で洗浄し、５ｘ１０⁶ 細胞／ｍｌの割合で再懸濁した。これらを、室温で、１％のパラフォルムアルデヒドで１０分間処理することによって固定した。この固定後、これらをハンクス溶液中で２回洗浄し、１０％のヒト血清を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地中で再懸濁した。次に、これらの細胞を、３ｘ１０⁴ＰＢＬ又は１ｘ１０⁴腫瘍細胞で９６Ｖ−ボトム・ウェル中に分布させ、様々な濃度のペプチドを標識した（ｐｕｌｓｅｄ）。３７℃での２時間培養後、ＣＴＬｓ（１５００，１００ｕｌのＩｓｃｏｖｅ培地、１０％のヒト血清、２０Ｕ／ｍｌの組換えヒト１Ｌ−２）を添加する前に、細胞を２回洗浄し、ＷＥＨＩ−１６４細胞からのＴＮＦの放出を測定した。このアッセイの詳細については、ここに参考文献として添付するトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５（１９９２）参照。このアッセイのエフェクタ細胞は、ＣＴＬ８２／３５からのものであった。その結果は、下記の表に要約されている。ＴＮＦは、前述したＰＣＲアッセイに基づき、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１に対して陽性であると判定された患者から派生し、ペプチドを標識（ｐｕｌｓｅｄ）されていた標的細胞が存在している場合にのみ産生された。表１に要約するこれらの実験は、ペプチドを標識（ｐｕｌｓｅｄ）され、グルタルアルデヒドで固定され、その後、細胞溶解Ｔ細胞系ＣＴＬ８２／３５による認識のテストを行った細胞を使用した。前記表が示すように、ＴＮＦは、前述したＰＣＲアッセイにおいてＨＬＡ− Ｃｗ^*１６０１に対して陽性であると判定されペプチド標識された（ｐｕｌｓｅｄ）標的細胞が存在する場合にのみ産生された。例７このＨＬＡタイプに対して約８％のサンプル（９９の内７）が陽性であり、これらの陽性サンプルの内の５つについて、上述したように、ＣＴＬ溶解をテストした。表１に示されているように、すべてが溶解を誘発した。これに対して、ＨＬＡ− Ｃｗ^*１６０１に対して陽性でなかった４名の患者からのサンプルは、ＣＴＬｓによる溶解を誘発しなかった。例８別の実験において、エプスタイン・バールウイルスによって感染されたＭＺ２リンパ芽細胞を⁵¹Ｃｒ放出アッセイに使用した。”ＭＺ２−ＥＢＶ”と称する、これらの感染細胞を、⁵¹Ｃｒラベル化し、次に、１〜５０００ｎＭの範囲の濃度で、ＭＡＧＥ−１ペプチドの存在下において３０分間培養した。ＣＴＬｓ（ＣＴＬ８１／１２又はＣＴＬ８２／３５）を３：１のエフェクタ／標的比で添加した。４時間後、クロム放出を測定した。その結果は、ＣＴＬ８１／１２による溶解（図２Ａ）とＣＴＬ８２／３５による溶解（図２Ｂ）とを示す、図２Ａ，２Ｂに示されている。矢印は、ペプチドなしで培養された、ＭＺ２−ＭＥＬ４３（Ｂ⁺）とＭＺ２リンパ芽細胞（Ｂ^- ）の溶解レベルを示している。上述した実験は、特定の結合モチーフを備えたペプチドが、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１に対する結合に必要であることを示唆している。この式、即ち、（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０）は本発明の一特徴構成である。ＳＥＱＩＤＮＯ：１０において、Ｘａａは、あらゆるアミノ酸を指すが、以下のものが好ましい。ポジション１においてＡｌａ又はＳｅｒポジション３においてＴｙｒ又はＡｒｇポジション４においてＧｌｙ又はＡｌａポジション５においてＧｌｕ又はＶａｌポジション６においてＰｒｏ又はＰｈｅポジション７においてＡｒｇ又はＬｅｕポジション８においてＬｙｓ又はＡｌａ。この式の分離ペプチドは、後述するように、例えば、癌の診断に有用である。ここに引用した参考文献から、患者が、事実、自分の腫瘍に対して細胞溶解Ｔ細胞を発達させるということが知られている。ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１陽性の患者の場合、これらの細胞溶解Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０ｌと、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０、最も好ましくは配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４又は配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５のペプチドとの複合体を提示するすべての細胞を認識し、これに反応する。この認識は、ＣＴＬｓによるＴＮＦの放出、ＣＴＬｓの増殖、及び／又は標的細胞に含まれるなんらかの物質、例えば、放射性クロム（⁵¹Ｃｒ）の放出を介してモニタすることができる。従って、本発明の一態様において、ＰＢＬＳを含有する対象体の血液のサンプルを、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１提示細胞に接触させる。これらの細胞は、例えば、標識（ｐｕｌｓｉｎｇ）によって、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０のペプチドと接触される。これらのペプチドは、ＨＬＡ −Ｃｗ^*１６０１分子と複合化し、前記ＰＢＬ含有サンプル中のすべてのＣＴＬｓがそれに反応する。従って、本発明の一態様は、腫瘍細胞のみがＭＡＧＥ派生ＴＲＡｓを提示するとい事実に基づいて、腫瘍特異性ＣＴＬｓを測定する診断アッセイである。これに対する１つの例外は、精巣細胞であると思われるが、対象体の血液中のＣＴＬｓが精巣細胞と反応しているという可能性を除去することは容易である。又、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１陽性細胞を、ＭＡＧＥ遺伝子、例えば、ＭＡＧＥ−１、でトランスフェクションして、所望の複合体を産生することも可能である。本発明の更に別の態様において、ここに開示したペプチドは、単独で使用してもよいし、あるいは、キャリア・タンパク質に複合化し、免疫原として使用してもよい。このような免疫原は、単独で使用してもよいが、薬学的に許容可能なアジュバントと併用することが好ましい。これらの抗体は、特定のペプチドが細胞上で提示されるか否か、又、そのどの部分で提示されるかを決定する診断アッセイにおいても有用である。ここでも、そのような提示は癌を示す。本発明の分離核酸分子は、前述したように、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の発現を測定するプローブとしても有用である。ＨＬＡ分類が、例えば、移植やその他の分野における組織分類において重要であることはほとんど言うまでもない。従って、この側面において使用できる利用可能な物質があることは有用である。前記ＰＣＲ作業において使用したプライマは、単独または組合せ使用によって、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅アッセイに利用可能である。これらは、又、放射性又は非放射性ラベル化されることにより、その他の診断アッセイにおいて、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１が発現されているか否かを測定するプローブとしても利用可能である。従って、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯＳ）：６，７，８及び９を、 ”ワン・ポット”又はキットとして、診断用試薬として使用することができる。キットが特に好ましく、ここでは、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯＳ）：６，７及び配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯＳ）：８，９が、それぞれ別々の部分として１つのパッケージ手段に納められ、増幅やその他のフォーマットに使用される。特定の実施形態においては、これらのキットに、更に、Ｔａｑポリメラーゼ等のポリメラーゼを含ませてもよい。上述した実験は、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１が、腫瘍拒絶抗原としてＭＡＧＥ− １派生ペプチドを提示し、これによって提示細胞を融解することを例証するものである。この発見には、後述するように派生効果がある。例えば、ＣＴＬクローン８１／１２は、問題の複合体に対して特異的なＣＴＬｓを代表するものである。このようなＣＴＬｓを対象体に投与することは、その患者が異常細胞上にＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１を提示する場合に、治療的に有用であると期待される。当業者は、必要なＣＴＬｓを生体外で、開発することができる。具体的には、血液細胞などの細胞のサンプルを、前記複合体を提示し、特定のＣＴＬの増幅を誘発することが出来る細胞に接触させる。標的細胞は、前述したタイプのＣＯＳ細胞などのトランスフェクタント（移入体）であってよい。これらのトランスフェクタント（移入体）は、その表面に所望の複合体を提示し、対象のＣＴＬと組合せられた時、その増殖を刺激する。ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の配列がＧＥＮＢＡＮＫとＥＭＢＬとを通じて公知であることは既に指摘した。又、ＭＡＧＥ−１の配列と、その分離のためのプロトコルの詳細は、前述した、ここにその両方の全体を参考文献として添付する前記ＰＣＴ出願と、ファン・デア・ブルッゲン（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他によって提供されている。ここで使用されているもののようなＣＯＳ細胞は、広く入手可能であり、その他の適当な宿主細胞も広く入手可能である。養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒ）と称される治療方法（グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７（１９８６）：リッデル（Ｒｉｄｄｅｌ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：２３８（７−１０−９２）；リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３−１４１０（１９９１）；カスト（Ｋａｓｔ）他，Ｃｅｌｌ５９：６０３−６１４（１１−１７−８９））について詳述すると、所望の複合体を提供する細胞を、ＣＴＬｓと結合させ、この細胞に対して特異的なＣＴＬｓを増殖させる。つぎに、この増殖したＣＴＬｓを、前記特定の複合体を提示している前記異常細胞によって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に投与する。すると、ＣＴＬｓが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を達成する。上述の治療方法は、対象体の異常細胞が前記ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１／ＭＡＧＥ−１派生ペプチド複合体を提示することを前提としている。これは、極めて容易に判断可能である。例えば、前述したトランスフェクタントを使用してＣＴＬｓを同定し、一旦分離した後は、そのような細胞を、対象体の異常細胞のサンプルについて使用し、生体外で溶解を測定することができる。溶融が観察されれば、このような治療において特定のＣＴＬｓを使用することによって、前記異常細胞に関連する状態を軽減することが可能である。より単純な方法は、標準式アッセイを使用して異常細胞のＨＬＡ表現型を調べ、例えば、ＰＣＲ法を使用した増幅によってＭＡＧＥ−１の発現を測定するものである。養子移入のみが本発明によって利用可能な治療方法ではない。種々のアプローチを使用して、生体内でＣＴＬｓを誘発することも可能である。１つのアプローチ、即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用については既に記載した。このアプローチにおいて使用される細胞としては、前記複合体を正常時において発現する細胞、例えば、照射済みメラノーマ細胞や、前記複合体の発現に必要な前記遺伝子の１つ又は両方によってトランスフェクションされた細胞、等を使用出来る。このアプローチの一具体例は、チェン（Ｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１１０−１１４（１９９１年１月）に記載されており、ここには、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクション細胞の治療法における使用が示されている。様々な細胞タイプを使用することができる。同様に、問題の遺伝子の片方または双方を担持するベクターを使用することができる。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらのシステムにおいて、問題の遺伝子は、例えば、ワクシニアビールスやバクテリアＢＣＧ等によって担持され、これらの物質が実質的に（ｄｅｆａｃｔｏ）宿主細胞を”インフェクト”する。その結果、得られる細胞は、問題の複合体を提示し、自己移植ＣＴＬｓによって認識され、増殖する。ＭＡＧＥ−１自身を、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１提示細胞への組み込みを促進するアジュバントと結合させることによっても、類似の効果を達成することができる。前記酵素は、プロセッシングされてＨＬＡ分子のペプチド・パートナーを生成する。以上の記載は、”異常細胞”及び”細胞異常”に言及している。これらの用語はその最も広い解釈において使用されており、問題の細胞が、それらの特定タイプに属する正常な細胞と異なっていることを示す少なくとも１つの特性を示しているすべての状態を指すものである。異常特性の例としては、例えば、組織的変化や生化学的変化が含まれる。細胞異常には、メラノーマ等の腫瘍、自己免疫疾患などが含まれる。本発明のその他の側面は当業者にとって明らかであろう。したがって、ここでは繰り返す必要はない。ここに使用した用語および表現は、説明のための用語であって限定的なものではなく、従って、これらの用語および表現の使用において、図示記載された特徴構成または、その均等物またはそれらの一部を除外する意図はなく、本発明の範囲内において様々な変形態様が可能であると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/48 ＭＣ１２Ｑ 1/02 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/48 33/566 33/53 33/574 Ａ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０８／２９２，４９２ (32)優先日平成６年８月18日(1994．8．18) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者クーリ，ピエールベルギー国ビー―1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ワイルドマン，クロードベルギー国ビー―1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ベール，パスカーレベルギー国ビー―1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ブーン―ファラー，ティエリーベルギー国ビー―1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４のペプチドとの複合体に対して特異的な治療剤によって処置する対象体を同定するための方法であって、以下の工程を有する、（ｉ）対象体からの異常細胞サンプルを、前記複合体に対して特異的な細胞溶解Ｔ細胞に接触させる工程、そして（ｉｉ）前記異常細胞サンプルの少なくとも一部の溶解を、前記処置対象体を示すものと判定する工程。２．細胞異常を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４のペプチドとの複合体をその表面に提示する細胞に対して細胞溶解Ｔ細胞応答を誘発する薬剤を、表面上に前記複合体を提示する異常細胞に対する応答を誘発するのに十分な量、前記対象体に対して投与する工程を有する方法。３．請求項２の方法であって、前記細胞異常は癌である。４．請求項３の方法であって、前記癌はメラノーマである。５．請求項２の方法であって、前記薬剤は、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４の前記ペプチドをコード化するベクターを有する。６．請求項５の方法であつて、前記薬剤は、更に、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０をコード化するベクターを有する。７．請求項５の方法であって、前記ベクターは、更に、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０をコード化する。８．請求項２の方法であって、前記薬剤は、その表面に前記複合体を提示する非増殖性細胞のサンプルである。９．細胞異常を処置する方法であって、異常細胞の表面上におけるＨＬＡ−Ｃ −クローン１０と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４のペプチドとの複合体の提示によって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に対して、前記複合体に対して特異的な細胞溶解Ｔ細胞を、前記異常細胞を溶解するのに十分な量、投与する工程を有する方法。１０．請求項９の方法であって、前記細胞異常は癌である。１１．請求項１０の方法であって、前記癌はメラノーマである。１２．請求項９の方法であって、前記細胞溶解Ｔ細胞は、自己由来である。１３．ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：４のペプチドとの複合体に対して特異的な分離細胞溶解Ｔ細胞。１４．その表面上にＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４のペプチドとの複合体を提示する異常細胞を同定する方法であって、異常細胞のサンプルを前記複合体に対して特異的な細胞溶解Ｔ細胞に接触させる工程と、前記異常細胞の溶解を、前記複合体を提示する細胞として判定する工程とを有する方法。１５．以下のグループから選択された分離ペプチド、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３、と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４。１６．ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４の分離ペプチドとの分離複合体。１７．以下の式の分離ノナペプチド、ＸａａＡｌａ（Ｘａａ）₆Ｌｅｕ（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０）ここで、Ｘａａはアミノ酸である。１８．請求項１７の分離ノナペプチドと、薬剤的に許容可能なアジュバントとを有する免疫原組成物。１９．請求項１８の免疫原組成物であって、前記分離ノナペプチドは、キャリア・タンパク質に複合化されている。２０．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６，配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：７，配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９からなるグループから選択された、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の発現の判定に有用な分離核酸分子。２１．ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の発現の判定に有用なキットであって、以下を有する、（ａ）配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：７を有する第１試薬、（ｂ）配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９を有する第２試薬、そして（ｃ）前記第１及び第２試薬を保持するパッケージ手段。２２．請求項２１のキットであって、更に、別体のポリメラーゼのポーションを有する。２３．サンプル中におけるＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の発現を判定するのに有用な組成物であって、以下を有する、（ａ）配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：７との混合物、又は、（ｂ）配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９との混合物。