JP3180123B2 - Ｇａｇｅ腫瘍拒絶抗原をコードする、単離、トランケート核酸分子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願 この出願は、1995年１月10日出願の特許出願番号第08
/370,648の一部継続出願であり、1994年５月27日出願の
特許出願番号第08/250,162の継続出願であり、1993年７
月22日出願の特許出願番号第08/096,039号の一部継続出
願である。これらの出願は全て参照として導入される。

【０００２】 発明の分野 本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子
に関し、特に本発明は、その腫瘍拒絶前駆体が、とりわ
けHLA−Cw6分子で表示される、少なくとも１つの腫瘍拒
絶抗原に変えられる遺伝子に関する。問題のこの遺伝子
は、他の公知の腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列に関連す
るとは思われない。また、本発明は、HLA−Cw6分子によ
って表示されるペプチド及びその使用に関する。また、
本発明の一部はHLA−A29分子によって表示されるペプチ
ド及びその使用である。

【０００３】 背景及び従来技術 外来の、即ち異種物質を認識して反応する哺乳動物の
免疫系の過程は複雑なものである。この免疫系の重要な
一面は、Ｔリンパ球又は「Ｔ細胞」応答である。

【０００４】 この応答は、Ｔ細胞が認識して、ヒト白血球抗原（HL
A）、又は主たる組織適合性複合体（MHCs）と称する細
胞表面分子とペプチドとの複合体と相互反応する事を必
要とする。このペプチドは、HLA/MHC分子を表す細胞に
よって変化させられる巨大分子由来のものである。これ
に関しては、メール等（Male et al.）のAdvanced Immu
nology（J.P.Lipincott Company.1997）、特に６〜10章
参照。Ｔ細胞とHLA/ペプチド複合体との相互反応は、HL
A分子とペプチドの特定の組合せの為の特異なＴ細胞を
要求する事を制限する。特異なＴ細胞が存在しなけれ
ば、そのパートナー複合体が存在してもＴ細胞応答は存
在しない。

【０００５】 同様に、特異な複合体が存在せずＴ細胞が存在しても
応答は存在しない。この機構は、外来物質に対する免疫
系応答、自己免疫異常及び細胞異常に対する応答に含ま
れる。多くの研究が、蛋白質がHLA結合ペプチドに変え
られるこの機構について注がれてきた。これに関して
は、バリナガ（Barinaga）、Science 257:880（199
2）：フレモント等（Fremont et al.）、Science 257:9
19（1992）：マツムラ等（Matsumura et al.）、Scienc
e 257:927（1992）：ラトロン等（Latron ey al.）、Sc
ience 257:964（1992）を参照。又、Eegelhard,Ann.Re
v.Immunol.12:181−207（1994）を参照。

【０００６】 Ｔ細胞が細胞異常を認識するこの機構は、又癌に係わ
るものであった。例えばPCT出願PCT/US92/04354（1992
年５月22日出願、1992年11月26日公開（参考として組み
入れられる））には、細胞表面で発現するペプチドに変
えられ、特異CTLs（細胞溶解性Ｔリンパ球、以下「CTL
s」という）による腫瘍細胞の溶解へと導く事の出来る
一連の遺伝子が開示されている。この遺伝子は、「腫瘍
拒絶抗原前駆体」、即ち「TRAP」分子をコードすると言
われ、それから得られるペプチドは「腫瘍拒絶抗原」即
ち「TRAs」と称される。

【０００７】 この一連の遺伝子に関する詳しい情報については、ト
ラバーサリ等（Traversari et al.）、Immunogenetics
35:145（1992）：ファン デル ブルッゲン等（van d
er Bruggen et al.）、Science 254:1643（1991）を
参照。又、米国特許第5,342,774号明細書を参照。

【０００８】 参考として組み入れられる米国特許出願第938,334号
の開示では、MAGE−１遺伝子は、HLA−A1分子で表され
るノナペプチドに変えられる腫瘍拒絶抗原前駆体をコー
ドすると説明されている。この引用例は、特定のHLA分
子に対する特定のペプチドの公知の特異性を与えた事を
教示し、１つのHLA分子に結合し、他には結合しない特
定のペプチドを期待させる。このことは、異なる固体は
異なるHLA表現型を保有するので重要である。結果とし
て、特異HLA分子のパートナーとしての特定ペプチドの
同定は、診断的且つ治療的結果を持つが、これらは、そ
の特定のHLA表現型の個体にとって意味があるだけであ
る。細胞異常が１つの特定のHLA表現型に限定されるも
のではなく、目標とされる治療が、組織における異常細
胞の表現型の知識を要求するが故に、この分野では更に
研究の必要性が存在する。

【０００９】 参考として組み入れられる米国特許出願第8,446号（1
993年１月22日出願）では、MAGE−１発現生産物は、第
２のTRAに変えられると言う事実が開示されている。こ
の第２のTRAはHLA−Ｃクローン10分子と表される。この
開示は、与えられたTRAPは、複数のTRAsを生成する事が
出来る事を示す。

【００１０】 ここに参考として組み入れられる米国特許出願第994,
928号（1992年12月22日出願）では、チロシナーゼ、或
る種の正常細胞（例えば、メラノサイト）によって産生
される分子は腫瘍細胞に変えられ、HLA−A2分子で表さ
れるペプチドを生成する事が教示されている。

【００１１】 全体を参考として組み入れる米国特許出願第08/032,9
78号（1993年３月18日出願）では、チロシナーゼ由来の
ものではない第２のTRAは、HLA−A2分子で表される事が
教示されている。このTRAは、TRAP由来のものである
が、非−MAGE遺伝子によりコードされている。この開示
は、特定のHLA分子は、異なる資源由来のTRAsを表示し
てもよい事を示す。

【００１２】 ここに参考として組み入れられる1993年６月17日出願
の米国特許出願08/079,110号では、関連のない腫瘍拒絶
抗原前駆体、所謂「BAGE」前駆体が開示されている。こ
のBAGE前駆体はMAGEファミリーとは関連がない。上で引
用された論文、特許及び特許出願で提示される研究は、
大部分がMAGEファミリー遺伝子及び関係のないBAGE遺伝
子に関するものである。

【００１３】 ここにおいて、付加的腫瘍拒絶抗原前駆体が、細胞に
よって発現される事が見出された。これらの腫瘍拒絶抗
原前駆体を、「GAGE」腫瘍拒絶抗原前駆体と称する。こ
れらは、MAGEファミリー遺伝子ともBAGE遺伝子とも同族
関係を示さない。斯くして、本発明は、TRAPsをコード
する遺伝子、腫瘍拒絶抗原前駆体それ自身、及びこれら
の利用に関するものである。

【００１４】 この様に、本発明の他の対象物は、何処でも９〜16の
アミノ酸長であり、配列： 配列番号:23 （ここで、Xaaは、任意のアミノ酸である）。これらの
ペプチドは折り曲げられて、そして／又はHLA−A29分子
に結合するプチドに加工される。 本発明は、更に以下の記述に従って詳述される。

【００１５】 好適な実施態様の詳細な説明 実施例１ メラノーマ細胞株、MZ2−MELを、標準の手順で、患者
のMZ2から採取されたメラノーマ細胞から株化した。こ
の細胞株は、例えば、ここにその全体を参考として組み
入れるPCT出願PCT/US92/04354（1992年５月22日出願、1
992年11月26日公開）に開示されている。この細胞株が
株化されたら、そのサンプルを放射線照射し、これを非
増殖性にした。これらの照射細胞を、それらに対して特
異な細胞溶解性Ｔ細胞クローン（CTLs）の単離に使用し
た。末梢血単核細胞（PBMCs）のサンプルを患者のMZ2か
ら採取し、照射メラノーマ細胞に接触させた。この混合
物を、メラノーマ細胞の細胞溶解につき観察し、メラノ
ーマ細胞によって表示されるペプチドとHLA分子の複合
体に対する特異なCTLsが、サンプル中に存在した事を示
した。

【００１６】 使用したこの細胞溶解アッセイは、ヘリン等（Herin
et al.）、Int.J.Cancer 39:390−396（1987）に従
ったクロム放出アッセイであり、その既述は参考として
組み入れられる。このアッセイをここに記述する。目標
メラノーマ細胞は、in vitroで育成し、次いでDMEM中
に10⁷細胞/mlで再懸濁し、10mM HEPESと30％FCSで補充
し、Na（⁵¹Cr）O₄の200μCi/mlで、37℃で45分間培養し
た。標識化細胞をDMEMで３回洗浄し、10mM HEPESを補
充した。これを、次いで10mM HEPESと10％FCSで補充し
たDMEM中に再懸濁し、その後、10³細胞を含む100μｌの
液を、96ウエルマイクロプレートに分散した。PBLsのサ
ンプルを100μｌの同じ培地に添加し、アッセイを繰り
返し行った。プレートを、100gで４分間遠心分離に掛
け、８％C0₂雰囲気中で、36℃で４時間培養した。

【００１７】 プレートを再度遠心分離に掛け、上澄み液の100μｌ
の液を収集し、計量した。⁵¹Cr放出の割合は、以下の様
に計算した。 ％⁵¹Cr放出＝［（ER−SR）／（MR−SR）］×100 ここで、ERは、観察された、実験的⁵¹Cr放出、SRは、20
0μｌの培地単独での10³標準化細胞を培養する事によっ
て測定された自然放出、MRは、100μｌの0.3％トリトン
（Triton）Ｘ−100を添加して得られる最大放出であ
る。高いCTL活性を示したこれらの単核血サンプルを拡
張し、限界希釈を介してクローン化し、同じ方法を使用
して再度スクリーニングした。CTLクローンMZ2−CTL76/
6はこの様にして単離した。このクローンを以後「76/
6」と称する。

【００１８】 同じ方法を、メラノーマ細胞株同様に目標K562細胞を
試験するのに使用した。図１は、このCTLクローンが認
識してメラノーマ細胞株、即ちMZ2−MELであってK562で
はない株を溶解する事を示す。このクローンを、次い
で、上に述べたと同じ方法で、他のメラノーマ細胞株及
び自己由来EBV−形質転換Ｂ細胞に対して試験した。図
１は、エプシュタインバールウイルス（Epstein Barr
Virus）（EBV）で形質転換された自己由来Ｂ細胞は溶
解せず、しかもMZ2−MEL3.0はCTLクローン76/6で溶解さ
れるのに、抗原Ｆを発現しないこの細胞株MZ2−MEL.4F
−突然変異株は溶解しない事を示す。故に、このクロー
ンは、この抗原に対して特異的である事が明らかであ
る。 上に提示された結果は、HLA分子がTRAを表示する事と
は無関係である。

【００１９】 溶解した細胞株、即ちMZ2−MELは、HLA−A1、HLA−A2
9、HLA−B37、HLA−B44、HLA−Cw6及びHLA−Ｃクローン
10を発現する事が知られている。ここに報告されていな
いがこの実施例のプロトコールに従う実験では、HLA分
子A29、B44及びＣクローン10の発現を喪失したMZ2−MEL
の補助株（subline）を試験した。この補助株は溶解
し、存在している分子が、A1、B37又はCw6の１つである
事を示した。

【００２０】 実施例２ 76/6が、目標細胞と接触した時に腫瘍壊死因子（TN
F）を産生するかを決定するために、更に検討を行っ
た。使用した方法は、トラバーサリ等（Traversari et
al.）、Immunogenetics 35:145−152（1992）、によ
り開示された方法であり、その記述は参考として組み入
れられる。要するに、CTL株のサンプルを、培養培地
で、目的とする目標細胞のサンプルと組み合わせた。24
時間後、この培養からの上澄み液を除去し、次いでTNF
−感受性WEHI細胞上で試験した。

【００２１】 細胞株MZ2−MEL43、即ち引用参考例におけると同様に
上で検討されたMZ2−MEL細胞株の補助株は、極めて強力
な応答を与えた。これを次の実験に使用した。

【００２２】 実施例３ 実施例２の結果は、MZ2.MEL.43が目的物の目標抗原を
表示した事を示した。そこで、これをcDNAライブラリー
調製の為の全mRNA源として使用した。

【００２３】 全RNAは、この細胞株から単離した。この全mRNAを、
良く知られた技術に従って、オリゴ−dT結合キット（ol
igo−dT binding kit）を使用して単離した。mRNAを
確保したら、Not I部位を含むオリゴdTプライマーを使
用して、逆転写でcDNAに転写し、次いで第２ストランド
合成（second strand synthesis）を行った。このcDN
Aを、次いでBst XIアダプターに結合し、Not Iで消化
し、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−500HRカラム上でサ
イズ画分化し、Bst XI及びpcDNA−Ｉ−AmpのNot I部位
に間接的にクローン化した。この組み換えプラスミド
を、次いでDH5α大腸菌バクテリアの中にエレクトロポ
レーションした。100の組み換えバクテリアの合計1500
プールをマイクロウエルに播種した。殆ど全てのバクテ
リアは挿入物（insert）を含んでいたので、各々は約10
0のcDNAsを含んでいた。

【００２４】 それぞれのプールを飽和するまで増殖し、プラスミド
DNAを、アルカリ溶解及び酢酸カリウム沈殿で、フェノ
ール抽出なしで抽出した。

【００２５】 実施例４ 実施例３で開示したライブラリーの調製に続いて、cD
NAを、真核細胞に形質移入した。ここで述べられる形質
移入を繰り返して行った。COS−７細胞のサンプルを、1
5,000細胞／ウエルで、10％ウシ胎児血清で補充したダ
ルベッコ変性イーグルス培地（Dulbecco's modified
Eagles Medium）（DMEM）において、組織培養平底マイ
クロウエル中に、播種した。この細胞を、37℃で一昼夜
培養し、培地を除去して、10％Nu血清、400μg/ml DEA
E−デキストラン及び10μＭクロロキン、更に100ngのプ
ラスミドを含むDMEM培地の50μl/ウエルで置き換えた。

【００２６】 上で示した様に、この溶解研究は、HLA分子が抗原を
表示した事を立証しなかった。結果として、抗原（A1、
B37、Cw6）を表示出来たHLA分子のそれぞれのcDNAを、
細胞を同時形質移入する為に、別々に使用した。

【００２７】 具体的には、ライブラリーでの形質移入で使用したの
と同じプロトコールを使用して、pCD−SRαにクローン
化されたHLA−A1をコードする遺伝子の28ng、pcDNA−Ｉ
−AmpでのHLA−B37に対するcDNAの50ng、又はpcDNA−Ｉ
−AmpでのHLA−Cw6に対するcDNAの75ngを使用した。

【００２８】 形質移入は、複数のウエル中で行ったが、HLA−Cw6形
質移入体の500プールだけは、単一ウエル中で試験出来
た。37℃での４時間培養の後、培地を除去し、10％DMSO
を含むPBSの50nlで置き換えた。この培地を２分後に除
去し、10％FCSで補充したDMEMの200μｌで置き換えた。

【００２９】 培地でのこの変換の後、COS細胞を37℃で24−48時間
培養した。培地を、次いで捨て、1000〜3000のCLTクロ
ーン76/6細胞を、IL−２の20〜30U/mlで補充した10％プ
ールヒト血清を含むイスコーブ（Iscove）培地の100μ
ｌに添加した。上澄み液を24時間後に除去し、トラバー
サリ等（Traversari et al.）、Immunogenetics 35:
145−152（1992）により開示された方法（その記述は参
考として組み入れられる）により、WEHI細胞上でのアッ
セイで、TNF含有量を決定した。

【００３０】 HLA−A1で形質移入された1500プール、及びHLA−B37
で形質移入された1500プールは、15〜20pg/ml又は２〜6
pg/mlのそれぞれの濃度に対してTNF放出を刺激した。60
pg/mlより多く生成した一つのプールを除いて、大部分
のHLA−Cw6形質移入体は３〜20pg/mlを生成した。この
プールを次の研究の為に選択した。

【００３１】 実施例５ 選択したプールのバクテリアをクローン化し、600の
クローンを試験した。プラスミドDNAをそれらから抽出
し、上に述べたのと同じ方法でCOS細胞の新しいサンプ
ル中に形質移入し、この細胞を、CTLクローン76/6の刺
激の為に再度試験した。94の陽性クローンが見つかっ
た。これらの内の一つで、cDNAクローン2D6と称するも
のを更に試験した。比較試験では、COS細胞は、cDNAク
ローン2D6とHLA−Cw6、HLA−Cw6単独又は2D6単独で形質
移入した。対照細胞株MZ2−MEL Ｆ−とMZ2−MELF⁺も使
用した。CTL上澄み液中へのTNF放出は、上で引用した様
にWEHI細胞上でそれを試験する事によって測定した。生
き残っているWEHI細胞の数は、細胞の培養後の光学濃度
をMTTを使用して測定した。図２は、HLA−Cw6とcDNA−2
D6で形質移入したCOS細胞と、細胞株MZ2−MELF⁺が、CTL
クローン76/6からのTNF放出を刺激した事を示した。こ
れは、HLA−Cw6が対象のTRAを表示した事を示してい
る。

【００３２】 実施例６ cDNA−2D6を、公知の技術に従って配列分析した。配
列調査は、プラスミドインサートが、既知の遺伝子又は
蛋白質に対して相同性を示さない事を明らかにした。

【００３３】 配列番号１は、以後「GAGE」と称する同定された遺伝
子の為のcDNAヌクレオチド情報を表す。推定上のオープ
ンリーディングフレームは、この分子の51〜467の塩基
の所に位置している。この配列の最初の２つの塩基は、
cDNA配列を運ぶベクター由来のものであり、cDNAそれ自
身の一部ではない。

【００３４】 実施例７ cDNAの配列分析に続いて、実施例６の様に、正常組織
の細胞がこの遺伝子を発現したかを決定する為の実験を
行った。これを決定する為に、以下に示す様に、ノーザ
ンブロッティング（Northern blotting）を、組織及び
腫瘍細胞株上で行った。このブロッティング試験は、配
列番号１の完全な配列のcDNAを使用した。次いでPCRを
使用して結果を確認した。

【００３５】

【００３６】 実施例８ 上で述べたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）及びGAGE遺
伝子情報を利用して、正常組織と腫瘍についての詳細な
分析を行った。

【００３７】 先ず始め、全RNAを、慣用の方法を使用して特定のサ
ンプルから採取した。これを、cDNAの調製の為に使用し
た。このcDNAを作製する為に使用したプロトコールは、
逆転写酵素バッファー5xの４μｌ、各dNTPの１μｌ、
（10mM）、ジチオスレイトールの２μｌ（100mM）、dT
−15プライマーの２μｌ（20μｍ）、RNアジン（RNasi
n）（40単位／μｌ）の0.5μｌ及びMOMLV逆転写酵素（2
00単位／μｌ）の１μｌを一緒にする事を含む。

【００３８】 次に、6.5μｌのテンプレートRNA（１μg/3.25μｌ
水、又は合計２μｇのテンプレートRNA）を添加した。
混合物の全容量は20μｌであった。これを混合し、42℃
で60分間培養し、その後氷上で冷却した。次いで、合計
80μｌの水を添加し、合計100μｌとした。この混合物
を、PCRに使用するまで−20℃で貯蔵した。 PCRを行う為のプライマー ５′−AGA CGC TAC GTA GAG CCT−３′（セン
ス）及び ５′−CCA TCA GGA CCA TCT TCA−３″（アンチ
センス）

【００３９】 配列番号２及び３をそれぞれ使用した。この試薬は、
30.5μｌの水、５μｌのPCRバッフアー10x、１μｌの各
dNTP（10μＭ）、2.5μｌの各プライマー（20μＭ）、
及び0.5μｌの重合酵素「ダイナザイム（Dynazyme）」
（２単位／μｌ）を含み、全容量を45μｌとした。cDNA
の５μｌ全部を添加した（これは100ngの全RNAに相当し
た）。この混合物を組合せ、鉱油１滴で層状にした。こ
の混合物を熱循環系（thermocycler block）に移し、9
4℃に予熱し、増幅を30サイクル行った。各サイクルの
内容は次の通りであった。 最初の変性： 94℃、４分 変性： 94℃、１分 アニーリング： 55℃、２分 エクステンション： 72℃、３分 最終エクステンション： 72℃、15分

【００４０】 このサイクルの後、10μｌの液を、1.5％アガロース
ゲル上に流し、臭化エチジウムで染色した。

【００４１】 上に示したプライマーを使用して増幅されたcDNAは、
238塩基対合フラグメント（pair fragment）を生成す
る。汚染ゲノムDNAが存在しても、その増幅はない。

【００４２】 結果を以下の表２に示す。これらの結果は、GAGEを発
現する唯一正常な組織は睾丸であり、一方、メラノー
マ、肺、乳房、喉頭、咽頭、サルコーマ、睾丸精上皮
腫、膀胱及び結腸を含む多数の腫瘍がこの遺伝子を発現
する事を示している。この様にして、GAGE遺伝子の発現
NI対して、これらの腫瘍のどれについても分析が出来
る。

【００４３】

【００４４】 実施例９ 先の実施例で参照された核酸分子の同定は、HLA−Cw6
分子で表示され、GAGE遺伝子由来の免疫拒絶抗原の決定
に係わる更なる研究につながる。

【００４５】 発現ベクターpcDNA/Amp中のGAGEの完全なcDNAは、制
限内ヌクレアーゼNot I及びSpH Iで消化され、次いで、
供給者の指示に従って外ヌクレアーゼで消化した（Eras
e−ａ−base System,Promega）。この処理は、３′末
端で始まる、一連の漸進的欠失を発生した。

【００４６】 欠失生産物は、pcDNA I/AMPに戻し結紮され、次い
で、公知の技術を使用して、大腸菌株DH5alpha'IQの中
にエレクトロポレイトした。形質転換体はアンピシリン
（50μg/ml）で選択した。

【００４７】 プラスミドDNAを、各組み換え体クローンから抽出
し、次いで、HLA−Cw6をコードするベクターと共に、CO
S−７細胞中に形質移入した。プロトコールは上述のプ
ロトコールに従って使用した。

【００４８】 次いで、形質移入体をTNF放出アッセイ中でテストし
た。これは、ネガティブ及びポジティブなクローンの分
離を許した。全てのネガティブクローンは全てのGAGE配
列の欠失を示した。最も小さなポジティブクローンは、
配列番号１の最初の170ヌクレオチドを含んでいた。こ
の配列の分析は、オープンリーディングフレームがヌク
レオチド51で開始する事を示した。この様に、このフレ
ームはGAGE−TRAPの最初のアミノ酸をコードする配列を
含む。

【００４９】 実施例10 次いで、TRAペプチドをコードする領域を更に正確に
定義する為の追加実験を行った。ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）増幅は、これを行う為に使用された。

【００５０】 ２つのプライマーを合成した。最初のプライマーは、
BamH I部位の上流に位置するプラスミドベクターpcDNA
I/Amp内の配列に対して20mer相補的であった。第２のプ
ライマーは、３′末端で配列番号１のヌクレオチド102
〜119を含み、５′末端でXba I制限部位を含む11ヌクレ
オチドの範囲を含む29merであった。

【００５１】 増幅に続いて、PCR生産物をBamH I及びXba Iで消化
し、プラスミドpcDNA−３のBamH I−Xba I部位にクロー
ン化した。組み換え体コロニーは、実施例４によって、
COS−７細胞中に、HLA−Cw6をコードするcDNAで以て形
質移入され、上述のTNF放出アッセイがCTLを使用して行
われた。

【００５２】 TNF放出が観察され、「ミニ遺伝子」（minigene）がT
RAに対して処理された事を示した。ミニ遺伝子、即ち、
配列番号１のヌクレオチド１〜119、ヌクレオチド51〜1
19から始まるコード領域は、配列番号１のcDNAの最初の
23アミノ酸をコードした。この情報は、次に行う実験の
基礎として役立った。

【００５３】 実施例11 配列番号１の最初の23アミノ酸を基にして２つのペプ
チドを合成した。これらは、 配列番号:12 配列番号:13 であった。

【００５４】 各ペプチドを、以前にHLA−Cw6で形質移入したCOS−
７細胞中にパルスし、TNF放出が誘起されるかを決定す
る為に、CTL76/6と結合した。ペプチド（20μg/ml）
を、以前に24時間HLA−Cw6DNAで形質移入されているCOS
−７細胞に添加した。37℃で、90分間培養後、培地を捨
て、3000CTLを、IL−２を25単位/ml含む100μｌの培地
に添加した。18時間後、上澄み液のTNF含有量を、WEHI
−164−13細胞の毒性の決定を介してテストした。第二
のペプチド（配列番号13）は、30pg/mlより多いTNFを誘
発する事が分かった。一方、第一のペプチド（配列番号
12）は10pg/ml未満のTNFを誘発する事が分かった。第二
のペプチドは次の実験に使用した。

【００５５】 実施例12 配列番号13を基にして様々なペプチドを合成し、以下
に表示されるその内の幾つかについてテストした。これ
らのテストを行う為に、⁵¹Crラベル化LB33−EBV細胞（H
LA−Cw6ポジティブ）を、次のペプチドの１つで培養し
た。 配列番号:4 配列番号:5 配列番号:6 配列番号:7 配列番号:8 配列番号:12

【００５６】 ペプチド濃度を、図３で示され様に変化させ、CTL:LB
33−EBSの比（エフェクター：ターゲット比）を10:1と
した。⁵¹Cr放出は37℃での培養４時間後に決定した。ポ
ジティブ（“F⁺",MZ2−MEL.3.1）に対する溶解水準及び
ネガティブ（“F⁺",MZ2−MEL.2.2.5）コントロール細胞
は図３に示される。

【００５７】 配列番号４のオクタマーが最高のペプチドであり、腫
瘍拒絶抗原である事が明らかとなった事が分かった。こ
れは、オクタマーが、人間のMHC分子の表示中に含まれ
る事を報告した最初のものである。上述の、199での、
Ｈ−2K^b及びＨ−2K^K分子に対してエンゲルハートによっ
て報告されたマウス系に対しては幾つかの前例が存在す
る。又、配列番号５及び配列番号６のノナマーは、配列
番号４のオクタマーより少ない範囲であるにもかかわら
ず、CTL溶解を誘発した。

【００５８】 ここに報告されていない結果では、第二のCTLがテス
トされた（CTL82/31）。このCTLは、MZ2−Ｆを表示する
細胞を溶解する事が知られている。それは、配列番号４
のペプチドでのパルスに続いて、HLA−Cw6ポジティブ細
胞をまた溶解した。

【００５９】 実施例13 前記GAGEのDNAが独特のものであるかどうか見出すた
めに、MZ2−MEL43由来のRNAを用いて作製したcDNAライ
ブラリー（GAGEのクローニングに使用したのと同一のラ
イブラリー）を、GAGEのcDNA由来のプローブとハイブリ
ダイズさせた。プローブは配列番号１の20〜328番目の
部位間の308塩基対のPCR断片であった。20の陽性のcDNA
を得た。そのうちの６つを完全に配列決定した。それら
はGAGE配列と非常に高い関連性を有していたが、わずか
に異なっていた。６つのクローンのうちの２つは互いに
同一であったが、その他のものは互いに全く異なってい
た。したがって、GAGEとは異なるが、高い関連性を有す
る５つの新規の配列を同定した。それらをGAGE−２、
３、４、５及び６と呼び、それぞれを配列番号14〜18に
示す。その他の14のクローンを、５′末端について部分
的に配列決定したところ、その配列は６つのGAGEのcDNA
の１つに対応していた。

【００６０】 これらのcDNAとGAGE−１間の主要な差異は、配列番号
１のGAGE配列の379〜521番目の部位に位置する143塩基
対のストレッチ（stretch）が存在しないことである。
５′末端の最初の112塩基対がその他のGAGEと全く異な
っているGAGE−３を除いて、配列の残りの部分は19の異
なる部位におけるミスマッチ（mismatcn）を示したのみ
であった。このGAGE−３のcDNA領域は長い反復（repea
t）かつヘアピン構造を含んでいた。

【００６１】 腫瘍拒絶抗原前駆体に相当する推定したGAGE−１タン
パク質は、最後の７つの残基がGAGE−１の相同な残基と
は異なる、その他の５つのタンパク質よりもアミノ酸約
20個分長い（図５）。タンパク質配列の残りの部分は10
のミスマッチのみを示した。これらの中の１つは、配列
番号４の抗原ペプチドに対応する領域内に存在した。ペ
プチド配列をGAGE−３、４、５及び６について修飾を行
い、２番目の部位はＲに代わりＷにした。

【００６２】 実施例14 ２番目の部位における変化がペプチドの抗原性に影響
するかどうかを評価するために、６つのGAGEのcDNAのcD
NAを、独立して、HLA−Cw6のcDNAと共にCOS細胞に形質
移入し、形質移入体を、CTL 76/6による認識につい
て、前記のように試験した。GAGE−１及びGAGE−２を形
質移入した細胞のみが認識され、これは、GAGE−３、
４、５及び６によりコードされた修飾ペプチドは、本実
験の情況においては、抗原性でなかったことを示してい
る。前記のその他14のクローンの５′末端の配列解析
は、それらの中の７つが抗原性ペプチドをコードする配
列を含み、したがってそれらはGAGE−１又はGAGE−２の
いずれかに相当するだろうということを示した。

【００６３】 実施例15 腫瘍サンプルにおけるGAGE発現を試験するために前記
で使用したPCRプライマーは、GAGE−１又は２と抗原MZ2
Fをコードしないその他の４つのGAGEのcDNAとを識別す
ることができなかった。GAGE−１及び２を特異的に増幅
し、GAGE−３、４、５及び６を増幅しないプライマーの
新規なセットを調製した。これらのプライマーは以下に
示すとおりである。

【００６４】 これらのプライマーを、前記したように、以下に示す
温度条件でポリメラーゼ酵素を使用したRT−PCR反応に
おいて用いた。 94℃で40分間 94℃で１分間、56℃で２分間、72℃で３分間を30サイク
ル 72℃で15分間 この解析結果を表３に示す。

【００６５】

【００６６】 更なる研究において、全てのGAGE遺伝子を増幅する新
規のプライマーを設計し、正常組織において、それらは
全く発現しないことを確認した。これらのプライマーは
以下のとおりである。

【００６７】 VDE44及びVDE24プライマーを用いたPCRに関する限り
では、これらを厳密に使用した。結果を表４に示す。結
果より、精巣を除いて、正常組織は陰性であったことを
確認した。

【００６８】

【００６９】 実施例16 ここで報告しない作業において、細胞溶解性Ｔ細胞ク
ローンCTL22/23（Van der Eyndeら、Int.J.Cancre 4
4:634−640（1989）：参考としてここに導入する）は、
メラノーマ細胞MZ2−MEL.3.1.を認識しながったことが
判明した。このメラノーマ細胞ラインが、Van der Br
uggenらにより、Eur.J.Immunol.24:2134−2140（1994）
において、MHC分子、HLA−A29、HLA−B24、及びHLA−Cw
^＊1601の発現を失っていることが報告された。これらの
MHC分子の一つによるトランスフェクトによって、ライ
ンがCTL 22/23に感受性となるがどうかを決定するため
の研究がなされた。HLA−A29は、最初に試験された分子
である。このために、市販の抽出キットを使用しかつ指
示に従って、HLA−A29^＊細胞ラインMZ2−MEL.43からポ
リA⁺RNAを抽出した。標準方法を使用してmRNAをcDNAに
変換し、サイズ分画し、次いで、プラスミドpcDNA−I/A
mpのBst I及びNot I部位に単一方向で挿入した。プラス
ミドをE.コリー株DH5α５′IQ中にエレクトロプレート
し、アンピシリン（50μg/ml）で選択した。細菌をニト
ロセルロースフィルター上にプレートし、複写した。フ
ィルターを調製し、40℃において以下の配列を有する³²
P標識プローブを使用して、6xSSC/0.1％ SDS/1xのDeng
ardt's溶液中で一夜ハイブリダイゼイションした。 配列番号:19 プローブは、ほとんどのHLA配列の出発コドンを囲む
配列である。

【００７０】 フィルターは、室温で５分間それぞれ6xSSC中で二
度、43℃で6xSSC中で二度洗浄した。陽性の配列は、次
いで、以下のプローブによってスクリーニングした。 配列番号:20

【００７１】 このプローブは、³²Pで標識したものである。この配
列は、免疫学的に興味のある配列及びタンパク質のKaba
t Database（参考としてここに導入する）を参照する
ことによって決定すると、HLA−A29に特異的である。こ
のデータベースは、NCBI（USA）又はWeb Solte（イン
ターネット）WWW.NCBI.NLM.N1H.GOV.において入手可能
である。フィルターは、室温で５分間それぞれ6xSSCで
二度洗浄し、次いで42℃で二度、6xSSC（１回の洗浄当
たり５分間）で洗浄した。

【００７２】 実施例17 陽性のHLA−A29クローンが単離されると、上記DEAE−
デキストリンクロロキン法を使用して、これらをCOS−
７にトランスフェクトした。即ち、1.5x10⁴のCOS−７細
胞を、HLA−A29を含有するプラスミドpcDNA−I/Amp50n
g、及び上記GAGE配列の一つに対するcDNAを含有するcDN
A若しくはそれぞれプラスミドpcDNAα−I/Amp又はpcDSR
−α中の従来のMAGE又はBAGE配列の一つ100ngで処理し
た。トランスフェクタントは、次いで、37℃で24時間イ
ンキュベートした。

【００７３】 次いで、トランスフェクタントは、上記実施例４の最
後に説明した分析を使用して、CTLによるTNF産生を刺激
する能力について試験した。

【００７４】 この研究の結果を示す図７は、トランスフェクタント
として、GAGE−３、４、５及び６並びにHLA−A29のいず
れかを使用することによってTNF産生の高いレベルが達
成されることを示す。これとは対照的に、GAGE−１及び
２は、CTLクローン22/23を刺激しないことから、GAGE
3、４、５及び６は、HLA−A29分子によって提示される
抗原に対して処理されかつCT22/23によって認識される
ことが結論される。

【００７５】 実施例18 GAGE−３、４、５及び６がHLA−A29⁺細胞によって提
示されるペプチドに対して処理され、一方、GAGE−１及
び２は、そうでないという事実は、GAGE−３、４、５及
び６に共通し、GAGE−１及び２には存在しないアミノ酸
配列に関する推論されるアミノ酸配列の検討を示唆す
る。この配列は、以下のものとして特定される。 配列番号:21

【００７６】 このペプチドを成し、凍結乾燥し、次いで、水中にお
ける１容量のDMSO及び９容量の10mMの酢酸中に溶解し
た。この方法は、合成された他のペプチドに対して使用
し、以下で検討した。

【００７７】 ペプチド（配列番号21）を、上記で説明した方法に従
って、⁵¹Cr放出実験で試験した。このペプチドは、溶解
を引き起こすことが分かった。連続する欠失を調製し、
再び⁵¹Cr放出分析を使用して、溶解を引き起こす能力に
ついて試験した。この作業は、図９に説明した。溶解を
引き起こす最短のペプチドは、以下の通りであった。 配列番号:22

【００７８】 この配列は、GAGE−３〜６のすべてに共通する。詳細
に述べれば、GAGE−３のアミノ酸10〜18及びGAGE−４、
５及び６のアミノ酸９〜17がこのペプチドに対応する。

【００７９】 図９に示されるペプチドファミリーの番号、例えば、
配列番号21及び22で示される番号は、トーバート（Toub
ert）ら、「HLA−A29ペプチド結合モチーフ」、Abstrac
t No.4183,Ninth International Congress of Imm
unology,July23−29,1995,San Francisco,CA（参考と
してここに導入する）によって提示されるデータと一致
しない。トーバートらによれば、少なくとも、HLA−A29
と結合するペプチドの３位にPhe残基が必要である。こ
こに示されるように、そのような場合には該当しない。

【００８０】 前述のサンプルは、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする
核酸分子の単離を示す。この「TRAP」をコードする分子
は、然しながら、上に示した引用例に記載された、以前
に開示されたMAGE及びBAGEコード配列とは相同ではな
い。故に、本発明の一観点は、配列番号１〜６及びその
フィラグメント、例えば、ヌクレオチド１〜170、及び
配列番号１の51〜170、又は腫瘍拒絶抗原に加工される
その他のフラグメントで示すヌクレオチド配列を含む単
離核酸分子である。この配列番号１〜６の配列は、引用
例に開示されたそれら遺伝子のいずれの配列と比較して
も分かる通り、MAGEでもなければBAGEコード配列でもな
い。また、本発明の一部は、非−MAGE及び非−BAGE腫瘍
拒絶抗原前駆体をコードするが、ストリンジェント条件
下において前述開示の配列番号１のヌクレオチド配列を
含む核酸分子に対して交雑する核酸分子でもある。ここ
で使用される「ストリンジェント条件」と言う言葉は、
当該分野においてはよう知られているパラメーターであ
り、更に詳しくは、ここで使用される「ストリンジェン
ト条件」とは、1MNaCl、１％SDS及び10％デキストラン
硫酸中での、65℃、18時間でのハイブリダイゼーション
を意味する。この後、2xSSCで、５分間、室温でのフィ
ルターの２回洗浄及び、65℃で、2xSSC、0.1％SDSで、3
0分間の１回洗浄が行われる。他の条件、試薬等が使用
でき、同じか又はより高い程度のストリンジェンシーと
なる。当業者は、この様な条件についてはよく知ってい
るであろうから、ここには開示しない。

【００８１】 本発明は、原核（例えば、大腸菌）、又は真核（例え
ば、CHO又はCOS細胞）である宿主細胞及び細胞株を形質
移入するのと同様に、発現ベクターにおける配列の使用
を包含する。発現ベクターは、関連配列、即ち上に開示
されたそれらがプロモーターに操作的に結合される事を
要求する。ヒト白血球抗原HLA−Cw6及びHLA−A29共に、
それらの遺伝子由来の腫瘍拒絶遺伝子を表示する事が見
出されているので、発現ベクターも又HLA−Cw6又はHLA
−A29の１つをコードする核酸配列を含むことが出来
る。ベクターが両方のコード配列を含む場合は、いずれ
か１つを正常に発現しない細胞を形質移入するのに使用
出来る。腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列は、例えば、宿
主細胞が既にHLA−Cw6及びHLA−A29の１つ又は両方の発
現する時は、単独で使用出来る。勿論、使用する事の出
来る特定の宿主細胞についての制限は存在しない。２つ
のコード配列を含むベクターは、所望ならばHLA−A29又
はHLA−Cw6発現細胞で使用され得る如くに、腫瘍拒絶抗
原前駆体の遺伝子はHLA−A29又はHLA−Cw6を発現しない
宿主細胞で使用出来る。

【００８２】 本発明は又、当業者が所望の発現ベクターを調製出来
る様な所謂発現キットを包含する。その様な発現キット
は、前に論議したコード配列のそれぞれの少なくとも別
々の部分を含む。所望により、必要とされる前述の配列
が含まれる限りにおいて、他の成分を添加してもよい。

【００８３】 本発明の核酸分子及びTRAPsを、前述開示のMAGE及びB
AGEと区別する為に、本発明は、遺伝子とTRAPsのGAGEフ
ァミリーと称する。それ故、ここにおいて「GAGE」が使
用される時は常に、前述開示の配列によってコードされ
た腫瘍拒絶抗原前駆体を意味する。「GAGEコード分子」
及び類似の言葉は、核酸分子それ自身を述べるのに使用
される。

【００８４】 ここにおいて開示される発明は、多数の用途を有し、
その幾つかがここに開示される。第一に、本発明は、当
業者がTRAPの発現或いは腫瘍拒絶抗原の発現で特徴付け
られる、例えばメラノーマの様な疾患を診断する事を可
能とする。これらの方法は、TRAP遺伝子及び／又はそれ
ら由来のTRAs、例えばHLA−Cw6又はHLA−A29で表示され
るTRAの発現の決定を含む。前者の場合は、その様な決
定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含む任意の標準核酸決定
アッセイ又は標識ハイブリダイゼーションプローブを用
いたアッセイにより行う事が出来る。後者の場合は、TR
A及びHLAの複合体の為の結合パートナー、例えば抗体を
使用したアッセイが特に好ましい。他の方法は、上に開
示されたタイプのTNF放出アッセイである。このアッセ
イを行う為には、睾丸細胞は通常はGAGEを発現しないの
で、これらが存在しない事を確かめる事が好ましい。然
しながら、このことは、睾丸と他の細胞は常法により区
別する事が出来るから、必須ではない。又、非−睾丸性
サンプル中に睾丸細胞を存在させる事は、実際には不可
能である。

【００８５】 TRAP遺伝子の単離は又、TRAP分子それ自身、特に配列
番号２〜６によりコードされたアミノ酸配列を含むTRAP
分子の単離を可能とする。TRAとして、又はTRAとHLA、
例えばHLA−Cw6又はHLA−A29の複合体として存在した時
のこれら単離分子は、アジュバントの様な物質と結合し
て、TRAP分子の発現で特徴付けられる疾患治療に有用な
ワクチンを作ることが出来る。

【００８６】 アジュバントの例としては、フロイントの完全、不完
全なアジュバント、死菌百日咳微生物（killed B.pert
ussis organisms）（BCG）、又は、Bacille Calmente
−Guerin、Al（OH）_３、ムラミルジペプチド及びその誘
導体（例えばスクワレンの様な代謝性オイルに乳化され
る）、モノホスホリルリピドＡ（MPL）、キーホールリ
ムペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyani
n）（KLH）、QA−７、QA−19、及びQA−21（QS−21とも
いわれる）の様なサポニン抽出物（これらは、米国特許
第5,057,540号明細書に記載されており、ここに参照と
して導入される）、MTP−MF59、Ｎ−〔１−（2,3−ジオ
レオイロキシ）プロピル〕−N.N,N−トリメチルアンモ
ニウムメチルスルフェート（DOTAP）、カチオン性アン
フィフィルDOTMA（cationic amphiphile DOTMA）、DO
PEの様な天然ホスホリピド及びそれらの組合せが挙げら
れる。この列挙は、包括的なものを意味するものではな
く、当業者はこの列挙に意見を述べる事が出来る。全て
の追加のアジュバントはここに包含される。

【００８７】 更に、ワクチンは、それらの表面でTRA/HLA複合体を
表示する細胞、例えば非−増殖性癌細胞、非−増殖性形
質移入体等から調製出来る。細胞がワクチンとして使用
される全ての場合において、これらは、CTL応答を用意
するのに必要な成分の１つ又は両方のコード配列で形質
移入された細胞、又は形質移入なしに両分子を発現する
細胞であり得る。更に、TRAP分子、その会合TRAsは、TR
AとHLAの複合体同様に、当該分野において公知の標準的
な方法を使用して、抗体を産生するのに使用出来る。

【００８８】 ここで使用される「疾患」とは、腫瘍拒絶抗原前駆体
が発現するあらゆる病的状態を意味する。その様な疾患
の例には、癌、特にメラノーマがある。メラノーマは、
色素産生細胞の癌として良く知られている。

【００８９】 上に例示した様に、配列番号４で表示されたものの様
な腫瘍拒絶抗原は、本発明の一部である。又、本発明の
一部は、８〜16のアミノ酸を含む分子の様なポリペプチ
ドであり、このポリペプチドは配列番号４で示したアミ
ノ酸配列を含む。

【００９０】 実施例が示す通り、配列番号４のオクタマーより長い
これらのペプチドは、癌細胞を表示し、それによって表
示されるHLA−Cw6によって、配列番号４の腫瘍拒絶抗原
中に加工される。この表示は、複合体を表示する細胞に
接触した体液サンプルに存在する細胞溶解性Ｔリンパ球
による溶解へとつながる。同様に、配列番号22より長い
ペプチド、例えば配列番号21の様なペプチドは適当なTR
A中に加工され、HLA−A29ポジティブ細胞の様な癌細胞
によって表示される。

【００９１】 この様に、本発明の他の目的物は、何処においても９
〜16のアミノ酸の長さであり、配列： 配列番号:23 （ここで、Xaaは、任意のアミノ酸である）を含むペプ
チドである。これらのペプチドは折り曲げて、そして／
又はHLA−A29分子に結合するペプチドに加工される。こ
れらのペプチドが、腫瘍拒絶抗原に加工されるという事
実は、実施例で例示された。

【００９２】 この特性は、他のパラメータの関連性において、特に
メラノーマのようなガンの、病理学的な状態の診断を確
認する場合において、活用することができる。例えば、
研究者は血液または尿の中に抗体を加えて調べることに
より、生理学的な変化を観察することができ、かつこれ
により、本明細書に記載したCTL増殖法を用いてメラノ
ーマの診断を確認することができる。

【００９３】 それ自体で、本発明のペプチドを用いて、HLAタイプ
アッセイを行うことができる。よく知られていることで
あるが、皮膚移植、臓器移植などが必要な場合、移植片
が拒絶される可能性を最小にするように、HLAタイプの
確認を行わなければならない。本発明のペプチドを使用
して、個体がHLA−CW6またはHLA−A29陽性であるか否か
決定し、それにより適当なドナーを選択することができ
る。このタイプのアッセイは、実施が簡単である。本発
明のペプチドを対象となる試料に接触させ、それにより
該試料中の細胞と結合体が、試料を取り出した個体がHL
A−CW6またはHLA−A29陽性であるか否かを示すのであ
る。このようなアッセイを最適化するように、本発明の
ペプチド自体をラベルし、該ペプチドをラベルしたリン
カーに共役または他の結合をさせ、あるいは該ペプチド
を固相に固定するなどする。他の標準的な方法も、当業
者にとり明らかであろうし、本明細書に記載する必要は
ないであろう。

【００９４】 この開示を基にした治療手段は、TRA表現細胞、例え
ばHLA−A29又はHLA−Cw6細胞の溶解へと導く、被験者の
免疫系での応答を前提条件とする。その手段の１つは、
結果において異常細胞の表現型を持つ被験者に対する、
複合体に対して特異なCTLsの投与である。in vitroで
その様なCTLsを発生させる事は当業者の技術範囲内であ
る。特に、血球の様な細胞のサンプルは、複合体を表示
する細胞に接触させ、増殖の為の特異CTLを誘発する事
ができる。標的細胞は、例えば上に述べたタイプのCOS
細胞の様な形質移入体であり得る。これらの形質移入体
は、それらの表面において所望の複合体を表示し、目的
のCTLと結合した時に、その増殖を刺激する。ここで使
用した様なCOS細胞は、他の適当な宿主細胞同様に広く
利用できる。

【００９５】 養子免疫細胞移入と言われる治療法（Greenberg,J.Im
munol.136（５）:1917（1986）:Riddel et al.,Scien
ce 257:238（７−10−92）:Lynch et al.,Eur.J.Imm
unol.21:1403−1410（1991）:Kast et al.,Cell 59:
603−614（11−17−89））を詳述する為に、所望の複合
体を表示する細胞をCTLsと結合して、それらに特異なCT
Lsを増殖させる。増殖したCTLsを、次いで関連HLA分子
を含む特定の複合体を表示する或る種の異常細胞で特徴
付けられる細胞異常性を持つ被験者に投与する。このCT
Lsは異常細胞を溶解し、それによって所望の治療目的を
達成する。

【００９６】 前述の治療は、被験者の異常細胞の少なくとも幾つか
は、関連HLA/TRA複合体を表示する事を仮定している。
これは、関連する配列、この場合はGAGE配列のRNA発現
細胞の同定法及び特定のHLA分子を表示する細胞の同定
法が非常に良く知られているため、極めて容易に決定出
来る。関連複合体を表示する細胞が前述のスクリーニン
グ法で同定されたならば、それらはCTLsを含む患者から
のサンプルと結合出来る。細胞を表示する複合体が、混
合CTLサンプルによって溶解されれば、GAGE由来の腫瘍
拒絶抗原が存在しており、被験者は、上に示した治療手
段にとって適切な候補者であると推定出来る。

【００９７】 養子免疫細胞移入は、本発明に関して利用できる治療
法の唯一の形態ではない。CTLsは、又多数の手段を用い
てin vivoでも誘発する事が出来る。１つの手段、即ち
複合体を表示する非−増殖性細胞の使用は、上に詳しく
述べられている。

【００９８】 このアプローチで使用される細胞は、複合体を正常に
表現する細胞、例えば照射メラノーマ細胞又は複合体の
発現に必要な遺伝子の一方又は両方を形質移入された細
胞であってもよい。チェン等（Chen et al.,）、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 88:110−114（January,1991）
は、治療的養生法において、HPV E7ペプチドを発現す
る形質移入細胞の使用を示して、このアプローチを実証
している。

【００９９】 様々な細胞のタイプが使用出来る。同様に、目的の遺
伝子の一方又は両方を含むベクターが使用出来る。ウイ
ルス又はバクテリアベクターは特に好ましい。これらの
系では、目的の遺伝子は、例えばワクチニアウイルス又
はバクテリアBCGによって運ばれ、この物質は、事実上
宿主細胞を「感染」させる。この細胞は目的の複合体を
表示することとなり、そして自己由来のCTLsによって認
識され、次いで増殖する。類似の効果は、目的のHLA/ペ
プチド複合体を表示する細胞を表示するHLAL−Cw6中へ
の導入を促進するために、腫瘍拒絶抗原又はそれ自身の
前駆体をアジュバンドと結合する事により達成出来る。
TRAPは、HLA分子のペプチドパートナーを生成する為に
変えられ、一方TRAは更なる変更を必要とせずに表示さ
れる。

【０１００】 本発明の他の特徴は、当業者にとっては明らかであ
り、ここに繰り返すまでもないであろう。 使用された言葉及び表現は、記述の為の言葉として使
用されるもので、限定の為のものではなく、表示及び開
示された要旨又はその一部のいかなる均等物をも排除す
る為の言葉及表現の使用を意図するものではなく、様々
な変更が本発明の範囲内において可能である事が認識さ
れる。 図面の簡単な説明

【図１】 CTLクローン76/6を用いた細胞溶解の研究を示す

【図２】 種々の形質移入体と比較対象物で得られた腫瘍壊死因子
（TNF）の放出アッセイを示す

【図３】 クローンCTL76/6の溶解性Ｔリンパ球により誘発される
溶解を比較する。種々の長さのペプチドが、配列番号:4
を含めてテストされた

【図４】 ここで検討された６つのGAGE遺伝子のcDNAの配列を表示
する。図において、同一領域は、四角で囲まれている。
又、翻訳開始部位及び停止コドンが例示される。実施例
において述べられる様なポリメラーゼ連鎖反応で使用さ
れるプライマーは、矢印で例示される

【図５】 GAGEファミリーのメンバーに対する推定アミノ酸配列の
配列を示す。同一領域は四角で示され、配列番号:4の抗
原ペプチドが示される

【図６】 各GAGEcDNAが、HLA−Cw6cDNAと一緒にCOS細胞中に形質
移入された時に得られた結果を示す。24時間後、CTL76/
6のサンプルが添加され、TNF放出が24時間後に測定され
た

【図７】 HLA−A29cDNA、MAGE、BAGE又はGAGE配列で形質移入され
た、COS−７細胞でのCTL22/23の刺激を比較する

【図８】 配列番号:22を含む種々のペプチド及びそれらから誘導
された種々のペプチドを使用して、⁵¹Cr放出研究によっ
て得られた結果を表示する

【配列表】

配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:646塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:1: 配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:2: 配列番号:3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:3: 配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:8アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:4: 配列番号:5の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:5: 配列番号:6の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:6: 配列番号:7の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:7: 配列番号:8の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:8: 配列番号:9の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:9: 配列番号:10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:10: 配列番号:11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:11: 配列番号:12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:15アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:12: 配列番号:13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:16アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:13: 配列番号:14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:538塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:14: 配列番号:15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:560塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:15: 配列番号:16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:540塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:16: 配列番号:17の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:532塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:17: 配列番号:18の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:539塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:18: 配列番号:19の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:19: 配列番号:20の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:20: 配列番号:21の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:14アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:21: 配列番号:22の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号:22: 配列番号:23の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴： （Ｄ）他の情報：各Xaaは、任意のアミノ酸であって
もよい。 （xi）配列：配列番号:23:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ファン デル エインド ベノワ ベルギー ベー1200 ブリュッセル ア ベニュー イッポクラート 74 ユセエ ル 7459 (72)発明者 デバッケル オリヴィエール ベルギー ベー1200 ブリュッセル ア ベニュー イッポクラート 74 ユセエ ル 7459 (72)発明者 ボーン ファルール ティエリー ベルギー ベー1200 ブリュッセル ア ベニュー イッポクラート 74 ユセエ ル 7459 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 7/06 ZNA C07K 7/08 C12N 15/09 G01N 33/48 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号21からなる単離ペプチド。
2. 【請求項２】配列番号22からなる単離ペプチド。
3. 【請求項３】HLA−A29分子と配列番号21あるいは配列番
   号22との複合体に対して特異的である体液サンプル中に
   おける溶解性Ｔリンパ球の存在を決定する方法であっ
   て、配列番号21あるいは配列番号22を含むポリペプチド
   を配列番号21あるいは配列番号22に加工するのに好まし
   い条件下でその表面上にHLA−A29を提示する細胞サンプ
   ルを前記ポリペプチドと接触させる工程、ならびに配列
   番号21あるいは配列番号22のポリペプチドを該HLA−A29
   分子と結合させる工程、該溶解性Ｔリンパ球を含むと考
   えられる体液サンプルを、その表面上にHLA−A29および
   配列番号21あるいは配列番号22の複合体を提示する該細
   胞に接触させる工程、該サンプル中における該溶解性Ｔ
   リンパ球の存在を決定するために（ｉ）溶解性Ｔリンパ
   球により溶出された腫瘍壊死因子、又は（ii）該複合体
   を提示する該細胞の溶解の少なくとも１つを決定する工
   程を含む方法。
4. 【請求項４】腫瘍壊死因子の放出を決定する工程を含
   む、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】放射能標識化クロムの放出の決定により溶
   解を決定する工程を含む、請求項３に記載の方法。