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Biologische
Faktoren, wie zum Beispiel Coenzyme, Cofaktoren, Vitamine und andere,
spielen bei biologischen Umwandlungsprozessen wichtige Rollen. Sie
werden normalerweise in kleinen Mengen in einer Ganzzelle erzeugt
(1 × 10–5 – 1 × 10–6).
Die Isolierung und Reinigung derartiger biologischer Faktoren aus
normalen Zellen ist jedoch ein schwieriges Unterfangen.
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Es
wurden hyperimmunisierte Eier entwickelt und es wurde gezeigt, dass
sie Antikörper
und bestimmte biologische Faktoren überproduzieren. Da die Hyperimmunisierung
durch Injektion polyvalenter bakterieller Antigene in das Zieltier
durchgeführt
wird, kann die Menge an biologischen Faktoren, die in Eiern dieser
hyperimmunisierten Tiere gefunden wird, nicht mehr als um eine Größenordnung
erhöht
werden. Daher macht die kleine Menge biologischer Faktoren in hyperimmunisierten
Eiern die Reinigung biologischer Faktoren schwierig und somit besteht
ein Bedarf für
ein wirksames Verfahren zur Isolierung, Reinigung oder anderweitigen
Herstellung von derartigen biologischen Faktoren.
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Das
normale Immunsystem befindet sich in einem Gleichgewicht, wobei
entzündungsfördernde
und entzündungshemmende
Zellen und Moleküle
sorgfältig
reguliert sind, um die Immunabwehr des normalen Wirts ohne die Zerstörung von
Geweben des Wirts zu fördern.
Sobald dieses sorgfältige
Gleichgewicht gestört ist,
kann eine nicht spezifische Stimulierung und Aktivierung dazu führen, dass
erhöhte
Mengen an wirksamen schädlichen
immunologischen und eine Entzündung
hervorrufenden Molekülen
erzeugt und abgegeben werden. Daher ist eine Überschussproduktion an entzündungsfördernden
Cytokinen oder eine Erzeugung von Cytokinen im falschen biologischen
Zusammenhang mit der Sterblichkeit und Pathologie in einem großen Bereich an
Krankheiten assoziiert, wie zu Beispiel unter anderen Malaria, Blutvergiftung,
rheumatische Arthritis, entzündliche
Darmerkrankung, Krebs und AIDS.
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Cytokine
sind omnipotente Polypeptide, die auf autokrine/parakrine Arten
durch Binden an spezifische Zellrezeptoren wirken. Ihre Sekretion
ist zur Bestimmung der Dauer und Intensität einer Immunantwort von Bedeutung.
Zum Beispiel wurde das Sekret von bestimmten Untersätzen von
CD4+ T-Helfer (Th)-Klonen in Mäusen
in klassischer Weise als Th1- und Th2-Cytokine beschrieben. Th1-Zellen
erzeugen Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-γ (IFN-γ) und erleichtern die Immunantwort.
Th2-Zellen erzeugen
IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10 und unterstützen die Aktivierung von Immunglobulin
absondernden Zellen. Während
des Entzündungsprozesses werden
Cytokine, wie zum Beispiel IL-1β,
IL-6 und der Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) an der Entzündungsstelle
freigesetzt. Diese Cytokine weisen pleiotrope Wirkungen auf und
vermitteln einen großen
Bereich von Symptomen, die mit einer Entzündung assoziiert sind.
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Ein
Schlüsselcytokin,
TNF-α, das
ebenfalls als Cachectin bekannt ist, ist ein Protein von 17 Kilo-Dalton,
das aus 157 Aminosäuren
besteht und hauptsächlich
von Monozyten und aktivierten Makrophagen erzeugt wird. Es wurde
gezeigt, dass TNF-α eine
tumorizide Aktivität
besitzt sowie eine Vielzahl physiologischer Wirkungen auf die meisten
Hauptorgansysteme aufweist. Im Zentralnervensystem hat TNF-α mit Fieber,
Anorexie und Veränderungen
der Hypophysenabgabe zu tun. Im kardiovaskulären System spielt TNF-α eine Rolle bei
Schock, akuter Atemnot und dem Kapillarundichtigkeitssyndrom (Prokoagulation).
TNF-α ist
in dem Prozess der akuten tubulösen
Nekrose und Nephritis in der Niere und Ischämie, Dickdarmentzündung und
hepatischer Nekrose im Magen-Darm-System förderlich. Es ist ebenfalls
ein Schlüsselcytokin,
das mit dem Entzündungsprozess
zu tun hat.
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Verschiedene
Gattungen der Klasse der Vögel,
wie zum Beispiel Hühner
(Gallus domesticus), Truthähne
und Enten, erzeugen im Blut und in Eiern Antikörper gegen Immunogene, die
Vogelkrankheiten verursachen, sowie gegen andere Immunogene. Zum
Beispiel haben LeBacq-Verheyden et al. (Immunology 27:683 (974))
und Leslie, G.A., et al. (J. Med. 130:1337 (1969)) quantitativ Immunglobuline
von Hühnern
analysiert. Polson et al. (Immunological Communications 9:495–514 (1980))
immunisierten Hennen gegen mehrere Proteine und natürliche Mischungen
von Proteinen und wiesen IgY-Antikörper in den Dottern der Eier
nach. Fertel et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications
102:1028–1033
(1981)) immunisierten Hennen gegen Prostaglandine und wiesen Antikörper in
dem Eigelb nach. Jensenius et al. (Journal of Immunological Methods
46:63-38 (1981)) stellten ein Verfahren zur Isolierung von Eigelb-IgG
zur Verwendung in der Immundiagnostik bereit. Polson et al. (Immunological
Communications 9:475–493
(1980)) beschrieben Antikörper,
die aus dem Eigelb von Hennen isoliert sind, die mit einer Vielzahl
von Pflanzenviren immunisiert wurden.
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Das
U.S. Patent Nr. 4,375,272 offenbart die Isolierung von Antikörpern aus
den Dottern von Eiern, die von hyperimmunisierten Hennen stammen.
Die Antikörperantwort
wurde durch wiederholte Injektionen von Imunogenen hervorgerufen,
die von Pflanzenviren, menschlichem IgG, Tetanus-Antitoxin, Schlangen-Antiveninen
und Serameba abgeleitet waren.
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Das
U.S. Patent Nr. 4,550,019 offenbart die Isolierung von Antikörpern aus
Eigelben, die in der Henne durch Hyperimmunisierung mit Immunogenen
mit einem Molekular- oder
Teilchengewicht von mindestens 30.0000 hervorgerufen wurden. Die
zur Hyperimmunisierung der Hühner
verwendeten Immunogene wurden unter Pflanzenviren, menschlichen
Immunglobulinen, Tetanustoxin und Schlangengiften ausgewählt.
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Das
U.S. Patent Nr. 4,748,018 offenbart ein Verfahren zur passiven Immunisierung
eines Säugers,
das die parenterale Verabreichung eines gereinigten Antikörpers umfasst,
der aus den Eiern eines Vogels erhalten wurde, der gegen das entsprechende
Antigen immunisiert worden ist, und wobei der Säuger eine Immunität gegen
die Eier erworben hat.
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Das
U.S. Patent Nr. 5,772,999 von DCV-Biologics offenbart ein Verfahren
zum Verhindern, Entgegenwirken oder Verringern von chronischen gastrointestinalen
Erkrankungen oder einer durch ein nicht steroidales entzündungshemmendes
Arzneimittel induzierten (NSAID-induzierten) gastrointestinalen
Schädigung
in einem Versuchstier durch Verabreichung eines hyperimmunisierten
Eis und/oder Milch oder Fraktionen davon an ein Versuchstier.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung der vorliegenden
Erfinder, dass es eine spezifische immunregulatorische Aktivität im Ei
und insbesondere in einem Ei gibt, das von hyperimmunisierten Tieren
erhalten wurde, und das, wenn es einem Versuchstier und insbesondere
Säugern
verabreicht wird, die Cytokinerzeugung in diesem Versuchstier aktiviert.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung einen hochgereinigten Cytokin-Aktivierungsfaktor,
der aus den Eiern eines Vogels erhalten werden kann. Der Cytokin-Aktivierungsfaktor
kann aus Fraktionen, die sowohl aus dem Eigelb als auch aus Eiweiß isoliert
worden sind, hochgereinigt werden. Der Cytokin-Aktivierungsfaktor
kann ebenfalls rekombinant oder durch chemische Synthese hergestellt
werden.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Cytokin-Aktivierungsfaktor-(CAF)-Protein.
Ein derartiges Protein umfasst eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus
der Gruppe aus: (a) einer Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe der SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und (b) einer Aminosäuresequenz,
umfassend mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste
von jeder der beiden Aminosäuresequenzen
von (a). Das isolierte CAF-Protein der vorliegenden Erfindung reguliert
die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder
Interleukin-6 (IL-6) hoch, und/oder reguliert die Expression des
Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunter. In einer bevorzugten
Ausführungsform
umfasst das isolierte Protein der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz,
mit mindestens ungefähr
15 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten
von jeder der beiden Aminosäuresequenzen
von (a), und bevorzugter mit mindestens ungefähr 20 aufeinanderfolgenden
Aminosäureresten
und besonders bevorzugt mit mindestens ungefähr 25 aufeinanderfolgenden
Aminosäureresten
von jeder der beiden Aminosäuresequenzen
von (a). In einer anderen Ausführungsform
umfasst das isolierte Protein der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz
mit mindestens ungefähr
50 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten
der SEQ ID Nr:6.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst ein isoliertes Protein der vorliegenden Erfindung
eine Aminosäuresequenz,
die mindestens zu ungefähr
65 % identisch mit einer Aminosäuresequenz von
(a) über
mindestens 15 Aminosäuren
der Aminosäuresequenz
von (a) ist. Das Protein umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz,
die mindestens zu ungefähr
75 % identisch mit einer Aminosäuresequenz von
(a) über
mindestens 15 Aminosäuren
der Aminosäuresequenz
von (a) ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Protein
eine Aminosäurese quenz,
die mindestens zu ungefähr
60 % identisch mit SEQ ID Nr:6 über
66 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:6 ist. In einer weiteren Ausführungsform wird das Protein
von einer Nukleinsäuresequenz
kodiert, die unter Hochstringenzbedingungen an eine Nukleinsäuresequenz
hybridisiert, die eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, kodiert. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
umfasst das isolierte CAF-Protein der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6 und besonders
bevorzugt SEQ ID Nr:6.
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In
einer Ausführungsform
weist ein isoliertes CAF-Protein der vorliegenden Erfindung eines
oder mehrere der folgenden biochemischen Merkmale auf: (a) es weist
mindestens eine biologisch aktive Untereinheit auf, die einen Filter
mit einem Ausschluss von 3000 MW passiert; (b) es ist bei einer
Temperatur bis zu mindestens ungefähr 50 °C stabil; (c) es ist bei einem
pH-Wert von ungefähr
2 bis ungefähr
10 stabil; (d) es ist wasserlöslich;
(e) es ist nicht steroidal; (f) es ist negativ geladen; (g) es ist
im Wesentlichen nicht polar und/oder (h) es hat eine λmax von
ungefähr
254 nm. Ein isoliertes Protein der vorliegenden Erfindung ist biologisch
aktiv, wenn es oral verabreicht wird. Ein isoliertes Protein der
vorliegenden Erfindung ist natürlicherweise
sowohl im Eiweiß als
auch im Eigelb von Vogeleiern vorhanden. Wie vorstehend erörtert wurde,
reguliert ein isoliertes CAF-Protein der vorliegenden Erfindung
die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder
Interleukin-6 (IL-6) hoch. In einer Ausführungsform reguliert ein isoliertes
Protein der vorliegenden Erfindung die Expression des Transformierenden
Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunter.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft einen isolierten Antikörper, der
selektiv an das isolierte CAF-Protein der vorliegenden Erfindung
bindet.
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Noch
eine weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung. Eine derartige
Zusammensetzung umfasst einen pharmazeutisch verträglichen
Träger,
und ein wie vorstehend beschriebenes Cytokin-Aktivierungsfaktor
(CAF)-Protein gemäß der vorliegenden
Erfindung. In einer Ausführungsform
ist der pharmazeutisch verträgliche
Träger
ein Lebensmittelprodukt, ausgewählt
aus der Gruppe aus: (a) einem hyperimmunen Ei-Produkt, das ausgewählt ist,
um mit dem CAF-Protein angereichert zu werden, und (b) einem mit
mindestens einem Teil des hyperimmunen Ei-Produkts hergestellten
Lebensmittelprodukts, wobei der Teil eine angereicherte Menge des
CAF-Proteins im Vergleich zu dem hyperimmunen Ei-Produkt umfasst. Der pharmazeutisch
verträgliche
Träger
umfasst vorzugsweise einen Teil eines hyperimmunen Ei-Produkts,
der im Vergleich zum hyperimmunen Ei-Produkt eine angereicherte Menge des
CAF-Proteins enthält.
Geeignete Fraktionen eines hyperimmunen Ei-Produkts umfassen, sind
aber nicht beschränkt
auf flüssiges
Eigelb, flüssiges
Eiweiß,
pulverisiertes Eiweiß und
eine wasserlösliche
Fraktion des hyperimmunen Ei-Produkts.
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In
einer Ausführungsform
liegt die Zusammensetzung in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe aus einer
Flüssigkeit,
einem Aerosol, einer Kapsel, einer Tablette, einer Pille, einem
Puder, einem Gel und einem Granulat vor. In einer weiteren Ausführungsform
umfasst der pharmazeutisch verträgliche
Träger
eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung. In einer weiteren
Ausführungsform
ist der pharmazeutisch verträgliche Träger aus
der Gruppe aus Wasser, Phosphat-gepufferter Salzlösung, Ringer's-Lösung, Dextroselösung, Serum-enthaltenden
Lösungen,
Hank's-Lösung, anderen
wässrigen
physiologisch ausgewogenen Lösungen, Ölen, Estern,
Glykolen, biokompatiblen Polymeren, polymeren Matrizes, Kapseln,
Mikrokapseln, Mikropartikeln, Bolus-Präparationen, osmotischen Pumpen,
Diffusionsvorrichtungen, Liposomen, Liposphären, Zellen und zellulären Membranen
ausgewählt.
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Noch
eine weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis, septischem Schock
oder Krebs. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Medikament für die Verabreichung
einer Dosis von 1 Nanogramm bis 400 Milligramm des CAF-Proteins
pro Kilogramm Körpergewicht
geeignet. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf: orale, intravenöse Verabreichung,
intraperitoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, subkutane
Verabreichung, transdermale Zufuhr, intratracheale Verabreichung,
Inhalation, Imprägnierung
eines Katheters, durch ein Zäpfchen
und durch direkte Injektion in ein Gewebe. In einer Ausführungsform
umfasst die Zusammensetzung ein das CAF-Protein enthal tendes Lebensmittelprodukt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Tier ein Säuger.
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Die
Verabreichung der Zusammensetzung reguliert vorzugsweise die Expression
des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder
Interleukin-6 (IL-6) durch Zellen des Tiers hoch. In einem Aspekt
reguliert die Verabreichung der Zusammensetzung die Expression des
Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) durch Zellen des Tiers herunter.
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Eine
weitere Ausführungsform
betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
in der Herstellung eines Medikaments gegen Krebs in einem Tier.
Die Zusammensetzung kann einem Tier verabreicht werden, das Krebs
oder ein Risiko zur Entwicklung von Krebs aufweist, wobei die Zusammensetzung
ein Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF)-Protein der vorliegenden Erfindung
umfasst, wie es hier vorstehend beschrieben wurde. Die Zusammensetzung
ist vorzugsweise für
die Verabreichung einer Dosis von ungefähr 1 Nanogramm bis ungefähr 400 Milligramm
des CAF-Proteins pro Kilogramm Körpergewicht
des Tieres geeignet. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen, sind
aber nicht beschränkt
auf: orale, intravenöse
Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung,
subkutane Verabreichung, transdermale Zufuhr, intratracheale Verabreichung,
Inhalation, Imprägnation
eines Katheters, durch ein Zäpfchen und
durch direkte Injektion in ein Gewebe an der Stelle des Krebses
oder benachbart dazu. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung
ein das CAF-Protein enthaltendes Lebensmittelprodukt.
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Die
Verabreichung der Zusammensetzung erzeugt vorzugsweise ein Ergebnis,
ausgewählt
aus der Gruppe aus: der Reduktion der Symptome des Krebses, der
Reduktion eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, der Eliminierung
eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, der Prävention von metastasierendem Krebs,
der Prävention
von Krebs und der Stimulation einer Effektorzellen-Immunität gegen
Krebs.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül. Ein derartiges
Nukleinsäuremolekül umfasst
eine Nukleinsäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe aus: (a) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Pro tein
kodiert, das eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus: (i) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und (ii)
einer Aminosäuresequenz,
umfassend mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste
einer Aminosäuresequenz
von (i), umfasst, und (b) einer Nukleinsäuresequenz, die vollkommen komplementär zu der
Nukleinsäuresequenz
von (a) ist. Das durch die Nukleinsäuresequenz von (a) kodierte Protein
reguliert vorzugsweise die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder
Interleukin-6 (IL-6) hoch. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz,
die eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, kodiert.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung umfasst, wie es hier vorstehend dargestellt ist. Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, die
ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung umfasst, wie es hier vorstehend dargestellt ist, wobei
die Zelle das Nukleinsäuremolekül exprimiert.
Eine weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung, wie es hier vorstehend dargestellt ist.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 ist
ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung eines 3000 Dalton MW-Permeats
auf die Induktion von Cytokinen ein einem in vitro Assay zeigt.
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2 ist
ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung eines 3000 Dalton MW-Permeats
auf die Induktion von TNFα in
einem in vitro Assay zeigt.
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3 ist
ein HPLC-Chromatogramm des PL-100 3000 Dalton MW-Permeats.
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4 ist
ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung von Q Sepharose-Fraktionen
des 3000 Da MW-Permeats auf die TNFα-Induktion in THP-1-Zellen zeigt.
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5 ist
ein HPLC-Chromatogramm der CAF-aktiven Fraktion auf einer Q Sepharose-Säule.
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6 ist
ein Festphasenextraktions-Chromatogramm der CAF1-aktiven Fraktion
von der Q Sepharose-Säule.
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7 ist
ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung der Festphasenextraktionsfraktionen
auf die TNFα-Induktion
in einem in vitro Assay zeigt.
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8 ist
ein HPLC-Chromatogramm der CAF-aktiven Fraktion der Festphasenextraktion.
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9 ist
ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung von Verteilungsextraktionsfraktionen
auf die TNFα-Induktion
in einem in vitro Assay zeigt.
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10 ist ein HPLC-Chromatogramm der wasserlöslichen
Fraktion durch Verteilungsextraktion.
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11 ist ein HPLC-Chromatogramm einer C18-HPLC-Trennung
der wasserlöslichen
Fraktion.
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12 ist ein HPLC-Chromatogramm von gereinigtem
CAF.
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13 ist ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung
von CAF auf die IL-1β-Induktion
in einem in vitro Assay zeigt.
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14 ist ein Chromatogramm, das die Infrarot-Spektrometrie
von CAF zeigt.
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15 zeigt die Anordnung und Positionierung der
SPE-GFII-Sequenz mit dem Huhn-Vitellogenin II-Vorläufer.
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16 ist eine schematische Zeichnung, die die Reinigungsschritte
für CAF
erläutert.
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17 ist ein digitalisiertes Bild, das Cytokin-RNA-Gehalte
in THP-1-Zellen zeigt, die mit unterschiedlichen Ei-Fraktionen behandelt
wurden.
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18 ist ein digitalisiertes Bild, das die Kinetik
der TNFα-Aktivierung
durch die 3000 Da-Permeatfraktion eines Eis zeigt.
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19 ist ein digitalisiertes Bild, das die Induktion
von drei Cytokinen durch CAFb zeigt.
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20 ist ein digitalisiertes Bild, das die Inhibierung
des Transformierenden Wachstumsfaktors β durch CAFb zeigt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen einen neuen Cytokin-Aktivierungsfaktor
(CAF), eine einen Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF) umfassende Zusammensetzung
und eine Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bakterieller
Infektion, Sepsis, septischen Schock oder Krebs. Die Zusammensetzung
der Erfindung kann Zusammensetzungen umfassen, die rekombinant hergestellten
CAF, synthetisch (das heißt
chemisch hergestellten CAF oder gereinigten CAF) umfassen, und/oder
eine Zusammensetzung der Erfindung kann ein natürliches CAF-enthaltendes Lebensmittelprodukt sein,
und vorzugsweise ein natürliches
Lebensmittelprodukt oder einen Teil davon umfassen, der so angereichert
ist, dass CAF vorhanden ist, wie zum Beispiel durch Auswahlverfahren
oder durch Herstellung eines angereicherten Teils. Derartige natürliche Produkte
umfassen hyperimmune Ei-Produkte,
einschließlich
Teilen von hyperimmunen Ei-Produkten, die mit CAF angereichert sind. Die
vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass das neue Protein CAF
die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-6 (IL-6) und
Interleukin-1β (IL-1β) hochreguliert
und die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunterreguliert.
Daher kann das CAF-Protein der vorliegenden Erfindung allgemein
zur Modulation (das heißt
zur Regulierung) des Immunsystems durch Modulation der Expression
dieser Cytokine und der Zellen, die diese Cytokine erzeugen oder
von diesen Cytokinen beeinflusst werden, verwendet werden.
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Da
typischerweise angenommen wird, dass TNFα, IL-1β und IL-6 entzündungsfördernde
Cytokine sind und da typischerweise angenommen wird, dass TGFβ ein entzündungshemmendes
Cytokin ist, ist das CAF-Protein der vorliegenden Erfindung außerdem zur
Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis und Krebs verwendbar,
wobei die Stimulation einer Immunantwort und Zellen, die auf entzündungsfördernde
Cytokine reagieren, wünschenswert
ist.
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Von
den vorliegenden Erfindern wurde ursprünglich entdeckt, dass der CAF
der vorliegenden Erfindung eine Komponente ist, die in hyperimmunisierten
Ei-Produkten erzeugt wird. Es ist nicht erforderlich, dass die bevorzugte
immunogene Mischung, die vorzugsweise den Ei-erzeugenden Tieren
zur Induktion einer Immunantwort und zur Erzeugung des hyperimmunen
Ei-Produkts, das den Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden
Erfindung enthält,
durch Injektion verabreicht wird, spezifische Immunogene enthält, von
denen bekannt ist, dass sie durch Aktivierung spezieller Cytokine
oder durch Induktion der Erzeugung eines Faktors, der spezielle
Cytokine induziert, das Immunsystem modulieren. Es ist daher überraschend,
einen derartigen Cytokin-Aktivierungsfaktor in einem hyperimmunen
Ei-Produkt zu finden, das von Tieren erhalten wurde, die gegen einen
gemischten Antigenimpfstoff immunisiert wurden, und von dem erwartet
wird, dass er bei Verabreichung an ein Versuchstier das Immunsystem
moduliert. Außerdem
war vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt, dass die Hyperimmunisierung
von Ei-erzeugenden Tieren zur Erzeugung des neuen Cytokin-Aktivierungsfaktors
der vorliegenden Erfindung führen
würde,
der die Eigenschaften aufweisen würde, dass er zur Regulierung
der Cytokinerzeugung und zur Differenzierung der Zellen des Immunsystems
in einem Tier in der Lage ist. Nach Kenntnis der vorliegenden Erfinder
wurde vor dieser Erfindung noch niemals der hier beschriebene Cytokin-Aktivierungsfaktor
identifiziert, gereinigt, charakterisiert oder sequenziert.
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Der
Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung kann abgetrennt
und aus einem Ei unter Verwendung von Ultrafiltration, Q Sepharose
Ionenaustauschchromatographie, Festphasenextraktion, Verteilungsextraktion
und Umkehrphasen-C18 HPLC-Technologien (siehe
Beispiel 1) hoch gereinigt werden. Analytische HPLC, in vitro Cytokinexpressionsuntersuchungen
und Bioassaydaten haben alle die Reinigung eines biologisch aktiven
Cytokin-Aktivierungsfaktors gezeigt. Außerdem kann, wie hier beschrieben
ist, der Cytokin-Aktivierungsfaktor isoliert, kloniert und rekombinant
oder synthetisch unter Verwendung der hier bereitgestellten Sequenzinformation
hergestellt werden.
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Definitionen
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Die
folgenden Definitionen gelten für
die gesamte Anmeldung sofern es nicht anders angegeben ist.
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Der
Begriff „Hyperimmunisierung" bedeutet die Aussetzung
gegenüber
einem oder mehreren Immunogenen (zum Beispiel Antigenen), so dass
eine Immunantwort hervorgerufen und gegenüber dem natürlichen Zustand ohne Aussetzung
beibehalten wird.
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Der
Begriff „immunogen" bedeutet eine Substanz,
die eher zur Induktion einer humoralen Antikörper- und/oder einer Zell-vermittelten
Immunantwort als zur immunologischen Toleranz in der Lage ist. Der
Begriff bezeichnet die Fähigkeit
zur Stimulation einer Immunantwort, sowie zur Reaktion mit ihren
Produkten, zum Beispiel Antikörper.
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Der
Begriff „kombinatorisch
abgeleitete Immunogene" bezieht
sich auf ein Verfahren zur Erzeugung einer molekularen Verschiedenartigkeit
unter Immunogenen mittels kombinatorischer Synthese.
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Der
Begriff „biotechnologisch
hergestellte Immunogene" bezieht
sich auf Immunogene, die durch das Verfahren von Genklonierungstechnologien
und durch genetische Manipulation oder chemische Synthese erhalten
werden.
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Der
Begriff „genetischer
Impfstoff" bezieht
sich auf einen Nukleinsäureimpfstoff,
der im Allgemeinen durch Rekombinationstechnologien hergestellt
wird und der eine Immunantwort hervorrufen kann.
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Die
Begriffe „Ei" oder „Ei-Produkt" bedeuten jeweils
jedes ganze Ei (Speiseei, hyperimmunisiertes oder sonstiges Ei)
oder jedes Produkt oder davon stammende Teil.
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Die
Begriffe „Speiseei" oder „Speiseei-Produkt" bedeuten jeweils
ein ganzes Ei oder jedes Produkt oder davon stammende Teil, das
von Ei-erzeugenden Tieren erhalten wird, die nicht in einem hyperimmunen Zustand
gehalten werden.
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Die
Begriffe „hyperimmunes
Ei" oder „hyperimmunes
Ei-Produkt" bedeuten
jeweils ein ganzes Ei oder jedes Produkt oder davon stammende Teil,
das von einem Ei-erzeugenden
Tier erhalten wird, das in einem hyperimmunen Zustand gehalten wird.
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Der
Begriff „supranormale
Gehalte" bedeutet
Gehalte, die über
denjenigen liegen, die in Eiern von Ei-erzeugenden. Tieren, die
nicht in einem hyperimmunen Zustand gehalten wurden, gefunden wurden.
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Der
Begriff „immunregulatorsiches
Ei" bedeutet Ei
oder Eiteile, die den hier offenbarten Cytokin-Aktivierungsfaktor
enthalten.
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Der
Begriff „Immunantwort" bezieht sich im
Allgemeinen auf eine Zell-vermittelte oder zelluläre Immunantwort
(das heißt,
eine Immunantwort, die durch Zellen des Immunsystems, einschließlich T
Lymphozyten, B Lymphozyten und Makrophagen vermittelt wird) und/oder
eine humorale Immunantwort (das heißt, eine durch Antikörper vermittelte
Immunantwort).
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Der
Begriff „Tier" bezieht sich auf
jede Spezies des Tierreichs. Bevorzugte, gemäß der vorliegenden Erfindung
zu immunisierende Tiere umfassen alle Tiere der Wirbeltierklasse,
Vögel,
umfassend, ohne beschränkt
darauf zu sein, Hühner,
Truthähne
und Enten. Bevorzugte, gemäß der vorliegenden
Erfindung zu behandelnde Tiere umfassen alle Tiere der Wirbeltierklassen,
Vögel und
Säuger,
umfassend, ohne beschränkt darauf
zu sein, Primaten, Nagetiere, Vieh und Haustiere. Vieh umfasst Säuger, die
zu verzehren sind, oder die verwendbare Produkte erzeugen (zum Beispiel
Schafe für
die Wollproduktion). Bevorzugte Säuger, die vor einer Krankheit
oder einem Zustand zu schützen
sind, umfassen Menschen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder,
Pferde und Schweine, wobei Menschen besonders bevorzugt sind.
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Der
Begriff „Zieltier" bezieht sich auf
ein Tier, das als Ei-erzeugendes Tier dient.
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Der
Begriff „Versuchstier" bezieht sich auf
das Tier, dem eine CAF-enthaltende Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung, umfassend Zusammensetzungen, die gereinigten CAF, synthetisch
hergestellten CAF, rekombinant hergestellten CAF, oder ein CAF-angereichertes
Ei oder ein durch das Zieltier erzeugtes Ei-Produkt verabreicht
wird. Ein Versuchstier kann ebenfalls als ein Patient bezeichnet
werden.
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Der
Begriff „Cytokin-Aktivierungsfaktor" oder „CAF" wird im Allgemeinen
zur Bezeichnung des Faktors der vorliegenden Erfindung in jedem
Zustand der Reinheit (zum Beispiel einschließlich einer Komponente eines
Eis, als halbgereinigtes Protein, als hochgereinigtes Protein, als
rekombinantes Protein oder als chemisch synthetisiertes Protein)
verwendet, wobei dieser die hier für den Cytokin-Aktivierungsfaktor
beschriebenen biochemischen, physikalischen, strukturellen und/oder
funktionalen Merkmale (zum Beispiel biologische Aktivität) aufweist.
Es wird festgestellt, dass hochgereinigter erfindungsgemäßer CAF
ebenfalls als „CAFb" bezeichnet werden
kann (siehe Beispiel 1).
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Der
Begriff „hochreiner
Cytokin-Aktivierungsfaktor" oder „hochreiner
CAF" bedeutet einen
Cytokin-Aktivierungsfaktor mit mindestens der Reinheit, die in Beispiel
1 für CAFb
beschrieben ist.
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Der
Begriff „Cytokin-Aktivierungsfaktor-angereichertes" oder „CAF-angereichertes" Produkt oder Zusammensetzung
bezieht sich auf ein Produkt oder eine Zusammensetzung, die gereinigt,
verarbeitet und/oder so hergestellt ist, dass sie im Vergleich zu
dem Gehalt des Cytokin-Aktivierungsfaktors in dem Produkt oder der
Zusammensetzung vor der Reinigung, Verarbeitung und/oder vor dem
Herstellungsschritt einen größeren Gehalt
des Cytokin-Aktivierungsfaktors in dem angereicherten oder Endprodukt
enthält.
Daher ist in einer Ausführungsform
der CAF in dem ursprünglichen
Produkt oder der Zusammensetzung vorhanden und die Schritte des
Reinigens, Verarbeitens und/oder Herstellens erhöhen die Menge an CAF in dem
Produkt oder der Zusammensetzung im Vergleich zu den anderen Komponenten
in dem Produkt oder der Zusammensetzung, typischerweise durch Eliminierung
oder Verringerung der Menge von einigen der Komponenten aus dem
ursprünglichen
Produkt. In einer wei teren Ausführungsform
enthält
weder das ursprüngliche
Produkt noch die Zusammensetzung CAF oder eine Anfangsmenge an CAF
und das CAF-angereicherte Produkt oder die Zusammensetzung wird
durch Zugabe von gereinigtem rekombinanten oder synthetisch hergestellten
CAF zu dem ursprünglichen
Produkt oder Zusammensetzung erzeugt. Derartige CAF-angereicherte
Zusammensetzungen werden nachstehend ausführlicher erörtert. Andere Wege zur Anreicherung
einer Zusammensetzung oder eines Produkts bezüglich CAF sind für den Fachmann
offensichtlich.
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Der
Begriff „isoliert" bezieht sich im
Hinblick auf eine Verbindung (zum Beispiel ein Protein oder ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung) auf eine Verbindung, die aus ihrem natürlichen
Milieu entfernt worden ist (das heißt, die einer menschlichen
Manipulation unterzogen worden ist). Der Begriff „isoliert" als solches spiegelt
nicht das Ausmaß der
Reinigung der Verbindung wider.
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Der
Begriff „Protein" kann untereinander
austauschbar mit dem Begriff „Polypeptid" verwendet werden,
obwohl der letztere Begriff typischerweise zur Bezeichnung kleiner
Proteine mit im Wesentlichen linearer Sekundärstruktur verwendet wird. Der
Begriff „Protein" oder „Polypeptid" umfasst Proteine
von vollständiger Länge, Fusionsproteine
oder jedes Homolog eines derartigen Proteins.
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Der
Ausdruck „Homolog
eines CAF-Proteins" (das
heißt
ein „CAF-Homolog") umfasst CAF-Proteine, in
denen mindestens eine oder einige wenige, aber nicht beschränkt auf
eine oder ein paar Aminosäuren
deletiert (zum Beispiel eine abgeschnittene Version des Proteins,
wie zum Beispiel ein Peptid oder Fragment), eingeschoben, invertiert,
substituiert und/oder derivatisiert worden sind (zum Beispiel durch
Glycosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Myristoylierung,
Prenylierung, Palmitierung, Amidierung und/oder Addition von Glycosylphosphatidylinositol).
Ein CAF-Homolog weist vorzugsweise eine CAF-biologische Aktivität auf.
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Der
Ausdruck „biologisch
aktiv" oder „biologische
Aktivität" bezieht sich unter
Bezugnahme auf ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung auf jede
funktionale Aktivität
eines CAF-Proteins, und typischerweise auf eine funktionale Aktivität eines
natürlich
vorkommenden CAF-Proteins. Insbesondere bezieht sich die Bezugnahme
auf die biologische Aktivität
eines CAF-Proteins vorzugsweise auf die Fähigkeit eines CAF-Proteins zur Hochregulation
(Induktion, Stimulation, Verstärkung,
Zunahme) der Expression eines Cytokins, das den Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder
Interleukin-6 (IL-6) umfasst. Es wird festgestellt, dass natürlich vorkommender
CAF, wie er hier ausführlich
beschrieben ist, die Expression von jedem der TNFα, IL-1β und IL-6
hochregulieren kann. Die biologische Aktivität von CAF kann ebenfalls eine
Fähigkeit
zur Herunterregulation (Inhibierung, Abnahme, Unterdrückung) der
Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) umfassen.
Eine biologische Aktivität
eines CAF-Proteins kann ebenfalls umfassen, ist aber nicht beschränkt auf
eine Fähigkeit
von CAF zur Bindung an einen Rezeptor oder ein anderes Protein, DNA,
eine Kohlenwasserstoffeinheit oder eine Lipideinheit, die zu den
vorstehend identifizierten biologischen Aktivitäten führt oder zu einer von diesen
beiträgt.
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Eine „biologisch
aktive Untereinheit" eines
Proteins ist ein Teil (das heißt
ein Fragment, Domäne
oder Monomer) des Proteins, das die biologische Aktivität des Proteins
mit vollständiger
Länge aufweist,
oder ein Multimer.
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Der
Begriff „mimetische
Verbindung" wird
zur Bezeichnung jeder Peptid- oder Nicht-Peptidverbindung verwendet, die zur
Nachahmung der biologischen Wirkung eines natürlich vorkommenden Peptids
in der Lage ist, weil die mimetische Verbindung häufig eine
Grundstruktur aufweist, die die Grundstruktur des natürlich vorkommenden
Peptids nachahmt und/oder hervorstechende biologische Eigenschaften
des natürlich
vorkommenden Peptids aufweist. Mimetische Verbindungen können umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf: Peptide, die wesentliche Modifikationen, ausgehend von dem
Prototyp, aufweisen, wie zum Beispiel keine Ähnlichkeit in Seitenketten
mit dem natürlich
vorkommenden Peptid (derartige Modifikationen können zum Beispiel ihre Anfälligkeit
gegenüber
Abbau verringern); antiidiotype und/oder katalytische Antikörper oder
Fragmente davon; nicht proteinhaltige Teile eines isolierten Proteins
(zum Beispiel Kohlenwasserstoffstrukturen), oder synthetische oder
natürliche
organische Moleküle,
einschließlich
zum Beispiel von Nukleinsäuren
und Arzneimitteln, die durch kombinatorische Chemie identifiziert
sind.
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Der
Begriff „stabil" in Bezug auf ein
Protein der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Fähigkeit eines
Proteins gegen Abbau beständig
zu sein, der durch Zunahmen oder Abnahmen in der Temperatur, durch Zunahmen
oder Abnahmen im pH-Wert,
durch Zunahmen oder Abnahmen in den Salzkonzentrationen, durch Oxidation
und/oder Reduktion, durch Deamidierung verursacht wird, und/oder
gegen andere Formen chemischen Abbaus und proteolytischen Abbaus
beständig
zu sein. Insbesondere wird durch den Nachweis jeglichen messbaren
Gehalts an biologischer Aktivität
des Proteins, vorzugsweise durch den Nachweis der Fähigkeit
des Proteins zur Beeinflussung einer beliebigen messbaren Zunahme
in der TNFα-,
IL-1β- oder
IL-6-Expression
durch eine Zelle, bestimmt, dass ein Protein unter jeder gegebenen
Bedingung stabil ist. Ein Protein, von dem angenommen wird, dass
es stabil ist, behält
vorzugsweise mindestens 10 % und bevorzugter mindestens 50 % seiner
biologischen Aktivität
nach Aussetzen gegenüber
einer gegebenen Bedingung bei, im Vergleich zu seiner biologischen
Aktivität
vor dem Aussetzen gegenüber
der Bedingung (zum Beispiel seine biologische Aktivität unter
normalen Bedingungen). Die Stabilität eines Proteins kann sich,
wie vorstehend beschrieben ist, auf die Fähigkeit eines Proteins beziehen,
entweder während
seiner Lagerung oder während
seiner Verwendung stabil zu sein.
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Der
Ausdruck „Nukleinsäuremolekül" bezieht sich vor
allem auf das physikalische Nukleinsäuremolekül und der Ausdruck „Nukleinsäuresequenz" bezieht sich vor
allem auf die Sequenz von Nukleotiden auf dem Nukleinsäuremolekül. Jedoch
können
die zwei Ausdrücke
untereinander austauschbar verwendet werden, besonders in Bezug
auf ein Nukleinsäuremolekül oder eine
Nukleinsäuresequenz,
die zur Kodierung eines Proteins in der Lage ist.
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Der
Ausdruck „rekombinantes
Molekül" oder „rekombinantes
Nukleinsäuremolekül" bezieht sich vor
allem auf ein Nukleinsäuremolekül, das funktionsfähig an eine
Transkriptionskontrollsequenz gebunden ist.
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Der
Ausdruck „funktionsfähig gebunden" bezieht sich auf
die Bindung eines Nukleinsäuremoleküls an eine
Transkriptionskontrollsequenz in so einer Weise, dass das Molekül in der
Lage ist, bei Transfektion (das heißt, Transformation, Transduktion,
Transfektion, Konjugation oder Einleitung) in eine Wirtszelle, exprimiert zu
werden.
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Der
Ausdruck „Transkriptionskontrollsequenz" bezieht sich auf
alle Sequenzen, die die Initiierung, Verlängerung und Terminierung der
Transkription kontrollieren. Besonders wichtige Transkriptionskontrollsequenzen
sind solche, die die Transkriptionsinitiierung kontrollieren, wie
zum Beispiel Promotor-, Verstärker-,
Operator- und Repressorsequenzen.
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Der
Begriff „Transfektion" wird zur Bezeichnung
eines jeden Verfahrens verwendet, durch das ein exogenes Nukleinsäuremolekül (das heißt ein rekombinantes
Nukleinsäuremolekül) in die
Zelle inseriert werden kann. Der Begriff „Transformation" kann untereinander
austauschbar mit dem Begriff „Transfektion" verwendet werden,
wenn ein derartiger Begriff verwendet wird, um auf die Einführung von
Nukleinsäuremoleküle in mikrobielle
Zellen, wie zum Beispiel Bakterien und Hefe, zu verweisen. In mikrobiellen
Systemen wird der Begriff „Transformation" dazu verwendet,
eine vererbte Änderung
aufgrund des Erwerbs exogener Nukleinsäuren durch den Mikroorganismus
zu beschreiben, und ist im Wesentlichen zu dem Begriff „Transfektion" synonym. In Tierzellen
eignete sich der Begriff Transformation eine zweite Bedeutung an,
die sich auf Änderungen
in den Wachstumseigenschaften von Zellen in Kultur, nachdem sie
zum Beispiel kanzerös
geworden sind, beziehen kann. Zur Vermeidung von Verwirrungen wird
daher der Begriff „Transfektion" vorzugsweise in
Bezug auf die Einführung
exogener Nukleinsäuren
in Tierzellen verwendet und der Begriff „Transfektion" wird hier im Allgemeinen
so verwendet, dass er sowohl die Transfektion von Tierzellen als
auch die Transformation von mikrobiellen Zellen in dem Ausmaß umfasst,
dass der Begriff die Einführung
exogener Nukleinsäuren
in eine Zelle betrifft. Transfektionstechniken umfassen daher Transformation,
Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion, Adsorption, Infektion
und Protoplastenfusion, aber sind nicht beschränkt darauf,
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Die
Begriffe „aneinandergrenzend" oder „aufeinanderfolgend" werden in Bezug
auf hier beschriebene Nukleinsäure-
oder Aminosäuresequenzen
untereinander austauschbar verwendet und beziehen sich auf in einer
ununterbrochenen Sequenz zusammenhängende Sequenzen. Zum Beispiel
bedeutet es für
eine erste Sequenz, die 30 aneinandergrenzende (oder aufeinanderfolgende)
Aminosäuren
einer zweiten Sequenz umfasst, dass die erste Sequenz eine ununterbrochene
Sequenz von 30 Aminosäureresten
umfasst, die zu 100 % mit einer ununterbrochenen Sequenz von 30
Aminosäureresten
in der zweiten Sequenz identisch ist. Ähnlich bedeutet es für eine erste
Sequenz, die eine „Identität von 100
%" mit einer zweiten
Sequenz aufweist, dass die erste Sequenz exakt mit der zweiten Sequenz
ohne Lücken
zwischen Nukleotiden oder Aminosäuren übereinstimmt.
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Der
Verweis auf eine prozentuale (%) Identität bezieht sich, sofern nichts
anderes angegeben ist, auf eine Bewertung der Homologie zwischen
zwei oder mehreren Aminosäure-
oder Nukleinsäuresequenzen,
die durchgeführt
wird unter Verwendung: (1) einer BLAST 2.0 Basic BLAST Homologiesuche
(httpa/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) unter Verwendung von blastp für Aminosäuresuchen
und blastn für
Nukleinsäuresuchen
mit Standard-Defaultparametern, wobei die Query-Sequenz auf Regionen
niedriger Komplexität
gemäß der Vorgabe
gefiltert wird (beschrieben in Altschul, S.F., Madden, T.L. Schäffer, A.A.,
Zhang, J., Zhang, Z. Miller, W. & Lipman,
D.J. (1997) „Gapped
BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids. Res.
25:3389–3402,
(2) einer BLAST 2 Anordnung (unter Verwendung der nachstehend beschriebenen
Parameter) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST); oder (3) sowohl
BLAST 2.0 als auch BLAST 2. Es wird festgestellt, dass aufgrund
einiger Unterschiede in den Standardparametern zwischen BLAST 2.0
Basic BLAST und BLAST 2 unter Verwendung des BLAST 2 Programms zwei
spezifische Sequenzen mit signifikanter Homologie erkannt werden
könnten,
wohingegen eine in BLAST 2.0 Basic BLAST durchgeführte Suche
unter Verwendung einer der Sequenzen als Query-Sequenz die zweite
Sequenz in den besten Übereinstimmungen
nicht identifizierten könnte.
Daher ist es verständlich,
dass die prozentuale Identität
durch Verwendung von entweder einem oder beiden dieser Programme
bestimmt werden kann, jedoch vorzugsweise unter Verwendung von BLAST
2.0 Basic BLAST. Zwei spezifische Sequenzen können unter Verwendung der BLAST
2 Sequenz, entsprechend der Beschreibung in Tatusova und Madden,
(1999), „Blast
2 sequences – a
new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol.
Lett. 174:247–250,
zueinander vergleichend angeordnet werden. Die BLAST 2 Sequenzanordnung
wird in blastp oder blastp unter Verwendung des BLAST 2.0 Algorithmus
zur Durchführung
einer Gapped BLAST Suche (BLAST 2.0) zwischen zwei Sequenzen durchgeführt, wobei
die Einführung
von Lücken
(Deletionen und Insertionen) in der resultierenden Anordnung erlaubt sind.
Aus Gründen
der Klarheit für
die vorliegenden Beschreibung, wird eine BLAST 2 Sequenzanordnung
unter Verwendung der Standard-Defaultparameter wie folgt durchgeführt:
Für blastn
unter Verwendung einer 0 BLOSUM62 Matrix:
Belohnung für Übereinstimmung
= 1
Strafe für
fehlende Übereinstimmung
= –2
Offene
Lücke (5)
und Verlängerungslücke (2)
Strafen
Lücke
x_dropoff (50) erwartet (10) Wortgröße (11) Filter (an)
Für blastp
unter Verwendung einer 0 BLOSUM62 Matrix:
Offene Lücke (11)
und Verlängerungslück- (1)
Strafen
Lücke
x_dropoff (50) erwartet (10) Wortgröße (11) Filter (an).
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Der
Verweis auf „Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf
Standardhybridisierungsbedingungen, unter denen Nukleinsäuremoleküle zur Identifizierung ähnlicher
Nukleinsäuremoleküle verwendet
werden. Derartige Standardbedingungen werden zum Beispiel in Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Labs Press, 1989, offenbart. Sambrook et al., ebd., (siehe insbesondere
die Seiten 9.31–9.62).
Außerdem
werden Formeln zur Berechnung der geeigneten Hybridisierung und
Waschbedingungen zum Erreichen einer Hybridisierung, die variierende
Grade fehlender Übereinstimmung
von Nukleotiden erlauben, zum Beispiel in Meinkoth et al., 1984,
Anal. Biochem. 138, 267–284;
Meinkoth et al., ebd., offenbart. Der Fachmann kann die Formeln
in Meinkoth et al., ebd. zur Berechnung der geeigneten Hybridisierung
und Waschbedingungen verwenden, um spezielle Grade fehlender Nukleotidübereinstimmung
zu erreichen. Derartige Bedingungen werden in Abhängigkeit
davon, ob DNA:RNA- oder DNA:DNA-Hybride gebildet werden, variieren.
Berechnete Schmelztemperaturen für
DNA:DNA-Hybride betragen 10 °C
weniger als für DNA:RNA-Hybride.
In speziellen Ausführungsformen
umfassen beispielhaft stringente Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride
eine Hybridisierung bei einer Ionenstärke von 6X SSC (0,9 M Na+) bei einer Temperatur zwischen ungefähr 20°C und ungefähr 35°C (zum Beispiel
weniger stringente Bedingungen), bevorzugter zwischen ungefähr 28°C und ungefähr 40°C (zum Beispiel
stringentere Bedingungen) und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 35°C und ungefähr 45°C (noch stringentere
Bedingungen). In speziellen Ausführungsformen umfassen
stringente Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride eine Hybridisierung
bei einer Ionenstärke
von 6X SSC (0,9 M Na+) bei einer Temperatur
zwischen ungefähr
30 °C und
ungefähr
45 °C, bevorzugter
zwischen ungefähr
38 °C und
ungefähr
50 °C und
besonders bevorzugt zwischen ungefähr 45 °C und ungefähr 55 °C. Diese Werte basieren auf
Berechnungen einer Schmelztemperatur für Moleküle, die größer als ungefähr 100 Nukleotide
sind, 0 % Formamid und einem G + C-Gehalt von ungefähr 40 %.
Alternativ dazu kann Tm empirisch berechnet
werden, wie in Sambrook et al., s.o., Seiten 9.31 bis 9.62 ausgeführt ist.
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Der
Verweis auf eine „Hybridisierung
mit niedriger Stringenz" (und
Waschbedingungen) bezieht sich auf Bedingungen, die die Isolierung
von Nukleinsäuremolekülen erlauben,
die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem
als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens ungefähr 40 %
aufweisen (das heißt
Bedingungen, die ungefähr
60 % oder weniger fehlende Übereinstimmung von
Nukleotiden erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung
der Formeln in Meinkoth et al., ebd.).
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Der
Verweis auf „eine
Hybridisierung mit mäßiger Stringenz" (und Waschbedingungen)
bezieht sich auf Bedingungen, die die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen erlauben,
die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem
als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens 60
% aufweisen (das heißt
Bedingungen, die ungefähr
40 % oder weniger fehlende Übereinstimmung
von Nukleotiden erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung
der Formeln in Meinkoth et al., ebd.).
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Der
Verweis auf „eine
Hybridisierung mit hoher Stringenz" (und Waschbedingungen) bezieht sich
auf Bedingungen, die die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen erlauben, die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem
als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens
80 % aufweisen (das heißt
Bedingungen, die ungefähr
20 % oder weniger fehlende Übereinstimmung
erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung der Formeln
in Meinkoth et al., ebd.).
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Der
Verweis auf „eine
Hybridisierung mit sehr hoher Stringenz" (und Waschbedingungen) bezieht sich auf
Bedingungen, die die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen erlauben, die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem
als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens 90
% aufweisen (das heißt
Bedingungen, die ungefähr
10 % oder weniger fehlende Übereinstimmung
von Nukleotiden erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung
der Formeln in Meinkoth et al., ebd.).
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Der
Begriff „modulieren" oder Ableitungen
eines solchen Begriffs bedeuten, den Zustand von einem zu einem
anderen zu ändern,
zu regulieren oder zu variieren, und umfasst eine messbare oder
beobachtbare Zunahme oder Abnahme in einem beliebigen messbaren
Merkmal und/oder eine Änderung
von einem Merkmal zu einem anderen unterschiedlichen Merkmal.
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Der
Ausdruck „pharmazeutisch
verträglicher
Träger" bezieht sich auf
pharmazeutisch verträgliche
Arzneimittelträger,
Formulierungen und/oder pharmazeutisch verträgliche Abgabevehikel, die zur
Verwendung in der Verabreichung einer Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung an eine geeignete Stelle in vitro, ex vivo oder in vivo
geeignet sind. Pharmazeutisch verträgliche Träger können es den Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung ermöglichen,
dass sie in jeder zur Verwendung geeigneten Form hergestellt/bereitgestellt
werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf eine Flüssigkeit,
ein Aerosol, eine Kapsel, eine Tablette, eine Pille, ein Puder,
ein Gel und ein Granulat. Einige pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen
Zellen, Membranen, Lipidformulierungen (einschließlich Flüssigkeiten,
die nach Verabreichung an einen Patienten in situ einen Feststoff
oder ein Gel bilden), Antikörperformulierungen,
Lebensmittelprodukte (zum Beispiel jedes essbare Produkt oder Präparat) und
rekombinante Viren. Bevorzugte Träger sind ebenfalls biologisch
abbaubar (das heißt
bioerodierbar).
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Ein „pharmazeutisch
verträglicher
Arzneimittelträger" umfasst Arzneimittelträger oder
Formulierungen, die transportieren oder den Transport unterstützen, aber
nicht spezifisch eine Zusammensetzung auf eine Zelle lenken (sie
werden hier ebenfalls als nicht zielende Träger bezeichnet). Beispiele
pharmazeutisch verträglicher
Träger
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Wasser, Phosphat-gepufferte Salzlösung, Ringers-Lösung, Dextroselösung, Serum-enthaltende
Lösungen,
Hank's-Lösung, andere
wässrige
physiologisch ausgewogene Lösungen, Öle, Ester
und Glykole. Wässrige
Träger
können
geeignete Hilfssubstanzen enthalten, die zur Annäherung der physiologischen
Bedingungen des Empfängers,
zum Beispiel durch Erhöhung
der chemischen Stabilität
und Isotonizität,
erforderlich sind. Geeignete Hilfssubstanzen umfassen zum Beispiel
Natriumacetat, Natriumchlorid, Natriumlactat, Kaliumchlorid, Calciumchlorid
und andere Substanzen, die zur Herstellung von Phosphatpuffer, Trispuffer
und Bicarbonatpuffer verwendet werden. Hilfssubstanzen können ebenfalls
Konservierungsmittel, wie zum Beispiel Thimerosal, oder o-Cresol,
Formalin und Benzolalkohol enthalten.
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Ein „Vehikel
zur kontrollierten Freisetzung" ist
eine Art eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, der zur Freisetzung einer
Zusammensetzung oder Proteins der vorliegenden Erfindung auf kontrollierte
Weise in einen Patienten oder Kultur in der Lage ist. Eine Formulierung
zur kontrollierten Freisetzung umfasst eine Verbindung der vorliegenden
Erfindung (zum Beispiel ein CAF-Protein (einschließlich eines
Homologen), einen Antikörper,
ein Nukleinsäuremolekül oder eine
mimetische Verbindung) in einem Vehikel zur kontrollierten Freisetzung.
Geeignete Vehikel zur kontrollierten Freisetzung umfassen, sind
aber nicht beschränkt
auf biokompatible Polymere, polymere Matrices, Kapseln, Mikrokapseln,
Mikropartikel, Bolus-Präparationen,
osmotische Pumpen, Diffusionsvorrichtungen, Liposomen, Liposphären, und
transdermale Abgabesysteme.
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Ein „pharmazeutisch
verträgliches
Abgabevehikel" ist
ein pharmazeutisch verträglicher
Träger,
der zur Abgabe einer Zusammensetzung oder eines Proteins der vorliegenden
Erfindung an eine Zielstelle in der Lage ist. Ein pharmazeutisch
verträgliches
Abgabevehikel ist vorzugsweise zum Zielen (das heißt, Lenken,
selektiv Zuführen)
der Zusammensetzung auf die Zielstelle in der Lage. Eine „Zielstelle" bezieht sich auf
eine Stelle in einem Patienten, an welcher die Abgabe der Zusammensetzung
gewünscht
ist. Eine Zielstelle kann jede Zelle oder Gewebe sein, auf die durch
direkte Injektion oder durch Abgabe unter Verwendung künstlicher
und natürlicher
Lipid-enthaltender
Abgabevehikel (zum Beispiel Liposomen), Antikörper, viraler Vektoren und
anderer Abgabevehikel, einschließlich von Ribozymen, gezielt
wird. Natürliche
Lipid-enthaltende Abgabevehikel umfassen Liposomen und Micellen.
Ist die Verbin dung ein Protein (zum Beispiel ein CAF-Protein) umfassen
geeignete Abgabevehikel, Antikörper,
Liposomen und Zellen (zum Beispiel eine das Protein exprimierende
rekombinante Zelle), sind aber nicht beschränkt darauf. Ist die Verbindung
ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassen
geeignete Abgabevehikel Liposomen, virale Vektoren, Goldteilchen,
Poly-L-Lysin/DNA-Molekülkonjugate,
künstliche
Chromosomen oder andere Abgabevehikel, einschließlich von Ribozymen, sind aber nicht
beschränkt
darauf.
-
Der
Begriff „Liposom" bezieht sich auf
ein Abgabevehikel, das eine Lipidzusammensetzung umfasst, die zur
Abgabe eines Nukleinsäuremoleküls oder
Proteins an eine spezielle oder ausgewählte Stelle in einem Patienten
in der Lage ist. Ein Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung,
die zur Fusion mit der Plasmamembran der Zielzelle zur Abgabe des
Nukleinsäuremoleküls in eine
Zelle in der Lage ist. Geeignete Liposomen zur Verwendung im Rahmen
der vorliegenden Erfindung umfassen jedes Liposom. Bevorzugte Liposomen
der vorliegenden Erfindung umfassen solche Lipsomen, die im Allgemeinen
beispielsweise in Genabgabeverfahren, die dem Fachmann bekannt sind,
verwendet werden. Bevorzugter umfassen Liposomen Liposomen mit einer
polykationischen Lipidzusammensetzung und/oder Liposomen mit einem
Cholesteringerüst,
das an Polyethylenglykool konjugiert ist. Die Komplexierung eines
Liposoms mit einem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung kann unter Verwendung von Standardverfahren aus der Stand
der Technik erreicht werden.
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Der
Begriff „viraler
Vektor" bezieht
sich auf ein in der vorliegenden Erfindung verwendbares isoliertes Nukleinsäuremolekül, in dem
die Nukleinsäuremoleküle in eine
virale Hülle
gepackt sind, die den Eintritt der DNA in eine Zelle erlaubt. Es
kann eine Anzahl viraler Vektoren verwendet werden, umfassend aber
nicht beschränkt
auf solche, die auf Alphaviren, Pockeviren, Adenoviren, Herpesviren,
Lentiviren, Adenoassozierten Viren und Retroviren basieren.
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Der
Begriff „Verabreichen" bedeutet jedes Verfahren,
um ein Versuchstier mit einer Substanz (zum Beispiel Einführen einer
Substanz in ein Versuchstier) zu versehen, einschließlich der
in vivo oder ex vivo Verabreichung. Verfahren zur in vivo Verabreichung
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf intravenöse
Verabreichung, intrape ritoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung,
intrakoronare Verabreichung, intraarterielle Verabreichung (zum
Beispiel in eine Arteria carotis), subkutane Verabreichung, transdermale
Zufuhr, intratracheale Verabreichung, subkutane Verabreichung, intraartikuläre Verabreichung,
intraventrikuläre
Verabreichung, Inhalation (zum Beispiel Aerosol), intracerebrale,
nasale, orale, intraokulare, pulmonale Verabreichung, Imprägnierung
eines Katheters, durch ein Zäpfchen
und durch direkte Injektion in ein Gewebe. Ex vivo bezieht sich
auf die Durchführung
eines Teils des regulatorischen Schritts außerhalb des Patienten, wie
zum Beispiel durch Transfektion einer Population von Zellen, die
von einem Patienten entfernt wurden, mit einem rekombinanten Molekül, umfassend
eine ein erfindungsgemäßes CAF-Protein
kodierende Nukleinsäuresequenz,
unter solchen Bedingungen, dass das rekombinante Molekül nachfolgend
durch die transfizierte Zelle exprimiert wird, und das Rückführen der
transfizierten Zelle an den Patienten. Verfahren zur Ausführung einer derartigen
Transfektion umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Transfektion, virale
Infektion, Elektroporation, Lipofektion, bakteriellen Transfer,
Sphäroblastenfusion
und Adsorption. Ex vivo Verfahren sind besonders geeignet, wenn
die Zielzelle leicht aus dem Patienten entfernt und zurückgeführt werden
kann.
-
Der
Begriff „therapeutischer
Nutzen" bezieht
sich nicht notwendigerweise auf eine Heilung einer speziellen Erkrankung
oder eines Zustands, sondern er umfasst vielmehr vorzugsweise ein
Ergebnis, das eine Linderung der Erkrankung oder des Zustands, eine
Beseitigung der Erkrankung oder des Zustands, eine Verringerung
eines mit der Erkrankung oder dem Zustand assoziierten Symptoms,
eines Prävention
oder Linderung einer sekundären
Erkrankung oder eines Zustands, die aus dem Auftreten einer primären Erkrankung
oder eines Zustands resultieren (zum Beispiel aus einem primären Krebs
resultierender metastatischer Krebs), und/oder eine Prävention
der Erkrankung oder des Zustands umfassen können.
-
Der
Begriff „Schutz" in Bezug auf eine
Erkrankung oder einen Zustand bezieht sich auf die Verringerung
von Symptomen der Erkrankung, der Verringerung des Auftretens der
Erkrankung und/oder die Verringerung der Schwere der Erkrankung.
Das Schützen
eines Patienten oder Versuchstiers kann sich auf die Fähigkeit
einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei Verabreichung
an einen Patienten darauf beziehen, dass das Auftreten einer Erkrankung
verhindert wird und/oder Symptome der Erkrankung, Anzeichen oder
Ursachen geheilt oder gelindert werden. Somit umfasst der Schutz
eines Patienten vor einer Krankheit sowohl das Verhindern des Auftretens
der Erkrankung (prophylaktische Behandlung) als auch die Behandlung eines
Patienten, der eine Erkrankung aufweist (therapeutische Behandlung).
-
Der
Begriff „Prävention" bedeutet, dass das
Fortschreiten der Erkrankung reduziert und/oder eliminiert wird,
oder dass der Beginn der Erkrankung eliminiert wird (prophylaktische
Behandlung).
-
Der
Begriff „Behandlung" bedeutet, dass der
Beginn der Symptome (einschließlich
Schmerz) der Erkrankung und/oder pathogene Ursprung der Erkrankung
verzögert,
reduziert oder vollständig
verhindert wird, oder sofern vorhanden die Symptome verbessert oder
vollständig
eliminiert werden. Zum Beispiel behandelt die CAF-Zusammensetzung Krebs
nicht nur durch Unterdrückung
der Symptome der Erkrankung in Menschen und anderen Säugern, sondern
ebenfalls durch die Wirkung als prophylaktisches Mittel, um dem
Vorhandensein der Erkrankung in dem Empfänger entgegenzuwirken.
-
Der
Begriff „Erkrankung" bezieht sich auf
jede Abweichung von der normalen Gesundheit eines Säugers und
umfasst einen Zustand, wenn Krankheitssymptome vorhanden sind, sowie
Zustände,
bei denen eine Abweichung (zum Beispiel eine Infektion, Genmutation,
genetischer Defekt, etc.) aufgetreten ist, jedoch noch keine Symptome
augenscheinlich geworden sind.
-
Der
Begriff „ein" oder „eine" Einheit bezieht
sich auf eine oder mehrere dieser Einheiten. Als solches können die
Begriffe „ein" (oder „eine"), „eine oder
mehrere" und "mindestens eine" hier untereinander
austauschbar verwendet werden.
-
Die
Begriffe „umfassend", „einschließlich", und „aufweisend" können untereinander
austauschbar verwendet werden.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF)-Protein.
Der Bezug auf ein isoliertes CAF-Protein umfasst Proteine mit vollständiger Länge, abgeschnittene
Proteine (das heißt
Fragmente von Proteinen mit vollständiger Länge), Fusionsproteine oder
jedes Homologe eines derartigen Proteins. CAF-Homologe sind vorstehend
definiert worden. Ein CAF-Homolog
weist vorzugsweise CAF-biologische Aktivität auf, wie ebenfalls vorstehend
definiert ist. Insbesondere weist ein CAF-Protein der vorliegenden
Erfindung vorzugsweise eine biologische Aktivität auf, die eine Fähigkeit
zur Hochregulation (Zunahme, Stimulation, Induktion, Erhöhung) der
Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder
Interleukin-6 (IL-6) und/oder eine Fähigkeit zur Herunterregulation
(Abnahme, Inhibierung, Verhinderung, Unterdrückung) der Expression des Transformierenden
Wachstumsfaktors β (TGFβ) einschließt. Eine
derartige biologische Aktivität
kann durch jedes geeignete Verfahren zur Messung der Cytokinaktivität aus dem
Stand der Technik, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Immunoassays (einschließlich
enzymgekoppelter Immunadsorptionsassays, oder ELISA), Radioimmunassays
und RNA-Assays (siehe Beispiele), gemessen werden. Eine biologische
Aktivität
eines CAF-Proteins kann umfassen, ist aber nicht beschränkt auf:
eine Fähigkeit
des CAF zur Bindung an einen Rezeptor oder ein anderes Protein,
an DNA, eine Kohlenwasserstoffeinheit oder eine Lipideinheit zu
binden, die zu den vorstehend identifizierten biologischen Aktivitäten führt oder
dazu beiträgt.
Verfahren zur Messung der Fähigkeit
eines Proteins zur Bindung an eine andere Einheit, liegen innerhalb
der Fähigkeit
eines Fachmanns. Weiterhin liegt es innerhalb der Fähigkeit
eines Fachmanns unter Verwendung der hier bereitgestellten Lehre,
Modifikationen in der Nukleinsäure-
und/oder Aminosäuresequenz
des Wildtyp-CAF (zum Beispiel Aminosäure SEQ ID Nr:1 oder 6) durchzuführen und
Homologe mit derartigen Modifikationen auf eine oder mehrere biologische
Aktivitäten
von CAF zu testen. Zum Beispiel sind Verfahren zur Bestimmung der
Fähigkeit
von CAF zur Induktion oder Inhibierung der Cytokinexpression in
dem die Beispiele betreffenden Abschnitt beschrieben.
-
Die
Bezugnahme auf ein isoliertes CAF-Protein kann ein CAF-Protein,
das im Wesentlichen aus einer natürlichen Quelle gereinigt wurde
(zum Beispiel ein erfindungsgemäßes hyperimmunes
Ei), rekombinant hergestellten CAF und/oder synthetisch hergestellten
CAF umfassen. Ein besonderes bevorzugtes CAF-Protein der vorlie genden
Erfindung umfasst eine aus SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 ausgewählte Aminosäuresequenz.
SEQ ID Nr:1 erstreckt sich über
die Aminosäuren
1–30 der
SEQ ID Nr:6 und ist ein N-terminales Fragment von SEQ ID Nr:6. Es
wird angenommen, dass SEQ ID Nr:6 eine Aminosäuresequenz eines CAF-Proteins der
vorliegenden Erfindung mit vollständiger Länge ist, das aus einem hyperimmunen
Ei gereinigt wurde.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst ein CAF-Protein Proteine mit einer Aminosäuresequenz,
die mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der SEQ IDNr:1 oder
SEQ ID Nr:5 umfassen (das heißt
9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste,
die mit 9 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der SEQ ID Nr:1 oder SEQ ID
Nr:6 zu 100 % identisch sind). Ein derartiges Protein kann als ein
Homologes eines Proteins bezeichnet werden, das die SEQ ID Nr:1
und/oder SEQ ID Nr:6 (zum Beispiel ein CAF-Homolog) umfasst, jedoch ebenfalls Proteine
umfasst, die die SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 umfassen (zum
Beispiel natürlich
vorkommende CAF-Proteine). In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst ein Homologes eines CAF-Proteins eine Aminosäuresequenz,
die mindestens 12, bevorzugter mindestens ungefähr 15 und besonders bevorzugt mindestens
ungefähr
20 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste
der SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 umfasst. In einer anderen Ausführungsform
umfasst ein CAF-Homolog eine Aminosäuresequenz, die mindestens
ungefähr
30, bevorzugter mindestens ungefähr
35 und bevorzugter mindestens ungefähr 40 und bevorzugter mindestens
ungefähr
45 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 50 und besonders bevorzugt
mindestens ungefähr
55 und besonderes bevorzugt mindestens ungefähr 60 und bevorzugter mindestens
ungefähr
65 aufeinanderfolgende Aminosäurereste
der SEQ ID Nr:6 umfasst.
-
Ein
CAF-Proteinhomolog kann Proteine umfassen, die durch eine Nukleinsäuresequenz,
umfassend mindestens 27 und bevorzugt mindestens 36 und bevorzugter
mindestens 45 und bevorzugter mindestens 60 und bevorzugter mindestens
75 aufeinanderfolgende Nukleotide einer SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ
ID Nr:6 kodierenden Nukleinsäuresequenz,
kodiert wird. In einer weiteren Ausführungsform kann ein CAF-Homolog
Proteine umfassen, die durch eine Nukleinsäuresequenz, umfassend mindestens
90 und bevorzugt mindestens 105 und bevorzugter mindestens 120 und bevorzugter
mindestens 135 und bevorzugter mindestens 150 und bevorzugter mindestens
165 und bevorzugter mindestens 180 und bevorzugter mindestens 195
aufeinanderfolgende Nukleotide einer SEQ ID Nr:6 kodierenden Nukleinsäuresequenz,
kodiert wird.
-
Ein
CAF-Protein weist, wie vorstehend diskutiert wurde, vorzugsweise
eine messbare CAF-biologische Aktivität auf (das heißt es weist
eine biologische Aktivität
auf). Jedoch wird in einigen Ausführungsformen eine CAF-Protein,
einschließlich
eines CAF-Homologen, für
die Herstellung von Antikörpern
oder die Entwicklung von Oligonukleotiden verwendet, die zur Identifizierung
von CAF und CAF-verwandten Proteinen (zum Beispiel zum Zwecke des
Screenings/Auswahl von hyperimmunen Ei-Produkten bezüglich CAF-angereichter Teile
im Falle von Antikörpern
oder Oligonukleotide, zur Klonierung der CAF-kodierenden Nukleinsäuresequenz
(im Falle von Oligonukleotiden) und/oder zur Identifikation von
Proteinen oder Nukleinsäuren,
die an CAF binden, verwendbar sind. In diesen Ausführungsformen
ist es nicht besonderes relevant, ob das CAF-Protein eine biologische
Aktivität
aufweist, ansonsten ist es nur im dem Maße relevant, dass ein für derartige
Verfahren verwendbares CAF-Protein
intrinsisch eine CAF-biologische Aktivität aufweist.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst ein CAF-Protein (zum Beispiel ein CAF-Proteinhomologes) eine Aminosäuresequenz,
die mindestens zu ungefähr
65 % mit SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 15 aufeinanderfolgende
Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
20 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens 25 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist.
Ein CAF-Protein umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens
zu ungefähr
70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % zu SEQ ID Nr:1 und/oder
SEQ ID Nr:6 über
mindestens ungefähr
15 Aminosäuren,
bevorzugter über
mindestens ungefähr
20 Aminosäuren
und besonderes bevorzugt über
mindestens ungefähr
25 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist.
In einer weiteren Ausführungsform
umfasst ein CAF-Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens
zu ungefähr
65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt
mindestens zu ungefähr
95 % z mit SEQ ID Nr:6 über mindestens
ungefähr
30 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
35 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
40 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
45 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
50 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
55 Aminosäuren
und besonderes bevorzugt über
mindestens ungefähr
60 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:6 identisch ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst ein CAF-Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu
ungefähr
60 % mit SEQ ID Nr:6 über
mindestens ungefähr
66 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
67 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
68 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
69 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Ein CAF-Protein umfasst vorzugsweise
eine Aminosäuresequenz,
die mindestens zu ungefähr
65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt
mindestens zu ungefähr
95 % mit SEQ ID Nr:6 über
mindestens 66 Aminosäuren
und bevorzugter über mindestens
ungefähr
67 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
68 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
69 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Verfahren zur Bestimmung der prozentualen
Identität
sind vorstehend beschrieben.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst ein CAF-Protein, einschließlich eines CAF-Proteinhomologen,
ein Protein mit einer Aminosäuresequenz,
die ausreichend ähnlich
zu einer natürlichen
CAF-Aminosäuresequenz
ist, so dass eine das Homologe kodierende Nukleinsäuresequenz
in der Lage ist, unter Bedingungen mäßiger, hoher oder sehr hoher
Stringenz (wie vorstehend beschrieben) an (das heißt mit)
ein Nukleinsäuremolekül, das das
natürliche
CAF-Protein kodiert, zu hybridisieren (das heißt an das Komplement des Nukleinsäurestrangs,
der die natürliche
CAF-Aminosäuresequenz
kodiert). Derartige Bedingungen sind vorstehend definiert. Ein Homolog
eines CAF-Proteins ist vorzugsweise durch ein Nukleinsäuremolekül ko diert,
das eine Nukleinsäuresequenz
umfasst, die unter Bedingungen mäßiger, hoher
oder sehr hoher Stringez an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz
hybridisiert, die ein Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, dargestellt
durch SEQ ID Nr:1 oder SEQ ID Nr:6, kodiert. Ein Nukleinsäuresequenzkomplement
einer Nukleinsäuresequenz,
die ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, bezieht
sich auf die Nukleinsäuresequenz
des Nukleinsäurestrangs,
der zu dem Strang, der CAF kodiert, komplementär ist. Es ist klar, dass eine doppelsträngige DNA,
die eine gegebene Aminosäuresequenz
kodiert, eine einzelsträngige
DNA und deren komplementären
Strang mit einer Sequenz, die zu der einzelsträngigen DNA das Komplement ist,
umfasst. Als solches können
die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung entweder doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein und diejenigen Nukleinsäuremoleküle umfassen,
die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz,
die die Aminosäuresequenz
SEQ ID Nr:1 und/oder SQ ID Nr:6 kodiert, und/oder mit dem Komplement
der Nukleinsäuresequenz,
die eine Aminosäuresequenz
SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 kodiert, stabile Hybride bilden.
Verfahren zum Ableiten einer komplementären Sequenz sind dem Fachmann
bekannt. Es ist zu beachten, dass, da die Aminosäuresequenzierungs- und Nukleinsäuresequenzierungstechnologien
nicht vollkommen fehlerfrei sind, die hier dargestellten Sequenzen
höchstens
scheinbare Sequenzen eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung
darstellen.
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CAF-Proteinhomologe
können
das Ergebnis einer natürlichen
allelen Variation oder natürlichen
Mutation sein. CAF-Proteinhomologe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls
unter Verwendung von Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt
sind, umfassend aber nicht beschränkt auf direkte Modifikationen an
dem Protein oder Modifikationen an dem das Protein kodierenden Gen
unter Verwendung von zum Beispiel klassischen oder rekombinanten
DNA-Techniken zum Ausführen
von zufälliger
oder gezielter Mutagenese, hergestellt werden. Eine natürlich vorkommende
allele Variante einer CAF-kodierenden Nukleinsäure ist ein Gen, das im Wesentlichen
an demselben Locus (oder Loci) in dem Genom vorkommt, wie das Gen,
das eine Aminosäuresequenz
SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 kodiert, aber das aufgrund natürlicher
Variationen, die zum Beispiel durch Mutation oder Rekombination
verursacht sind, eine ähnliche
jedoch keine identische Sequenz aufweist. Natürliche allele Varianten kodieren
typischerweise Proteine mit einer Aktivität, die im Vergleich zu derjenigen
des Proteins, das durch das Gen, mit dem sie verglichen werden,
kodiert wird, ähnlich
ist. Eine Klasse aller Varianten kann dasselbe Protein kodieren,
jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterschiedliche
Nukleinsäuresequenzen
aufweisen. Allele Varianten können
ebenfalls Änderungen
in den 5'- oder 3'-nichttranslatierten
Regionen des Gens (zum Beispiel regulatorische Kontrollregionen) umfassen.
Allele Varianten sind dem Fachmann gut bekannt und man würde erwarten,
sie innerhalb einer gegebenen bakteriellen Spezies zu finden, da
das Genom haploid ist, und/oder unter einer Gruppe von zwei oder mehreren
bakteriellen Spezies.
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CAF-Proteine
umfassen ebenfalls Expressionsprodukte von Genfusionen (zum Beispiel
diejenigen, die zur Überexpression
löslicher
aktiver Formen des rekombinanten Proteins verwendet werden), von
mutagenisierten Genen (wie zum Beispiel Gene mit Codonmodifikationen
zur Steigerung der Gentranskription und -translation) und von abgeschnittenen
Genen (wie zum Beispiel Gene mit Domänen, die zur Erzeugung biologisch
aktiver Fragmente unter Untereinheiten des Proteins mit voller Länge entfernt
wurden). Es wird festgestellt, dass CAF-Proteine und Proteinhomologe
der vorliegenden Erfindung Proteine umfassen, die keine CAF-Aktivität aufweisen.
Derartige Proteine sind zum Beispiel für die Herstellung von Antikörpern verwendbar.
-
Ein
isoliertes CAF-Protein der vorliegenden Erfindung, umfassend Proteine
von voller Länge,
abgeschnittene Proteine, andere Homologe und Fusionsproteine können auf
unkomplizierte Art identifiziert werden: (1) durch die Fähigkeit
des Proteins, die Expression von TNFα, IL-1β und/oder IL-6 hochzuregulieren
und/oder TGFβ herunterzuregulieren,
wie zum Beispiel in den Beispielen erläutert wird, (2) durch die biochemischen
und strukturellen Eigenschaften des Proteins (zum Beispiel Molekulargewicht,
Primärstruktur,
Stabilitätscharakteristika),
(3) durch die selektive Bbindung des Proteins an einen Antikörper gegen
ein CAF-Protein, und/oder (4) durch die Homologie des Proteins mit
anderen CAF-Aminosäure-
und Nukleinsäuresequenzen,
wie zum Beispiel mit einer CAF-Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz
von anderen Quellen als einem hyperimmunen Ei. Die minimale Größe eines
Proteins und/oder Homologen der vorliegenden Erfindung ist eine
Größe, die
für eine
CAF-biologische Aktivität
ausreicht, oder wenn das Protein keine derartige Aktivität aufweisen
muss, ist sie eine Größe, die
ausreicht, um für
einen anderen mit einem CAF-Protein der vorliegenden Erfindung assoziierten
Zweck auszureichen, wie zum Beispiel für die Herstellung von Antikörpern, die
an natürlich
vorkommendes CAF-Protein binden. Somit ist die minimale Größe eines
CAF-Proteins oder Homologen der vorliegenden Erfindung eine Größe, die
zur Bildung von mindestens einem Epitop, das durch einen Antikörper erkannt werden
kann, ausreicht und sie beträgt
typischerweise mindestens 8 bis 30 Aminosäuren in der Länge (einschließlich jeder
Länge zwischen
8 und 30 in Schritten von einer Aminosäure), wobei bevorzugte Größen davon
abhängen,
ob Teile von voller Länge,
multivalente oder funktionale Teile derartiger Proteine erwünscht sind.
Es gibt keine andere Einschränkung
als eine praktische Einschränkung
für die
maximale Größe eines derartigen
Proteins, wobei das Protein einen Teil eines CAF-Proteins (einschließlich eines
CAF-Homologen) oder eines CAF von voller Länge umfassen kann.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Fusionsprotein, das
eine CAF-enthaltende
Domäne (einschließlich eines
Homologen eines CAF-Proteins) umfasst, die an einem oder mehreren
Fusionssegmenten gebunden ist. Geeignete Fusionssegmente zur Verwendung
mit der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Segmente, die die Stabilität
des Proteins erhöhen,
eine weitere wünschenswerte
biologische Aktivität
bereitstellen (zum Beispiel ein Cytokin), und/oder die Reinigung
eines CAF-Proteins (zum Beispiel durch Affinitätschromatographie) unterstützen können. Ein
geeignetes Fusionssegment kann eine Domäne von beliebiger Größe sein,
die die gewünschte
Funktion aufweist (zum Beispiel, die eine erhöhte Stabilität, Löslichkeit,
Wirkung oder biologische Aktivität
verleiht, und/oder die die Reinigung eines Proteins vereinfacht).
Fusionssegmente können
an Amino- und/oder
Carboxylenden der CAF-enthaltenden Domäne des Proteins gebunden werden
und sie können
bezüglich
Spaltung anfällig
sein, um eine einfache Rückgewinnung
eines CAF-Proteins zu ermöglichen.
Fusionsproteine werden vorzugsweise durch Kultivierung einer rekombinanten
Zelle hergestellt, die mit einem Fusionsnukleinsäuremolekül transfiziert ist, das ein
Protein kodiert, umfassend das entweder an das Carboxyl- und/oder
Aminoende einer CAF-enthaltenden Domäne gebundene Fusionssegment.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls eine mimetische Verbindung
eines CAF-Proteins.
Der Begriff „mimetische
Verbindung", wie
er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Peptid- oder Nicht-Peptidverbindung,
die in der Lage ist, die biologische Wirkung eines natürlich vorkommenden
Peptids nachzuahmen, weil oftmals die mimetische Verbindung eine
Grundstruktur aufweist, die die Grundstruktur des natürlich vorkommenden
Peptids nachahmt, und/oder die wichtigsten biologischen Eigenschaften
des natürlich
vorkommenden Peptids aufweist. Mimetische Verbindungen können umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf: Peptide, die wesentliche Modifikationen ausgehend von dem Prototyp
aufweisen, wie zum Beispiel keine Seitenkettenähnlichkeit mit dem natürlich vorkommenden
Peptid (derartige Modifikationen können zum Beispiel die Anfälligkeit
gegen Abbau verringern), antiidiotype und/oder katalytische Antikörper, oder
Fragmente davon, nicht proteinhaltige Teile eines isolierten Proteins
(zum Beispiel Kohlenwasserstoffstrukturen), oder synthetische oder
natürliche
organische Moleküle,
einschließlich
von zum Beispiel Nukleinsäuren
und Arzneimitteln, die durch kombinatorische Chemie identifiziert
worden sind.
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Derartige
mimetische Verbindungen können
konstruiert, ausgewählt
und/oder anderweitig unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren,
die aus dem Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden.
Verschiedene Verfahren des Arzneimittelsdesigns, die zur Konstruktion
von mimetischen Verbindungen oder anderen therapeutischen Verbindungen,
die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, werden in Maulik
et al., 1997, Molecular Bitechnology: Therapeutic Applications and
Strategies, Wiley-Liss, Inc. offenbart. Eine CAF-mimetische Verbindung
kann zum Beispiel von Molekülmannigfaltigkeitsstrategien
(eine Kombination verwandter Strategien, die die schnelle Konstruktion
großer
chemisch verschiedener Molekülbibliotheken
gestattet), Bibliotheken natürlicher
oder synthetischer Verbindungen, insbesondere von chemischen oder
kombinatorischen Bibliotheken (das heißt Bibliotheken von Verbindungen,
die sich in der Sequenz oder Größe unterscheiden,
die aber ähnliche
Baueinheiten aufweisen) oder durch rationales gerichtetes oder zufälliges Arzneimitteldesign
erhalten werden. Siehe zum Beispiel Maulik et al., s.o.
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Bei
Molekülmannigfaltigkeitsstrategien
werden Bibliotheken großer
Verbindungen, zum Beispiel von Peptiden, Oligonukleotiden, Kohlenwasserstoffen
und/oder synthetischen organischen Molekülen, unter Verwendung biologischer,
enzymatischer und/oder chemischer Methoden synthetisiert. Die zur
Entwicklung einer Molekülmannigfaltigkeitsstrategie
entscheidenden Parameter umfassen die Mannigfaltigkeit einer Untereinheit,
Molekulargröße und Mannigfaltigkeit
der Bibliothek. Das allgemeine Ziel des Screenings derartiger Bibliotheken
besteht darin, die sequentielle Anwendung der kombinatorischen Auswahl
zum Erhalten von Liganden mit hoher Affinität für ein gewünschtes Ziel zu verwenden und
dann die Leitmoleküle
entweder durch zufällige oder
gerichtete Designstrategien zu optimieren. Verfahren der Molekülmannigfaltigkeit
sind ausführlich
in Maulik, et al., ebd. beschrieben.
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Maulik
et al. offenbaren zum Beispiel ebenfalls Verfahren eines gerichteten
Designs, bei denen der Anwender das Verfahren zur Erzeugung neuer
Moleküle
aus einer Fragmentbibliothek von geeignet ausgewählten Fragmenten steuert; Verfahren
eines zufälligen
Designs, bei denen der Anwender einen genetischen oder anderen Algorithmus
zur zufälligen
Mutation von Fragmenten und deren Kombinationen verwendet, während gleichzeitig
ein Auswahlkriterium zur Bewertung der Eignung der Kandidatliganden
angewandt wird; und ein Gitter-basiertes Verfahren, bei dem der
Anwender die Wechselwirkungsenergie zwischen dreidimensionalen Rezeptorstrukturen
und kleinen Fragmentsonden, gefolgt von dem Aneinanderbinden vorteilhafter
Sondenstellen, berechnet.
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CAF-Proteine
können
erfindungsgemäß von jedem
Tier und insbesondere von jedem Tier der Wirbeltierklassen der Säuger oder
Vögel abgeleitet
werden. CAF-Proteine werden vorzugsweise von einem Ei-erzeugenden
Tier aus der Wirbeltierklasse der Vögel, abgeleitet. Bevorzugte
CAF-Proteine umfassen isolierte CAF-Proteine von hyperimmunisierten
Hühnern,
Truthähnen
oder Enten. Ein besonders bevorzugtes isoliertes CAF-Protein ist
ein aus hyperimmunisierten Hühnereiern
stammendes CAF-Protein.
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Ein
CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kann, wie vorstehend erörtert, durch
jedes für
die Herstellung von Proteinen oder Polypeptiden geeignete Verfahren
hergestellt werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung
eines CAF-Proteins
der vorliegenden Erfindung ist durch chemische Syntheseverfahren.
Derartige Verfahren umfassen zum Beispiel gut bekannte chemische
Verfahren, wie zum Beispiel eine Lösungs- oder Festphasenpeptidsynthese
oder einer halbe Synthese in Lösung,
beginnend mit Proteinfragmenten, die über herkömmliche Lösungsverfahren gekoppelt sind.
Derartige Verfahren sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und
können
in allgemeinen Texten und Artikeln auf diesem Gebiet, wie zum Beispiel: Merrifield,
1997, Methods Enzymol. 289:3–13;
Wade et al., 1993, Australas Biotechnol. 3(6):332–336; Wong et
al., 1991, Expertentia 47(11–12);1123–1129; Carey
et al., 1991, Ciba Found Symp. 158:187–203; Plaue et al., 1990, Biologicals
18(3):147–157;
Bodanszky, 1985, Int. J. Pept. Protein Res. 25(5):449–474; oder
H. Dugas und C. Penny, Bioorganic Chemistry, (1981) auf den Seiten
54–92
gefunden werden. Peptide können
zum Beispiel durch eine Festphasenmethodologie unter Verwendung
einer handelsüblichen
Peptidsynthesevorrichtung und Synthesezyklen, die von dem Hersteller
bereitgestellt werden, synthetisiert werden. Der Fachmann erkennt,
dass die Festphasensynthese ebenfalls unter Verwendung der FMOC-Strategie
und einer TFA/Spülmittelspaltungsmischung
ausgeführt
werden könnte.
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Sind
größere Mengen
eines CAF-Proteins erwünscht,
kann das Protein unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnologie
hergestellt werden, obwohl für
Proteine dieser kleineren Größe (das
heißt Peptide)
die Peptidsynthese im Allgemeinen bevorzugt werden kann. Ein Protein
kann rekombinant durch Kultivierung einer Zelle, die zur Expression
des Proteins in der Lage ist (das heißt durch Exprimierung eines
das Protein kodierenden rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wie nachstehend ausführlich beschrieben
ist), unter Bedingungen, die die Erzeugung des Proteins bewirken,
und durch Rückgewinnung
des Proteins hergestellt werden. Wirksame Kulturbedingungen umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf wirksame Medien, Bioreaktor-, Temperatur-, pH-Wert- und Sauerstoffbedingungen,
die die Proteinerzeugung erlauben. Ein wirksames Medium bezieht
sich auf jedes Medium, in dem eine Zelle zur Erzeugung eines CAF-Proteins
der vorliegenden Erfindung kultiviert wird. Ein derartiges Medium
umfasst typischerweise ein wässriges
Medium mit assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff und Phosphatquellen
und geeigneten Salzen, Mineralien, Metallen und anderen Nährstoffen,
wie zum Beispiel Vitaminen. Rekombinante Zellen (das heißt Zellen,
die ein CAF-Protein-kodierendes Nukleinsäuremolekül exprimieren) können in
herkömmlichen
Fermentationsbioreaktoren, Schüttelkolben,
Teströhrchen,
Mikrotiterschalen und Petrischalen kultiviert werden. Die Kultivierung
kann bei einer für
eine rekombinante Zelle geeigneten Temperatur, pH-Wert und Sauerstoffgehalt
ausgeführt
werden. Derartige Kultivierungsbedingungen sind im Rahmen der Fachkenntnis
eines Durchschnittsfachmanns. Derartige Techniken sind aus dem Stand
der Technik gut bekannt und werden zum Beispiel in Sambrook et al.,
1988, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York
oder Current Protocols in Molecular Biology (1989) und Ergänzungsbänden beschrieben.
-
In
Abhängigkeit
von dem für
die Erzeugung verwendeten Vektor und Wirtssystem können die
resultierenden rekombinanten CAF-Proteine der vorliegenden Erfindung
entweder innerhalb der rekombinanten Zelle bleiben, in das Kulturmedium
ausgeschieden werden, in einen Raum zwischen zwei Zellmembranen,
wie zum Beispiel der periplasmatische Raum in E. coli, ausgeschieden
werden, oder auf der äußeren Oberfläche einer Zelle
oder viralen Membran zurückbehalten
werden. Der Ausdruck „Rückgewinnung
des Proteins" bezieht
sich auf das Sammeln des das Protein enthaltenden gesamten Kulturmediums
und muss nicht zusätzliche
Schritte der Trennung und Reinigung beinhalten. CAF-Proteine der
vorliegenden Erfindung können
unter Verwendung einer Vielzahl von Standardreinigungstechniken,
wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Affinitätschromatographie,
Ionenaustauschchromatographie, Filtration, Elektrophorese, hydrophobe
Wechselwirkungschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Umkehrphasenchromatographie,
Concanavalin A-Chromatographie,
Chromatofokussierung und differentielle Solubilisierung gereinigt
werden. Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise
in einer „im
Wesentlichen reinen" Form
gewonnen. Der Begriff „im
Wesentlichen rein" beizieht
sich, wie er hier verwendet wird, auf eine Reinheit, die die wirksame
Verwendung des Proteins als Biokatalysator, anderes Reagenz oder
zur Verabreichung an ein Versuchstier gestattet. Zum Beispiel wird angenommen,
dass eine CAF-umfassende wasserlösliche
Fraktion, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, im Wesentlichen
rein ist und zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
kann ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung aus einer geeigneten
Quelle hochgereinigt werden, umfassend aber nicht beschränkt auf
das Ei eines Vogels, der mit einem oder mehreren Immunogenen und
insbesondere bakteriellen Antigenen oder deren synthetischen Äquivalenten
hyperimmunisiert worden ist. Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt,
dass der Cytokin-Aktivierungsfaktor
der vorliegenden Erfindung in hyperimmunen Eiern in supranormalen
Gehalten vorhanden ist. Der hochgereinigte Ei-Cytokin-Aktivierungsfaktor
kann aus dem gesamten Ei, Eigelb und Eiweiß isoliert werden. Der aus dem
Eigelb hochgereinigte CAF zeigt eine höhere immunregulatorische Aktivität als der
aus dem Eiweiß gereinigte
CAF.
-
Das
Reinigungsverfahren von CAF aus dem Ei in großem Maßstab verwendet typischerweise
40 kg hyperimmunes Eigelb (zum Beispiel PL100 oder S-100 Eigelb,
das in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999 beschrieben ist) als Ausgangspunkt.
Der CAF wird unter Verwendung der Technologien der Ultrafiltration,
Q Sepharose Ionenaustauschchromatographie, Festphasenextraktion
und zusätzliche
Verfahren, wie sie nachstehend kurz und in dem Abschnitt der Beispiele
ausführlich
beschrieben sind, hoch gereinigt.
-
Der
Cytokin-Aktivierungsfaktor kann aus dem gesamten Ei, Eigelb oder
Eiweiß hoch
gereinigt werden. Ein Beispiel eines bevorzugten Verfahrens zur
hohen Reinigung ist wie folgt:
- 1. Eigelbdelipidisierung,
- 2. Eigelb 3.000 Dalton MW-Permeatherstellung,
- 3. Trennung der Fraktionen durch Ionen- oder Anionenaustauschchromatographie,
- 4. Festphasenextraktion,
- 5. Verteilungsextraktion der Festphasenextraktionsfraktion,
- 6. HPLC-Trennung und
- 7. Bioassay für
die Cytokininduktionsaktivität.
-
Das
Nachfolgende ist eine ausführlichere
Beschreibung dieses Verfahrens:
-
Schritt
1: Der Cytokin-Aktivierungsfaktor kann aus dem gesamten Ei, Eigelb
oder Eiweiß hoch
gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung
aus dem Eigelb gereinigt. Der Lipidteil wird aus dem gesamten Ei
oder Eigelb durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind,
entfernt. Im Falle eines sprühgetrockneten
Eigelbpulvers kann die Entfettung mit Lösungsmitteln (Propan, Butan
oder Hexan oder mit binären
Lösungsmitteln),
superkritischem CO2, Enzymen und dergleichen
erreicht werden, und im Falle von flüssigem Eigelb kann die Entfettung durch
das Caprylsäuretrennungsverfahren
(CAPS), das von Lee (U.S. Patent Nr. 5,367,054) offenbart wurde,
erreicht werden. Für
Eiweiß ist
keine Fettentfernung notwendig und daher kann die flüssige oder
pulverisierte Form des Eiweißes
entweder erhitzt oder direkt durch herkömmliche Verfahren und wie in
den nachstehend aufgeführten
Beispielen beschrieben ist, gelöst
werden. Das gesamte Ei, Eigelb oder Eiweiß wird dann vorzugsweise in
entweder flüssiger
oder Pulverform verarbeitet und wird weiterhin zum Erhalten von
wasserlöslichen
Fraktionen verarbeitet. (Siehe Beispiele).
-
Schritt
2: Die resultierenden wasserlöslichen
Fraktionen aus dem gesamten Ei, Eigelb oder Eiweiß werden
einer Ultrafiltration unter Verwendung von Ultrafiltrationssystemen
unterzogen, die mit einer Molekulargewichtsausschlussmembran von
30.000 Dalton ausgestattet sind. Das Ultrafiltrationsverfahren trennt
Moleküle
mit einem Molekulargewicht von mehr als näherungsweise 3000 Dalton von
denjenigen mit einem Molekulargewicht von weniger als näherungsweise
3000 Dalton. Es wird angemerkt, dass der Ausschluss von 3000 Dalton
eine Näherung
ist, da signifikant größere Proteine
den Filter passieren können,
wenn die Sekundärstruktur
dies erlaubt (das heißt
im Wesentlichen lineare Polypeptide/Proteine). Sobald gefiltert
wurde, enthalten die resultierenden Ultrafiltrate Moleküle mit einem
Molekulargewicht von weniger als näherungsweise 3000 Dalton (oder
größere im
Wesentlichen lineare Polypeptide), die dann gefriergetrocknet, gewogen
und zum Testen mit einem Bioassay und für weitere Trennung präpariert
werden.
-
Schritte
3–7: Diese
Schritte werden ausführlich
in Beispiel 1 und den Figuren beschrieben und werden hier nicht
wiederholt.
-
Der
hochreine Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung
weist die folgenden physikalischen/chemischen Merkmale (das heißt identifizierende
Charakteristika) auf:
- a. er weist mindestens
eine biologisch aktive Untereinheit auf, die einen Ultrafiltrationsfilter
mit einem Molekulargewichtsausschluss von 30.000 Dalton passiert,
- b. er ist bei einer Temperatur bis zu mindestens 50 °C stabil
(das heißt
er weist eine messbare biologische Aktivität auf),
- c. er ist bei einem pH-Wert von ungefähr 2 bis ungefähr 10 stabil
(das heißt
er weist eine messbare biologische Aktivität auf),
- d. er ist wasserlöslich,
- e. er ist nicht steroidal,
- f. er ist negativ geladen,
- g. er ist im Wesentlichen nicht polar und
- h. er weist eine λmax von ungefähr 254 nm auf.
-
Zusätzlich weist
der hochreine Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung
die folgenden biochemischen/funktionalen Merkmale auf:
- a. er weist eine immunregulatorische Aktivität in einem Versuchstier auf,
- b. er ist sowohl in dem Eiweiß als auf dem Eigelb von Vogeleiern
vorhanden,
- c. er weist bei Isolierung aus Eigelb typischerweise eine größere immunregulatorische
Aktivität
als bei Isolierung aus Eiweiß auf,
- d. er induziert die Cytokinexpression in vitro und er induziert
insbesondere die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder
Interleukin-6 (IL-6) in vitro und/oder
- e. er reguliert die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β/TGFβ) herunter.
-
Außerdem kann
das CAF-Protein der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit zur Induzierung der
Differenzierung von Zellen der Makrophagen- und/oder der Monozytenlinie
aufweisen.
-
Das
Molekulargewicht von 3000 Dalton wird aus der Isolierung und Reinigung
der Zusammensetzung abgeleitet, wobei das Isolierungs- und Reinigungsverfahren
eine Ultrafiltrationsmembran verwendet, die den Durchgang von molekularen
Spezies mit mehr als 3000 Dalton durch den Filter nicht erlaubt.
Es wurde anfangs angenommen, dass der hochgereinigte Cytokin-Aktivierungsfaktor
nicht proteinhaltig und nicht steroidal ist, weil er eine kleine
Größe aufweist
und durch Enzyme, die Proteine abbauen, nicht abgebaut wird (basierend auf
einem in vivo Assay, in dem das Protein nach oraler Verabreichung
eine biologische Aktivität
zeigte und daher Verdauungsenzymen ausgesetzt war). Überdies
ist die Zusammensetzung oral aktiv. Ohne Bindung an eine Theorie
nehmen die vorliegenden Erfinder an, dass die kleine stabile Form
des hochgereinigten Cytokin-Aktivierungsfaktors (da er sich von
den meisten Proteinen unterscheidet, die viel größer sind) seine Absorption
von dem Verdauungstrakt erleichtert. Schließlich ist der hochgereinigte
Cytokin-Aktivierungsfaktor hitzestabil, ein Merkmal, das bei den
meisten Proteinen typischerweise nicht gefunden wird. Es ist jedoch
bekannt, dass der hochgereinigte Cytokin-Aktivierungsfaktor tatsächlich ein
Protein ist, das die vorstehend identifizierten Stabilitätsmerkmale
aufweist. Eine derartige Entdeckung war überraschend und zeigt weiter
die Vorteile des Cytokin-Aktivierungsfaktors
der vorliegenden Erfindung, wobei er für einen Einschluß in Formulierungen,
verarbeiteten Lebensmitteln und Impfstoffen, einschließlich oraler
Impfstoffe und Formulierungen sehr geeignet ist.
-
Weitere
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung umfassen Nukleinsäuremoleküle, die ein CAF-Protein kodieren.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung umfasst ein Nukleinsäuremolekül, umfassend
eine Nukleinsäuresequenz,
die jedes der isolierten CAF-Proteine, einschließlich eine CAF-Homologen, wie
vorstehend beschrieben, kodiert. Ein bevorzugtes CAF-Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung umfasst eine Nukleinsäuresequenz,
die ein Protein kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens
9 und bevorzugter mindestens 12 und bevorzugter mindestens ungefähr 15 und
bevorzugter mindestens ungefähr
20 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste
der SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 umfasst. In einer weiteren
Ausführungsform
umfasst ein bevorzugtes CAF-Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz,
die ein Protein kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens
ungefähr
30 und bevorzugter mindestens ungefähr 35 und bevorzugter mindestens
ungefähr
40 und bevorzugter mindestens ungefähr 45 und bevorzugter mindestens
ungefähr
50 und bevorzugter mindestens ungefähr 55 und bevorzugter mindestens
ungefähr 60
und bevorzugter mindestens ungefähr
65 aufeinanderfolgende Aminosäurereste
der SEQ ID Nr:6 umfasst.
-
In
einer Ausführungsform
umfassen derartige Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäuremoleküle, die
unter Bedingungen mäßiger Stringenz
und bevorzugter und Bedingungen hoher Stringenz und besonders bevorzugt unter
Bedingungen sehr hoher Stringenz mit dem Komplement einer Nukleinsäuresequenz,
die einen natürlich vorkommenden
CAF kodiert (das heißt
einschließlich
natürlich
vorkommender alleler Varianten, die einen CAF kodieren), hybridisiert.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein
CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, umfasst eine Nukleinsäuresequenz,
die unter Bedingungen mäßiger, hoher
oder sehr hoher Stringenz an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz
hybridisiert, die ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz,
dargestellt durch SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 kodiert.
-
In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die ein CAF-Protein
der vorliegenden Erfindung kodiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die eine Aminosäuresequenz
kodiert, die mindestens zu ungefähr
65 % mit SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 15 aufeinanderfolgende
Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
20 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
25 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist.
Ein Nukleinsäuremolekül, das ein
CAF-Protein der
vorliegenden Erfindung kodiert, umfasst eine Nukleinsäuresequenz,
die eine Aminosäuresequenz
kodiert, die mindestens zu ungefähr
70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % mit SEQ ID Nr:1 und/oder
SEQ ID Nr:6 über
mindestens ungefähr
15 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
20 Aminosäuren
und besonderes bevorzugt über
mindestens ungefähr
25 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist.
In einer Ausführungsform umfasst
ein Nukleinsäuremolekül, das ein
CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die eine Aminosäuresequenz
kodiert, die mindestens zu ungefähr
65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr 85
% und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt
mindestens zu ungefähr
95 % mit SEQ ID Nr:6 über
mindestens ungefähr
30 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
35 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr 40
Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
45 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
50 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
55 Aminosäuren
und besonderes bevorzugt über
mindestens ungefähr
60 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:6 identisch ist.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein
CAF-Protein der
vorliegenden Erfindung kodiert, eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz
kodiert, die mindestens zu ungefähr
60 % mit SEQ ID Nr:6 über
mindestens 66 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr 67
Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
68 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
69 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das ein CAF-Protein der
vorliegenden Erfindung kodiert, umfasst vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz,
die eine Aminosäuresequenz
kodiert, die mindestens zu ungefähr
65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens
zu ungefähr
85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt
mindestens zu ungefähr
95 % mit SEQ ID Nr:6 über
mindestens 66 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
67 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
68 Aminosäuren
und bevorzugter über
mindestens ungefähr
69 Aminosäuren
von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Identität sind vorstehend
beschrieben.
-
Ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül ist erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül, das aus
seinem natürlichen
Milieu entfernt worden ist (das heißt, das menschlicher Manipulation
unterzogen worden ist) und kann eine DNA, RNA oder Derivate von
entweder einer DNA oder RNA, einschließlich cDNA, umfassen. Somit
spiegelt der Begriff „isoliert" nicht das Ausmaß wider,
bis zu dem das Nukleinsäuremolekül gereinigt
worden ist. Isolierte CAF-Nukleinsäuremoleküle können zum Beispiel CAF-Gene, natürliche allele
Varianten von CAF-Genen, CAF-kodierende Regionen oder Teile davon
und CAF-kodierenden und/oder regulatorische Regionen, die durch Nukleotideinschübe modifiziert
worden sind, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen in
einer Art, so dass die Modifikationen nicht wesentlich die Fähigkeit
des Nukleinsäuremoleküls zur Kodierung
eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung stören, oder zur Bildung von stabilen
Hybriden unter stringenten Bedingungen mit natürlichen Genisolaten stören, umfassen.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung
umfasst nicht natürlich
vorkommende Moleküle,
die größer als
ein CAF-Gen sind. Daher werden Chromosomen und Moleküle, die
ein CAF-Gen zuzüglich
von zusätzlichen
flankierenden Sequenzen enthalten, von der vorliegenden Erfindung
nicht umfasst. Die minimale Größe eines
Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden
Erfindung ist eine Größe, die
zur Kodierung eines Proteins mit CAF-biologischer Aktivität ausreicht, die zur Kodierung
eines CAF-Proteins, umfassend mindestens ein Epitop, das an einen
Antikörper
bindet, ausreicht, oder zur Bildung einer Sonde oder eines Oligonukleotidprimers
ausreicht, der zur Bildung eines stabilen Hybrids mit der komplementären Sequenz
eines ein natürliches
CAF-Protein kodierenden Nukleinsäuremoleküls in der
Lage ist (zum Beispiel unter Bedingungen niedriger, mäßiger oder
hoher Stringenz). Somit kann die Größe des Nukleinsäuremoleküls, das
ein derartiges Protein kodiert, von der Nukleinsäurezusammensetzung und der
prozentualen Homologie oder Identität zwischen dem Nukleinsäuremolekül und der
komplementären Sequenz
sowie von den Hybridisierungsbedingungen per se (zum Beispiel Temperatur,
Salzkonzentration und Formamidkonzentration) abhängig sein. Die minimale Größe eines
Nukleinsäuremoleküls, das
als Oligonukleotidprimer oder als Sonde verwendet wird, beträgt typischerweise
mindestens ungefähr
12 bis ungefähr
15 Nukleotide in der Länge,
falls die Nukleinsäuremoleküle GC-reich sind, und mindestens
ungefähr
15 bis 18 Basen in der Länge,
falls sie AT-arm sind.
-
Ein
isoliertes CAF-Nukleinsäuremolekül kann Degenerationen
umfassen. Der Begriff Nukleotiddegenerationen, wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf das Phänomen,
dass eine Aminosäure
durch verschiedene Nukleotidcodone kodiert werden kann. Daher kann
die Nukleinsäuresequenz
eines Nukleinsäuremoleküls, das
ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, aufgrund von
Degenerationen variieren. Es wird angemerkt, dass ein isoliertes
CAF-Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung nicht notwendigerweise ein Protein mit CAF-Aktivität kodieren
muss. Ein CAF-Nukleinsäuremolekül kann zum
Beispiel ein abgeschnittenes, mutier tes oder inaktives Protein kodieren.
Derartige Nukleinsäuremoleküle und die
durch derartige Nukleinsäuremoleküle kodierten
Proteine sind zum Beispiel zur Klonierung anderer CAF-kodierenden
Nukleinsäuremoleküle, zum
Nachweis des Vorhandenseins von CAF in einer Probe oder für andere
Zwecke, wie zum Beispiel zur Antikörperherstellung verwendbar.
-
Der
Bezug auf ein CAF-Gen umfasst erfindungsgemäß alle Nukleinsäuresequenzen,
die mit einem natürlichen
CAF-Gen (das heißt
vom Wildtyp) verwandt sind, wie zum Beispiel regulatorische Regionen,
die die Erzeugung des durch das Gen kodierten CAF-Proteins kontrollieren
(wie zum Beispiel, aber nicht eingeschränkt auf Transkription, Translation
oder Post-Translationskontrollregionen), sowie die kodierende Region selbst.
In einer anderen Ausführungsform
kann ein CAF-Gen eine natürlich
vorkommende allele Variante sein, die eine ähnliche aber nicht identische
Sequenz zu der Nukleinsäuresequenz,
die ein gegebenes CAF-Protein kodiert, umfasst.
-
Ein
isoliertes CAF-Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung kann aus seiner natürlichen
Quelle isoliert oder unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnologie (zum Beispiel
Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Amplifikation,
Klonierung) oder chemischer Synthese hergestellt werden. Verfahren
zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuremolekülen sind aus dem Stand der
Technik gut bekannt. Da die CAF-Proteine relativ kleine Proteine
sind, kann die das gewünschte
Protein kodierende DNA-Sequenz zum Beispiel unter Verwendung von
herkömmlichen,
handelsüblichen
DNA-Synthesevorrichtungen erzeugt werden. Alternativ dazu kann die
das gewünschte
Protein kodierende DNA ebenfalls unter Verwendung von Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Techniken
oder anderen Klonierungstechniken ausgehend von der genomischen
DNA vieler Spezies und insbesondere aus Eiern von Ei-erzeugenden
Tieren erzeugt werden. Derartige Methodologien sind aus dem Stand
der Technik gut bekannt (Sambrook et al., s.o.)
-
Ein
CAF-Nukleinsäuremolekülhomolog
(das heißt
eines, das ein CAF-Proteinhomolog
kodiert) kann unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren, die dem
Fachmann bekannt sind (siehe zum Beispiel Sambrook et al.) hergestellt
werden. Nukleinsäuremoleküle können zum
Beispiel unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, einschließlich aber
nicht beschränkt
auf klassische Mutagenese und DNA-Rekombinationstechniken (zum Beispiel
ortsspezifische Mutagenese, chemische Behandlung, Spaltung mittels
Restriktionsenzymen, Ligation von Nukleinsäurefragmenten und/oder PCR-Amplifikation),
oder Synthese von Oligonukleotidmischungen und Ligation der Mischgruppen
zum „Aufbau" einer Mischung aus
Nukleinsäuremolekülen und
Kombinationen davon, modifiziert werden. Ein weiteres Verfahren
zur Modifikation eines ein CAF-Protein kodierenden rekombinanten
Nukleinsäuremoleküls besteht
in dem Gen-Mischen (molekulares Züchten) (siehe zum Beispiel
das U.S. Patent Nr. 5,605,793 für
Stemmer, Minshull und Stemmer, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284–290; Stemmer,
1994, P.N.A.S. USA 91:10747–10751.
Diese Technik kann zum wirksamen Einführen mehrfacher gleichzeitiger
positiver Änderungen
in der CAF-Proteinwirkung verwendet werden. Nukleinsäuremolekülhomologe
können
durch Hybridisierung mit einem CAF-Gen oder durch Screenen der Funktion
eines durch eine Nukleinsäuremolekül kodierten
Porteins (zum Beispiel die Fähigkeit
zur Erhöhung
der B-Zellenproliferation) ausgewählt werden.
-
Ein
Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise
ein Teil eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls. Ein derartiges rekombinantes
Nukleinsäuremolekül umfasst
einen Expressionsvektor, der funktionsfähig an das Nukleinsäuremolekül gebunden
ist. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle sind
nachstehend ausführlich
beschrieben. In dieser Ausführungsform
weist das durch das Nukleinsäuremolekül kodierte
CAF-Protein eine CAF-biologische Aktivität auf. Ein derartiges Nukleinsäuremolekül kann eine
ein CAF-Proteinhomolog kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen und kann
daher als Homolog einer Nukleinsäuresequenz,
die einen natürlich
vorkommenden CAF kodiert, bezeichnet werden (das heißt ein Nukleinsäuresequenzhomolog).
-
Daher
umfasst eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das mindestens
ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung, das in einen beliebigen Nukleinsäurevektor (zum Beispiel ein
rekombinanter Vektor) eingeschoben ist, der zum Klonieren, Sequenzieren
und/oder anderweitigen Manipulieren des Nukleinsäuremoleküls, wie zum Beispiel exprimieren
und/oder Abgeben des Nukleinsäuremoleküls an eine
Wirtszelle zur Bildung einer rekombinanten Zelle, geeignet ist.
Ein derartiger Vektor enthält
heterologe Nukleinsäuresequenzen,
das heißt,
Nukleinsäuresequenzen,
die natürlicherweise
nicht benachbart zu Nukleinsäuremolekülen der
vorliegenden Erfindung gefunden werden, obwohl der Vektor ebenfalls
regulatorische Nukleinsäuresequenzen
(zum Beispiel Promotoren, nichttranslatierte Regionen) enthalten
kann, die natürlicherweise
benachbart zu Nukleinsäuremolekülen der
vorliegenden Erfindung gefunden werden (wie nachstehend erörtert ist).
Der Vektor kann entweder eine RNA oder DNA, entweder porkaryotisch
oder eukaryotisch sein und ist typischerweise ein Virus oder ein
Plasmid. Der Vektor kann als ein extrachromosomales Element (zum
Beispiel ein Plasmid) behalten werden oder er kann in das Chromosom
integriert werden. Der gesamte Vektor kann am Ort innerhalb einer
Wirtzelle bleiben oder unter bestimmten Bedingungen kann die Plasmid-DNA
deletiert werden, wobei das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung
zurückbleibt.
Das integrierte Nukleinsäuremolekül kann unter
chromosomaler Promotorkontrolle, unter nativer oder Plasmidpromotorkontrolle
oder unter einer Kombination aus mehreren Promotorkontrollen integriert
werden. Einzelne oder mehrfache Kopien des Nukleinsäuremoleküls können in
das Chromosom der Wirtszelle integriert werden.
-
Ein
rekombinantes Molekül
umfasst typischerweise ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung,
das funktionsfähig
an eine oder mehrere Transkriptionskontrollsequenzen gebunden ist.
Derartige Begriffe sind vorstehend definiert worden. Die Ausdrücke „rekombinantes
Molekül" oder „rekombinantes
Nukleinsäuremolekül", wie sie hier verwendet
werden, beziehen sich auf ein Nukleinsäuremolekül oder eine Nukleinsäuresequenz,
die funktionsfähig
an eine Transkriptionskontrollsequenz gebunden ist, jedoch können sie
untereinander austauschbar mit dem Begriff „Nukleinsäuremolekül" verwendet werden, wenn ein derartiges
Nukleinsäuremolekül ein rekombinantes
Molekül
ist, wie es hier erörtert
ist. Geeignete Transkriptionskontrollsequenzen umfassen jede Transkriptionskontrollsequenz,
die mindestens in einer der zur Expression eines CAF-Proteins der
vorliegenden Erfindung verwendbaren rekombinanten Zellen arbeitet.
Eine Vielzahl derartiger Transkriptionskontrollsequenzen sind dem
Fachmann bekannt. Bevorzugte Transkriptionskontrollsequenzen umfassen
diejenigen, die in bakteriellen, fungalen (zum Beispiel Hefe), Insekten-,
Pflanzen- oder Tierzellen arbeiten.
-
Rekombinante
Moleküle
der vorliegenden Erfindung, die entweder eine DNA oder RNA sein
können, können ebenfalls
zusätzliche
regulatorische Sequenzen, wie zum Beispiel Translationsregulationssequenzen, Ursprünge der
Replikation und andere regulatorische Sequenzen enthalten, die mit
der rekombinanten Zelle kompatibel sind. In einer Ausführungsform
enthält
ein rekombinantes Molekül
der vorliegenden Erfindung, einschließlich derjenigen, die in das
Wirtszellchromosom integriert sind, ebenfalls sekretorische Signale
(das heißt
Signalsegmentnukleinsäuresequenzen),
um zu ermöglichen,
das ein exprimiertes CAF-Protein von der Zelle, die das Protein
erzeugt, ausgeschieden wird. Geeignete Signalsegmente umfassen ein
Signalsegment, das natürlicherweise
mit einem CAF-Protein der vorliegenden Erfindung assoziiert ist,
oder jedes heterologe Signalsegment, das zur Steuerung der Sekretion
eines erfindungsgemäßen CAF-Proteins
in der Lage ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein rekombinantes
Molekül
der vorliegenden Erfindung eine Signalsequenz, um zu ermöglichen,
dass ein exprimiertes CAF-Protein an die Membran einer Wirtszelle
abgegeben und dort inseriert wird. Geeignete Signalsequenzen umfassen
eine Signalsequenz, die natürlicherweise
mit einem CAF-Protein der vorliegenden Erfindung assoziiert ist,
oder jede heterologe Signalsequenz, die in der Lage ist, die Abgabe
und Insertion eines CAF-Proteins an beziehungsweise in die Membran
einer Zelle zu steuern.
-
Ein
Typ eines rekombinanten Moleküls,
das hier als rekombinantes Virus bezeichnet wird, umfasst ein rekombinantes
Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung, das in eine virale Hülle
verpackt ist und das in einer Zelle nach Abgabe des Virus an die
Zelle exprimiert werden kann. Eine Zahl rekombinanter Virusteilchen,
umfassend aber nicht beschränkt
auf diejenigen, die auf Alphaviren, Baculoviren, Pockenviren Adenoviren,
Herpesviren und Retroviren basieren, kann verwendet werden.
-
Eines
der rekombinanten Moleküle
der vorliegenden Erfindung kann zur Erzeugung eines kodierten Produkts
(zum Beispiel ein CAF-Protein) der vorliegenden Erfindung verwendet
werden. In einer Ausführungsform
wird ein kodiertes Produkt durch Expression eines Nukleinsäuremoleküls, wie
hier beschrieben ist, unter Bedingungen, die die Erzeugung des Proteins
bewirken, erzeugt. Ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung eines
kodierten Proteins besteht in der Transfektion einer Wirtszelle
mit einem oder mehreren rekombinanten Molekülen zur Bildung einer rekombinanten
Zelle. Zur Transfektion geeignete Wirtszellen umfassen, sind aber nicht
eingeschränkt
auf jede bakterielle, fungale (zum Beispiel), Insekten-, Pflanzen-
oder Tierzelle, die transfiziert werden kann. Wirtszellen können entweder
nicht transfizierte Zellen sein oder Zellen, die schon mit mindestens
einem Nukleinsäuremolekül transfiziert
worden sind.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls isolierte (das heißt aus ihrem
natürlichen
Milieu entfernte) Antikörper,
die zur selektiven Bindung an ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung
(einschließlich
eines CAF-Homologen) oder einer mimetischen Verbindung davon (zum
Beispiel CAF-Antikörper)
in der Lage sind. Der Begriff „selektiv
binden an" bezieht
sich, wie er hier verwendet wird, auf die Fähigkeit von Antikörpern der vorliegenden
Erfindung bevorzugt an spezifizierte Proteine der vorliegenden Erfindung
und mimetische Verbindungen davon zu binden. Die Bindung kann unter
Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die Standardverfahren aus
dem Stand der Technik sind, einschließlich Enzymimmunoassays (zum
Beispiel ELISA), Immunblotsassays, usw., gemessen werden, siehe
zum Beispiel Sambrook et al., ebd. In einer Ausführungsform bindet ein CAF-Antikörper vorzugsweise
derart selektiv an ein CAF-Protein , dass die Aktivität dieses
Proteins verringert wird, wie zum Beispiel durch Blockierung der
Fähigkeit
des Proteins an einen Rezeptor (das heißt ein CAF-Rezeptor), an ein
anderes Protein oder an ein Nukleinsäuremolekül zu binden oder anderweitig
dessen Wirkungsmechanismus zu unterbrechen.
-
Isolierte
Antikörper
der vorliegenden Erfindung können
Serum, das derartige Antikörper
enthält,
oder Antikörper,
die auf verschiedene Grade aufgereinigt worden sind, umfassen. Antikörper der
vorliegenden Erfindung können
polyklonal oder monoklonal, funktionale Äquivalente, wie zum Beispiel
Antikörperfragmente und
gentechnisch hergestellte Antikörper
sein, einschließlich
einzelkettiger Antikörper
oder chimärer
Antikörper,
einschließlich
bispezifischer Antikörper,
die an mehr als ein Epitop binden können.
-
Ein
bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Antikörpern der vorliegenden Erfindung
umfasst (a) die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Proteins,
Peptids oder mimetischen Verbindung davon der vorliegenden Erfindung
an ein Tier zur Erzeugung der Antikörper und (b) die Rückgewinnung
der Antikörper.
In einem weiteren Verfahren werden Antikörper der vorliegenden Erfindung
rekombinant unter Verwendung von Techniken, die hier offenbart sind
zur Erzeugung von CAF-Proteinen der vorliegenden Erfindung erzeugt.
Antikörper,
die gegen definierte Proteine oder mimetische Verbindungen hervorgerufen
werden, können
vorteilhaft sein, weil derartige Antikörper nicht wesentlich mit Antikörpern gegen
andere Substanzen verunreinigt sind, die sonst eine Störung eines
diagnostischen Assays, eines Screening-Assays oder Nebenwirkungen bei Verwendung
in einer therapeutischen Zusammensetzung verursachen können.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die einen Cytokin-Aktivierungsfaktor
der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Zusammensetzung umfasst
vorzugsweise ebenfalls einen pharmazeutisch verträglichen
Träger,
die vorstehend definiert worden ist. Eine „Zusammensetzung" umfasst erfindungsgemäß jede Zusammensetzung
(Formulierung, Produkt), die einen Cytokin-Aktivierungsfaktor der
vorliegenden Erfindung umfasst, wobei der CAF in der Zusammensetzung
in einer gereinigten, rekombinant erzeugten, chemisch erzeugten,
im Wesentlichen gereinigten (das heißt jedes hyperimmune Ei, da
zu einem beliebigen Grad zur Erhöhung
der CAF-Menge im Vergleich zu anderen Komponenten des Ei-Produkts
gereinigt worden ist) oder jeder anderen CAF-angereicherten Form
insbesondere im Vergleich zu hyperimmunen Ei-Produkten in Abwesenheit
jeglichen CAF-Auswahl- oder Screening-Verfahrens vorhanden ist (zum
Beispiel wie es in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999 beschrieben ist).
Daher werden hyperimmune Ei-Produkte in Abwesenheit einer Auswahl
oder Screenings bezüglich
angereichteren CAF-Mengen
im Vergleich zum mittleren CAF-Gehalt in hyperimmunen Ei-Produkten,
oder in Abwesenheit jeden anderen Mittels zur Anreicherung bezüglich des
CAF-Gehalts in dem
Ei-Produkt von einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung nicht umfasst.
Somit muss eine Zusammensetzung, die ein hyperimmunes Ei-Produkt,
das einen erfindungsgemäßen CAF
enthält,
ausgewählt,
gescreent oder so hergestellt werden, dass es angereichert ist,
wie zum Beispiel durch: Screening des Immunisierungsprozesses zur
Auswahl hyperimmunisierter Tiere und/oder hyperimmuner Ei-Produkte, die statistisch
signifikant höhere
CAF-Menge enthalten, als das durchschnittliche hyperimmune Ei-Produkt;
durch Screening der hyperimmunisierten Produkte bezüglich eines
statistisch signifikant höheren
CAF-Gehalts im Vergleich zu durchschnittlichen CAF-Mengen in hyperimmunen
Ei-Produkten; oder durch Anreichern des hyperimmunen Ei-Produkts
(zum Beispiel durch Fraktionierung, Reinigung oder Ergänzung mit
exogenem CAF) bezüglich
CAF.
-
Daher
richtet sich in einer Ausführungsform
die Zusammensetzung der Erfindung besondere auf die Herstellung
von Zusammensetzungen, die hyperimmunes Ei und alle daraus hergestellten
Produkte (das heißt Lebensmittelprodukte
oder Nicht-Lebensmittelprodukte)
umfassen, die bezüglich
des Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung angereichert
sind und die zur Modulierung des Immunsystems verwendbar sind. Da
diese Lebensmittelprodukte natürlich
sind, können
sie zur Modulation des Immunsystems verwendet werden, ohne dass
man Nebenwirkungen fürchten
muss, abgesehen natürlich
von allergischen Reaktionen, an denen diejenigen mit Überempfindlichkeit
gegenüber
Eiern leiden. Das hyperimmune Ei wird vorzugsweise von einem Ei-erzeugenden
Tier, bevorzugter von einem Vogel erhalten, der mit mindestens einem
Immunogen hyperimmunisiert worden ist. Das hyperimmune Ei-Produkt
kann ausgewählt,
gescreent oder so hergestellt werden, dass es einen statistisch
signifikant höheren
CAF-Gehalt (zum Beispiel p>0,05)
im Vergleich zu einem für
hyperimmunisierte Eier aus demselben Stamm des Ei-erzeugenden Tiers,
das mit denselben oder verschiedenen Immunogenen immunisiert worden
ist, aufweist. Das hyperimmune Ei-Produkt wird vorzugsweise weiter
in CAF-angereicherte
Fraktionen, wie zum Beispiele diejenigen, die in Beispiel 1 beschrieben
sind, getrennt.
-
Auf
beispielhafte Weise können
mehrere Chargen eines hyperimmunen Ei-Produkts gescreent werden,
um solche hyperimmunen Ei-Produkte mit dem höchsten Gehalt an Cytokin-Aktivierungsfaktor
pro Trockengewicht Ei-Produkt auszuwählen. Alternativ dazu kann
das Hyperimmunisierungsverfahren (zum Beispiel durch Probennahme
von Ei-Produkten während
des Immunisierungsverfahrens) so überwacht werden, dass eine
maximale Produktion des Cytokin-Aktivierungsfaktors erreicht wird.
Verfahren zum Nachweis des Cytokin-Aktivierungsfaktors umfassen,
sind aber nicht eingeschränkt
auf Reinigung, quantitative Bestimmung des Faktors in dem Produkt,
wie zum Beispiel durch jede geeignete Proteinreinigung und quantitativen
Bestimmungsverfahrens (für
ein beispielhaftes Reinigungsverfahren, siehe den Abschnitt mit
den Beispielen). In einer Ausführungsform
wird die Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor in einem hyperimmunen
Ei-Produkt unter Verwendung eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung,
der selektiv an das Protein in der Ei-Probe bindet, nachgewiesen.
-
Zusätzlich kann
das Ei-Produkt zur Anreicherung bezüglich des Vorhandenseins des
Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung im Vergleich
zu anderen Komponenten in dem Ei-Produkt oder zur Erhöhung der
CAF-Menge (zum Beispiel bezogen auf das Gewicht) in dem Endprodukt
im Vergleich zu der CAF-Menge in dem ursprünglichen Ei-Produkt fraktioniert
und/oder gereinigt werden. Die Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor
in einem Teil oder gereinigten Produkt wird vorzugsweise um mindestens
ungefähr
5 % und bevorzugter um mindestens ungefähr 10 % und bevorzugter um
mindestens ungefähr
25 %, bevorzugter um mindestens ungefähr 50 % und bevorzugter um
mindestens ungefähr
75 % und bevorzugter um mindestens ungefähr 100 % im Vergleich zu der
Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor, die in einem nicht gereinigten hyperimmunisierten
Lebensmittelprodukt vorhanden ist, angereichert. Bevorzugter wird
die Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor in einem Teil oder gereinigten
Produkt im Vergleich zu einer Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor
in dem ursprünglichen
Produkt mindestens um ungefähr
das 2-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 3-fache und bevorzugter
mindestens um ungefähr
das 5-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 10-fache und bevorzugter
mindestens um ungefähr
das 50-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 100-fache und besonderes
bevorzugt mindestens um ungefähr
das 500-fache angereichert. In einer Ausführungsform wird der Cytokin-Aktivierungsfaktor
der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen auf eine Reinheit von
100 % gereinigt, so dass er als ein im Wesentlichen reiner Faktor
zu jeder hier beschriebenen Zusammensetzung gegeben werden kann.
In einer anderen Ausführungsform
wird der Cytokin-Aktivierungsfaktor
rekombinant oder synthetisch, wie an anderer Stelle hier diskutiert
ist, hergestellt.
-
Das
Verfahren zur Hyperimmunisierung eines Ei-erzeugenden Tiers wird
kurz wie folgt beschrieben. Das hyperimmune Ei oder Ei-Produkt kann
von jedem Ei-erzeugenden
Tier erzeugt werden. Es ist bevorzugt, dass das Ei-erzeugende Tier
ein Mitglied der Klasse Aves, oder in anderen Worten, ein Vogel
ist. Innerhalb der Klasse Aves wird Hausgeflügel bevorzugt, aber andere
Mitglieder dieser Klasse, wie zum Beispiel Truthähne, Enten und Gänse sind
eine geeignete Quelle für
ein hyperimmunes Ei-Produkt.
-
Werden
derartige Ei-erzeugende Tiere in einen spezifischen Zustand der
Immunisierung mittels zum Beispiel periodischen Auffrischungsverabreichungen
von Immunogenen gebracht, werden die Tiere Eier erzeugen, die bei
Verzehr durch ein Versuchstier vorteilhafte Eigenschaften aufweisen
werden, umfassend supranormale Gehalte des Cytokin-Aktivierungsfaktors,
die die Modulation des Immunsystems in diesem Versuchstier bewirken.
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Nur
die Induktion der Immunsensitivität in dem Ei-erzeugenden Tier
ist nicht ausreichend, um das Auftreten supranormaler Gehalte des
Cytokin-Aktivierungsfaktors in Eiern zu verursachen, wie durch die
Tatsache gezeigt wird, dass Speiseeier keine derartigen supranormalen
Gehalte enthalten, obwohl die Vögel
gegen verschiedene Immunogene während
der normalen Immunisierung gegen Vogelkrankheiten und während des
normalen Aussetzens gegen Umweltfaktoren sensibilisiert worden sind.
Es ist die Entdeckung der Erfinder, dass nur in den spezifischen
hyperimmunen Zuständen
die Eier die gewünschten
supranormalen Gehalte des Cytokin-Aktivierungsfaktors aufweisen.
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Dieser
spezielle Zustand der Hyperimmunisierung, in dem das Ei hohe Gehalte
des Cytokin-Aktivierungsfaktors enthalten wird, wird vorzugsweise
durch Verabreichung einer Anfangsimmunisierung, gefolgt von periodischen
Auffrischungen mit ausreichend hohen Dosen spezifischer Immunogene
oder Mischungen von Immunogenen, erreicht. Die bevorzugte Dosierung
der Auffrischung sollte gleich oder größer als 50 % der Dosierung
sein, die zur Erzeugung einer primären Immunisierung des Vogels
notwendig ist. Daher gibt es eine Schwellendosierung zur Auffrischung,
unterhalb der die Eigenschaften in dem Ei des Vogels nicht erzeugt
werden, obwohl der Vogel in einem Zustand ist, der normalerweise
als immunisiert bezeichnet wird. Mit Kenntnis der Erfordernis zur
Entwicklung und Beibehaltung eines hyperimmunen Zustands liegt es
in der Fertigkeit des Fachmanns die Menge des verabreichten Immunogens
in Abhängigkeit
von den Gattungen des Ei-erzeugenden Tiers und des verwendeten Stamms,
zu variieren, um das Tier in einem hyperimmunen Zustand zu halten. Weiterhin
kann mit Kenntnis des durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten
CAF zusätzlich
das Immunisierungsverfahren, zum Beispiel durch Erhöhung der
Zahl oder der Dosierung der Auffrischungen oder durch Auswahl spezifischer
Immunogene, modifiziert werden, was zu einer erhöhten Erzeugung des CAF im Vergleich
zu dem durchschnittlichen hyperimmunen Ei, das derartigen Auswahl/Screeningverfahren
nicht ausgesetzt war, führt.
-
Der
hyperimmune Zustand wird vorzugsweise durch jedes Immunogen oder
jede Kombination von Immunogenen erzeugt. Eine Hyperimmunisierung
wird vorzugsweise durch mehrfache Aussetzungen gegenüber mehrfachen
Immunogenen, mehrfache Aussetzung gegenüber einzelnen Immunogenen oder
einzelne Aussetzungen gegenüber
Bibliotheken von Immunogenen erreicht. Nahezu jedes Immunogen kann
zur Induktion des hyperimmunen Zustands verwendet werden, umfassend
aber nicht beschränkt
auf bakterielle, virale, Protozoen-, allergene, fungale oder zelluläre Substanzen.
-
Zusätzlich zu
Immunisierungen mit natürlich
vorkommenden Immunogenen kann eine Immunisierung ebenfalls unter
Verwendung von Immunogenen ausgeführt werden, die durch kombinatorische
Chemie synthetisch abgeleitet sind. Die grundlegende Strategie besteht
in dem Zusammenfügen
chemischer Baublöcke zur
Herstellung einer Population von Molekülen mit Verschiedenartigkeit.
In letzter Zeit sind mehrere Verfahren für die kombinatorische Fest-
und Lösungsphasensynthese
von Bibliotheken von Oligomeren (Fodor, S. et al., Science 251:767
(1991); Houghton, R. et al., Nature 354:82 (1991)) sowie von kleinen
organischen Molekülen (Bunin,
B. & Ellman,
J., J. Am. Chem. Soc. 114:10997 (1992)) entwickelt worden. Eine
schnelle mehrfache Peptid- und Oligomersynthese kann als Quelle
für kombinatorisch
abgeleitete Immunogene dienen. Weiterhin würde eine alternative Strategie
die Addition organischer Baublöcke
auf kombinatorische Weise zu einem Gerüstmolekül für eine verbesserte Immunogenität erlauben.
-
Alternative
Arten der Hyperimmunisierung von Ei-erzeugenden Tieren können anstelle
immunogener Impfstoffe verwendet werden und umfassen die Verwendung
genetischer Impfstoffe. Insbesondere wird jedes DNA-Konstrukt (das
im Allgemeinen aus einer Promotorregion und einer Antigen-kodierenden
Sequenz besteht) eine Immunantwort auslösen. Genetische Impfstoffe
bestehen aus Antigen-kodierenden Vektoren, Fragmenten einer nackten
DNA, Plasmid-DNA, DNA-RNA-Antigenen, DNA-Proteinkonjugaten, DNA-Liposomkonjugaten,
DNA-Expressionsbibliotheken und viraler und bakterieller DNA, die
zur Erzeugung einer Immunantwort abgegeben werden.
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Verfahren
der DNA-Abgabe umfassen unter anderen Teilchenbeschuss, direkte
Injektion, virale Vektoren, Liposomen und Jetinjektion. Bei Anwendung
dieser Abgabeverfahren können
viel kleinere Mengen notwendig sein und sie führen im Allgemeinen zu einer
anhaltenderen Immunogenerzeugung. Werden derartige genetische Verfahren
verwendet, ist das bevorzugte Verfahren zur Einführung einer DNA in Vögel die
intramuskuläre
Injektion der DNA in den Brustmuskel.
-
Verfahren
zur DNA-Abgabe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Teilchenbeschuss, direkte
Injektion, Liposomen, Jetinjektion (Fynan, E.F. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:11478–11482
(1993)). Die Nukleinsäuren,
die bekannte oder unbekannte Immunogene, Promotorregionen (vor allem
das CMV-Blumenkohl-Mosaikvirus)
und SV40 bakteriellen Ursprungs kodieren, können in Bakterien zur Erzeugung
der Plasmid-DNA zur Verwendung in DNA-Injektionen repliziert werden.
Obwohl mehrere Wege der parenteralen Verabreichung der DNA in Hühnern wirksam
sind, ist das bevorzugte Verfahren die intramuskuläre Injektion
in den Brustmuskel. Impfstofftests sind in Eier-legenden Vögeln, vorzugsweise
Hühnern
ausgeführt
worden. Wiederholte Immunisierungen sind in Abständen von ein bis zwei Wochen
bis zu sechs Monaten gegeben worden.
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Es
wird bevorzugt, dass die Mengen an verwendeter DNA zur direkten
Injektion im Allgemeinen in der Größenordnung von 50–300 μg DNA in
Salzlösung
liegen. Für
einen Teilchenbeschuss werden 4–100
mg DNA, die auf Goldkügelchen
durch Zugabe von 2,5 M CaCl2 zusammen gefällt wurde,
bevorzugt. Wiederholte Immunisierungen können durch dieses Verfahren
der Beschleunigung von DNA-beschichteten Teilchen in das lebende
Tier intradermal gegeben werden.
-
Eine
ausführliche
Beschreibung eines bevorzugten Verfahrens, das dazu verwendet wurde,
um ein Ei-erzeugendes Tier in einen erhöhten Zustand der Immunität zu bringen,
von dem aus das resultierende hyperimmune Ei oder Ei-Produkt einem
Versuchstier verabreicht werden kann, ist in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999
offenbart. Kurz, das Folgende ist ein Beispiel für das Verfahren, das dazu verwendet
wurde, um ein Ei-erzeugendes Tier in einen erhöhten Zustand der Immunität zu bringen,
für die
Verwendung zur Reinigung von CAF oder für die Erzeugung eines CAF-angereichterten Lebensmittelprodukts
zur Verabreichung an ein Versuchstier. Es ist verständlich,
dass ein derartiges Verfahren, wie vorstehend diskutiert ist, modifiziert
werden kann, um bezüglich
einer erhöhten
CAF-Erzeugung auszuwählen
oder zu screenen. Im Allgemeinen umfasst das Hyperimmunisierungsverfahren
die Schritte des:
- 1. Auswählens von einem oder mehreren
Antigenen.
- 2. Hervorrufens eine Immunantwort in dem Ei-erzeugenden Tier
durch primäre
Immunisierung.
- 3. Verabreichens von Auffrischungsimpfstoffen von Antigenen
mit geeigneter Dosierung zur Induktion und Beibehaltung des hyperimmunen
Zustands.
- 4. Sammelns und Verarbeitens der Eier zur Herstellung eines
hyperimmunen Ei-Produkts
von dem in dem hyperimmunen Zustand gehaltenen Ei-erzeugenden Tier.
-
Schritt
1 Jedes Antigen oder Kombination von Antigenen kann verwendet werden.
Die Antigenen können
bakterielle, virale, Protozeoen-, fungale, zelluläre oder
andere Substanzen sein, auf die das Immunsystems eines Ei-erzeugenden
Tiers antworten wird. Der entscheidende Punkt in diesem Schritt
ist, dass das Antigene) in der Lage sein muss, immune und hyperimmune
Zustände
in dem Ei-erzeugenden Tier zu induzieren. Ein bevorzugter Impfstoff
ist eine Mischung aus polyvalent bakteriellen Antigenen, der als
Serie 100 (S-100) Impfstoff bezeichnet wird (der ebenfalls als PL-100
bezeichnet wird). Die in dem S-100 Impfstoff (PL-100) enthaltenen
Bakterien sind in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999 (Tabelle 1) aufgelistet.
Dieser Impfstoff ist früher
in den U.S. Patenten mit den Nummern 5,106,618 und 5,215,746 beschrieben
worden. Ein weiterer zur Verwendung bevorzugter Impfstoff ist der
EB-100E Impfstoff, wobei die Einzelheiten von diesem ebenfalls im
Beispiel 1 des U.S. Patents Nr. 5,772,999 beschrieben sind.
-
Schritt
2 Der Impfstoff kann entweder ein Todimpfstoff oder abgeschwächter Lebendimpfstoff
sein und er kann durch jedes Verfahren, das eine Immunantwort hervorruft,
verabreicht werden. Es wird bevorzugt, dass die Immunisierung durch
Verabreichung der Antigene über
intramuskuläre
Injektion ausgeführt
wird. Der für die
Injektion in einen Vogel bevorzugte Muskel ist der Brustmuskel.
Die Dosierung beträgt
vorzugsweise 0,5–5 Milligramm
des Antigen(e)-Impfstoffs. Andere Verfahren zur Verabreichung, die
verwendet werden können, umfassen
die intravenöse
Injektion, intraperitoneale Injektion, rektale Zäpfchen oder die orale Verabreichung. Werden
DNA- Techniken für das Hyperimmunisierungsverfahren
verwendet, sind viel kleinere Mengen erforderlich, im Allgemeinen
1–100
Mikrogramm. Durch eine Zahl von Verfahren, die dem Fachmann auf
dem Gebiet der Immunologie bekannt sind, kann bestimmt werden, ob
der Impfstoff eine Immunantwort in dem Ei-erzeugenden Tier hervorgerufen
hat. Beispiele für
diese umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsassays (ELISA), Tests
bezüglich
des Vorhandenseins von Antikörpern
gegen die stimulierenden Antigene und Tests, die zur Bewertung der
Fähigkeit
immuner Zellen von dem Wirt zum Antworten auf das Antigen, konstruiert
sind. Im Allgemeinen ist das Auftreten von Ei-Antikörpern nach
Immunisierung mit dem Impfstoff ein Hinweis für eine Immunantwort. Die minimale
Dosierung des Antigens, die zur Induktion einer Immunantwort notwendig
ist, hängt
von dem verwendeten Impfverfahren, einschließlich der Art des verwendeten
Antigens(e) sowie der Art des als Wirt verwendeten Ei-erzeugenden Tiers
ab.
-
Schritt
3 Der hyperimmune Zustand wird vorzugsweise durch wiederholte Auftrischungsverabreichungen
mit einer geeigneten Dosierung in festgelegten Zeitabständen induziert
und beibehalten. Die Zeitabstände sind
vorzugsweise Abstände
von zwei Wochen über
einen Zeitraum von sechs Monaten. Es ist jedoch wesentlich, dass
die Auffrischungsverabreichungen nicht zu einer Immuntoleranz führen. Es
ist möglich,
andere Verfahren zur Beibehaltung der Hyperimmunisierung oder eine
Kombination von Verfahren zur verwenden, wie zum Beispiel die intramuskuläre Injektion
für eine
primäre
Immunisierung und die intravenöse
Injektion für
Auffrischungsinjektionen. Weitere Verfahren umfassen die gleichzeitige
Verabreichung von in Mikrokapseln eingeschlossenem und flüssigem Antigen
oder die intramuskuläre
Injektion für
eine primäre
Immunisierung und Auffrischungsdosierungen durch orale Verabreichung
oder parenterale Verabreichung durch Mittel zur Mikroverkapselung.
Mehrere Kombinationen von primärer
und Hyperimmunisierung sind dem Fachmann bekannt.
-
Schritt
4 Die hyperimmunen Eier können
zur Verabreichung an das Versuchstier oder zur Reinigung auf eine
Vielzahl von Wegen verarbeitet werden. Diese umfassen die Herstellung
einer Zusammensetzung, umfassend das hyperimmune Ei-Produkt selbst
(zum Beispiel in Kapseln) und den Einbau des hyperimmunen Ei-Produkts
in Lebensmittel zur Verabreichung an ein Versuchstier oder die Befolgung
des Reini gungsprotokolls für
den Cytokin-Aktivierungsfaktor, wie an anderer Stelle hier beschrieben
ist.
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In
anderen Ausführungsformen
kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung CAF in gereinigter,
rekombinanter, chemisch synthetisierter, im Wesentlichen gereinigter
oder jeder anderen angereicherten Form in Kombination mit jedem
geeigneten pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfassen. Geeignete erfindungsgemäße pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen
pharmazeutisch verträgliche
Arzneimittelträger,
Vehikel zur kontrollierten Freisetzung und pharmazeutisch verträgliche Abgabevehikel,
wie vorstehend beschrieben ist. Die Zusammensetzung kann in jeder
zur Abgabe geeigneten Form vorliegen, umfassend, aber nicht beschränkt auf
eine Flüssigkeit,
ein Aerosol, eine Kapsel, eine Tablette, eine Pille, ein Puder,
ein Gel und ein Granulat. Präparationen
des CAF, die zur parenteralen Verabreichung besonders geeignet sind,
umfassen sterile wässrige
oder nicht-wässrige
Lösungen,
Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel oder Vehikel sind
Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie zum Beispiel Olivenöl, und injizierbare
organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat.
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In
festen Dosierungsformen kann dem CAF-Protein mindestens ein inertes
Verdünnungsmittel,
wie zum Beispiel Sucrose, Lactose oder Stärke, beigemischt werden. Derartige
Dosierungsformen können,
wie es normalerweise üblich
ist, ebenfalls zusätzliche
Substanzen, die andere als ein inertes Verdünnungsmittel sind, umfassen.
Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen ebenfalls
Mittel zum Puffern, pH-Wert-empfindliche Polymere oder alle anderen
Substanzen zur Einkapselung für
eine langsame Freisetzung (das heißt Vehikel zur kontrollierten
Freisetzung), die typischerweise als Zusammensetzung zur Einkapselung
in der Lebensmittel- und Arzneimittelindustrie verwendet werden,
oder andere Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung umfassen.
Tabletten und Pillen können
zusätzlich
mit einer enterischen Beschichtung hergestellt werden.
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Flüssige Dosierungsformen
des Cytokin-Aktivierungsfaktors zur oralen Verabreichung umfassen
pharmazeutisch verträgliche
Emulsionen, Lösungen,
Suspensionen, Sirups und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel
enthalten, die im Allgemeinen in der Pharmazie verwendet werden.
Neben inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen
ebenfalls Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspensions- und Süßstoffe umfassen.
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In
einer Ausführungsform
liegt die Zusammensetzung in Form eines Lebensmittelprodukts vor.
In dieser Ausführungsform
wird das CAF-angereicherte Ei, jeder CAF-angereicherte Teil davon, der hochgereinigte CAF,
rekombinanter CAF und/oder chemisch synthetisierter CAF in ein Nahrungsergänzungsmittel
integriert. Ein bevorzugtes Verfahren, um das Ei oder jeden Teil
davon so herzustellen, dass er in ein Nahrungsergänzungsmittel
eingeschlossen werden kann, betrifft das Trocknen des Eis zu einem
Pulver. Obwohl verschiedene Verfahren zum Trockenen von Eiern bekannt
sind, ist Sprühtrocknen
ein bevorzugtes Verfahren. Das Verfahren des Sprühtrocknens von Eiern ist aus
dem Stand der Technik gut bekannt. Ein derart getrocknetes Eipulver kann
in Getränke
in Form von zum Beispiel Proteinpulvern, Getränken zum Energieaufbau, Proteinergänzungsmitteln
und in allen anderen mit Sportlern assoziierten Nahrungsprodukten
eingeschlossen werden. Zusätzlich
kann das Eipulver in Backmischungen, Energieriegeln, Süßigkeiten,
Keksen, usw. verwendet werden. Andere Beispiele des Verarbeitens
von Eiern umfassen die Herstellung eines Omeletts, das Weich- oder
Hartkochen des Eis, Braten von Ei oder, falls erwünscht, kann
das Ei roh oder als flüssiges
Ei verarbeitet gegessen werden. Bevorzugte Teile eines CAF-angereicherten
Ei-Produkts der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf: flüssiges
Eigelb, flüssiges
Eiweiß,
pulverisiertes Eigelb, pulverisiertes Eiweiß und/oder einen wasserlöslichen
Teil dieses hyperimmunisierten Ei-Produkts.
-
In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann eine Zusammensetzung ein rekombinantes
Nukleinsäuremolekül, umfassend
eine ein CAF-Protein (einschließlich
eines CAF-Homologen) kodierende Nukleinsäuresequenz, wie vorstehend
hier beschrieben ist, und/oder einen Antikörper, der selektiv an ein CAF-Protein
bindet, umfassen.
-
Eine
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann an eine Zellkultur
(wie zum Beispiel in einem Cytokin-Assay) oder an einen Patienten
durch jedes geeignete Verfahren abgegeben werden. Die Auswahl eines
derartigen Verfahrens wird mit der Art der zu verabreichenden oder
abzugebenden Verbindung (das heißt ein Protein, eine Nukleinsäure, eine
mimetische Verbindung), dem Weg der Abgabe (das heißt in vivtro, in
vivo, ex vivo) und dem durch die Verabreichung/Abgabe der Verbindung
oder Zusammensetzung zu erreichenden Ziel variieren. Ein wirksames
Verabreichungsprotokoll (das heißt die Verabreichung einer
Zusammensetzung in einer wirksamen Menge) umfasst erfindungsgemäß geeignete
Dosisparameter und Wege der Verabreichung, die zur Abgabe einer
Zusammensetzung an eine gewünschte
Stelle (das heißt
an eine gewünschte
Zelle) und/oder zur Regulation einer Immunantwort in einem Versuchstier
führen.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise
einem Versuchstier durch alle Mittel, die das Immunsystem in dem
Versuchstier modulieren, verabreicht.
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Verabreichungswege
umfassen in vivo, in vitro und ex vivo Wege. In vivo Wege umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf orale, nasale, intratracheale Injektion, Inhalierung, transdermale,
rektale Wege, Imprägnation
eines Katheters, durch ein Suppositorium, direkte Injektion in ein
Gewebe und parenterale Wege. Bevorzugte parenterale Wege können umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf subkutane, intradermale, intravenöse, intramuskuläre und intraperitoneale
Wege. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die ein CAF-Protein,
einen Antikörper,
eine mimetische Verbindung oder ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung
enthält, über einen
parenteralen Weg verabreicht. Intravenöse, intraperitoneale, intradermale,
subkutane und intramuskuläre
Verabreichungen können
unter Verwendung von Verfahren aus dem Stand der Technik durchgeführt werden.
Eine Abgabe durch ein Aerosol (Inhalation) kann ebenfalls unter
Verwendung von Verfahren aus dem Stand der Technik durchgeführt werden
(siehe zum Beispiel Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
189:11277–11281,
1992. In einer weiteren Ausführungsform wird
eine ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung umfassende Zusammensetzung
oral verabreicht. Die orale Abgabe kann durch Komplexierung einer
therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen
Träger,
der einem Abbau durch Verdauungsenzyme in dem Darm eines Tiers standhalten
kann, durchgeführt
werden. Es wird festgestellt, dass ein CAF-Protein der vorliegenden
Erfindung besonders resistent gegen Verdauungsenzyme ist und daher
muss ein derartiger Träger
nicht kritisch sein. Beispiele derartiger Träger umfassen Kunststoffkapseln
oder Tabletten und solche, die aus dem Stand der Technik bekannt
sind. Derartige Wege können
die Verwendung von pharmazeutisch verträgli chen Trägern, wie vorstehend beschrieben
ist, umfassen. Der Begriff ex vivo bezieht sich darauf, dass ein
Teil des Regulationsschritts außerhalb
des Patienten durchgeführt
wird, wie zum Beispiel durch Transfektion einer Population von Zellen
die aus einem Patienten entfernt worden ist, mit einem rekombinantem
Molekül,
umfassend eine ein erfindungsgemäßes Protein
kodierende Nukleinsäuresequenz,
unter solchen Bedingungen, dass das rekombinante Moleküle nachfolgend
durch die transfizierte Zelle exprimiert wird, und durch Zurückgeben
der transfizierten Zellen an den Patienten. In vivo und ex vivo
Wege der Verabreichung einer Zusammensetzung an eine Kultur von
Wirtszellen kann durch ein Verfahren, umfassend aber nicht beschränkt auf
Transfektion, Transformation, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion,
Adsorption, Protoblastenfusion, Verwendung von Protein-tragenden
Mitteln, Verwendung von Ionen-tragenden Mitteln, Verwendung von
Detergentien für
die Zellpermeabilisierung und einfaches Mischen (zum Beispiel Kombinieren)
einer Verbindung in Kultur mit einer Zielzelle, ausgeführt werden.
-
In
einer Ausführungsform
werden hyperimmune Eier oder Fraktionen davon, die bezüglich des
Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung angereichert
und von hyperimmunisierten Tieren gesammelt worden sind, zur Herstellung
eines hyperimmunen Ei-Produkts verarbeitet, das nachfolgend einem
Versuchstier verabreicht werden kann. In einer Ausführungsform
findet die Verabreichung direkt durch Füttern des Eis oder eines beliebigen
Derivats davon an das Versuchstier statt. Es ist wichtig zu beachten,
dass ein Ei ein natürlicher
Lebensmittelbestandteil ist, der ungiftig und sicher ist. Ähnlich wird
in einer anderen Ausführungsform
bevorzugt, dass der im Wesentlichen gereinigte rekombinant hergestellte
oder synthetisch hergestellte Cytokin-Aktivierungsfaktor auf eine
Art hergestellt (zum Beispiel formuliert) wird, die nachfolgend
einem Tier verabreicht werden kann.
-
Zur
Modulation des Immunsystems wird die Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung vorzugsweise einem Tier in einer Menge verabreicht, die
das Erreichen der Cytokin (zum Beispiel TNFα, IL-1β und/oder IL-6)-Expression und
vorzugsweise die Cytokinaktivierung und Immunmodulation immunologisch
bewirkt. Die Dauer und Intensität
der Behandlung wird von dem speziellen Versuchstier und dem Zustand
des Versuchstiers und von dessen Vorhandensein abhängen, falls
das der Fall ist, von dem Fortschritt des Zustands des Versuchstiers.
Die Zusammensetzung wird ebenfalls in jeder Menge bereitgestellt,
die den Zustand und die Symptome des Zustands behandelt oder verhindert.
Im Falle der Verabreichung von CAF-angereichterten hyperimmunen Eiern oder
daraus hergestellten Produkten können
zum Beispiel tägliche
Mengen im Bereich von weniger als einem bis mehreren hyperimmunen
Eiern (oder hyperimmunen Ei-Produkten, die das äquivalente zu weniger als einem
bis mehreren ganzen hyperimmunen Eiern enthalten) dem Versuchstier
in Abhängigkeit
von dem speziellen Umstand des Zustands verabreicht werden. Wirksamere
Fraktionen können durch
Verfahren, die hier beschrieben sind, sowie durch andere Verfahren,
die aus dem Stand der Technik bekannt sind, getrennt und konzentriert
werden. Im Hinblick auf die Verabreichung des CAF-angereicherten
hyperimmunen Eis oder Ei-Produkts an ein Versuchstier wurde festgelegt,
dass der bevorzugte Dosisbereich des hyperimmunen Eis oder Ei-Produkts,
das einem Versuchtier gegeben werden soll, zwischen 100 Milligramm bis
10 Gramm pro Kilogramm Gewicht des Versuchstiers liegt.
-
Im
Hinblick auf den isolierten Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden
Erfindung, einschließlich hochgereinigten
CAF, rekombinanten CAF und/oder chemisch synthetisierten CAF wurde
festgestellt, dass der bevorzugte Dosisbereich der hochgereinigten
Zusammensetzung zwischen 1 Nanogramm und 400 Milligramm pro Kilogramm
Gewicht des Versuchstiers liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform
liegt der bevorzugte Dosisbereich zwischen ungefähr 0,01 Mikrogramm und ungefähr 100 Milligramm
pro Kilogramm Gewicht des Versuchstiers. In einer anderen Ausführungsform
wird ein Protein oder Antikörper
in einer Menge zwischen ungefähr
0,1 μg und
ungefähr
10 mg pro kg Körpergewicht
des Patienten und bevorzugter zwischen ungefähr 0,1 μg und ungefähr 100 μg pro kg Körpergewicht des Patienten verabreicht.
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Ist
die abzugebende Verbindung ein Nukleinsäuremolekül führt eine geeignete Einzeldosis
zu mindestens ungefähr
1 pg Protein, das pro mg Gesamtgewebeprotein pro μg abgegebener
Nukleinsäure
exprimiert wird. Bevorzugter ist eine geeignete Einzeldosis eine
Dosis, die zu mindestens ungefähr
10 pg Protein führt, das
pro mg Gesamtgewebeprotein pro μg
abgegebener Nukleinsäure
exprimiert wird; und bevorzugter mindestens ungefähr 50 pg
Protein, das pro mg Gesamtgewebeprotein pro μg abgegebener Nukleinsäure exprimiert
wird und bevorzugter mindestens ungefähr 100 pg Protein, das pro
mg Gesamtgewebeprotein pro μg
abgegebener Nukleinsäu re
exprimiert wird. Eine bevorzugte Einzeldosis eines nackten Nukleinsäureimpfstoffs liegt
im Bereich von ungefähr
1 Nanogramm (ng) bis ungefähr
100 μg,
in Abhängigkeit
von dem Weg der Verabreichung und/oder des Abgabeverfahrens, wie
durch den Fachmann bestimmt werden kann. Geeignete Abgabeverfahren
umfassen zum Beispiel solche durch Injektion, als Tropfen, mittels
Aerosol und/oder topische. In einer Ausführungsform bedecken reine DNA-Konstrukte
die Oberfläche
von Goldteilchen (1 bis 3 μm
Durchmesser) und werden in die Hautzellen oder den Muskel mit einer „Genkanone" geschossen. Für den Fachmann
ist es offensichtlich, dass die Zahl der einem Patienten verabreichten
Dosen von dem Ziel der Verabreichung (das heißt von dem Ausmaß der Erkrankung
und dem Ansprechen eines einzelnen Patienten auf die Behandlung)
abhängt.
Daher liegt es im Rahmen der Erfindung, dass eine geeignete Zahl
von Dosen jede Zahl von Dosen umfasst, die zur Regulation einer
Immunantwort in einem Tier oder zur Regulation einer Erkrankung oder
eines Zustands erforderlich ist, von dem erwartet wird, dass er
durch Hochregulation von entzündungsfördernden
Cytokinen (TNFα-IL-1β, IL-6) und/oder
durch Herrunterregulation von TGFβ behandelt
oder verhindert wird. Wirksame in vivo Dosisparameter können unter
Verwendung von Verfahren aus dem Stand der Technik bestimmt werden.
Derartige Verfahren umfassen zum Beispiel die Bestimmung von Überlebensraten,
Nebenwirkungen (das heißt
Toxizität),
die Bestimmung von Wirkungen der zellulären und humoralen Immunantwort
und/oder Wirkungen auf Zustände,
die mit derartigen Wirkungen auf Immunantworten zusammenhängen.
-
Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, eine Verwendung einer Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis, septischem Schock
oder Krebs bereitzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Zusammensetzung einen pharmazeutisch verträglichen
Träger,
der ebenfalls vorstehend hier beschrieben ist. In dieser Ausführungsform
kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als lokaler
oder systemischer Stimulator des Immunsystems verwendet werden.
Sie könnte
ebenfalls eine lokalisierte und systemische bakterielle Infektion
verhindern und/oder behandeln und könnte als ein allgemeines Antikrebsmittel
verwendet werden. Sie könnte
ebenfalls mit spezifischen Abgabereagenzien, wie Gewebe-spezifischen
Antikörpern
markiert werden, um durch den intravenösen Weg an die spezifische
Stelle der bakteriellen Infektion oder Tumorbildung abgegeben zu werden.
Sie könnte
ebenfalls mit spezifischen Liposomen oder Abgabevehikeln, die handelsüblich sind,
gemischt werden, damit sie durch die cytoplasmatische und Kernmembran
der Zelle abgegeben wird und dadurch die Regulation der TNF-α, IL-1β und/oder IL-6-Expression auf
dem RNA-Niveau erleichtert. Geeignete Arten der Verabreichung, einschließlich der
bevorzugten Wege und Dosen sind vorstehend beschrieben. Einem Tier
wird vorzugsweise eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
in einer Dosis und auf einem Weg verabreicht, der zur Regulation
einer Immunantwort durch Erhöhung
der Expression von TNF-α,
IL-1β und/oder
IL-6 oder durch Verringerung der Expression von TGFβ geeignet
ist.
-
Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur
Behandlung von Krebs in einem Tier, das Krebs oder ein Risiko zur
Entwicklung von Krebs aufweist. Die Verfahren der Verabreichung
und Einzelheiten der Zusammensetzung sind so wie vorstehend ausführlich beschrieben
ist. Die Verabreichung der Zusammensetzung erzeugt vorzugsweise
ein Ergebnis, das ausgewählt
ist aus der Gruppe aus: Verringerung der Symptome des Krebses, Verringerung
eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, Eliminierung eines mit
dem Krebs assoziierten Tumors, Prävention von metastatischem
Krebs, Prävention
von Krebs und Stimulation einer Effektorzellenimmunität gegen
Krebs.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung zur Behandlung oder Verhinderung von
Sepsis und/oder septischem Schock in einem Tier. Die Verfahren der
Verabreichung und Einzelheiten der Zusammensetzung sind so, wie sie
vorstehend ausführlich
beschrieben sind. Die Verabreichung der Zusammensetzung erzeugt
vorzugsweise ein Ergebnis, das ausgewählt ist aus der Gruppe aus:
Verringerung der Symptome der Sepsis oder des septischen Schocks,
Prävention
der Sepsis oder des septischen Schocks und Stimulation einer Effektorzellenimmunität gegen
die mit einer Sepsis oder einem septischen Schock assoziierten bakteriellen
Antigene.
-
Die
vorteilhaften Eigenschaften der vorliegenden Erfindung können unter
Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die die Erfindung erläutern, gesehen
werden.
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Diese
Beispiele werden für
die Zwecke der Erläuterung
bereitgestellt und beabsichtigen, nicht den Umfang der vorliegenden
Erfindung einzuschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Das
folgende Beispiel zeigt die Reinigung, Isolierung und Sequenzierung
des Cytokin-Aktivierungsfaktors (CAF) der vorliegenden Erfindung.
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Reinigung
des Cytokin-Aktivierungsfaktors
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Allgemeine Zusammenfassung
der CAF-Reinigung
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CAF
wurde anfänglich
600.000-fach aus ganzen PL-100 Eiern durch sieben Schritte (16) gereinigt und es wurde auf dem HPLC-Chromatogramm
gezeigt, dass er eine homogene Komponente ist. Die Reinigung des
CAF wurde durch Assays von Fraktionen bezüglich der CAF-in vitro biologischen
Aktivität über Cytokin-Assays
(nachstehend beschrieben) durch das Verfahren hindurch verfolgt.
Das ganze Ei wurde in dem ersten Schritt zu Eigelb fraktioniert.
Nach Delipidisierung des Eigelbs wurde CAF als 3.000 Dalton (oder
weniger) Permeatfraktion unter Verwendung von Ultrafiltrationstechnologie
konzentriert. Es wird festgestellt, dass der 3.000 Dalton Ausschluss
eine Näherung
ist, da signifikant größere Proteine.
durch den Filter hindurchgehen können,
wenn die Sekundärstruktur
es erlaubt (das heißt
im Wesentlichen lineare Polypeptide/Proteine). Das Permeat, das
den 3.000 MW Ausschlussfilter passierte, wurde auf Q Sepharose zur
Chromatographie für eine
weitere Trennung aufgebracht. CAF erschien als stark negativ geladenes
Molekül,
das fest an die Q-Sepharosesäule
bindet, und kann durch 0,3 M NaCl eluiert werden. Im nächsten Schritt
wurde die Festphasenextraktion zur Entfernung der großen Menge
an NaCl verwendet. Dieser Schritt steigerte durch die Entfernung anderer
polarerer Komponenten ebenfalls die CAF-Reinigung. Die CAF-aktive
Fraktion von SPE enthält
eine wasserunlösliche
Komponente, die durch Ethylacetat und Ethanol extrahiert wurde,
wobei CAF in der wasserlöslichen
Fraktion blieb. Schließlich
wurde CAF zu einer homogenen Komponente durch Umkehrphasen-C18 HPLC und Gelfiltrations-HPLC separiert.
Die Gesamtausbeute der CAF-Reinigung wurde auf ungefähr 20 % geschätzt. Die
Menge an CAF in dem ganzen Ei wird mit 3–5 ppm berechnet (Tabelle 1).
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TABELLE
1 CAF-Reinigungstabelle
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Die
einzelnen Schritte des Reinigungsverfahrens sind spezieller wie
folgt beschrieben.
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Eigelb-Delipidisierung
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Sprühgetrocknetes
PL-100-Eigelb enthält
Lipide, Proteine, Kohlenwasserstoffe, Aschen und viele biologische
Faktoren, einschließlich
CAF. Zur Entfernung von Lipiden und wasserunlöslichen Proteinen wurde das
Eigelb durch Caprylsäurephasenextraktion,
gefolgt von Zentrifugation behandelt. CAF und andere wasserlösliche Komponenten
wurden in der Wasserphase erhalten.
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Ein
Delipidisierungspuffer für
PL-100-Eigelb wurde durch Lösen
von 3,0 ml Eisessig und 100 ml Caprylsäure in 9 Litern ultrareinem
Wasser hergestellt. Der pH-Wert des Puffers beträgt näherungsweise 5,0. Eigelbmaterialien
(1,0 kg sprühgetrocknetes
Ei oder 2,0 Liter Eigelb mit Außenhaut)
wurden zu dem Puffer gegeben und die Mischung wurde weiter durch
Mischen mit 24.000 UpM bei Raumtemperatur während 5 Min homogenisiert.
Die Formen wurden entfernt und 20 ml zusätzliche Caprylsäure wurde
in die Mischung zur Ergänzung
der Caprylsäure
gegeben. Die Eimischung wurde bei Raumtemperatur für über 2 Stunden
gehalten, um eine Phasentrennung zu gestatten. Der ausgeflockte
Niederschlag wurde entfernt und die wässrige Phase der Eimischung
wurde bei Raumtemperatur während
20 Minuten mit 2.190 × g
zentrifugiert. Der Überstand
des Eigelbs wurde durch Whatman-Filterpapier (113V, 40 um) filtriert.
Der pH-Wert des Überstands
wurde auf 7,5 mit 2,0 M NaOH eingestellt.
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3.000 Dalton MW Eigelbpermeatherstellung.
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Delipidisierter
Eigelbüberstand
enthält
wasserlösliche
Proteine und CAF. CAF kann von Komponenten mit großem Molekulargewicht
durch ein Ultrafiltrationsverfahren getrennt werden. Bei dieser
Herstellung wurde überstehende
Flüssigkeit
des Eigelbs in einen Behälter
mit 22 l zusammengefasst, der an eine Filtrationseinheit (3K MWCO,
Amicon Modell CH2 Pumpengehäuse
und ein Spiralpatronen-Adapter Kit) angebracht wurde. Der Pumpendruck
wurde bei näherungsweise
30 psi in sowohl dem Einlass als auch dem Auslass der Filtration gehalten.
Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von näherungsweise
weniger als 3.000 Dalton (basierend auf ihrer Fähigkeit den Filter mit einem
Ausschluss von 3.000 Da zu passieren) wurden als Permeat gesammelt
und zur Trockene für
eine Lagerung gefriergetrocknet oder für eine weitere CAF-Reinigung gefroren.
Näherungsweise
2 % eines ganzen Eigelbs wird als 3.000 Dalton Permeat erhalten
(das hier ebenfalls als „3K
Permeat" bezeichnet
wird). CAF-Aktivitäten
bezüglich
TNFα- und
IL-1β in
in vitro Assays wurden zur Verfolgung des Vorhandenseins des CAF-Proteins
bestimmt (1 und 2). Das
3.000 Dalton MW Permeat von Eigelb wurde ebenfalls mit Collagen
II induzierter Arthritis und Air-Pouch-Tierassays getestet (Daten sind
nicht gezeigt). Das 3K Permeat wurde durch Umkehrphasen-C18 HPLC für
eine Reinheitsbestimmung analysiert (3).
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Q Sepharose-Ionenaustauschchromatographie.
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Der
CAF in dem 3.000 Dalton Permeat wurde weiterhin durch Q Sepharose
Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die meisten Komponenten
des 3.000 Dalton Permeats waren Moleküle mit positiven Ladungen und
sie banden nicht an Q Sepha rose. CAF band jedoch in diesem Beispiel
an Q Sepharose und es wurde festgestellt, dass er ein Molekül mit einer
großen
negativen Ladung ist. Die Reinigung von CAF durch Q Sepharose war
ein sehr wirksames Verfahren. Zum Setzenlassen der Q Sepharosesäule wurde
2.000 ml Q Sepharose mit 1.000 ml dH2O verdünnt und
auf eine Glassäule
(8 × 40
cm) gegeben. Das Verhältnis
von I.D. zur Länge
betrug 1:5. Das Chromatographieverfahren wurde bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Die Säule wurde
mit 4.000 ml Wasser und 8.000 ml 20 mM Ammoniumacetat, bei einem
pH-Wert von 7,5
und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2.500 ml/h äquilibriert.
20-30 l des 3.000
Dalton Permeats wurden auf die Q Sepharosesäule mit einer Durchflussgeschwindigkeit
von 1.500 ml/h gegeben. Die Q Sepharose wurde mit den folgenden
Puffern bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2.000 ml/h durch
schrittweise Elution gewaschen: (1) 4.000 ml 20 mM Ammoniumacetat,
pH-Wert 7,5, zum Waschen der Säule
und Elution aller ungebundenen Moleküle; (2) 4.000 ml 300 mM Ammoniumacetat,
pH-Wert 6,5 zur Elution einiger schwach gebundener Moleküle; (3)
4.000 ml 0,3 M NaCl zur Elution von CAF und anderen Molekülen; (4)
4.000 ml 1,5 M NaCl zur Elution der am stärksten gebundenen Moleküle und zur
Regeneration der Q Sepharose Säule.
Eine Fraktion 0,3 M NaCl wurde in einem Kolben nach 1.200 ml Eluant
gesammelt. Zur weiteren CAF-Reinigung wurde die 0,3 M NaCl Fraktion
einer Festphasenextraktion unterzogen. CAF-Aktivitäten bezüglich TNFα und IL-1β wurden in
einem in vitro Assay bestimmt (4). Das
3.000 Dalton MW Permeat wurde ebenfalls durch Umkehrphasen-C18 HPLC analysiert (5).
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Festphasenextraktion (SPE).
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Die
0,3 M NaCl Fraktion von der Q Sepharose enthält CAF und enorme Menge an
Salzen. Das Festphasenextraktions-(SPE)-Verfahren wird zur Entfernung
der Salze und zur Erhöhung
der CAF-Reinheit eingeführt.
Die Festphasenextraktion ist eine praktische, günstige und zeitsparende Alternative
zur Flüssig-Flüssig-Extraktion.
Dieses Verfahren wird normalerweise zur Reinigung und Konzentrierung
von Verbindungen für analytische
oder Isolierungszwecke verwendet. Zur Erhöhung der Bindung von CAF auf
SPE wird die Q Sepharosefraktion mit Trifluoressigsäure auf
einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Die saure Fraktion wird auf Umkehrphasen-C18
Harz in einer Säule
(5 × 22
cm) mit einer Bedingung für
Wechselwirkungen aufgebracht. Die Q Sepharosefraktion wurde auf
die SPE-Säule
bei Raumtemperatur mit einer Durch flussgeschwindigkeit von 40 ml/Min
aufgebracht. Die Chromatographie wurde bei einer Wellenlänge von
254 nm überwacht:
CAF und andere Komponenten wurden auf dem Packungsmaterial zurückgehalten
und die meisten Verunreinigungen gingen durch die Säule hindurch.
Sie Säule
wurde mit 800 ml Wasser, pH-Wert 2,0 und 1.200 ml 15 % Acetonitril
in Wasser, pH-Wert 2,0 gewaschen. CAF und weitere Komponenten, die
auf der Packung der Säule
zurückgehalten
worden waren, wurden durch 100 % Acetonitril, pH-Wert 2,0 selektiv
ausgewaschen (6). Die CAF-Fraktion (die ebenfalls als SPE-Fraktion
bezeichnet wird) wurde in einem kleinen Volumen gesammelt. Hochgereinigtes
CAF wurde zur Trockene gefriergetrocknet und es war bereit für eine weitere
Reinigung. CAF Aktivitäten
bezüglich
TNFα- und
IL-1β wurden
in einem in vitro Assay bestimmt (7). Die
SPE-Fraktion wurde ebenfalls durch Umkehrphasen-C18 HPLC
(8) analysiert.
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Verteilungsextraktion
der Fraktion der Festphasenextraktion.
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Erster
Schritt der Verteilungsextraktion (16):
Es wurde gezeigt, dass die Fraktion der Festphasenextraktion der
Q Sepharosesäule
eine wasserunlösliche
Komponente enthält
(das heißt
eine Lösungsmittel-lösliche Fraktion).
Diese Komponente wurde durch Ethylacetat und Ethanol extrahiert,
wobei CAF in der wasserlöslichen
Fraktion zurückblieb
(das heißt
die SPE-wasserlösliche
Fraktion). Kurz, 100 mg der Fraktion der Festphasenextraktion wurden
zu 10 ml Ethylacetat gegeben und bei Raumtemperatur während 20
Min gehalten. Die Mischung wurde in ein Glaszentrifugenröhrchen überführt und
mit 2.190 × g
während
20 Min gedreht. Ein weißes
Pellet (SPEwasserlösliche
Fraktion) wurde nach Zentrifugation erhalten. Ethylacetat wurde entfernt
und ein zweites Mal wurden 10 ml Ethylacetat zur nochmaligen Wiederholung
des Schritts zugegeben. Danach wurden 5,0 ml Ethanol mit dem Pellet
gemischt und mit 2.190 × g
während
20 Min gemischt.
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Die
SPE-wasserlösliche
Fraktion zeigte eine Inhibierung der Entzündung in einem Arthritismodell
eines Tiers. In einem in vitro Assay wurde gezeigt, dass die SPEwasserlösliche Fraktion
(weißes
Pellet nach dem Drehen) TNFα und
IL-1β in
THP1-Zellen stimuliert.
Im Gegensatz dazu zeigte die SPE-wasserunlösliche Fraktion keine derartige
Aktivitäten
in einem in vitro Assay.
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Zweiter
Schritt der Verteilungsextraktion (16):
Die SPE-wasserlösliche
Fraktion wurde weiter mit 5,0 ml 20 mM NH4OAc
in Wasser, das 20 % Acetonitril, pH-Wert 7,0 enthielt, gewaschen
und mit 2.190 × g während 20
Min gedreht. Bei neutralem pH-Wert
gibt es eine wasserlösliche
Fraktion (16, bei neutralem pH-Wert WSF)
und eine wasserunlösliche
Fraktion. Die wasserunlösliche
Fraktion (bei neutralem pH-Wert) wurde
zur Trockene für
eine CAF-Reinigung mit einer präparativen
HPLC, wie nachstehend beschrieben ist, gefriergetrocknet. Obwohl
diese bei neutralem pH-Wert waserunlösliche Fraktion bei neutralem
pH-Wert in Wasser praktisch unlöslich
ist, stellten die vorliegenden Erfinder fest, dass sie in Wasser
mit niedrigem pH-Wert löslich
ist, und daher wird sie als die bei saurem pH-Wert wasserlösliche Fraktion
bezeichnet. CAF-Aktivitäten bezüglich TNFα und IL-1β in einem
in vitro Assay (9) wurden in der bei saurem
pH-Wert WSF bestätigt und
diese CAF-aktive Fraktion (das heißt 16,
bei saurem pH-Wert WSF) wurde weiterhin durch Umkehrphasen-C18 HPLC
analysiert (10). Da die SPE-wasserlösliche Fraktion
(Pellet nach Drehen) in Wasser mit 0,1 % TFA, pH-Wert 2,0 oder in
Wasser mit hohem pH-Wert 12,0 löslich
ist, aber in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 schlecht löslich ist
(1,0 mg/ml), deutete dies darauf hin, dass die SPE-wasserlösliche Fraktion
sowohl eine Amingruppe als auch eine Carbonsäuregruppe enthielt, die im
Allgemein in Peptiden vorhanden sind.
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C18 HPLC-Trennung
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Die
bei saurem pH-Wert wasserlösliche
Fraktion der Festphasenextraktion schien eine einzelne Komponente
zu enthalten, die auf einem HPLC-Chromatogramm gezeigt wird (11). Dieser einzelne Peak wurde dahingehend identifiziert,
dass er CAF-Aktivität
in einer Cytokininduktionsuntersuchung zeigt, wie vorstehend beschrieben
ist. Diese CAF-angereicherte Fraktion wurde weiter in drei Komponenten
durch Umkehrphasen-C18 HPLC getrennt. Bei
dieser Trennung wurde eine Shimadzu HPLC-Einheit verwendet. Sie
ist mit einem SPD-M10A VP Diodenfelddetektor, einer LC-6AD-Flüssigkeitschromatographie,
einer SCL-10A VP-Entgasungsvorrichtung, einer LPM-600 Niedrigdruck-Mischvorrichtung
und einem CTO-10A VP Säulenofen
ausgestattet. Die bei saurem pH-Wert wasserlösliche Fraktion wurde mit 1,0
mg/ml in reinem Wasser mit 0,1 % TFA hergestellt. 3,0 ml der Probe
wurden auf eine BTR IMPAQ C18 Säule (10 μm, 22 × 250 mm)
bei 29° und
mit einer Durchflussgeschwin digkeit von 12,0 ml/Min gegeben. Ein
linearer Gradient mit 10 % – 100
% Methanol in dH2O, das 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA)
enthielt, wurde als mobile Phase verwendet. Die drei Fraktionen, die
unmittelbar vorstehend erwähnt
wurden, wurden zur CAF-Isolierung gesammelt. Sie wurden CAFo, CAFa und
CAFb genannt. Das Acetonitril in den Fraktionen wurde durch einen
Rotationsverdampfer entfernt und das Wasser wurde durch Gefriertrocknen
entfernt. Es wurde festgestellt, dass die Fraktion CAFb (47 Min – 49,5 Min)
einen einzelnen Peak enthielt, der auf dem HPLC-Chromatogramm identifiziert wurde (12). Diese Fraktion zeigte ebenfalls TNFα und IL-1β-Aktivitäten in einem
in vitro Assay, was darauf hinwies, dass der CAF zu einer homogenen
Komponente als CAFb gereinigt worden war (13).
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Gelfiltrations-HPLC-Trennung.
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Eine
weitere Reinigung verschiedener Fraktionen aus den vorstehenden
SPE- und C18 HPLC-Schritten wurde unter
Verwendung von Gelfiltrations-HPLC in den Shimadzu-HPLC-Vorrichtungen,
wie sie vorstehend beschrieben sind, durchgeführt. Kurz, eine Probe wurde
auf eine Gelfiltrations-HPLC-Säule
(250 × 9,4 mm,
Zorbox GF-250 Bio Reihe) unter der Durchlaufbedingung (Puffer: 50
mM NH4OAc, pH-Wert 8,0, Durchflussgeschwindigkeit:
1,0 ml/Min, 20 °C,
20 Min) gegeben. Die Probe wurde in dem Laufpuffer mit weniger als 1,0
mg/ml gelöst
und in 30 μl
für jeden
Durchlaufzeitpunkt injiziert.
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SPE-wasserlösliche Fraktion:
Die SPE-wasserlösliche
Fraktion wurde teilweise in 50 mM NH4OAc, pH-Wert
8,0 mit weniger als 1,0 mg/ml gelöst. Kurz, 1,0 mg SPEwasserlösliche Fraktion
wurde mit dem Puffer gemischt. Nach Drehen mit 10.000 UpM während 5
Min wurde der Überstand
gesammelt. Dann wurde das Pellet mit dem Puffer wieder gemischt.
Die ersten Überstände wurden
auf eine GF250 HPLC-Säule zur
Bestimmung von Molekülmassen
aufgebracht. Es gibt drei Hauptfraktionen nach der Trennung auf
der GF250 Säule.
Sie sind Fraktionen mit 530.000 Da, 122.000 Da und 1.240 Da. Die
drei Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockene für einen
Cytokin-Assay gefriergetrocknet. Die MW 530.000 Da und 122.000 Da
wurden in dem ersten Entwicklungspuffer gründlich gelöst und sie wurden beim zweiten
Lösen nicht
gefunden. Der 1.240 Da Peak wurde jedoch besser mit zweiten Lösung gelöst, was
darauf hinweist, dass die Moleküle
mit 530.000 Da und 122.000 Da größ tenteils
durch Lösen
von 1,0 mg SPE-wasserlöslicher
Fraktion in dem Puffer entfernt wurden. Das zurückbleibende nicht gelöste Pellet
(das heißt
SPE-GFII) ist tatsächlich
eine ziemlich reine Verbindung mit einem MW von 1.240 Da.
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CAFb-Fraktion:
Die CAFb-Fraktion aus der C18 HPLC-Trennung
wurde ebenfalls auf eine Gelfiltrations-HPLC-Säule (GF250) zum Testen ihres
Molekulargewichts gegeben. Es wurde festgestellt, dass es drei Hauptfraktionen
mit 530.000 Da, 122.000 Da beziehungsweise 40.000 Da gibt. Die Moleküle mit 530.000
Da und 122.000 Da können
zu einem großen
Molekül
on 700.000 Da durch 2-Mercaptoethanol und Sieden reduziert werden,
was darauf hinweist, dass eine Aggregation durch Änderung
der Oxidations-Reduktions-Bedingung auftreten konnte.
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CAFo,
CAFa, CAFb: Zum Vergleich der Molekulargewichte aller Cytokin-positiver
CAF-Fraktionen aus der bei saurem pH-Wert WSF auf der GF250-HPLC-Säule wurden
CAFo, CAFa und CAFb analysiert. CAFo weist einen einzelnen Peak
bei 8,621 Min (MW von 122.000 Da) auf. CFAa weist zwei Peaks bei
7,27 Min (MW 530.000 Da und 8,391 Min (MW 122.000 Da) auf. Wie vorstehend
erörtert
ist, weist CAFb einen zusätzlichen Peak
bei 9,483 Min (40.000 Da) auf. Die Moleküle mit dem MW 530.000 Da und
122.000 Da können
zu einem Molekül
mit 70.000 Da reduziert werden, was ähnlich zu dem ist, das in der
SPE-wasserlöslichen
Fraktion gesehen wird. Die einmalig vorhandene 40.000 Da Fraktion
von CAFb ist jedoch unter Reduktionsbedingungen stabil (Tabelle
2). Ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird vorgeschlagen, dass
das Molekül
von CAFb mit einem MW von 40.000 Da noch die aktive Stelle des CAF
besitzen kann, das ausgehend von einem kleineren Molekül des aktiven
CAF durch Aggregation gebildet worden sein könnte. Die isolierte CAFb-Fraktion
III (16) (MW 40.000 Da) aus der
GF-250-HPLC wurde CAFb-GFII genannt.
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TABELLE
2 Vergleich
der CAF-Fraktionen aus der HPLC-C
18 Säule
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- * Dieser Peak kann zu einem großen Molekül reduziert werden (7,000 Min).
- ** Diese Verbindung ist unter Reduktionsbedingungen stabil.
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SPE-GFII:
Der Überstand
der SPE-Wassserextraktion wurde ebenfalls durch GF-250-HPLC analysiert.
Wir fanden nach HPLC-Chromatographie zwei Hauptpeaks (8,40 Min und
12,22 Min). Die MW der zwei Peaks betrugen ungefähr 120.000 Da beziehungsweise
2.000 Da. Das Molekül
mit 2.000 Da wurde nicht in CAFo, CAFa und CAFb gefunden, was darauf
schließen
lässt,
dass es eine davon verschiedene Verbindung ist. Sie wurde mit SPE-GFII
bezeichnet.
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Biologische Aktivität der Fraktionen.
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Während des
gesamten Reinigungsverfahrens hindurch wurde, wie vorstehend beschrieben
ist, die in vitro Cytokinaktivität
(Messung der Induktion von TNFα und/oder
IL-1β) zum
Aufzeichnen des Reinigungsverfahrens und zur Auswahl der aktiven
Fraktionen verwendet. In den meisten Experimenten wurde festgestellt, dass
die SPE-wasserlösliche
Fraktion eine starke CAF-Cytokinaktivität aufweist. Überraschenderweise
zeigte hochgereinigtes CAFb keine so starke Aktivität oder eine
Aktivität,
die besser als die der SPE-wasserlöslichen Fraktion ist. Ohne
an eine Theorie gebunden zu sein wird vorgeschlagen, dass CAFb durch
das subsequente Reinigungsverfahren seine Form verändert hat,
und dass seine Aktivität
bezüglich
Cytokinen nach dem Aggregationsprozess abnimmt.
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Charakterisierung
der CAF-Fraktionen
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Analytische C18 HPLC.
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CAF-enthaltende
Fraktionen wurde mit Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
(Shimadzu Einheit, SPD-M10A VP Diodenfelddetektion, LC-6AD Flüssigkeitschromatographie, SCL-10A
VP Entgasungsvorrichtung, LPM-600 Niedrigdruck-Mischvorrichtung
und CTO-10A VP Säulenofen) analysiert.
Alle Fraktionen wurden mit 5,0 mg/ml in reinem Wasser herge stellt
und durch eine 0,2 μm
Filtereinheit filtriert. 20 μl
wurden von jeder Probe auf eine Wassersymmetrie-C18-Säule (3,9 × 150 mm)
bei 29 °C
und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min gegeben.
Ein linearer Gradient mit 0 % – 60
% Acetonitril in dH2O, das 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA)
enthielt, wurde als mobile Phase verwendet.
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3 zeigt
eine Chromatographie mit maximaler Auftragung der Trennung des Permeats
mit 3.000 Dalton aus delipidisiertem PL-100-Eigelb. Unter Verwendung
derselben Analysebedingungen wurden nachfolgende Fraktionen der
vorstehend beschriebenen Reinigungsschritte ebenfalls erhalten (5, 8, 10 und 12).
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CAF-Strukturanalyse
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Protein-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE).
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Das
Molekulargewicht von CAFb wurde unter Verwendung von SDS-PAGE bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, dass CAFb ein kleines Peptid mit einem MW
von ungefähr
6.670 Da ist. Es wird jedoch angenommen, dass aufgrund der Variabilität von SDS-PAGE
das Molekulargewicht von CAFb unter Verwendung von SDS-PAGE keine
genaue Zahl ist, sondern vielmehr eine Schätzung des Molekulargewichts
ist.
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Massenspektometrie (MS).
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Die
SPE-wasserlösliche
Fraktion wurde in saurem Wasser (WSF bei saurem pH-Wert) gelöst und auf eine
präparative
Umkehrphasen-C18 Säule zur CAF-Trennung aufgebracht.
Es wurden drei Fraktionen gesammelt. Sie sind CAFo, CAFa und CAFb.
Die aktive CAFb-Fraktion stimulierte TNFα- und IL-1β-Aktivitäten in einem in vitro Assay.
CAFb wurde mit Massenspektrometrie für eine Molekulargewichtsbestimmung
untersucht. Ergebnisse der ESI-MS zeigten, dass CAFb ein Protein
mit einem MW von 15.500 Da ist. Die Moleküle mit großem MW aus der CAFb-Fraktion
könnten
aus einer Aggregation des natürlichen
Moleküls
während
des Reinigungsverfahrens resultieren, die als Ergebnis der Entsalzung
auftreten könnte.
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Infrarotspektrometrie
(IR)
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Infrarotspektrometrieergebnisse
zeigten, dass CAFb ein Polypeptid mit ähnlichem Muster wie das Milchprotein,
Casein ist (14). IR-Ergebnisse zeigten
ebenfalls, dass CAFb eine reine Verbindung ist.
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N-terminale
Aminosäuresequenz
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Eine
N-terminale Aminosäuresequenzierung
wurde unter Verwendung eines verbeserten Hewlett Packard G1005A
N-terminalen Sequenzanalysators, der mit HP G1314A variablen Wellenlängendetektoren ausgestattet
war, durchgeführt.
Die verwendete Technologie führt
die Sequenzierung effizient mit Proben im Bereich von sub-pikomolaren
bis nanomolaren Niveaus aus. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen
von CAFb-GFII und SPE-GFII wurden bestimmt.
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CAFb
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Kurz,
CAFb wurde mit 50 μl
Wasser zuzüglich
50 μl 8
M GuHCl gelöst.
Näherungsweise
50 μl Probe wurden
auf die Umkehrphasenprobensäule
unter Verwendung des Beladungsprotokolls von Hewlett-Packard geladen.
Die Probenpatrone wurde mit 1 ml 2 % TFA gewaschen. Am Anfang der
Sequenzierung war die wichtigste N-terminale Sequenz eine sehr signifikante
Sequenz mit 30 Aminosäuren
und sie wird hier als SEQ ID Nr:1 dargestellt. Zwei weniger bedeutende
Sequenzen wurden ebenfalls in CAFb-GFII bestimmt und sie waren zu
der Hauptsequenz, abgesehen von dem Verlust von einem und zwei N-terminalen
Resten identisch (bezeichnet mit SEQ ID Nr:2 beziehungsweise SEQ
ID Nr:3). Die anfänglichen
Sequenzdaten sind nachstehend gezeigt: CAFb-GFII
900
pmol H2N – AGSSHEWPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISR | (SEQ
ID Nr:1) |
90
pmol H2N – s•hev•psl•qt••egsi•qly(a)gpl(s)r•n | (SEQ
ID Nr:2) |
90
pmol H2N – •••hev•psl••t••••s••q••••p | (SEQ
ID Nr:3) |
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Nachfolgend
wurde eine zusätzliche
Sequenz erhalten und ein Polypeptid mit 70 Aminosäuren wurde bestimmt,
das hier durch SEQ ID Nr:6 dargestellt ist und von dem angenommen
wird, dass es das CAFb-Protein mit voller Länge darstellt.
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CAFb-GFII
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- 900 pmol H2N – AGSSHEWPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISRYNVDEMTSAA
LAELKKCIDELPPXHLKALVNLXKQIRTEA
(SEQ ID Nr:6)
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CAFb
scheint ein Polypeptid mit 70 Aminosäuren zu sein und das Molekulargewicht
von CAFb wurde auf 8.839 Da berechnet, wie in Tabelle 3 gezeigt
ist. Aufgrund von Unsicherheiten bei den Sequenzpositionen 54 und
63 ist die Hauptsequenz (SEQ ID Nr:6) an diesen Positionen nicht
sicher zugeordnet. Dieses Polypeptid kann ein Dimer sein und ein
Protein von 15.000 Da bilden, wie es in der Untersuchung durch Massenspektrometrie
(MS) gefunden wurde. Die Sequenzdaten weisen ebenfalls darauf hin,
dass das anfängliche
CAFb während
der Immunisierung in dem zellulären
Metabolisierungsprozess zu einem kleinen aktiven Peptid proteolysiert
worden sein könnte.
Das im Eigelb vorhandene kleine CAFb könnte während des Reinigungsverfahrens zu
einem großen
Molekül
aggregiert worden sein.
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Es
ist klar, dass ein Fachmann in der Lage sein wird, Nukleinsäuresequenzen,
die SEQ ID Nr:6 kodieren, unter Verwendung des genetisch Codes und
unter Berücksichtung
der Degeneration darin, abzuleiten. Alle SEQ ID Nr:6 kodierende
Nukleinsäuresequenzen
werden von der vorliegenden Erfindung betrachtet und umfasst. Es
ist ebenfalls verständlich,
dass nun, da die Aminosäuresequenz
des CAF-Proteins bekannt ist, der Fachmann ohne weiteres in der
Lage sein wird, das Nukleinsäuremolekül, das das
CAF-Protein kodiert, unter Verwendung von Techniken, die aus dem
Stand der Technik gut bekannt sind, zu identifizieren, klonieren
und sequenzieren. Zum Beispiel kann der Durchschnittsfachmann degenerierte
Primer, basierend auf der CAF-Aminosäuresequenz, herstellen und
die gesamte oder einen Teil der Nukleinsäuresequenz, ausgehend von einer
geeigneten Bibliothek oder einer anderen geeigneten Quelle, durch
Polymerasekettenreaktion herstellen. Zusätzliches Klonieren des Nukleinsäuremoleküls kann
durch Herstellung einer Sonde und durch Screening einer cDNA-Bibliothek,
zum Beispiel, falls notwendig, bezüglich des Mole küls mit voller
Länge,
hergestellt werden. Nukleinsäuresequenzierungstechniken
sind dem Fachmann gut bekannt.
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-
-
-
-
- P
- = Polar aber ungeladen
- NP
- = Unpolar
- PC
- = Positiv geladen
- NC
- = Negativ geladen
Berechnetes M.W. von CAFb liegt nahe bei 8.839
Da.
-
SPE-GFII
-
SPE-GFII
wurde ebenfalls von dem N-Ende ausgehend sequenziert. Aus den Daten
von Zyklus 10 aufwärts
war es klar ersichtlich, dass es in dieser Probe zwei Hauptsequenzen
gab. Eine Sequenz, die hier als SEQ ID Nr:4 dargestellt ist, wurde
als ein Fragment eines bekannten Huhn-Vitellogenin 11-Vorläufers identifiziert.
Die x-Zeichen deuteten darauf hin, dass in den Positionen etwas
Glycosylierung auftrat.
SPE-GFII H2N-AViENLKARXxVSxNxIxTFNgVxFxYSMPA
(SEQ ID Nr:4)
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Die
Peptidsequenz wurde mit anderen bekannten Sequenzen in der von der
NIH zur Verfügung
gestellten BLAST-Datenbank verglichen (weiterentwickelter BLAST,
BLASTp, nr, Erwartet = 19, Gefiltert).
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Homologiesuche in der
Datenbank.
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Bei
der Ähnlichkeitssuche
bezüglich
CAFb-GFII (SEQ ID Nr:6) mit 70 Aminosäuren wurden 518.313 Proteinsequenzen
und 162.653.948 Buchstaben verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass
dieser Teil von CAFb-GFII eine einmalig vorhandene Sequenz ist und,
dass es keine identische Sequenz mit irgendeiner signifikanten Homo logie
dazu gibt. Das Protein mit der am nächsten liegenden Identität zu CAF
ist eine Aminosäuresequenz
wahrscheinlichen eines Ligand-bindenden Proteins RYD5, das aus der
norwegischen Ratte (Zugangsnr. S17449) isoliert wurde. Dieses Protein
mit 94 Aminosäuren
war zu 51 % zu SEQ ID Nr:6 über
die Aminosäurereste
1–66 der
SEQ ID Nr:6 hinweg identisch. Der längste aufeinanderfolgende Stretch
von Aminosäuren,
die die zwei Sequenzen gemeinsam hatten, war fünf. Die Funktion des potentiell
Ligand-bindenden Proteins RYD5 scheint ein Ligand-bindendes Protein
in den Subregionen der Geruchsschleimhaut der norwegischen Ratte
zu sein. Es wird daher angenommen, dass das CAF der vorliegenden
Erfindung und das RYD5-Protein
nicht über
Struktur oder Funktion zusammenhängen.
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SPE-GFII
wurde ebenfalls in der BLAST-Datenbank gesucht. Es wurde bestätigt, dass
es ein modifiziertes Fragment des Huhn-Vitellogenin 11-Vorläufers (SEQ
ID Nr:5) an den Positionen 1572–1602
war (15). Durch dasselbe Phänomen, wie
es für
CAF angenommen wurde, kann die Größe von SPE-GFII aufgrund des
Abbau- und Aggregationsprozesses
varriiert sein. Der Vitellogenin II-Vorläufer ist ein wichtiges Protein
zur Regulation vieler Proteine in dem Differenzierungsprozess, einschließlich von
Cytokinen. Das modifizierte Vitellogen II-Vorläuferfragment kann ebenfalls
in der Funktion zur Entzündungshemmung
eine Rolle spielen.
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Beispiel 2
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Das
folgende Beispiel zeigt die Wirkung des Cytokin-Aktivierungsfaktors
(CAF) auf Cytokinprofile und Aktivierung.
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Cytokin-Assays
wurden wie folgt durchgeführt.
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Stimulation von Zellen.
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Menschliche
THP-1-Zellen (mit Makrophagen-/Monozytenursprung) wurden gewaschen
und mit einer Dichte von 1 × 106 Zellen in 10 ml serumfreiem RPMI-Medium,
das unterschiedliche Eifraktionen enthielt, in einem 25 ml Kolben
ausgestrichen. Man ließ die
Zellen in einem befeuchteten CO2-Inkubator
während
4 Stunden wachsen, worauf sie abgeschabt und in einem 50 ml Zentrifugenrohr
gesammelt wurden. Die Zellen werden durch Zentrifugation mit 400 × g während 10
Min pelletisiert und in 750 μl
TRIzol-Reagenz (Gibco BRL) lysiert und zur Extraktion der gesamten
RNA, wie nachstehend beschrieben ist, verwendet.
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Extraktion der RNA aus
behandelten Zellen.
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Die
Extraktion der gesamten RNA aus den PBL-Zellpellets wurde gemäß dem TRIzol-Reagenzprotokoll
(Gibco, BRL) durchgeführt.
Die extrahierte gesamte RNA wurde durch Ultraviolett-Spktrophotometrie quantitativ
bestimmt und die Qualität
des Präparats
wurde durch Analyse der 28 s und 18 s Banden auf einem 1,0 % Agarosegel
in TBE-Puffer bestimmt.
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Synthese der cDNA aus
der gesamten RNA.
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Der
erste Strang der cDNA wurde aus 5 μg gesamter RNA von jeder Probe
unter Verwendung des Cycle® Kit für RT-PCR (InVitrogen, Carlsbad,
CA) synthetisiert. Für
Vergleichszwecke wird die allgegenwärtige GAPDH-mRNA verwendet,
um jedes cDNA-Präparat
halb zu quantifizieren.
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17 stellt die Cytokinprofile von THP-1-Zellen
dar, die mit teilweise gereinigten Fraktionen verschiedener Eier
behandelt worden waren. Die Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)-Expressiosngehalte
waren in Zellen, die mit einer 3k-Fraktion (2 mg/ml) eines PL-100-Eis
behandelt worden waren, höher
als im Vergleich zu der 3k-Fraktion von Speiseeiern. Ebenfalls waren
die Interleukin-1β (IL-1β)-Gehalte
höher,
jedoch zu einem geringeren Ausmaß in PL-100-Eiern als im Vergleich
zu den Speiseeiern. In diesen Assay gab es unter Verwendung der
3k-Fraktion keine nachweisbare Induktion von Interleukin-6 (IL-6)
oder Interleukin-10 (IL-10) in diesen Zellen. Es wird festgestellt,
dass in nachfolgenden Assays die Induktion von IL-6 unter Verwendung
von hochgereinigtem CAFb deutlich nachgewiesen wurde. Die Gehalte
von TNF-α in
dem ganzen PL-100-Ei waren geringfügig höher als diejenigen im Speiseei,
jedoch war die Konzentrationen viel höher als diejenigen der 3k-Fraktionen.
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Kinetik der TNF-α-Aktivierung
durch die 3k-Fraktion des hyperimmunen Eis.
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18 stellt die Kinetik der TNF-α-Aktivierung in THP-1-Zellen
durch die 3k-Fraktion des PL-100-Eigelbs dar. Die Induktion von
TNF-α durch
die PL-100 3k-Fraktion begann nach 30 Minuten und erreichte einen Peak
bei 2 Stunden, worauf sie zurückging
und nach 8 Stunden Grundlinienniveaus erreichte. Die Induktion von
TNF-α durch
die Speiseei 3k-Fraktion war gleich oder leicht höher als
normale in der Zelle gefundene Gehalte.
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Induktion der Differenzierung
in THP-1-Zellen durch eine gereinigte Fraktion des hyperimmunen
Eis.
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Die
THP-1-Zellen, die transformierte menschliche Zellen von Monozyten-
oder Makrophagenursprung sind, durchmachen bei Behandlung mit der
aus hyperimmunem Eigelb stammenden 3k-Fraktion eine Differenzierung.
Normalerweise wachsen diese Zellen in einer Suspension als Cluster
und haften nicht an den Kunststoffoberflächen an. Wurden sie jedoch
in einem die 3k-Fraktion aus einem hyperimmunen Ei (nachstehend als
PL-100 bezeichnet) (1 mg/ml) enthaltenden serumfreiem Medium vermehrt,
differenzierten sie in Fibroblast-ähnliche Zellen und hafteten
an die Kunststoffoberfläche
an. Wurde die 3k-Fraktion weiter auf einer Ionenaustauschsäule (Q-Sepharose) gereinigt
und mit 200 mM Natriumchlorid eluiert, bewirkte sie die Differenzierung
der THP-1-Zellen bei viel geringerer Konzentration (0,01 mg/ml).
Es gibt mehrere Berichte in der Literatur, die vorschlagen, dass
die Herstellung von TNF-α,
IL-1α und
IL-1β mit
einer Antiproliferation und Differenzierung von Zellen von Monozyten-/Makrophagenursprung
assoziiert ist.
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Induktion
der Cytokinexpression durch CAFb
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Cytokin-Assays
wurden, wie vorstehend beschrieben ist, unter Verwendung der SPE-wasserlöslichen Fraktion
und der hochgereinigten CAFb-Fraktion, wie in Beispiel 1 beschrieben
ist, durchgeführt. 19 zeigt, dass sowohl die SPEwasserlösliche Fraktion
als auch das CAFb-Präparat
die Expression von TNF-α,
IL-1β und IL-6
induzieren.
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Inhibierung von TGFβ durch CAFb
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Cytokin-Assays
wurden, wie vorstehend beschrieben ist, unter Verwendung der SPE-wasserlöslichen Fraktion
und der hochgereinigten CAFb-Fraktion, wie in Beispiel 1 beschrieben
ist, durchgeführt. 20 zeigt, dass CAFb, jedoch nicht die SPEwasserlösliche Fraktion
die Induktion des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) inhibieren.
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Während verschiedene
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ausführlich
beschrieben worden sind, ist es für den Fachmann offensichtlich,
dass Modifikationen und Anpassungen dieser Ausführungsformen vorkommen werden.
Es versteht sich jedoch ausdrücklich,
dass Modifikationen und Anpassungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden
Erfindung liegen, wie in den folgenden Ansprüchen definiert ist.