DE60018426T2

DE60018426T2 - Hochgereinigter cytokin-aktivierender faktor und verfahren zu seiner verwendung

Info

Publication number: DE60018426T2
Application number: DE60018426T
Authority: DE
Inventors: Subramanian Iyer; Lance Nguyen; Dauh-Rurng Wu; Ruye Xing
Original assignee: Arkion Life Sciences LLC
Current assignee: Arkion Life Sciences LLC
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: ATE290017T1; EP1198475B1; ES2239019T3; WO2001007472A1; CA2379251A1; CO5290297A1; EP1198475A1; DE60018426D1; CN1376163A; US20030143190A1; AR033340A1; JP2003506019A; US6420337B1; TWI250164B; AU778239B2; MXPA02000779A; EP1198475A4; MY125980A; JP4763193B2; NZ516744A

Description

Biologische Faktoren, wie zum Beispiel Coenzyme, Cofaktoren, Vitamine und andere, spielen bei biologischen Umwandlungsprozessen wichtige Rollen. Sie werden normalerweise in kleinen Mengen in einer Ganzzelle erzeugt (1 × 10^–5 – 1 × 10^–6). Die Isolierung und Reinigung derartiger biologischer Faktoren aus normalen Zellen ist jedoch ein schwieriges Unterfangen.
Es wurden hyperimmunisierte Eier entwickelt und es wurde gezeigt, dass sie Antikörper und bestimmte biologische Faktoren überproduzieren. Da die Hyperimmunisierung durch Injektion polyvalenter bakterieller Antigene in das Zieltier durchgeführt wird, kann die Menge an biologischen Faktoren, die in Eiern dieser hyperimmunisierten Tiere gefunden wird, nicht mehr als um eine Größenordnung erhöht werden. Daher macht die kleine Menge biologischer Faktoren in hyperimmunisierten Eiern die Reinigung biologischer Faktoren schwierig und somit besteht ein Bedarf für ein wirksames Verfahren zur Isolierung, Reinigung oder anderweitigen Herstellung von derartigen biologischen Faktoren.
Das normale Immunsystem befindet sich in einem Gleichgewicht, wobei entzündungsfördernde und entzündungshemmende Zellen und Moleküle sorgfältig reguliert sind, um die Immunabwehr des normalen Wirts ohne die Zerstörung von Geweben des Wirts zu fördern. Sobald dieses sorgfältige Gleichgewicht gestört ist, kann eine nicht spezifische Stimulierung und Aktivierung dazu führen, dass erhöhte Mengen an wirksamen schädlichen immunologischen und eine Entzündung hervorrufenden Molekülen erzeugt und abgegeben werden. Daher ist eine Überschussproduktion an entzündungsfördernden Cytokinen oder eine Erzeugung von Cytokinen im falschen biologischen Zusammenhang mit der Sterblichkeit und Pathologie in einem großen Bereich an Krankheiten assoziiert, wie zu Beispiel unter anderen Malaria, Blutvergiftung, rheumatische Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Krebs und AIDS.
Cytokine sind omnipotente Polypeptide, die auf autokrine/parakrine Arten durch Binden an spezifische Zellrezeptoren wirken. Ihre Sekretion ist zur Bestimmung der Dauer und Intensität einer Immunantwort von Bedeutung. Zum Beispiel wurde das Sekret von bestimmten Untersätzen von CD4+ T-Helfer (Th)-Klonen in Mäusen in klassischer Weise als Th1- und Th2-Cytokine beschrieben. Th1-Zellen erzeugen Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-γ (IFN-γ) und erleichtern die Immunantwort. Th2-Zellen erzeugen IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10 und unterstützen die Aktivierung von Immunglobulin absondernden Zellen. Während des Entzündungsprozesses werden Cytokine, wie zum Beispiel IL-1β, IL-6 und der Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) an der Entzündungsstelle freigesetzt. Diese Cytokine weisen pleiotrope Wirkungen auf und vermitteln einen großen Bereich von Symptomen, die mit einer Entzündung assoziiert sind.
Ein Schlüsselcytokin, TNF-α, das ebenfalls als Cachectin bekannt ist, ist ein Protein von 17 Kilo-Dalton, das aus 157 Aminosäuren besteht und hauptsächlich von Monozyten und aktivierten Makrophagen erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass TNF-α eine tumorizide Aktivität besitzt sowie eine Vielzahl physiologischer Wirkungen auf die meisten Hauptorgansysteme aufweist. Im Zentralnervensystem hat TNF-α mit Fieber, Anorexie und Veränderungen der Hypophysenabgabe zu tun. Im kardiovaskulären System spielt TNF-α eine Rolle bei Schock, akuter Atemnot und dem Kapillarundichtigkeitssyndrom (Prokoagulation). TNF-α ist in dem Prozess der akuten tubulösen Nekrose und Nephritis in der Niere und Ischämie, Dickdarmentzündung und hepatischer Nekrose im Magen-Darm-System förderlich. Es ist ebenfalls ein Schlüsselcytokin, das mit dem Entzündungsprozess zu tun hat.
Verschiedene Gattungen der Klasse der Vögel, wie zum Beispiel Hühner (Gallus domesticus), Truthähne und Enten, erzeugen im Blut und in Eiern Antikörper gegen Immunogene, die Vogelkrankheiten verursachen, sowie gegen andere Immunogene. Zum Beispiel haben LeBacq-Verheyden et al. (Immunology 27:683 (974)) und Leslie, G.A., et al. (J. Med. 130:1337 (1969)) quantitativ Immunglobuline von Hühnern analysiert. Polson et al. (Immunological Communications 9:495–514 (1980)) immunisierten Hennen gegen mehrere Proteine und natürliche Mischungen von Proteinen und wiesen IgY-Antikörper in den Dottern der Eier nach. Fertel et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 102:1028–1033 (1981)) immunisierten Hennen gegen Prostaglandine und wiesen Antikörper in dem Eigelb nach. Jensenius et al. (Journal of Immunological Methods 46:63-38 (1981)) stellten ein Verfahren zur Isolierung von Eigelb-IgG zur Verwendung in der Immundiagnostik bereit. Polson et al. (Immunological Communications 9:475–493 (1980)) beschrieben Antikörper, die aus dem Eigelb von Hennen isoliert sind, die mit einer Vielzahl von Pflanzenviren immunisiert wurden.
Das U.S. Patent Nr. 4,375,272 offenbart die Isolierung von Antikörpern aus den Dottern von Eiern, die von hyperimmunisierten Hennen stammen. Die Antikörperantwort wurde durch wiederholte Injektionen von Imunogenen hervorgerufen, die von Pflanzenviren, menschlichem IgG, Tetanus-Antitoxin, Schlangen-Antiveninen und Serameba abgeleitet waren.
Das U.S. Patent Nr. 4,550,019 offenbart die Isolierung von Antikörpern aus Eigelben, die in der Henne durch Hyperimmunisierung mit Immunogenen mit einem Molekular- oder Teilchengewicht von mindestens 30.0000 hervorgerufen wurden. Die zur Hyperimmunisierung der Hühner verwendeten Immunogene wurden unter Pflanzenviren, menschlichen Immunglobulinen, Tetanustoxin und Schlangengiften ausgewählt.
Das U.S. Patent Nr. 4,748,018 offenbart ein Verfahren zur passiven Immunisierung eines Säugers, das die parenterale Verabreichung eines gereinigten Antikörpers umfasst, der aus den Eiern eines Vogels erhalten wurde, der gegen das entsprechende Antigen immunisiert worden ist, und wobei der Säuger eine Immunität gegen die Eier erworben hat.
Das U.S. Patent Nr. 5,772,999 von DCV-Biologics offenbart ein Verfahren zum Verhindern, Entgegenwirken oder Verringern von chronischen gastrointestinalen Erkrankungen oder einer durch ein nicht steroidales entzündungshemmendes Arzneimittel induzierten (NSAID-induzierten) gastrointestinalen Schädigung in einem Versuchstier durch Verabreichung eines hyperimmunisierten Eis und/oder Milch oder Fraktionen davon an ein Versuchstier.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung der vorliegenden Erfinder, dass es eine spezifische immunregulatorische Aktivität im Ei und insbesondere in einem Ei gibt, das von hyperimmunisierten Tieren erhalten wurde, und das, wenn es einem Versuchstier und insbesondere Säugern verabreicht wird, die Cytokinerzeugung in diesem Versuchstier aktiviert.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen hochgereinigten Cytokin-Aktivierungsfaktor, der aus den Eiern eines Vogels erhalten werden kann. Der Cytokin-Aktivierungsfaktor kann aus Fraktionen, die sowohl aus dem Eigelb als auch aus Eiweiß isoliert worden sind, hochgereinigt werden. Der Cytokin-Aktivierungsfaktor kann ebenfalls rekombinant oder durch chemische Synthese hergestellt werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Cytokin-Aktivierungsfaktor-(CAF)-Protein. Ein derartiges Protein umfasst eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe aus: (a) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und (b) einer Aminosäuresequenz, umfassend mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste von jeder der beiden Aminosäuresequenzen von (a). Das isolierte CAF-Protein der vorliegenden Erfindung reguliert die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder Interleukin-6 (IL-6) hoch, und/oder reguliert die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunter. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Protein der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz, mit mindestens ungefähr 15 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten von jeder der beiden Aminosäuresequenzen von (a), und bevorzugter mit mindestens ungefähr 20 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten und besonders bevorzugt mit mindestens ungefähr 25 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten von jeder der beiden Aminosäuresequenzen von (a). In einer anderen Ausführungsform umfasst das isolierte Protein der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz mit mindestens ungefähr 50 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten der SEQ ID Nr:6.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein isoliertes Protein der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu ungefähr 65 % identisch mit einer Aminosäuresequenz von (a) über mindestens 15 Aminosäuren der Aminosäuresequenz von (a) ist. Das Protein umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu ungefähr 75 % identisch mit einer Aminosäuresequenz von (a) über mindestens 15 Aminosäuren der Aminosäuresequenz von (a) ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Protein eine Aminosäurese quenz, die mindestens zu ungefähr 60 % identisch mit SEQ ID Nr:6 über 66 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 ist. In einer weiteren Ausführungsform wird das Protein von einer Nukleinsäuresequenz kodiert, die unter Hochstringenzbedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, kodiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte CAF-Protein der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6 und besonders bevorzugt SEQ ID Nr:6.
In einer Ausführungsform weist ein isoliertes CAF-Protein der vorliegenden Erfindung eines oder mehrere der folgenden biochemischen Merkmale auf: (a) es weist mindestens eine biologisch aktive Untereinheit auf, die einen Filter mit einem Ausschluss von 3000 MW passiert; (b) es ist bei einer Temperatur bis zu mindestens ungefähr 50 °C stabil; (c) es ist bei einem pH-Wert von ungefähr 2 bis ungefähr 10 stabil; (d) es ist wasserlöslich; (e) es ist nicht steroidal; (f) es ist negativ geladen; (g) es ist im Wesentlichen nicht polar und/oder (h) es hat eine λ_max von ungefähr 254 nm. Ein isoliertes Protein der vorliegenden Erfindung ist biologisch aktiv, wenn es oral verabreicht wird. Ein isoliertes Protein der vorliegenden Erfindung ist natürlicherweise sowohl im Eiweiß als auch im Eigelb von Vogeleiern vorhanden. Wie vorstehend erörtert wurde, reguliert ein isoliertes CAF-Protein der vorliegenden Erfindung die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder Interleukin-6 (IL-6) hoch. In einer Ausführungsform reguliert ein isoliertes Protein der vorliegenden Erfindung die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunter.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen isolierten Antikörper, der selektiv an das isolierte CAF-Protein der vorliegenden Erfindung bindet.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung. Eine derartige Zusammensetzung umfasst einen pharmazeutisch verträglichen Träger, und ein wie vorstehend beschriebenes Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF)-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform ist der pharmazeutisch verträgliche Träger ein Lebensmittelprodukt, ausgewählt aus der Gruppe aus: (a) einem hyperimmunen Ei-Produkt, das ausgewählt ist, um mit dem CAF-Protein angereichert zu werden, und (b) einem mit mindestens einem Teil des hyperimmunen Ei-Produkts hergestellten Lebensmittelprodukts, wobei der Teil eine angereicherte Menge des CAF-Proteins im Vergleich zu dem hyperimmunen Ei-Produkt umfasst. Der pharmazeutisch verträgliche Träger umfasst vorzugsweise einen Teil eines hyperimmunen Ei-Produkts, der im Vergleich zum hyperimmunen Ei-Produkt eine angereicherte Menge des CAF-Proteins enthält. Geeignete Fraktionen eines hyperimmunen Ei-Produkts umfassen, sind aber nicht beschränkt auf flüssiges Eigelb, flüssiges Eiweiß, pulverisiertes Eiweiß und eine wasserlösliche Fraktion des hyperimmunen Ei-Produkts.
In einer Ausführungsform liegt die Zusammensetzung in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe aus einer Flüssigkeit, einem Aerosol, einer Kapsel, einer Tablette, einer Pille, einem Puder, einem Gel und einem Granulat vor. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der pharmazeutisch verträgliche Träger eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung. In einer weiteren Ausführungsform ist der pharmazeutisch verträgliche Träger aus der Gruppe aus Wasser, Phosphat-gepufferter Salzlösung, Ringer's-Lösung, Dextroselösung, Serum-enthaltenden Lösungen, Hank's-Lösung, anderen wässrigen physiologisch ausgewogenen Lösungen, Ölen, Estern, Glykolen, biokompatiblen Polymeren, polymeren Matrizes, Kapseln, Mikrokapseln, Mikropartikeln, Bolus-Präparationen, osmotischen Pumpen, Diffusionsvorrichtungen, Liposomen, Liposphären, Zellen und zellulären Membranen ausgewählt.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis, septischem Schock oder Krebs. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Medikament für die Verabreichung einer Dosis von 1 Nanogramm bis 400 Milligramm des CAF-Proteins pro Kilogramm Körpergewicht geeignet. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: orale, intravenöse Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, subkutane Verabreichung, transdermale Zufuhr, intratracheale Verabreichung, Inhalation, Imprägnierung eines Katheters, durch ein Zäpfchen und durch direkte Injektion in ein Gewebe. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ein das CAF-Protein enthal tendes Lebensmittelprodukt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tier ein Säuger.
Die Verabreichung der Zusammensetzung reguliert vorzugsweise die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder Interleukin-6 (IL-6) durch Zellen des Tiers hoch. In einem Aspekt reguliert die Verabreichung der Zusammensetzung die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) durch Zellen des Tiers herunter.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments gegen Krebs in einem Tier. Die Zusammensetzung kann einem Tier verabreicht werden, das Krebs oder ein Risiko zur Entwicklung von Krebs aufweist, wobei die Zusammensetzung ein Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF)-Protein der vorliegenden Erfindung umfasst, wie es hier vorstehend beschrieben wurde. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise für die Verabreichung einer Dosis von ungefähr 1 Nanogramm bis ungefähr 400 Milligramm des CAF-Proteins pro Kilogramm Körpergewicht des Tieres geeignet. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: orale, intravenöse Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, subkutane Verabreichung, transdermale Zufuhr, intratracheale Verabreichung, Inhalation, Imprägnation eines Katheters, durch ein Zäpfchen und durch direkte Injektion in ein Gewebe an der Stelle des Krebses oder benachbart dazu. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ein das CAF-Protein enthaltendes Lebensmittelprodukt.
Die Verabreichung der Zusammensetzung erzeugt vorzugsweise ein Ergebnis, ausgewählt aus der Gruppe aus: der Reduktion der Symptome des Krebses, der Reduktion eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, der Eliminierung eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, der Prävention von metastasierendem Krebs, der Prävention von Krebs und der Stimulation einer Effektorzellen-Immunität gegen Krebs.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül. Ein derartiges Nukleinsäuremolekül umfasst eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe aus: (a) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Pro tein kodiert, das eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und (ii) einer Aminosäuresequenz, umfassend mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer Aminosäuresequenz von (i), umfasst, und (b) einer Nukleinsäuresequenz, die vollkommen komplementär zu der Nukleinsäuresequenz von (a) ist. Das durch die Nukleinsäuresequenz von (a) kodierte Protein reguliert vorzugsweise die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder Interleukin-6 (IL-6) hoch. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, kodiert.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfasst, wie es hier vorstehend dargestellt ist. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, die ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfasst, wie es hier vorstehend dargestellt ist, wobei die Zelle das Nukleinsäuremolekül exprimiert. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, wie es hier vorstehend dargestellt ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung eines 3000 Dalton MW-Permeats auf die Induktion von Cytokinen ein einem in vitro Assay zeigt.
2 ist ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung eines 3000 Dalton MW-Permeats auf die Induktion von TNFα in einem in vitro Assay zeigt.
3 ist ein HPLC-Chromatogramm des PL-100 3000 Dalton MW-Permeats.
4 ist ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung von Q Sepharose-Fraktionen des 3000 Da MW-Permeats auf die TNFα-Induktion in THP-1-Zellen zeigt.
5 ist ein HPLC-Chromatogramm der CAF-aktiven Fraktion auf einer Q Sepharose-Säule.
6 ist ein Festphasenextraktions-Chromatogramm der CAF1-aktiven Fraktion von der Q Sepharose-Säule.
7 ist ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung der Festphasenextraktionsfraktionen auf die TNFα-Induktion in einem in vitro Assay zeigt.
8 ist ein HPLC-Chromatogramm der CAF-aktiven Fraktion der Festphasenextraktion.
9 ist ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung von Verteilungsextraktionsfraktionen auf die TNFα-Induktion in einem in vitro Assay zeigt.
10 ist ein HPLC-Chromatogramm der wasserlöslichen Fraktion durch Verteilungsextraktion.
11 ist ein HPLC-Chromatogramm einer C₁₈-HPLC-Trennung der wasserlöslichen Fraktion.
12 ist ein HPLC-Chromatogramm von gereinigtem CAF.
13 ist ein digitalisiertes Bild, das die Wirkung von CAF auf die IL-1β-Induktion in einem in vitro Assay zeigt.
14 ist ein Chromatogramm, das die Infrarot-Spektrometrie von CAF zeigt.
15 zeigt die Anordnung und Positionierung der SPE-GFII-Sequenz mit dem Huhn-Vitellogenin II-Vorläufer.
16 ist eine schematische Zeichnung, die die Reinigungsschritte für CAF erläutert.
17 ist ein digitalisiertes Bild, das Cytokin-RNA-Gehalte in THP-1-Zellen zeigt, die mit unterschiedlichen Ei-Fraktionen behandelt wurden.
18 ist ein digitalisiertes Bild, das die Kinetik der TNFα-Aktivierung durch die 3000 Da-Permeatfraktion eines Eis zeigt.
19 ist ein digitalisiertes Bild, das die Induktion von drei Cytokinen durch CAFb zeigt.
20 ist ein digitalisiertes Bild, das die Inhibierung des Transformierenden Wachstumsfaktors β durch CAFb zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen einen neuen Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF), eine einen Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF) umfassende Zusammensetzung und eine Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis, septischen Schock oder Krebs. Die Zusammensetzung der Erfindung kann Zusammensetzungen umfassen, die rekombinant hergestellten CAF, synthetisch (das heißt chemisch hergestellten CAF oder gereinigten CAF) umfassen, und/oder eine Zusammensetzung der Erfindung kann ein natürliches CAF-enthaltendes Lebensmittelprodukt sein, und vorzugsweise ein natürliches Lebensmittelprodukt oder einen Teil davon umfassen, der so angereichert ist, dass CAF vorhanden ist, wie zum Beispiel durch Auswahlverfahren oder durch Herstellung eines angereicherten Teils. Derartige natürliche Produkte umfassen hyperimmune Ei-Produkte, einschließlich Teilen von hyperimmunen Ei-Produkten, die mit CAF angereichert sind. Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass das neue Protein CAF die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-1β (IL-1β) hochreguliert und die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunterreguliert. Daher kann das CAF-Protein der vorliegenden Erfindung allgemein zur Modulation (das heißt zur Regulierung) des Immunsystems durch Modulation der Expression dieser Cytokine und der Zellen, die diese Cytokine erzeugen oder von diesen Cytokinen beeinflusst werden, verwendet werden.
Da typischerweise angenommen wird, dass TNFα, IL-1β und IL-6 entzündungsfördernde Cytokine sind und da typischerweise angenommen wird, dass TGFβ ein entzündungshemmendes Cytokin ist, ist das CAF-Protein der vorliegenden Erfindung außerdem zur Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis und Krebs verwendbar, wobei die Stimulation einer Immunantwort und Zellen, die auf entzündungsfördernde Cytokine reagieren, wünschenswert ist.
Von den vorliegenden Erfindern wurde ursprünglich entdeckt, dass der CAF der vorliegenden Erfindung eine Komponente ist, die in hyperimmunisierten Ei-Produkten erzeugt wird. Es ist nicht erforderlich, dass die bevorzugte immunogene Mischung, die vorzugsweise den Ei-erzeugenden Tieren zur Induktion einer Immunantwort und zur Erzeugung des hyperimmunen Ei-Produkts, das den Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung enthält, durch Injektion verabreicht wird, spezifische Immunogene enthält, von denen bekannt ist, dass sie durch Aktivierung spezieller Cytokine oder durch Induktion der Erzeugung eines Faktors, der spezielle Cytokine induziert, das Immunsystem modulieren. Es ist daher überraschend, einen derartigen Cytokin-Aktivierungsfaktor in einem hyperimmunen Ei-Produkt zu finden, das von Tieren erhalten wurde, die gegen einen gemischten Antigenimpfstoff immunisiert wurden, und von dem erwartet wird, dass er bei Verabreichung an ein Versuchstier das Immunsystem moduliert. Außerdem war vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt, dass die Hyperimmunisierung von Ei-erzeugenden Tieren zur Erzeugung des neuen Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung führen würde, der die Eigenschaften aufweisen würde, dass er zur Regulierung der Cytokinerzeugung und zur Differenzierung der Zellen des Immunsystems in einem Tier in der Lage ist. Nach Kenntnis der vorliegenden Erfinder wurde vor dieser Erfindung noch niemals der hier beschriebene Cytokin-Aktivierungsfaktor identifiziert, gereinigt, charakterisiert oder sequenziert.
Der Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung kann abgetrennt und aus einem Ei unter Verwendung von Ultrafiltration, Q Sepharose Ionenaustauschchromatographie, Festphasenextraktion, Verteilungsextraktion und Umkehrphasen-C₁₈ HPLC-Technologien (siehe Beispiel 1) hoch gereinigt werden. Analytische HPLC, in vitro Cytokinexpressionsuntersuchungen und Bioassaydaten haben alle die Reinigung eines biologisch aktiven Cytokin-Aktivierungsfaktors gezeigt. Außerdem kann, wie hier beschrieben ist, der Cytokin-Aktivierungsfaktor isoliert, kloniert und rekombinant oder synthetisch unter Verwendung der hier bereitgestellten Sequenzinformation hergestellt werden.
Definitionen
Die folgenden Definitionen gelten für die gesamte Anmeldung sofern es nicht anders angegeben ist.
Der Begriff „Hyperimmunisierung" bedeutet die Aussetzung gegenüber einem oder mehreren Immunogenen (zum Beispiel Antigenen), so dass eine Immunantwort hervorgerufen und gegenüber dem natürlichen Zustand ohne Aussetzung beibehalten wird.
Der Begriff „immunogen" bedeutet eine Substanz, die eher zur Induktion einer humoralen Antikörper- und/oder einer Zell-vermittelten Immunantwort als zur immunologischen Toleranz in der Lage ist. Der Begriff bezeichnet die Fähigkeit zur Stimulation einer Immunantwort, sowie zur Reaktion mit ihren Produkten, zum Beispiel Antikörper.
Der Begriff „kombinatorisch abgeleitete Immunogene" bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung einer molekularen Verschiedenartigkeit unter Immunogenen mittels kombinatorischer Synthese.
Der Begriff „biotechnologisch hergestellte Immunogene" bezieht sich auf Immunogene, die durch das Verfahren von Genklonierungstechnologien und durch genetische Manipulation oder chemische Synthese erhalten werden.
Der Begriff „genetischer Impfstoff" bezieht sich auf einen Nukleinsäureimpfstoff, der im Allgemeinen durch Rekombinationstechnologien hergestellt wird und der eine Immunantwort hervorrufen kann.
Die Begriffe „Ei" oder „Ei-Produkt" bedeuten jeweils jedes ganze Ei (Speiseei, hyperimmunisiertes oder sonstiges Ei) oder jedes Produkt oder davon stammende Teil.
Die Begriffe „Speiseei" oder „Speiseei-Produkt" bedeuten jeweils ein ganzes Ei oder jedes Produkt oder davon stammende Teil, das von Ei-erzeugenden Tieren erhalten wird, die nicht in einem hyperimmunen Zustand gehalten werden.
Die Begriffe „hyperimmunes Ei" oder „hyperimmunes Ei-Produkt" bedeuten jeweils ein ganzes Ei oder jedes Produkt oder davon stammende Teil, das von einem Ei-erzeugenden Tier erhalten wird, das in einem hyperimmunen Zustand gehalten wird.
Der Begriff „supranormale Gehalte" bedeutet Gehalte, die über denjenigen liegen, die in Eiern von Ei-erzeugenden. Tieren, die nicht in einem hyperimmunen Zustand gehalten wurden, gefunden wurden.
Der Begriff „immunregulatorsiches Ei" bedeutet Ei oder Eiteile, die den hier offenbarten Cytokin-Aktivierungsfaktor enthalten.
Der Begriff „Immunantwort" bezieht sich im Allgemeinen auf eine Zell-vermittelte oder zelluläre Immunantwort (das heißt, eine Immunantwort, die durch Zellen des Immunsystems, einschließlich T Lymphozyten, B Lymphozyten und Makrophagen vermittelt wird) und/oder eine humorale Immunantwort (das heißt, eine durch Antikörper vermittelte Immunantwort).
Der Begriff „Tier" bezieht sich auf jede Spezies des Tierreichs. Bevorzugte, gemäß der vorliegenden Erfindung zu immunisierende Tiere umfassen alle Tiere der Wirbeltierklasse, Vögel, umfassend, ohne beschränkt darauf zu sein, Hühner, Truthähne und Enten. Bevorzugte, gemäß der vorliegenden Erfindung zu behandelnde Tiere umfassen alle Tiere der Wirbeltierklassen, Vögel und Säuger, umfassend, ohne beschränkt darauf zu sein, Primaten, Nagetiere, Vieh und Haustiere. Vieh umfasst Säuger, die zu verzehren sind, oder die verwendbare Produkte erzeugen (zum Beispiel Schafe für die Wollproduktion). Bevorzugte Säuger, die vor einer Krankheit oder einem Zustand zu schützen sind, umfassen Menschen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder, Pferde und Schweine, wobei Menschen besonders bevorzugt sind.
Der Begriff „Zieltier" bezieht sich auf ein Tier, das als Ei-erzeugendes Tier dient.
Der Begriff „Versuchstier" bezieht sich auf das Tier, dem eine CAF-enthaltende Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, umfassend Zusammensetzungen, die gereinigten CAF, synthetisch hergestellten CAF, rekombinant hergestellten CAF, oder ein CAF-angereichertes Ei oder ein durch das Zieltier erzeugtes Ei-Produkt verabreicht wird. Ein Versuchstier kann ebenfalls als ein Patient bezeichnet werden.
Der Begriff „Cytokin-Aktivierungsfaktor" oder „CAF" wird im Allgemeinen zur Bezeichnung des Faktors der vorliegenden Erfindung in jedem Zustand der Reinheit (zum Beispiel einschließlich einer Komponente eines Eis, als halbgereinigtes Protein, als hochgereinigtes Protein, als rekombinantes Protein oder als chemisch synthetisiertes Protein) verwendet, wobei dieser die hier für den Cytokin-Aktivierungsfaktor beschriebenen biochemischen, physikalischen, strukturellen und/oder funktionalen Merkmale (zum Beispiel biologische Aktivität) aufweist. Es wird festgestellt, dass hochgereinigter erfindungsgemäßer CAF ebenfalls als „CAFb" bezeichnet werden kann (siehe Beispiel 1).
Der Begriff „hochreiner Cytokin-Aktivierungsfaktor" oder „hochreiner CAF" bedeutet einen Cytokin-Aktivierungsfaktor mit mindestens der Reinheit, die in Beispiel 1 für CAFb beschrieben ist.
Der Begriff „Cytokin-Aktivierungsfaktor-angereichertes" oder „CAF-angereichertes" Produkt oder Zusammensetzung bezieht sich auf ein Produkt oder eine Zusammensetzung, die gereinigt, verarbeitet und/oder so hergestellt ist, dass sie im Vergleich zu dem Gehalt des Cytokin-Aktivierungsfaktors in dem Produkt oder der Zusammensetzung vor der Reinigung, Verarbeitung und/oder vor dem Herstellungsschritt einen größeren Gehalt des Cytokin-Aktivierungsfaktors in dem angereicherten oder Endprodukt enthält. Daher ist in einer Ausführungsform der CAF in dem ursprünglichen Produkt oder der Zusammensetzung vorhanden und die Schritte des Reinigens, Verarbeitens und/oder Herstellens erhöhen die Menge an CAF in dem Produkt oder der Zusammensetzung im Vergleich zu den anderen Komponenten in dem Produkt oder der Zusammensetzung, typischerweise durch Eliminierung oder Verringerung der Menge von einigen der Komponenten aus dem ursprünglichen Produkt. In einer wei teren Ausführungsform enthält weder das ursprüngliche Produkt noch die Zusammensetzung CAF oder eine Anfangsmenge an CAF und das CAF-angereicherte Produkt oder die Zusammensetzung wird durch Zugabe von gereinigtem rekombinanten oder synthetisch hergestellten CAF zu dem ursprünglichen Produkt oder Zusammensetzung erzeugt. Derartige CAF-angereicherte Zusammensetzungen werden nachstehend ausführlicher erörtert. Andere Wege zur Anreicherung einer Zusammensetzung oder eines Produkts bezüglich CAF sind für den Fachmann offensichtlich.
Der Begriff „isoliert" bezieht sich im Hinblick auf eine Verbindung (zum Beispiel ein Protein oder ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung) auf eine Verbindung, die aus ihrem natürlichen Milieu entfernt worden ist (das heißt, die einer menschlichen Manipulation unterzogen worden ist). Der Begriff „isoliert" als solches spiegelt nicht das Ausmaß der Reinigung der Verbindung wider.
Der Begriff „Protein" kann untereinander austauschbar mit dem Begriff „Polypeptid" verwendet werden, obwohl der letztere Begriff typischerweise zur Bezeichnung kleiner Proteine mit im Wesentlichen linearer Sekundärstruktur verwendet wird. Der Begriff „Protein" oder „Polypeptid" umfasst Proteine von vollständiger Länge, Fusionsproteine oder jedes Homolog eines derartigen Proteins.
Der Ausdruck „Homolog eines CAF-Proteins" (das heißt ein „CAF-Homolog") umfasst CAF-Proteine, in denen mindestens eine oder einige wenige, aber nicht beschränkt auf eine oder ein paar Aminosäuren deletiert (zum Beispiel eine abgeschnittene Version des Proteins, wie zum Beispiel ein Peptid oder Fragment), eingeschoben, invertiert, substituiert und/oder derivatisiert worden sind (zum Beispiel durch Glycosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Myristoylierung, Prenylierung, Palmitierung, Amidierung und/oder Addition von Glycosylphosphatidylinositol). Ein CAF-Homolog weist vorzugsweise eine CAF-biologische Aktivität auf.
Der Ausdruck „biologisch aktiv" oder „biologische Aktivität" bezieht sich unter Bezugnahme auf ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung auf jede funktionale Aktivität eines CAF-Proteins, und typischerweise auf eine funktionale Aktivität eines natürlich vorkommenden CAF-Proteins. Insbesondere bezieht sich die Bezugnahme auf die biologische Aktivität eines CAF-Proteins vorzugsweise auf die Fähigkeit eines CAF-Proteins zur Hochregulation (Induktion, Stimulation, Verstärkung, Zunahme) der Expression eines Cytokins, das den Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder Interleukin-6 (IL-6) umfasst. Es wird festgestellt, dass natürlich vorkommender CAF, wie er hier ausführlich beschrieben ist, die Expression von jedem der TNFα, IL-1β und IL-6 hochregulieren kann. Die biologische Aktivität von CAF kann ebenfalls eine Fähigkeit zur Herunterregulation (Inhibierung, Abnahme, Unterdrückung) der Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) umfassen. Eine biologische Aktivität eines CAF-Proteins kann ebenfalls umfassen, ist aber nicht beschränkt auf eine Fähigkeit von CAF zur Bindung an einen Rezeptor oder ein anderes Protein, DNA, eine Kohlenwasserstoffeinheit oder eine Lipideinheit, die zu den vorstehend identifizierten biologischen Aktivitäten führt oder zu einer von diesen beiträgt.
Eine „biologisch aktive Untereinheit" eines Proteins ist ein Teil (das heißt ein Fragment, Domäne oder Monomer) des Proteins, das die biologische Aktivität des Proteins mit vollständiger Länge aufweist, oder ein Multimer.
Der Begriff „mimetische Verbindung" wird zur Bezeichnung jeder Peptid- oder Nicht-Peptidverbindung verwendet, die zur Nachahmung der biologischen Wirkung eines natürlich vorkommenden Peptids in der Lage ist, weil die mimetische Verbindung häufig eine Grundstruktur aufweist, die die Grundstruktur des natürlich vorkommenden Peptids nachahmt und/oder hervorstechende biologische Eigenschaften des natürlich vorkommenden Peptids aufweist. Mimetische Verbindungen können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Peptide, die wesentliche Modifikationen, ausgehend von dem Prototyp, aufweisen, wie zum Beispiel keine Ähnlichkeit in Seitenketten mit dem natürlich vorkommenden Peptid (derartige Modifikationen können zum Beispiel ihre Anfälligkeit gegenüber Abbau verringern); antiidiotype und/oder katalytische Antikörper oder Fragmente davon; nicht proteinhaltige Teile eines isolierten Proteins (zum Beispiel Kohlenwasserstoffstrukturen), oder synthetische oder natürliche organische Moleküle, einschließlich zum Beispiel von Nukleinsäuren und Arzneimitteln, die durch kombinatorische Chemie identifiziert sind.
Der Begriff „stabil" in Bezug auf ein Protein der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Fähigkeit eines Proteins gegen Abbau beständig zu sein, der durch Zunahmen oder Abnahmen in der Temperatur, durch Zunahmen oder Abnahmen im pH-Wert, durch Zunahmen oder Abnahmen in den Salzkonzentrationen, durch Oxidation und/oder Reduktion, durch Deamidierung verursacht wird, und/oder gegen andere Formen chemischen Abbaus und proteolytischen Abbaus beständig zu sein. Insbesondere wird durch den Nachweis jeglichen messbaren Gehalts an biologischer Aktivität des Proteins, vorzugsweise durch den Nachweis der Fähigkeit des Proteins zur Beeinflussung einer beliebigen messbaren Zunahme in der TNFα-, IL-1β- oder IL-6-Expression durch eine Zelle, bestimmt, dass ein Protein unter jeder gegebenen Bedingung stabil ist. Ein Protein, von dem angenommen wird, dass es stabil ist, behält vorzugsweise mindestens 10 % und bevorzugter mindestens 50 % seiner biologischen Aktivität nach Aussetzen gegenüber einer gegebenen Bedingung bei, im Vergleich zu seiner biologischen Aktivität vor dem Aussetzen gegenüber der Bedingung (zum Beispiel seine biologische Aktivität unter normalen Bedingungen). Die Stabilität eines Proteins kann sich, wie vorstehend beschrieben ist, auf die Fähigkeit eines Proteins beziehen, entweder während seiner Lagerung oder während seiner Verwendung stabil zu sein.
Der Ausdruck „Nukleinsäuremolekül" bezieht sich vor allem auf das physikalische Nukleinsäuremolekül und der Ausdruck „Nukleinsäuresequenz" bezieht sich vor allem auf die Sequenz von Nukleotiden auf dem Nukleinsäuremolekül. Jedoch können die zwei Ausdrücke untereinander austauschbar verwendet werden, besonders in Bezug auf ein Nukleinsäuremolekül oder eine Nukleinsäuresequenz, die zur Kodierung eines Proteins in der Lage ist.
Der Ausdruck „rekombinantes Molekül" oder „rekombinantes Nukleinsäuremolekül" bezieht sich vor allem auf ein Nukleinsäuremolekül, das funktionsfähig an eine Transkriptionskontrollsequenz gebunden ist.
Der Ausdruck „funktionsfähig gebunden" bezieht sich auf die Bindung eines Nukleinsäuremoleküls an eine Transkriptionskontrollsequenz in so einer Weise, dass das Molekül in der Lage ist, bei Transfektion (das heißt, Transformation, Transduktion, Transfektion, Konjugation oder Einleitung) in eine Wirtszelle, exprimiert zu werden.
Der Ausdruck „Transkriptionskontrollsequenz" bezieht sich auf alle Sequenzen, die die Initiierung, Verlängerung und Terminierung der Transkription kontrollieren. Besonders wichtige Transkriptionskontrollsequenzen sind solche, die die Transkriptionsinitiierung kontrollieren, wie zum Beispiel Promotor-, Verstärker-, Operator- und Repressorsequenzen.
Der Begriff „Transfektion" wird zur Bezeichnung eines jeden Verfahrens verwendet, durch das ein exogenes Nukleinsäuremolekül (das heißt ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül) in die Zelle inseriert werden kann. Der Begriff „Transformation" kann untereinander austauschbar mit dem Begriff „Transfektion" verwendet werden, wenn ein derartiger Begriff verwendet wird, um auf die Einführung von Nukleinsäuremoleküle in mikrobielle Zellen, wie zum Beispiel Bakterien und Hefe, zu verweisen. In mikrobiellen Systemen wird der Begriff „Transformation" dazu verwendet, eine vererbte Änderung aufgrund des Erwerbs exogener Nukleinsäuren durch den Mikroorganismus zu beschreiben, und ist im Wesentlichen zu dem Begriff „Transfektion" synonym. In Tierzellen eignete sich der Begriff Transformation eine zweite Bedeutung an, die sich auf Änderungen in den Wachstumseigenschaften von Zellen in Kultur, nachdem sie zum Beispiel kanzerös geworden sind, beziehen kann. Zur Vermeidung von Verwirrungen wird daher der Begriff „Transfektion" vorzugsweise in Bezug auf die Einführung exogener Nukleinsäuren in Tierzellen verwendet und der Begriff „Transfektion" wird hier im Allgemeinen so verwendet, dass er sowohl die Transfektion von Tierzellen als auch die Transformation von mikrobiellen Zellen in dem Ausmaß umfasst, dass der Begriff die Einführung exogener Nukleinsäuren in eine Zelle betrifft. Transfektionstechniken umfassen daher Transformation, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion, Adsorption, Infektion und Protoplastenfusion, aber sind nicht beschränkt darauf,
Die Begriffe „aneinandergrenzend" oder „aufeinanderfolgend" werden in Bezug auf hier beschriebene Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen untereinander austauschbar verwendet und beziehen sich auf in einer ununterbrochenen Sequenz zusammenhängende Sequenzen. Zum Beispiel bedeutet es für eine erste Sequenz, die 30 aneinandergrenzende (oder aufeinanderfolgende) Aminosäuren einer zweiten Sequenz umfasst, dass die erste Sequenz eine ununterbrochene Sequenz von 30 Aminosäureresten umfasst, die zu 100 % mit einer ununterbrochenen Sequenz von 30 Aminosäureresten in der zweiten Sequenz identisch ist. Ähnlich bedeutet es für eine erste Sequenz, die eine „Identität von 100 %" mit einer zweiten Sequenz aufweist, dass die erste Sequenz exakt mit der zweiten Sequenz ohne Lücken zwischen Nukleotiden oder Aminosäuren übereinstimmt.
Der Verweis auf eine prozentuale (%) Identität bezieht sich, sofern nichts anderes angegeben ist, auf eine Bewertung der Homologie zwischen zwei oder mehreren Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen, die durchgeführt wird unter Verwendung: (1) einer BLAST 2.0 Basic BLAST Homologiesuche (httpa/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) unter Verwendung von blastp für Aminosäuresuchen und blastn für Nukleinsäuresuchen mit Standard-Defaultparametern, wobei die Query-Sequenz auf Regionen niedriger Komplexität gemäß der Vorgabe gefiltert wird (beschrieben in Altschul, S.F., Madden, T.L. Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z. Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids. Res. 25:3389–3402, (2) einer BLAST 2 Anordnung (unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Parameter) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST); oder (3) sowohl BLAST 2.0 als auch BLAST 2. Es wird festgestellt, dass aufgrund einiger Unterschiede in den Standardparametern zwischen BLAST 2.0 Basic BLAST und BLAST 2 unter Verwendung des BLAST 2 Programms zwei spezifische Sequenzen mit signifikanter Homologie erkannt werden könnten, wohingegen eine in BLAST 2.0 Basic BLAST durchgeführte Suche unter Verwendung einer der Sequenzen als Query-Sequenz die zweite Sequenz in den besten Übereinstimmungen nicht identifizierten könnte. Daher ist es verständlich, dass die prozentuale Identität durch Verwendung von entweder einem oder beiden dieser Programme bestimmt werden kann, jedoch vorzugsweise unter Verwendung von BLAST 2.0 Basic BLAST. Zwei spezifische Sequenzen können unter Verwendung der BLAST 2 Sequenz, entsprechend der Beschreibung in Tatusova und Madden, (1999), „Blast 2 sequences – a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174:247–250, zueinander vergleichend angeordnet werden. Die BLAST 2 Sequenzanordnung wird in blastp oder blastp unter Verwendung des BLAST 2.0 Algorithmus zur Durchführung einer Gapped BLAST Suche (BLAST 2.0) zwischen zwei Sequenzen durchgeführt, wobei die Einführung von Lücken (Deletionen und Insertionen) in der resultierenden Anordnung erlaubt sind. Aus Gründen der Klarheit für die vorliegenden Beschreibung, wird eine BLAST 2 Sequenzanordnung unter Verwendung der Standard-Defaultparameter wie folgt durchgeführt:
Für blastn unter Verwendung einer 0 BLOSUM62 Matrix:
Belohnung für Übereinstimmung = 1
Strafe für fehlende Übereinstimmung = –2
Offene Lücke (5) und Verlängerungslücke (2) Strafen
Lücke x_dropoff (50) erwartet (10) Wortgröße (11) Filter (an)
Für blastp unter Verwendung einer 0 BLOSUM62 Matrix:
Offene Lücke (11) und Verlängerungslück- (1) Strafen
Lücke x_dropoff (50) erwartet (10) Wortgröße (11) Filter (an).
Der Verweis auf „Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Standardhybridisierungsbedingungen, unter denen Nukleinsäuremoleküle zur Identifizierung ähnlicher Nukleinsäuremoleküle verwendet werden. Derartige Standardbedingungen werden zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989, offenbart. Sambrook et al., ebd., (siehe insbesondere die Seiten 9.31–9.62). Außerdem werden Formeln zur Berechnung der geeigneten Hybridisierung und Waschbedingungen zum Erreichen einer Hybridisierung, die variierende Grade fehlender Übereinstimmung von Nukleotiden erlauben, zum Beispiel in Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267–284; Meinkoth et al., ebd., offenbart. Der Fachmann kann die Formeln in Meinkoth et al., ebd. zur Berechnung der geeigneten Hybridisierung und Waschbedingungen verwenden, um spezielle Grade fehlender Nukleotidübereinstimmung zu erreichen. Derartige Bedingungen werden in Abhängigkeit davon, ob DNA:RNA- oder DNA:DNA-Hybride gebildet werden, variieren. Berechnete Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride betragen 10 °C weniger als für DNA:RNA-Hybride. In speziellen Ausführungsformen umfassen beispielhaft stringente Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride eine Hybridisierung bei einer Ionenstärke von 6X SSC (0,9 M Na⁺) bei einer Temperatur zwischen ungefähr 20°C und ungefähr 35°C (zum Beispiel weniger stringente Bedingungen), bevorzugter zwischen ungefähr 28°C und ungefähr 40°C (zum Beispiel stringentere Bedingungen) und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 35°C und ungefähr 45°C (noch stringentere Bedingungen). In speziellen Ausführungsformen umfassen stringente Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride eine Hybridisierung bei einer Ionenstärke von 6X SSC (0,9 M Na⁺) bei einer Temperatur zwischen ungefähr 30 °C und ungefähr 45 °C, bevorzugter zwischen ungefähr 38 °C und ungefähr 50 °C und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 45 °C und ungefähr 55 °C. Diese Werte basieren auf Berechnungen einer Schmelztemperatur für Moleküle, die größer als ungefähr 100 Nukleotide sind, 0 % Formamid und einem G + C-Gehalt von ungefähr 40 %. Alternativ dazu kann T_m empirisch berechnet werden, wie in Sambrook et al., s.o., Seiten 9.31 bis 9.62 ausgeführt ist.
Der Verweis auf eine „Hybridisierung mit niedriger Stringenz" (und Waschbedingungen) bezieht sich auf Bedingungen, die die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen erlauben, die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens ungefähr 40 % aufweisen (das heißt Bedingungen, die ungefähr 60 % oder weniger fehlende Übereinstimmung von Nukleotiden erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung der Formeln in Meinkoth et al., ebd.).
Der Verweis auf „eine Hybridisierung mit mäßiger Stringenz" (und Waschbedingungen) bezieht sich auf Bedingungen, die die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen erlauben, die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens 60 % aufweisen (das heißt Bedingungen, die ungefähr 40 % oder weniger fehlende Übereinstimmung von Nukleotiden erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung der Formeln in Meinkoth et al., ebd.).
Der Verweis auf „eine Hybridisierung mit hoher Stringenz" (und Waschbedingungen) bezieht sich auf Bedingungen, die die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen erlauben, die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens 80 % aufweisen (das heißt Bedingungen, die ungefähr 20 % oder weniger fehlende Übereinstimmung erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung der Formeln in Meinkoth et al., ebd.).
Der Verweis auf „eine Hybridisierung mit sehr hoher Stringenz" (und Waschbedingungen) bezieht sich auf Bedingungen, die die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen erlauben, die eine Nukleinsäuresequenzidentität mit dem als Sonde in der Hybridisierungsreaktion zu verwendenden Nukleinsäuremolekül von mindestens 90 % aufweisen (das heißt Bedingungen, die ungefähr 10 % oder weniger fehlende Übereinstimmung von Nukleotiden erlauben, entsprechend der Bestimmung unter Verwendung der Formeln in Meinkoth et al., ebd.).
Der Begriff „modulieren" oder Ableitungen eines solchen Begriffs bedeuten, den Zustand von einem zu einem anderen zu ändern, zu regulieren oder zu variieren, und umfasst eine messbare oder beobachtbare Zunahme oder Abnahme in einem beliebigen messbaren Merkmal und/oder eine Änderung von einem Merkmal zu einem anderen unterschiedlichen Merkmal.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglicher Träger" bezieht sich auf pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger, Formulierungen und/oder pharmazeutisch verträgliche Abgabevehikel, die zur Verwendung in der Verabreichung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an eine geeignete Stelle in vitro, ex vivo oder in vivo geeignet sind. Pharmazeutisch verträgliche Träger können es den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen, dass sie in jeder zur Verwendung geeigneten Form hergestellt/bereitgestellt werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf eine Flüssigkeit, ein Aerosol, eine Kapsel, eine Tablette, eine Pille, ein Puder, ein Gel und ein Granulat. Einige pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen Zellen, Membranen, Lipidformulierungen (einschließlich Flüssigkeiten, die nach Verabreichung an einen Patienten in situ einen Feststoff oder ein Gel bilden), Antikörperformulierungen, Lebensmittelprodukte (zum Beispiel jedes essbare Produkt oder Präparat) und rekombinante Viren. Bevorzugte Träger sind ebenfalls biologisch abbaubar (das heißt bioerodierbar).
Ein „pharmazeutisch verträglicher Arzneimittelträger" umfasst Arzneimittelträger oder Formulierungen, die transportieren oder den Transport unterstützen, aber nicht spezifisch eine Zusammensetzung auf eine Zelle lenken (sie werden hier ebenfalls als nicht zielende Träger bezeichnet). Beispiele pharmazeutisch verträglicher Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Wasser, Phosphat-gepufferte Salzlösung, Ringers-Lösung, Dextroselösung, Serum-enthaltende Lösungen, Hank's-Lösung, andere wässrige physiologisch ausgewogene Lösungen, Öle, Ester und Glykole. Wässrige Träger können geeignete Hilfssubstanzen enthalten, die zur Annäherung der physiologischen Bedingungen des Empfängers, zum Beispiel durch Erhöhung der chemischen Stabilität und Isotonizität, erforderlich sind. Geeignete Hilfssubstanzen umfassen zum Beispiel Natriumacetat, Natriumchlorid, Natriumlactat, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und andere Substanzen, die zur Herstellung von Phosphatpuffer, Trispuffer und Bicarbonatpuffer verwendet werden. Hilfssubstanzen können ebenfalls Konservierungsmittel, wie zum Beispiel Thimerosal, oder o-Cresol, Formalin und Benzolalkohol enthalten.
Ein „Vehikel zur kontrollierten Freisetzung" ist eine Art eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, der zur Freisetzung einer Zusammensetzung oder Proteins der vorliegenden Erfindung auf kontrollierte Weise in einen Patienten oder Kultur in der Lage ist. Eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung umfasst eine Verbindung der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel ein CAF-Protein (einschließlich eines Homologen), einen Antikörper, ein Nukleinsäuremolekül oder eine mimetische Verbindung) in einem Vehikel zur kontrollierten Freisetzung. Geeignete Vehikel zur kontrollierten Freisetzung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf biokompatible Polymere, polymere Matrices, Kapseln, Mikrokapseln, Mikropartikel, Bolus-Präparationen, osmotische Pumpen, Diffusionsvorrichtungen, Liposomen, Liposphären, und transdermale Abgabesysteme.
Ein „pharmazeutisch verträgliches Abgabevehikel" ist ein pharmazeutisch verträglicher Träger, der zur Abgabe einer Zusammensetzung oder eines Proteins der vorliegenden Erfindung an eine Zielstelle in der Lage ist. Ein pharmazeutisch verträgliches Abgabevehikel ist vorzugsweise zum Zielen (das heißt, Lenken, selektiv Zuführen) der Zusammensetzung auf die Zielstelle in der Lage. Eine „Zielstelle" bezieht sich auf eine Stelle in einem Patienten, an welcher die Abgabe der Zusammensetzung gewünscht ist. Eine Zielstelle kann jede Zelle oder Gewebe sein, auf die durch direkte Injektion oder durch Abgabe unter Verwendung künstlicher und natürlicher Lipid-enthaltender Abgabevehikel (zum Beispiel Liposomen), Antikörper, viraler Vektoren und anderer Abgabevehikel, einschließlich von Ribozymen, gezielt wird. Natürliche Lipid-enthaltende Abgabevehikel umfassen Liposomen und Micellen. Ist die Verbin dung ein Protein (zum Beispiel ein CAF-Protein) umfassen geeignete Abgabevehikel, Antikörper, Liposomen und Zellen (zum Beispiel eine das Protein exprimierende rekombinante Zelle), sind aber nicht beschränkt darauf. Ist die Verbindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassen geeignete Abgabevehikel Liposomen, virale Vektoren, Goldteilchen, Poly-L-Lysin/DNA-Molekülkonjugate, künstliche Chromosomen oder andere Abgabevehikel, einschließlich von Ribozymen, sind aber nicht beschränkt darauf.
Der Begriff „Liposom" bezieht sich auf ein Abgabevehikel, das eine Lipidzusammensetzung umfasst, die zur Abgabe eines Nukleinsäuremoleküls oder Proteins an eine spezielle oder ausgewählte Stelle in einem Patienten in der Lage ist. Ein Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die zur Fusion mit der Plasmamembran der Zielzelle zur Abgabe des Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle in der Lage ist. Geeignete Liposomen zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen jedes Liposom. Bevorzugte Liposomen der vorliegenden Erfindung umfassen solche Lipsomen, die im Allgemeinen beispielsweise in Genabgabeverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Bevorzugter umfassen Liposomen Liposomen mit einer polykationischen Lipidzusammensetzung und/oder Liposomen mit einem Cholesteringerüst, das an Polyethylenglykool konjugiert ist. Die Komplexierung eines Liposoms mit einem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von Standardverfahren aus der Stand der Technik erreicht werden.
Der Begriff „viraler Vektor" bezieht sich auf ein in der vorliegenden Erfindung verwendbares isoliertes Nukleinsäuremolekül, in dem die Nukleinsäuremoleküle in eine virale Hülle gepackt sind, die den Eintritt der DNA in eine Zelle erlaubt. Es kann eine Anzahl viraler Vektoren verwendet werden, umfassend aber nicht beschränkt auf solche, die auf Alphaviren, Pockeviren, Adenoviren, Herpesviren, Lentiviren, Adenoassozierten Viren und Retroviren basieren.
Der Begriff „Verabreichen" bedeutet jedes Verfahren, um ein Versuchstier mit einer Substanz (zum Beispiel Einführen einer Substanz in ein Versuchstier) zu versehen, einschließlich der in vivo oder ex vivo Verabreichung. Verfahren zur in vivo Verabreichung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf intravenöse Verabreichung, intrape ritoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, intrakoronare Verabreichung, intraarterielle Verabreichung (zum Beispiel in eine Arteria carotis), subkutane Verabreichung, transdermale Zufuhr, intratracheale Verabreichung, subkutane Verabreichung, intraartikuläre Verabreichung, intraventrikuläre Verabreichung, Inhalation (zum Beispiel Aerosol), intracerebrale, nasale, orale, intraokulare, pulmonale Verabreichung, Imprägnierung eines Katheters, durch ein Zäpfchen und durch direkte Injektion in ein Gewebe. Ex vivo bezieht sich auf die Durchführung eines Teils des regulatorischen Schritts außerhalb des Patienten, wie zum Beispiel durch Transfektion einer Population von Zellen, die von einem Patienten entfernt wurden, mit einem rekombinanten Molekül, umfassend eine ein erfindungsgemäßes CAF-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, unter solchen Bedingungen, dass das rekombinante Molekül nachfolgend durch die transfizierte Zelle exprimiert wird, und das Rückführen der transfizierten Zelle an den Patienten. Verfahren zur Ausführung einer derartigen Transfektion umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Transfektion, virale Infektion, Elektroporation, Lipofektion, bakteriellen Transfer, Sphäroblastenfusion und Adsorption. Ex vivo Verfahren sind besonders geeignet, wenn die Zielzelle leicht aus dem Patienten entfernt und zurückgeführt werden kann.
Der Begriff „therapeutischer Nutzen" bezieht sich nicht notwendigerweise auf eine Heilung einer speziellen Erkrankung oder eines Zustands, sondern er umfasst vielmehr vorzugsweise ein Ergebnis, das eine Linderung der Erkrankung oder des Zustands, eine Beseitigung der Erkrankung oder des Zustands, eine Verringerung eines mit der Erkrankung oder dem Zustand assoziierten Symptoms, eines Prävention oder Linderung einer sekundären Erkrankung oder eines Zustands, die aus dem Auftreten einer primären Erkrankung oder eines Zustands resultieren (zum Beispiel aus einem primären Krebs resultierender metastatischer Krebs), und/oder eine Prävention der Erkrankung oder des Zustands umfassen können.
Der Begriff „Schutz" in Bezug auf eine Erkrankung oder einen Zustand bezieht sich auf die Verringerung von Symptomen der Erkrankung, der Verringerung des Auftretens der Erkrankung und/oder die Verringerung der Schwere der Erkrankung. Das Schützen eines Patienten oder Versuchstiers kann sich auf die Fähigkeit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei Verabreichung an einen Patienten darauf beziehen, dass das Auftreten einer Erkrankung verhindert wird und/oder Symptome der Erkrankung, Anzeichen oder Ursachen geheilt oder gelindert werden. Somit umfasst der Schutz eines Patienten vor einer Krankheit sowohl das Verhindern des Auftretens der Erkrankung (prophylaktische Behandlung) als auch die Behandlung eines Patienten, der eine Erkrankung aufweist (therapeutische Behandlung).
Der Begriff „Prävention" bedeutet, dass das Fortschreiten der Erkrankung reduziert und/oder eliminiert wird, oder dass der Beginn der Erkrankung eliminiert wird (prophylaktische Behandlung).
Der Begriff „Behandlung" bedeutet, dass der Beginn der Symptome (einschließlich Schmerz) der Erkrankung und/oder pathogene Ursprung der Erkrankung verzögert, reduziert oder vollständig verhindert wird, oder sofern vorhanden die Symptome verbessert oder vollständig eliminiert werden. Zum Beispiel behandelt die CAF-Zusammensetzung Krebs nicht nur durch Unterdrückung der Symptome der Erkrankung in Menschen und anderen Säugern, sondern ebenfalls durch die Wirkung als prophylaktisches Mittel, um dem Vorhandensein der Erkrankung in dem Empfänger entgegenzuwirken.
Der Begriff „Erkrankung" bezieht sich auf jede Abweichung von der normalen Gesundheit eines Säugers und umfasst einen Zustand, wenn Krankheitssymptome vorhanden sind, sowie Zustände, bei denen eine Abweichung (zum Beispiel eine Infektion, Genmutation, genetischer Defekt, etc.) aufgetreten ist, jedoch noch keine Symptome augenscheinlich geworden sind.
Der Begriff „ein" oder „eine" Einheit bezieht sich auf eine oder mehrere dieser Einheiten. Als solches können die Begriffe „ein" (oder „eine"), „eine oder mehrere" und "mindestens eine" hier untereinander austauschbar verwendet werden.
Die Begriffe „umfassend", „einschließlich", und „aufweisend" können untereinander austauschbar verwendet werden.
Beschreibung der Erfindung
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF)-Protein. Der Bezug auf ein isoliertes CAF-Protein umfasst Proteine mit vollständiger Länge, abgeschnittene Proteine (das heißt Fragmente von Proteinen mit vollständiger Länge), Fusionsproteine oder jedes Homologe eines derartigen Proteins. CAF-Homologe sind vorstehend definiert worden. Ein CAF-Homolog weist vorzugsweise CAF-biologische Aktivität auf, wie ebenfalls vorstehend definiert ist. Insbesondere weist ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine biologische Aktivität auf, die eine Fähigkeit zur Hochregulation (Zunahme, Stimulation, Induktion, Erhöhung) der Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder Interleukin-6 (IL-6) und/oder eine Fähigkeit zur Herunterregulation (Abnahme, Inhibierung, Verhinderung, Unterdrückung) der Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) einschließt. Eine derartige biologische Aktivität kann durch jedes geeignete Verfahren zur Messung der Cytokinaktivität aus dem Stand der Technik, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Immunoassays (einschließlich enzymgekoppelter Immunadsorptionsassays, oder ELISA), Radioimmunassays und RNA-Assays (siehe Beispiele), gemessen werden. Eine biologische Aktivität eines CAF-Proteins kann umfassen, ist aber nicht beschränkt auf: eine Fähigkeit des CAF zur Bindung an einen Rezeptor oder ein anderes Protein, an DNA, eine Kohlenwasserstoffeinheit oder eine Lipideinheit zu binden, die zu den vorstehend identifizierten biologischen Aktivitäten führt oder dazu beiträgt. Verfahren zur Messung der Fähigkeit eines Proteins zur Bindung an eine andere Einheit, liegen innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns. Weiterhin liegt es innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns unter Verwendung der hier bereitgestellten Lehre, Modifikationen in der Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz des Wildtyp-CAF (zum Beispiel Aminosäure SEQ ID Nr:1 oder 6) durchzuführen und Homologe mit derartigen Modifikationen auf eine oder mehrere biologische Aktivitäten von CAF zu testen. Zum Beispiel sind Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit von CAF zur Induktion oder Inhibierung der Cytokinexpression in dem die Beispiele betreffenden Abschnitt beschrieben.
Die Bezugnahme auf ein isoliertes CAF-Protein kann ein CAF-Protein, das im Wesentlichen aus einer natürlichen Quelle gereinigt wurde (zum Beispiel ein erfindungsgemäßes hyperimmunes Ei), rekombinant hergestellten CAF und/oder synthetisch hergestellten CAF umfassen. Ein besonderes bevorzugtes CAF-Protein der vorlie genden Erfindung umfasst eine aus SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 ausgewählte Aminosäuresequenz. SEQ ID Nr:1 erstreckt sich über die Aminosäuren 1–30 der SEQ ID Nr:6 und ist ein N-terminales Fragment von SEQ ID Nr:6. Es wird angenommen, dass SEQ ID Nr:6 eine Aminosäuresequenz eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung mit vollständiger Länge ist, das aus einem hyperimmunen Ei gereinigt wurde.
In einer Ausführungsform umfasst ein CAF-Protein Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der SEQ IDNr:1 oder SEQ ID Nr:5 umfassen (das heißt 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste, die mit 9 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der SEQ ID Nr:1 oder SEQ ID Nr:6 zu 100 % identisch sind). Ein derartiges Protein kann als ein Homologes eines Proteins bezeichnet werden, das die SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 (zum Beispiel ein CAF-Homolog) umfasst, jedoch ebenfalls Proteine umfasst, die die SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 umfassen (zum Beispiel natürlich vorkommende CAF-Proteine). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Homologes eines CAF-Proteins eine Aminosäuresequenz, die mindestens 12, bevorzugter mindestens ungefähr 15 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 20 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein CAF-Homolog eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 30, bevorzugter mindestens ungefähr 35 und bevorzugter mindestens ungefähr 40 und bevorzugter mindestens ungefähr 45 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 50 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 55 und besonderes bevorzugt mindestens ungefähr 60 und bevorzugter mindestens ungefähr 65 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der SEQ ID Nr:6 umfasst.
Ein CAF-Proteinhomolog kann Proteine umfassen, die durch eine Nukleinsäuresequenz, umfassend mindestens 27 und bevorzugt mindestens 36 und bevorzugter mindestens 45 und bevorzugter mindestens 60 und bevorzugter mindestens 75 aufeinanderfolgende Nukleotide einer SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 kodierenden Nukleinsäuresequenz, kodiert wird. In einer weiteren Ausführungsform kann ein CAF-Homolog Proteine umfassen, die durch eine Nukleinsäuresequenz, umfassend mindestens 90 und bevorzugt mindestens 105 und bevorzugter mindestens 120 und bevorzugter mindestens 135 und bevorzugter mindestens 150 und bevorzugter mindestens 165 und bevorzugter mindestens 180 und bevorzugter mindestens 195 aufeinanderfolgende Nukleotide einer SEQ ID Nr:6 kodierenden Nukleinsäuresequenz, kodiert wird.
Ein CAF-Protein weist, wie vorstehend diskutiert wurde, vorzugsweise eine messbare CAF-biologische Aktivität auf (das heißt es weist eine biologische Aktivität auf). Jedoch wird in einigen Ausführungsformen eine CAF-Protein, einschließlich eines CAF-Homologen, für die Herstellung von Antikörpern oder die Entwicklung von Oligonukleotiden verwendet, die zur Identifizierung von CAF und CAF-verwandten Proteinen (zum Beispiel zum Zwecke des Screenings/Auswahl von hyperimmunen Ei-Produkten bezüglich CAF-angereichter Teile im Falle von Antikörpern oder Oligonukleotide, zur Klonierung der CAF-kodierenden Nukleinsäuresequenz (im Falle von Oligonukleotiden) und/oder zur Identifikation von Proteinen oder Nukleinsäuren, die an CAF binden, verwendbar sind. In diesen Ausführungsformen ist es nicht besonderes relevant, ob das CAF-Protein eine biologische Aktivität aufweist, ansonsten ist es nur im dem Maße relevant, dass ein für derartige Verfahren verwendbares CAF-Protein intrinsisch eine CAF-biologische Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform umfasst ein CAF-Protein (zum Beispiel ein CAF-Proteinhomologes) eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu ungefähr 65 % mit SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 20 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens 25 Aminosäuren von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist. Ein CAF-Protein umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % zu SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 15 Aminosäuren, bevorzugter über mindestens ungefähr 20 Aminosäuren und besonderes bevorzugt über mindestens ungefähr 25 Aminosäuren von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein CAF-Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu ungefähr 65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % z mit SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 30 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 35 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 40 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 45 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 50 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 55 Aminosäuren und besonderes bevorzugt über mindestens ungefähr 60 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 identisch ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein CAF-Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu ungefähr 60 % mit SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 66 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 67 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 68 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 69 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Ein CAF-Protein umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu ungefähr 65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % mit SEQ ID Nr:6 über mindestens 66 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 67 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 68 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 69 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Identität sind vorstehend beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein CAF-Protein, einschließlich eines CAF-Proteinhomologen, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die ausreichend ähnlich zu einer natürlichen CAF-Aminosäuresequenz ist, so dass eine das Homologe kodierende Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, unter Bedingungen mäßiger, hoher oder sehr hoher Stringenz (wie vorstehend beschrieben) an (das heißt mit) ein Nukleinsäuremolekül, das das natürliche CAF-Protein kodiert, zu hybridisieren (das heißt an das Komplement des Nukleinsäurestrangs, der die natürliche CAF-Aminosäuresequenz kodiert). Derartige Bedingungen sind vorstehend definiert. Ein Homolog eines CAF-Proteins ist vorzugsweise durch ein Nukleinsäuremolekül ko diert, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die unter Bedingungen mäßiger, hoher oder sehr hoher Stringez an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die ein Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr:1 oder SEQ ID Nr:6, kodiert. Ein Nukleinsäuresequenzkomplement einer Nukleinsäuresequenz, die ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, bezieht sich auf die Nukleinsäuresequenz des Nukleinsäurestrangs, der zu dem Strang, der CAF kodiert, komplementär ist. Es ist klar, dass eine doppelsträngige DNA, die eine gegebene Aminosäuresequenz kodiert, eine einzelsträngige DNA und deren komplementären Strang mit einer Sequenz, die zu der einzelsträngigen DNA das Komplement ist, umfasst. Als solches können die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung entweder doppelsträngig oder einzelsträngig sein und diejenigen Nukleinsäuremoleküle umfassen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr:1 und/oder SQ ID Nr:6 kodiert, und/oder mit dem Komplement der Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 kodiert, stabile Hybride bilden. Verfahren zum Ableiten einer komplementären Sequenz sind dem Fachmann bekannt. Es ist zu beachten, dass, da die Aminosäuresequenzierungs- und Nukleinsäuresequenzierungstechnologien nicht vollkommen fehlerfrei sind, die hier dargestellten Sequenzen höchstens scheinbare Sequenzen eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung darstellen.
CAF-Proteinhomologe können das Ergebnis einer natürlichen allelen Variation oder natürlichen Mutation sein. CAF-Proteinhomologe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls unter Verwendung von Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, umfassend aber nicht beschränkt auf direkte Modifikationen an dem Protein oder Modifikationen an dem das Protein kodierenden Gen unter Verwendung von zum Beispiel klassischen oder rekombinanten DNA-Techniken zum Ausführen von zufälliger oder gezielter Mutagenese, hergestellt werden. Eine natürlich vorkommende allele Variante einer CAF-kodierenden Nukleinsäure ist ein Gen, das im Wesentlichen an demselben Locus (oder Loci) in dem Genom vorkommt, wie das Gen, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 kodiert, aber das aufgrund natürlicher Variationen, die zum Beispiel durch Mutation oder Rekombination verursacht sind, eine ähnliche jedoch keine identische Sequenz aufweist. Natürliche allele Varianten kodieren typischerweise Proteine mit einer Aktivität, die im Vergleich zu derjenigen des Proteins, das durch das Gen, mit dem sie verglichen werden, kodiert wird, ähnlich ist. Eine Klasse aller Varianten kann dasselbe Protein kodieren, jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen aufweisen. Allele Varianten können ebenfalls Änderungen in den 5'- oder 3'-nichttranslatierten Regionen des Gens (zum Beispiel regulatorische Kontrollregionen) umfassen. Allele Varianten sind dem Fachmann gut bekannt und man würde erwarten, sie innerhalb einer gegebenen bakteriellen Spezies zu finden, da das Genom haploid ist, und/oder unter einer Gruppe von zwei oder mehreren bakteriellen Spezies.
CAF-Proteine umfassen ebenfalls Expressionsprodukte von Genfusionen (zum Beispiel diejenigen, die zur Überexpression löslicher aktiver Formen des rekombinanten Proteins verwendet werden), von mutagenisierten Genen (wie zum Beispiel Gene mit Codonmodifikationen zur Steigerung der Gentranskription und -translation) und von abgeschnittenen Genen (wie zum Beispiel Gene mit Domänen, die zur Erzeugung biologisch aktiver Fragmente unter Untereinheiten des Proteins mit voller Länge entfernt wurden). Es wird festgestellt, dass CAF-Proteine und Proteinhomologe der vorliegenden Erfindung Proteine umfassen, die keine CAF-Aktivität aufweisen. Derartige Proteine sind zum Beispiel für die Herstellung von Antikörpern verwendbar.
Ein isoliertes CAF-Protein der vorliegenden Erfindung, umfassend Proteine von voller Länge, abgeschnittene Proteine, andere Homologe und Fusionsproteine können auf unkomplizierte Art identifiziert werden: (1) durch die Fähigkeit des Proteins, die Expression von TNFα, IL-1β und/oder IL-6 hochzuregulieren und/oder TGFβ herunterzuregulieren, wie zum Beispiel in den Beispielen erläutert wird, (2) durch die biochemischen und strukturellen Eigenschaften des Proteins (zum Beispiel Molekulargewicht, Primärstruktur, Stabilitätscharakteristika), (3) durch die selektive Bbindung des Proteins an einen Antikörper gegen ein CAF-Protein, und/oder (4) durch die Homologie des Proteins mit anderen CAF-Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen, wie zum Beispiel mit einer CAF-Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz von anderen Quellen als einem hyperimmunen Ei. Die minimale Größe eines Proteins und/oder Homologen der vorliegenden Erfindung ist eine Größe, die für eine CAF-biologische Aktivität ausreicht, oder wenn das Protein keine derartige Aktivität aufweisen muss, ist sie eine Größe, die ausreicht, um für einen anderen mit einem CAF-Protein der vorliegenden Erfindung assoziierten Zweck auszureichen, wie zum Beispiel für die Herstellung von Antikörpern, die an natürlich vorkommendes CAF-Protein binden. Somit ist die minimale Größe eines CAF-Proteins oder Homologen der vorliegenden Erfindung eine Größe, die zur Bildung von mindestens einem Epitop, das durch einen Antikörper erkannt werden kann, ausreicht und sie beträgt typischerweise mindestens 8 bis 30 Aminosäuren in der Länge (einschließlich jeder Länge zwischen 8 und 30 in Schritten von einer Aminosäure), wobei bevorzugte Größen davon abhängen, ob Teile von voller Länge, multivalente oder funktionale Teile derartiger Proteine erwünscht sind. Es gibt keine andere Einschränkung als eine praktische Einschränkung für die maximale Größe eines derartigen Proteins, wobei das Protein einen Teil eines CAF-Proteins (einschließlich eines CAF-Homologen) oder eines CAF von voller Länge umfassen kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Fusionsprotein, das eine CAF-enthaltende Domäne (einschließlich eines Homologen eines CAF-Proteins) umfasst, die an einem oder mehreren Fusionssegmenten gebunden ist. Geeignete Fusionssegmente zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Segmente, die die Stabilität des Proteins erhöhen, eine weitere wünschenswerte biologische Aktivität bereitstellen (zum Beispiel ein Cytokin), und/oder die Reinigung eines CAF-Proteins (zum Beispiel durch Affinitätschromatographie) unterstützen können. Ein geeignetes Fusionssegment kann eine Domäne von beliebiger Größe sein, die die gewünschte Funktion aufweist (zum Beispiel, die eine erhöhte Stabilität, Löslichkeit, Wirkung oder biologische Aktivität verleiht, und/oder die die Reinigung eines Proteins vereinfacht). Fusionssegmente können an Amino- und/oder Carboxylenden der CAF-enthaltenden Domäne des Proteins gebunden werden und sie können bezüglich Spaltung anfällig sein, um eine einfache Rückgewinnung eines CAF-Proteins zu ermöglichen. Fusionsproteine werden vorzugsweise durch Kultivierung einer rekombinanten Zelle hergestellt, die mit einem Fusionsnukleinsäuremolekül transfiziert ist, das ein Protein kodiert, umfassend das entweder an das Carboxyl- und/oder Aminoende einer CAF-enthaltenden Domäne gebundene Fusionssegment.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls eine mimetische Verbindung eines CAF-Proteins. Der Begriff „mimetische Verbindung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Peptid- oder Nicht-Peptidverbindung, die in der Lage ist, die biologische Wirkung eines natürlich vorkommenden Peptids nachzuahmen, weil oftmals die mimetische Verbindung eine Grundstruktur aufweist, die die Grundstruktur des natürlich vorkommenden Peptids nachahmt, und/oder die wichtigsten biologischen Eigenschaften des natürlich vorkommenden Peptids aufweist. Mimetische Verbindungen können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Peptide, die wesentliche Modifikationen ausgehend von dem Prototyp aufweisen, wie zum Beispiel keine Seitenkettenähnlichkeit mit dem natürlich vorkommenden Peptid (derartige Modifikationen können zum Beispiel die Anfälligkeit gegen Abbau verringern), antiidiotype und/oder katalytische Antikörper, oder Fragmente davon, nicht proteinhaltige Teile eines isolierten Proteins (zum Beispiel Kohlenwasserstoffstrukturen), oder synthetische oder natürliche organische Moleküle, einschließlich von zum Beispiel Nukleinsäuren und Arzneimitteln, die durch kombinatorische Chemie identifiziert worden sind.
Derartige mimetische Verbindungen können konstruiert, ausgewählt und/oder anderweitig unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden. Verschiedene Verfahren des Arzneimittelsdesigns, die zur Konstruktion von mimetischen Verbindungen oder anderen therapeutischen Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, werden in Maulik et al., 1997, Molecular Bitechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc. offenbart. Eine CAF-mimetische Verbindung kann zum Beispiel von Molekülmannigfaltigkeitsstrategien (eine Kombination verwandter Strategien, die die schnelle Konstruktion großer chemisch verschiedener Molekülbibliotheken gestattet), Bibliotheken natürlicher oder synthetischer Verbindungen, insbesondere von chemischen oder kombinatorischen Bibliotheken (das heißt Bibliotheken von Verbindungen, die sich in der Sequenz oder Größe unterscheiden, die aber ähnliche Baueinheiten aufweisen) oder durch rationales gerichtetes oder zufälliges Arzneimitteldesign erhalten werden. Siehe zum Beispiel Maulik et al., s.o.
Bei Molekülmannigfaltigkeitsstrategien werden Bibliotheken großer Verbindungen, zum Beispiel von Peptiden, Oligonukleotiden, Kohlenwasserstoffen und/oder synthetischen organischen Molekülen, unter Verwendung biologischer, enzymatischer und/oder chemischer Methoden synthetisiert. Die zur Entwicklung einer Molekülmannigfaltigkeitsstrategie entscheidenden Parameter umfassen die Mannigfaltigkeit einer Untereinheit, Molekulargröße und Mannigfaltigkeit der Bibliothek. Das allgemeine Ziel des Screenings derartiger Bibliotheken besteht darin, die sequentielle Anwendung der kombinatorischen Auswahl zum Erhalten von Liganden mit hoher Affinität für ein gewünschtes Ziel zu verwenden und dann die Leitmoleküle entweder durch zufällige oder gerichtete Designstrategien zu optimieren. Verfahren der Molekülmannigfaltigkeit sind ausführlich in Maulik, et al., ebd. beschrieben.
Maulik et al. offenbaren zum Beispiel ebenfalls Verfahren eines gerichteten Designs, bei denen der Anwender das Verfahren zur Erzeugung neuer Moleküle aus einer Fragmentbibliothek von geeignet ausgewählten Fragmenten steuert; Verfahren eines zufälligen Designs, bei denen der Anwender einen genetischen oder anderen Algorithmus zur zufälligen Mutation von Fragmenten und deren Kombinationen verwendet, während gleichzeitig ein Auswahlkriterium zur Bewertung der Eignung der Kandidatliganden angewandt wird; und ein Gitter-basiertes Verfahren, bei dem der Anwender die Wechselwirkungsenergie zwischen dreidimensionalen Rezeptorstrukturen und kleinen Fragmentsonden, gefolgt von dem Aneinanderbinden vorteilhafter Sondenstellen, berechnet.
CAF-Proteine können erfindungsgemäß von jedem Tier und insbesondere von jedem Tier der Wirbeltierklassen der Säuger oder Vögel abgeleitet werden. CAF-Proteine werden vorzugsweise von einem Ei-erzeugenden Tier aus der Wirbeltierklasse der Vögel, abgeleitet. Bevorzugte CAF-Proteine umfassen isolierte CAF-Proteine von hyperimmunisierten Hühnern, Truthähnen oder Enten. Ein besonders bevorzugtes isoliertes CAF-Protein ist ein aus hyperimmunisierten Hühnereiern stammendes CAF-Protein.
Ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kann, wie vorstehend erörtert, durch jedes für die Herstellung von Proteinen oder Polypeptiden geeignete Verfahren hergestellt werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung ist durch chemische Syntheseverfahren. Derartige Verfahren umfassen zum Beispiel gut bekannte chemische Verfahren, wie zum Beispiel eine Lösungs- oder Festphasenpeptidsynthese oder einer halbe Synthese in Lösung, beginnend mit Proteinfragmenten, die über herkömmliche Lösungsverfahren gekoppelt sind. Derartige Verfahren sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Texten und Artikeln auf diesem Gebiet, wie zum Beispiel: Merrifield, 1997, Methods Enzymol. 289:3–13; Wade et al., 1993, Australas Biotechnol. 3(6):332–336; Wong et al., 1991, Expertentia 47(11–12);1123–1129; Carey et al., 1991, Ciba Found Symp. 158:187–203; Plaue et al., 1990, Biologicals 18(3):147–157; Bodanszky, 1985, Int. J. Pept. Protein Res. 25(5):449–474; oder H. Dugas und C. Penny, Bioorganic Chemistry, (1981) auf den Seiten 54–92 gefunden werden. Peptide können zum Beispiel durch eine Festphasenmethodologie unter Verwendung einer handelsüblichen Peptidsynthesevorrichtung und Synthesezyklen, die von dem Hersteller bereitgestellt werden, synthetisiert werden. Der Fachmann erkennt, dass die Festphasensynthese ebenfalls unter Verwendung der FMOC-Strategie und einer TFA/Spülmittelspaltungsmischung ausgeführt werden könnte.
Sind größere Mengen eines CAF-Proteins erwünscht, kann das Protein unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnologie hergestellt werden, obwohl für Proteine dieser kleineren Größe (das heißt Peptide) die Peptidsynthese im Allgemeinen bevorzugt werden kann. Ein Protein kann rekombinant durch Kultivierung einer Zelle, die zur Expression des Proteins in der Lage ist (das heißt durch Exprimierung eines das Protein kodierenden rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wie nachstehend ausführlich beschrieben ist), unter Bedingungen, die die Erzeugung des Proteins bewirken, und durch Rückgewinnung des Proteins hergestellt werden. Wirksame Kulturbedingungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf wirksame Medien, Bioreaktor-, Temperatur-, pH-Wert- und Sauerstoffbedingungen, die die Proteinerzeugung erlauben. Ein wirksames Medium bezieht sich auf jedes Medium, in dem eine Zelle zur Erzeugung eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung kultiviert wird. Ein derartiges Medium umfasst typischerweise ein wässriges Medium mit assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff und Phosphatquellen und geeigneten Salzen, Mineralien, Metallen und anderen Nährstoffen, wie zum Beispiel Vitaminen. Rekombinante Zellen (das heißt Zellen, die ein CAF-Protein-kodierendes Nukleinsäuremolekül exprimieren) können in herkömmlichen Fermentationsbioreaktoren, Schüttelkolben, Teströhrchen, Mikrotiterschalen und Petrischalen kultiviert werden. Die Kultivierung kann bei einer für eine rekombinante Zelle geeigneten Temperatur, pH-Wert und Sauerstoffgehalt ausgeführt werden. Derartige Kultivierungsbedingungen sind im Rahmen der Fachkenntnis eines Durchschnittsfachmanns. Derartige Techniken sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und werden zum Beispiel in Sambrook et al., 1988, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York oder Current Protocols in Molecular Biology (1989) und Ergänzungsbänden beschrieben.
In Abhängigkeit von dem für die Erzeugung verwendeten Vektor und Wirtssystem können die resultierenden rekombinanten CAF-Proteine der vorliegenden Erfindung entweder innerhalb der rekombinanten Zelle bleiben, in das Kulturmedium ausgeschieden werden, in einen Raum zwischen zwei Zellmembranen, wie zum Beispiel der periplasmatische Raum in E. coli, ausgeschieden werden, oder auf der äußeren Oberfläche einer Zelle oder viralen Membran zurückbehalten werden. Der Ausdruck „Rückgewinnung des Proteins" bezieht sich auf das Sammeln des das Protein enthaltenden gesamten Kulturmediums und muss nicht zusätzliche Schritte der Trennung und Reinigung beinhalten. CAF-Proteine der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung einer Vielzahl von Standardreinigungstechniken, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Filtration, Elektrophorese, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Concanavalin A-Chromatographie, Chromatofokussierung und differentielle Solubilisierung gereinigt werden. Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer „im Wesentlichen reinen" Form gewonnen. Der Begriff „im Wesentlichen rein" beizieht sich, wie er hier verwendet wird, auf eine Reinheit, die die wirksame Verwendung des Proteins als Biokatalysator, anderes Reagenz oder zur Verabreichung an ein Versuchstier gestattet. Zum Beispiel wird angenommen, dass eine CAF-umfassende wasserlösliche Fraktion, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, im Wesentlichen rein ist und zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung aus einer geeigneten Quelle hochgereinigt werden, umfassend aber nicht beschränkt auf das Ei eines Vogels, der mit einem oder mehreren Immunogenen und insbesondere bakteriellen Antigenen oder deren synthetischen Äquivalenten hyperimmunisiert worden ist. Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass der Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung in hyperimmunen Eiern in supranormalen Gehalten vorhanden ist. Der hochgereinigte Ei-Cytokin-Aktivierungsfaktor kann aus dem gesamten Ei, Eigelb und Eiweiß isoliert werden. Der aus dem Eigelb hochgereinigte CAF zeigt eine höhere immunregulatorische Aktivität als der aus dem Eiweiß gereinigte CAF.
Das Reinigungsverfahren von CAF aus dem Ei in großem Maßstab verwendet typischerweise 40 kg hyperimmunes Eigelb (zum Beispiel PL100 oder S-100 Eigelb, das in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999 beschrieben ist) als Ausgangspunkt. Der CAF wird unter Verwendung der Technologien der Ultrafiltration, Q Sepharose Ionenaustauschchromatographie, Festphasenextraktion und zusätzliche Verfahren, wie sie nachstehend kurz und in dem Abschnitt der Beispiele ausführlich beschrieben sind, hoch gereinigt.
Der Cytokin-Aktivierungsfaktor kann aus dem gesamten Ei, Eigelb oder Eiweiß hoch gereinigt werden. Ein Beispiel eines bevorzugten Verfahrens zur hohen Reinigung ist wie folgt:

1. Eigelbdelipidisierung,
2. Eigelb 3.000 Dalton MW-Permeatherstellung,
3. Trennung der Fraktionen durch Ionen- oder Anionenaustauschchromatographie,
4. Festphasenextraktion,
5. Verteilungsextraktion der Festphasenextraktionsfraktion,
6. HPLC-Trennung und
7. Bioassay für die Cytokininduktionsaktivität.

Das Nachfolgende ist eine ausführlichere Beschreibung dieses Verfahrens:
Schritt 1: Der Cytokin-Aktivierungsfaktor kann aus dem gesamten Ei, Eigelb oder Eiweiß hoch gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung aus dem Eigelb gereinigt. Der Lipidteil wird aus dem gesamten Ei oder Eigelb durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, entfernt. Im Falle eines sprühgetrockneten Eigelbpulvers kann die Entfettung mit Lösungsmitteln (Propan, Butan oder Hexan oder mit binären Lösungsmitteln), superkritischem CO₂, Enzymen und dergleichen erreicht werden, und im Falle von flüssigem Eigelb kann die Entfettung durch das Caprylsäuretrennungsverfahren (CAPS), das von Lee (U.S. Patent Nr. 5,367,054) offenbart wurde, erreicht werden. Für Eiweiß ist keine Fettentfernung notwendig und daher kann die flüssige oder pulverisierte Form des Eiweißes entweder erhitzt oder direkt durch herkömmliche Verfahren und wie in den nachstehend aufgeführten Beispielen beschrieben ist, gelöst werden. Das gesamte Ei, Eigelb oder Eiweiß wird dann vorzugsweise in entweder flüssiger oder Pulverform verarbeitet und wird weiterhin zum Erhalten von wasserlöslichen Fraktionen verarbeitet. (Siehe Beispiele).
Schritt 2: Die resultierenden wasserlöslichen Fraktionen aus dem gesamten Ei, Eigelb oder Eiweiß werden einer Ultrafiltration unter Verwendung von Ultrafiltrationssystemen unterzogen, die mit einer Molekulargewichtsausschlussmembran von 30.000 Dalton ausgestattet sind. Das Ultrafiltrationsverfahren trennt Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als näherungsweise 3000 Dalton von denjenigen mit einem Molekulargewicht von weniger als näherungsweise 3000 Dalton. Es wird angemerkt, dass der Ausschluss von 3000 Dalton eine Näherung ist, da signifikant größere Proteine den Filter passieren können, wenn die Sekundärstruktur dies erlaubt (das heißt im Wesentlichen lineare Polypeptide/Proteine). Sobald gefiltert wurde, enthalten die resultierenden Ultrafiltrate Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als näherungsweise 3000 Dalton (oder größere im Wesentlichen lineare Polypeptide), die dann gefriergetrocknet, gewogen und zum Testen mit einem Bioassay und für weitere Trennung präpariert werden.
Schritte 3–7: Diese Schritte werden ausführlich in Beispiel 1 und den Figuren beschrieben und werden hier nicht wiederholt.
Der hochreine Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung weist die folgenden physikalischen/chemischen Merkmale (das heißt identifizierende Charakteristika) auf:

a. er weist mindestens eine biologisch aktive Untereinheit auf, die einen Ultrafiltrationsfilter mit einem Molekulargewichtsausschluss von 30.000 Dalton passiert,
b. er ist bei einer Temperatur bis zu mindestens 50 °C stabil (das heißt er weist eine messbare biologische Aktivität auf),
c. er ist bei einem pH-Wert von ungefähr 2 bis ungefähr 10 stabil (das heißt er weist eine messbare biologische Aktivität auf),
d. er ist wasserlöslich,
e. er ist nicht steroidal,
f. er ist negativ geladen,
g. er ist im Wesentlichen nicht polar und
h. er weist eine λ_max von ungefähr 254 nm auf.

Zusätzlich weist der hochreine Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung die folgenden biochemischen/funktionalen Merkmale auf:

a. er weist eine immunregulatorische Aktivität in einem Versuchstier auf,
b. er ist sowohl in dem Eiweiß als auf dem Eigelb von Vogeleiern vorhanden,
c. er weist bei Isolierung aus Eigelb typischerweise eine größere immunregulatorische Aktivität als bei Isolierung aus Eiweiß auf,
d. er induziert die Cytokinexpression in vitro und er induziert insbesondere die Expression des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und/oder Interleukin-6 (IL-6) in vitro und/oder
e. er reguliert die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β/TGFβ) herunter.

Außerdem kann das CAF-Protein der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von Zellen der Makrophagen- und/oder der Monozytenlinie aufweisen.
Das Molekulargewicht von 3000 Dalton wird aus der Isolierung und Reinigung der Zusammensetzung abgeleitet, wobei das Isolierungs- und Reinigungsverfahren eine Ultrafiltrationsmembran verwendet, die den Durchgang von molekularen Spezies mit mehr als 3000 Dalton durch den Filter nicht erlaubt. Es wurde anfangs angenommen, dass der hochgereinigte Cytokin-Aktivierungsfaktor nicht proteinhaltig und nicht steroidal ist, weil er eine kleine Größe aufweist und durch Enzyme, die Proteine abbauen, nicht abgebaut wird (basierend auf einem in vivo Assay, in dem das Protein nach oraler Verabreichung eine biologische Aktivität zeigte und daher Verdauungsenzymen ausgesetzt war). Überdies ist die Zusammensetzung oral aktiv. Ohne Bindung an eine Theorie nehmen die vorliegenden Erfinder an, dass die kleine stabile Form des hochgereinigten Cytokin-Aktivierungsfaktors (da er sich von den meisten Proteinen unterscheidet, die viel größer sind) seine Absorption von dem Verdauungstrakt erleichtert. Schließlich ist der hochgereinigte Cytokin-Aktivierungsfaktor hitzestabil, ein Merkmal, das bei den meisten Proteinen typischerweise nicht gefunden wird. Es ist jedoch bekannt, dass der hochgereinigte Cytokin-Aktivierungsfaktor tatsächlich ein Protein ist, das die vorstehend identifizierten Stabilitätsmerkmale aufweist. Eine derartige Entdeckung war überraschend und zeigt weiter die Vorteile des Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung, wobei er für einen Einschluß in Formulierungen, verarbeiteten Lebensmitteln und Impfstoffen, einschließlich oraler Impfstoffe und Formulierungen sehr geeignet ist.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Nukleinsäuremoleküle, die ein CAF-Protein kodieren. Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfasst ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die jedes der isolierten CAF-Proteine, einschließlich eine CAF-Homologen, wie vorstehend beschrieben, kodiert. Ein bevorzugtes CAF-Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 9 und bevorzugter mindestens 12 und bevorzugter mindestens ungefähr 15 und bevorzugter mindestens ungefähr 20 und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 umfasst. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein bevorzugtes CAF-Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 30 und bevorzugter mindestens ungefähr 35 und bevorzugter mindestens ungefähr 40 und bevorzugter mindestens ungefähr 45 und bevorzugter mindestens ungefähr 50 und bevorzugter mindestens ungefähr 55 und bevorzugter mindestens ungefähr 60 und bevorzugter mindestens ungefähr 65 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der SEQ ID Nr:6 umfasst.
In einer Ausführungsform umfassen derartige Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäuremoleküle, die unter Bedingungen mäßiger Stringenz und bevorzugter und Bedingungen hoher Stringenz und besonders bevorzugt unter Bedingungen sehr hoher Stringenz mit dem Komplement einer Nukleinsäuresequenz, die einen natürlich vorkommenden CAF kodiert (das heißt einschließlich natürlich vorkommender alleler Varianten, die einen CAF kodieren), hybridisiert. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen mäßiger, hoher oder sehr hoher Stringenz an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 kodiert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens zu ungefähr 65 % mit SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 20 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 25 Aminosäuren von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % mit SEQ ID Nr:1 und/oder SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 15 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 20 Aminosäuren und besonderes bevorzugt über mindestens ungefähr 25 Aminosäuren von SEQ ID Nr:1 und/oder beziehungsweise SEQ ID Nr:6 identisch ist. In einer Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens zu ungefähr 65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % mit SEQ ID Nr:6 über mindestens ungefähr 30 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 35 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 40 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 45 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 50 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 55 Aminosäuren und besonderes bevorzugt über mindestens ungefähr 60 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 identisch ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens zu ungefähr 60 % mit SEQ ID Nr:6 über mindestens 66 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 67 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 68 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 69 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, umfasst vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens zu ungefähr 65 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 70 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 75 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 80 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 85 % und bevorzugter mindestens zu ungefähr 90 % und besonders bevorzugt mindestens zu ungefähr 95 % mit SEQ ID Nr:6 über mindestens 66 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 67 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 68 Aminosäuren und bevorzugter über mindestens ungefähr 69 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 identisch ist. Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Identität sind vorstehend beschrieben.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül, das aus seinem natürlichen Milieu entfernt worden ist (das heißt, das menschlicher Manipulation unterzogen worden ist) und kann eine DNA, RNA oder Derivate von entweder einer DNA oder RNA, einschließlich cDNA, umfassen. Somit spiegelt der Begriff „isoliert" nicht das Ausmaß wider, bis zu dem das Nukleinsäuremolekül gereinigt worden ist. Isolierte CAF-Nukleinsäuremoleküle können zum Beispiel CAF-Gene, natürliche allele Varianten von CAF-Genen, CAF-kodierende Regionen oder Teile davon und CAF-kodierenden und/oder regulatorische Regionen, die durch Nukleotideinschübe modifiziert worden sind, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen in einer Art, so dass die Modifikationen nicht wesentlich die Fähigkeit des Nukleinsäuremoleküls zur Kodierung eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung stören, oder zur Bildung von stabilen Hybriden unter stringenten Bedingungen mit natürlichen Genisolaten stören, umfassen. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfasst nicht natürlich vorkommende Moleküle, die größer als ein CAF-Gen sind. Daher werden Chromosomen und Moleküle, die ein CAF-Gen zuzüglich von zusätzlichen flankierenden Sequenzen enthalten, von der vorliegenden Erfindung nicht umfasst. Die minimale Größe eines Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung ist eine Größe, die zur Kodierung eines Proteins mit CAF-biologischer Aktivität ausreicht, die zur Kodierung eines CAF-Proteins, umfassend mindestens ein Epitop, das an einen Antikörper bindet, ausreicht, oder zur Bildung einer Sonde oder eines Oligonukleotidprimers ausreicht, der zur Bildung eines stabilen Hybrids mit der komplementären Sequenz eines ein natürliches CAF-Protein kodierenden Nukleinsäuremoleküls in der Lage ist (zum Beispiel unter Bedingungen niedriger, mäßiger oder hoher Stringenz). Somit kann die Größe des Nukleinsäuremoleküls, das ein derartiges Protein kodiert, von der Nukleinsäurezusammensetzung und der prozentualen Homologie oder Identität zwischen dem Nukleinsäuremolekül und der komplementären Sequenz sowie von den Hybridisierungsbedingungen per se (zum Beispiel Temperatur, Salzkonzentration und Formamidkonzentration) abhängig sein. Die minimale Größe eines Nukleinsäuremoleküls, das als Oligonukleotidprimer oder als Sonde verwendet wird, beträgt typischerweise mindestens ungefähr 12 bis ungefähr 15 Nukleotide in der Länge, falls die Nukleinsäuremoleküle GC-reich sind, und mindestens ungefähr 15 bis 18 Basen in der Länge, falls sie AT-arm sind.
Ein isoliertes CAF-Nukleinsäuremolekül kann Degenerationen umfassen. Der Begriff Nukleotiddegenerationen, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf das Phänomen, dass eine Aminosäure durch verschiedene Nukleotidcodone kodiert werden kann. Daher kann die Nukleinsäuresequenz eines Nukleinsäuremoleküls, das ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, aufgrund von Degenerationen variieren. Es wird angemerkt, dass ein isoliertes CAF-Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise ein Protein mit CAF-Aktivität kodieren muss. Ein CAF-Nukleinsäuremolekül kann zum Beispiel ein abgeschnittenes, mutier tes oder inaktives Protein kodieren. Derartige Nukleinsäuremoleküle und die durch derartige Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine sind zum Beispiel zur Klonierung anderer CAF-kodierenden Nukleinsäuremoleküle, zum Nachweis des Vorhandenseins von CAF in einer Probe oder für andere Zwecke, wie zum Beispiel zur Antikörperherstellung verwendbar.
Der Bezug auf ein CAF-Gen umfasst erfindungsgemäß alle Nukleinsäuresequenzen, die mit einem natürlichen CAF-Gen (das heißt vom Wildtyp) verwandt sind, wie zum Beispiel regulatorische Regionen, die die Erzeugung des durch das Gen kodierten CAF-Proteins kontrollieren (wie zum Beispiel, aber nicht eingeschränkt auf Transkription, Translation oder Post-Translationskontrollregionen), sowie die kodierende Region selbst. In einer anderen Ausführungsform kann ein CAF-Gen eine natürlich vorkommende allele Variante sein, die eine ähnliche aber nicht identische Sequenz zu der Nukleinsäuresequenz, die ein gegebenes CAF-Protein kodiert, umfasst.
Ein isoliertes CAF-Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann aus seiner natürlichen Quelle isoliert oder unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnologie (zum Beispiel Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Amplifikation, Klonierung) oder chemischer Synthese hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuremolekülen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Da die CAF-Proteine relativ kleine Proteine sind, kann die das gewünschte Protein kodierende DNA-Sequenz zum Beispiel unter Verwendung von herkömmlichen, handelsüblichen DNA-Synthesevorrichtungen erzeugt werden. Alternativ dazu kann die das gewünschte Protein kodierende DNA ebenfalls unter Verwendung von Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Techniken oder anderen Klonierungstechniken ausgehend von der genomischen DNA vieler Spezies und insbesondere aus Eiern von Ei-erzeugenden Tieren erzeugt werden. Derartige Methodologien sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (Sambrook et al., s.o.)
Ein CAF-Nukleinsäuremolekülhomolog (das heißt eines, das ein CAF-Proteinhomolog kodiert) kann unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind (siehe zum Beispiel Sambrook et al.) hergestellt werden. Nukleinsäuremoleküle können zum Beispiel unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, einschließlich aber nicht beschränkt auf klassische Mutagenese und DNA-Rekombinationstechniken (zum Beispiel ortsspezifische Mutagenese, chemische Behandlung, Spaltung mittels Restriktionsenzymen, Ligation von Nukleinsäurefragmenten und/oder PCR-Amplifikation), oder Synthese von Oligonukleotidmischungen und Ligation der Mischgruppen zum „Aufbau" einer Mischung aus Nukleinsäuremolekülen und Kombinationen davon, modifiziert werden. Ein weiteres Verfahren zur Modifikation eines ein CAF-Protein kodierenden rekombinanten Nukleinsäuremoleküls besteht in dem Gen-Mischen (molekulares Züchten) (siehe zum Beispiel das U.S. Patent Nr. 5,605,793 für Stemmer, Minshull und Stemmer, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284–290; Stemmer, 1994, P.N.A.S. USA 91:10747–10751. Diese Technik kann zum wirksamen Einführen mehrfacher gleichzeitiger positiver Änderungen in der CAF-Proteinwirkung verwendet werden. Nukleinsäuremolekülhomologe können durch Hybridisierung mit einem CAF-Gen oder durch Screenen der Funktion eines durch eine Nukleinsäuremolekül kodierten Porteins (zum Beispiel die Fähigkeit zur Erhöhung der B-Zellenproliferation) ausgewählt werden.
Ein Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise ein Teil eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls. Ein derartiges rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfasst einen Expressionsvektor, der funktionsfähig an das Nukleinsäuremolekül gebunden ist. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle sind nachstehend ausführlich beschrieben. In dieser Ausführungsform weist das durch das Nukleinsäuremolekül kodierte CAF-Protein eine CAF-biologische Aktivität auf. Ein derartiges Nukleinsäuremolekül kann eine ein CAF-Proteinhomolog kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen und kann daher als Homolog einer Nukleinsäuresequenz, die einen natürlich vorkommenden CAF kodiert, bezeichnet werden (das heißt ein Nukleinsäuresequenzhomolog).
Daher umfasst eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das mindestens ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, das in einen beliebigen Nukleinsäurevektor (zum Beispiel ein rekombinanter Vektor) eingeschoben ist, der zum Klonieren, Sequenzieren und/oder anderweitigen Manipulieren des Nukleinsäuremoleküls, wie zum Beispiel exprimieren und/oder Abgeben des Nukleinsäuremoleküls an eine Wirtszelle zur Bildung einer rekombinanten Zelle, geeignet ist. Ein derartiger Vektor enthält heterologe Nukleinsäuresequenzen, das heißt, Nukleinsäuresequenzen, die natürlicherweise nicht benachbart zu Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung gefunden werden, obwohl der Vektor ebenfalls regulatorische Nukleinsäuresequenzen (zum Beispiel Promotoren, nichttranslatierte Regionen) enthalten kann, die natürlicherweise benachbart zu Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung gefunden werden (wie nachstehend erörtert ist). Der Vektor kann entweder eine RNA oder DNA, entweder porkaryotisch oder eukaryotisch sein und ist typischerweise ein Virus oder ein Plasmid. Der Vektor kann als ein extrachromosomales Element (zum Beispiel ein Plasmid) behalten werden oder er kann in das Chromosom integriert werden. Der gesamte Vektor kann am Ort innerhalb einer Wirtzelle bleiben oder unter bestimmten Bedingungen kann die Plasmid-DNA deletiert werden, wobei das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung zurückbleibt. Das integrierte Nukleinsäuremolekül kann unter chromosomaler Promotorkontrolle, unter nativer oder Plasmidpromotorkontrolle oder unter einer Kombination aus mehreren Promotorkontrollen integriert werden. Einzelne oder mehrfache Kopien des Nukleinsäuremoleküls können in das Chromosom der Wirtszelle integriert werden.
Ein rekombinantes Molekül umfasst typischerweise ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, das funktionsfähig an eine oder mehrere Transkriptionskontrollsequenzen gebunden ist. Derartige Begriffe sind vorstehend definiert worden. Die Ausdrücke „rekombinantes Molekül" oder „rekombinantes Nukleinsäuremolekül", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf ein Nukleinsäuremolekül oder eine Nukleinsäuresequenz, die funktionsfähig an eine Transkriptionskontrollsequenz gebunden ist, jedoch können sie untereinander austauschbar mit dem Begriff „Nukleinsäuremolekül" verwendet werden, wenn ein derartiges Nukleinsäuremolekül ein rekombinantes Molekül ist, wie es hier erörtert ist. Geeignete Transkriptionskontrollsequenzen umfassen jede Transkriptionskontrollsequenz, die mindestens in einer der zur Expression eines CAF-Proteins der vorliegenden Erfindung verwendbaren rekombinanten Zellen arbeitet. Eine Vielzahl derartiger Transkriptionskontrollsequenzen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Transkriptionskontrollsequenzen umfassen diejenigen, die in bakteriellen, fungalen (zum Beispiel Hefe), Insekten-, Pflanzen- oder Tierzellen arbeiten.
Rekombinante Moleküle der vorliegenden Erfindung, die entweder eine DNA oder RNA sein können, können ebenfalls zusätzliche regulatorische Sequenzen, wie zum Beispiel Translationsregulationssequenzen, Ursprünge der Replikation und andere regulatorische Sequenzen enthalten, die mit der rekombinanten Zelle kompatibel sind. In einer Ausführungsform enthält ein rekombinantes Molekül der vorliegenden Erfindung, einschließlich derjenigen, die in das Wirtszellchromosom integriert sind, ebenfalls sekretorische Signale (das heißt Signalsegmentnukleinsäuresequenzen), um zu ermöglichen, das ein exprimiertes CAF-Protein von der Zelle, die das Protein erzeugt, ausgeschieden wird. Geeignete Signalsegmente umfassen ein Signalsegment, das natürlicherweise mit einem CAF-Protein der vorliegenden Erfindung assoziiert ist, oder jedes heterologe Signalsegment, das zur Steuerung der Sekretion eines erfindungsgemäßen CAF-Proteins in der Lage ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein rekombinantes Molekül der vorliegenden Erfindung eine Signalsequenz, um zu ermöglichen, dass ein exprimiertes CAF-Protein an die Membran einer Wirtszelle abgegeben und dort inseriert wird. Geeignete Signalsequenzen umfassen eine Signalsequenz, die natürlicherweise mit einem CAF-Protein der vorliegenden Erfindung assoziiert ist, oder jede heterologe Signalsequenz, die in der Lage ist, die Abgabe und Insertion eines CAF-Proteins an beziehungsweise in die Membran einer Zelle zu steuern.
Ein Typ eines rekombinanten Moleküls, das hier als rekombinantes Virus bezeichnet wird, umfasst ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, das in eine virale Hülle verpackt ist und das in einer Zelle nach Abgabe des Virus an die Zelle exprimiert werden kann. Eine Zahl rekombinanter Virusteilchen, umfassend aber nicht beschränkt auf diejenigen, die auf Alphaviren, Baculoviren, Pockenviren Adenoviren, Herpesviren und Retroviren basieren, kann verwendet werden.
Eines der rekombinanten Moleküle der vorliegenden Erfindung kann zur Erzeugung eines kodierten Produkts (zum Beispiel ein CAF-Protein) der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einer Ausführungsform wird ein kodiertes Produkt durch Expression eines Nukleinsäuremoleküls, wie hier beschrieben ist, unter Bedingungen, die die Erzeugung des Proteins bewirken, erzeugt. Ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung eines kodierten Proteins besteht in der Transfektion einer Wirtszelle mit einem oder mehreren rekombinanten Molekülen zur Bildung einer rekombinanten Zelle. Zur Transfektion geeignete Wirtszellen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf jede bakterielle, fungale (zum Beispiel), Insekten-, Pflanzen- oder Tierzelle, die transfiziert werden kann. Wirtszellen können entweder nicht transfizierte Zellen sein oder Zellen, die schon mit mindestens einem Nukleinsäuremolekül transfiziert worden sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls isolierte (das heißt aus ihrem natürlichen Milieu entfernte) Antikörper, die zur selektiven Bindung an ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung (einschließlich eines CAF-Homologen) oder einer mimetischen Verbindung davon (zum Beispiel CAF-Antikörper) in der Lage sind. Der Begriff „selektiv binden an" bezieht sich, wie er hier verwendet wird, auf die Fähigkeit von Antikörpern der vorliegenden Erfindung bevorzugt an spezifizierte Proteine der vorliegenden Erfindung und mimetische Verbindungen davon zu binden. Die Bindung kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die Standardverfahren aus dem Stand der Technik sind, einschließlich Enzymimmunoassays (zum Beispiel ELISA), Immunblotsassays, usw., gemessen werden, siehe zum Beispiel Sambrook et al., ebd. In einer Ausführungsform bindet ein CAF-Antikörper vorzugsweise derart selektiv an ein CAF-Protein , dass die Aktivität dieses Proteins verringert wird, wie zum Beispiel durch Blockierung der Fähigkeit des Proteins an einen Rezeptor (das heißt ein CAF-Rezeptor), an ein anderes Protein oder an ein Nukleinsäuremolekül zu binden oder anderweitig dessen Wirkungsmechanismus zu unterbrechen.
Isolierte Antikörper der vorliegenden Erfindung können Serum, das derartige Antikörper enthält, oder Antikörper, die auf verschiedene Grade aufgereinigt worden sind, umfassen. Antikörper der vorliegenden Erfindung können polyklonal oder monoklonal, funktionale Äquivalente, wie zum Beispiel Antikörperfragmente und gentechnisch hergestellte Antikörper sein, einschließlich einzelkettiger Antikörper oder chimärer Antikörper, einschließlich bispezifischer Antikörper, die an mehr als ein Epitop binden können.
Ein bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Antikörpern der vorliegenden Erfindung umfasst (a) die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Proteins, Peptids oder mimetischen Verbindung davon der vorliegenden Erfindung an ein Tier zur Erzeugung der Antikörper und (b) die Rückgewinnung der Antikörper. In einem weiteren Verfahren werden Antikörper der vorliegenden Erfindung rekombinant unter Verwendung von Techniken, die hier offenbart sind zur Erzeugung von CAF-Proteinen der vorliegenden Erfindung erzeugt. Antikörper, die gegen definierte Proteine oder mimetische Verbindungen hervorgerufen werden, können vorteilhaft sein, weil derartige Antikörper nicht wesentlich mit Antikörpern gegen andere Substanzen verunreinigt sind, die sonst eine Störung eines diagnostischen Assays, eines Screening-Assays oder Nebenwirkungen bei Verwendung in einer therapeutischen Zusammensetzung verursachen können.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die einen Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Zusammensetzung umfasst vorzugsweise ebenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger, die vorstehend definiert worden ist. Eine „Zusammensetzung" umfasst erfindungsgemäß jede Zusammensetzung (Formulierung, Produkt), die einen Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei der CAF in der Zusammensetzung in einer gereinigten, rekombinant erzeugten, chemisch erzeugten, im Wesentlichen gereinigten (das heißt jedes hyperimmune Ei, da zu einem beliebigen Grad zur Erhöhung der CAF-Menge im Vergleich zu anderen Komponenten des Ei-Produkts gereinigt worden ist) oder jeder anderen CAF-angereicherten Form insbesondere im Vergleich zu hyperimmunen Ei-Produkten in Abwesenheit jeglichen CAF-Auswahl- oder Screening-Verfahrens vorhanden ist (zum Beispiel wie es in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999 beschrieben ist). Daher werden hyperimmune Ei-Produkte in Abwesenheit einer Auswahl oder Screenings bezüglich angereichteren CAF-Mengen im Vergleich zum mittleren CAF-Gehalt in hyperimmunen Ei-Produkten, oder in Abwesenheit jeden anderen Mittels zur Anreicherung bezüglich des CAF-Gehalts in dem Ei-Produkt von einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung nicht umfasst. Somit muss eine Zusammensetzung, die ein hyperimmunes Ei-Produkt, das einen erfindungsgemäßen CAF enthält, ausgewählt, gescreent oder so hergestellt werden, dass es angereichert ist, wie zum Beispiel durch: Screening des Immunisierungsprozesses zur Auswahl hyperimmunisierter Tiere und/oder hyperimmuner Ei-Produkte, die statistisch signifikant höhere CAF-Menge enthalten, als das durchschnittliche hyperimmune Ei-Produkt; durch Screening der hyperimmunisierten Produkte bezüglich eines statistisch signifikant höheren CAF-Gehalts im Vergleich zu durchschnittlichen CAF-Mengen in hyperimmunen Ei-Produkten; oder durch Anreichern des hyperimmunen Ei-Produkts (zum Beispiel durch Fraktionierung, Reinigung oder Ergänzung mit exogenem CAF) bezüglich CAF.
Daher richtet sich in einer Ausführungsform die Zusammensetzung der Erfindung besondere auf die Herstellung von Zusammensetzungen, die hyperimmunes Ei und alle daraus hergestellten Produkte (das heißt Lebensmittelprodukte oder Nicht-Lebensmittelprodukte) umfassen, die bezüglich des Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung angereichert sind und die zur Modulierung des Immunsystems verwendbar sind. Da diese Lebensmittelprodukte natürlich sind, können sie zur Modulation des Immunsystems verwendet werden, ohne dass man Nebenwirkungen fürchten muss, abgesehen natürlich von allergischen Reaktionen, an denen diejenigen mit Überempfindlichkeit gegenüber Eiern leiden. Das hyperimmune Ei wird vorzugsweise von einem Ei-erzeugenden Tier, bevorzugter von einem Vogel erhalten, der mit mindestens einem Immunogen hyperimmunisiert worden ist. Das hyperimmune Ei-Produkt kann ausgewählt, gescreent oder so hergestellt werden, dass es einen statistisch signifikant höheren CAF-Gehalt (zum Beispiel p>0,05) im Vergleich zu einem für hyperimmunisierte Eier aus demselben Stamm des Ei-erzeugenden Tiers, das mit denselben oder verschiedenen Immunogenen immunisiert worden ist, aufweist. Das hyperimmune Ei-Produkt wird vorzugsweise weiter in CAF-angereicherte Fraktionen, wie zum Beispiele diejenigen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, getrennt.
Auf beispielhafte Weise können mehrere Chargen eines hyperimmunen Ei-Produkts gescreent werden, um solche hyperimmunen Ei-Produkte mit dem höchsten Gehalt an Cytokin-Aktivierungsfaktor pro Trockengewicht Ei-Produkt auszuwählen. Alternativ dazu kann das Hyperimmunisierungsverfahren (zum Beispiel durch Probennahme von Ei-Produkten während des Immunisierungsverfahrens) so überwacht werden, dass eine maximale Produktion des Cytokin-Aktivierungsfaktors erreicht wird. Verfahren zum Nachweis des Cytokin-Aktivierungsfaktors umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Reinigung, quantitative Bestimmung des Faktors in dem Produkt, wie zum Beispiel durch jede geeignete Proteinreinigung und quantitativen Bestimmungsverfahrens (für ein beispielhaftes Reinigungsverfahren, siehe den Abschnitt mit den Beispielen). In einer Ausführungsform wird die Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor in einem hyperimmunen Ei-Produkt unter Verwendung eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung, der selektiv an das Protein in der Ei-Probe bindet, nachgewiesen.
Zusätzlich kann das Ei-Produkt zur Anreicherung bezüglich des Vorhandenseins des Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu anderen Komponenten in dem Ei-Produkt oder zur Erhöhung der CAF-Menge (zum Beispiel bezogen auf das Gewicht) in dem Endprodukt im Vergleich zu der CAF-Menge in dem ursprünglichen Ei-Produkt fraktioniert und/oder gereinigt werden. Die Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor in einem Teil oder gereinigten Produkt wird vorzugsweise um mindestens ungefähr 5 % und bevorzugter um mindestens ungefähr 10 % und bevorzugter um mindestens ungefähr 25 %, bevorzugter um mindestens ungefähr 50 % und bevorzugter um mindestens ungefähr 75 % und bevorzugter um mindestens ungefähr 100 % im Vergleich zu der Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor, die in einem nicht gereinigten hyperimmunisierten Lebensmittelprodukt vorhanden ist, angereichert. Bevorzugter wird die Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor in einem Teil oder gereinigten Produkt im Vergleich zu einer Menge an Cytokin-Aktivierungsfaktor in dem ursprünglichen Produkt mindestens um ungefähr das 2-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 3-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 5-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 10-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 50-fache und bevorzugter mindestens um ungefähr das 100-fache und besonderes bevorzugt mindestens um ungefähr das 500-fache angereichert. In einer Ausführungsform wird der Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen auf eine Reinheit von 100 % gereinigt, so dass er als ein im Wesentlichen reiner Faktor zu jeder hier beschriebenen Zusammensetzung gegeben werden kann. In einer anderen Ausführungsform wird der Cytokin-Aktivierungsfaktor rekombinant oder synthetisch, wie an anderer Stelle hier diskutiert ist, hergestellt.
Das Verfahren zur Hyperimmunisierung eines Ei-erzeugenden Tiers wird kurz wie folgt beschrieben. Das hyperimmune Ei oder Ei-Produkt kann von jedem Ei-erzeugenden Tier erzeugt werden. Es ist bevorzugt, dass das Ei-erzeugende Tier ein Mitglied der Klasse Aves, oder in anderen Worten, ein Vogel ist. Innerhalb der Klasse Aves wird Hausgeflügel bevorzugt, aber andere Mitglieder dieser Klasse, wie zum Beispiel Truthähne, Enten und Gänse sind eine geeignete Quelle für ein hyperimmunes Ei-Produkt.
Werden derartige Ei-erzeugende Tiere in einen spezifischen Zustand der Immunisierung mittels zum Beispiel periodischen Auffrischungsverabreichungen von Immunogenen gebracht, werden die Tiere Eier erzeugen, die bei Verzehr durch ein Versuchstier vorteilhafte Eigenschaften aufweisen werden, umfassend supranormale Gehalte des Cytokin-Aktivierungsfaktors, die die Modulation des Immunsystems in diesem Versuchstier bewirken.
Nur die Induktion der Immunsensitivität in dem Ei-erzeugenden Tier ist nicht ausreichend, um das Auftreten supranormaler Gehalte des Cytokin-Aktivierungsfaktors in Eiern zu verursachen, wie durch die Tatsache gezeigt wird, dass Speiseeier keine derartigen supranormalen Gehalte enthalten, obwohl die Vögel gegen verschiedene Immunogene während der normalen Immunisierung gegen Vogelkrankheiten und während des normalen Aussetzens gegen Umweltfaktoren sensibilisiert worden sind. Es ist die Entdeckung der Erfinder, dass nur in den spezifischen hyperimmunen Zuständen die Eier die gewünschten supranormalen Gehalte des Cytokin-Aktivierungsfaktors aufweisen.
Dieser spezielle Zustand der Hyperimmunisierung, in dem das Ei hohe Gehalte des Cytokin-Aktivierungsfaktors enthalten wird, wird vorzugsweise durch Verabreichung einer Anfangsimmunisierung, gefolgt von periodischen Auffrischungen mit ausreichend hohen Dosen spezifischer Immunogene oder Mischungen von Immunogenen, erreicht. Die bevorzugte Dosierung der Auffrischung sollte gleich oder größer als 50 % der Dosierung sein, die zur Erzeugung einer primären Immunisierung des Vogels notwendig ist. Daher gibt es eine Schwellendosierung zur Auffrischung, unterhalb der die Eigenschaften in dem Ei des Vogels nicht erzeugt werden, obwohl der Vogel in einem Zustand ist, der normalerweise als immunisiert bezeichnet wird. Mit Kenntnis der Erfordernis zur Entwicklung und Beibehaltung eines hyperimmunen Zustands liegt es in der Fertigkeit des Fachmanns die Menge des verabreichten Immunogens in Abhängigkeit von den Gattungen des Ei-erzeugenden Tiers und des verwendeten Stamms, zu variieren, um das Tier in einem hyperimmunen Zustand zu halten. Weiterhin kann mit Kenntnis des durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten CAF zusätzlich das Immunisierungsverfahren, zum Beispiel durch Erhöhung der Zahl oder der Dosierung der Auffrischungen oder durch Auswahl spezifischer Immunogene, modifiziert werden, was zu einer erhöhten Erzeugung des CAF im Vergleich zu dem durchschnittlichen hyperimmunen Ei, das derartigen Auswahl/Screeningverfahren nicht ausgesetzt war, führt.
Der hyperimmune Zustand wird vorzugsweise durch jedes Immunogen oder jede Kombination von Immunogenen erzeugt. Eine Hyperimmunisierung wird vorzugsweise durch mehrfache Aussetzungen gegenüber mehrfachen Immunogenen, mehrfache Aussetzung gegenüber einzelnen Immunogenen oder einzelne Aussetzungen gegenüber Bibliotheken von Immunogenen erreicht. Nahezu jedes Immunogen kann zur Induktion des hyperimmunen Zustands verwendet werden, umfassend aber nicht beschränkt auf bakterielle, virale, Protozoen-, allergene, fungale oder zelluläre Substanzen.
Zusätzlich zu Immunisierungen mit natürlich vorkommenden Immunogenen kann eine Immunisierung ebenfalls unter Verwendung von Immunogenen ausgeführt werden, die durch kombinatorische Chemie synthetisch abgeleitet sind. Die grundlegende Strategie besteht in dem Zusammenfügen chemischer Baublöcke zur Herstellung einer Population von Molekülen mit Verschiedenartigkeit. In letzter Zeit sind mehrere Verfahren für die kombinatorische Fest- und Lösungsphasensynthese von Bibliotheken von Oligomeren (Fodor, S. et al., Science 251:767 (1991); Houghton, R. et al., Nature 354:82 (1991)) sowie von kleinen organischen Molekülen (Bunin, B. & Ellman, J., J. Am. Chem. Soc. 114:10997 (1992)) entwickelt worden. Eine schnelle mehrfache Peptid- und Oligomersynthese kann als Quelle für kombinatorisch abgeleitete Immunogene dienen. Weiterhin würde eine alternative Strategie die Addition organischer Baublöcke auf kombinatorische Weise zu einem Gerüstmolekül für eine verbesserte Immunogenität erlauben.
Alternative Arten der Hyperimmunisierung von Ei-erzeugenden Tieren können anstelle immunogener Impfstoffe verwendet werden und umfassen die Verwendung genetischer Impfstoffe. Insbesondere wird jedes DNA-Konstrukt (das im Allgemeinen aus einer Promotorregion und einer Antigen-kodierenden Sequenz besteht) eine Immunantwort auslösen. Genetische Impfstoffe bestehen aus Antigen-kodierenden Vektoren, Fragmenten einer nackten DNA, Plasmid-DNA, DNA-RNA-Antigenen, DNA-Proteinkonjugaten, DNA-Liposomkonjugaten, DNA-Expressionsbibliotheken und viraler und bakterieller DNA, die zur Erzeugung einer Immunantwort abgegeben werden.
Verfahren der DNA-Abgabe umfassen unter anderen Teilchenbeschuss, direkte Injektion, virale Vektoren, Liposomen und Jetinjektion. Bei Anwendung dieser Abgabeverfahren können viel kleinere Mengen notwendig sein und sie führen im Allgemeinen zu einer anhaltenderen Immunogenerzeugung. Werden derartige genetische Verfahren verwendet, ist das bevorzugte Verfahren zur Einführung einer DNA in Vögel die intramuskuläre Injektion der DNA in den Brustmuskel.
Verfahren zur DNA-Abgabe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Teilchenbeschuss, direkte Injektion, Liposomen, Jetinjektion (Fynan, E.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478–11482 (1993)). Die Nukleinsäuren, die bekannte oder unbekannte Immunogene, Promotorregionen (vor allem das CMV-Blumenkohl-Mosaikvirus) und SV40 bakteriellen Ursprungs kodieren, können in Bakterien zur Erzeugung der Plasmid-DNA zur Verwendung in DNA-Injektionen repliziert werden. Obwohl mehrere Wege der parenteralen Verabreichung der DNA in Hühnern wirksam sind, ist das bevorzugte Verfahren die intramuskuläre Injektion in den Brustmuskel. Impfstofftests sind in Eier-legenden Vögeln, vorzugsweise Hühnern ausgeführt worden. Wiederholte Immunisierungen sind in Abständen von ein bis zwei Wochen bis zu sechs Monaten gegeben worden.
Es wird bevorzugt, dass die Mengen an verwendeter DNA zur direkten Injektion im Allgemeinen in der Größenordnung von 50–300 μg DNA in Salzlösung liegen. Für einen Teilchenbeschuss werden 4–100 mg DNA, die auf Goldkügelchen durch Zugabe von 2,5 M CaCl₂ zusammen gefällt wurde, bevorzugt. Wiederholte Immunisierungen können durch dieses Verfahren der Beschleunigung von DNA-beschichteten Teilchen in das lebende Tier intradermal gegeben werden.
Eine ausführliche Beschreibung eines bevorzugten Verfahrens, das dazu verwendet wurde, um ein Ei-erzeugendes Tier in einen erhöhten Zustand der Immunität zu bringen, von dem aus das resultierende hyperimmune Ei oder Ei-Produkt einem Versuchstier verabreicht werden kann, ist in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999 offenbart. Kurz, das Folgende ist ein Beispiel für das Verfahren, das dazu verwendet wurde, um ein Ei-erzeugendes Tier in einen erhöhten Zustand der Immunität zu bringen, für die Verwendung zur Reinigung von CAF oder für die Erzeugung eines CAF-angereichterten Lebensmittelprodukts zur Verabreichung an ein Versuchstier. Es ist verständlich, dass ein derartiges Verfahren, wie vorstehend diskutiert ist, modifiziert werden kann, um bezüglich einer erhöhten CAF-Erzeugung auszuwählen oder zu screenen. Im Allgemeinen umfasst das Hyperimmunisierungsverfahren die Schritte des:

1. Auswählens von einem oder mehreren Antigenen.
2. Hervorrufens eine Immunantwort in dem Ei-erzeugenden Tier durch primäre Immunisierung.
3. Verabreichens von Auffrischungsimpfstoffen von Antigenen mit geeigneter Dosierung zur Induktion und Beibehaltung des hyperimmunen Zustands.
4. Sammelns und Verarbeitens der Eier zur Herstellung eines hyperimmunen Ei-Produkts von dem in dem hyperimmunen Zustand gehaltenen Ei-erzeugenden Tier.

Schritt 1 Jedes Antigen oder Kombination von Antigenen kann verwendet werden. Die Antigenen können bakterielle, virale, Protozeoen-, fungale, zelluläre oder andere Substanzen sein, auf die das Immunsystems eines Ei-erzeugenden Tiers antworten wird. Der entscheidende Punkt in diesem Schritt ist, dass das Antigene) in der Lage sein muss, immune und hyperimmune Zustände in dem Ei-erzeugenden Tier zu induzieren. Ein bevorzugter Impfstoff ist eine Mischung aus polyvalent bakteriellen Antigenen, der als Serie 100 (S-100) Impfstoff bezeichnet wird (der ebenfalls als PL-100 bezeichnet wird). Die in dem S-100 Impfstoff (PL-100) enthaltenen Bakterien sind in dem U.S. Patent Nr. 5,772,999 (Tabelle 1) aufgelistet. Dieser Impfstoff ist früher in den U.S. Patenten mit den Nummern 5,106,618 und 5,215,746 beschrieben worden. Ein weiterer zur Verwendung bevorzugter Impfstoff ist der EB-100E Impfstoff, wobei die Einzelheiten von diesem ebenfalls im Beispiel 1 des U.S. Patents Nr. 5,772,999 beschrieben sind.
Schritt 2 Der Impfstoff kann entweder ein Todimpfstoff oder abgeschwächter Lebendimpfstoff sein und er kann durch jedes Verfahren, das eine Immunantwort hervorruft, verabreicht werden. Es wird bevorzugt, dass die Immunisierung durch Verabreichung der Antigene über intramuskuläre Injektion ausgeführt wird. Der für die Injektion in einen Vogel bevorzugte Muskel ist der Brustmuskel. Die Dosierung beträgt vorzugsweise 0,5–5 Milligramm des Antigen(e)-Impfstoffs. Andere Verfahren zur Verabreichung, die verwendet werden können, umfassen die intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, rektale Zäpfchen oder die orale Verabreichung. Werden DNA- Techniken für das Hyperimmunisierungsverfahren verwendet, sind viel kleinere Mengen erforderlich, im Allgemeinen 1–100 Mikrogramm. Durch eine Zahl von Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie bekannt sind, kann bestimmt werden, ob der Impfstoff eine Immunantwort in dem Ei-erzeugenden Tier hervorgerufen hat. Beispiele für diese umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsassays (ELISA), Tests bezüglich des Vorhandenseins von Antikörpern gegen die stimulierenden Antigene und Tests, die zur Bewertung der Fähigkeit immuner Zellen von dem Wirt zum Antworten auf das Antigen, konstruiert sind. Im Allgemeinen ist das Auftreten von Ei-Antikörpern nach Immunisierung mit dem Impfstoff ein Hinweis für eine Immunantwort. Die minimale Dosierung des Antigens, die zur Induktion einer Immunantwort notwendig ist, hängt von dem verwendeten Impfverfahren, einschließlich der Art des verwendeten Antigens(e) sowie der Art des als Wirt verwendeten Ei-erzeugenden Tiers ab.
Schritt 3 Der hyperimmune Zustand wird vorzugsweise durch wiederholte Auftrischungsverabreichungen mit einer geeigneten Dosierung in festgelegten Zeitabständen induziert und beibehalten. Die Zeitabstände sind vorzugsweise Abstände von zwei Wochen über einen Zeitraum von sechs Monaten. Es ist jedoch wesentlich, dass die Auffrischungsverabreichungen nicht zu einer Immuntoleranz führen. Es ist möglich, andere Verfahren zur Beibehaltung der Hyperimmunisierung oder eine Kombination von Verfahren zur verwenden, wie zum Beispiel die intramuskuläre Injektion für eine primäre Immunisierung und die intravenöse Injektion für Auffrischungsinjektionen. Weitere Verfahren umfassen die gleichzeitige Verabreichung von in Mikrokapseln eingeschlossenem und flüssigem Antigen oder die intramuskuläre Injektion für eine primäre Immunisierung und Auffrischungsdosierungen durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung durch Mittel zur Mikroverkapselung. Mehrere Kombinationen von primärer und Hyperimmunisierung sind dem Fachmann bekannt.
Schritt 4 Die hyperimmunen Eier können zur Verabreichung an das Versuchstier oder zur Reinigung auf eine Vielzahl von Wegen verarbeitet werden. Diese umfassen die Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend das hyperimmune Ei-Produkt selbst (zum Beispiel in Kapseln) und den Einbau des hyperimmunen Ei-Produkts in Lebensmittel zur Verabreichung an ein Versuchstier oder die Befolgung des Reini gungsprotokolls für den Cytokin-Aktivierungsfaktor, wie an anderer Stelle hier beschrieben ist.
In anderen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung CAF in gereinigter, rekombinanter, chemisch synthetisierter, im Wesentlichen gereinigter oder jeder anderen angereicherten Form in Kombination mit jedem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Geeignete erfindungsgemäße pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger, Vehikel zur kontrollierten Freisetzung und pharmazeutisch verträgliche Abgabevehikel, wie vorstehend beschrieben ist. Die Zusammensetzung kann in jeder zur Abgabe geeigneten Form vorliegen, umfassend, aber nicht beschränkt auf eine Flüssigkeit, ein Aerosol, eine Kapsel, eine Tablette, eine Pille, ein Puder, ein Gel und ein Granulat. Präparationen des CAF, die zur parenteralen Verabreichung besonders geeignet sind, umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel oder Vehikel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie zum Beispiel Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat.
In festen Dosierungsformen kann dem CAF-Protein mindestens ein inertes Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel Sucrose, Lactose oder Stärke, beigemischt werden. Derartige Dosierungsformen können, wie es normalerweise üblich ist, ebenfalls zusätzliche Substanzen, die andere als ein inertes Verdünnungsmittel sind, umfassen. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen ebenfalls Mittel zum Puffern, pH-Wert-empfindliche Polymere oder alle anderen Substanzen zur Einkapselung für eine langsame Freisetzung (das heißt Vehikel zur kontrollierten Freisetzung), die typischerweise als Zusammensetzung zur Einkapselung in der Lebensmittel- und Arzneimittelindustrie verwendet werden, oder andere Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit einer enterischen Beschichtung hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen des Cytokin-Aktivierungsfaktors zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die im Allgemeinen in der Pharmazie verwendet werden. Neben inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen ebenfalls Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspensions- und Süßstoffe umfassen.
In einer Ausführungsform liegt die Zusammensetzung in Form eines Lebensmittelprodukts vor. In dieser Ausführungsform wird das CAF-angereicherte Ei, jeder CAF-angereicherte Teil davon, der hochgereinigte CAF, rekombinanter CAF und/oder chemisch synthetisierter CAF in ein Nahrungsergänzungsmittel integriert. Ein bevorzugtes Verfahren, um das Ei oder jeden Teil davon so herzustellen, dass er in ein Nahrungsergänzungsmittel eingeschlossen werden kann, betrifft das Trocknen des Eis zu einem Pulver. Obwohl verschiedene Verfahren zum Trockenen von Eiern bekannt sind, ist Sprühtrocknen ein bevorzugtes Verfahren. Das Verfahren des Sprühtrocknens von Eiern ist aus dem Stand der Technik gut bekannt. Ein derart getrocknetes Eipulver kann in Getränke in Form von zum Beispiel Proteinpulvern, Getränken zum Energieaufbau, Proteinergänzungsmitteln und in allen anderen mit Sportlern assoziierten Nahrungsprodukten eingeschlossen werden. Zusätzlich kann das Eipulver in Backmischungen, Energieriegeln, Süßigkeiten, Keksen, usw. verwendet werden. Andere Beispiele des Verarbeitens von Eiern umfassen die Herstellung eines Omeletts, das Weich- oder Hartkochen des Eis, Braten von Ei oder, falls erwünscht, kann das Ei roh oder als flüssiges Ei verarbeitet gegessen werden. Bevorzugte Teile eines CAF-angereicherten Ei-Produkts der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: flüssiges Eigelb, flüssiges Eiweiß, pulverisiertes Eigelb, pulverisiertes Eiweiß und/oder einen wasserlöslichen Teil dieses hyperimmunisierten Ei-Produkts.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Zusammensetzung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine ein CAF-Protein (einschließlich eines CAF-Homologen) kodierende Nukleinsäuresequenz, wie vorstehend hier beschrieben ist, und/oder einen Antikörper, der selektiv an ein CAF-Protein bindet, umfassen.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann an eine Zellkultur (wie zum Beispiel in einem Cytokin-Assay) oder an einen Patienten durch jedes geeignete Verfahren abgegeben werden. Die Auswahl eines derartigen Verfahrens wird mit der Art der zu verabreichenden oder abzugebenden Verbindung (das heißt ein Protein, eine Nukleinsäure, eine mimetische Verbindung), dem Weg der Abgabe (das heißt in vivtro, in vivo, ex vivo) und dem durch die Verabreichung/Abgabe der Verbindung oder Zusammensetzung zu erreichenden Ziel variieren. Ein wirksames Verabreichungsprotokoll (das heißt die Verabreichung einer Zusammensetzung in einer wirksamen Menge) umfasst erfindungsgemäß geeignete Dosisparameter und Wege der Verabreichung, die zur Abgabe einer Zusammensetzung an eine gewünschte Stelle (das heißt an eine gewünschte Zelle) und/oder zur Regulation einer Immunantwort in einem Versuchstier führen. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise einem Versuchstier durch alle Mittel, die das Immunsystem in dem Versuchstier modulieren, verabreicht.
Verabreichungswege umfassen in vivo, in vitro und ex vivo Wege. In vivo Wege umfassen, sind aber nicht beschränkt auf orale, nasale, intratracheale Injektion, Inhalierung, transdermale, rektale Wege, Imprägnation eines Katheters, durch ein Suppositorium, direkte Injektion in ein Gewebe und parenterale Wege. Bevorzugte parenterale Wege können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf subkutane, intradermale, intravenöse, intramuskuläre und intraperitoneale Wege. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die ein CAF-Protein, einen Antikörper, eine mimetische Verbindung oder ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung enthält, über einen parenteralen Weg verabreicht. Intravenöse, intraperitoneale, intradermale, subkutane und intramuskuläre Verabreichungen können unter Verwendung von Verfahren aus dem Stand der Technik durchgeführt werden. Eine Abgabe durch ein Aerosol (Inhalation) kann ebenfalls unter Verwendung von Verfahren aus dem Stand der Technik durchgeführt werden (siehe zum Beispiel Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277–11281, 1992. In einer weiteren Ausführungsform wird eine ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung umfassende Zusammensetzung oral verabreicht. Die orale Abgabe kann durch Komplexierung einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen Träger, der einem Abbau durch Verdauungsenzyme in dem Darm eines Tiers standhalten kann, durchgeführt werden. Es wird festgestellt, dass ein CAF-Protein der vorliegenden Erfindung besonders resistent gegen Verdauungsenzyme ist und daher muss ein derartiger Träger nicht kritisch sein. Beispiele derartiger Träger umfassen Kunststoffkapseln oder Tabletten und solche, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Derartige Wege können die Verwendung von pharmazeutisch verträgli chen Trägern, wie vorstehend beschrieben ist, umfassen. Der Begriff ex vivo bezieht sich darauf, dass ein Teil des Regulationsschritts außerhalb des Patienten durchgeführt wird, wie zum Beispiel durch Transfektion einer Population von Zellen die aus einem Patienten entfernt worden ist, mit einem rekombinantem Molekül, umfassend eine ein erfindungsgemäßes Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, unter solchen Bedingungen, dass das rekombinante Moleküle nachfolgend durch die transfizierte Zelle exprimiert wird, und durch Zurückgeben der transfizierten Zellen an den Patienten. In vivo und ex vivo Wege der Verabreichung einer Zusammensetzung an eine Kultur von Wirtszellen kann durch ein Verfahren, umfassend aber nicht beschränkt auf Transfektion, Transformation, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion, Adsorption, Protoblastenfusion, Verwendung von Protein-tragenden Mitteln, Verwendung von Ionen-tragenden Mitteln, Verwendung von Detergentien für die Zellpermeabilisierung und einfaches Mischen (zum Beispiel Kombinieren) einer Verbindung in Kultur mit einer Zielzelle, ausgeführt werden.
In einer Ausführungsform werden hyperimmune Eier oder Fraktionen davon, die bezüglich des Cytokin-Aktivierungsfaktors der vorliegenden Erfindung angereichert und von hyperimmunisierten Tieren gesammelt worden sind, zur Herstellung eines hyperimmunen Ei-Produkts verarbeitet, das nachfolgend einem Versuchstier verabreicht werden kann. In einer Ausführungsform findet die Verabreichung direkt durch Füttern des Eis oder eines beliebigen Derivats davon an das Versuchstier statt. Es ist wichtig zu beachten, dass ein Ei ein natürlicher Lebensmittelbestandteil ist, der ungiftig und sicher ist. Ähnlich wird in einer anderen Ausführungsform bevorzugt, dass der im Wesentlichen gereinigte rekombinant hergestellte oder synthetisch hergestellte Cytokin-Aktivierungsfaktor auf eine Art hergestellt (zum Beispiel formuliert) wird, die nachfolgend einem Tier verabreicht werden kann.
Zur Modulation des Immunsystems wird die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorzugsweise einem Tier in einer Menge verabreicht, die das Erreichen der Cytokin (zum Beispiel TNFα, IL-1β und/oder IL-6)-Expression und vorzugsweise die Cytokinaktivierung und Immunmodulation immunologisch bewirkt. Die Dauer und Intensität der Behandlung wird von dem speziellen Versuchstier und dem Zustand des Versuchstiers und von dessen Vorhandensein abhängen, falls das der Fall ist, von dem Fortschritt des Zustands des Versuchstiers. Die Zusammensetzung wird ebenfalls in jeder Menge bereitgestellt, die den Zustand und die Symptome des Zustands behandelt oder verhindert. Im Falle der Verabreichung von CAF-angereichterten hyperimmunen Eiern oder daraus hergestellten Produkten können zum Beispiel tägliche Mengen im Bereich von weniger als einem bis mehreren hyperimmunen Eiern (oder hyperimmunen Ei-Produkten, die das äquivalente zu weniger als einem bis mehreren ganzen hyperimmunen Eiern enthalten) dem Versuchstier in Abhängigkeit von dem speziellen Umstand des Zustands verabreicht werden. Wirksamere Fraktionen können durch Verfahren, die hier beschrieben sind, sowie durch andere Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, getrennt und konzentriert werden. Im Hinblick auf die Verabreichung des CAF-angereicherten hyperimmunen Eis oder Ei-Produkts an ein Versuchstier wurde festgelegt, dass der bevorzugte Dosisbereich des hyperimmunen Eis oder Ei-Produkts, das einem Versuchtier gegeben werden soll, zwischen 100 Milligramm bis 10 Gramm pro Kilogramm Gewicht des Versuchstiers liegt.
Im Hinblick auf den isolierten Cytokin-Aktivierungsfaktor der vorliegenden Erfindung, einschließlich hochgereinigten CAF, rekombinanten CAF und/oder chemisch synthetisierten CAF wurde festgestellt, dass der bevorzugte Dosisbereich der hochgereinigten Zusammensetzung zwischen 1 Nanogramm und 400 Milligramm pro Kilogramm Gewicht des Versuchstiers liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der bevorzugte Dosisbereich zwischen ungefähr 0,01 Mikrogramm und ungefähr 100 Milligramm pro Kilogramm Gewicht des Versuchstiers. In einer anderen Ausführungsform wird ein Protein oder Antikörper in einer Menge zwischen ungefähr 0,1 μg und ungefähr 10 mg pro kg Körpergewicht des Patienten und bevorzugter zwischen ungefähr 0,1 μg und ungefähr 100 μg pro kg Körpergewicht des Patienten verabreicht.
Ist die abzugebende Verbindung ein Nukleinsäuremolekül führt eine geeignete Einzeldosis zu mindestens ungefähr 1 pg Protein, das pro mg Gesamtgewebeprotein pro μg abgegebener Nukleinsäure exprimiert wird. Bevorzugter ist eine geeignete Einzeldosis eine Dosis, die zu mindestens ungefähr 10 pg Protein führt, das pro mg Gesamtgewebeprotein pro μg abgegebener Nukleinsäure exprimiert wird; und bevorzugter mindestens ungefähr 50 pg Protein, das pro mg Gesamtgewebeprotein pro μg abgegebener Nukleinsäure exprimiert wird und bevorzugter mindestens ungefähr 100 pg Protein, das pro mg Gesamtgewebeprotein pro μg abgegebener Nukleinsäu re exprimiert wird. Eine bevorzugte Einzeldosis eines nackten Nukleinsäureimpfstoffs liegt im Bereich von ungefähr 1 Nanogramm (ng) bis ungefähr 100 μg, in Abhängigkeit von dem Weg der Verabreichung und/oder des Abgabeverfahrens, wie durch den Fachmann bestimmt werden kann. Geeignete Abgabeverfahren umfassen zum Beispiel solche durch Injektion, als Tropfen, mittels Aerosol und/oder topische. In einer Ausführungsform bedecken reine DNA-Konstrukte die Oberfläche von Goldteilchen (1 bis 3 μm Durchmesser) und werden in die Hautzellen oder den Muskel mit einer „Genkanone" geschossen. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die Zahl der einem Patienten verabreichten Dosen von dem Ziel der Verabreichung (das heißt von dem Ausmaß der Erkrankung und dem Ansprechen eines einzelnen Patienten auf die Behandlung) abhängt. Daher liegt es im Rahmen der Erfindung, dass eine geeignete Zahl von Dosen jede Zahl von Dosen umfasst, die zur Regulation einer Immunantwort in einem Tier oder zur Regulation einer Erkrankung oder eines Zustands erforderlich ist, von dem erwartet wird, dass er durch Hochregulation von entzündungsfördernden Cytokinen (TNFα-IL-1β, IL-6) und/oder durch Herrunterregulation von TGFβ behandelt oder verhindert wird. Wirksame in vivo Dosisparameter können unter Verwendung von Verfahren aus dem Stand der Technik bestimmt werden. Derartige Verfahren umfassen zum Beispiel die Bestimmung von Überlebensraten, Nebenwirkungen (das heißt Toxizität), die Bestimmung von Wirkungen der zellulären und humoralen Immunantwort und/oder Wirkungen auf Zustände, die mit derartigen Wirkungen auf Immunantworten zusammenhängen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, eine Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis, septischem Schock oder Krebs bereitzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der ebenfalls vorstehend hier beschrieben ist. In dieser Ausführungsform kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als lokaler oder systemischer Stimulator des Immunsystems verwendet werden. Sie könnte ebenfalls eine lokalisierte und systemische bakterielle Infektion verhindern und/oder behandeln und könnte als ein allgemeines Antikrebsmittel verwendet werden. Sie könnte ebenfalls mit spezifischen Abgabereagenzien, wie Gewebe-spezifischen Antikörpern markiert werden, um durch den intravenösen Weg an die spezifische Stelle der bakteriellen Infektion oder Tumorbildung abgegeben zu werden. Sie könnte ebenfalls mit spezifischen Liposomen oder Abgabevehikeln, die handelsüblich sind, gemischt werden, damit sie durch die cytoplasmatische und Kernmembran der Zelle abgegeben wird und dadurch die Regulation der TNF-α, IL-1β und/oder IL-6-Expression auf dem RNA-Niveau erleichtert. Geeignete Arten der Verabreichung, einschließlich der bevorzugten Wege und Dosen sind vorstehend beschrieben. Einem Tier wird vorzugsweise eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Dosis und auf einem Weg verabreicht, der zur Regulation einer Immunantwort durch Erhöhung der Expression von TNF-α, IL-1β und/oder IL-6 oder durch Verringerung der Expression von TGFβ geeignet ist.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem Tier, das Krebs oder ein Risiko zur Entwicklung von Krebs aufweist. Die Verfahren der Verabreichung und Einzelheiten der Zusammensetzung sind so wie vorstehend ausführlich beschrieben ist. Die Verabreichung der Zusammensetzung erzeugt vorzugsweise ein Ergebnis, das ausgewählt ist aus der Gruppe aus: Verringerung der Symptome des Krebses, Verringerung eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, Eliminierung eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, Prävention von metastatischem Krebs, Prävention von Krebs und Stimulation einer Effektorzellenimmunität gegen Krebs.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Behandlung oder Verhinderung von Sepsis und/oder septischem Schock in einem Tier. Die Verfahren der Verabreichung und Einzelheiten der Zusammensetzung sind so, wie sie vorstehend ausführlich beschrieben sind. Die Verabreichung der Zusammensetzung erzeugt vorzugsweise ein Ergebnis, das ausgewählt ist aus der Gruppe aus: Verringerung der Symptome der Sepsis oder des septischen Schocks, Prävention der Sepsis oder des septischen Schocks und Stimulation einer Effektorzellenimmunität gegen die mit einer Sepsis oder einem septischen Schock assoziierten bakteriellen Antigene.
Die vorteilhaften Eigenschaften der vorliegenden Erfindung können unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die die Erfindung erläutern, gesehen werden.
Diese Beispiele werden für die Zwecke der Erläuterung bereitgestellt und beabsichtigen, nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Das folgende Beispiel zeigt die Reinigung, Isolierung und Sequenzierung des Cytokin-Aktivierungsfaktors (CAF) der vorliegenden Erfindung.
Reinigung des Cytokin-Aktivierungsfaktors
Allgemeine Zusammenfassung der CAF-Reinigung
CAF wurde anfänglich 600.000-fach aus ganzen PL-100 Eiern durch sieben Schritte (16) gereinigt und es wurde auf dem HPLC-Chromatogramm gezeigt, dass er eine homogene Komponente ist. Die Reinigung des CAF wurde durch Assays von Fraktionen bezüglich der CAF-in vitro biologischen Aktivität über Cytokin-Assays (nachstehend beschrieben) durch das Verfahren hindurch verfolgt. Das ganze Ei wurde in dem ersten Schritt zu Eigelb fraktioniert. Nach Delipidisierung des Eigelbs wurde CAF als 3.000 Dalton (oder weniger) Permeatfraktion unter Verwendung von Ultrafiltrationstechnologie konzentriert. Es wird festgestellt, dass der 3.000 Dalton Ausschluss eine Näherung ist, da signifikant größere Proteine. durch den Filter hindurchgehen können, wenn die Sekundärstruktur es erlaubt (das heißt im Wesentlichen lineare Polypeptide/Proteine). Das Permeat, das den 3.000 MW Ausschlussfilter passierte, wurde auf Q Sepharose zur Chromatographie für eine weitere Trennung aufgebracht. CAF erschien als stark negativ geladenes Molekül, das fest an die Q-Sepharosesäule bindet, und kann durch 0,3 M NaCl eluiert werden. Im nächsten Schritt wurde die Festphasenextraktion zur Entfernung der großen Menge an NaCl verwendet. Dieser Schritt steigerte durch die Entfernung anderer polarerer Komponenten ebenfalls die CAF-Reinigung. Die CAF-aktive Fraktion von SPE enthält eine wasserunlösliche Komponente, die durch Ethylacetat und Ethanol extrahiert wurde, wobei CAF in der wasserlöslichen Fraktion blieb. Schließlich wurde CAF zu einer homogenen Komponente durch Umkehrphasen-C₁₈ HPLC und Gelfiltrations-HPLC separiert. Die Gesamtausbeute der CAF-Reinigung wurde auf ungefähr 20 % geschätzt. Die Menge an CAF in dem ganzen Ei wird mit 3–5 ppm berechnet (Tabelle 1).
TABELLE 1 CAF-Reinigungstabelle
Die einzelnen Schritte des Reinigungsverfahrens sind spezieller wie folgt beschrieben.
Eigelb-Delipidisierung
Sprühgetrocknetes PL-100-Eigelb enthält Lipide, Proteine, Kohlenwasserstoffe, Aschen und viele biologische Faktoren, einschließlich CAF. Zur Entfernung von Lipiden und wasserunlöslichen Proteinen wurde das Eigelb durch Caprylsäurephasenextraktion, gefolgt von Zentrifugation behandelt. CAF und andere wasserlösliche Komponenten wurden in der Wasserphase erhalten.
Ein Delipidisierungspuffer für PL-100-Eigelb wurde durch Lösen von 3,0 ml Eisessig und 100 ml Caprylsäure in 9 Litern ultrareinem Wasser hergestellt. Der pH-Wert des Puffers beträgt näherungsweise 5,0. Eigelbmaterialien (1,0 kg sprühgetrocknetes Ei oder 2,0 Liter Eigelb mit Außenhaut) wurden zu dem Puffer gegeben und die Mischung wurde weiter durch Mischen mit 24.000 UpM bei Raumtemperatur während 5 Min homogenisiert. Die Formen wurden entfernt und 20 ml zusätzliche Caprylsäure wurde in die Mischung zur Ergänzung der Caprylsäure gegeben. Die Eimischung wurde bei Raumtemperatur für über 2 Stunden gehalten, um eine Phasentrennung zu gestatten. Der ausgeflockte Niederschlag wurde entfernt und die wässrige Phase der Eimischung wurde bei Raumtemperatur während 20 Minuten mit 2.190 × g zentrifugiert. Der Überstand des Eigelbs wurde durch Whatman-Filterpapier (113V, 40 um) filtriert. Der pH-Wert des Überstands wurde auf 7,5 mit 2,0 M NaOH eingestellt.
3.000 Dalton MW Eigelbpermeatherstellung.
Delipidisierter Eigelbüberstand enthält wasserlösliche Proteine und CAF. CAF kann von Komponenten mit großem Molekulargewicht durch ein Ultrafiltrationsverfahren getrennt werden. Bei dieser Herstellung wurde überstehende Flüssigkeit des Eigelbs in einen Behälter mit 22 l zusammengefasst, der an eine Filtrationseinheit (3K MWCO, Amicon Modell CH2 Pumpengehäuse und ein Spiralpatronen-Adapter Kit) angebracht wurde. Der Pumpendruck wurde bei näherungsweise 30 psi in sowohl dem Einlass als auch dem Auslass der Filtration gehalten. Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von näherungsweise weniger als 3.000 Dalton (basierend auf ihrer Fähigkeit den Filter mit einem Ausschluss von 3.000 Da zu passieren) wurden als Permeat gesammelt und zur Trockene für eine Lagerung gefriergetrocknet oder für eine weitere CAF-Reinigung gefroren. Näherungsweise 2 % eines ganzen Eigelbs wird als 3.000 Dalton Permeat erhalten (das hier ebenfalls als „3K Permeat" bezeichnet wird). CAF-Aktivitäten bezüglich TNFα- und IL-1β in in vitro Assays wurden zur Verfolgung des Vorhandenseins des CAF-Proteins bestimmt (1 und 2). Das 3.000 Dalton MW Permeat von Eigelb wurde ebenfalls mit Collagen II induzierter Arthritis und Air-Pouch-Tierassays getestet (Daten sind nicht gezeigt). Das 3K Permeat wurde durch Umkehrphasen-C₁₈ HPLC für eine Reinheitsbestimmung analysiert (3).
Q Sepharose-Ionenaustauschchromatographie.
Der CAF in dem 3.000 Dalton Permeat wurde weiterhin durch Q Sepharose Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die meisten Komponenten des 3.000 Dalton Permeats waren Moleküle mit positiven Ladungen und sie banden nicht an Q Sepha rose. CAF band jedoch in diesem Beispiel an Q Sepharose und es wurde festgestellt, dass er ein Molekül mit einer großen negativen Ladung ist. Die Reinigung von CAF durch Q Sepharose war ein sehr wirksames Verfahren. Zum Setzenlassen der Q Sepharosesäule wurde 2.000 ml Q Sepharose mit 1.000 ml dH₂O verdünnt und auf eine Glassäule (8 × 40 cm) gegeben. Das Verhältnis von I.D. zur Länge betrug 1:5. Das Chromatographieverfahren wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Säule wurde mit 4.000 ml Wasser und 8.000 ml 20 mM Ammoniumacetat, bei einem pH-Wert von 7,5 und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2.500 ml/h äquilibriert. 20-30 l des 3.000 Dalton Permeats wurden auf die Q Sepharosesäule mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1.500 ml/h gegeben. Die Q Sepharose wurde mit den folgenden Puffern bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2.000 ml/h durch schrittweise Elution gewaschen: (1) 4.000 ml 20 mM Ammoniumacetat, pH-Wert 7,5, zum Waschen der Säule und Elution aller ungebundenen Moleküle; (2) 4.000 ml 300 mM Ammoniumacetat, pH-Wert 6,5 zur Elution einiger schwach gebundener Moleküle; (3) 4.000 ml 0,3 M NaCl zur Elution von CAF und anderen Molekülen; (4) 4.000 ml 1,5 M NaCl zur Elution der am stärksten gebundenen Moleküle und zur Regeneration der Q Sepharose Säule. Eine Fraktion 0,3 M NaCl wurde in einem Kolben nach 1.200 ml Eluant gesammelt. Zur weiteren CAF-Reinigung wurde die 0,3 M NaCl Fraktion einer Festphasenextraktion unterzogen. CAF-Aktivitäten bezüglich TNFα und IL-1β wurden in einem in vitro Assay bestimmt (4). Das 3.000 Dalton MW Permeat wurde ebenfalls durch Umkehrphasen-C₁₈ HPLC analysiert (5).
Festphasenextraktion (SPE).
Die 0,3 M NaCl Fraktion von der Q Sepharose enthält CAF und enorme Menge an Salzen. Das Festphasenextraktions-(SPE)-Verfahren wird zur Entfernung der Salze und zur Erhöhung der CAF-Reinheit eingeführt. Die Festphasenextraktion ist eine praktische, günstige und zeitsparende Alternative zur Flüssig-Flüssig-Extraktion. Dieses Verfahren wird normalerweise zur Reinigung und Konzentrierung von Verbindungen für analytische oder Isolierungszwecke verwendet. Zur Erhöhung der Bindung von CAF auf SPE wird die Q Sepharosefraktion mit Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Die saure Fraktion wird auf Umkehrphasen-C18 Harz in einer Säule (5 × 22 cm) mit einer Bedingung für Wechselwirkungen aufgebracht. Die Q Sepharosefraktion wurde auf die SPE-Säule bei Raumtemperatur mit einer Durch flussgeschwindigkeit von 40 ml/Min aufgebracht. Die Chromatographie wurde bei einer Wellenlänge von 254 nm überwacht: CAF und andere Komponenten wurden auf dem Packungsmaterial zurückgehalten und die meisten Verunreinigungen gingen durch die Säule hindurch. Sie Säule wurde mit 800 ml Wasser, pH-Wert 2,0 und 1.200 ml 15 % Acetonitril in Wasser, pH-Wert 2,0 gewaschen. CAF und weitere Komponenten, die auf der Packung der Säule zurückgehalten worden waren, wurden durch 100 % Acetonitril, pH-Wert 2,0 selektiv ausgewaschen (6). Die CAF-Fraktion (die ebenfalls als SPE-Fraktion bezeichnet wird) wurde in einem kleinen Volumen gesammelt. Hochgereinigtes CAF wurde zur Trockene gefriergetrocknet und es war bereit für eine weitere Reinigung. CAF Aktivitäten bezüglich TNFα- und IL-1β wurden in einem in vitro Assay bestimmt (7). Die SPE-Fraktion wurde ebenfalls durch Umkehrphasen-C₁₈ HPLC (8) analysiert.
Verteilungsextraktion der Fraktion der Festphasenextraktion.
Erster Schritt der Verteilungsextraktion (16): Es wurde gezeigt, dass die Fraktion der Festphasenextraktion der Q Sepharosesäule eine wasserunlösliche Komponente enthält (das heißt eine Lösungsmittel-lösliche Fraktion). Diese Komponente wurde durch Ethylacetat und Ethanol extrahiert, wobei CAF in der wasserlöslichen Fraktion zurückblieb (das heißt die SPE-wasserlösliche Fraktion). Kurz, 100 mg der Fraktion der Festphasenextraktion wurden zu 10 ml Ethylacetat gegeben und bei Raumtemperatur während 20 Min gehalten. Die Mischung wurde in ein Glaszentrifugenröhrchen überführt und mit 2.190 × g während 20 Min gedreht. Ein weißes Pellet (SPEwasserlösliche Fraktion) wurde nach Zentrifugation erhalten. Ethylacetat wurde entfernt und ein zweites Mal wurden 10 ml Ethylacetat zur nochmaligen Wiederholung des Schritts zugegeben. Danach wurden 5,0 ml Ethanol mit dem Pellet gemischt und mit 2.190 × g während 20 Min gemischt.
Die SPE-wasserlösliche Fraktion zeigte eine Inhibierung der Entzündung in einem Arthritismodell eines Tiers. In einem in vitro Assay wurde gezeigt, dass die SPEwasserlösliche Fraktion (weißes Pellet nach dem Drehen) TNFα und IL-1β in THP1-Zellen stimuliert. Im Gegensatz dazu zeigte die SPE-wasserunlösliche Fraktion keine derartige Aktivitäten in einem in vitro Assay.
Zweiter Schritt der Verteilungsextraktion (16): Die SPE-wasserlösliche Fraktion wurde weiter mit 5,0 ml 20 mM NH₄OAc in Wasser, das 20 % Acetonitril, pH-Wert 7,0 enthielt, gewaschen und mit 2.190 × g während 20 Min gedreht. Bei neutralem pH-Wert gibt es eine wasserlösliche Fraktion (16, bei neutralem pH-Wert WSF) und eine wasserunlösliche Fraktion. Die wasserunlösliche Fraktion (bei neutralem pH-Wert) wurde zur Trockene für eine CAF-Reinigung mit einer präparativen HPLC, wie nachstehend beschrieben ist, gefriergetrocknet. Obwohl diese bei neutralem pH-Wert waserunlösliche Fraktion bei neutralem pH-Wert in Wasser praktisch unlöslich ist, stellten die vorliegenden Erfinder fest, dass sie in Wasser mit niedrigem pH-Wert löslich ist, und daher wird sie als die bei saurem pH-Wert wasserlösliche Fraktion bezeichnet. CAF-Aktivitäten bezüglich TNFα und IL-1β in einem in vitro Assay (9) wurden in der bei saurem pH-Wert WSF bestätigt und diese CAF-aktive Fraktion (das heißt 16, bei saurem pH-Wert WSF) wurde weiterhin durch Umkehrphasen-C₁₈ HPLC analysiert (10). Da die SPE-wasserlösliche Fraktion (Pellet nach Drehen) in Wasser mit 0,1 % TFA, pH-Wert 2,0 oder in Wasser mit hohem pH-Wert 12,0 löslich ist, aber in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 schlecht löslich ist (1,0 mg/ml), deutete dies darauf hin, dass die SPE-wasserlösliche Fraktion sowohl eine Amingruppe als auch eine Carbonsäuregruppe enthielt, die im Allgemein in Peptiden vorhanden sind.
C₁₈ HPLC-Trennung
Die bei saurem pH-Wert wasserlösliche Fraktion der Festphasenextraktion schien eine einzelne Komponente zu enthalten, die auf einem HPLC-Chromatogramm gezeigt wird (11). Dieser einzelne Peak wurde dahingehend identifiziert, dass er CAF-Aktivität in einer Cytokininduktionsuntersuchung zeigt, wie vorstehend beschrieben ist. Diese CAF-angereicherte Fraktion wurde weiter in drei Komponenten durch Umkehrphasen-C₁₈ HPLC getrennt. Bei dieser Trennung wurde eine Shimadzu HPLC-Einheit verwendet. Sie ist mit einem SPD-M10A VP Diodenfelddetektor, einer LC-6AD-Flüssigkeitschromatographie, einer SCL-10A VP-Entgasungsvorrichtung, einer LPM-600 Niedrigdruck-Mischvorrichtung und einem CTO-10A VP Säulenofen ausgestattet. Die bei saurem pH-Wert wasserlösliche Fraktion wurde mit 1,0 mg/ml in reinem Wasser mit 0,1 % TFA hergestellt. 3,0 ml der Probe wurden auf eine BTR IMPAQ C₁₈ Säule (10 μm, 22 × 250 mm) bei 29° und mit einer Durchflussgeschwin digkeit von 12,0 ml/Min gegeben. Ein linearer Gradient mit 10 % – 100 % Methanol in dH₂O, das 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) enthielt, wurde als mobile Phase verwendet. Die drei Fraktionen, die unmittelbar vorstehend erwähnt wurden, wurden zur CAF-Isolierung gesammelt. Sie wurden CAFo, CAFa und CAFb genannt. Das Acetonitril in den Fraktionen wurde durch einen Rotationsverdampfer entfernt und das Wasser wurde durch Gefriertrocknen entfernt. Es wurde festgestellt, dass die Fraktion CAFb (47 Min – 49,5 Min) einen einzelnen Peak enthielt, der auf dem HPLC-Chromatogramm identifiziert wurde (12). Diese Fraktion zeigte ebenfalls TNFα und IL-1β-Aktivitäten in einem in vitro Assay, was darauf hinwies, dass der CAF zu einer homogenen Komponente als CAFb gereinigt worden war (13).
Gelfiltrations-HPLC-Trennung.
Eine weitere Reinigung verschiedener Fraktionen aus den vorstehenden SPE- und C₁₈ HPLC-Schritten wurde unter Verwendung von Gelfiltrations-HPLC in den Shimadzu-HPLC-Vorrichtungen, wie sie vorstehend beschrieben sind, durchgeführt. Kurz, eine Probe wurde auf eine Gelfiltrations-HPLC-Säule (250 × 9,4 mm, Zorbox GF-250 Bio Reihe) unter der Durchlaufbedingung (Puffer: 50 mM NH₄OAc, pH-Wert 8,0, Durchflussgeschwindigkeit: 1,0 ml/Min, 20 °C, 20 Min) gegeben. Die Probe wurde in dem Laufpuffer mit weniger als 1,0 mg/ml gelöst und in 30 μl für jeden Durchlaufzeitpunkt injiziert.
SPE-wasserlösliche Fraktion: Die SPE-wasserlösliche Fraktion wurde teilweise in 50 mM NH₄OAc, pH-Wert 8,0 mit weniger als 1,0 mg/ml gelöst. Kurz, 1,0 mg SPEwasserlösliche Fraktion wurde mit dem Puffer gemischt. Nach Drehen mit 10.000 UpM während 5 Min wurde der Überstand gesammelt. Dann wurde das Pellet mit dem Puffer wieder gemischt. Die ersten Überstände wurden auf eine GF250 HPLC-Säule zur Bestimmung von Molekülmassen aufgebracht. Es gibt drei Hauptfraktionen nach der Trennung auf der GF250 Säule. Sie sind Fraktionen mit 530.000 Da, 122.000 Da und 1.240 Da. Die drei Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockene für einen Cytokin-Assay gefriergetrocknet. Die MW 530.000 Da und 122.000 Da wurden in dem ersten Entwicklungspuffer gründlich gelöst und sie wurden beim zweiten Lösen nicht gefunden. Der 1.240 Da Peak wurde jedoch besser mit zweiten Lösung gelöst, was darauf hinweist, dass die Moleküle mit 530.000 Da und 122.000 Da größ tenteils durch Lösen von 1,0 mg SPE-wasserlöslicher Fraktion in dem Puffer entfernt wurden. Das zurückbleibende nicht gelöste Pellet (das heißt SPE-GFII) ist tatsächlich eine ziemlich reine Verbindung mit einem MW von 1.240 Da.
CAFb-Fraktion: Die CAFb-Fraktion aus der C₁₈ HPLC-Trennung wurde ebenfalls auf eine Gelfiltrations-HPLC-Säule (GF250) zum Testen ihres Molekulargewichts gegeben. Es wurde festgestellt, dass es drei Hauptfraktionen mit 530.000 Da, 122.000 Da beziehungsweise 40.000 Da gibt. Die Moleküle mit 530.000 Da und 122.000 Da können zu einem großen Molekül on 700.000 Da durch 2-Mercaptoethanol und Sieden reduziert werden, was darauf hinweist, dass eine Aggregation durch Änderung der Oxidations-Reduktions-Bedingung auftreten konnte.
CAFo, CAFa, CAFb: Zum Vergleich der Molekulargewichte aller Cytokin-positiver CAF-Fraktionen aus der bei saurem pH-Wert WSF auf der GF250-HPLC-Säule wurden CAFo, CAFa und CAFb analysiert. CAFo weist einen einzelnen Peak bei 8,621 Min (MW von 122.000 Da) auf. CFAa weist zwei Peaks bei 7,27 Min (MW 530.000 Da und 8,391 Min (MW 122.000 Da) auf. Wie vorstehend erörtert ist, weist CAFb einen zusätzlichen Peak bei 9,483 Min (40.000 Da) auf. Die Moleküle mit dem MW 530.000 Da und 122.000 Da können zu einem Molekül mit 70.000 Da reduziert werden, was ähnlich zu dem ist, das in der SPE-wasserlöslichen Fraktion gesehen wird. Die einmalig vorhandene 40.000 Da Fraktion von CAFb ist jedoch unter Reduktionsbedingungen stabil (Tabelle 2). Ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird vorgeschlagen, dass das Molekül von CAFb mit einem MW von 40.000 Da noch die aktive Stelle des CAF besitzen kann, das ausgehend von einem kleineren Molekül des aktiven CAF durch Aggregation gebildet worden sein könnte. Die isolierte CAFb-Fraktion III (16) (MW 40.000 Da) aus der GF-250-HPLC wurde CAFb-GFII genannt.
TABELLE 2 Vergleich der CAF-Fraktionen aus der HPLC-C₁₈ Säule

* Dieser Peak kann zu einem großen Molekül reduziert werden (7,000 Min).
** Diese Verbindung ist unter Reduktionsbedingungen stabil.

SPE-GFII: Der Überstand der SPE-Wassserextraktion wurde ebenfalls durch GF-250-HPLC analysiert. Wir fanden nach HPLC-Chromatographie zwei Hauptpeaks (8,40 Min und 12,22 Min). Die MW der zwei Peaks betrugen ungefähr 120.000 Da beziehungsweise 2.000 Da. Das Molekül mit 2.000 Da wurde nicht in CAFo, CAFa und CAFb gefunden, was darauf schließen lässt, dass es eine davon verschiedene Verbindung ist. Sie wurde mit SPE-GFII bezeichnet.
Biologische Aktivität der Fraktionen.
Während des gesamten Reinigungsverfahrens hindurch wurde, wie vorstehend beschrieben ist, die in vitro Cytokinaktivität (Messung der Induktion von TNFα und/oder IL-1β) zum Aufzeichnen des Reinigungsverfahrens und zur Auswahl der aktiven Fraktionen verwendet. In den meisten Experimenten wurde festgestellt, dass die SPE-wasserlösliche Fraktion eine starke CAF-Cytokinaktivität aufweist. Überraschenderweise zeigte hochgereinigtes CAFb keine so starke Aktivität oder eine Aktivität, die besser als die der SPE-wasserlöslichen Fraktion ist. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird vorgeschlagen, dass CAFb durch das subsequente Reinigungsverfahren seine Form verändert hat, und dass seine Aktivität bezüglich Cytokinen nach dem Aggregationsprozess abnimmt.
Charakterisierung der CAF-Fraktionen
Analytische C₁₈ HPLC.
CAF-enthaltende Fraktionen wurde mit Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Shimadzu Einheit, SPD-M10A VP Diodenfelddetektion, LC-6AD Flüssigkeitschromatographie, SCL-10A VP Entgasungsvorrichtung, LPM-600 Niedrigdruck-Mischvorrichtung und CTO-10A VP Säulenofen) analysiert. Alle Fraktionen wurden mit 5,0 mg/ml in reinem Wasser herge stellt und durch eine 0,2 μm Filtereinheit filtriert. 20 μl wurden von jeder Probe auf eine Wassersymmetrie-C₁₈-Säule (3,9 × 150 mm) bei 29 °C und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min gegeben. Ein linearer Gradient mit 0 % – 60 % Acetonitril in dH₂O, das 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) enthielt, wurde als mobile Phase verwendet.
3 zeigt eine Chromatographie mit maximaler Auftragung der Trennung des Permeats mit 3.000 Dalton aus delipidisiertem PL-100-Eigelb. Unter Verwendung derselben Analysebedingungen wurden nachfolgende Fraktionen der vorstehend beschriebenen Reinigungsschritte ebenfalls erhalten (5, 8, 10 und 12).
CAF-Strukturanalyse
Protein-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).
Das Molekulargewicht von CAFb wurde unter Verwendung von SDS-PAGE bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass CAFb ein kleines Peptid mit einem MW von ungefähr 6.670 Da ist. Es wird jedoch angenommen, dass aufgrund der Variabilität von SDS-PAGE das Molekulargewicht von CAFb unter Verwendung von SDS-PAGE keine genaue Zahl ist, sondern vielmehr eine Schätzung des Molekulargewichts ist.
Massenspektometrie (MS).
Die SPE-wasserlösliche Fraktion wurde in saurem Wasser (WSF bei saurem pH-Wert) gelöst und auf eine präparative Umkehrphasen-C₁₈ Säule zur CAF-Trennung aufgebracht. Es wurden drei Fraktionen gesammelt. Sie sind CAFo, CAFa und CAFb. Die aktive CAFb-Fraktion stimulierte TNFα- und IL-1β-Aktivitäten in einem in vitro Assay. CAFb wurde mit Massenspektrometrie für eine Molekulargewichtsbestimmung untersucht. Ergebnisse der ESI-MS zeigten, dass CAFb ein Protein mit einem MW von 15.500 Da ist. Die Moleküle mit großem MW aus der CAFb-Fraktion könnten aus einer Aggregation des natürlichen Moleküls während des Reinigungsverfahrens resultieren, die als Ergebnis der Entsalzung auftreten könnte.
Infrarotspektrometrie (IR)
Infrarotspektrometrieergebnisse zeigten, dass CAFb ein Polypeptid mit ähnlichem Muster wie das Milchprotein, Casein ist (14). IR-Ergebnisse zeigten ebenfalls, dass CAFb eine reine Verbindung ist.
N-terminale Aminosäuresequenz
Eine N-terminale Aminosäuresequenzierung wurde unter Verwendung eines verbeserten Hewlett Packard G1005A N-terminalen Sequenzanalysators, der mit HP G1314A variablen Wellenlängendetektoren ausgestattet war, durchgeführt. Die verwendete Technologie führt die Sequenzierung effizient mit Proben im Bereich von sub-pikomolaren bis nanomolaren Niveaus aus. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen von CAFb-GFII und SPE-GFII wurden bestimmt.
CAFb

Kurz, CAFb wurde mit 50 μl Wasser zuzüglich 50 μl 8 M GuHCl gelöst. Näherungsweise 50 μl Probe wurden auf die Umkehrphasenprobensäule unter Verwendung des Beladungsprotokolls von Hewlett-Packard geladen. Die Probenpatrone wurde mit 1 ml 2 % TFA gewaschen. Am Anfang der Sequenzierung war die wichtigste N-terminale Sequenz eine sehr signifikante Sequenz mit 30 Aminosäuren und sie wird hier als SEQ ID Nr:1 dargestellt. Zwei weniger bedeutende Sequenzen wurden ebenfalls in CAFb-GFII bestimmt und sie waren zu der Hauptsequenz, abgesehen von dem Verlust von einem und zwei N-terminalen Resten identisch (bezeichnet mit SEQ ID Nr:2 beziehungsweise SEQ ID Nr:3). Die anfänglichen Sequenzdaten sind nachstehend gezeigt: CAFb-GFII

900 pmol H₂N – AGSSHEWPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISR	(SEQ ID Nr:1)
90 pmol H₂N – s•hev•psl•qt••egsi•qly(a)gpl(s)r•n	(SEQ ID Nr:2)
90 pmol H₂N – •••hev•psl••t••••s••q••••p	(SEQ ID Nr:3)

Nachfolgend wurde eine zusätzliche Sequenz erhalten und ein Polypeptid mit 70 Aminosäuren wurde bestimmt, das hier durch SEQ ID Nr:6 dargestellt ist und von dem angenommen wird, dass es das CAFb-Protein mit voller Länge darstellt.
CAFb-GFII

900 pmol H₂N – AGSSHEWPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISRYNVDEMTSAA LAELKKCIDELPPXHLKALVNLXKQIRTEA (SEQ ID Nr:6)

CAFb scheint ein Polypeptid mit 70 Aminosäuren zu sein und das Molekulargewicht von CAFb wurde auf 8.839 Da berechnet, wie in Tabelle 3 gezeigt ist. Aufgrund von Unsicherheiten bei den Sequenzpositionen 54 und 63 ist die Hauptsequenz (SEQ ID Nr:6) an diesen Positionen nicht sicher zugeordnet. Dieses Polypeptid kann ein Dimer sein und ein Protein von 15.000 Da bilden, wie es in der Untersuchung durch Massenspektrometrie (MS) gefunden wurde. Die Sequenzdaten weisen ebenfalls darauf hin, dass das anfängliche CAFb während der Immunisierung in dem zellulären Metabolisierungsprozess zu einem kleinen aktiven Peptid proteolysiert worden sein könnte. Das im Eigelb vorhandene kleine CAFb könnte während des Reinigungsverfahrens zu einem großen Molekül aggregiert worden sein.
Es ist klar, dass ein Fachmann in der Lage sein wird, Nukleinsäuresequenzen, die SEQ ID Nr:6 kodieren, unter Verwendung des genetisch Codes und unter Berücksichtung der Degeneration darin, abzuleiten. Alle SEQ ID Nr:6 kodierende Nukleinsäuresequenzen werden von der vorliegenden Erfindung betrachtet und umfasst. Es ist ebenfalls verständlich, dass nun, da die Aminosäuresequenz des CAF-Proteins bekannt ist, der Fachmann ohne weiteres in der Lage sein wird, das Nukleinsäuremolekül, das das CAF-Protein kodiert, unter Verwendung von Techniken, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, zu identifizieren, klonieren und sequenzieren. Zum Beispiel kann der Durchschnittsfachmann degenerierte Primer, basierend auf der CAF-Aminosäuresequenz, herstellen und die gesamte oder einen Teil der Nukleinsäuresequenz, ausgehend von einer geeigneten Bibliothek oder einer anderen geeigneten Quelle, durch Polymerasekettenreaktion herstellen. Zusätzliches Klonieren des Nukleinsäuremoleküls kann durch Herstellung einer Sonde und durch Screening einer cDNA-Bibliothek, zum Beispiel, falls notwendig, bezüglich des Mole küls mit voller Länge, hergestellt werden. Nukleinsäuresequenzierungstechniken sind dem Fachmann gut bekannt.

P

= Polar aber ungeladen

NP

= Unpolar

PC

= Positiv geladen

NC

= Negativ geladen

Berechnetes M.W. von CAFb liegt nahe bei 8.839 Da.

SPE-GFII
SPE-GFII wurde ebenfalls von dem N-Ende ausgehend sequenziert. Aus den Daten von Zyklus 10 aufwärts war es klar ersichtlich, dass es in dieser Probe zwei Hauptsequenzen gab. Eine Sequenz, die hier als SEQ ID Nr:4 dargestellt ist, wurde als ein Fragment eines bekannten Huhn-Vitellogenin 11-Vorläufers identifiziert. Die x-Zeichen deuteten darauf hin, dass in den Positionen etwas Glycosylierung auftrat.
SPE-GFII H₂N-AViENLKARXxVSxNxIxTFNgVxFxYSMPA (SEQ ID Nr:4)
Die Peptidsequenz wurde mit anderen bekannten Sequenzen in der von der NIH zur Verfügung gestellten BLAST-Datenbank verglichen (weiterentwickelter BLAST, BLASTp, nr, Erwartet = 19, Gefiltert).
Homologiesuche in der Datenbank.
Bei der Ähnlichkeitssuche bezüglich CAFb-GFII (SEQ ID Nr:6) mit 70 Aminosäuren wurden 518.313 Proteinsequenzen und 162.653.948 Buchstaben verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass dieser Teil von CAFb-GFII eine einmalig vorhandene Sequenz ist und, dass es keine identische Sequenz mit irgendeiner signifikanten Homo logie dazu gibt. Das Protein mit der am nächsten liegenden Identität zu CAF ist eine Aminosäuresequenz wahrscheinlichen eines Ligand-bindenden Proteins RYD5, das aus der norwegischen Ratte (Zugangsnr. S17449) isoliert wurde. Dieses Protein mit 94 Aminosäuren war zu 51 % zu SEQ ID Nr:6 über die Aminosäurereste 1–66 der SEQ ID Nr:6 hinweg identisch. Der längste aufeinanderfolgende Stretch von Aminosäuren, die die zwei Sequenzen gemeinsam hatten, war fünf. Die Funktion des potentiell Ligand-bindenden Proteins RYD5 scheint ein Ligand-bindendes Protein in den Subregionen der Geruchsschleimhaut der norwegischen Ratte zu sein. Es wird daher angenommen, dass das CAF der vorliegenden Erfindung und das RYD5-Protein nicht über Struktur oder Funktion zusammenhängen.
SPE-GFII wurde ebenfalls in der BLAST-Datenbank gesucht. Es wurde bestätigt, dass es ein modifiziertes Fragment des Huhn-Vitellogenin 11-Vorläufers (SEQ ID Nr:5) an den Positionen 1572–1602 war (15). Durch dasselbe Phänomen, wie es für CAF angenommen wurde, kann die Größe von SPE-GFII aufgrund des Abbau- und Aggregationsprozesses varriiert sein. Der Vitellogenin II-Vorläufer ist ein wichtiges Protein zur Regulation vieler Proteine in dem Differenzierungsprozess, einschließlich von Cytokinen. Das modifizierte Vitellogen II-Vorläuferfragment kann ebenfalls in der Funktion zur Entzündungshemmung eine Rolle spielen.
Beispiel 2
Das folgende Beispiel zeigt die Wirkung des Cytokin-Aktivierungsfaktors (CAF) auf Cytokinprofile und Aktivierung.
Cytokin-Assays wurden wie folgt durchgeführt.
Stimulation von Zellen.
Menschliche THP-1-Zellen (mit Makrophagen-/Monozytenursprung) wurden gewaschen und mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen in 10 ml serumfreiem RPMI-Medium, das unterschiedliche Eifraktionen enthielt, in einem 25 ml Kolben ausgestrichen. Man ließ die Zellen in einem befeuchteten CO₂-Inkubator während 4 Stunden wachsen, worauf sie abgeschabt und in einem 50 ml Zentrifugenrohr gesammelt wurden. Die Zellen werden durch Zentrifugation mit 400 × g während 10 Min pelletisiert und in 750 μl TRIzol-Reagenz (Gibco BRL) lysiert und zur Extraktion der gesamten RNA, wie nachstehend beschrieben ist, verwendet.
Extraktion der RNA aus behandelten Zellen.
Die Extraktion der gesamten RNA aus den PBL-Zellpellets wurde gemäß dem TRIzol-Reagenzprotokoll (Gibco, BRL) durchgeführt. Die extrahierte gesamte RNA wurde durch Ultraviolett-Spktrophotometrie quantitativ bestimmt und die Qualität des Präparats wurde durch Analyse der 28 s und 18 s Banden auf einem 1,0 % Agarosegel in TBE-Puffer bestimmt.
Synthese der cDNA aus der gesamten RNA.
Der erste Strang der cDNA wurde aus 5 μg gesamter RNA von jeder Probe unter Verwendung des Cycle^® Kit für RT-PCR (InVitrogen, Carlsbad, CA) synthetisiert. Für Vergleichszwecke wird die allgegenwärtige GAPDH-mRNA verwendet, um jedes cDNA-Präparat halb zu quantifizieren.
17 stellt die Cytokinprofile von THP-1-Zellen dar, die mit teilweise gereinigten Fraktionen verschiedener Eier behandelt worden waren. Die Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)-Expressiosngehalte waren in Zellen, die mit einer 3k-Fraktion (2 mg/ml) eines PL-100-Eis behandelt worden waren, höher als im Vergleich zu der 3k-Fraktion von Speiseeiern. Ebenfalls waren die Interleukin-1β (IL-1β)-Gehalte höher, jedoch zu einem geringeren Ausmaß in PL-100-Eiern als im Vergleich zu den Speiseeiern. In diesen Assay gab es unter Verwendung der 3k-Fraktion keine nachweisbare Induktion von Interleukin-6 (IL-6) oder Interleukin-10 (IL-10) in diesen Zellen. Es wird festgestellt, dass in nachfolgenden Assays die Induktion von IL-6 unter Verwendung von hochgereinigtem CAFb deutlich nachgewiesen wurde. Die Gehalte von TNF-α in dem ganzen PL-100-Ei waren geringfügig höher als diejenigen im Speiseei, jedoch war die Konzentrationen viel höher als diejenigen der 3k-Fraktionen.
Kinetik der TNF-α-Aktivierung durch die 3k-Fraktion des hyperimmunen Eis.
18 stellt die Kinetik der TNF-α-Aktivierung in THP-1-Zellen durch die 3k-Fraktion des PL-100-Eigelbs dar. Die Induktion von TNF-α durch die PL-100 3k-Fraktion begann nach 30 Minuten und erreichte einen Peak bei 2 Stunden, worauf sie zurückging und nach 8 Stunden Grundlinienniveaus erreichte. Die Induktion von TNF-α durch die Speiseei 3k-Fraktion war gleich oder leicht höher als normale in der Zelle gefundene Gehalte.
Induktion der Differenzierung in THP-1-Zellen durch eine gereinigte Fraktion des hyperimmunen Eis.
Die THP-1-Zellen, die transformierte menschliche Zellen von Monozyten- oder Makrophagenursprung sind, durchmachen bei Behandlung mit der aus hyperimmunem Eigelb stammenden 3k-Fraktion eine Differenzierung. Normalerweise wachsen diese Zellen in einer Suspension als Cluster und haften nicht an den Kunststoffoberflächen an. Wurden sie jedoch in einem die 3k-Fraktion aus einem hyperimmunen Ei (nachstehend als PL-100 bezeichnet) (1 mg/ml) enthaltenden serumfreiem Medium vermehrt, differenzierten sie in Fibroblast-ähnliche Zellen und hafteten an die Kunststoffoberfläche an. Wurde die 3k-Fraktion weiter auf einer Ionenaustauschsäule (Q-Sepharose) gereinigt und mit 200 mM Natriumchlorid eluiert, bewirkte sie die Differenzierung der THP-1-Zellen bei viel geringerer Konzentration (0,01 mg/ml). Es gibt mehrere Berichte in der Literatur, die vorschlagen, dass die Herstellung von TNF-α, IL-1α und IL-1β mit einer Antiproliferation und Differenzierung von Zellen von Monozyten-/Makrophagenursprung assoziiert ist.
Induktion der Cytokinexpression durch CAFb
Cytokin-Assays wurden, wie vorstehend beschrieben ist, unter Verwendung der SPE-wasserlöslichen Fraktion und der hochgereinigten CAFb-Fraktion, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, durchgeführt. 19 zeigt, dass sowohl die SPEwasserlösliche Fraktion als auch das CAFb-Präparat die Expression von TNF-α, IL-1β und IL-6 induzieren.
Inhibierung von TGFβ durch CAFb
Cytokin-Assays wurden, wie vorstehend beschrieben ist, unter Verwendung der SPE-wasserlöslichen Fraktion und der hochgereinigten CAFb-Fraktion, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, durchgeführt. 20 zeigt, dass CAFb, jedoch nicht die SPEwasserlösliche Fraktion die Induktion des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) inhibieren.
Während verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben worden sind, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass Modifikationen und Anpassungen dieser Ausführungsformen vorkommen werden. Es versteht sich jedoch ausdrücklich, dass Modifikationen und Anpassungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, wie in den folgenden Ansprüchen definiert ist.

Claims

Isoliertes Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a. einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und b. einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer Aminosäuresequenz von (a) umfaßt, wobei das isolierte Protein die Expression von Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) oder Interleukin-6 (IL-6) hochreguliert oder die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunterreguliert.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten einer Aminosäuresequenz von (a) umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 20 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten einer Aminosäuresequenz von (a) umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 25 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten einer Aminosäuresequenz von (a) umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten von SEQ ID Nr:6 umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens 65% identisch mit einer Aminosäuresequenz von (a) über mindestens 15 Aminosäuren der Aminosäuresequenz von (a) ist, umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens 75% identisch mit einer Aminosäuresequenz von (a) über mindestens 15 Aminosäuren der Aminosäuresequenz von (a) ist, umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60% identisch mit SEQ ID Nr:6 über 66 Aminosäuren von SEQ ID Nr:6 ist, umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein von einer Nukleinsäuresequenz, die unter Hochstringenzbedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr: 6 kodiert, kodiert ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr:6 umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein mindestens eine biologisch aktive Untereinheit aufweist, welche einen Ultrafiltrationsfilter mit einem Molekulargewicht-Ausschluß von 3.000 Dalton passiert.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein bei einer Temperatur bis zu mindestens 50°C stabil ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein bei einem pH-Wert von 2 bis 10 stabil ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ein identifizierendes Merkmal, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a. ist wasserlöslich b. ist nicht steroidal c. ist negativ geladen d. ist nicht polar und e. hat eine λ_max von ungefähr 254 nm, umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein biologisch aktiv ist, wenn es oral verabreicht wird.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein natürlicherweise sowohl im Eiweiß als auch im Eigelb von aviären Eiern vorhanden ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Expression von Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) oder Interleukin-6 (IL-6) hochreguliert.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunterreguliert.
Isolierter Antikörper, der selektiv an das isolierte Protein von Anspruch 1 bindet.
Isoliertes Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a. einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und b. einer Aminosäuresequenz, die mindestens 65% identisch mit einer Aminosäuresequenz von (a) über mindestens 15 Aminosäuren einer Aminosäuresequenz von (a) ist, wobei das isolierte Protein die Expression von Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) oder Interleukin-6 (IL-6) hochreguliert oder die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunterreguliert.
Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Cytokin-Aktivierungsfaktor (CAF)-Protein, welches eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a. einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und b. einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer Aminosäuresequenz von (a) umfaßt, umfaßt, wobei das CAF-Protein die Expression von Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) oder Interleukin-6 (IL-6) hochreguliert oder die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktor β (TGFβ) herunterreguliert.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger ein Lebensmittelprodukt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a. einem hyperimmunen Ei-Produkt, welches ausgewählt ist, um mit dem CAF-Protein angereichert zu sein, und b. einem mit mindestens einem Teil des hyperimmunen Ei-Produkts hergestellten Lebensmittelprodukt, wobei der Teil eine angereicherte Menge des CAF-Proteins im Vergleich zu dem hyperimmunen Ei-Produkt umfaßt, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger einen Teil eines hyperimmunen Ei-Produkts, der im Vergleich zum hyperimmunen Ei-Produkt eine angereicherte Menge des CAF-Proteins enthält, umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei der Teil aus der Gruppe, bestehend aus flüssigem Eigelb, flüssigem Eiweiß, pulverisiertem Eigelb, pulverisiertem Eiweiß und einem wasserlöslichen Teil des hyperimmunen Ei-Produkts, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Flüssigkeit, einem Aerosol, einer Kapsel, einer Tablette, einer Pille, einem Puder, einem Gel oder einem Granulat, vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger aus der Gruppe, bestehend aus Wasser, Phosphat-gepufferter Salzlösung, Ringers-Lösung, Dextroselösung, Serum-enthaltender Lösung, Hank's-Lösung, anderen wäßrigen, physiologisch ausgewogenen Lösungen, Ölen, Estern, Glykolen, biokompatiblen Polymeren, polymeren Matrices, Kapseln, Mikrokapseln, Mikropartikeln, Bolus-Präparationen, osmotischen Pumpen, Diffusionsvorrichtungen, Liposomen, Liposphären, Zellen und zellulären Membranen, ausgewählt ist.
Verwendung eines isolierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 19 und 21 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 28 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bakterieller Infektion, Sepsis, septischem Schock oder Krebs.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Medikament einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Medikament für die Verabreichung durch einen Weg, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus oraler Verabreichung, intravenöser Verabreichung, intraperitonealer Verabreichung, intramuskulärer Verabreichung, subkutaner Verabreichung, transdermaler Zufuhr, intratrachealer Verabreichung, Inhalation, Imprägnation eines Katheters, durch ein Suppositorium und durch direkte Injektion in ein Gewebe, geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Verabreichung des Medikaments die Expression von Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) oder Interleukin-6 (IL-6) durch Zellen des Tieres hochreguliert.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Verabreichung des Medikaments die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) durch Zellen des Tieres herunterreguliert.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Tier ein Säuger ist.
Verwendung nach Anspruch 29 eines isolierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 19 und 21 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 28 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem Tier.
Verwendung nach Anspruch 29 oder 35, wobei das Medikament für die Verabreichung einer Dosis von 1 Nanogramm bis 400 Milligramm des CAF-Proteins pro Kilogramm Körpergewicht des Tieres geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Medikament für die Verabreichung durch einen Weg, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus oraler Verabreichung, intravenöser Verabreichung, intraperitonealer Verabreichung, intramuskulärer Verabreichung, subkutaner Verabreichung, transdermaler Zufuhr, intratrachealer Verabreichung, Inhalation, Imprägnation eines Katheters, durch ein Suppositorium und durch direkte Injektion in ein Gewebe oder in die Nähe des Krebses, geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 29 oder 35, wobei das Medikament ein das CAF-Protein enthaltendes Lebensmittelprodukt umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei die Verabreichung des Medikaments ein Resultat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Reduktion der Symptome des Krebses, Reduktion eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, Elimination eines mit dem Krebs assoziierten Tumors, Prävention von metastasierendem Krebs und Stimulation einer Effektorzellen-Immunität gegen den Krebs, erzeugt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a. einer Nukleinsäuresequenz, die ein Protein, das eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i. einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, und ii. einer Aminosäuresequenz, umfassend mindestens 9 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer Aminosäuresequenz von (i), umfaßt, kodiert, wobei das Protein die Expression von Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) oder Interleukin-6 (IL-6) hochreguliert oder die Expression des Transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) herunterreguliert, und b. einer Nukleinsäuresequenz, die vollkommen komplementär zu der Nukleinsäuresequenz von (a) ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 40, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr:1 und SEQ ID Nr:6, umfaßt.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, welches ein wie in Anspruch 40 dargestelltes, isoliertes Nukleinsäuremolekül umfaßt.
Rekombinante Zelle, welche ein wie in Anspruch 40 dargestelltes, isoliertes Nukleinsäuremolekül umfaßt, wobei die Zelle das Nukleinsäuremolekül exprimiert.
Rekombinantes Virus, welches ein wie in Anspruch 40 dargestelltes, isoliertes Nukleinsäuremolekül umfaßt.