ES2239019T3 - Factor de activacion de citoquina altamente purificada y procedimientos de uso. - Google Patents

Abstract

Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por: a. una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 6 y, b. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (a); En la que dicha proteína aislada regula de forma positiva la expresión del factor de necrosis tumoral a (TNF-alfa), interleuquina-1beta (IL-beta) ) o interleuquina-6 (IL-6), o regula de forma negativa la expresión del factor de transformación de crecimiento beta (TGF/beta).

Description

Factor de activación de citoquina altamente purificada y procedimientos de uso.

Antecedentes de la invención

Los factores biológicos, tales como coenzimas, cofactores, vitaminas y otros, juegan papeles importantes en los procedimientos de conversión biológica. Se producen habitualmente en pequeñas cantidades en una célula completa (1 x 10^{-5}- 1 x 10^{-6}). El aislamiento y la purificación de dichos factores biológicos a partir de células normales, sin embargo, es un proyecto difícil.

Se han desarrollado huevos hiperinmunizados y se ha demostrado que producen en exceso anticuerpos y ciertos factores biológicos. Como la hiperinmunización se realiza por inyección de antígenos bacterianos polivalentes en el animal diana, la cantidad de factores biológicos encontrados en los huevos de estos animales hiperinmunizados no puede aumentarse en más de un orden de magnitud. Por lo tanto, la pequeña cantidad de factores biológicos en huevos hiperinmunizados hace la purificación de factores biológicos difícil, y, por tanto, existe la necesidad de un procedimiento eficaz para asilar, purificar o producir de otro modo dichos factores biológicos.

El sistema inmune normal está en un equilibro en el que las células y las moléculas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias se regulan meticulosamente para promover la defensa inmune del huésped normal sin la destrucción de tejidos del huésped. Una vez que se altera este equilibrio regulador meticuloso, la estimulación y activación no específica puede conducir a cantidades aumentadas de moléculas inmunológicas e inflamatorias destructivas potentes que se producen y se liberan. Por tanto, una producción en exceso de citoquinas pro-inflamatorias o una producción de citoquinas en el contexto biológico equivocado, se asocian con mortalidad y patología en un amplio intervalo de enfermedades, tales como malaria, sepsis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, cáncer y SIDA, entre otros.

Las citoquinas son polipéptidos pluripotentes que funcionan de modo autocrino/paracrino uniéndose a receptores celulares específicos. Su secreción es importante para determinar la duración e intensidad de una respuesta inmune. Por ejemplo, en ratones, diferentes subpoblaciones de clones de CD4+ auxiliares (Th) segregan lo que clásicamente se ha descrito como citoquinas Th1 y Th2. Las células Th1 producen interleuquina-2 (IL-2) e interferón \gamma (IFN-\gamma) y facilitan la respuesta inmune celular. Las células Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 y mantienen la activación de células secretoras de inmunoglobulinas. Durante el procedimiento de inflamación, las citoquinas tales como IL-1\beta, IL-6 y el factor de necrosis tumoral-\alpha (TNF\alpha) se liberan al sitio de inflamación. Estas citoquinas tienen efectos pleiotrópicos y median un amplio intervalo de síntomas asociados con la inflamación.

Una citoquina clave, TNF-\alpha, también conocida como cacectina, es una proteína de 17 kiloDalton compuesta por 157 aminoácidos y producida principalmente por monocitos y macrófagos activados. Se ha demostrado que TNF-\alpha tiene actividad tumoricida así como una diversidad de efectos fisiológicos en la mayoría de los sistemas orgánicos. En el sistema nervioso central, TNF-\alpha está implicado en la fiebre, anorexia, y alteraciones en la liberación de hormonas de la pituitaria. En el sistema cardiovascular, TNF-\alpha juega un papel en choque, distrés respiratorio agudo y síndrome de fuga capilar (procoagulación). TNF-\alpha contribuye decisivamente al procedimiento de necrosis tubular aguda y nefritis en el riñón e isquemia, colitis, y necrosis hepática en el sistema gastrointestinal. También es una citoquina clave implicada en el procedimiento de inflamación.

Diversos géneros de la clase Aves, tales como pollos (gallus domesticus), pavos, y patos, producen anticuerpos en la sangre y los huevos frente a inmunógenos que causan enfermedades de aves, así como frente a otros inmunógenos. Por ejemplo, LeBacq-Veheyden y col. (Immunology 27:683 (974)) y Leslie, G.A., y col. (J. Med. 130:1337 (1969)), han analizado cuantitativamente las inmunoglobulinas del pollo. Polson y col. (Immunological Communications 9:495-514(1980)) inmunizaron gallinas frente a varias proteínas y mezclas naturales de proteínas, y detectaron anticuerpos IgY en las yemas de los huevos. Fertel y col. (Biochemical and Biophysical Research Communications 102:1028:1033 (1981)) inmunizaron gallinas frente a prostaglandinas y detectaron anticuerpos en la yema de los huevos. Jensenius y col. (Journal of Immunological Methods 46:63-68 (1981)) proporcionan un procedimiento para asilar IgG de yema de huevo para usar en inmunodiagnósticos. Polson y col. (Immunological Communications 9:475-493 (1980)) describen anticuerpos aislados de la yema de huevos de gallinas que fueron inmunizadas con una diversidad de virus de plantas.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.357.272 describe el aislamiento de anticuerpos a partir de las yemas de huevos obtenidos de gallinas hiperimunizadas. La respuesta de anticuerpo se provocó por inyecciones repetitivas de inmunógenos obtenidos de virus de plantas, IgG humanas, antitoxina del tétanos, antiveninas de serpiente, y Serameba.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.550.019 describe el asilamiento a partir de yemas de huevos de anticuerpos provocados en la gallina por inmunización con inmunógenos que tienen un peso molecular o de particular de al menos 30.000. Los inmunógenos usados para hiperinmunizar los pollos se seleccionaron entre virus de plantas, inmunoglobulinas humanas, toxina del tétanos, y venomas de serpiente.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.748.018 describe un procedimiento de inmunización pasiva de un mamífero que comprende administrar por vía parenteral un anticuerpo purificado obtenido de los huevos de un ave que se ha inmunizado frente al correspondiente antígeno, y donde el mamífero ha adquirido la inmunidad a los huevos.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.772.999, atribuida a DCV-Biologics, describe un procedimiento para prevenir, hacer frente a o reducir los trastornos gastrointestinales crónicos o daño gastrointestinal Inducido por Fármacos Anti-inflamatorios No Esteroideos (inducido por AINE) en un sujeto administrando un huevo hiperinmunizado y/o leche o fracciones de los mismos al sujeto.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de la presente invención de que hay actividad inmunorreguladora específica en un huevo, y particularmente en un huevo obtenido de animales hiperinmunizados, que cuando se administran a un animal sujeto y, particularmente, a mamíferos, activa la producción de citoquinas en ese animal sujeto.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un Factor de Activación de Citoquinas altamente purificado que puede obtenerse de los huevos de un ave. El Factor de Activación de Citoquinas puede purificarse altamente a partir de fracciones asiladas tanto de yema de huevo como de clara de huevo. El Factor de Activación de Citoquinas también puede producirse de manera recombinante o por síntesis química.

Una realización de la presenten invención se refiere a una proteína Factor de Activación de Citoquinas (CAF) asilada. Dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de: (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 6; y, (b) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a). La proteína CAF asilada de la presente invención regula positivamente la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y/o interleuquina-6 (IL-6), y/o regula negativamente la expresión del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta). En una realización preferida, la proteína asilada de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 15 restos de aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a), y más preferiblemente, al menos aproximadamente 20 restos de aminoácidos consecutivos, e incluso mas preferiblemente, al menos aproximadamente 25 restos de aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a). En otra realización, la proteína aislada de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50 restos de aminoácidos consecutivos de SEC ID Nº: 6.

En una realización de la presente invención, una proteína asilada de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) sobre al menos 15 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de (a). Preferiblemente, la proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) sobre al menos 15 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de (a). En otra realización, la proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 60% idéntica a SEC ID Nº: 6 sobre 66 aminoácidos de SEC ID Nº: 6. En otra realización mas, la proteína está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida en condiciones de rigurosidad alta con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 6. En una realización mas preferida, la proteína CAF asilada de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 6, y más preferiblemente, SEC ID Nº: 6.

En una realización, una proteína CAF asilada de la presente invención tiene una o más de las siguientes características bioquímicas: (a) tiene al menos una subunidad biológicamente activa que pasa a través de un filtro de punto de corte de 3000 de PM; (b) es estable a una temperatura de hasta al menos aproximadamente 50ºC; (c) es estable a un pH entre aproximadamente 2 a aproximadamente 10; (d) es soluble en agua; (e) es no esteroidea; (f) está cargada negativamente; (g) es sustancialmente no polar; y/o, (h) tiene una \lambda_{max} a aproximadamente 254 nm. Una proteína aislada de la presente invención es biológicamente activa cuando se administra por vía oral. Una proteína asilada de la presente invención está presente de manera natural tanto en la clara de huevo como en la yema de huevo de huevos de ave. Como se ha analizado anteriormente, una proteína CAF aislada de la presente invención preferiblemente regula positivamente la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y/o interleuquina-6 (IL-6). En una realización, una proteína asilada de la presente invención regula negativamente la expresión del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta).

Una realización de la presente invención se refiere a un anticuerpo asilado que se une selectivamente a la proteína CAF asilada de la presente invención.

Otra realización más de la presente invención se refiere a una composición. Dicha composición incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína factor de activación de citoquinas (CAF) de la presente invención como se ha descrito anteriormente. En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un producto alimenticio seleccionado entre el grupo de: (a) un producto de huevo hiperinmune que se selecciona para que esté enriquecido con la proteína CAF; y, (b) un producto alimenticio producido con al menos una fracción de un producto de huevo hiperinmune, donde la fracción comprende una cantidad enriquecida de la proteína CAF en comparación con el producto de huevo hiperinmune. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una fracción de un producto de huevo hiperinmune que contiene una cantidad enriquecida de la proteína CAF en comparación con el producto de huevo hiperinmune. Las fracciones apropiadas de un producto de huevo hiperinmune incluyen, aunque sin limitación: yema de huevo líquida, clara de huevo líquida, yema de huevo en polvo, clara de huevo en polvo, y una fracción soluble en agua del producto de huevo hiperinmune.

En una realización, la composición de la presente invención está en una forma seleccionada entre el grupo de un líquido, un aerosol, una cápsula, un comprimido, una píldora, un polvo, un gel y un gránulo. En otra realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una formulación de liberación controlada. En otra realización más, el vehículo farmacéuticamente aceptable se selecciona entre el grupo de: agua, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, y otras soluciones acuosas fisiológicamente equilibradas, aceites, ésteres, glicoles, polímeros biocompatibles, matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones en bolo, bombas osmóticas, mecanismos de difusión, liposomas, lipoesferas, células, y membranas celulares.

Otra realización más de la presente invención se refiere al uso de una composición de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección bacteriana, sepsis, choque séptico o cáncer en un animal. Preferiblemente, la composición incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, el medicamento es apropiado para la administración a una dosis de aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 400 miligramos de la proteína CAF por kilogramo de peso corporal del animal. Las vías preferidas de administración incluyen, aunque sin limitación: oral, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea, liberación transdérmica, administración intratraqueal, inhalación, impregnación de un catéter, por supositorio, e inyección directa a un tejido. En una realización, la composición comprende un producto alimenticio que contiene la proteína CAF. En una realización preferida, el animal es un mamífero.

Preferiblemente, la administración de la composición regula positivamente la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y/o interleuquina-6 (IL-6) por células del animal. En un aspecto, la administración de la composición regula negativamente la expresión del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta) por células del animal.

Otra realización de la presente invención se refiere al uso de una composición de la presente invención en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un mamífero. La composición puede administrarse a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer una composición que comprende una proteína factor de activación de citoquinas (CAF) de la presente invención como se ha descrito previamente en este documento. Preferiblemente, la composición es apropiada para la administración a una dosis de aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 400 miligramos de la proteína CAF por kilogramo de peso corporal del animal. Las vías preferidas de administración incluyen, aunque sin limitación: oral, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea, liberación transdérmica, administración intratraqueal, inhalación, impregnación de un catéter, por supositorio, e inyección directa en un tejido en o adyacente al cáncer. En una realización, la composición comprende un producto alimenticio que contiene la proteína CAF.

Preferiblemente, la administración de la composición produce un resultado seleccionado entre el grupo compuesto por: reducción de los síntomas del cáncer, reducción de un tumor asociado con el cáncer, eliminación de un tumor asociado con el cáncer, prevención de cáncer metastásico, prevención del cáncer y estimulación de inmunidad de células efectoras frente al cáncer.

Otra realización más de la presente invención se refiere a una molécula de ácidos nucleicos asilada. Dicha molécula de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre el grupo compuesto por: (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por: (i) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 6; y, (ii) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (i); y, (b) una secuencia de ácidos nucleicos que es completamente complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de (a). Preferiblemente, la proteína codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de (a) regula positivamente la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y/o interleuquina-6 (IL-6). En una realización preferida, la molécula de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 6.

Una realización de la presente invención se refiere a una molécula de ácidos nucleicos recombinante que comprende una molécula de ácidos nucleicos asilada de la presente invención como se ha expuesto previamente en este documento. Otra realización más de la presente invención se refiere a una célula recombinante que comprende una molécula de ácidos nucleicos asilada de la presente invención como se ha expuesto previamente en este documento, donde la célula expresa la molécula de ácidos nucleicos. Otra realización más de la presente invención se refiere a una molécula de ácidos nucleicos asilada de la presente invención como se ha expuesto previamente en este documento.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de un permeado de 3.000 Dalton de PM en la inducción de citoquinas en un ensayo in vitro.

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La Figura 2 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de un permeado de 3.000 Dalton de PM en la inducción de TNF\alpha en un ensayo in vitro.

La Figura 3 es un cromatograma de HPLC de un permeado PL-100 de 3.000 Dalton de PM.

La Figura 4 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de fracciones de Q Sepharose del permeado de 3.000 Da de PM en la inducción de TNF\alpha en células THP-1.

La Figura 5 es un cromatograma de HPLC de la fracción activa CAF en una columna de Q Sepharose.

La Figura 6 es un cromatograma de Extracción en Fase Sólida de una fracción activa CAF1 de una columna de Q Sepharose.

La Figura 7 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de las fracciones de Extracción en Fase Sólida en la inducción de TNF\alpha en un ensayo in vitro.

La Figura 8 es un cromatograma de HPLC de la fracción activa CAF de Extracción en Fase Sólida.

La Figura 9 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de las fracciones de Extracción por Reparto en la inducción TNF\alpha en un ensayo in vitro.

La Figura 10 es un cromatograma de HPLC de una fracción soluble en agua por Extracción por Reparto.

La Figura 11 es un cromatograma de HPLC de separación por C_{18} HPLC de una fracción soluble en agua.

La Figura 12 es un cromatograma de HPLC de CAF purificado.

La Figura 13 es una imagen digitalizada que muestra el efecto de CAF en la inducción de IL-1\beta en un ensayo in vitro.

La Figura 14 es un cromatograma que muestra la Espectrometría de Infrarrojos de CAF.

La Figura 15 muestra el alineamiento y colocación de la secuencia EFS-FGII con el precursor de la vitelogenina II de pollo.

La Figura 16 es un dibujo esquemático que ilustra las etapas de purificación para CAF.

La Figura 17 es una imagen digitalizada que muestra los niveles de ARN de citoquinas en células THP-1 tratadas con diferentes fracciones de huevo.

La Figura 18 es una imagen digitalizada que muestra la cinética de la activación de TNF\alpha por la fracción de permeado de 3.000 Da de huevo.

La Figura 19 es una imagen digitalizada que muestra la inducción de tres citoquinas por CAFb.

La Figura 20 es una imagen digitalizada que muestra la inhibición del factor de crecimiento de transformación \beta por CAFb.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere en líneas generales a un nuevo Factor de Activación de Citoquinas (CAF), a una composición que comprende un Factor de Activación de Citoquinas (CAF), y a un uso de una composición de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección bacteriana, sepsis, choque séptico o cáncer. La composición de la invención puede incluir composiciones que comprenden CAF producido de manera recombinante, CAF producido de manera sintética (es decir, químicamente), o CAF purificado, y/o una composición de la invención que puede ser un producto alimenticio natural que contiene CAF, y preferiblemente, incluye un producto alimenticio natural o fracción del mismo que está enriquecido para la presencia de CAF, tal como por procedimientos de selección o por producción de una fracción enriquecida. Dichos productos alimenticios naturales incluyen productos de huevo hiperinmune, incluyendo fracciones de productos de huevo hiperinmune que están enriquecidos para CAF. Se ha descubierto que la nueva proteína, CAF, regula positivamente la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-1\beta (IL-1\beta), y regula negativamente la expresión del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta). Por lo tanto, la proteína CAF de la presente invención puede usarse para modular (es decir, regular) el sistema inmune general modulando la expresión de estas citoquinas en las células que producen o están influidas por estas citoquinas. Además, como TNF\alpha, IL-1\beta e IL-6 se considera típicamente que son citoquinas pro-inflamatorias, y como TGF\beta se considera típicamente que es una citoquina anti-inflamatoria, la proteína CAF de la presente invención es útil para el tratamiento de infección bacteriana, sepsis y cáncer en los que es deseable la estimulación de una respuesta inmune y células que respondan a citoquinas pro-inflamatorias.

Los presentes inventores descubrieron en un principio que el CAF de la presente invención es un componente que se produce en productos de huevo hiperinmunizado. La mezcla inmunogénica preferida que se administra, preferiblemente por inyección, a los animales productores de huevos para inducir una respuesta inmune y para producir el producto de huevo hiperinmune que contiene el Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención no se requiere que contenga inmunógenos específicos que se sabe que modulan el sistema inmune activando citoquinas particulares o induciendo la producción de un factor que induce citoquinas particulares. Por lo tanto, es sorprendente encontrar dicho Factor de Activación de Citoquinas en un producto de huevo hiperinmune obtenido de animales inmunizados frente a una vacuna antigénica mixta, que se espera que sea eficaz en la modulación del sistema inmune cuando se administra un sujeto. Además, antes de la presente invención, no se sabía que la hiperinmunización de animales que producen huevos podría dar como resultado la producción del nuevo factor de activación de citoquinas de la presente invención que podría tener las propiedades de ser capaz de regular la producción de citoquinas y la diferenciación de células del sistema inmune en un animal. Para el conocimiento de los presentes inventores, antes de la presente invención, el Factor de Activación de Citoquinas descrito en este documento nunca se había identificado, purificado, caracterizado, o secuenciado.

El Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención puede separarse y purificarse altamente a partir de huevo usando ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico en Q Sepharose, extracción en fase sólida, extracción por reparto y tecnologías de C_{18} HPLC en fase inversa (véase Ejemplo 1). La HPLC analítica, los estudios de expresión de citoquinas in vitro, y datos de bioensayo han mostrado todos la purificación de un Factor de Activación de Citoquinas biológicamente activo. Además, como se describe en este documento, el Factor de Activación de Citoquinas puede asilarse, clonarse, y producirse de manera recombinante, o producirse de manera sintética, usando la información de secuencia proporcionada en este documento.

Definiciones

Las siguientes definiciones son aplicables en toda esta solicitud salvo que se especifique lo contrario:

El término "hiperinmunización" significa exponer a uno o más inmunógenos (por ejemplo, antígenos) de modo que se obtenga una respuesta inmune y se mantenga por encima del estado no expuesto natural.

El término "inmunógeno" significa una sustancia que es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo tumoral y/o una respuesta inmune mediada por células en lugar de tolerancia inmunológica. El término indica la capacidad de estimular una respuesta inmune así como reaccionar con los productos de la misma, por ejemplo, anticuerpo.

La expresión "inmunógenos obtenidos mediante combinación" se refiere a un procedimiento para generar diversidad molecular entre los inmunógenos por medio de síntesis de combinación.

El término "inmunógenos biodiseñados" se refiere a inmunógenos que se obtienen a través de procedimientos de tecnologías de clonación génica y manipulación genética o síntesis química.

El término "vacuna genética" se refiere a una vacuna de ácidos nucleicos que se produce generalmente por tecnologías recombinantes y que pueden provocar una respuesta inmune.

Los términos "huevo" o "producto de huevo" significan cada uno cualquier huevo completo (de mesa, hiperinmunizado o distinto) o cualquier producto o fracción obtenidos del mismo.

Los términos "huevo de mesa" o "producto de huevo de mesa" significan cada uno un huevo completo, o cualquier producto o fracción obtenidos de los mismos, obtenidos de animales que producen huevos que no se han mantenido en un estado hiperinmune.

Los términos "huevo hiperinmune" y/o "producto de huevo hiperinmune" significan cada uno un huevo completo o cualquier producto o fracción obtenidos de los mismos, obtenidos de un animal que produce huevos mantenido en un estado hiperinmune.

La expresión "niveles por encima de los normales" significa niveles en exceso de los encontrados en huevos de animales que producen huevos no mantenidos en un estado hiperinmune.

El término "huevo inmunorregulador" significa un huevo o fracciones de huevo que contienen el Factor de Activación de Citoquinas descrito en este documento.

El término "respuesta inmune" se refiere en líneas generales a una respuesta inmune mediada por células o celular (es decir, una respuesta inmune mediada por células del sistema inmune incluyendo linfocitos T, linfocitos B y macrófagos) y/o una respuesta inmune humoral (es decir, una respuesta inmune mediada por anticuerpos).

El término "animal" se refiere a cualquier especie del reino Animalia. Los animales preferidos para inmunizar de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier animal de la clase de vertebrados, Aves, incluyendo, sin limitación, pollos, pavos, y patos. Los animales preferidos para tratar de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier animal de las clases de vertebrados, Aves y Mammalia, incluyendo, sin limitación, primates, roedores, ganado y animales domésticos. El ganado incluye mamíferos que se consumen o que producen productos útiles (por ejemplo, ovejas para la producción de lana). Los mamíferos preferidos para proteger de una enfermedad o afección incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas, ovejas, ganado, caballos y cerdos, siendo particularmente preferidos los seres humanos.

El término "animal diana" se refiere a un animal que funciona como animal de producción de huevos.

El término "animal sujeto" se refiere al animal al que se le administra una composición que contiene CAF de la presente invención, incluyendo composiciones que contienen CAF purificado, CAF producido de manera sintética, CAF producido de manera recombinante, o un huevo o producto de huevo enriquecido con CAF producido por el animal diana. Una animal sujeto también puede mencionarse como paciente.

El término "Factor de Activación de Citoquinas" o "CAF" se usa generalmente para hacer referencia al factor de la presente invención en cualquier estado de pureza (por ejemplo, incluyendo como componente de huevo, como proteína semipurificada, como proteína altamente purificada, como proteína recombinante o como proteína sintetizada de manera química) y que tiene las características bioquímicas, físicas, estructuras y/o funcionales (por ejemplo, actividad biológica) descritas en este documento para el Factor de Activación de Citoquinas. Se observa que CAF altamente purificado de acuerdo con la presente invención también puede mencionarse como "CAFb" (véase Ejemplo 1).

La expresión "Factor de Activación de Citoquinas altamente puro" o "CAF altamente puro" significa un Factor de Activación de Citoquinas de al menos la pureza descrita en el Ejemplo 1 para CAFb.

La expresión producto o composición "enriquecido con Factor de Activación de Citoquinas" o "enriquecido con CAF" se refiere a un producto composición que se ha purificado, procesado y/o producido para que contenga un nivel mas alto de Factor de Activación de Citoquinas en el producto enriquecido, o final en comparación con el nivel de Factor de Activación de Citoquinas en el producto o composición antes de la etapa de purificación, procesamiento y/o producción. Por lo tanto, en una realización, el CAF está presente en el producto o composición inicial, y las etapas de purificación, procesamiento y/o producción aumentan la cantidad de CAF en el producto o composición en relación con otros componentes en el producto o composición, típicamente por eliminación o reducción de la cantidad de algunos de los componentes a partir del producto inicial. En otra realización, el producto o composición inicial no contiene CAF o contiene una cantidad inicial de CAF y el producto o composición enriquecida con CAF se produce por adición de CAF producida de manera recombinante o sintética purificado al producto o composición inicial. Dichas composiciones enriquecidas con CAF se analizan con más detalle a continuación. Otros medios para enriquecer una composición o producto para CAF serán evidentes para los especialistas en la técnica.

El término "aislado" con respecto a un compuesto (por ejemplo, una proteína o molécula de ácidos nucleicos de la presente invención) se refiere a un compuesto que se ha retirado de su medio natural (es decir, que sea sometido a manipulación humana). Por tanto, "asilado" no refleja el grado al que se a purificado el compuesto.

El término "proteína" puede utilizarse de manera intercambiable con el término "polipéptido", aunque el último término típicamente se usa para referirse a proteínas relativamente pequeñas que tienen estructura secundaria sustancialmente lineal. El término "proteína" o "polipéptido" incluye proteínas de longitud completa, proteínas de fusión, o cualquier homólogo de dicha proteína.

La expresión "homólogo de una proteína CAF" (es decir, un "homólogo de CAF") incluye proteínas CAF en las que al menos uno o unos pocos, pero sin limitación a uno o unos pocos, aminoácidos se han eliminado (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o fragmento), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, por glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, fenilación, palmitación, amidación y/o adición de glucofosfatidil inositol). Preferiblemente, un homólogo de CAF tiene actividad biológica de CAF.

La expresión "biológicamente activo" o "actividad biológica" con respecto a una proteína CAF de la presente invención se refiere a cualquier actividad funcional de una proteína CAF y, típicamente, una actividad funcional de una proteína CAF de origen natural. En particular, una referencia a la actividad biológica de una proteína CAF se refiere preferiblemente a la capacidad de una proteína CAF de regular positivamente (inducir, estimular, potenciar, aumentar) la expresión de una citoquina que incluye el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta), y/o interleuquina-6 (IL-6). Se observa que CAF de origen natural como se describe con detalle en este documento puede regular positivamente la expresión de TNF\alpha, IL-1\beta e IL-6. La actividad biológica de CAF también puede incluir una capacidad de regular negativamente (inhibir, disminuir, suprimir) la expresión del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta). Una actividad biológica de un proteína CAF también puede incluir, aunque sin limitación, una capacidad de CAF de unirse a un receptor o a otra proteína, ADN, un resto carbohidrato o un resto lipídico, que da como resultado o contribuye a una de las actividades biológicas identificadas anteriormente.

Una "subunidad biológicamente activa" de una proteína es una porción (es decir, fragmento, dominio o monómero) de la proteína que tiene actividad biológica de la proteína de longitud completa o multímero.

El término "mimético" se usa para referirse a cualquier péptido o compuesto no peptídico que es capaz de mimetizar la acción biológica de un péptido de origen natural, a menudo porque el mimético tiene una estructura básica que mimetiza la estructura básica del péptido de origen natural y/o tiene las propiedades biológicas sobresalientes del péptido de origen natural. Los miméticos pueden incluir, aunque sin limitación: péptidos que tienen modificaciones sustanciales del prototipo tales como similitud de cadena lateral con el péptido de origen natural (dichas modificaciones, por ejemplo, pueden disminuir su susceptibilidad a la degradación); anticuerpos anti-idiotípicos y/o catalíticos, o fragmentos de los mismos; porciones no proteicas de una proteína asilada (por ejemplo, estructuras de carbohidrato); o moléculas orgánicas sintéticas o naturales, incluyendo ácidos nucleicos y fármacos identificados por química de combinación, por ejemplo.

En término "estable" con respecto a una proteína de la presente invención, se refiere a la capacidad de una proteína de ser resistente a la degradación causada por aumentos o disminuciones de la temperatura, por aumentos o disminuciones del pH, por aumentos o disminuciones de las concentraciones salinas, por oxidación y/o reducción, por desaminación, y/o resistentes a otras formas de degradación química y a degradación proteolítica. Más específicamente, una proteína se determina que es estable a cualquier condición dada por detección de cualquier nivel que se pueda medir de actividad biológica de la proteína, preferiblemente por detección de la capacidad de la proteína de lograr cualquier aumento que se pueda medir en la expresión de TNF\alpha, IL-1\beta o IL-6 por una célula. Preferiblemente, una proteína que se considera que es estable mantiene al menos el 10% de su actividad biológica después de exposición a una condición dada, y más preferiblemente, al menos el 25%, y más preferiblemente al menos el 50%, en comparación con su actividad biológica antes de la exposición a la condición (por ejemplo, su actividad biológica en condiciones normales). La estabilidad de una proteína puede referirse a la capacidad de la proteína de ser estable, como se ha descrito anteriormente, durante el almacenamiento o durante el uso.

La expresión "molécula de ácidos nucleicos" se refiere principalmente a la molécula de ácidos nucleicos física y la expresión "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácidos nucleicos. Sin embargo, las dos expresiones pueden usarse de manera intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácidos nucleicos, o una secuencia de ácidos nucleicos, que es capaz de codificar una proteína.

La expresión "molécula recombinante" o "molécula de ácidos nucleicos recombinante" se refiere principalmente a una molécula de ácidos nucleicos unida de manera operativa a una secuencia de control de la transcripción.

La expresión "unido de manera operativa" se refiere a la unión de una molécula de ácidos nucleicos a una secuencia de control de la trascripción de un modo tal que la molécula es capaz de expresarse cuando se transfecta (es decir, se trasforma, transduce, transfecta, conjuga o dirige) en una célula huésped.

La expresión "secuencia de control de la transcripción" se refiere a cualquier secuencia que controla el inicio, la elongación y la terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son las que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras.

El término "transfección" se usa para referirse a cualquier procedimiento por el cual una molécula de ácidos nucleicos exógena (es decir, una molécula de ácidos nucleicos recombinante) puede insertarse en una célula. El término "transformación" puede usarse de manera intercambiable con el término "transfección" cuando dicho término se usa para referirse a la introducción de moléculas de ácidos nucleicos en células microbianas, tales como bacterias y levaduras. En sistemas microbianos, el término "transformación" se usa para describir un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo al término "transfección". Sin embargo, en células animales, la transformación ha adquirido un segundo significado que puede referirse a cambios en las propiedades de crecimiento de células en cultivo después de que lleguen a ser cancerosas, por ejemplo. Por lo tanto, para evitar la confusión, el término "transfección" se usa preferiblemente con respecto a la introducción de ácidos nucleicos exógenos en células animales, y el término "transfección" se usará en este documento para abarcar en líneas generales tanto la transfección de células animales como la transformación de células microbianas, hasta el punto de que los términos pertenecen a la introducción de ácidos nucleicos exógenos en una célula. Por lo tanto, las técnicas de transfección incluyen, aunque sin limitación, transformación, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.

El término "contiguo" o "consecutivo", con respecto a secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos descritas en este documento, se usan de manera intercambiable y se refieren a que están conectadas en una secuencia continua. Por ejemplo, para que una primera secuencia comprende 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, significa que la primera secuencia incluye una secuencia continua de 30 restos de aminoácidos que es 100% idéntica a una secuencia continua de 30 restos de aminoácidos en la segunda secuencia. De manera similar, para una primera secuencia que tenga un "100% de identidad" con una segunda secuencia significa que la primera secuencia coincide exactamente con la segunda secuencia sin huecos entre nucleótidos o aminoácidos.

Una referencia a un porcentaje (%) de identidad, salvo que se especifique lo contrario, se refiere a una evaluación de homología entre dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos que se realiza usando: (1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), usando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácidos nucleicos con parámetros por defecto convencionales, donde la secuencia problema se filtra para regiones de complejidad baja por defecto (descrito en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schääffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); (2) un alineamiento BLAST 2 (usando los parámetros descritos a continuación) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST); o (3) tanto BLAST 2.0 como BLAST 2. Se observa que debido a algunas diferencias en los parámetros convencionales entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BALST 2, dos secuencias específicas podrían reconocerse como que tienen homología significativa usando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias como secuencia problema podría no identificar la segunda secuencia en las coincidencias superiores. Por lo tanto, debe entenderse que el porcentaje de identidad puede determinarse usando uno o ambos de estos programas, pero preferiblemente, usando BLAST 2.0 Basic BLAST. Pueden alinearse dos secuencias específicas a otra usando secuencia BLAST 2 como se describe en Tatusova y Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. El alineamiento de secuencia BLAST 2 se realiza en blastp o blastn usando el algoritmo BLAST 2.0 para realizar una búsqueda Gapped BLAST (BLAST 2.0) entre las dos secuencias permitiendo la introducción de huecos (deleciones e inserciones) en el alineamiento resultante. Para propósitos de claridad en este documento, el alineamiento de secuencia BLAST 2 se realiza usando los siguientes parámetros por defecto convencionales:

Para blastn, usando la matriz 0 BLOSUM62:

Recompensa por coincidencia = 1

Penalización por falta de coincidencia = -2

Penalizaciones por abrir hueco (5) y por extensión de hueco (2)

Disminución_x de hueco (50) valor esperado (10) tamaño de palabra (11) filtro (activo)

Para blastp, usando una matriz 0 BLOSUM62:

Penalizaciones por abrir hueco (11) y por extensión de hueco (1)

Disminución_x de hueco (50) valor esperado (10) tamaño de palabra (3) filtro (activo).

La referencia a "condiciones de hibridación" se refiere a condiciones de hibridación convencionales en las que las moléculas de ácidos nucleicos se usan para identificar moléculas de ácidos nucleicos similares. Dichas condiciones convencionales se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook y col., ibid., (véase específicamente, páginas 9.31-9.62). Además, la fórmula para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para conseguir la hibridación que permita grados variados de desapareamientos de nucleótidos se describen, por ejemplo, en Meinkoth y col., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth y col., ibid. Un especialista en la técnica puede usar la fórmula de Meinkoth y col., ibid. para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para conseguir niveles particulares de desapareamientos de nucleótidos. Dichas condiciones pueden variar, dependiendo de si se están formando híbridos ADN:ARN o ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para híbridos ADN:ADN son 10ºC menos que para híbridos AND:ARN. A modo de ejemplo, en realizaciones particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para híbridos ADN:ADN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na^{+}0,9 M) a una temperatura entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 35ºC (por ejemplo, condiciones menos rigurosas), más preferiblemente, entre aproximadamente 28ºC y aproximadamente 40ºC (por ejemplo, condiciones más rigurosas), e incluso mas preferiblemente, entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente 45ºC (condiciones incluso mas rigurosas). En realizaciones particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para híbridos AND:ARN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na^{+} 0,9 M) a una temperatura entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 45ºC, más preferiblemente, entre aproximadamente 38ºC y aproximadamente 50ºC, e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 45ºC y aproximadamente 55ºC. Estos valores están basados en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos, formamida al 0% y un contenido de G + C de aproximadamente 40%. Como alternativa, T_{m} puede calcularse de manera empírica como se expone en Sambrook y col., supra, páginas 9,31 a 9,62.

La referencia a "hibridación de rigurosidad baja" (y condiciones de lavado) se refiere a condiciones que permiten el asilamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tienen al menos aproximadamente el 40% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácidos nucleicos usada como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente el 60% o menos de desapareamientos de nucleótidos como se determina usando la fórmula de Meinkoth y col., ibid.).

La referencia a "hibridación de rigurosidad moderada" (y condiciones de lavado) se refiere a condiciones que permiten el asilamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tienen al menos aproximadamente el 60% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácidos nucleicos usada como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente el 40% o menos de desapareamientos de nucleótidos como determina usando la fórmula de Meinkoth y col., ibid).

La referencia a "hibridación de rigurosidad alta" (y condiciones de lavado) se refiere a condiciones que permiten el asilamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácidos nucleicos usada como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente el 20% o menos de desapareamientos de nucleótidos como se determina usando la formula de Meinkoth y col., ibid.)

La referencia a "hibridación de rigurosidad muy alta" (y condiciones de lavado) se refiere a condiciones que permiten un asilamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tienen al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácidos nucleicos usada como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente el 10% o menos de desapareamientos de los nucleótidos como se determina usando la fórmula de Meinkoth y col., ibid.).

El término "modular" o derivados de dicho término, significa cambiar, regular o variar de un estado a otro, e incluye un aumento o disminución que se puede medir u observar en cualquier característica que se puede medir y/o un cambio de una característica a otra característica diferente.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a excipientes, formulaciones farmacéuticamente aceptables y/o vehículos de liberación farmacéuticamente aceptables, que son apropiados para usar en la administración de una composición de la presente invención en un sitio apropiado in vitro, ex vivo o in vivo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden posibilitar a las composiciones de la presente invención que se produzcan/proporcionen en cualquier forma apropiada de uso, incluyendo, aunque sin limitación, un líquido, un aerosol, una cápsula, un comprimido, una píldora, un polvo, un gel y un gránulo. Algunos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen células, membranas, formulaciones lipídicas (incluyendo líquidos que, en la administración a un paciente, forman un sólido o un gel in situ), formulaciones de anticuerpo, productos alimenticios (por ejemplo, cualquier producto o preparación comestible) y virus recombinantes. Los vehículos preferidos son también biodegradables (es decir, bioerosionables).

Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye excipientes o formulaciones que transportan o ayudan al transporte, pero no dirigen específicamente una composición a una célula (también mencionados en este documento como vehículos de no dirección). Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, agua, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, otras soluciones acuosas equilibradas fisiológicamente, aceites, ésteres y glicoles. Los vehículos acuosos pueden contener sustancias auxiliares apropiadas requeridas para aproximarse a las condiciones fisiológicas del receptor, por ejemplo, potenciando la estabilidad química e isotonicidad. Las sustancias auxiliares apropiadas incluyen, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, lactato sódico, cloruro potásico, cloruro de calcio, y otras sustancias usadas para producir tampón fosfato, tampón Tris y tampón bicarbonato. Las sustancias auxiliares también pueden incluir conservantes, tales como timerosal, u o-cresol, formalina y alcohol benzol.

Un "vehículo de liberación controlada" es un tipo de vehículo farmacéuticamente aceptable que es capaz de liberar una composición o proteína de la presente invención de un modo controlado en un paciente o cultivo. Una formulación de liberación controlada comprende un compuesto de la presente invención (por ejemplo, una proteína CAF (incluyendo homólogos), un anticuerpo, una molécula de ácidos nucleicos, o un mimético) en un vehículo de liberación controlada. Los vehículos de liberación controlada apropiados incluyen, aunque sin limitación, polímeros biocompatibles, otras matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones en bolo, bombas osmóticas, mecanismos de difusión, liposomas, lipoesferas, y sistemas de suministro transdérmico.

Un "vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable" es un vehículo farmacéuticamente aceptable que es capaz de suministrar una composición o proteína de la presente invención a un sitio diana. Preferiblemente, el vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable es capaz de dirigir (es decir, dirigir, suministrar selectivamente) la composición al sitio diana. Un "sitio diana" se refiere a un sitio en un paciente al que se desea suministrar una composición. Por ejemplo, un sitio diana puede ser cualquier célula o tejido que está marcado como diana por inyección directa o suministro usando vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales y naturales (por ejemplo, liposomas), anticuerpos, vectores virales u otros vehículos de suministro, incluyendo ribozimas. Los vehículos de suministro que contienen lípidos naturales incluyen células y membranas celulares. Los vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales incluyen liposomas y micelas. Cuando el compuesto es una proteína (por ejemplo, una proteína CAF), los vehículos de suministro apropiados incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos, liposomas y células (por ejemplo, una célula recombinante que expresa la proteína). Cuando el compuesto es una molécula de ácidos nucleicos recombinante, los vehículos de suministro apropiados incluyen, aunque sin limitación, liposomas, vectores virales, partículas de oro, conjugados poli-L-lisina/ADN molecular, cromosomas artificiales u otros vehículos de suministro, incluyendo ribozimas.

El término "liposoma" se refiere a un vehículo de suministro que comprende una composición lipídica que es capaz de suministrar una molécula de ácidos nucleicos o proteína a un sitio particular o seleccionado en un paciente. Un liposoma comprende una composición lipídica que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la célula marcada como diana para suministrar una molécula de ácidos nucleicos al interior de una célula. Los liposomas apropiados para usar con la presente invención incluyen cualquier liposoma. Los liposomas preferidos de la presente invención incluyen los liposomas usados habitualmente en, por ejemplo, procedimientos de suministro de genes conocidos por los especialistas en la técnica. Los liposomas más preferidos comprenden liposomas que tienen una composición de lípidos policatiónicos y/o liposomas que tienen una estructura de colesterol conjugada con polietilenglicol. Complejar un liposoma con una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención puede conseguirse usando procedimientos convencionales en la técnica.

El término "vector viral" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos aislada útil en la presente invención, en la que las moléculas de ácidos nucleicos se empaquetan en una cubierta viral que permite la entrada del ADN al interior de una célula. Pueden usarse varios vectores virales, incluyendo, aunque sin limitación, los basados en alfavirus, poxvirus, adenovirus, herpesvirus, lentivirus, virus adenoasociados y retrovirus.

El término "administrar" significa cualquier procedimiento para proporcionar una sustancia a un sujeto (por ejemplo, introducir una sustancia en un sujeto), incluyendo por administración in vivo o ex vivo. Los procedimientos de administración in vivo incluyen, aunque sin limitación, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración intracoronaria, administración intraarterial (por ejemplo, en una arteria carótida), administración subcutánea, liberación transdérmica, administración intratraqueal, administración subcutánea, administración intraarticular, administración intraventricular, inhalación (por ejemplo, aerosol), administración intracerebral, nasa, oral, intraocular, pulmonar, impregnación de un catéter, por supositorio e inyección directa en un tejido. Ex vivo se refiere a realizar parte de la etapa reguladora fuera del paciente, tal como transfectando una población de células retiradas de un paciente con una molécula recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF de acuerdo con la presente invención en condiciones tales que la molécula recombinante se expresa posteriormente por la célula transfectada, y devolver las células transfectadas al paciente. Los procedimientos para conseguir dicha transfección incluyen, aunque sin limitación, transfección, infección viral, electroporación, lipofección, transferencia bacteriana, fusión de esferoplastos, y adsorción. Los procedimientos ex vivo son particularmente apropiados cuando la célula diana puede retirarse fácilmente y devolverse al paciente.

El término "beneficio terapéutico" no necesariamente se refiere a la cura de una enfermedad o afección particular, sino que, preferiblemente abarca un resultado que puede incluir mejora de la enfermedad o afección, eliminación de la enfermedad o afección, reducción de un síntoma asociado con la enfermedad o afección, prevención o mejora de una enfermedad o afección secundaria como resultado de la aparición de una enfermedad o afección primaria (por ejemplo, cáncer metastásico como resultado de cáncer primario), y/o prevención de la enfermedad o afección.

El término "protección" con respecto a una enfermedad o afección se refiere a reducir los síntomas de la enfermedad; reducir la aparición de la enfermedad, y/o reducir la gravedad de la enfermedad. Proteger a un paciente o sujeto puede referirse a la capacidad de una composición de la presente invención, cuando se administra a un paciente, para prevenir que aparezca una enfermedad y/o curar o mejorar los síntomas, signos o causas de la enfermedad. Por tanto, proteger a un paciente de una enfermedad incluye tanto prevenir la aparición de la enfermedad y (tratamiento profiláctico) como tratar un paciente que tiene una enfermedad (tratamiento terapéutico).

El término "prevención" significa que la progresión de la enfermedad se reduce y/o elimina, o que el comienzo de la enfermedad se elimina (tratamiento profiláctico).

El término "tratamiento" significa que la aparición de los síntomas (incluyendo dolor) del trastorno y/u origen patogénico de la enfermedad a retardar, reducir, o prevenir completamente, o, si están presentes, los síntomas a mejorar o eliminar completamente. Por ejemplo, la composición de CAF trata el cáncer no sólo suprimiendo los síntomas del trastorno en humanos y otros mamíferos sino que también funcionando como agente profiláctico para contrarrestar la presencia del trastorno en el receptor.

El término "enfermedad" se refiere a cualquier desviación de la salud normal de un mamífero e incluye un estado cuando los síntomas de enfermedad están presentes, así como condiciones en las que una desviación (por ejemplo, infección, mutación génica, defecto genético, etc.) ha sucedido, pero los síntomas aún no se han manifestado.

El término "una" entidad se refiere a una o más de esas entidades. Por tanto, los términos "un", "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse de manera intercambiable en este documento.

Los términos "comprendiendo", "incluyendo", y "teniendo" pueden usarse de manera intercambiable.

Descripción de la invención

Una realización de la presente invención se refiere a una proteína Factor de Activación de Citoquinas (CAF) aislada. La referencia a una proteína CAF aislada incluye proteínas de longitud completa, proteínas truncadas (es decir, fragmentos de una proteína de longitud completa), proteínas de fusión, o cualquier homólogo de dicha proteína. Los homólogos de CAF se han definido anteriormente. Preferiblemente, un homólogo de CAF tiene actividad biológica de CAF, también definido anteriormente. Específicamente, una proteína CAF de la presente invención preferiblemente tiene una actividad biológica que incluye una capacidad de regular positivamente (aumentar, estimular, inducir, potenciar) la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y/o interleuquina-6 (IL-6) y/o una capacidad de regular negativamente (disminuir, inhibir, prevenir, reducir) la expresión del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta). Dicha actividad biológica puede medirse por cualquier procedimiento apropiado para medir la actividad de citoquinas en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, inmunoensayos (incluyendo ensayos inmunoabsorbentes de enzimas unidas, o ELISA), radioinmunoensayos, y ensayos de ARN (Véanse los Ejemplos). La actividad biológica de una proteína CAF también puede incluir, aunque sin limitación: una capacidad de CAF para unirse a un receptor o a otra proteína, ADN, un resto carbohidrato o un resto lipídico, que da como resultado o contribuye a una de las actividades biológicas identificadas anteriormente. Los procedimientos para medir la capacidad de una proteína de unirse a otro resto pertenecen a la capacidad de un especialista en la técnica. Además, usando las directrices proporcionadas en este documento, está en la capacidad de un especialista en la técnica hacer modificaciones en la secuencia de ácidos nucleicos y/o aminoácidos de CAF tipo silvestre (por ejemplo, aminoácidos de SEC ID Nº: 1 ó 6) y ensayar homólogos que tienen dichas modificaciones para una o más actividades biológicas de CAF. Por ejemplo, los procedimientos para determinar la capacidad de CAF para inducir o inhibir la expresión de citoquinas se describen en la sección de Ejemplos.

La referencia a una proteína CAF aislada puede incluir una proteína CAF que se ha purificado sustancialmente de una fuente natural (por ejemplo, un huevo hiperinmune de acuerdo con la presente invención), CAF producido de manera recombinante y/o CAF producido de manera sintética. Una proteína CAF particularmente preferida de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6. La SEC ID Nº: 1 abarca los aminoácidos 1-30 de la SEC ID Nº: 6 y es un fragmento N-terminal de la SEC ID Nº: 6. Se cree que la SEC ID Nº: 6 es una secuencia de aminoácidos de longitud completa de una proteína CAF de la presente invención que se purificó de huevo hiperinmune.

En una realización, una proteína CAF incluye proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden al menos 9 restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 6, (es decir, 9 restos de aminoácidos contiguos que tienen el 100% de identidad con 9 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 6). Esta proteína puede referirse a un homólogo de una proteína que comprende la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6 (por ejemplo, un homólogo de CAF), pero también incluye proteínas que comprenden la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6 (por ejemplo, proteínas CAF de origen natural). En una realización preferida, una proteína CAF homóloga comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 12, y más preferiblemente al menos aproximadamente 15, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20, y más preferiblemente al menos aproximadamente 25 restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6. En otra realización preferida, un homólogo de CAF comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 30, y más preferiblemente al menos aproximadamente 35, y más preferiblemente al menos aproximadamente 40, e incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente 45, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50, y más preferiblemente al menos aproximadamente 55, y más preferiblemente al menos aproximadamente 60, y más preferiblemente al menos aproximadamente 65 restos de aminoácidos contiguos de SEC ID Nº: 6.

Un homólogo de proteína CAF puede incluir proteínas codificadas por una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos 27, y preferiblemente al menos 36, y más preferiblemente al menos 45, y más preferiblemente al menos 60, y más preferiblemente al menos 75 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácido nucleico que codifica la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6. En otra realización, un homólogo de la proteína CAF puede incluir proteínas codificadas por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende al menos 90, y más preferiblemente al menos 105, y más preferiblemente al menos 120, y más preferiblemente al menos 135, y más preferiblemente al menos 150, y más preferiblemente al menos 165, y más preferiblemente al menos 180, y más preferiblemente al menos 195 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácido nucleico que codifica la SEC ID Nº: 6.

Como se ha analizado anteriormente, un homólogo de proteína CAF preferiblemente tiene una actividad biológica de CAF que se puede medir (es decir, tiene actividad biológica). Sin embargo, en algunas realizaciones, una proteína CAF, incluyendo un homólogo de CAF, se usa para la preparación de anticuerpo o el desarrollo de oligonucleótidos útiles para identificar CAF y proteínas relacionadas con CAF (por ejemplo, con el propósito de buscar/seleccionar productos de huevo hiperinmune para fracciones enriquecidas en CAF en el caso de anticuerpos u oligonucleótidos), para clonar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica CAF (en el caso de oligonucleótidos), y/o para identificar proteínas o ácidos nucleicos que se unen a CAF. En estas realizaciones, no es particularmente relevante si la proteína CAF tiene o no actividad biológica, pero sí hasta que punto tiene actividad biológica de CAF, de manera intrínseca, una proteína CAF útil para estos procedimientos.

En una realización, una proteína CAF (por ejemplo, un homólogo de proteína CAF) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65% idéntica a la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6 sobre al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 20 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 25 aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6, respectivamente. Preferiblemente, una proteína CAF comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 75%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% idéntica a la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6 sobre al menos aproximadamente 15 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 20 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 25 aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6, respectivamente. En otra realización, una proteína CAF comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un el 65%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 75%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 85%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 90%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% idéntica a la SEC ID Nº: 6 sobre al menos aproximadamente 30 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 35 aminoácidos y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 40 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 45 aminoácidos y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 55 aminoácidos, e incluso más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 60 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.

En otra realización, una proteína CAF comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65% idéntica a la SEC ID Nº: 6 sobre al menos 66 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 67 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 68 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 69 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6. Preferiblemente, una proteína CAF comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, y mas preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% idéntica a la SEC ID Nº: 6 sobre al menos 66 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 67 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 68 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 69 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6. Los procedimientos para determinar el porcentaje de identidad se han descrito anteriormente.

En otra realización, una proteína CAF, incluyendo un homólogo de proteína CAF, incluye una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es suficientemente similar a una secuencia de aminoácidos de CAF natural de modo que una secuencia de ácido nucleico que codifica el homólogo es capaz de hibridar en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta (descritas anteriormente) a (es decir, con) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína CAF natural (es decir, al complementario de la cadena de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de CAF natural). Estas condiciones se han definido anteriormente. Preferiblemente, un homólogo de una proteína CAF está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complementario de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representado por la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 6. Una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CAF de la presente invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico de la cadena de ácido nucleico que es complementaria con la cadena que codifica CAF. Se apreciará que un ADN de doble hélice que codifica una secuencia de aminoácidos dada comprenda un ADN de hélice única y su cadena complementaria que tiene una secuencia que es complementaria al ADN de hélice única. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser de doble hélice o de hélice única, e incluyen aquellas moléculas de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6, y/o con el complementario de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y/o la SEC ID Nº: 6. Los procedimientos para deducir una secuencia complementaria son conocidos por los especialistas en la técnica. Debe observarse que como las tecnologías de secuenciación de aminoácidos y secuenciación de ácidos nucleicos no están completamente libres de error, las secuencias presentadas en este documento, en el mejor de los casos, representan secuencias aparentes de una proteína CAF de la presente invención.

Los homólogos de proteína CAF pueden ser el resultado de variación alélica o natural o mutación natural. Los homólogos de proteína CAF de la presente invención también pueden producirse usando técnicas conocidas en la técnica que incluyen, aunque sin limitación, modificaciones directas de la proteína o modificaciones del gen que codifica la proteína usando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para provocar la mutagénesis aleatoria o dirigida. Una variante alélica de origen natural de un ácido nucleico que codifica CAF es un gen que sucede esencialmente en el mismo locus (loci) del genoma que el gen que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 y/o SEC ID Nº: 6, pero que, debido a las variaciones naturales causadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una secuencia similar pero no idéntica. Las variantes alélicas naturales típicamente codifican proteínas que tienen actividad similar a la de la proteína codificada por el gen al que se comparan. Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína pero tener diferentes secuencias de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas 5' o 3' del gen (por ejemplo, en regiones de control reguladoras). Las variantes alélicas son bien conocidas por los especialistas en la técnica y podría esperarse que se encontraran en una especie bacteriana dada ya que el genoma es haploide y/o entre un grupo de dos o más especies bacterianas.

Las proteínas CAF también incluyen productos de expresión de fusiones de genes (por ejemplo, usados para sobre expresar formas activa solubles de la proteína recombinante), o genes mutagenizados (tales como genes que tienen modificaciones en codones para potenciar la trascripción y traducción génica), y de genes truncados (tales como genes que tienen dominios retirados para generar fragmentos biológicamente activos o subunidades de una proteína de longitud completa). Se observa que las proteínas CAF y homólogos proteicos de la presente invención incluyen proteínas que no tienen actividad CAF. Dichas proteínas son útiles, por ejemplo, para la producción de anticuerpos.

Una proteína CAF aislada de la presente invención, incluyendo proteínas de longitud completa, proteínas truncadas, otros homólogos, y proteínas de fusión, pueden identificarse de un modo sencillo: (1) por la capacidad de la proteína de regular positivamente la expresión de TNF\alpha, IL-1\beta y/o IL-6, y/o de regular negativamente TGF\beta, tal como se ilustra en los Ejemplos; (2) por las propiedades bioquímicas y estructurales de la proteína (por ejemplo, peso molecular, estructura primaria, características de estabilidad); (3) por la unión selectiva de la proteína a un anticuerpo frente a una proteína CAF; y/o (4) por homología de la proteína con otras secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de CAF tales como a la secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de CAF de otras fuentes distintas de huevo hiperinmune. El tamaño mínimo de una proteína y/u homólogo de la presente invención es una tamaño suficiente para tener actividad biológica de CAF o, cuando no se requiere que la proteína tenga dicha actividad, suficiente para ser útil para otro propósito asociado con una proteína CAF de la presente invención, tal como para la producción de anticuerpos que se unan a una proteína CAF de origen natural. Por tanto, el tamaño mínimo de una proteína u homólogo de CAF de la presente invención es un tamaño apropiado para formar al menos un epítopo que pueda reconocerse por un anticuerpo, y es típicamente al menos de 8 a 30 aminoácidos de longitud (incluyendo cualquier longitud entre 8 y 30 en incrementos de un aminoácido), dependiendo dichos tamaños preferidos en si se desean porciones de longitud completa, porciones multivalentes (es decir, proteína de fusión que tiene más de un dominio cada uno de los cuales tiene una función), o porciones funcionales de dichas proteínas. No hay límite, sino un límite práctico, en el tamaño máximo de dicha proteína en el que la proteína puede incluir una porción de una proteína CAF (incluyendo monólogos de CAF) o un CAF de longitud completa.

La presente invención también incluye una proteína de fusión que incluye un dominio que contiene CAF (incluyendo un homólogo de una proteína CAF) unido a uno o más segmentos de fusión. Los segmentos de fusión apropiados para usar con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, segmentos que pueden: potenciar una estabilidad de la proteína; proporcionar otra actividad biológica deseable (por ejemplo, una citoquina); y/o ayudar a la purificación de una proteína CAF (por ejemplo, por cromatografía de afinidad). Un segmento de fusión apropiado puede ser un dominio de cualquier tamaño que tiene la función deseada (por ejemplo, confiere estabilidad, solubilidad, acción o actividad biológica aumentadas; y/o simplifica la purificación de una proteína). Los segmentos de fusión pueden unirse a los terminales amino y/o carboxilo del dominio que contiene CAF de la proteína y pueden ser susceptibles de escisión para posibilitar la recuperación sencilla de una proteína CAF. Las proteínas fusión se producen preferiblemente cultivando una célula recombinante transfectada con una molécula de ácidos nucleicos fusión que codifica una proteína que incluye el segmento fusión unido a el extremo terminal carboxilo y/o amino de un dominio que contiene CAF.

La presente invención también incluye un mimético de una proteína CAF. Como se usa en este documento, el término "mimético" se usa para referirse a cualquier compuesto peptídico o no peptídico que es capaz de mimetizar la acción biológica de un péptido de origen natural, a menudo porque el mimético tiene una estructura básica que mimetiza la estructura básica del péptido de origen natural y/o tiene propiedades biológicas sobresalientes del péptido de origen natural. Los miméticos pueden incluir, aunque sin limitación: péptidos que tienen modificaciones sustanciales del prototipo tales como similitud de cadena lateral con el péptido de origen natural (dichas modificaciones, por ejemplo, puede disminuir su susceptibilidad a degradación); anticuerpos anti-idiotípicos y/o catalíticos, o fragmentos de los mismos; porciones no proteicas de una proteína aislada (por ejemplo, estructuras de carbohidrato); o moléculas orgánicas sintéticas o naturales, incluyendo ácidos nucleicos y fármacos identificados a través de química de combinación, por ejemplo.

Dichos miméticos puede diseñarse, seleccionarse y/o identificarse de otro modo usando una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Diversos procedimientos de diseño de fármacos, útiles para diseñar miméticos u otros compuestos terapéuticos útiles en la presente invención se describen en Maulik y col., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc. Un mimético de CAF puede obtenerse, por ejemplo, a partir de estrategias de diversidad molecular (una combinación de estrategias relacionadas que permiten la construcción rápida de bibliotecas de moléculas químicamente diversas, grandes), bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos, en particular de bibliotecas químicas o de combinación (es decir, bibliotecas de compuestos que difieren en la secuencia o tamaño pero que tienen los componentes básicos similares) o por diseño de fármaco racional, dirigido o aleatorio. Véase por ejemplo, Maulik y col. supra.

En una estrategia de diversidad molecular, se sintetizan bibliotecas de compuestos grandes, por ejemplo, de péptidos, oligonucleótidos, carbohidratos y/o moléculas orgánicas sintéticas, usando enfoques biológicos, enzimáticos y/o químicos. Los parámetros químicos en el desarrollo de una estrategia de diversidad molecular incluyen diversidad de subunidades, tamaño molecular, y diversidad de biblioteca. El objetivo general de explorar dichas bibliotecas es utilizar una aplicación secuencial de selección de combinación para obtener ligandos de alta afinidad para una diana deseada, y después optimizar las moléculas principales por estrategias de diseño aleatorio o dirigido. Los procedimientos de diversidad molecular se describen con detalle en Maulik, y col., ibid.

Maulik y col. también describen, por ejemplo, procedimientos de diseño dirigido, en el que el usuario dirige el procedimiento de creación de moléculas nuevas a partir de una biblioteca de fragmentos apropiadamente seleccionados; diseño aleatorio, en el que el usuario usa un algoritmo genético u otro para fragmentos mutados de manera aleatoria y sus combinaciones aplicando de manera simultánea un criterio de selección para evaluar la capacidad de los ligandos candidatos; y un enfoque basado en cuadrículas en el que el usuario calcula la energía de interacción entre estructuras de receptor tridimensional y sondas de fragmentos pequeños, seguido por unión entre sí de sitios de sonda favorables.

De acuerdo con la presente invención, las proteínas CAF pueden obtenerse de cualquier animal y, particularmente, de cualquier animal de las clases de vertebrados, Mammalia o Aves. Preferiblemente, las proteínas CAF se obtienen de un animal que produce huevos de la clase de vertebrados, Aves. Las proteínas CAF preferidas incluyen proteínas CAF aisladas de pollos, pavos, o patos hiperinmunizados. Una proteína CAF asilada particularmente preferida es una proteína CAF obtenida de huevos de pollo hiperinmunizados.

Como se ha analizado anteriormente, una proteína CAF de la presente invención puede producirse por cualquier procedimiento apropiado para la producción de proteínas o polipéptidos. Un procedimiento particularmente preferido para la producción de una proteína CAF de la presente invención es por procedimientos de síntesis química. Por ejemplo, dichos procedimientos incluyen procedimientos químicos bien conocidos, tales como síntesis peptídica en solución o en fase sólida, o semisíntesis en solución comenzando con fragmentos de proteína acoplados a través de procedimientos en solución convencionales. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse en textos generales y artículos del área tal como: Merrifield, 1997, Methods Enzymol. 289:3-13; Wade y col., 1993, Australas Biotechnol. 3(6):332-336; Wong y col., 1991, Experientia 47 (11-12): 1123-1129; Carey y col., 1991, Ciba Found Symp. 158:187-203; Plaue y col., 1990, Biologicals 18(3):147-157; Bodanszky, 1985, Int. J. Pept. Protein Res. 25(5):449-474; o H. Dugas y C. Penney, BIOORGANIC CHEMISTRY, (1981) en las páginas 54-92. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse por metodología en fase sólida utilizando un sintetizador peptídico disponible en el mercado y ciclos de síntesis aportados por el fabricante. Un especialista en la técnica reconoce que la síntesis en fase sólida podría también conseguirse usando la estrategia FMOC y una mezcla de escisión TFA/eliminador.

Si se desean grandes cantidades de una proteína CAF, la proteína puede producirse usando tecnología de ADN recombinante, aunque para proteínas de tamaño más pequeño (es decir, péptidos), puede preferirse generalmente síntesis peptídica. Una proteína puede producirse de manera recombinante cultivando una célula capaz de expresar la proteína (es decir, expresando una molécula de ácidos nucleicos recombinante que codifica la proteína, descrito con detalle a continuación) en condiciones eficaces para producir la proteína, y recuperando la proteína. Las condiciones de cultivos eficaces incluyen, aunque sin limitación, medios eficaces, biorreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permiten la producción de proteína. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que una célula se cultiva para producir una proteína CAF de la presente invención. Dicho medio comprende típicamente un medio acuoso que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Las células recombinantes (es decir, células que expresan una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF) pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, en matraces de agitación, tubos de ensayo, platos de microtitulación, y placas petri. El cultivo puede realizarse a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. Dichas condiciones de cultivo pertenecen a los conocimientos de un especialista en la técnica. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1988, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York o Protocolos Actuales en Biología Molecular (1989) y suplementos.

Dependiendo del vector y sistema huésped usado para la producción, las proteínas CAF recombinantes resultantes de la presente invención pueden permanecer en la célula recombinante; pueden secretarse al medio de cultivo; pueden secretarse al espacio entre dos membranas celulares; tal como el espacio periplásmico en E. coli; o pueden retenerse en la superficie exterior de una célula o membrana viral. La expresión "recuperar la proteína" se refiere a recoger el medio de cultivo completo que contiene la proteína y no necesita implicar etapas adicionales de separación o purificación. Las proteínas CAF de la presente invención pueden purificarse usando una diversidad de técnicas de purificación de proteínas convencionales, tales como, aunque sin limitación, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial. Las proteínas de la presente invención se recuperan preferiblemente en forma "sustancialmente pura". Como se usa en este documento, "sustancialmente puro" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína como biocatalizador, otro reactivo, o para administración a un sujeto. Por ejemplo, una fracción soluble en agua que comprende CAF como se describe en el Ejemplo 1 se considera que es sustancialmente pura y es apropiada para administración a un paciente.

En otra realización mas, una proteína CAF de la presente invención puede purificarse altamente a partir de una fuente apropiada, incluyendo, aunque sin limitación, el huevo de un ave que se ha hiperinmunizado con uno o mas inmunógenos, y, en particular, antígenos bacterianos o sus equivalentes sintéticos. Se ha descubierto que el Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención está presente en huevos hiperinmunes a niveles por encima de los normales. El Factor de Activación de Citoquinas de huevo altamente purificado puede asilarse del huevo completo, la yema del huevo y la clara del huevo. El CAF altamente purificado de yema de huevo muestra actividad inmunorreguladora más alta que el CAF altamente purificado de clara de huevo.

El procedimiento de purificación a gran escala del CAF a partir de huevo típicamente emplea 40 kg de yema de huevo hiperinmune (por ejemplo, yema de huevo PL-100 o S-100 descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 5.772.999) como punto de partida. El CAF se purifica altamente usando las tecnologías de ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico en Q Sepharose, extracción en fase sólida, y procedimientos adicionales que se describen brevemente a continuación y con detalle en la sección de Ejemplos.

El Factor de Activación de Citoquinas puede purificarse altamente a partir del huevo completo, la yema del huevo o clara del huevo. Un ejemplo de un procedimiento de alta purificación preferido es el siguiente:

1. Deslipidación de la yema del huevo;

2. Preparación del permeado de 3000 Dalton de PM de la yema del huevo;

3. Separación de fracciones por cromatografía de intercambio iónico o aniónico;

4. Extracción en fase sólida;

5. Extracción por reparto de la fracción de extracción en fase sólida;

6. Separación por HPLC; y

7. Bioensayo para la actividad de inducción de citoquinas.

A continuación se proporciona una descripción más detallada de este procedimiento:

Etapa 1

El factor de Activación de Citoquinas puede purificarse altamente a partir de huevo completo, yema de huevo o clara de huevo. En una realización preferida, la composición se purifica de yema de huevo. La porción lipídica se retira del huevo completo o de la yema del huevo por procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, en el caso de polvo de yema de huevo secado por pulverización, el desengrasado puede conseguirse con disolventes (propano, butano o hexano o con disolventes binarios), CO_{2} por encima del valor crítico, enzimas y similares, y en el caso de yema de huevo líquida, el desengrasado puede conseguirse por el procedimiento de separación de ácido caprílico (CAPS) descrito por Lee (Patente de Estados Unidos Nº: 5.367.054). No es necesaria la retirada de grasas de clara de huevo, y por tanto la forma líquida o en polvo de la clara de huevo puede calentarse o disolverse por procedimientos convencionales y como se describe en los ejemplos enumerados a continuación. Después el huevo completo, la yema de huevo o la clara de huevo se procesa preferiblemente en forma líquida o en polvo, y se procesa adicionalmente para obtener fracciones solubles en agua. (Véanse los Ejemplos)

Etapa 2

Las fracciones solubles en agua resultantes, del huevo completo, yema de huevo o clara de huevo, se someten a ultrafiltración usando sistemas de ultrafiltración equipados con una membrana de punto de corte de 3.000 Dalton de peso molecular. Los procedimientos de ultrafiltración separan moléculas que tienen un peso molecular de más de aproximadamente 3.000 Dalton de los que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 3.000 Dalton. Se observa que el punto de corte de 3.000 Dalton es aproximado, ya que pueden pasar proteínas significativamente más grandes a través del filtro si la estructura secundaria lo permite (es decir, polipéptidos/proteínas sustancialmente lineales). Una vez filtrados, los ultrafiltrados resultantes contienen moléculas de menos de aproximadamente 3.000 Dalton de peso molecular (o superior, polipéptidos sustancialmente lineales), que después se liofilizan, se pesan, y se preparan para ensayar los bioensayos y separación adicional.

Etapas 3-7

Estas etapas se exponen con detalle en el Ejemplo 1 y las Figuras y no se repetirán.

El Factor de Activación de Citoquinas altamente puro de la presente invención tiene las siguientes características físicas/químicas (es decir, características que se identifican):

a. tiene al menos una subunidad biológicamente activa que pasa a través del filtro de ultrafiltración de punto de corte de 3.000 Dalton de peso molecular;

b. es estable (es decir, tiene actividad biológica que se puede medir) a una temperatura de hasta al menos aproximadamente 50ºC;

c. es estable (es decir, tiene actividad biológica que se puede medir) a un pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 10;

d. es soluble en agua;

e. es no esteroideo;

f. está cargado negativamente;

g. es sustancialmente no polar; y,

h. tiene un \lambda_{max} a aproximadamente 254 nm.

Además, el Factor de Activación de Citoquinas altamente puro de la presente invención tiene las siguientes características bioquímicas/funcionales:

a. tiene actividad inmunorreguladora en un animal sujeto;

b. está presente tanto en clara de huevo como en yema de huevo de huevos de ave;

\newpage

c. cuando se asila de yema de huevo, tiene típicamente actividad inmunorreguladora más alta que cuando se asila de clara de huevo;

d. induce la expresión de citoquinas in vitro y, particularmente, induce la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y/o interleuquina-6 (IL-6) in vitro; y/o

e. regula negativamente la expresión del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta).

Además, la proteína CAF de la presente invención puede tener la capacidad de inducir la diferenciación de células de la línea de macrófagos y/o monocitos.

El peso molecular de 3.000 Dalton se deduce del aislamiento y purificación de la composición donde el procedimiento de asilamiento y purificación usa una membrana de ultrafiltración que no permite el paso de especies moleculares mayores de 3.000 Dalton a su través. En un principio se sospechó que el Factor de Activación de Citoquinas altamente purificado no era proteico ni esteroideo a causa de su pequeño tamaño y porque no se degrada por enzimas que degradan proteínas (en base a ensayos in vivo donde la proteína mostró actividad biológica después de administrase por vía oral, y exponiéndose de este modo a enzimas digestivas). Además, la composición es activa por vía oral. Sin querer unirse a una teoría, se cree que la forma pequeña estable del Factor de Activación de Citoquinas altamente purificado (a diferencia de muchas proteínas que son mucho más grandes) facilita su absorción a partir del tracto digestivo. Finalmente, el Factor de Activación de Citoquinas altamente purificado es estable a calor, una característica que no se encuentra típicamente en la mayoría de las proteínas. Sin embargo, se sabe que el Factor de Activación de Citoquinas altamente purificado es de hecho una proteína que tiene las características de estabilidad identificadas anteriormente. Dicho descubrimiento fue sorprendente y demuestra adicionalmente las ventajas del Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención como altamente apropiado para la inclusión en formulaciones, alimentos procesados, y vacunas, incluyendo vacunas y formulaciones orales.

Realizaciones adicionales de la presente invención incluyen moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína CAF. Una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención incluye una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de las proteínas CAF aisladas, incluyendo un homólogo de CAF, descrito anteriormente. Una molécula de ácidos nucleicos de CAF preferida de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 9, y más preferiblemente al menos 12, y más preferiblemente al menos aproximadamente 15, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20, y más preferiblemente al menos aproximadamente 25 restos de aminoácidos contiguos de SEC ID Nº: 1 y/o SEC ID Nº: 6. En otra realización, una molécula de ácidos nucleicos de CAF preferida comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 30, y más preferiblemente al menos aproximadamente 35, y más preferiblemente al menos aproximadamente 40, e incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente 45, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50, y más preferiblemente al menos aproximadamente 55, y más preferiblemente al menos aproximadamente 60 y más preferiblemente al menos aproximadamente 65 restos de aminoácidos contiguos de SEC ID Nº: 6.

En una realización, dichas moléculas de ácidos nucleicos incluyen moléculas de ácidos nucleicos aisladas que hibridan en condiciones de rigurosidad moderada, y más preferiblemente en condiciones de rigurosidad alta, e incluso más preferiblemente en condiciones de rigurosidad muy alta, con el complementario de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un CAF de origen natural (es decir, incluyendo variantes alélicas de origen natural que codifican un CAF). Preferiblemente, una molécula de ácidos nucleicos aislada que codifica una proteína CAF de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida en condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta con el complementario de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 1 y/o SEC ID Nº: 6.

En una realización de la presente invención, una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65% idéntica a SEC ID Nº: 1 y/o SEC ID Nº: 6 sobre al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 20 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 25 aminoácidos de SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 6, respectivamente. Preferiblemente, una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 75%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% idéntica a SEC ID Nº: 1 y/o SEC ID Nº: 6 sobre al menos aproximadamente 15 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 20 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 25 aminoácidos de SEC ID Nº: 1 y/o SEC ID N: 6, respectivamente. En una realización, una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, y más preferiblemente, al menos el 75%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente el 95% idéntica a SEC ID Nº: 6 sobre al menos aproximadamente 30 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 35 aminoácidos y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 40 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 45 aminoácidos y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 55 aminoácidos e incluso más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 60 aminoácidos de SEC ID Nº: 6.

En otra realización, una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 60% idéntica a SEC ID Nº: 6 sobre al menos 66 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 67 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 68 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 69 aminoácidos de SEC ID Nº: 6. Preferiblemente, una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 65%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% idéntica a SEC ID Nº: 6 sobre al menos 66 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 67 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 68 aminoácidos, y más preferiblemente sobre al menos aproximadamente 69 aminoácidos de SEC ID Nº: 6. Los procedimientos para determinar el porcentaje de identidad se han descrito anteriormente.

De acuerdo con la presente invención, una molécula de ácidos nucleicos asilada es una molécula de ácidos nucleicos que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana) y puede incluir ADN, ARN, o derivados de ADN o ARN, incluyendo ADNc. Por tanto, "asilado" no refleja el punto hasta el que la molécula de ácidos nucleicos se ha purificado. Las moléculas de ácidos nucleicos de CAF asiladas pueden incluir, por ejemplo, genes de CAF, variantes alélicas naturales de genes de CAF, regiones codificantes de CAF o porciones de las mismas, y regiones codificantes y/o reguladoras de CAF modificadas por inserciones, deleciones, sustituciones, y/o inversiones de nucleótidos de un modo tal que las modificaciones no impiden sustancialmente la capacidad de la molécula de ácidos nucleicos de codificar un proteína CAF de la presente invención o formar híbridos estables en condiciones de rigurosidad con asilados génicos naturales. Una molécula de ácidos nucleicos asilada de la presente invención no incluye moléculas de origen natural más grandes que un gen de CAF. Por lo tanto, los cromosomas y moléculas que contienen un gen de CAF más secuencias flanqueantes adicionales no se abarcan por la presente invención. El tamaño mínimo de una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención es un tamaño suficiente para codificar una proteína que tiene actividad biológica de CAF, suficiente para codificar una proteína CAF que comprende al menos un epítopo que se une a un anticuerpo, o suficiente para formar un sonda o cebador oligonucleotídico que es capaz de formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF natural (por ejemplo, en condiciones de rigurosidad baja, moderada o alta). Por tanto, el tamaño de la molécula de ácidos nucleicos que codifica dicha proteína puede depender de la composición de ácidos nucleicos y porcentaje de homología o identidad entra la molécula de ácidos nucleicos y la secuencia complementaria así como en las condiciones de hibridación per se (por ejemplo, temperatura, concentración salina, y concentración de formamida). El tamaño mínimo de una molécula de ácidos nucleicos que se usa como cebador oligonucleotídico o como sonda típicamente es al menos aproximadamente de 12 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud si las moléculas de ácidos nucleicos son ricas en GC y al menos aproximadamente de 15 a aproximadamente 18 bases de longitud si son ricas en AT.

Una molécula de ácidos nucleicos de CAF aislada puede incluir degeneraciones. Como se usa en este documento, degeneraciones de nucleótidos se refiere al fenómeno de que un aminoácido puede estar codificado por diferentes codones nucleotídicos. Por tanto, la secuencia de ácidos nucleicos de una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF de la presente invención puede variar debido a las degeneraciones. Se observa que una molécula de ácidos nucleicos de CAF asilada de la presente invención no necesariamente tiene que codificar una proteína que tiene actividad CAF. Una molécula de ácidos nucleicos de CAF puede codificar una proteína truncada, mutada o inactiva, por ejemplo. Dichas moléculas de ácidos nucleicos y las proteínas codificadas por dichas moléculas de ácidos nucleicos son útiles en la clonación de otras moléculas de ácidos nucleicos que codifican CAF, en la detección de la presencia de CAF en una muestra, por ejemplo, o para otros propósitos tales como producción de anticuerpos.

De acuerdo con la presente invención, una referencia a un gen de CAF incluye todas las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con un gen de CAF natural (es decir, tipo silvestre), tal como regiones reguladoras que controlan la producción de proteína CAF codificada por ese gen (tal como, aunque sin limitación, regiones de control de la trascripción, traducción o post-traduccionales) así como la región codificante en sí misma. En otra realización, un gen de CAF puede ser una variante alélica de origen natural que incluye una secuencia similar pero no idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína CAF dada.

Una molécula de ácidos nucleicos de CAF asilada de la presente invención pude asilarse de su fuente natural o producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química. Los procedimientos para producir moléculas de ácidos nucleicos sintéticas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, como las proteínas CAF son proteínas relativamente pequeñas, la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada puede generarse usando aparatos de síntesis de ADN convencionales disponibles en el mercado. Como alternativa, el ADN que codifica la proteína deseada también puede crearse usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otras técnicas de clonación de ADN genómico de muchas especies y, particularmente, de huevos de animales que producen huevos. Dichas metodologías son bien conocidas en la técnica (Sambrook y col., supra).

Un homólogo de molécula de ácidos nucleicos de CAF (es decir, que codifica un homólogo de proteína CAF) puede producirse usando varios procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col.). Por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos pueden modificarse usando una diversidad de técnicas que incluyen, aunque sin limitación, mutagénesis clásica y técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, mutagénesis dirigida de sitio, tratamiento químico, escisión con enzimas de restricción, ligamiento de fragmentos de ácidos nucleicos y/o amplificación por PCR), o síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligamiento de grupos mezcla para "construir" una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos y combinaciones de las mismas. Otro procedimiento para modificar una molécula de ácidos nucleicos recombinante que codifica una proteína CAF es combinación de genes (es decir, cría molecular) (Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.605.793 para Stemmer; Minshull y Stemmer; 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290; Stemmer, 1994, P.N.A.S. USA 91:10747-10751). Esta técnica puede usarse para introducir de manera eficaz múltiples cambios positivos simultáneos en la acción de la proteína CAF. Los homólogos de moléculas de ácidos nucleicos pueden seleccionarse por hibridación con un gen de CAF o por exploración de la función de una proteína codificada por una molécula de ácidos nucleicos (por ejemplo, capacidad para aumentar la proliferación de células B).

Preferiblemente, una molécula de ácidos nucleicos es parte de una molécula de ácidos nucleicos recombinante. Dicha molécula de ácidos nucleicos recombinante comprende un vector de expresión unido de manera operativa a una molécula de ácidos nucleicos. Las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes se describen con detalle a continuación. En esta realización, la proteína CAF codificada por la molécula de ácidos nucleicos preferiblemente tiene actividad biológica de CAF. Dicha molécula de ácidos nucleicos puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un homólogo de proteína CAF, y puede, por lo tanto, mencionarse como homólogo de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un CAF de origen natural (es decir, un homólogo de secuencia de ácidos nucleicos).

Por lo tanto, una realización de la presente invención incluye una molécula de ácidos nucleicos recombinante, que incluye al menos una molécula de ácidos nucleicos asilada de la presente invención insertada en cualquier vector de ácidos nucleicos (por ejemplo, un vector recombinante) que es apropiado para clonación, secuenciación y/o manipulación de otro modo de la molécula de ácidos nucleicos, tal como expresando y/o suministrando la molécula de ácidos nucleicos en el interior de una célula huésped para formar una célula recombinante. Dicho vector contiene secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran de manera natural contiguas a las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, aunque en el vector también puede contener secuencias de ácidos nucleicos reguladoras (por ejemplo, regiones promotoras, no traducidas) que se encuentran de manera natural contiguas a las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención (analizadas con detalle a continuación). El vector puede ser de ARN o ADN, procariota o eucariota, y típicamente es un virus o un plásmido. El vector puede mantenerse como elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o puede integrarse en el cromosoma. El vector por completo puede permanecer en el lugar en una célula huésped, o en ciertas condiciones, el ADN plasmídico puede eliminarse, no llevando consigo la molécula de ácidos nucleicos de la presente invención. La molécula de ácidos nucleicos integrada puede estar bajo el control de un promotor cromosómico, bajo el control de un promotor nativo o plasmídico, o bajo el control de una combinación de varios promotores. Puede integrase una única copia o múltiples copias de la molécula de ácidos nucleicos en el cromosoma de la célula huésped.

Típicamente, una molécula recombinante incluye una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención uncida de manera operativa a una o más secuencias de control de la trascripción. Dichos términos se han definido anteriormente. Como se usa en este documento, la expresión "molécula recombinante" o "molécula de ácidos nucleicos recombinante" se refiere principalmente a una molécula de ácidos nucleicos o secuencia de ácidos nucleicos unida de manera operativa a una secuencia de control de la transcripción, pero puede usare de manera intercambiable con la expresión "molécula de ácidos nucleicos", cuando dicha molécula de ácidos nucleicos es una molécula recombinante como se analiza en este documento. Las secuencias de control de la trascripción apropiadas incluyen cualquier secuencia de control de la trascripción que puede funcionar en el menos una de las células recombinantes útiles para la expresión de una proteína CAF de la presente invención. Se conoce una diversidad de dichas secuencias de control de la trascripción por los especialistas en la técnica. Las secuencias de control de la trascripción preferidas incluyen las que funcionan en células bacterianas, fúngicas (por ejemplo, levaduras), de insectos, vegetales o animales.

Las moléculas recombinantes de la presente invención, que pueden ser ADN o ARN, también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras compatibles con la célula recombinante. En una realización, una molécula recombinante de la presente invención, incluyendo aquellas que están integradas en el cromosoma de la célula huésped, también contienen señales secretoras (es decir, secuencias de ácido nucleico de segmento señal) para permitir que una proteína CAF expresada se secrete a partir de la célula que produce la proteína. Los segmentos señales adecuados incluyen un segmento señal que está asociado de forma natural con una proteína CAF de la presente invención o cualquier segmento heterólogo capaz de dirigir la secreción de una proteína CAF de acuerdo con la presente invención. En otra realización, una molécula recombinante de la presente invención comprende una secuencia líder para permitir que se suministre una proteína CAF expresada y se inserte en la membrana de una célula huésped. Las secuencias líderes adecuadas incluyen una secuencia líder que se asocia de forma natural con una proteína CAF de la presente invención, o cualquier secuencia líder heteróloga capaz de dirigir el suministro y la inserción de una proteína CAF en la membrana de una célula.

Un tipo de molécula recombinante, referida en este documento con un virus recombinante, incluye una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención que se empaqueta en una cubierta viral y que puede expresarse en una célula tras el suministro del virus a la célula. Pueden usarse varias partículas de virus recombinantes, incluyendo, pero no de forma limitante, aquellas basadas en alfavirus, baculovirus, poxvirus, adenovirus, herpesvirus y retrovirus.

Pueden usarse una o más moléculas recombinantes de la presente invención para producir un producto codificado (por ejemplo, una proteína CAF) de la presente invención. En otra realización, un producto codificado se produce expresando una molécula de ácido nucleico como se describe en este documento en condiciones eficaces para producir la proteína Un procedimiento preferido para producir una proteína codificada es transfectar una célula huésped con una o más moléculas recombinantes para formar una célula recombinante. Las células hospedadoras adecuadas para transfectar incluyen, pero no de forma limitante, cualquier célula bacteriana, fúngica (por ejemplo, de levadura), de insecto, vegetales o animales que pueden ser transfectadas. Las células huésped pueden ser células no transfectadas o células que ya han sido transfectadas con al menos una molécula de ácido nucleico.

La presente invención también incluye anticuerpos aislados (es decir, sacados de su medio natural) capaces de unirse de forma selectiva a una proteína CAF de la presente invención (incluyendo homólogos de CAF) o a un mimético de ésta (por ejemplo, anticuerpos CAF). Según se usa en este documento, la expresión "unirse de forma selectiva" se refiere a la capacidad de anticuerpos de la presente invención para unirse de forma preferente a proteínas específicas de la presente invención y a miméticos de éstas. La unión puede medirse usando diversos procedimientos convencionales en la técnica incluyendo inmunoensayos enzimáticos (por ejemplo, ELISA), ensayos de inmunotransferencia, etc, véase, por ejemplo, Sambrook y col, ibid. En una realización, un anticuerpo CAF se une preferiblemente de forma selectiva a una proteína CAF de modo que reduce la actividad de esta proteína, tal como bloqueando la capacidad de la proteína para unirse al receptor (es decir, un receptor de CAF), a otra proteína y a una molécula de ácido nucleico, o alterando de algún modo su mecanismo de acción.

Los anticuerpos aislados de la presente invención pueden incluir el suero que contiene estos anticuerpos, o anticuerpos que han sido purificados en diverso grado. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales, equivalentes funcionales tales como fragmentos de anticuerpos y anticuerpos genéticamente modificados, incluyendo anticuerpos de cadena única o anticuerpos quiméricos, incluyendo anticuerpos biespecíficos que pueden unirse a más de un epítope.

Un procedimiento preferido para producir anticuerpos de la presente invención incluye (a) administrar a un animal una cantidad eficaz de una proteína, péptido o mimético de ésta de la presente invención para producir los anticuerpos y (b) recuperar los anticuerpos. El otro procedimiento, los anticuerpos de la presente invención se producen de forma recombinante usando técnicas como las descritas anteriormente en este documento para producir proteínas CAF de la presente invención. Los anticuerpos obtenidos contra proteínas o miméticos definidos puede tener ventajas ya que estos anticuerpos no están contaminados de forma sustancial con anticuerpos contra otras sustancias que pudieran por otro lado causar interferencias en un ensayo diagnóstico, un ensayo de análisis o efectos secundarios si se usan en una composición terapéutica.

Otra realización de la presente invención se refiere a una composición que comprende un Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención. Preferiblemente, una composición que también incluya un vehículo farmacéuticamente aceptable, el cual se ha definido anteriormente. De acuerdo con la presente invención, una "composición" incluye cualquier composición (formulación, producto) que comprende un Factor Activador de Citoquinas de la presente invención, en el que CAF está presente en la composición de forma purificada, producida de forma recombinante, producida de forma química, sustancialmente purificada (es decir, cualquier huevo hiperinmune que ha sido purificado en cualquier grado que aumente la cantidad de CAF en comparación con otros componentes de producto del huevo), o cualquier otra forma enriquecida de CAF, en particular en comparación con los productos del huevo hiperinmune en ausencia de cualquier selección o procedimientos de de análisis de CAF (por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.772.999). Por tanto, una composición de la presente invención no abarca los productos del huevo hiperinmune, en ausencia de selección o análisis de cantidades enriquecidas de CAF en comparación con la cantidad media de CAF en los productos del huevo hiperinmune, o en ausencia de cualquier otro medio de enriquecer el contenido en CAF en el producto del huevo. Así, una composición que incluye un producto del huevo hiperinmune conteniendo CAF de acuerdo con la presente invención, puede seleccionarse, analizarse o producirse de forma enriquecida, por ejemplo por: análisis del procedimiento de inmunización para seleccionar animales hiperinmunizados y/o productos del huevo hiperinmune que contengan cantidades más altas estadísticamente significativas de CAF que la media del producto del huevo hiperinmune; por análisis de contenidos de CAF más altos estadísticamente significativos en los productos hiperinmunizados en comparación con las cantidades medias de CAF en los productos del huevo hiperinmune, o enriqueciendo el producto del huevo en CAF (por ejemplo por fraccionamiento, purificación o complementación con CAF exógeno).

Por tanto, en una realización, la composición de la invención se dirige especialmente a la producción de composiciones que comprenden huevo hiperinmune y cualquier producto producido a partir de éste (es decir, productos alimenticios y productos no alimenticios), que estén enriquecidos en el Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención, que es útil en la modulación del sistema inmune. Siendo naturales, estos productos alimenticios pueden usarse para modular el sistema inmune sin temor a efectos secundarios, excepto, por supuesto, por reacciones alérgicas sufridas por aquellos con intolerancia a los huevos. Preferiblemente, el huevo hiperinmune se obtiene a partir de un huevo producido por un animal, y más preferiblemente, un ave, que ha sido hiperinmunizado con al menos un inmunógeno. El producto del huevo hiperinmune puede seleccionarse, analizarse o producirse para que tenga un contenido de CAF más alto estadísticamente significativo (por ejemplo, p>0,05) que un contenido medio de los huevos hiperinmunizados de las mismas existencias del animal que produce huevos inmunizado con los mismos o diferentes inmunógenos. El producto del huevo hiperinmune preferiblemente se separa adicionalmente en fracciones enriquecidas en CAF, tales como aquellas descritas en el Ejemplo 1.

A modo de ejemplo, pueden analizarse varios lotes de productos de huevo hiperinmune para seleccionar aquellos productos de huevo hiperinmune con el nivel más elevado de Factor de Activación de Citoquinas por peso seco del producto de huevo. De forma alternativa, puede seguirse el procedimiento de hiperinmunización (por ejemplo, tomado muestras de los productos del huevo durante el procedimiento de inmunización) de modo que se alcance la producción máxima del Factor de Activación de Citoquinas. Los procedimientos para detectar el Factor de Activación de Citoquinas incluyen, pero no de forma limitante, purificación y cuantificación del factor en el producto, tal como por cualquier procedimiento de purificación y cuantificación de proteína adecuado (Véase la sección de Ejemplos para un ejemplo de procedimiento de purificación). En una realización, la cantidad de Factor de Activación de Citoquinas en un producto de huevo hiperinmune se detecta usando un anticuerpo de la presente invención que se une de forma selectiva a la proteína en la muestra de huevo.

Además, el producto del huevo puede fraccionarse y/o purificarse para enriquecer en presencia del Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención en relación con los otros componentes del producto del huevo o para aumentar la cantidad de CAF (por ejemplo, en peso) en el producto final en comparación con la cantidad de CAF en el producto de huevo inicial. Preferiblemente, la cantidad de Factor de Activación de Citoquinas en una fracción o producto purificado está enriquecida en al menos aproximadamente el 5%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente el 10%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente el 25%, más preferiblemente en al menos aproximadamente el 50%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente el 75%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente el 100%, en comparación con la cantidad de Factor de Activación de Citoquinas presente en el producto alimenticio hiperinmunizado no purificado. Incluso más preferiblemente, la cantidad de Factor de Activación de Citoquinas en una fracción o producto purificado está enriquecida en comparación con una cantidad de Factor de Activación de Citoquinas en el producto inicial en al menos aproximadamente 2 veces, y más preferiblemente en al menos aproximadamente 3 veces, y más preferiblemente en al menos aproximadamente 5 veces, y más preferiblemente en al menos aproximadamente 10 veces, y más preferiblemente en al menos aproximadamente 50 veces, y más preferiblemente en al menos aproximadamente 100 veces, e incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente 500 veces. En una realización, el Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención se purifica a una pureza sustancialmente del 100%, de modo que puede añadirse con un factor sustancialmente puro a cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento. En otra realización, el Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención se produce de forma recombinante o sintética, como se discute en otra parte del presente documento.

El procedimiento de hiperinmunización de un animal que produce huevos se describe brevemente a continuación. El huevo hiperinmunizado o el producto del huevo puede producirse en cualquier animal que produce huevos. Se prefiere que el animal que produce huevos sea un miembro de la clase Aves o, en otras palabras, un ave. Dentro de la clase Aves, se prefieren las aves de corral domesticadas, pero otros miembros de esta clase, tales como pavos, patos, y gansos, son fuente adecuada de productos de huevo hiperinmune.

Cuando estos animales productores de huevos se llevan a un estado específico de inmunización por medio de, por ejemplo, administraciones periódicas de reinmunización de inmunógenos, los animales producirán huevos que, cuando un sujeto los consuma, tendrán propiedades beneficiosas, incluyendo niveles por encima de lo normal del Factor de Activación de Citoquinas, que son eficaces para la modulación del sistema inmune de este sujeto.

La sola inducción de sensibilidad inmune en el animal que produce huevos es insuficiente para provocar la aparición de niveles por encima de lo normal del Factor de Activación de Citoquinas en huevos, como se demuestra por el hecho de que los huevos de mesa no contienen tales niveles por encima de lo normal, incluso si las aves se ha sensibilizado contra diversos inmunógenos durante la inmunización normal contra enfermedades de aves y durante la exposición normal a factores medioambientales. Se ha encontrado que los huevos tiene niveles deseados por encima de lo normal del Factor de Activación de Citoquinas sólo en los estados hiperinmunes específicos.

Este estado especial de hiperinmunización, en el que el huevo contendrá niveles altos del Factor de Activación de Citoquinas, se alcanza preferiblemente administrando una inmunización inicial, seguida de reinmunizaciones periódicas con dosis suficientemente altas de inmunógenos específicos o mezclas de inmunógenos. La dosificación preferida de inmunización puede ser igual o mayor del 50% de la dosificación necesaria para producir la inmunización primaria del ave. De esta manera, ésta es una dosificación umbral de reinmunización por debajo de la cual no se producen las propiedades en el huevo del ave, incluso aunque el ave esté en lo que normalmente puede llamarse un estado inmune. Conociendo el requerimiento de desarrollar y mantener un estado hiperinmune, está en el especialista en la técnica variar la cantidad de inmunógeno administrado, dependiendo de los géneros de animales que producen huevos y de la raza empleada, para mantener al animal en el estado hiperinmune. Además, con el conocimiento sobre CAF proporcionado por la presente invención, el procedimiento de inmunización puede modificarse de forma adicional, tal como incrementando el número o dosificación de las reinmunizaciones, o seleccionando inmunógenos específicos, lo que tiene como resultado el aumento de la producción de CAF en comparación con la media del huevo hiperinmune que no se expone a estos procedimientos de selección/análisis.

El estado hiperinmune se produce preferiblemente por cualquier inmunógeno o combinación de inmunógenos. La hiperinmunización se alcanza preferiblemente por exposición múltiple a inmunógenos múltiples, exposición múltiple a antígenos individuales o exposiciones únicas a bibliotecas de inmunógenos. Puede usarse prácticamente cualquier inmunógeno para inducir el estado hiperinmune, incluyendo, pero no de forma limitante sustancias bacterianas, virales, de protozoos, alergenos, sustancias fúngicas o celulares.

Además de las inmunizaciones con inmunógenos que aparecen de forma natural, la inmunización también puede conseguirse usando inmunógenos derivados de forma sintética por química combinatoria. La estrategia básica es unir combinaciones múltiples de bloques de construcción química para producir una población de moléculas con diversidad. Recientemente se han desarrollado varios procedimientos para la síntesis combinatoria en fase sólida o en solución de bibliotecas de oligómeros (Fodor, S. y col., Science 251: 767 (1991); Houghton, R. y col., Nature 354:82 (1991)) así como moléculas orgánicas pequeñas (Bunin, B. y Ellman, J., J. Am. Chem. Soc. 114:10997 (1992)). La síntesis rápida de péptido múltiple y oligómero puede servir como fuente de inmunógenos derivados de forma combinatoria. Además, una estrategia alternativa podría permitir la adición de bloques de construcción orgánica de modo combinatorio a un estructura molecular para mejora la inmunogenicidad.

Pueden usarse modos alternativos de hiperinmunización de animales que producen huevos en lugar de vacunas inmunogénicas e incluyen el uso de vacunas genética. En particular, cualquier construcción de ADN (que generalmente consiste en una región promotora y una secuencia que codifica un antígeno) desencadenará una respuesta inmune. Las vacunas genéticas consisten en vectores que codifican antígenos, fragmento de ADN desnudo, ADN plasmídico, antígenos de ADN-ARN, conjugados ADN-proteína, conjugados ADN-liposoma, bibliotecas de expresión de ADN y ADN viral y bacteriano suministrados para producir una respuesta inmune. Los procedimientos de suministro de ADN incluyen bombardeo de partículas, inyección directa, vectores virales, liposomas e inyección a presión, entre otros. Cuando se aplican estos procedimientos de suministro, pueden necesitarse cantidades mucho más pequeñas y generalmente tienen como resultado una producción de inmunógeno más persistente. Cuando se usan estos procedimientos genéticos, el procedimiento preferido para introducir ADN en aves es a través de la inyección intramuscular de ADN en el músculo de la pechuga.

Los procedimientos de suministro de ADN incluyen, pero no de forma limitante, bombardeo de partículas, inyección directa, liposoma, inyección a presión (Fynan, E.F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482 (1993)). Los ácidos nucleicos que codifican inmunógenos conocidos o desconocidos, regiones promotoras (en particular virus del mosaico de la coliflor CMV) y el origen bacteriano de SV40 pueden replicarse en bacterias para producir ADN plasmídico usado en las inyecciones de ADN. Aunque en pollos son efectivas varias vías de administración parenteral de ADN, el procedimiento preferido es la inyección intramuscular en el músculo de la pechuga. Los ensayos de vacunas se llevan a cabo en aves que ponen huevos, preferiblemente en pollos. Las inmunizaciones repetidas se dan a intervalos de una a dos semanas hasta seis meses.

Se prefiere que las cantidades de ADN usadas generalmente sean del orden de 50-300 \mug de ADN en solución salina para inyección directa. Para el bombardeo de partículas, se prefieren 4-100 mg de ADN coprecipitado sobre perlas de oro por adición de CaCl_{2} 2,5 M. Pueden darse inmunizaciones repetidas por vía intradérmica por este procedimiento de aceleración de partículas recubiertas de ADN en el animal vivo.

Una descripción detallada de un procedimiento preferido usado para llevar a un animal que produce huevos a un estado aumentado de inmunidad a partir del cual el huevo hiperinmune o producto de huevo pueda administrarse a un sujeto, se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.772.999.

Brevemente, el siguiente es un ejemplo del procedimiento usado para llevar a un animal que produce huevos a un estado aumentado de inmunidad para usarlo en la purificación de CAF o en la producción de un producto alimenticio enriquecido en CAF para administrar a un sujeto. Ha de entenderse que este procedimiento puede modificarse según se discute anteriormente para seleccionar o analizar la producción potenciada de CAF. En general, el procedimiento de hiperinmunización incluye las etapas de:

1. Seleccionar uno o más antígenos.

2. Provocar una respuesta inmune en el animal que produce huevos por inmunización primaria.

3. Administrar vacunas de reinmunización de antígenos de dosificación apropiada para inducir y mantener el estado hiperinmune.

4. Recoger y procesar los huevos para producir un producto de huevo hiperinmune a partir del animal que produce huevos mantenido en el estado hiperinmune.

Etapa 1

Puede emplearse cualquier antígeno o combinación de antígenos. Los antígenos puede ser bacterianos, virales, de protozoos, fúngicos, celulares o cualquier otra sustancia a la que el sistema inmune de un animal que produce huevos responderá. El punto crítico de esta etapa es que el antígeno o antígenos puedan ser capaces de inducir los estados inmune e hiperinmune en el animal que produce huevos. Una vacuna preferida es una mezcla de antígenos bacterianos polivalentes, denominada como vacuna de Serie 100 (S-100) (también denominada como PL-100). Las bacterias incluidas en la vacuna S-100 (PL-100) se enumeran en la Patente de Estados Unidos Nº 5.772.999 (Tabla 1). Esta vacuna se ha descrito previamente en las Patentes de Estados Unidos Nº: 5.106.681 y 5.215.746. Otra vacuna preferida usada es la vacuna EB-100E, cuyos detalles también se describen en el Ejemplo I de la Patente de Estados Unidos Nº 5.777.999.

Etapa 2

La vacuna puede ser una vacuna muerta o viva atenuada y puede administrarse por cualquier procedimiento que provoque una respuesta inmune. Se prefiere que la inmunización se lleva a cabo administrando los antígenos a través de inyección intramuscular. El músculo preferido para inyección en un ave es el músculo de la pechuga. La dosificación preferiblemente es de 0,5-5 miligramos de la vacuna de antígeno o antígenos. Otros procedimientos de administración que pueden usarse incluyen inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, supositorio rectal o administración oral. Cuando se usan las técnicas de ADN para los procedimientos de hiperinmunización, se requieren cantidades mucho más pequeñas, generalmente de 1-100 microgramos. Puede determinarse si la vacuna ha provocado una respuesta inmune en el animal que produce huevos a través de diversos procedimientos conocidos por los especiales en la técnica de inmunología. Los ejemplos de estos incluyen ensayos de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA), ensayos de la presencia de anticuerpos para los antígenos estimuladores y ensayos diseñados para evaluar la capacidad de las células inmunes del huésped para responder al antígeno. En general, la aparición de anticuerpos de huevo tras la inmunización con la vacuna es indicativo de una respuesta inmune. La dosificación mínima de antígeno necesaria para inducir una respuesta inmune depende del procedimiento de vacunación usado, incluyendo el tipo de antígeno o antígenos usados así como el tipo de animales productores de huevos usando como huésped.

Etapa 3

El estado hiperinmune preferiblemente se induce y mantiene por administraciones de reinmunizaciones repetidas de una dosificación apropiada a intervalos de tiempo fijos. Los intervalos de tiempo preferiblemente son intervalos de dos semanas durante un periodo de seis meses. Sin embargo, es esencial que las administraciones de reinmunizaciones no induzcan tolerancia inmune. Es posible usar otros procedimientos de mantenimiento de la hiperinmunización o combinar procedimientos, tales como, por ejemplo, inyección intramuscular para la primera inmunización e inyección intravenosa para las inyecciones de reinmunización. Procedimientos adicionales incluyen administrar simultáneamente antígeno microencapsulado y líquido, o inyección intramuscular para la inmunización primaria y dosificaciones de reinmunización por administración oral o administración parenteral por medios de microencapsulación. Los especialistas en la técnica conocen varias combinaciones de inmunización primaria e hiperinmunización.

Etapa 4

Los huevos hiperinmunes pueden procesarse por administración al sujeto o por purificación de diversas maneras. Estas incluyen la preparación de una composición que comprende el producto del huevo hiperinmune sustancialmente por si mismo (por ejemplo, en cápsulas) y la incorporación del producto del huevo hiperinmune a comidas para administración a un sujeto, o siguiendo el protocolo de purificación del Factor de Activación de Citoquinas como se describe en algún lugar de este documento.

En otras realizaciones, la composición de la presente invención puede incluir CAF en forma purificada, recombinante, sintetizada químicamente, sustancialmente purificada o cualquier otra forma enriquecida, en combinación con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados de acuerdo con la presente invención incluyen excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos de liberación controlada y vehículos de suministro farmacéuticamente aceptables como se describe anteriormente. La composición puede estar en cualquier forma adecuada para el suministro, incluyendo, pero no de forma limitante, un líquido, un aerosol, una cápsula, un comprimido, una píldora, un polvo, un gel o un gránulo. Las preparaciones del CAF que son particularmente adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones o emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.

En formas de dosificación sólida, la proteína CAF puede mezclarse con al menos un diluyente inertes tal como sacarosa, lactosa o almidón. Estas formas de dosificación también pueden comprender, como en una práctica normal, sustancias adicionales además del diluyente inerte. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprende agentes tamponadores, polímeros sensibles al pH o cualquier otro encapsulante de liberación lenta (es decir, vehículos de liberación controlada) que generalmente se usan como composiciones de encapsulamiento en la industria alimentaria y farmacéutica o cualquier otra formulación de liberación controlada. Los comprimidos y las píldoras adicionalmente pueden prepararse con un recubrimiento entérico.

Las formas de dosificación líquida del Factor de Activación de Citoquinas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables, que contienen diluyentes inertes usados normalmente en la técnica farmacéutica. Además de los diluyentes inertes, las composiciones también pueden incluir agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión y edulcorantes.

En una realización, la composición está en forma de un producto alimenticio. En esta realización, en un aspecto, el huevo enriquecido en CAF, cualquier fracción enriquecida en CAF de ésta, la CAF altamente purificada, CAF recombinante y/o CAF sintetizada químicamente se integra en un suplemento nutricional. Un procedimiento preferido para preparar el huevo, o cualquier fracción de éste, se incorpora en un suplemento nutricional que implica desecar el huevo hasta polvo. Aunque se conocen diversos procedimientos de desecado de huevos, un procedimiento preferido es el desecado por pulverización. El procedimiento de desecado de huevos por pulverización se conoce bien en la técnica. Este huevo en polvo seco puede incorporarse a bebidas en forma de, por ejemplo, proteínas en polvo, bebidas en polvo, suplementos protéicos y cualquier otro producto nutricional asociado con atletas. Además, el huevo en polvo puede usarse, en mezclas para cocción, tabletas de polvo, caramelos, galletas, etc. Otros ejemplos de procesamiento de huevo incluyen hacer una tortilla, cocer el huevo blando o duro, hornear el huevo o, si se desea, puede comerse el huevo crudo o procesado como huevo líquido. Las fracciones preferidas de un producto de huevo enriquecido en CAF de la presente invención incluyen, pero no de forma limitante: yema de huevo líquida, clara de huevo líquida, yema de huevo en polvo, clara de huevo en polvo y/o una fracción soluble en agua de dicho producto de huevo hiperinmunizado.

En una realización de la presente invención, una composición incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CAF (incluyendo un homólogo de CAF) como se describe previamente en este documento, y/o un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína CAF.

Puede suministrarse una composición de la presente invención (es decir, administrarse) a un cultivo celular (tal como en un ensayo de citoquinas) o a un paciente por cualquier procedimiento adecuado, La selección de este procedimiento variará con el tipo de compuesto administrado o suministrado (es decir, proteína, ácido nucleico, mimético), el modo de suministro (es decir, in vitro, in vivo, ex vivo) y el objetivo que se desea alcanzar por la administración/suministro del compuesto o composición. De acuerdo con la presente invención, un protocolo de administración eficaz (es decir, administrar una composición de forma eficaz) comprende parámetros de dosis y modos de administración adecuados que tiene como resultado el suministro de una composición en un lugar deseado (es decir, en una célula deseada) y/o en la regulación de una respuesta inmune en un sujeto. Preferiblemente, la composición de la presente invención se administra a un sujeto animal por cualquier medio que module el sistema inmune en el sujeto animal.

Las vías de administración incluyen vías in vivo, in vitro y ex vivo. Las vías in vivo incluyen, pero no de forma limitante, vías oral, nasal, inyección intratraqueal, inhalado, transdérmica, rectal, impregnación de un catérer, por supositorio, inyección directa en un tejido y parenteral. Las vías parenterales preferidas pueden incluir, pero no de forma limitante, vías subcutánea, intradérmica, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal. En una realización de la presente invención, una composición que contiene la proteína CAF, anticuerpo, mimético o una molécula de ácido nucleico de la presente invención se administra por una ruta parenteral. Las administraciones intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea e intramuscular pueden llevarse a cabo usando procedimientos convencionales en la técnica. También puede llevarse a cabo el suministro por aerosol (inhalación) usando procedimientos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Stribling y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992). En otra realización, se administra por vía oral una composición que comprende una proteína CAF de la presente invención. El suministro oral puede llevarse a cabo complejando una composición terapéutica de la presente invención con un vehículo capaz de resistir la degradación de las enzimas digestivas del intestino de un animal. Cabe resaltar que una proteína CAF de la presente invención es especialmente resistente a las enzimas digestivas, y por lo tanto, este vehículo puede no ser crítico. Los ejemplos de estos vehículos, incluyen cápsulas de plástico o comprimidos, tales como aquellos conocidos en la técnica. Estas vías pueden incluir el uso de vehículos farmacéuticamente aceptables como se describe anteriormente. La expresión ex vivo se refiere a llevar a cabo parte de la etapa reguladora fuera del paciente, tal como transfectando una población de células extraídas de un paciente con una molécula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleido que codifica una proteína de acuerdo con la presente invención en condiciones tales que la célula transfectada posteriormente expresa la molécula, y devolver las células transfectadas al paciente. Las vías de administración in vitro y ex vivo de una composición a un cultivo de células huésped pueden lograse por un procedimiento que incluye, pero no de forma limitante, transfección, transformación, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, fusión de protoplastos, uso de agentes que transportan proteína, uso de agentes que transportan iones, uso de detergentes para permeabilización celular y simplemente mezclar (por ejemplo, combinar) un compuesto en cultivo con una célula diana.

En una realización, los huevos hiperinmunes o fracciones de estos que están enriquecidos en el Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención y recogidos a partir de animales hiperinmunizados se procesan para producir un producto de huevo hiperinmune que posteriormente puede administrarse a un sujeto animal. En una realización, la administración tiene lugar dando de comer al sujeto animal el huevo directamente, o cualquier derivado del mismo. Es importante destacar que el huevo es un ingrediente alimenticio natural que no es tóxico y es seguro. De forma similar, en otra realización, se prefiere preparar (por ejemplo, formulado) el Factor de Activación de Citoquinas sustancialmente purificado, producido de forma recombinante o sintetizado, de forma que pueda administrarse posteriormente a un animal.

Cuando ésta lleva a la modulación de sistema inmune, la composición de la presente invención preferiblemente se administra al sujeto en una cantidad que es eficaz desde el punto de vista inmunológico para conseguir la expresión de citoquinas (por ejemplo, TNF\alpha, IL-1\beta y/o IL-6) y preferiblemente, la activación de citoquinas y la modulación inmune. La duración e intensidad del tratamiento dependerá del sujeto y afección en particular, del sujeto y si está presente, y, en este caso, del progreso de la afección en el sujeto. La composición también se proporciona en cualquier cantidad que trate y/o prevenga la afección y los síntomas de la afección. Por ejemplo, en el caso de administración de huevos hiperinmunizados enriquecidos en CAF o de productos producidos a partir de éstos, pueden administrarse al sujeto cantidades diarias que oscilan de menos de uno a varios huevos hiperinmunizados completos (o productos del huevo hiperinmunizado que contienen el equivalente de menos de uno a varios huevos hiperinmunizados completos) dependiente de las circunstancias particulares de la afección. Pueden separarse fracciones más potentes y concentrarse por procedimientos descritos en este documento así como por otros procedimientos de la técnica. Con respecto a la administración a un sujeto del huevo hiperinmune enriquecido en CAF y del producto del huevo, se ha determinado que el intervalo de dosis preferido de huevo hiperinmune o de producto del huevo para dar a un sujeto está entre 100 miligramos a 10 gramos por kilogramo del peso del sujeto.

Con respecto al Factor de Activación de Citoquinas de la presente invención, incluyendo CAF altamente purificado, CAF recombinante y/o CAF químicamente sintetizado, se ha determinado que el intervalo de dosis preferida de la composición altamente purificada está entre 1 nanogramo y 400 miligramos por kilogramo del peso del sujeto. En una realización preferida, el intervalo de dosis preferida está entre aproximadamente 0,01 microgramos y aproximadamente 100 miligramos por kilogramo del peso del sujeto. En otra realización preferida, se administra una cantidad de proteína o anticuerpo que está entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 100 \mug por kg de peso corporal del paciente.

Cuando el compuesto a suministrar es una molécula de ácido nucleico, una dosis única apropiada tiene como resultado al menos aproximadamente 1 pg de proteína expresada por mg de proteína tisular total por \mug de ácido nucleico liberado. Más preferiblemente, una dosis única apropiada es una dosis que da como resultado al menos aproximadamente 10 pg de proteína expresada por mg de proteína tisular total por \mug de ácido nucleico suministrado; e incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente 50 pg de proteína expresada por mg de proteína tisular total por \mug de ácido nucleico suministrado; y más preferiblemente, al menos aproximadamente 100 pg de proteína expresada por mg de proteína tisular total por \mug de ácido nucleico suministrado. Una dosis única preferida es una vacuna de ácido nucleico desnudo que varía entre aproximadamente 1 nanogramo (ng) a aproximadamente 100 \mug, dependiendo de la vía de administración y/o procedimiento de suministro, como puede determinarse por los especialistas en la técnica. Los procedimientos de suministro apropiados incluyen, por ejemplo, por inyección, como gotas, en aerosol y/o por vía tópica. En una realización, las construcciones de ADN puro cubren la superficie de partículas de oro (1 a 3 \mum de diámetro) y se introducen dentro de células de la piel o músculo con un "cañón génico". Será obvio para un especialista en la técnica que la cantidad de dosis administradas a un paciente depende del objetivo de la administración (por ejemplo, la extensión de la enfermedad y la respuesta de un paciente individual al tratamiento). Por lo tanto, pertenece al alcance de la presente invención que una cantidad apropiada de dosis incluye cualquier cantidad requerida para regular una respuesta inmune en un animal, o para regular una enfermedad o afección que se espera que se trate o evite por regulación positiva de citoquinas proinflamatorias (TNF\alpha, IL-1\beta, IL-6) y/o por regulación negativa de TGF\beta. Los parámetros de dosis eficaces in vivo pueden determinarse usando procedimientos convencionales en la técnica. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, determinación de tasas de supervivencia, efectos secundarios (es decir, toxicidad), determinación de efectos de respuesta inmune celular y humoral, y/o efectos en afecciones relacionadas con estos efectos de respuesta inmune.

Es una realización de la presente invención proporcionar un uso de una composición de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección bacteriana, sepsis, choque séptico o cáncer en un animal. En una realización preferida, la composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, también descrito previamente en este documento. En esta realización, la composición de la presente invención puede usarse como estimulador local o sistémico del sistema inmune. Podría también prevenirse y/o tratarse una infección bacteriana localizada y sistémica y podría emplearse como agente anticáncer general. También podría marcarse con reactivos de suministro específico como anticuerpos específicos de tejido, para suministrar a través de la vía intravenosa al sitio específico de infección bacteriana o formación tumoral. También podría mezclarse con liposomas específicos o vehículos de suministro que están disponibles en el mercado, para suministrarlo a través de la membrana citoplasmática y nuclear de la célula facilitando de ese modo la regulación de la expresión de TNF-\alpha, IL-1\beta, y/o IL-6 a nivel del ARN. Los modos apropiados de administración, incluyendo vías y dosis preferidas, se describen anteriormente. Preferiblemente, a un animal se le administra una composición de la presente invención en una dosis y por una vía apropiada para regular una respuesta inmune aumentando la expresión de TNF-\alpha, IL-1\beta, y/o IL-6 y/o disminuyendo la expresión de TGF\beta.

Una realización de la presente invención se refiere al uso de una composición de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer. Los procedimientos de administración y detalles de la composición son como se ha descrito con detalle anteriormente. Preferiblemente, la administración de la composición produce un resultado seleccionado entre el grupo compuesto por: reducción de síntomas del cáncer, reducción de un tumor asociado con el cáncer, eliminación de un tumor asociado con el cáncer, prevención de cáncer metastásico, prevención del cáncer y estimulación de inmunidad de células efectoras frente al cáncer.

Otra realización más de la presente invención se refiere al uso de una composición de la presente invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la sepsis y/o choque séptico en un animal. Los procedimientos de administración y detalles de la composición son como se ha descrito con detalle anteriormente. Preferiblemente, la administración de la composición produce un resultado seleccionado entre el grupo compuesto por: reducción de los síntomas de sepsis o choque séptico, prevención de la sepsis o choque séptico y estimulación de la inmunidad de células efectoras frente a los antígenos bacterianos asociados con la sepsis o choque séptico.

Las propiedades ventajosas de esta invención pueden observarse en referencia a los siguientes ejemplos que ilustran la invención. Estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

El siguiente ejemplo muestra la purificación, aislamiento y secuenciación del Factor de Activación de Citoquinas (CAF) de la presente invención.

Purificación del factor de activación de citoquinas Resumen global de la purificación de CAF

CAF se purificó inicialmente 600.000 veces a partir de huevo PL-100 completo en siete etapas (Fig. 16), y se mostró como un componente homogéneo en el cromatograma de HPLC. La purificación del CAF a través del procedimiento se siguió ensayando la actividad biológica in vitro de CAF en las fracciones por medio de ensayos de citoquinas (descritos posteriormente). En la primera etapa, el huevo completo se fraccionó hasta la yema del huevo. Después de la deslipidación de la yema del huevo, CAF se concentró como una fracción que permeaba a partir de 3000 Dalton (o menos) usando tecnología de ultrafiltración. Se observó que el punto límite de 3000 Dalton es aproximado, puesto que proteínas significativamente mayores pueden pasar a través del filtro si la estructura secundaria lo permite (es decir, proteínas/polipéptidos sustancialmente lineales). El permeado que pasa a través de los filtros de punto límite de 3000 de PM se aplicó en una cromatografía de Q Sepharosa para una separación adicional. CAF se presenta como una molécula cargada fuertemente negativa, que se une firmemente a la columna de Q Sepharosa y que puede eluirse con NaCl 0,3 M. En la siguiente etapa, se usó Extracción en Fase Sólida para eliminar la mayor cantidad de NaCl. Esta etapa también aumenta la purificación de CAF por la eliminación de los demás componentes polares. La fracción CAF activa de EFS contiene un componente insoluble en agua que se extrajo con acetato de etilo y etanol, dejando CAF en la fracción soluble en agua. Finalmente, CAF se separó como un componente homogéneo por HPLC en C_{18} en fase inversa y por Filtración en Gel por HPLC. El rendimiento total de la purificación de CAF se estimó en aproximadamente el 20%. La cantidad de CAF en el huevo completo se calculo como de 3-5 ppm (Tabla 1).

TABLA 1

1

Las etapas individuales del proceso de purificación se describen más en particular a continuación.

Deslipidación de la yema de huevo

La yema de huevo PL-100 desecada por pulverización contiene lípidos, proteínas, carbohidratos, cenizas y muchos factores biológicos, incluyendo CAF. Para eliminar los lípidos y las proteínas insolubles en agua, la yema de huevo se trató por extracción en fase con ácido caprílico seguido de centrifugación. CAF y otros componentes solubles en agua se obtuvieron en la fase acuosa.

El tampón de deslipidación de la yema de huevo PL-100 se preparó disolviendo 3,0 ml de ácido acético glacial y 100 ml de ácido caproico en 9 l de agua ultrapura. El pH del tampón es de aproximadamente 5,0. Los materiales de la yema de huevo (1,0 kg de huevo desecado por pulverización o 2,0 litros de yema de huevo sin cáscara) se añadieron al tampón y la mezcla se homogeneizó adicionalmente mezclando a 24.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se eliminaron los moldes y se añadieron 20 ml de ácido caprílico adicionales a la mezcla para complementar el ácido caprílico. La mezcla de huevo se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir la separación de fases. Se eliminó el floculado, y la fase acuosa de la mezcla del huevo se centrifugó a temperatura ambiente durante 20 minutos a 2.190 xg. El sobrenadante de la yema de huevo se filtró a través de papel de filtro Whatman (113V, 40 \mum). El pH del sobrenadante se ajustó a 7,5 con NaOH 2 M.

Preparación de yema de huevo permeada a través de 3.000 Dalton de PM

El sobrenadante de yema de huevo deslipidada contiene proteínas solubles en agua y CAF. CAF puede separarse de componentes de peso molecular mayor por un procedimiento de ultrafiltración. En esta preparación, el fluido sobrenadante de la yema de huevo se recogió en un recipiente de 22 l que se acopló a una unidad de filtración (3K MWCO, bomba portátil de Amicon Modelo CH2 y kit de Cartucho Adaptador en Espiral). La presión de la bomba se mantuvo a aproximadamente 30 psi (206,79 kPa) tanto en el interior como en el exterior de la filtración. Los componentes que tienen un peso molecular aparente de aproximadamente menos de 3.000 Dalton (en base a su capacidad para atravesar el filtro de 3.000 Dalton de punto límite) se recogieron como permeados y se liofilizaron hasta sequedad para su almacenamiento, o se congelaron para una purificación posterior de CAF. Se obtiene aproximadamente el 2% de la yema de huevo completa como permeado de 3.000 Dalton (también denominado en este documento como el "permeado 3K"). Se determinaron las actividades de CAF por ensayos contra TNF\alpha e IL-1\beta in vitro para seguir la presencia de la proteína CAF (Fig. 1 y 2). El permeado de 3.000 Dalton de PM de yema de huevo también se ensayó con los ensayos de la Bolsa de aire en animales y Artritis Inducida por Colágeno II (datos no mostrados). El permeado 3K se analizó por HPLC en C_{18} en fase inversa para determinar la pureza (Fig. 3).

Cromatografía de intercambio iónico en Q Sepharosa

El CAF en el permeado de 3.000 Dalton se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico en Q Sepharosa. La mayor parte de los componentes del permeado de 3.000 Dalton eran moléculas con cargas positivas y no se unían a la Q Sepharosa. Sin embargo, CAF, en este ejemplo, se unía a la Q Sepharosa y se encontró que era una molécula con una fuerte carga negativa. La purificación de CAF por Q Sepharosa fue un procedimiento muy eficaz. Para preparar la columna de Q Sepharosa, se diluyeron 2.000 ml de Q Sepharosa con 1.000 ml de H_{2}Od y se cargaron en una columna de vidrio (8 x 40 cm). La proporción de I.D. con respecto a la longitud fue de 1:5. El procedimiento cromatográfico se llevó a cabo a temperatura ambiente. La columna se equilibró con 4.000 ml de agua y 8.000 ml de acetato amónico 20 mM, pH 7,5, a un caudal de 1.500 ml/hora. Se aplicaron 20-30 l del permeado de 3.000 Dalton a la columna de Q Sepharosa con un caudal de 1.500 ml/h. La Q Sepharosa se lavó con los siguientes tampones a un caudal de 2.000 ml/h para la elución por etapas: (1) 4.000 ml de acetato amónico 20 mM, pH 7,5 para lavar la columna y eluir cualquier molécula no unida; (2) 4.000 ml de acetato amónico 300 mM, pH 6,5, para eluir cualquier molécula unida débilmente; (3) 4.000 ml de NaCl 0,3 M para eluir CAF y otras moléculas; (4) 4.000 ml de NaCl 1,5 M para eluir las moléculas unidas más firmemente y para regenerar la columna de Q Sepharosa. Se recogió una fracción de NaCl 0,3 M en un matraz después de la elución de 1.200 ml. Para una purificación adicional, la fracción de NaCl 0,3 M se aplicó para Extracción en Fase Sólida. Se determinaron de las actividades de CAF por el ensayo contra TNF\alpha e IL-1\beta in vitro (Fig. 4). El permeado de 3.000 Dalton de PM también se analizó por HPLC en C_{18} en fase inversa (Fig. 5).

Extracción en Fase Sólida (EFS)

La fracción de NaCl 0,3 M de la Q Sepharosa contenía CAF y cantidades enormes de sales. El procedimiento de Extracción en Fase Sólida (EFS) se introduce para eliminar las sales y para aumentar la pureza de CAF. La Extracción en Fase Sólida es una alternativa conveniente, barata y que ahorra tiempo de la extracción líquido/líquido. Este procedimiento se usa normalmente para limpiar y concentrar componentes con fines de análisis o aislamiento. Para aumentar la unión de CAF en EFS, la fracción de Q Sepharosa se ajustó a pH 2.0 con ácido trifluoroacético. La fracción acídica se aplica a la resina de fase inversa C_{18} en una columna (5 x 22 cm) en condiciones de interacción. La fracción de Q Sepharosa se cargó en la columna de EFS a temperatura ambiente con un caudal de 40 ml/min. La cromatografía se siguió a una longitud de onda de 254 nm. El CAF y otros componentes fueron retuvieron en el material empaquetado y la mayor parte de los contaminantes pasaron a través de la columna. La columna se lavó con 800 ml de agua, a pH 2,0 y 1.200 ml de acetonitrilo al 15% en agua, pH 2,0. CAF y otros componentes retenidos en la columna empaquetada se eluyeron de forma selectiva con acetonitrilo al 100%, pH 2,0 (Fig. 6). La fracción CAF (también denominada como la fracción de EFS) se recogió en un pequeño volumen. La CAF altamente purificada se liofilizó hasta sequedad y estuvo disponible para una purificación posterior. Se determinaron las actividades CAF por ensayo contra TNF\alpha e IL-1\beta in vitro (Fig. 7). La fracción de EFS también se analizó por HPLC en C_{18} en fase inversa (Fig. 8).

Extracción por reparto de la fracción de extracción en fase sólida

Primera etapa de la extracción por reparto (Fig. 16): Se demostró que la fracción de extracción en fase sólida de la columna de Q Sepharosa contenía un componente insoluble en agua (es decir, una fracción soluble en disolvente). Este componente se extrajo con acetato de etilo y etanol, dejando a CAF en la fracción soluble en agua (es decir, la fracción de EFS soluble en agua). Brevemente, 100 mg de la fracción de la Extracción en Fase Sólida se añadieron a 10 ml de acetato de etilo y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla se transfirió a un tubo de centrífuga de vidrio y se centrifugó a 2.190 xg durante 20 min. Se obtuvo un pequeño sedimento blanco (fracción soluble en agua de EFS) después de la centrifugación. Se eliminó el acetato de etilo y se añadieron 10 ml de un segundo acetato de etilo para repetir una vez más la etapa. Después, se mezclaron 5,0 ml de etanol con el sedimento y se centrifugaron a 2.190 xg durante 20 min.

La fracción soluble en agua de EFS mostraba inhibición de la inflamación en un modelo de artritis animal. En un ensayo in vitro, se demostró que la fracción soluble en agua de EFS (sedimento blanco después de la centrifugación) estimulaba a TNF\alpha e IL-1\beta en células THP1. Por el contrario, la fracción insoluble en agua de EFS no mostraba estas actividades en un ensayo in vitro.

Segunda etapa de extracción por reparto (Fig. 16): La fracción soluble en agua de EFS se lavó adicionalmente con 0,5 ml de NH_{4}OAc 20 mM en agua que contenían acetonitrilo al 20%, pH 7,0 y se centrifugó a 2.190 xg durante 20 min. A pH neutro, hay una fracción soluble en agua (Fig. 16, FSA a pH neutro) y una fracción insoluble en agua. La fracción insoluble en agua (a pH neutro) se liofilizó hasta sequedad para purificar CAF en un HPLC preparativo como se describe a continuación. Aunque esta fracción insoluble en agua a pH neutro es prácticamente insoluble en agua a pH neutro, se ha encontrado que es soluble en agua con pH bajo, y por tanto se denomina como la fracción soluble en agua a pH Ácido. Se confirmó que las actividades CAF contra TNF\alpha e IL-1\beta en un ensayo in vitro (Fig. 9) estaban en la FSA a pH ácido y esta fracción activa de CAF (es decir, Fig. 16, FSA a pH ácido) se analizó posteriormente por HPLC en C_{18} en fase inversa (Fig. 10). Puesto que la fracción soluble en agua de EFS (sedimento después de la centrifugación) es soluble en agua con TFA al 0,1%, pH 2,0 o en agua con pH por encima de 12,0, pero tiene pobre solubilidad en agua con pH 7,0 (1,0 mg/ml), esto sugería que la fracción soluble en agua de EFS poseía tanto un grupo amino como un grupo ácido carboxílico, que normalmente están presentes en péptidos.

Separación por HPLC en C_{18}

La fracción soluble en agua a pH Ácido de la Extracción en Fase Sólida mostraba contener un único componente, que se muestra en un cromatograma de HPLC (Fig. 11). En un estudio de inducción de citoquinas como previamente descrito, se identificó que este único pico tenía actividad CAF. Esta fracción enriquecida en CAF se separó posteriormente en tres componentes por HPLC en C_{18} en fase inversa. En esta separación, se empleó una unidad de HPLC de Shimadzu. Esta está equipada con detector de matriz de diodo SPD-M10A VP, cromatografía líquida LC-6AD, desgasificador SCL-10A VP, mezclador a baja presión LPM-600 y horno de columna CTO-10A VP. La fracción soluble en agua a pH Ácido se preparó a 1,0 mg/ml en agua pura con TFA al 0,1%. Se aplicaron 3,0 ml de la muestra en una columna C_{18} BTR IMPAQ (10 \mum, 22 x 250 ml) a 29ºC y con un caudal de 12 ml/min. Se usó un gradiente lineal de metanol de 20%-100% en H_{2}Od que contenía ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% como la fase móvil. Se recogieron las tres fracciones indicadas justo encima para aislar el CAF. Se denominaron: CAF_{0}, CAFa y CAFb. Se eliminó el acetonitrilo de las fracciones por evaporación rotatoria y el agua por liofilización. Se determinó que la fracción CAFb (47 min - 49,5 min) contenía un único pico que se identificó por el cromatograma de HPLC (Fig. 12). Esta fracción también mostraba actividades TNF\alpha e IL-1\beta en un ensayo in vitro, indicando que el CAF había sido purificado como un componente homogéneo en CAFb (Fig. 13).

Separación por filtración en gel en HPLC

Se llevó a cabo una purificación adicional de diversas fracciones de las etapas EFS y HPLC en C_{18} usando una Filtración en Gel en HPLC en el equipo de HPLC de Shimadzu como se describe anteriormente. Brevemente, se cargó una muestra en una columna de filtración en gel en HPLC (250 x 9,4 mm, series Zorbox GF-250 Bio) bajo una condición de desarrollo (Tampón: NH_{4}OAc 50 mM, pH 8,0. Caudal: 1,0 ml/min, 20ºC, 20 min). La muestra se disolvió en el tampón de desarrollo al menos a 1 mg/ml y se inyectó 30 \mul en cada tiempo de desarrollo.

Fracción soluble en agua de EFS: La fracción soluble en agua de EFS se disolvió parcialmente en tampón NH_{4}OAc 50 mM, pH 8,0 al menos a 1,0 mg/ml. Brevemente, 1,0 mg de la fracción soluble en agua de EFS se mezcló con el tampón. Después de la centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min, se recogió el sobrenadante. Después el sedimento se mezcló otra vez con el tampón. Los primeros sobrenadantes se aplicaron en una columna GF250 de HPLC para determinar sus masas moleculares. Hay tres fracciones principales en la separación de la columna GF250. Tienen 530.000 Da, 122.000 Da y 1.240 Da. Las tres fracciones se recogieron y liofilizaron hasta sequedad para el ensayo de citoquinas. Las de PM de 530.000 Da y 120.000 Da se disolvieron bien en el primer tampón de disolución, y no se encontraron en el segundo disolvente. Sin embargo, el pico de 1.240 se disolvió mejor en el segundo disolvente, lo que indica que las moléculas de 530.000 Da y 122.000 Da pueden prácticamente eliminarse disolviendo 1,0 mg de la fracción soluble en agua de EFS en el tampón. El sedimento que permanece sin disolver (es decir, EFS-FGII) es en realidad un compuesto prácticamente puro con un PM de 1.240 Da.

Fracción CAFb: La fracción CAFb de la separación por HPLC en C_{18} también se aplicó en la columna de Filtración en Gel de HPLC (GF250) para ensayar su peso molecular. Se encontró que había tres fracciones principales en la columna GF250, de 530.000 Da, 122.000 Da y 40.000 Da, respectivamente. Las moléculas de 530.000 Da y 122.000 Da pueden reducirse a una molécula mayor de 700.000 Da con 2-mercaptoetanol e hirviendo, lo que indica que la agregación puede tener lugar por cambio en el estado de óxido-reducción.

CAF_{0}, CAFa, CAFb: Para comparar los pesos moleculares de todas las fracciones CAF positivas para citoquinas de la FSA a pH ácido, CAF_{0}, CAFa y CAFb se analizaron en la columna de HPLC GF250. CAF_{0} tenía un único pico a 8,621 min (PM de 122.000 Da). CAFa tenía 2 picos a 7,27 min (PM 530.000 Da) y a 8,391 min (PM 122.000 Da). Como se discutió anteriormente, CAFb tenía un pico adicional a los 9,4823 min (40.000 Da). Las moléculas de PM de 530.000 Da y 122.000 Da pueden reducirse a una molécula de 700.000 Da, que es similar a la observada en la fracción soluble en agua de EFS. La fracción única de 40.000 Da de CAFb, sin embargo, es estable en condiciones reductoras (Tabla 2). Sin ceñirse a la teoría, esto sugiere que la molécula de PM de 40.000 de CAFb puede seguir manteniendo el sitio activo de CAF, la cual puede agregarse a partir de una molécula más pequeña de CAF activa. La fracción III aislada de CAFb (Fig. 16) (PM de 40.000 Da) de HPLC GF-250 se denominó CAFb-FGII).

TABLA 2

2

EFS-FG II: El sobrenadante de la extracción con agua de EFS también se analizó en HPLC GF-250. Se encontraron dos picos principales en la cromatografía en HPLC (8,40 min y 12,22 min). El PM de los dos picos era de aproximadamente 120.000 Da y 2.000 Da, respectivamente. La molécula de 2.000 Da no se encontró en CAF_{0}, CAFa y CAFb, lo que indica que es un compuesto diferente. Este se denominó como EFS-FG II.

Actividad biológica de las fracciones

Como se describe anteriormente, a través del procedimiento de purificación, se usó la actividad de citoquinas in vitro (medida de la inducción de TN\alpha y/o IL-1\beta) para el seguimiento del proceso de purificación y la selección de las fracciones activas. En la mayor parte de los experimentos, se determinó que la fracción soluble en agua de EFS tenía una fuerte actividad CAF para activar citoquinas. De forma sorprendente, la CAFb altamente purificada no mostraba una actividad tan fuerte o mejor que la fracción soluble en agua de EFS. Sin querer ceñirse a la teoría, esto sugiere que CAFb ha cambiado su forma durante el procedimiento de purificación posterior, y su actividad frente a citoquinas descendió tras el procedimiento de agregación.

Caracterización de las fracciones CAF HPLC en C_{18} analítico

Las fracciones que contienen CAF se analizaron por una Cromatografía Líquida de Alta Resolución en fase inversa (HPLC) (unidad Shimadzu, detección por Diodo array SPD-M10A VP, cromatografía líquida LC-6AD, desgasificador SCL-10A VP, mezclador a baja presión LPM-600 y horno de columna CTO-10A VP). Todas las fracciones se prepararon a 5,0 mg/ml en agua pura y se filtraron a través de una unidad de filtración de 0,2 \mum. Se aplicaron 20 \mul de cada muestra en una columna C_{18} de Water Symmetry (2,9 x 150 mm) a 29ºC y con un caudal de 1,0 ml/min. Se usó un gradiente lineal de acetonitrilo de 0%-60% en H_{2}Od que contenía ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) como la fase móvil.

La Fig. 3 muestra una representación cromatografía de Max de la separación del permeado de 3.000 Dalton de PMa partir de la yema de huevo PL-100 deslipidada, También se obtuvieron las fracciones posteriores de las etapas de purificación descritas anteriormente usando las mismas condiciones analíticas (Fig. 5, 8, 10 y 12).

Análisis de la estructura de CAF Electroforesis en Gel de Poliacrilamida de Proteínas (PAGE)

El peso molecular de CAFb se determinó usando PAGE SDS. Los resultados mostraron que CAFb es un péptido pequeño con un PM de aproximadamente 6.670 Da. Sin embargo, debido a la variabilidad del PAGE SDS, el peso molecular de CAFb usando PAGE SDS no se considera un número preciso, sino más bien una estimación del peso molecular.

Espectometría de Masas (EM)

La fracción soluble en agua de EFS se disolvió en agua ácida (FSA a pH ácido) y se aplicó en una columna preparativa C_{18} de fase inversa para la separación de CAF. Se recogieron 3 fracciones. Son CAF_{0}, CAFa y CAFb. La fracción CAFb activa estimulaba las actividades TNF\alpha e IL-1\beta en un ensayo in vitro. CAFb se estudió en Espectrometría de Masas para determinación del peso molecular. Los resultados de ESI-EM mostraron que CAFb es una proteína con PM de 15.500 Dalton. Las moléculas de PM mayor de la fracción CAFb pueden ser el resultado de la agregación natural de la molécula durante el procedimiento de purificación que puede ocurrir como resultado de la desalación.

Espectrometría de Infrarrojos (EI)

Los resultados de la espectrometría de infrarrojos mostraron que CAFb es un polipéptido con un patrón similar a la proteína de la leche caseína (Fig. 14). Los resultados de EI también demostraron que CAFb es un compuesto puro.

Secuencia de aminoácidos N-terminal

La secuenciación de los aminoácidos N-terminal se llevó al cabo usando un Secuenciador de N-terminal Enhanced Hewlett-Packard G1005A equipado con un detector variable de longitud de onda HP G1314A. La tecnología empleada trabaja de forma eficaz con muestras que oscilan de niveles subpicomolar a nanomolar. Se determinaron las secuencias de aminoácidos N-terminal de CAFb-FGII y EFS-FGII.

CAFb

Brevemente, CAFb se disolvió con 50 \mul de agua más 50 \mul de GuHCl 8 M. Aproximadamente 50 \mul de la muestra se cargaron en una columna de muestra de fase inversa usando el protocolo de carga de Hewlett-Packard. El cartucho de muestra se lavó con 1 ml de TFA al 2%. En la secuenciación inicial, la secuencia N-terminal principal fue una secuencia muy significativa de 30 aminoácidos, y que se representa en este documento como SEC ID Nº: 1. También se determinaron dos secuencias menores en CAFb-FGII, y eran idénticas a la secuencia principal, excepto por la pérdida de uno o dos restos N-terminal (denominadas SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 3, respectivamente). Los datos de secuencia inicial se muestran a continuación:

CAFb-FGII

3

Posteriormente, se obtuvo una secuencia adicional y se determinó un polipéptido de 70 aminoácidos, representado en este documento como SEC ID Nº: 6, que se cree que representa a la proteína CAF de longitud completa:

CAFb-FGII

4

CAFb parece ser un polipéptido con 70 aminoácidos, y el peso molecular calculado de CAFb es de 8.839 Da, como se muestra en la Tabla 3. Debido a incertidumbres en las posiciones de la secuencia 54 y 63, la secuencia principal (SEC ID Nº: 6) no se ha asignado con seguridad a estas posiciones. Este polipéptido puede ser un dímero y formar una proteína de 15.000 Da como se ha encontrado en el estudio de espectrometría de masas (EM). Los datos de secuencia también sugieren que la CAFb inicial puede digerirse con proteasas dando un péptido activo más pequeño durante la inmunización en el procedimiento de metabolización celular. La CAFb pequeña presente en la yema puede agregarse en una molécula mayor durante el procedimiento de purificación.

Podrá apreciarse que un especialista en la técnica será capaz de deducir la secuencia de nucleótidos que codifica la SEC ID Nº: 6, usando el código genético y considerando la degeneración de este documento. La presente invención contempla y abarca todas las secuencias de ácido nucleico que codifican la SEC ID Nº: 6. También se entenderá, que ahora que la secuencia de aminoácidos de la proteína CAF es conocida, cualquier especialista en la técnica fácilmente será capaz de identificar, clonar y secuenciar la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína CAF usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, cualquier especialista en la técnica puede hacer cebadores degenerados basados en la secuencia de aminoácidos de CAF y amplificar toda o una parte de la secuencia de ácido nucleico a partir de una biblioteca apropiada u otra fuente adecuada, por la reacción de la polimerasa en cadena. La clonación adicional de la molécula de ácido nucleico puede llevarse a cabo preparando una sonda y seleccionando una biblioteca de ADNc, por ejemplo, para la molécula de longitud completa, si es necesario. Las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos son bien conocidas para los especialistas en la técnica.

TABLA 3

5

7

8

EFS-FGII

También se secuenció el extremo N-terminal de EFS-FGII. Mirando los datos a partir del décimo ciclo de progresión estuvo claro que había dos secuencias principales en la muestra. Una secuencia, representada en este documento como SEC ID Nº: 4, se identificó como un fragmento de un precursor conocido de la vitelogenina II de pollo. Las x indican que tiene lugar alguna glicosilación en las posiciones.

9

La secuencia del péptido se comparó con otras secuencias conocidas en la base de datos BLAST proporcionada por el NIH (BLAST avanzado, BLAST p, nr, Esperado = 10, Filtrado).

Búsqueda de homología en la base de datos

En la búsqueda de similitud para los 70 aminoácidos de CAF-FGII (SEC ID Nº: 6), se compararon 518.313 secuencias de proteínas y 162.653.948 letras. Los resultados muestran que esta porción de CAFb-FGII es una secuencia única, y que no hay ninguna secuencia idéntica con homología significativa con ésta. La proteína que tiene la identidad más próxima con CAF es una secuencia de una proteína RYD5 de unión a un posible ligando, que se aisló a partir de ratas Norway (Nº de Acceso S17449). Esta proteína de 94 aminoácidos era el 51% idéntica a la SEC ID Nº: 6 durante los restos de aminoácidos 1-66 de la SEC ID Nº: 6. La extensión consecutiva más larga de aminoácidos compartidos por las dos secuencias era de cinco. La función de la proteína RYD5 de unión a un posible ligando parece ser una proteína que se une a ligando en las subregiones de la mucosa olfativa de las ratas Norway. Por tanto, se cree que el CAF de la presente invención y la proteína RYD5 no están relacionadas ni en estructura ni en función.

También se buscó EFS-FGII en la base de datos BLAST. Se confirmó que era un fragmento modificado del precursor de la vitelogenina II de pollo (SEC ID Nº: 5) en las posiciones de 1.572 a 1-602 (Fig. 15). Por el mismo fenómeno que se hipotizó para CAF, el tamaño de EFS-FGII puede variar debido a los procedimientos de degradación y agregación. El precursor de la vitelogenina II es una proteína importante para la regulación de muchas proteínas en el proceso de diferenciación, incluyendo citoquinas. El fragmento del precursor de la vitelogenina II modificado también puede jugar un papel importante en la función antiinflamatoria.

Ejemplo 2

El siguiente ejemplo demuestra el efecto del Factor de Activación de Citoquinas (CAF) en los perfiles de citoquinas y en la activación.

Los ensayos de citoquinas se llevaron a cabo como sigue.

Estimulación de las células

Las células humanas THP-1 (de origen Macrófago-Monocito) se lavaron y dispusieron en placas a una densidad de 1 x 10^{6} células en 10 ml de medio RPMI libre de suero que contenían diferentes fracciones de huevo en un matraz de 25 ml. Se dejo que las células crecieran en un incubador de CO_{2} humidificado durante 4 horas, después de las cuales se rascaron y recogieron en un tubo de centrifugado de 50 ml. Las células se sedimentaron por centrifugación a 400 xg durante 10 minutos y se lisaron en 750 \mul de reactivo TRIzol (Gibco BRL) y se usaron para la extracción del ARN total como se describe a continuación

Extracción del ARN a partir de las células tratadas

La extracción del ARN total a partir de los sedimentos de las células PBL se llevó a cabo según el protocolo del reactivo de TRIzol (Gibco BRL). El ARN total extraído se cuantificó por espectrofotometría ultravioleta y la calidad de la preparación se determinó analizando las bandas 28S y 18S en un gel de agarosa al 1.0% en tampón TBE.

Síntesis de ADNc a partir del ARN total

La primera cadena de ADNc se sintetizó a partir de 5 \mug de ARN total de cada muestra, usando el kit de ADNc Cycle® para RT-PCR (InVitrogen, Carlsbad, CA). Con fines comparativos, se usará el ARN ubicuo de GAPDH para cada preparación de ADNc semicuantitativo.

La Fig. 17 representa los perfiles de citoquina en las células THP-1 tratadas con fracciones parcialmente purificadas de diversos huevos. Los niveles de expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha) eran más altos en las células tratadas con la fracción 3k (2 mg/ml) del huevo PL-100 en comparación con las fracciones 3k de los huevos de mesa. También, los niveles de interleuquina-1\beta (IL-1\beta) eran más altos, pero en menor grado en los PL-100 en comparación con los huevos de mesa. En este ensayo usando la fracción 3K, no hubo una inducción detectable de interleuquina-6 (IL-6) o interleuquina-10 (IL-10) en estas células. Es destacable que en ensayos posteriores usando CAFB altamente purificada, se detectó claramente la inducción de IL-6. Los niveles de TNF-\alpha en los huevos PL-100 enteros (10 mg/ml) eran ligeramente más altos que en los huevos de mesa, pero a concentraciones mucho más altas que las de las fracciones 3k.

Cinética de la activación de TNF-\alpha por la fracción 3k de huevos hiperinmunes

La Fig. 18 representa las cinéticas de activación de TNF-\alpha en células THP-1 por la fracción 3k de la yema de los huevos PL-100. La inducción de TNF-\alpha por la fracción 3k de PL-100 se iniciaba a los 30 minutos y tenía un pico a las 2 horas después del cual caía y alcanzaba los niveles basales tras 8 horas. La inducción de TNF-\alpha por la fracción 3k de los huevos de Mesa fue igual o ligeramente superior que los niveles normales encontrados en la célula.

Inducción de la diferenciación en Células THP-1 por una fracción purificada del huevo hiperinmune

En las células THP-1, que son células humanas transformadas de origen monocito/macrófago, experimentan diferenciación cuando se tratan con la fracción 3k derivada de la yema de huevo hiperinmune. Normalmente, estas células crecen en suspensión en grupos y no se fijan a las superficies plásticas. Sin embargo, cuando crecen en un medio libre de suero que contiene la fracción 3k (1 mg/ml) a partir del huevo hiperinmune (referido a partir de ahora como PL-100), se diferencian en células similares a fibroblastos y se unen a la superficie plástica. La fracción 3k, cuando se purifica posteriormente en una columna de intercambio iónico (Q-Sepharosa) y se eluye con cloruro sódico 200 mM, hace que las células THP-1 se diferencien a mucho menor concentración (0,01 mg/ml). Hay varias publicaciones en la bibliografía que sugieren que la producción de TNF-\alpha, IL-1\alpha e IL-1\beta está asociada con la antiproliferación y diferenciación de células de origen monocito/macrófago.

Inducción de la expresión de citoquina por CAFb

El ensayo de citoquinas se llevó a cabo como se describe anteriormente usando la fracción soluble en agua de EFS y la fracción altamente purificada CAFb como se describe en el Ejemplo 1. La fig. 19 demuestra que tanto la fracción soluble en agua de EFS como la fracción CAFb inducen la expresión de TNF-\alpha, IL-1\beta e IL-6.

Inhibición de TGF\beta por CAFb

Los ensayos de citoquinas se llevaron a cabo como se describe anteriormente usando la fracción soluble en agua de EFS y la fracción altamente purificada CAFb como se describe en el Ejemplo 1. La Fig. 20 demuestra que CAFb, pero no la fracción soluble en agua de EFS, inhiben la inducción del factor de transformación del crecimiento \beta (TGF-\beta).

Mientras que se han descrito con detalle diversas realizaciones de la presente invención, es evidente que pueden darse modificaciones y adaptaciones de estas realizaciones por aquellos expertos en la técnica. Debe entenderse de forma expresa, sin embargo, que dichas modificaciones y adaptaciones pertenecen al alcance de la presente invención, como se muestra en las siguientes reivindicaciones.

Claims (44)

1. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por:

a. una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 6 y,

b. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (a);

En la que dicha proteína aislada regula de forma positiva la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) o interleuquina-6 (IL-6), o regula de forma negativa la expresión del factor de transformación de crecimiento \beta (TGF\beta).

2. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (a).

3. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 20 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (a).

4. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 25 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (a).

5. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50 restos de aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº: 6.

6. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) más de al menos 15 aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos de (a).

7. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) más de al menos 15 aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos de (a).

8. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 60% idéntica a la SEC ID Nº: 6 más de 66 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.

9. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones estrictas con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 6.

10. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 6.

11. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6.

12. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína tiene al menos una subunidad biológicamente activa que atraviesa un filtro de ultrafiltración de 3.000 Dalton de peso molecular de punto límite.

13. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína es estable a una temperatura de hasta al menos 50ºC.

14. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína es estable a pH de 2 a 10.

15. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una característica identificativa seleccionada entre el grupo compuesto por.

a. es soluble en agua;

b. no es esteroide;

c. está cargada negativamente;

d. no es polar; y,

e. tiene una \lambda_{max} de aproximadamente 254 nm.

16. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína es biológicamente activa cuando se administra por vía oral.

17. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína se presenta de forma natural tanto en la clara de huevo como en la yema de huevo de los huevos de aves.

18. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína regula de forma positiva la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) o interleuquina-6 (IL-6).

19. La proteína aislada de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína regula de forma negativa la expresión del factor de crecimiento transformante \beta (TGF\beta).

20. Un anticuerpo aislado que une de forma selectiva la proteína aislada de la Reivindicación 1.

21. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por:

a. una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 6; y,

b. una secuencia de aminoácidos que es al menos el 65% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a) más de al menos 15 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de (a);

en el que dicha proteína aislada regula de forma positiva la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) o interleuquina-6 (IL-6), o regula de forma negativa la expresión del factor de transformación de crecimiento \beta (TGF\beta).

22. Una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína factor de activación de citoquinas (CAF) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por:

a. una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 6; y,

b. una secuencia de aminoácidos que es al menos un menos 9 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (a);

en el que dicha proteína CAF regula de forma positiva la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) o interleuquina-6 (IL-6), o regula de forma negativa la expresión del factor de transformación de crecimiento \beta (TGF\beta).

23. La composición de la Reivindicación 22, en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable es un producto alimenticio seleccionado entre el grupo compuesto por:

a. un producto de huevo hiperinmune seleccionado por estar enriquecido en dicha proteína CAF; y,

b. un producto alimenticio producido con al menos una fracción del producto de huevo hiperinmune, en el que dicha fracción comprende una cantidad enriquecida de dicha proteína CAF en comparación con dicho producto de huevo hiperinmune.

24. La composición de la Reivindicación 22, en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una fracción de un producto de huevo hiperinmune que contiene una cantidad enriquecida de dicha proteína CAF en comparación con dicho producto de huevo hiperinmune.

25. La composición de la Reivindicación 24, en la que dicha fracción se selecciona entre el grupo compuesto por: yema de huevo líquido, clara de huevo líquida, yema de huevo en polvo, clara de huevo en polvo y una fracción soluble en agua de dicho producto de huevo hiperinmune.

26. La composición de la Reivindicación 22, en la que dicha composición está en una forma seleccionada entre el grupo compuesto de un líquido, un aerosol, una cápsula, un comprimido, una píldora, un polvo, un gel o un gránu-
lo.

27. La composición de la Reivindicación 22, en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una formulación de liberación controlada.

28. La composición de la Reivindicación 22, en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable se selecciona entre el grupo compuesto por: agua, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, otras soluciones acuosas fisiológicamente equilibradas, aceites, ésteres, glicoles, polímeros biocompatibles, matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones en bolo, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas, células y membranas
celulares.

29. Uso de una proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y 21 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección bacteriana, sepsis, choque séptico o cáncer.

30. El uso de la Reivindicación 29, en el que dicho medicamento comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

31. El uso de la Reivindicación 29, en el que dicho medicamento es apropiado para administración por una vía seleccionada entre el grupo compuesto de oral, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intratraqueal, inhalación, impregnación de un catéter, por supositorio e inyección directa en un tejido.

32. El uso de la Reivindicación 29, en el que la administración de dicho medicamento regula de forma positiva la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) o interleuquina-6 (IL-6) por las células de dicho animal.

33. El uso de la Reivindicación 29, en el que la administración de dicho medicamento regula de forma negativa la expresión del factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) por las células de dicho animal.

34. El uso de la Reivindicación 29, en el que dicho animal es un mamífero.

35. Uso de acuerdo con la reivindicación 29 de una proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y 21 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un animal.

36. El uso de las reivindicaciones 25 ó 35, en el que dicho medicamento es adecuado para la administración en dosis de 1 nanogramo a 400 miligramos de dicha proteína CAF por kilogramo de peso corporal de dicho animal.

37. El uso de la Reivindicación 35, en el que dicho medicamento es adecuado para administración por una vía seleccionada entre el grupo compuesto por oral, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intratraqueal, inhalación, impregnación de un catéter, por supositorio e inyección directa en un tejido del cáncer o adyacente a dicho
cáncer.

38. El uso de la Reivindicación 29 ó 35, en el que dicho medicamento comprende un producto alimenticio que contiene dicha proteína CAF.

39. El uso de la Reivindicación 35, en el que la administración de dicho medicamento produce un resultado seleccionado entre el grupo compuesto de: reducción de los síntomas del cáncer, reducción de un tumor asociado con el cáncer, eliminación de un tumor asociado con el cáncer, prevención del cáncer metastático, prevención del cáncer y estimulación de la inmunidad celular efectora contra el cáncer.

40. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre el grupo compuesto por:

a. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo compuesto por:

i.

una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 6; y;

ii.

una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 9 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de (i);

en el que dicha proteína regula de forma positiva la expresión del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), interleuquina-1\beta (IL-1\beta) o interleuquina-6 (IL-6), o regula de forma negativa la expresión del factor de transformación de crecimiento \beta (TGF\beta); y,

b. una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria con dicha secuencia de ácido nucleico de (a).

41. La molécula de ácido nucleico aislada de la Reivindicación 40, en la que dicha proteína comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo compuesto por la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 6.

42. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico aislada como define en la Reivindicación 40.

\newpage

43. Una célula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico aislada como define en la Reivindicación 40, en la que dicha célula expresa dicha molécula de ácido nucleico.

44. Un virus recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico aislada como define en la Reivindicación 40.