KR20140041067A - 소 로타바이러스 에피토프 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents
소 로타바이러스 에피토프 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소 로타바이러스의 에피토프를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이의 제조방법, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 단백질을 이용하여 제조된 난황 항체 및 이의 제조방법, 상기 단백질을 포함하는 백신, 약학 조성물 및 사료조성물, 그리고 상기 백신 및 약학 조성물을 이용하여 소 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 소로타바이러스 에피토프, 상기 폴리펩타이드를 이용하여 제조된 난황 항체, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물, 약학적 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
로타바이러스는 이중나선 RNA 바이러스이다. '로타바이러스'라는 이름은 전자 현미경으로 관찰시 마치 바퀴처럼 보인다고 해서 붙여진 것이다. 이 바이러스의 전파는 분변에서 경구 감염으로 이루어진다. 다시 말하면, 바이러스를 포함한 분변이 직접 또는 바이러스에 오염된 물체가 경구적으로 침입함으로써 이루어진다. 또한 모우의 불현성 바이러스도 분변에 배출되어 감염원으로 작용할 가능성도 있다. 사람이 소들을 관리하는 도중에 감염우의 분변을 장화 등에 묻혀 다른 우사의 소들에게 전파시킬 수 있으며, 심지어는 사료 운반차에 의해 다른 농장으로 전파되기도 한다. 1주령 미만의 어린 송아지에서 감염되며 대부분 2-3일간의 심한 유백색 설사와 급격한 탈수 증상을 보이며 항생제 치료에도 크게 호전되지 않는다. 1개월 이상 된 송아지에서는 감염되어도 증상이 심하지 않으며 대증요법 치료에 의해서 쉽게 호전된다. 병변은 소장에 한정되며, 병리조직학적으로 관찰해 보면, 장융모 상피세포의 팽대, 변성 및 탈락 등이 보인다. 일반적으로 대규모 농장의 경우 계절 분만 프로그램을 시행하거나, 분만 간격이 좁으므로 어린 송아지에서의 유행 양상이 소규모 농장의 경우보다 더 폭발적이며, 특히 늦겨울부터 초봄까지가 심하다. 송아지가 로타바이러스에 감염되면 수양성 설사, 침울, 탈수 등의 증상이 나타난다.
현재 소 로타바이러스(Bovine Rotavirus) 감염 예방 방법이나 효과적인 치료방법이 없다. 다만 백신으로 미리 예방 접종을 하거나 조기 진단과 철저한 위생 관리 미 방역을 통해 감염을 방지하는 것이 최선이다. 이러한 바이러스 감염을 예방하기 위한 가장 기초적인 방법은 충분한 양의 초유를 빠른 시간에 신생 동물에게 급여하는 것이다. 동물은 사람과는 달리 임신 기간 동안 모체의 면역글로불린이 태아에 전이되지 못하므로 면역글로불린은 반드시 어미의 초유를 통해서만 이행된다. 모체 유래 항체를 이용한 수동면역, 즉 동일 축종 또는 다른 축종의 초유나 면역글로불린의 급여는 신생 가축에 있어서 설사 방지는 물론 각종 질병의 예방에 매우 효과적이다. 그러나 초유를 통한 모체 이행 항체는 지속 시간이 짧으며 이유시까지 충분한 방어력을 제공하지 못하는 단점이 있다.
최근에는 각종 호흡기 및 소화기와 관련 질병을 일으키는 세균 및 바이러스에 대응하기 위한 수동면역 방법이 임상적으로 응용되고 있다. 사람이나 동물 유래의 항체를 경구 투여하여 감염을 미리 예방하고 치료하는 방법이 점진적으로 시도되고 있다. 혈청이나 초유, 단일클론 항체를 이용한 항체를 경구 투여하게 되면 매우 효과적이지만, 다량의 항체를 얻기 위해서는 매우 많은 비용과 문제점이 발생된다.
따라서 포유동물의 혈액에서 면역글로불린을 추출하는 것 보다 난황에서 면역글로불린을 추출하는 것이 좀 더 간편하다. 태반과 모유가 없는 난생동물의 경우 모체가 획득한 항체는 난황 중에 축적되어 자손에게 전해진다. 이러한 성질을 이용하여 난황으로부터 특이 항체를 얻을 수 있다. 난황 항체는 시스템화된 면역이 가능하다. 또한, 채란이 용이하며, 간단한 처리로 항체의 분리가 가능하고 생산 비용이 저렴하며 섭취시 안정성이 높고, 그리고 포유동물 유래의 항원에 대해서는 포유동물의 경우보다 산란계에서 우수한 항체를 얻을 수 있다.
이에 본 발명자들은 소로타바이러스에 대한 효율적인 면역원 생산을 위해 연구를 계속하여 본 발명에 이르렀다.
본 발명의 목적은 소로타바이러스 에피토프 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 이용하여 제조된 난황 항체를 제공하기 위 한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 백신 조성물, 약학적 조성물 및 사료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 소로타바이러스의 에피토프 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 “에피토프(epitope)"란 바이러스 및 세균 등의 항원에의 항체 결합 부위를 의미하며, 일반적으로 에피토프는는 폴리펩타이드드 단편들로 이루어져 있다.
또한 "소 로타바이러스 에피토프 폴리펩타이드", "소 로타바이러스 에피토프" 또는 "소 로타바이러스의 폴리펩타이드 에피토프"와 같은 용어들은, 이 용어들에 의해 언급된 펩타이드 및 단백질은 물론 실질적으로 상동성을 가지는 모든 유사체 및 대립유전자의 변형을 모두 포함한다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자는 당해 유전자의 염기서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 소로타바이러스의 게놈 DNA를 주형으로 목적한 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 스파이크 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 서열번호 2에 기재된 염기서열로 이루어진 유전자 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기서열은 변화되지만, 상기 서열번호에 기재된 염기서열로 이루어진 유전자와 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 유전자이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 단백질은 상기 서열번호의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 벡터는, 예를 들면 pUC8, pBR322, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-21d(+) 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, pET-21d(+)를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는 데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있으며, 유전자의 도입효율이 높고 도입된 유전자의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들어, 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.
발현 벡터를 숙주 세포로 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 형질전환 (calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환 (DEAE-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 미세주입 (microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환 (cationic lipid-mediated transfection), 전기천공 (electroporation), 형질도입 (transduction), 스크래프 로딩 (scrape loading), 총알식 도입 (ballistic introduction), 감염 (infection) 등을 을 이용할 수 있다. 이외에도 당업계에 공지된 바를 참조하여 숙주 세포 및 발현 벡터 등의 종류에 따라 또 다른 최적의 형질전환 방법을 이용할 수도 있다.
또한 본 발명은,
제1항의 폴리펩타이드를 산란계에 투여하여 면역화시키고;
상기 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수하고; 그리고
상기 산란된 알의 난황에서 난황 항체를 분리하는 단계;
를 포함하는 소 로타바이러스에 대한 난황 항체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 난황 항체를 제공한다.
난황 항체(Immunoglubulin of egg yolk, IgY)란 난황 내에 존재하는 면역글로블린(IgG)이다. 태반과 모유가 없는 난생동물은 모체가 획득한 항체를 난황에 축적하여 면역 물질을 자손에게 전달한다. 또한 면역된 산란계에 형성된 항체는 난황에 효과적으로 전달된다. 이러한 특징을 이용하여 난황으로부터 특이 항체를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 난황 항체는 소로타바이러스를 인식함을 특징으로 한다. 본 발명의 폴리펩타이드 에피토프를 항원으로 하여 소 로타바이러스에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다.
폴리클로날 항체는 일반적으로 포유동물을 적절한 양의 항원으로 1회 이상의 회수로 면역화시키고 항체가가 일정 수치에 이르렀을 때, 상기 포유동물의 항혈청으로부터 회수하여, 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고, 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 포유동물에 항원을 주입하여 생긴 B 림프구를 분리해서 마이엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 만들고 이를 배양하여 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 에피토프 폴리펩타이드를 항원으로 사용하여 산란계에 면역화시키는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 기술에 따라 실시할 수 있다. 본 발명에 이용되는 산란계로는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색 레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용할 수 있다. 산란계에 항원 단백질을 투여하는 경로로는 복강내, 근육내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원 단백질은 어쥬번트, 예를 들어 프레운즈 컴플리트 또는 인컴플리트 어쥬번트를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
추가항원접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 3회 내지 4회 면역을 실시하고, 다음 접종은 약 8주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 단백질을 분리한 다음 유도된 단백질의 항체가를 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다. 제조된 난황항체는 항체가 측정을 통하여 분말형태의 항체 내에 스파이크 재조합 단백질에 대한 특이적 항체를 포함하고 있음을 확인한 후 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 소 로타바이러스의 에피토프 폴리펩타이드 및 이에 대한 항체는 모두 소 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 데 이용될 수 있다. 에피토프 폴리펩타이드는 능동 면역을 통하여, 에피토프에 대한 항체는 수동 면역을 통하여 소 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 능동 면역은 병원체가 침입하였을 때 생체 스스로가 자기 몸 속에 항체가 생성되게 하여 면역되는 것을 의미하고, 수동 면역은 다른 생체에서 생성된 면역체를 자신의 체내에 받아들임으로써 얻어진 면역을 의미한다.
따라서 본 발명은 상기 에피토프 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 소 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 에피토프 폴리펩타이드에 대한 난황 항체를 유효성분으로 포함하는 소 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 백신 조성물 또는 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
에피토프 펩타이드 및 이에 대한 항체를 백신 조성물 및 약학 조성물로 이용하는 경우, 상기 유효성분은 단독으로 이용되기 보다는 약학으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 이용하는 것이 적합하다. 여기서, 약학으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다.
본 발명의 백신 조성물과 약학 조성물에 이용할 수 있는 약제학적으로 허용된 담체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물과 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 특히, 액상 제제의 경우에는 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 등을 혼입시켜 살균하는 것이 바람직하다. 이렇게 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.
본 발명에 따른 백신 조성물과 약학 조성물은 소, 쥐, 마우스, 가축, 개, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물과 약학 조성물의 투여량은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 에피토프 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 폴리페타이드 또는 난황 항체의 면역원량의 멸균 용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원 자극을 수행할 수 있다.
또한 본 발명은 한편, 소 로타바이러스 에피토프에 대한 난황 항체를 유효성분으로 포함하는 소 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 사료 조성물을 제공한다.
즉 상기 난황 항체를 통상의 사료와 혼합하여 소 로타바이러스의 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물로 제조할 수도 있는데, 이 때 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 스파이크 재조합 단백질에 대한 항체를 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 소 로타바이러스의 에피토프를 포함하는 난황 항체는 소 로타바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 도 1은 VP8 유전자의 PCR 증포 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 전기영동을 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 pET-21d(+) 벡터를 확인한 것이다. 왼쪽부터 순서대로 1 래인에서 5 래인이고, 2 내지 5 래인은 pET-21d(+) 벡터가 제한효소 NcoI 및 XhoI.에 의해 분해되었다.
도 3은 VP8 유전자와 pET-21d(+) 벡터의 비율을 나타낸 결과이다. VP8 산물 및 pET21d(+) 는 각각 NcoI 및 XhoI 효소로 분해되었다.
도 4는 pET-21d(+)-VP8 클론을 확인한 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 VP8 유전자를 포함하는 발현 벡터 pET-21d(+) 벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 BL21(DE3) 세포에서 단백질 발현을 보여주는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 것이고(A), 재조합 VP8 유전자와 모노클로날 항-히스티딘 항체를 가지는 프로브의 웨스턴 블랏 결과를 보여주는 것이다(B). 화살표는 재조합 캡시드 단백질(30 kDa)을 나타낸다. 각각의 래인은 다음과 같다:
1 래인: pET21d(+)-VP8 0 시간 유도
2 래인: pET21d(+)-VP8 1 시간 유도
3 래인: pET21d(+)-VP8 2시간 유도
4 래인: pET21d(+)-VP8 3 시간 유도
5 래인: pET21d(+)-VP8 4 시간 유도
6 래인: pET21d(+) 벡터 4 시간 유도(음성 대조군)
7 래인: pET21d(+)-CMV 6 시간 유도(양성 대조군).
도 7은 BL21(DE3) 세포의 단백질 발현 수준을 보여주는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 것이고(A), 재조합 VP8 유전자와 모노클로날 항-히스티딘 항체를 가지는 프로브의 웨스턴 블랏 결과를 보여주는 것이다(B). 화살표는 재조합 캡시드 단백질(30 kDa)을 나타낸다. 각각의 래인은 다음과 같다:
1 래인: pET21d(+)-VP8 용해(lysis) (Buffer EL) 후 상층액
2 래인: pET21d(+)-VP8 세척(버퍼 A) 후 상층액
3 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 세척
4 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 용출 1
5 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 용출 2
6 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 용출 3
7 래인: pET21d(+) 벡터 4 시간 유도(음성 대조군)
8 래인: pET21d(+)-CMV 6 시간 유도(양성 대조군)
9 래인: Flow-through.
도 8은 소 로타바이러스(BRV)로 면역화된 산란계의 난황 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 9는 IgY의 헤마글루티닌 저해를 나타낸 것이다.
도 2는 전기영동을 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 pET-21d(+) 벡터를 확인한 것이다. 왼쪽부터 순서대로 1 래인에서 5 래인이고, 2 내지 5 래인은 pET-21d(+) 벡터가 제한효소 NcoI 및 XhoI.에 의해 분해되었다.
도 3은 VP8 유전자와 pET-21d(+) 벡터의 비율을 나타낸 결과이다. VP8 산물 및 pET21d(+) 는 각각 NcoI 및 XhoI 효소로 분해되었다.
도 4는 pET-21d(+)-VP8 클론을 확인한 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 VP8 유전자를 포함하는 발현 벡터 pET-21d(+) 벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 BL21(DE3) 세포에서 단백질 발현을 보여주는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 것이고(A), 재조합 VP8 유전자와 모노클로날 항-히스티딘 항체를 가지는 프로브의 웨스턴 블랏 결과를 보여주는 것이다(B). 화살표는 재조합 캡시드 단백질(30 kDa)을 나타낸다. 각각의 래인은 다음과 같다:
1 래인: pET21d(+)-VP8 0 시간 유도
2 래인: pET21d(+)-VP8 1 시간 유도
3 래인: pET21d(+)-VP8 2시간 유도
4 래인: pET21d(+)-VP8 3 시간 유도
5 래인: pET21d(+)-VP8 4 시간 유도
6 래인: pET21d(+) 벡터 4 시간 유도(음성 대조군)
7 래인: pET21d(+)-CMV 6 시간 유도(양성 대조군).
도 7은 BL21(DE3) 세포의 단백질 발현 수준을 보여주는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 것이고(A), 재조합 VP8 유전자와 모노클로날 항-히스티딘 항체를 가지는 프로브의 웨스턴 블랏 결과를 보여주는 것이다(B). 화살표는 재조합 캡시드 단백질(30 kDa)을 나타낸다. 각각의 래인은 다음과 같다:
1 래인: pET21d(+)-VP8 용해(lysis) (Buffer EL) 후 상층액
2 래인: pET21d(+)-VP8 세척(버퍼 A) 후 상층액
3 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 세척
4 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 용출 1
5 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 용출 2
6 래인: pET21d(+)-VP8 변성 후 + 레진 결합 후 용출 3
7 래인: pET21d(+) 벡터 4 시간 유도(음성 대조군)
8 래인: pET21d(+)-CMV 6 시간 유도(양성 대조군)
9 래인: Flow-through.
도 8은 소 로타바이러스(BRV)로 면역화된 산란계의 난황 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 9는 IgY의 헤마글루티닌 저해를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 바이러스 배양 및 균주 확보
10%의 FBS(fetal bovine serum, Gibco Co., USA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco Co., USA)을 첨가한 DMEM(Gibco Co., USA)에 신장 표피 세포(MA104)를 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양된 MA104 세포에 소 로타바이러스(전산등록번호 : VR9200179) 감염시켰다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 소 로타바이러스(BRV)에 감염된 MA104 세포가 약 80% CPE가 일어날 때까지 약 1-3일간 배양하였다. E. coli DH5α을 리얼바이오텍사(Real biotech. Co., Koera)에서 구입하여 컴피턴트 세포(competent cell)로 사용하였고, E. coli BL21(DE3)를 리얼바이오텍사(Real biotech. Co., Koera)에서 구입하여 발현 벡터 클로닝시 컴피턴트 세포로 사용하였다. 클로닝 벡터로는 pGEM T-easy TA 클로닝 벡터(Real biotech. Co.)를 사용하였으며 발현 벡터로는 pET-21d(+)(Novagen. Co.)를 사용하였다.
실시예 2: 바이러스 RNA 추출
MA104 세포에 소 로타바이러스 감염 후 바이러스 발현을 확인하기 위하여, 감염 세포의 용해물에서 전체 RNA를 추출하였다. 용해물을 원심분리로 모아 Tri 시약(MRC)으로 바이러스 RNA를 추출하였다. Tri 시약 800 ㎕ 첨가한 후 잘 섞어 실온에서 5분 동안 반응하였다. 클로로폼 200 ㎕ 첨가하여 볼텍싱한 후 10-15분 동안 반응 시켰다. 반응 후 4℃, 12,000 g에서 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후 반응 액은 세 가지 층으로 분리된다. 가장 위에 존재하는 투명한 층이 RNA층으로, RNA층을 새로운 튜브로 옮긴 후 이소프로판올을 500 ㎕ 첨가하여 10분간 반응하였다. 12,000 g에서 10분간 원심분리 과정을 거치게 되면 이소프로판올과 반응한 RNA가 침전하게 되므로 상층액을 제거하고 세척하기 위하여 75% 에탄올 1 ml로 잘 섞어 주었다. 7,500g에서 5분간 원심분리 과정을 거치고 상층액을 모두 제거한 후 실온에서 샘플을 건조하였다. 건조된 샘플은 DEPC(Diethyl Pyrocarbonate)처리 된 증류수를 사용해 재부유되었다. .
실시예 3: 유전자 증폭
타겟 유전자인 VP8 유전자(서열번호 1)를 증폭하기 위해서, 먼저 Maxime RT PreMix, Oligo dT 프라이머(iNtRON, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. RNA, DEPC 처리 워터를 키트에 최종 반응 산물의 양이 20 ㎕가 되도록 혼합한 후, cDNA 합성 단계인 45℃, 60분 후, RTase 불활성 단계인 95℃, 5분을 거쳐 cDNA를 합성하였다.
cDNA 합성 산물을 주형으로 하여 VP8 유전자를 증폭하였다. 유전자 증폭에는 2X EF Taq Premix(SolGent) 가 이용되었으며 하기 표 1에 기재된 VP8 정방향(F) 프라이머와 역방향(R) 프라이머가 이용되었다. 멸균된 D.W.를 이용하여 최종 반응 산물의 양이 20 ㎕가 되도록 혼합한 후 반응을 시작하였다. 반응 조건으로는 94℃에서 2분간 초기 변성을 실시하였으며, 변성, 어닐링 그리고 신장을 각각 94℃에서 1분, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30 사이클 수행하였다. 그리고 72℃에서 5분간 최종 신장(final-extension) 실시하였다. PCR(중합효소 연쇄 반응)으로 증폭된 유전자 산물의 크기를 확인하기 위하여 증폭된 유전자 산물 10 ㎕를 1% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다. BRV VP8 절편 유전자의 특이 프라이머는 GenBank의 데이터를 기초로 하여 VP8 유전자(769bp)를 증폭할 수 있도록 제작하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 1에 제시한 바와 같이 769bp 에서 나타났다.
| 프라이머 명칭 | 서열번호 | 서열 (5'→ 3')* | 증폭 산물(bp) |
| VP8 F | 3 | CC ATG G CTTCACTCATTTATAGA | 23 |
| VP8 R | 4 | CC CTCGAG GTCTTGATTAGGTTGTGCTCT | 29 |
* 밑줄 친 부분은 제한효소 부위를 나타냄
실시예 4: 발현 벡터 클로닝
4-1: 제한효소 반응
실시예 3에서 확인된 VP8 유전자 증폭 산물을 클로닝에 이용하기 위해 유전자 증폭을 6 반응 수행하였다. VP8의 유전자 증폭 산물의 경우, PCR quick-SpinTM(iNtRoN) 키트를 이용하여 유전자 증폭 산물 정제 후 제한효소 반응을 하였다. 제한효소는 NcoI과 XhoI(Enzynomics)를 이용하였다. 반응 조성은 정제된 VP8 유전자 증폭 산물과 pET21d(+) 벡터 각각 45 ㎕, NcoIㅇXhoI 각각 3 ㎕, 10X buffer 10 ㎕, 100X BSA 1 ㎕, 멸균된 D.W. 31로 총 100 ㎕를 37℃에서 90분 반응하였다. 효소 반응을 한 VP8 유전자 산물은 라이게이션의 효율을 높이기 위해 한번 더 정제를 수행하였다.
4-1: 제한효소 반응 벡터의 겔 용출(gel elution)
제한효소 반응을 한 pET-21d(+) 벡터는 1% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다(도 2). 그리고 겔 용출 과정을 수행하여 정제하였다. 겔 용출은 DNA PrepMateTM II(BIONEER사)을 이용하였다. 약 5.4kb 부근의 겔을 자른 후, SB 버퍼 540 ㎕와 실리카 10 ㎕를 혼합하여 50℃에서 겔을 녹인 후, 원심분리하여 상층액을 버린다. 실리카에 DNA가 붙들려 있음을 이용하여 워싱 버퍼 500 ㎕로 재부유하여 원심분리시켜 상층액을 제거함으로 불순물을 제거하였다. 건조 후 실리카가 투명에서 불투명으로 바뀌었을 때 용출 버퍼 15 ㎕를 처리하여 5분간 반응하였다. 원심분리를 통해 실리카로부터 자유로워진 DNA가 녹아있는 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 라이게이션에 이용하였다.
4-3: 라이게이션과 형질전환
정제된 두 DNA를 1 ㎕씩 1% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 두 DNA의 농도 비율을 확인하였다(도 .3). 이를 통해 이용가능하게 된 BRV VP8와 pET-21d(+) DNA는 유사한 농도임을 확인 할 수 있었다
pET-21d(+) 벡터 : VP8 = 1:3 비율로 T4 DNA 라이가아제(Fermentas)를 처리하여 16℃에서 밤새 두었다. 라이게이션 혼합물을 E. coli DH5α(Real biotech. Co.) 컴피턴트 세포와 혼합하여 얼음에서 10분간 안정화시킨 후, 42℃에서 1분간 열 충격 반응을 가하였다. 얼음에서 5분 안정화한 후 LB 브로쓰 500 ㎕를 첨가하여 1 시간 동안 37℃ 쉐이킹 배양을 하였다. 원심분리 후 100 ㎕만을 남기고 상층액을 제거하였다. 100 ㎕를 재부유하여 LB 아가(앰피실린 100 ㎍/ml)에 도말하였다.
4-4: 클론 확인
양성 콜로니를 LB 브로쓰(앰피실린 100 ㎍/ml) 에 접종한 뒤 37℃에서 16 시간 배양한 후 DNA-SpinTM(iNtRON)을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 각 클론의 플라스미드 DNA을 NcoI과 XhoI 효소로 반응하여 전기영동을 통해 확인하였다(도 4). 그 결과 세 개의 클론이 클로닝 되었음을 확인하였다. 또한 라이게이션을 통해 얻은 클론을 NcoI과 XhoI을 처리하여 pET-21d(+) 벡터인 5.4 kb와 BRV VP8인 769 bp에서 밴드를 확인할 수 있다. 그 중 1 래인의 클론을 Macrogen사(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. GeneBank의 데이터베이스를 기초로 하여 염기서열을 확인하였고 분석된 염기서열의 상동성을 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램으로 비교하였다. 그 결과 BRV VP8 유전자와 99~100%의 유사성을 나타내었다 또한 단백질 서열상에 개시 코돈과 종결 코돈이 제자리에 위치하고 있는지 확인하기 위하여 ExPASy 프로그램을 이용하여 DNA 염기서열을 아미노산 서열로 번역하였다. 그 결과 개시 코돈이 제자리에 있음을 확인하였고, 중간에 종결 코돈이 없음을 확인하여 사용가능한 클론임을 확인하였다.
실시예 5: 발현 벡터 구축과 단백질 발현
5-1: 발현 벡터 구축
pET-21d(+)-VP8 클론1을 이용하여 BL21(DE3) E. Coli 컴피턴트 세포(RBC, USA)에 열 충격 방법으로 형질전환시켜 1개 콜로니를 단백질 발현에 이용하였다. pET21d(+)-VP8 클론1의 벡터 지도는 도 5에 나타내었다.
5-2: 단백질 발현
1개 콜로니를 취하여 5 ㎖ LB 브로쓰에 접종한 후, 37℃에서 14 시간 동안 진탕 배양하였다. 50 ㎖ LB 브로쓰에 전배양된 세포(precultured cells)을 재접종하여 흡광도(A600)가 0.7∼0.8이 되도록 37℃, 200 rpm으로 배양하였으며, 0.8 M의 IPTG(isoproyl-β-D-thio-galactopyranoside)를 1 mM 되도록 첨가한 후 4 시간 동안 배양한 다음 4℃ 10,000 x g 조건으로 15분간 원심분리하여 균체를 회수하였다.
5-3: 단백질 정제
5-2에서 배양한 단밸질을 4℃, 10,000 g에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 모두 모은 후 5 ml 버퍼 EL(50 mM Tris-HCL, 0.5 M NaCl, pH 8.0,)과 추가적으로 1% 트리톤X-100, 40 ㎍/ml PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)로 재부유한 후 실온에서 20분간 반응하였다. 이후 라이소자임(lysozyme) 100 ㎍/ml을 첨가한 후 얼음에서 1 시간 동안 반응하여 세포를 용해시켰다. 세포를 완벽히 깨주기 위하여 냉동과 해동 과정(Freezing- thawing)을 수행하였다. 4℃, 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 용해 분획물(soluble fraction)을 보관하고, 불용성 분획물(insoluble fraction)을 포함하는 펠렛을 용해시켰다. 봉입체 펠렛(Inclusion bodies pellet)은 5 ml 버퍼 A(0.01M Tris-HCl, 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼, 2M 우레아, pH 8.0)을 RT에서 30분간 반응하였다. 4℃, 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액은 저장하고, 펠렛은 변성 버퍼(dunaturing buffer B) (0.01 M Tris-HCl, 0.1 M 소듐 포스페이트 버퍼, 8M 우레아, pH 8.0)를 얼음에서 1 시간 동안 처리하여 봉입체를 용해시켰다. 이후 16,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 이 상층액에 VP8 단백질이 녹아있는 것을 도 6으로부터 확인하였다. 수용성 VP8이 녹아 있는 상층액에 Ni-NTA 아가로스 레진(QIAGEN, Korea) 400 ㎕를 첨가하고 밤새 로테이터를 이용하여 360도 회전시켰다. 반응 산물을 컬럼에 떨어뜨렸다(flow-through fraction). 그 다음 컬럼에 세척 버퍼(버퍼 B+10 mM 이미다졸) 2 ml을 넣고 떨어뜨렸다. 컬럼에 버퍼 C(버퍼 B, pH 6.3) 2 ml을 넣고 떨어뜨려 한 번 더 세척하였다. 용출 버퍼(버퍼 B +100 nM EDTA, 2 mM 베타-머캅토에탄올)을 1ml 첨가하였다. 용출 과정을 8번 반복하였다.
5-4: 단백질 분석
5-3에서 회수한 단백질이 VP8 단편인지 확인하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 12.5% SDS-PAGE 두 장을 만들어 단백질을 로딩하여 250V로 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 한 장은 쿠마씨 블루 R-250으로 염색하여 육안으로 단백질의 양상을 확인하였고, 다른 한 장은 나일론 멤브레인에 단백질을 트랜스퍼시킨 후 블랏킹 버퍼로 16 시간 블랏킹시킨 다음 멤브레인을 TBS-T로 세척하였다. 그 다음 제1 항체인 래빗 His-태그 항체(KOMA Co.)를 2,000배 희석하여 실온에서 한 시간 반응시켰으며, TBS-T로 4회 세척하였다. 여기에 제2 항체인 HRP 컨쥬게이티든 고트 항-래빗 IgG(SIGMA co.)를 10,000배 희석하여 실온에서 한 시간 반응시켰으며, TBS-T로 4회 세척하였다. 그 후 DAB 기질(KOMA Co.)로 발색 반응을 유도하여 단백질 발현 여부를 확인하였다(도 6 및 도 7). 또한 생산된 단백질의 농도를 측정하기 위하여 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석을 실시하였다. 생산된 단백질을 10, 20, 40, 100, 200,400배로 희석하여 준비하였다. 표준 용액을 0, 10, 25, 50, 75, 100 ㎍/㎖로 준비하였다. 마이크로테스트Ⅲ 플렉서블 어세이 플레이트(Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, 워킹 시약 100㎕ 씩 첨가하여 37℃에서 2 시간 반응 시킨 후 562 nm에서 측정한 결과 0.6 mg/ml의 농도를 확인하였다.
실시예 6: 면역반응 확인
상기 실시예 5에서 획득한 단백질에 대한 항체 생산을 위해 20주령의 ISA-브라운계의 산란계를 사용하였다.
6-1: 항체 형성
실시예 5에서 분리한 단백질(100 ㎍/㎖)과 완전 항원 보강제(Freund's complete adjuvant, Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화시켰다. 상기 유화액 1 ㎖을 산란계의 흉근에 각각 0.25 ㎖씩 4곳에 근육 주사하여 1차 접종하였다. 추가 항원 주입은 1차 접종 후 2주 간격으로 실시하였으며, 면역항원을 불완전 항원보강제(Freund's incomplete adjuvant, Gibco)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 3차 접종까지 실시하였다.
6-2: 난황 항체 형성
분리한 난황으로부터 소 로타바이러스 VP8에 대한 항체가를 분석하기 위해 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 실시하였다. 균주에서 분리한 단백질을 5 ㎍/㎖이 되도록 카보네이트-바이카보네이트(carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6)로 희석하여 마이크로테스트Ⅲ 플렉서블 어세이 플레이트(Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅이 완료된 플레이트를 세척 버퍼(PBST, 0.02 M NaH2PO4, 0.13 M NaCl, 0.05 % Tween 20, pH 7.2)로 3회 세척한 후 3% BSA(bovine serum albumin, pH 7.3, Sigma Co. USA)/PBS을 각 웰에 175 ㎕씩 분주한 후 2 시간 동안 37℃에서 배양하였다. PBST로 5번 세척하고 3% BSA/PBS와 세척 버퍼(PBST, phosphate buffered saline-Tween 20)를 동량으로 섞은 희석 버퍼를 이용하여 수득한 항혈청과 난황을 각각 2,000배 희석하여 3배씩 연속 희석한 후, 상기 단백질(truncated recombinant protein)이 코팅된 웰에 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체인 알칼린 포스페이트 래빗 항-치킨 IgY(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. USA)를 5,000배로 희석하여 37℃에서 2 시간 동안 상기 플레이트의 웰에 분주하여 반응시켰다. 기질 버퍼인 포스페이트 기질 태블릿(ρ-nitrophenyl phosphate, PIERCE Co. USA)를, 0.5 mM MgCl2 가 포함된 10% 다이에탄올아민(diethanolamine, pH 9.8)에 용해시킨 용액을 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 정지액(stopping solution)으로 5M NaOH을 사용하여 반응을 블랏킹시킨 후 마이크로플레이트 리더 (EL-800, BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 반응을 조사하였다(도 8).
실시예 7: 난황 항체 중화시험
소 로타바이러스(BRV) 난황 항체에 대한 중화항체가를 파악하기 위하여 헤마글루티닌 저해 테스트(Hemagglutinin inhibition test)를 실시하여 항체에 대한 중화항체가를 측정하였다.
MA104 세포를 단층이 될 때까지 배양한 후, 트립신 10 ㎍/㎖을 포함하는 0% FBS DMEM 배지 1 ㎖과 바이러스 100 ㎕을 첨가하여 1 시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 감염시킨 후 2~3일간 배양하였다. IgY를 100 ㎎/㎖로 희석한 후 0.45 ㎍ 필터로 필터링한 후 96웰 u-플레이트에 2배수씩 희석하여 100 ㎕씩 분주하였다. 바이러스를 4HA가 되도록 희석한 후 50 ㎕가 되도록 분주한 후 37℃에서 30분 반응 후 1% 적혈구를 50 ㎕ 첨가하여 잘 혼합한 후 25℃에서 40분간 정치한 후 혈구 응집 반응을 관찰하였다(도 9). 중화시험 결과 10X24까지 중화 능력을 확인할 수 있었다.
<110> DAN Biotech
<120> EPITOPE PEPTIDE DERIVED FROM BOVINE ROTAVIRUS AND VACCINE
COMPOSITION CONTAINING THE SAME
<130> P120918
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> Bovine Rotavirus
<400> 1
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val
1 5 10 15
Glu Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Thr Lys Thr Gln Asn
20 25 30
Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Asn Tyr Ala Pro Val
35 40 45
Asn Trp Gly Pro Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val
50 55 60
Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Val Ser Tyr
65 70 75 80
Trp Met Leu Leu Ala Pro Thr Asn Ala Gly Val Val Val Glu Gly Thr
85 90 95
Asn Asn Thr Asn Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val
100 105 110
Gln Gln Val Glu Arg Thr Tyr Thr Leu Phe Gly Gln Gln Val Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Asn Asp Ser Gln Thr Lys Trp Lys Phe Val Asp Leu Ser
130 135 140
Lys Gln Thr Gln Asp Gly Asn Tyr Ser Gln His Gly Pro Leu Leu Ser
145 150 155 160
Thr Pro Lys Leu Tyr Gly Val Met Lys His Gly Gly Lys Ile Tyr Ile
165 170 175
Tyr Asn Gly Glu Thr Pro Asn Ala Asn Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr
180 185 190
Asn Phe Asp Thr Val Asn Met Thr Ala Tyr Cys Asp Phe Tyr Ile Ile
195 200 205
Pro Leu Ala Gln Glu Ala Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu
210 215 220
Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Ile Val Pro Val Ser Ile Val Ser
225 230 235 240
Arg Asn Ile Val Tyr Thr Arg Ala Gln Pro Asn Gln Asp Leu Glu His
245 250 255
His His His His His
260
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> Bovine Rotavirus
<400> 2
atggcttcac tcatttatag acagttgctt actaattcat acacagtaga actttcagat 60
gaaatacaag aaattggatc gactaagact caaaacgtta ccgttaatcc aggaccgttc 120
gcgcaaacaa actacgctcc agttaattgg ggacctggtg aaacgaatga ctcaactaca 180
gttgaaccag tgcttgatgg accatatcaa ccaacgactt tcaatccacc tgtaagttat 240
tggatgttgt tagcaccgac gaacgcgggg gtagtggttg aaggtacgaa caatacaaac 300
agatggttag caacaatatt aattgaacca aatgtgcagc aagttgagcg aacatataca 360
ttatttggac aacaagttca agtgacagta tcaaatgact cacaaacaaa gtggaaattt 420
gtggatctaa gtaagcagac acaagatggt aattattcac agcatggtcc tctactgtca 480
acaccaaaac tgtatggagt aatgaaacat gggggtaaaa tttacattta taatggagag 540
acaccgaatg caaatactgg ttactactct acaactaact ttgacactgt aaacatgaca 600
gcatattgtg atttttatat aattccatta gcacaagagg caaaatgcac cgaatacata 660
aataatggat taccaccaat acaaaatacg agaaatatcg taccagtttc gatagtatca 720
aggaatattg tatatacaag agcacaacct aatcaagacc tcgagcacca ccaccaccac 780
cac 783
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP8 F Primer
<400> 3
ccatggcttc actcatttat aga 23
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP8 R Primer
<400> 4
ccctcgaggt cttgattagg ttgtgctct 29
Claims (14)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 소 로타바이러스의 에피토프 폴리펩타이드.
- 제1항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자.
- 제2항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자.
- 제2항 또는 제3항에 따른 유전자를 포함하는 발현 벡터.
- 제4항에 있어서,
상기 발현 벡터가 pET-21d(+)인 발현 벡터.
- 제4항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제6항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균인 숙주세포.
- 제1항의 폴리펩타이드를 산란계에 투여하여 면역화시키고;
상기 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수하고; 그리고
상기 산란된 알의 난황에서 난황 항체를 분리하는 단계;
를 포함하는 소 로타바이러스에 대한 난황 항체의 제조방법.
- 제8항의 방법으로 제조된 소 로타바이러스에 대한 난황 항체.
- 제1항에 따른 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 소 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물.
- 제9항에 따른 난황 항체를 유효성분으로 포함하는 소 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
- 제9항에 따른 난황 항체를 유효성분으로 포함하는 소 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 사료 조성물.
- 제10항에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제11항에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 소 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
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| KR1020120107969A KR20140041067A (ko) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | 소 로타바이러스 에피토프 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020120107969A KR20140041067A (ko) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | 소 로타바이러스 에피토프 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
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| KR20140041067A true KR20140041067A (ko) | 2014-04-04 |
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ID=50650964
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| KR1020120107969A KR20140041067A (ko) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | 소 로타바이러스 에피토프 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
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| KR (1) | KR20140041067A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210038170A (ko) | 2019-09-30 | 2021-04-07 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물 |
-
2012
- 2012-09-27 KR KR1020120107969A patent/KR20140041067A/ko not_active Application Discontinuation
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