KR20220162674A

KR20220162674A - 웅취 제거용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR20220162674A
Application number: KR1020220158721A
Authority: KR
Inventors: 손은주; 이용직; 이상민
Original assignee: 주식회사 바이오앱
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2022-11-23
Publication date: 2022-12-08
Also published as: EP3925617A1; KR102477054B1; JP7233116B2; US20230173044A1; JP2022529752A; EP3925617A4; CN113747916A; KR20210119230A; WO2021194013A1

Abstract

본 발명은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 포함하는 웅취 제거용 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 GnRH에 대한 항체를 유도하기 위한 웅취 제거용 재조합 단백질, 이를 생산하기 위한 재조합 벡터, 상기 재조합 단백질을 포함하는 웅취 제거용 백신 조성물 및 이를 이용한 웅취 제거 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 개체에 GnRH에 대한 항체를 유도하고, 이를 통해 고환을 위축시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 낮은 비용, 높은 안전성 및 최소한의 부작용으로 수퇘지를 면역적으로 거세하여 웅취를 제거하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

웅취 제거용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물 {Recombinant Protein for Removing Boar Taint and Vaccine Composition Comprising the Same}

본 발명은 웅취 제거용 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 성선자극호르몬방출호르몬(Gonadotropin-releasing hormone; GnRH)에 대한 항체를 유도하기 위한 웅취 제거용 재조합 단백질, 이를 생산하기 위한 재조합 벡터, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 웅취 제거용 백신 조성물 및 이를 이용한 웅취 제거 방법 등에 관한 것이다.

웅취(boar taint)란 돼지고기 또는 돈육 제품을 조리하거나 먹는 동안에 흔히 나타나는 불쾌한 냄새나 맛을 의미하며, 식육의 안전성에는 전혀 문제가 없으나 소비자들이 식육을 선택하는 과정에서 가장 중요하게 생각하는 것이 색 다음으로 냄새이기 때문에 수퇘지의 웅취를 제거하는 작업은 매우 중요하다.

웅취의 주 원인 물질은 스카톨(skatole)과 안드로스테론(androsterone)으로, 스카톨은 장내 박테리아의 단백질이 분해되어 만들어진 화학물질로서 사람의 배설물에도 들어있다. 스카톨은 간에서 분해가 되는데 안드로스테론이 분해를 방해한다. 즉, 분해되지 않은 스카톨이 특히 지방 부분에 쌓이게 되며, 돼지고기를 익히는 과정에서 공기 중으로 날아가며 사라지는데 이 냄새가 바로 웅취이다.

수 세기 동안 웅취를 예방하기 위해 돼지에게 거세(castration)를 시행해 왔으며, 수퇘지의 거세는 생후 약 2~3주에 실시된다. 일부 국가(네덜란드, 스위스, 노르웨이)에서는 거세에 따른 통증과 스트레스를 줄여주기 위해 전신 또는 국부 마취제를 사용하기도 하나, 최근 동물보호단체로부터 마취 여부와 관계 없이 거세에 대한 비판을 받아 왔다.

수퇘지 거세에 대한 비판이 높아지자 호주와 뉴질랜드에서는 1998년 상용화된 화이자(Pfizer) 사의 면역적 거세 백신 '임프로박(Improvac)'의 접종이 시작되었으며, 미국, EU, 일본, 스위스, 호주, 브라질 등 세계 여러 국가에서 판매되었고, 국내에는 2006년 품목허가를 취득한 바 있다. 면역적 거세 백신은 웅취 억제를 위해 돼지의 면역계를 활용하는 매우 안전하고 효율적인 해결책이 될 수 있다. 상기 백신은 돼지의 면역계를 자극하여 성선자극호르몬방출호르몬(Gonadotropin-releasing hormone; GnRH)에 대한 특이 항체를 생성함으로써 고환의 기능을 억제하여 웅취의 원인이 되는 물질이 생성 및 축적되지 않도록 해준다. 이에 대해 면역계를 이용하여 외과적 수술인 거세와 동일한 효과를 나타낸다는 점에서 면역 거세라는 표현을 사용한다.

그러나 국내의 경우에는 면역적 거세 방법에 의한 웅취 제거나 육질 개선만으로는 거세 판정기준에 100% 적합하지 않고, 외과적 거세법과 비교하여 매우 고비용(외과적 거세법이 두당 100원이라면, 면역적 거세법은 두당 5,000원)이 지출되기 때문에 해당 백신의 시장 진출이 실패로 끝난바 있다.

그럼에도 불구하고 면역적 거세 방법은 웅취 제거뿐만 아니라 외과적 거세법 실시 후 나타날 수 있는 성장 능력의 저하, 스트레스 및 통증으로 인한 면역 억제를 유발하지 않기 때문에 결국 이를 사용한 농가의 생산성 향상에 도움을 줄 수 있으며, 동물복지라는 세계적 추세에 역행하지 않기 위해서라도 기존의 외과적 거세법을 면역적 거세법으로 대체할 필요성이 힘을 얻고 있다. 이에 높은 접종 비용, 등급 판정 시 불확실성, 안전성 이슈 등 기존의 면역 거세 백신의 한계를 극복하고 순수 국내 기술을 활용하여 실제 적용 가능한 웅취 제거용 백신의 개발 필요성이 점점 높아지고 있는 실정이다.

KR

10-0659737

B1

본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 인위적으로 성선자극호르몬방출호르몬(Gonadotropin-releasing hormone; GnRH)의 항원성을 향상시키기 위하여 캐리어(carrier) 단백질과 융합한 웅취 제거용 재조합 단백질을 포함하는 백신을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 웅취 제거 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 CTB 및 n 개의 GnRH가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 웅취를 제거하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 CTB 및 n 개의 GnRH가 융합되고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 재조합 단백질의 웅취 제거 용도를 제공한다.

더욱이, 본 발명은 CTB 및 n 개의 GnRH가 융합되고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 재조합 단백질의 웅취 제거에 이용되는 백신을 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 GnRH은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 n은 6일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 n이 6일 경우 GnRH는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 GnRH는 n이 2 이상일 때, 각각 알라닌-글라이신-알라닌 링커(alanine-glycine-alanine linker)로 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc2)이 추가로 융합될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 pFc2는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 pFc2는 GnRH의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 BiP(chaperone binding protein)가 추가로 융합될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 BiP는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 BiP는 CTB의 N-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)이 추가로 융합될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 HDEL은 서열번호 11의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 HDEL은 GnRH의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 BiP, CTB, GnRH, pFc2 및 HDEL이 순차적으로 융합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 애주번트는 에멀시겐(Emulsigen)-계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 거세 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동물은 개, 고래, 고양이, 고릴라, 거위, 기니피그, 꿩, 낙타, 노루, 노새, 닭, 당나귀, 돌고래, 돼지, 라마, 말, 물소, 사슴, 소, 순록, 알파카, 야크, 양, 염소, 오랑우탄, 오리, 원숭이, 페럿, 쥐, 칠면조, 타조 또는 토끼일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HDEL 유전자를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 12의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 포함하는, 웅취 제거용 백신 조성물 등에 관한 것으로서, GnRH의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 재조합 단백질을 이용하여 이를 투여한 개체에 GnRH에 대한 항체를 유도하였고, 이를 통해 고환의 위축 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명은 낮은 비용, 높은 안전성 및 최소한의 부작용으로 수퇘지를 면역적으로 거세하여 웅취를 제거하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질의 제조를 위한 발현 카세트(expression cassette)를 나타낸 도이다(BiP, chaperone binding protein; CTB, Cholera toxin B subunit; pFc2, porcine Fc fragment; HDEL, Histidine-Aspartic acid-Glutamic acid-Leucine).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질의 분리·정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 수컷 랫트에 투여한 일정을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 수컷 랫트에 3회 투여한 후 고환을 적출하여 크기를 비교한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 수컷 랫트에 3회 투여한 후 혈중 테스토스테론의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도로서, 상단 및 중단 그림은 스탠다드를, 하단 그림은 각 그룹의 측정 결과를 나타낸 도이다.

본 발명자들은 재조합 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH) 단백질을 4주령의 랫트에 접종한 후 그에 따른 고환의 크기 및 무게의 변화, 혈중 테스토스테론 농도의 변화를 분석하였다. 그 결과 본 발명의 재조합 GnRH 단백질로 백신화된 군이 대조군과 비교하여 고환의 크기 및 무게가 감소하고 혈중 테스토스테론의 농도가 감소하였음을 확인함으로써, 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 조성물이 면역 거세 효과 및 그에 따른 웅취 제거 효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH (Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “CTB(Cholera toxin B subunit)” 또는 “콜레라 독소 B 서브유닛”은 숙주 세포에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로서, 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되나, 서열번호 5의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 콜레라 독소는 A1 및 A2 서브유닛과 5개의 B 서브유닛이 결합한 형태의 복합체이며, 콜레라 독소의 내재화 및 활성화를 위해 CTB가 점막 면역계(mucosal immune system)의 M 세포(microfold cell)에 결합한다. 이때, CTB는 세포막 이중층의 GM1-갱글리오시드(ganglioside)와 특이적으로 반응하여 결합한 후에 CTB에 결합되어 있는 A 서브유닛 또는 항원 단백질이 세포막을 통과하게 한다. CTB는 점막 장벽을 통과하는 결합 항원의 흡수 증가 및 결합 항원의 효율적인 제시를 통해 항원의 면역원성을 개선하여 점막 면역 강화를 위한 강력한 점막 애주번트(adjuvant) 및 수송체(carrier) 분자로서 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오타이드”는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산디에스터(phosphodiester) 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 또한, 예를 들면 뉴클레오타이드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “GnRH(gonadotropin-releasing hormone)”란 성선자극호르몬방출호르몬을 의미하는 것으로서, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GnRH이나, GnRH에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 GnRH는 서열번호 1의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GnRH는 10개의 아미노산으로 구성되며, 모든 동물에서 거의 동일한 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. GnRH는 시상하부에서 생성되어 뇌하수체에 작용함으로써 성 호르몬인 FSH 및 LH의 생성을 촉진시키는데, GnRH를 항원으로 이용하여 동물에 접종할 경우 GnRH를 인식하는 항체가 형성되며, 상기 항체가 체내에서 존재하는 GnRH를 제거함으로써 수컷 및 암컷 동물의 성 성숙이 차단되어 거세 효과가 발생하게 되고, 이로써 웅취가 제거되는 효과가 나타나는 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “재조합 단백질” 또는 “융합된 재조합 단백질”은 2종 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 CTB와 GnRH가 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 상기와 같이 융합된 재조합 단백질은 각각의 파트너가 결정된 후 화학적으로 합성하거나 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, CTB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 GnRH를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 연결한 융합 유전자를 세포 발현 시스템에서 발현시켜 수득할 수 있다.

본 발명의 재조합 단백질에 사용되는 GnRH는 GnRH 아미노산 서열의 한 카피(one copy) 보다는 둘 또는 그 이상의 카피(two or more copies)를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 다중 카피(multiple copy)를 갖는 경우 GnRH에 대한 면역원성을 더욱 증강시킬 수 있으므로, GnRH의 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열이 2개 이상의 다량체를 취할 수 있다. GnRH의 개수는 발현 벡터 내에서 수용 가능하다면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 2개 내지 20개, 보다 바람직하게는 2개 내지 10개가 연결된 다량체 형태를 취할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 6개가 연결된 육량체를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 GnRH 단백질이 연속적으로 여섯 번 반복되도록 제작하였다. 상기 여섯 개의 GnRH이 연결된 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 이러한 융합 재조합 단백질은 CTB와 GnRH가 직접 연결되거나 링커와 같은 아미노산 연결자를 통해 연결될 수 있다. 또한, GnRH가 여러 카피 포함되는 경우에도 각 GnRH는 직접 연결되거나 링커와 같은 연결자를 통해 연결될 수 있다. 링커를 통해 연결되는 경우 이에 의한 전체 면역원성(immunogenicity)을 감소시키지 않는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 용어 “링커”란, CTB와 GnRH를 연결하여 재조합 단백질을 만드는 경우 또는 수 개의 GnRH를 연결시키는 경우, 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시켜 결합시킨 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩타이드를 의미한다. 링커는 면역반응을 최소화할 수 있는 것이라면 그 종류나 아미노산 개수는 제한이 없으나, 바람직하게는 아미노산 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 아미노산 1개 내지 5개가 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 각 단백질을 연결시키기 위해 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 있는 제한 효소 부위의 서열을 사용하거나 알라닌-글라이신-알라닌(AGA) 링커를 사용하였다.

본 명세서에서 사용된 용어 “백신(vaccine)”은, 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방 또는 특정 항원에 대한 항체를 유도하기 위하여 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 비인간 동물로서, 그 예는 후술하였다.

본 발명의 “백신 조성물”은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스터 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수도 있으나, 상기 열거한 투여 방법에 국한되지는 않으며, 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 체액성 또는 선택적으로 세포-매개성 면역 반응 및/또는 상기 두 면역반응의 조합을 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 면역 거세용 백신 조성물은 항원, 약제학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들로 구성될 수 있고, 면역학적 효과량으로 투여한다. 본 명세서에서 사용된 용어, “면역학적 효과량”이란 면역 거세 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며 면역반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc2)이 추가로 융합된 것일 수 있다. 상기 pFc2는 GnRH의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 “Fc 단편(Fc fragment)”이란, 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 돼지의 Fc 단편이나, 재조합 단백질과 융합되었을 때 재조합 단백질의 발현량 및 용해성을 증가시키는 Fc 단편이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 6의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 BiP(chaperone binding protein)가 추가로 융합된 것일 수 있다. 상기 BiP는 GnRH 또는 CTB의 N-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 “BiP(chaperone binding protein)”는 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용된 것으로서, 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP이나, 재조합 단백질과 융합되었을 때 재조합 단백질을 소포체로 이동시키는 BiP라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 BiP는 서열번호 8의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 BiP는 발현될 때 또는 발현된 후 펩타이드의 일부가 잘려나가 일부 펩타이드만이 남을 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)이 추가로 융합된 것일 수 있다. 상기 HDEL은 GnRH 또는 pFc2의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 “HDEL”은 히스티딘-아스파트산-글루탐산-류신으로 이루어진 표적 펩타이드 서열을 의미하는 것으로서, 상기 HDEL은 재조합 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 분비되는 것을 방지하거나 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 한다. 상기 HDEL은 서열번호 11의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 BiP, CTB, GnRH, pFc2 및 HDEL이 순차적으로 융합된 것일 수 있고, 이에 따른 상기 재조합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 상기 융합 순서 또는 아미노산 서열에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 웅취(boar taint) 제거에 탁월한 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 백신 조성물에는 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 애주번트 (adjuvant)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “애주번트(Adjuvant)”란, 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성이 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 “애주번트”는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트에 통합되거나 상기 애주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다. 적절한 애주번트의 예로, 알루미늄 하이드록사이드, 프로이드 완전 또는 불완전 애주번트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 에멀시겐(Emulsigen)-계 애주번트로서 DDA(dimethyldioctadecyl ammonium bromide)를 포함하는 에멀시겐-D 애주번트를 사용하였다.

본 발명에 따른 재조합 단백질은 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 융합된 재조합 단백질의 변이체를 포함한다. 재조합 단백질의 변이체란 정상 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath et al., 1979). 또한, 상기 재조합 단백질은 인산화(phosphorylation), 메틸화(methylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다. 상기 변이체 또는 수식체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이지만, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 것이다.

본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질은 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 방법을 통해 생산할 수 있으며, 바람직하게는 재조합 벡터를 이용하여 이를 숙주세포에 형질전환시켜 이로부터 발현된 단백질을 분리, 정제하여 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

재조합 벡터는 통상 외래 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “외래 DNA”란, 외래종으로부터 기원되는 DNA를 의미하거나, 동일한 종으로부터 기원되는 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태를 의미하며, 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 코딩한다. 재조합 벡터는 숙주세포에서 형질전환된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 상기 재조합 벡터는 개체의 세포 내에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물(construct)로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역(UTR), 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 6 카피의 GnRH 유전자 단편이 포함된 pCAMBIA13000 벡터에 CTB 유전자 단편을 삽입하여 제조한 재조합 벡터를 담배 식물(Nicotiana benthamiana)에 형질전환하였다. 상기 벡터는 35S 프로모터와 HSP(heat shock protein) 종결자 시스템을 가지고 있으며, 담배 식물에서 단백질을 대량 생산하기에 유용한 벡터이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “벡터(vector)”란, 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 유전체(genome) 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 용어 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

또한, 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HDEL 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열이 추가로 더 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “형질전환(transformation)”이란, 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism 또는 transformant)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 유기체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 유기체이며, 상기 유기체는 본 발명의 목적을 달성하기 위한 것이라면 제한이 없다.

본 발명의 또 다른 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 웅취 제거 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물을 이용한 웅취 제거 방법은 동물 종에 상관없이 인간을 제외한 모든 동물에 적용 가능하다. 상기 동물은 포유동물이 바람직하며, 예컨대 개, 고래, 고양이, 고릴라, 거위, 기니피그, 꿩, 낙타, 노루, 노새, 닭, 당나귀, 돌고래, 돼지, 라마, 말, 물소, 사슴, 소, 순록, 알파카, 야크, 양, 염소, 오랑우탄, 오리, 원숭이, 페럿, 쥐, 칠면조, 타조 또는 토끼를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 있어서, 투여는 2회 이상 실시하는 것이 바람직하다. 예컨대, 1차 접종(initial vaccination) 후에 부스터 접종(booster injections)을 1주 내지 10주 간격으로 1회 내지 4회 정도 실시할 수 있으나, 이는 해당 동물의 종류에 따라 당업자가 적절하게 변형하여 실시할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: BiP-CTB-GnRH-pFc2-HDEL 융합 단백질의 발현 및 정제

GnRH에 대한 면역원성을 유도하기 위해 도 1에 나타낸 바와 같이, GnRH에 CTB, pFc2, BiP 및 HDEL을 융합한 재조합 GnRH를 발현시키기 위한 벡터를 제작하였다. 10개의 아미노산으로 구성된 GnRH은 6개가 연속되도록 하여 알라닌-글라이신-알라닌(AGA) 링커로 연결하였다. 6개가 연결된 GnRH의 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 3에 나타내었다. 또한, CTB에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 4 및 서열번호 5에, pFc2에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 6 및 서열번호 7에, BiP에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 8 및 서열번호 9에, HDEL에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타내었으며, 발현 카세트(cassette)의 전체 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 12 및 서열번호 13에 나타내었다.

상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물의 잎에 접종하여 일과성 발현(transient expression)을 하였다. 식물 잎으로부터 총단백질(Total protein)을 추출하여 원심 분리한 후, 용액에 포함되어 있는 수용성(soluble) 형태의 단백질을 protein A-sepharose column을 장착한 AKTA prime(GE Healthcare, 미국)을 이용하여 pFc2 융합 GnRH 단백질을 분리하였다.

실시예 2: 재조합 GnRH 단백질 농도 확인

상기 실시예 1에서 분리·정제한 재조합 GnRH 단백질의 농도를 확인 및 측정하기 위해 농도를 알고 있는 BSA(bovine serum albumin)를 스탠다드(standard)로 하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 분리 정제한 재조합 GnRH 단백질을 1, 2 μl 로딩하고 정량을 위해 0.5, 1, 2 μg의 BSA를 포함시켰다. Gel은 쿠마씨 블루 염색(Coomassie blue staining)을 통해 밴드를 최종적으로 확인하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 재조합 GnRH 단백질이 잘 발현되어 분리·정제되었음을 확인하였으며, GnRH 재조합 단백질의 농도가 약 2 μg/μl 인 것을 확인하였다. 상기와 같이 확인된 재조합 GnRH 단백질을 하기 실시예 3의 동물 실험에 사용하였다.

실시예 3: 재조합 GnRH 단백질의 투여 효과 확인

3.1. 실험동물, 투여 조건 및 일정

재조합 GnRH 단백질의 면역 거세 효과를 확인하기 위해 4주령 수컷 SD(Sprague Dawley) 랫트에 하기 표 1에 기재된 투여 조건으로, 도 3에 나타낸 일정에 따라 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 투여하였다. 대조군은 동일한 양의 PBS(phosphate-buffered saline)를 투여하였고, 실험군은 상기 백신 조성물 100μg/180μl 및 Emulsigen®-D 애주번트 20μl을 투여하였다(하기 표 1 참조). 입고된 4주령 랫트를 4일 정도 안정화 시킨 후, 14일 내지 15일의 투여 간격으로 총 3회 투여하였다. 채혈은 각각 투여 전 및 실험 종료 시에 시행하였으며, 3차 투여 후 4주가 경과한 시점에서 고환을 적출하여 무게 및 크기를 측정하였고, 혈중 테스토스테론(testosterone)의 농도를 측정하였다.

		대조군	실험군 (재조합 GnRH 단백질)
투여	항원	PBS 180 μl	100 μg / 180 μl
투여	애주번트	20 μl	20 μl
실험 개체수		3	3

3.2. 고환의 육안 평가

본 발명에 따른 백신 조성물의 3차 투여 후 4주가 경과한 시점에서 고환을 적출하여 육안 평가를 실시하였다. 결과는 하기 표 2 및 도 4에 나타내었다.

상기 표 2 및 도 4에 나타난 바와 같이, 비접종 대조군과 비교하여 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 접종군은 고환의 무게 및 길이가 유의하게 감소하였음을 확인하였다. 또한 무게 비율에서 확인할 수 있는 바와 같이 개체의 총 체중 대비 고환의 무게가 차지하는 비율은 백신 접종군이 현저하게 낮은 것으로 나타났으며, 백신 접종군의 고환 평균 길이도 비접종군 대비 64% 내지 86% 수준으로 나타났다.

상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 조성물의 투여에 의해 성공적으로 면역적 거세가 되었음을 확인한 것이다.

3.3. 테스토스테론(testosterone) ELISA 결과

본 발명에 따른 백신 조성물의 3차 투여 후 4주가 경과한 시점에서 채혈하여 혈중 테스토스테론의 농도를 측정하였다. 측정은 Elabscience®의 ELISA 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 구체적으로, 테스토스테론이 코팅되어 있는 플레이트에 50 μL의 혈청을 넣고 바로 동일한 양의 biotinylated Detection 항체를 넣어주었다. 37℃에서 45분간 반응시킨 후 350 μL의 washing buffer를 이용하여 3회 세척하였다. 이어서, 100 μL의 HRP conjugate 용액을 넣고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 상술한 과정과 동일하게 세척을 5번 진행한 후 90 μL의 기질액을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 그 후 50 μL의 반응정지액을 넣고 ELISA 기계를 통해 450 nm 파장에서 OD값을 측정하였다. 혈중 테스토스테론의 실제양을 정량하기 위해서 테스토스테론 스탠다드 단백질을 0.1, 0.4, 1.6, 5, 20 ng/ml로 포함하여 반응을 진행하였다. 이를 통해 얻은 OD 값으로 스탠다드 그래프를 만들고 여기에 앞서 얻은 샘플의 OD 값을 대입하여 테스토스테론을 정량하였다. 그 결과는 하기 표 3 및 도 5에 나타내었다.

스탠다드 (ng/ml)	OD450 nm	그룹	투여	개체	OD450 nm
0	1.852	비접종 대조군	PBS	1	0.171
0.1	1.037			2	0.150
0.4	0.850			3	0.194
1.6	0.559	백신 접종군	CTB-GnRH 100 μg	1	0.491
5	0.302			2	0.540
20	0.154			3	0.530

그 결과 상기 표 3 및 도 5에 나타난 바와 같이, 비접종 대조군과 비교하여 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 접종군은 혈중 테스토스테론의 농도가 현저하게 감소한 것으로 나타났다.

상기와 같은 결과 상기 실시예 3.2.의 결과와 일치하는 것으로서 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 조성물의 투여에 의해 성공적으로 면역적 거세가 되었으며, 이에 따라 웅취가 제거됨을 확인한 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> BioApplications Inc. <120> Recombinant Protein for Removing Boar Taint and Vaccine Composition Comprising the Same <130> MP20-015D1 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GnRH <400> 1 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 6X GnRH <400> 2 Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp 20 25 30 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly 35 40 45 Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 <210> 3 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of 6X GnRH <400> 3 gcaggagcag aacattggtc ttacggtctt agacctggag ctggagctga acattggagt 60 tatggtttaa gacctggagc tggagctgaa cattggtctt atggacttag accaggtgca 120 ggtgctgagc attggtcata tggattgaga ccaggagctg gtgctgagca ttggtcttat 180 ggtctaagac ctggagctgg agctgaacat tggtcttacg gactcagacc cggt 234 <210> 4 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CTB <400> 4 Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala 20 25 30 Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe 35 40 45 Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala 50 55 60 Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala 65 70 75 80 Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile 85 90 95 Ala Ala Ile Ser Met Ala 100 <210> 5 <211> 306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of CTB <400> 5 actcctcaga acataaccga tttgtgcgct gaataccata acactcaaat acacacactc 60 aacgataaga ttttctctta cactgaatca cttgctggaa agagagagat ggcaattatc 120 acctttaaaa acggagctac tttccaggtt gaagtgcctg gtagtcaaca tatcgattca 180 cagaagaaag caatagagag gatgaaggat acacttagga ttgcttattt gaccgaagca 240 aaagttgaga aactctgtgt gtggaataac aaaacccctc acgctatcgc tgctatctct 300 atggcc 306 <210> 6 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of pFc2 <400> 6 Arg Ala Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro 1 5 10 15 Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 35 40 45 Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp Leu Lys Gly 85 90 95 Lys Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser 130 135 140 Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu 145 150 155 160 Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 180 185 190 Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe Gln Cys Ala 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Val Ser 210 215 220 Lys Thr Gln Gly Lys 225 <210> 7 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of pFc2 <400> 7 gttggaagac catgccctat atgtcctgct tgtgaaggtc caggtccctc tgcttttata 60 ttcccaccaa agccgaagga taccttgatg atttcacgta caccacaagt tacttgtgtt 120 gttgtggatg tttcacaaga aaatcctgag gtacaattca gctggtatgt tgatggggta 180 gaagtgcaca ctgcacagac tcgaccaaag gaggcccagt ttaactcgac ttatagagtt 240 gtttctgttc tcccaatcca acacgaagat tggctgaagg gcaaggaatt tgaatgcaag 300 gttaacaata aagatctacc agcaccaatt accaggatta tttctaaggc aaaaggaccc 360 tccagagagc cccaagttta cacattgtct ccttctgctg aggagcttag tagaagtaaa 420 gtgagcatta cctgcttagt gacgggattc taccctccag acatcgacgt cgaatggaaa 480 tctaatggtc aacctgagcc agaaggtaac tataggacta ctccaccaca acaggacgtc 540 gatggcacat actttcttta ttcaaaactt gctgtcgata aggcaagttg gcaaagagga 600 gatccatttc agtgtgctgt aatgcatgag gctttgcata atcattatac acagaaatca 660 gtttctaaaa cacaagggaa a 681 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of BiP <400> 8 Ile Glu Glu Ala Thr Lys Leu 1 5 <210> 9 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of BiP <400> 9 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HDEL <400> 10 His Asp Glu Leu 1 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of HDEL <400> 11 cacgatgagc tc 12 <210> 12 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full amino acid sequence of 1300-BiP:CTB:GnRH:pFc2:HDEL <400> 12 Ile Glu Glu Ala Thr Lys Leu Arg Ile Leu Thr Pro Gln Asn Ile Thr 1 5 10 15 Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp 20 25 30 Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala 35 40 45 Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly 50 55 60 Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp 65 70 75 80 Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys 85 90 95 Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala 100 105 110 Thr Ser Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala 115 120 125 Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu 130 135 140 His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser 145 150 155 160 Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 165 170 175 Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 180 185 190 Ala Arg Ala Arg Ala Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys 195 200 205 Glu Gly Pro Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 210 215 220 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp 225 230 235 240 Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly 245 250 255 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn 260 265 270 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp 275 280 285 Leu Lys Gly Lys Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro 290 295 300 Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu 305 310 315 320 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser 325 330 335 Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile 340 345 350 Asp Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr 355 360 365 Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr 370 375 380 Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe 385 390 395 400 Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 405 410 415 Ser Val Ser Lys Thr Gln Gly Lys His Asp Glu Leu 420 425 <210> 13 <211> 1565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full DNA sequence of 1300-BiP:CTB:GnRH:pFc2:HDEL <400> 13 tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60 gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120 cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180 tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240 ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcaat agaagaggct acgaagttaa 300 ggatcctcac tcctcagaac ataaccgatt tgtgcgctga ataccataac actcaaatac 360 acacactcaa cgataagatt ttctcttaca ctgaatcact tgctggaaag agagagatgg 420 caattatcac ctttaaaaac ggagctactt tccaggttga agtgcctggt agtcaacata 480 tcgattcaca gaagaaagca atagagagga tgaaggatac acttaggatt gcttatttga 540 ccgaagcaaa agttgagaaa ctctgtgtgt ggaataacaa aacccctcac gctatcgctg 600 ctatctctat ggccactagt gcaggagcag aacattggtc ttacggtctt agacctggag 660 ctggagctga acattggagt tatggtttaa gacctggagc tggagctgaa cattggtctt 720 atggacttag accaggtgca ggtgctgagc attggtcata tggattgaga ccaggagctg 780 gtgctgagca ttggtcttat ggtctaagac ctggagctgg agctgaacat tggtcttacg 840 gactcagacc cggtgcccgg gcagttggaa gaccatgccc tatatgtcct gcttgtgaag 900 gtccaggtcc ctctgctttt atattcccac caaagccgaa ggataccttg atgatttcac 960 gtacaccaca agttacttgt gttgttgtgg atgtttcaca agaaaatcct gaggtacaat 1020 tcagctggta tgttgatggg gtagaagtgc acactgcaca gactcgacca aaggaggccc 1080 agtttaactc gacttataga gttgtttctg ttctcccaat ccaacacgaa gattggctga 1140 agggcaagga atttgaatgc aaggttaaca ataaagatct accagcacca attaccagga 1200 ttatttctaa ggcaaaagga ccctccagag agccccaagt ttacacattg tctccttctg 1260 ctgaggagct tagtagaagt aaagtgagca ttacctgctt agtgacggga ttctaccctc 1320 cagacatcga cgtcgaatgg aaatctaatg gtcaacctga gccagaaggt aactatagga 1380 ctactccacc acaacaggac gtcgatggca catactttct ttattcaaaa cttgctgtcg 1440 ataaggcaag ttggcaaaga ggagatccat ttcagtgtgc tgtaatgcat gaggctttgc 1500 ataatcatta tacacagaaa tcagtttcta aaacacaagg gaaacacgat gagctctagc 1560 tcgag 1565

Claims

CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고,
상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 GnRH는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CTB는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 n은 6인 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제4항에 있어서,
상기 GnRH는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 GnRH는 n이 2 이상일 때, 각각 알라닌-글라이신-알라닌(alanine-glycine-alanine) 링커로 연결된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc2)이 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제7항에 있어서,
상기 pFc2는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제8항에 있어서,
상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 pFc2는 GnRH의 C-말단 방향에 융합되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 BiP(chaperone binding protein)가 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제10항에 있어서,
상기 BiP는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제10항에 있어서,
상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 BiP는 CTB의 N-말단 방향에 융합되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)이 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제13항에 있어서,
상기 HDEL은 서열번호 11의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제13항에 있어서,
상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 HDEL은 GnRH의 C-말단 방향에 융합되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 BiP, CTB, GnRH, pFc2 및 HDEL이 순차적으로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제16항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
제18항에 있어서,
상기 애주번트는 에멀시겐(Emulsigen)-계인 것을 특징으로 하는, 면역 거세용 백신 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 웅취 제거 방법.
제20항에 있어서,
상기 동물은 개, 고래, 고양이, 고릴라, 거위, 기니피그, 꿩, 낙타, 노루, 노새, 닭, 당나귀, 돌고래, 돼지, 라마, 말, 물소, 사슴, 소, 순록, 알파카, 야크, 양, 염소, 오랑우탄, 오리, 원숭이, 페럿, 쥐, 칠면조, 타조 또는 토끼인, 동물의 웅취 제거 방법.
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
제22항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
제22항 또는 제23항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
제24항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HDEL 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
제25항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 12의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
제22항의 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질.
제22항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.