WO2021194013A1 - 웅취 제거용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

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boar taint
gnrh
vaccine composition
seq
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine composition for removing boar taint, and more particularly, to a recombinant protein for removing boar taint for inducing an antibody against gonadotropin-releasing hormone (GnRH), a recombinant vector for producing the same, and the recombinant
  • the present invention relates to a vaccine composition for removing boar taint containing protein as an active ingredient, and a method for removing boar taint using the same.
  • Boar taint refers to an unpleasant odor or taste that is commonly seen while cooking or eating pork or pork products. It is very important to get rid of boar odor because it is an odor.
  • the main causative agents of boar taint are skatole and androsterone.
  • Skatole is a chemical made by decomposing the proteins of intestinal bacteria and is also contained in human excrement. Skatole is broken down in the liver, but androsterone interferes with its breakdown. In other words, undecomposed skatole accumulates, especially in the fat part, and it is blown into the air during the cooking process of pork and disappears, and this smell is boar odor.
  • Immunocastration vaccines could be a very safe and efficient solution to harness the pig's immune system to suppress boar taint.
  • the vaccine stimulates the immune system of pigs to produce specific antibodies to gonadotropin-releasing hormone (GnRH), thereby suppressing the function of the testicles, thereby preventing the production and accumulation of substances causing boar taint.
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • the expression “immune castration” is used in that it shows the same effect as the surgical castration using the immune system.
  • the immune castration method not only removes boar taint but also does not cause immunosuppression due to stress and pain, which can occur after surgical castration.
  • the need to replace the existing surgical castration with immunological castration is gaining strength. Accordingly, there is a growing need to develop a vaccine for removing boar taint that can be applied in practice by overcoming the limitations of the existing immuno-castration vaccine, such as high inoculation cost, uncertainty in grading, and safety issues, and using pure domestic technology.
  • the present invention has been devised in order to solve the problems of the prior art as described above, and is fused with a carrier protein to artificially improve the antigenicity of gonadotropin-releasing hormone (GnRH).
  • the present invention was completed by developing a vaccine containing a recombinant protein for removal.
  • n is an integer from 1 to 20.
  • a vaccine composition for removing boar taint is to provide
  • Another object of the present invention is to provide a method for eliminating boar taint in animals, comprising administering the vaccine composition according to the present invention to animals other than humans.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector for removing boar taint, comprising the GnRH gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the CTB gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant protein for removing boar taint prepared by using the recombinant vector according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant, transformed with the recombinant vector according to the present invention.
  • n is an integer from 1 to 20
  • a vaccine composition for eliminating boar taint is provided.
  • the present invention provides a method of removing boar taint by administering a vaccine composition comprising a recombinant protein in which CTB and n GnRHs are fused as an active ingredient, wherein n is an integer of 1 to 20 to individuals other than humans.
  • the present invention provides a use for removing boar taint of a recombinant protein in which CTB and n GnRHs are fused, wherein n is an integer of 1 to 20.
  • the present invention provides a use for producing a vaccine used for eliminating boar taint of a recombinant protein in which CTB and n GnRHs are fused, wherein n is an integer from 1 to 20.
  • the GnRH may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the CTB may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • n may be 6, but is not limited thereto.
  • GnRH may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the GnRH when n is 2 or more, may be linked by an alanine-glycine-alanine linker, but is not limited thereto.
  • the recombinant protein may be further fused with a pig immunoglobulin Fc fragment (pFc2).
  • pFc2 pig immunoglobulin Fc fragment
  • the pFc2 may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • the CTB may be fused to the N-terminal direction of GnRH, and the pFc2 may be fused to the C-terminal direction of GnRH, but is not limited thereto.
  • the recombinant protein may be further fused with a chaperone binding protein (BiP).
  • BiP chaperone binding protein
  • the BiP may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the CTB may be fused to the N-terminal direction of GnRH, and the BiP may be fused to the N-terminal direction of CTB, but is not limited thereto.
  • the recombinant protein may be further fused with HDEL (His-Asp-Glu-Leu).
  • the HDEL may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto.
  • the CTB may be fused to the N-terminal direction of GnRH
  • the HDEL may be fused to the C-terminal direction of GnRH, but is not limited thereto.
  • the recombinant protein may be a sequential fusion of BiP, CTB, GnRH, pFc2 and HDEL, but is not limited thereto.
  • the recombinant protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto.
  • the vaccine composition may further include an adjuvant.
  • the adjuvant may be an emulsigen-based, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for immune castration of an animal, comprising administering the vaccine composition according to the present invention to an animal other than a human.
  • the animal is a dog, whale, cat, gorilla, goose, guinea pig, pheasant, camel, roe deer, mule, chicken, donkey, dolphin, pig, llama, horse, water buffalo, deer, cattle, It may be, but is not limited to, a reindeer, alpaca, yak, sheep, goat, orangutan, duck, monkey, ferret, rat, turkey, ostrich or rabbit.
  • the present invention provides a recombinant vector for removing boar taint, comprising the GnRH gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the CTB gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the recombinant vector may further include a polynucleotide encoding pFc2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may further include a polynucleotide encoding BiP consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may further include an HDEL gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may include a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a recombinant protein for removing boar taint prepared by using the recombinant vector according to the present invention.
  • the present invention provides a transformant, transformed with the recombinant vector according to the present invention.
  • the present invention relates to a vaccine composition for eliminating boar taint, comprising a recombinant protein fused with Cholera toxin B subunit (CTB) and Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), using a recombinant protein comprising a GnRH polypeptide sequence.
  • CTB Cholera toxin B subunit
  • GnRH Gonadotropin-releasing hormone
  • Antibodies against GnRH were induced in the administered subject, and the atrophic effect of the testes was confirmed through this. Therefore, the present invention can be effectively used to remove boar taint by immuno-castrating boars with low cost, high safety and minimal side effects.
  • FIG. 1 is a view showing an expression cassette for the production of a recombinant GnRH protein according to an embodiment of the present invention (BiP, chaperone binding protein; CTB, Cholera toxin B subunit; pFc2, porcine Fc fragment; HDEL, Histidine-Aspartic acid-Glutamic acid-Leucine).
  • BiP chaperone binding protein
  • CTB Cholera toxin B subunit
  • pFc2 porcine Fc fragment
  • HDEL Histidine-Aspartic acid-Glutamic acid-Leucine
  • FIG. 2 is a view showing the results of separation and purification of recombinant GnRH protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a schedule in which a vaccine composition containing recombinant GnRH protein according to an embodiment of the present invention is administered to male rats.
  • FIG. 4 is a diagram comparing the size of the testes after administering the vaccine composition containing the recombinant GnRH protein according to an embodiment of the present invention to male rats three times.
  • FIG. 5 is a road showing the results of measuring the concentration of testosterone in the blood after administration of the vaccine composition containing the recombinant GnRH protein according to an embodiment of the present invention to male rats three times, the upper and the middle figures are the standard, the lower The figure is a diagram showing the measurement results of each group.
  • the present inventors analyzed changes in the size and weight of testes and changes in blood testosterone concentration after inoculation of recombinant gonadotropin-releasing hormone (GnRH) protein into 4-week-old rats. As a result, it was confirmed that the group vaccinated with the recombinant GnRH protein of the present invention reduced the size and weight of testes and decreased the concentration of testosterone in the blood compared to the control group, so that the vaccine composition comprising the recombinant GnRH protein according to the present invention was prepared The present invention was completed by confirming that it had an immune castration effect and thus a boar odor removal effect.
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • the present invention provides a vaccine composition for removing boar taint, comprising a recombinant protein in which CTB (Cholera toxin B subunit) and n GnRH (Gonadotropin-releasing hormone) are fused as an active ingredient, wherein n is an integer of 1 to 20.
  • CTB Choera toxin B subunit
  • n GnRH Gonadotropin-releasing hormone
  • Cholera toxin B subunit or “cholera toxin B subunit” refers to a polypeptide having binding activity to a host cell, and preferably includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 It is encoded by a polynucleotide that is, most preferably encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5, but 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% of the base sequence of SEQ ID NO: 5 It may be encoded by a nucleotide sequence having the above sequence homology.
  • sequence homology includes a polynucleotide having The "% of sequence homology" for a polynucleotide is determined by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) to the optimal alignment of the two sequences.
  • Cholera toxin is a complex of A1 and A2 subunits and five B subunits combined, and CTB binds to M cells (microfold cells) of the mucosal immune system for internalization and activation of cholera toxin. At this time, CTB reacts specifically with GM1-ganglioside of the cell membrane bilayer to allow the A subunit or antigenic protein bound to CTB to pass through the cell membrane after binding.
  • CTB can be used as a potent mucosal adjuvant and carrier molecule for enhancing mucosal immunity by improving antigen immunogenicity through increased absorption of bound antigens across the mucosal barrier and efficient presentation of bound antigens. have.
  • polynucleotide refers to an oligomer comprising two or more linked nucleotides or nucleotide derivatives linked to each other by generally phosphodiester bonds, including deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA). or a polymer.
  • Polynucleotides may also contain, for example, nucleotide analogs, or “backbone” bonds other than phosphate diester bonds, such as triphosphate bonds, phosphoramidate bonds, phosphorothioate bonds, thioester bonds or peptide bonds ( peptide nucleic acids), including DNA and RNA derivatives.
  • Polynucleotides include single-stranded and/or double-stranded polynucleotides, such as deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA), as well as analogs of either RNA or DNA.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • the peptide may include an amino acid sequence having 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is known that GnRH is composed of 10 amino acids, and is composed of almost the same amino acids in all animals.
  • GnRH is produced in the hypothalamus and acts on the pituitary gland to promote the production of sex hormones FSH and LH.
  • an antibody recognizing GnRH is formed, and the antibody is present in the body.
  • the term “recombinant protein” or “fused recombinant protein” refers to a protein in which two or more proteins are artificially linked, and in the present invention, it refers to a protein in which CTB and GnRH are linked.
  • the recombinant protein fused as described above can be obtained by chemically synthesizing after each partner is determined, or by expressing and purifying by a genetic recombination method. Preferably, it can be obtained by expressing a fusion gene in which a polynucleotide encoding CTB and a polynucleotide encoding GnRH are linked in a cell expression system.
  • GnRH used in the recombinant protein of the present invention preferably has two or more copies (two or more copies) rather than one copy (one copy) of the GnRH amino acid sequence. Since it is possible to further enhance immunogenicity against GnRH when having such multiple copies, the amino acid sequence of GnRH, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, may take two or more multimers.
  • the number of GnRH is not particularly limited as long as it is acceptable in the expression vector, but preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10 linked multimeric form, more preferably 6 linked A hexamer may be used.
  • the GnRH protein was produced to be repeated six times in a row.
  • the six GnRH-linked polypeptide may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • CTB and GnRH may be directly linked or may be linked through an amino acid linker such as a linker.
  • each GnRH may be directly linked or linked through a linker such as a linker. It is preferred not to reduce overall immunogenicity thereby when linked via a linker.
  • linker refers to when a recombinant protein is made by linking CTB and GnRH, or when linking several GnRHs, by increasing the structural flexibility of these proteins so that the activity of each bound protein can be enhanced. It refers to a peptide that is inserted between a protein and a protein. As long as the linker can minimize the immune response, the type or number of amino acids is not limited, but preferably 1 to 20 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids. In a specific example of the present invention, in order to link each protein, the sequence of the restriction enzyme site in the multi-cloning site of the vector was used or an alanine-glycine-alanine (AGA) linker was used.
  • AGA alanine-glycine-alanine
  • the term “vaccine” is a biological preparation containing an antigen that induces an immune response in a living body, and is injected or orally administered to an animal to prevent infection or induce an antibody to a specific antigen.
  • An immunogen that produces immunity to The animal is a non-human animal, examples of which will be described later.
  • the “vaccine composition” of the present invention may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and the like, and sterile injection solutions, respectively, according to conventional methods.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and the like, and sterile injection solutions, respectively, according to conventional methods.
  • it can be prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the lecithin-like emulsifier, for example, starch, calcium carbonate, sucrose.
  • compositions for oral administration suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc. can be used.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives are used. may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous preparations, suspensions, emulsions, and freeze-dried preparations.
  • non-aqueous preparation and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • the route of administration of the vaccine composition according to the present invention is, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the vaccine composition of the present invention may also be administered in the form of a suppository for rectal administration, but is not limited to the administration methods listed above, and may be administered by any device capable of transporting the active substance to a target cell.
  • the vaccine composition according to the invention is capable of inducing a humoral or optionally cell-mediated immune response and/or a combination of the two immune responses.
  • the dosage of the vaccine composition according to the present invention is selected in consideration of the individual's age, weight, sex, physical condition, and the like.
  • the amount required to induce an immune response in an individual without significant side effects may vary depending on the recombinant protein used as the immunogen and any presence of excipients.
  • the vaccine composition for immune castration according to the present invention may be composed of an antigen, a pharmaceutically acceptable carrier, an appropriate adjuvant, and other conventional substances, and is administered in an immunologically effective amount.
  • immunologically effective amount refers to an amount sufficient to exhibit an immune castration effect and an amount sufficient to not cause side effects or serious or excessive immune response, and the precise dosage concentration is the specific immunogen to be administered. , and can be determined by a person skilled in the art using known methods in order to examine the occurrence of an immune response. In addition, it may change depending on the dosage form and route, the age, health and weight of the recipient, the nature and severity of symptoms, the type of current treatment, and the number of treatments.
  • the recombinant protein according to the present invention may be a porcine Fc fragment (pFc2) further fused with porcine immunoglobulin.
  • the pFc2 may be fused to the C-terminal direction of GnRH, but is not limited thereto.
  • the term “Fc fragment” means that, when immunoglobulin is digested by papain, only the heavy chain (H chain) portion is connected by SS bond, and the antigen-binding site is The portion not having it is called an Fc fragment, and the Fc fragment of the present invention is preferably a porcine Fc fragment, more preferably a porcine Fc fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or a recombinant protein when fused with a recombinant protein If it is an Fc fragment that increases the expression level and solubility of, it is not limited thereto.
  • a variant of SEQ ID NO: 6 is included in the scope of the present invention.
  • the peptide may include an amino acid sequence having 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more sequence homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the recombinant protein according to the present invention may be a fusion of chaperone binding protein (BiP).
  • the BiP may be fused to the N-terminal direction of GnRH or CTB, but is not limited thereto.
  • the term “chaperone binding protein (BiP)” is used to move the expressed recombinant protein to the endoplasmic reticulum, preferably BiP consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or when fused with a recombinant protein. If it is BiP that moves the protein to the endoplasmic reticulum, it is not limited thereto.
  • BiP of the present invention a variant of SEQ ID NO: 8 is included in the scope of the present invention.
  • the peptide may include an amino acid sequence having 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more sequence homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. When the BiP is expressed or after it is expressed, a portion of the peptide may be cleaved, leaving only a portion of the peptide.
  • the recombinant protein according to the present invention may be a fusion of HDEL (His-Asp-Glu-Leu).
  • the HDEL may be fused to the C-terminal direction of GnRH or pFc2, but is not limited thereto.
  • the term “HDEL” refers to a target peptide sequence consisting of histidine-aspartic acid-glutamic acid-leucine, and the HDEL prevents the recombinant protein from being secreted from the endoplasmic reticulum or is stable in the endoplasmic reticulum. to be maintained as The HDEL may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto.
  • the recombinant protein according to the present invention may be one in which BiP, CTB, GnRH, pFc2 and HDEL are sequentially fused, and thus the recombinant protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, but the fusion sequence or amino acid sequence The present invention is not limited by the sequence.
  • the vaccine composition according to the present invention has an excellent effect in removing boar taint.
  • the vaccine composition according to the present invention may include one or more adjuvants to improve or enhance the immune response.
  • the term “adjuvant” refers to a substance or composition that is added to a vaccine or pharmaceutically active ingredients to increase or affect an immune response. Typically, it refers to a carrier or auxiliary material for an immunogen and/or other pharmaceutically active material or composition. Typically, the term “adjuvant” is to be construed in a broad sense and encompasses a broad range of substances or strategies capable of enhancing the immunogenicity of an antigen incorporated into or administered with the adjuvant. means In addition, the adjuvant, without being limited thereto, may be divided into an immune potentiator, an antigen delivery system, or a combination thereof.
  • Suitable adjuvants may include aluminum hydroxide, Freud's complete or incomplete adjuvant, DEAE dextran, levamisole, PCG and poly I:C or poly A:U.
  • an emulsigen-D adjuvant containing dimethyldioctadecyl ammonium bromide (DDA) was used as an emulsigen-based adjuvant.
  • the recombinant protein according to the present invention includes a mutant of a fused recombinant protein as well as a protein having a wild type amino acid sequence.
  • the recombinant protein variant refers to a protein having a sequence different from the normal amino acid sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of one or more amino acid residues, or a combination thereof.
  • Amino acid exchange at the protein and peptide level that does not entirely alter the activity of the molecule is known in the art (H. Neurath et al., 1979).
  • the recombinant protein may be modified by phosphorylation, methylation, sulfation, acrylation, glycosylation, farnesylation, or the like.
  • the variant or modified form is a functional equivalent that exhibits the same biological activity as that of a native protein, but may be a variant or modified form in which properties of the protein are modified, if necessary.
  • structural stability to heat, pH, etc. of the protein is increased or protein activity is increased by mutation and modification in the amino acid sequence.
  • the recombinant GnRH protein according to the present invention can be synthesized chemically or produced through a genetic recombination method, preferably by transforming the host cell using a recombinant vector to isolate and purify the expressed protein therefrom.
  • the present invention can provide a recombinant vector for removing boar taint, comprising the GnRH gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the CTB gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a recombinant vector is a carrier into which a fragment of foreign DNA is inserted, and generally refers to a fragment of double-stranded DNA.
  • foreign DNA refers to DNA originating from a foreign species or, when originating from the same species, a form substantially modified from the original form, and the foreign gene is a specific target nucleic acid to be transcribed. encodes a polypeptide.
  • Recombinant vectors must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host in order to increase the expression level of the transformed gene in the host cell.
  • the recombinant vector is a genetic construct comprising essential regulatory elements operably linked so that the gene insert is expressed in a cell of an individual, and standard recombinant DNA techniques can be used to prepare such a genetic construct.
  • the type of recombinant vector is not particularly limited as long as it functions to express a desired gene in various host cells of prokaryotic and eukaryotic cells and produce a desired protein.
  • a vector capable of producing a large amount of a foreign protein in a form similar to that of The recombinant vector preferably contains at least a promoter, a start codon, a gene encoding a desired protein, a stop codon, and a terminator.
  • DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, an untranslated region (UTR) at the 5' end and 3' end of a gene of interest, a selectable marker region, or a replicable unit may be included as appropriate.
  • a recombinant vector prepared by inserting the CTB gene fragment into the pCAMBIA13000 vector containing 6 copies of the GnRH gene fragment was transformed into a tobacco plant (Nicotiana benthamiana).
  • the vector has a 35S promoter and a heat shock protein (HSP) terminator system, and is a useful vector for mass production of proteins in tobacco plants.
  • HSP heat shock protein
  • the term “vector” refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to suitable regulatory sequences capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • a vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genome insert. Once transformed into an appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host's genome, or in some cases can be integrated into the genome itself.
  • plasmid is currently the most commonly used form of vector, the terms “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably.
  • the present invention includes other forms of vectors that have an equivalent function as known or coming to be known in the art.
  • the recombinant vector is a polynucleotide encoding pFc2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a polynucleotide encoding BiP consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and HDEL gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
  • pFc2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • BiP consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • HDEL gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
  • One or more sequences selected from the group consisting of may be further included.
  • the present invention may provide a recombinant protein for removing boar taint prepared by using the recombinant vector according to the present invention.
  • the present invention can provide a transformant, transformed with the recombinant vector according to the present invention.
  • transformation refers to a change in the genetic properties of an organism due to the injected DNA
  • transgenic organism or transformant refers to an external An organism produced by injecting a gene, preferably an organism transformed by the recombinant vector of the present invention, and the organism is not limited as long as it is intended to achieve the object of the present invention.
  • the present invention may provide a method for eliminating boar taint in animals, comprising administering the vaccine composition according to the present invention to animals other than humans.
  • the method for removing boar taint using the vaccine composition of the present invention is applicable to all animals except humans, regardless of animal species.
  • the animal is preferably a mammal, such as dog, whale, cat, gorilla, goose, guinea pig, pheasant, camel, roe deer, mule, chicken, donkey, dolphin, pig, llama, horse, water buffalo, deer, cattle, reindeer, Alpaca, yak, sheep, goat, orangutan, duck, monkey, ferret, rat, turkey, ostrich or rabbit may be exemplified, but not limited thereto.
  • administration is preferably performed twice or more.
  • booster injections may be administered about 1 to 4 times at intervals of 1 to 10 weeks after the initial vaccination, but this may be performed with appropriate modifications by those skilled in the art depending on the type of the animal. can
  • GnRH As shown in FIG. 1 to induce immunogenicity against GnRH, a vector for expressing recombinant GnRH in which CTB, pFc2, BiP and HDEL were fused to GnRH was constructed.
  • GnRH consisting of 10 amino acids was connected to 6 consecutive alanine-glycine-alanine (AGA) linkers.
  • AGA alanine-glycine-alanine
  • amino acid sequence and base sequence for CTB are in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively
  • amino acid sequence and base sequence for pFc2 are in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively
  • amino acid sequence and base sequence for BiP are, respectively
  • amino acid sequence and base sequence for HDEL are shown in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, respectively
  • the entire amino acid sequence and base sequence of the expression cassette are SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 is shown.
  • Agrobacterium tumefaciens By inoculating the transformed Agrobacterium Jewish meopae sieon's (Agrobacterium tumefaciens) with the vector in the leaves of tobacco plants were transient expression (transient expression). After extracting total protein from plant leaves and centrifuging, the soluble protein contained in the solution was converted to pFc2 using AKTA prime (GE Healthcare, USA) equipped with a protein A-sepharose column. The fusion GnRH protein was isolated.
  • AKTA prime GE Healthcare, USA
  • a vaccine composition containing the recombinant GnRH protein according to the present invention was administered to 4-week-old male SD (Sprague Dawley) rats according to the schedule shown in FIG. 3 under the administration conditions described in Table 1 below. administered.
  • the control group was administered the same amount of phosphate-buffered saline (PBS), and the experimental group was administered 100 ⁇ g/180 ⁇ l of the vaccine composition and 20 ⁇ l of Emulsigen®-D adjuvant (see Table 1 below).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Emulsigen®-D adjuvant see Table 1 below.
  • testicles were removed and visual evaluation was performed at a time point 4 weeks later.
  • the results are shown in Table 2 and FIG. 4 below.
  • reaction stop solution 50 ⁇ L was added and the OD value was measured at 450 nm wavelength through an ELISA machine.
  • the reaction was carried out by including testosterone standard protein at 0.1, 0.4, 1.6, 5, and 20 ng/ml. A standard graph was made with the OD value obtained through this, and testosterone was quantified by substituting the OD value of the previously obtained sample here. The results are shown in Table 3 and Figure 5 below.
  • the concentration of testosterone in the blood was significantly reduced in the vaccinated group including the recombinant GnRH protein compared to the non-vaccinated control group.
  • Example 3.2 The above results are consistent with the results of Example 3.2., and it was confirmed that immunocastration was successfully achieved by administration of the vaccine composition comprising the recombinant GnRH protein according to the present invention, and thus boar odor was removed.
  • the present invention relates to a vaccine composition for eliminating boar taint, comprising a recombinant protein fused with Cholera toxin B subunit (CTB) and Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), using a recombinant protein comprising a GnRH polypeptide sequence.
  • CTB Cholera toxin B subunit
  • GnRH Gonadotropin-releasing hormone
  • Antibodies against GnRH were induced in the administered subject, and the atrophic effect of the testes was confirmed through this. Therefore, the present invention can be used to immuno-castrate boars with low cost, high safety, and minimal side effects to remove boar odor, and is expected to have great industrial use value.

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Abstract

본 발명은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 포함하는 웅취 제거용 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 GnRH에 대한 항체를 유도하기 위한 웅취 제거용 재조합 단백질, 이를 생산하기 위한 재조합 벡터, 상기 재조합 단백질을 포함하는 웅취 제거용 백신 조성물 및 이를 이용한 웅취 제거 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 개체에 GnRH에 대한 항체를 유도하고, 이를 통해 고환을 위축시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 낮은 비용, 높은 안전성 및 최소한의 부작용으로 수퇘지를 면역적으로 거세하여 웅취를 제거하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

웅취 제거용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물
본 발명은 웅취 제거용 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 성선자극호르몬방출호르몬(Gonadotropin-releasing hormone; GnRH)에 대한 항체를 유도하기 위한 웅취 제거용 재조합 단백질, 이를 생산하기 위한 재조합 벡터, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 웅취 제거용 백신 조성물 및 이를 이용한 웅취 제거 방법 등에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 3월 24일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0035897호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
웅취(boar taint)란 돼지고기 또는 돈육 제품을 조리하거나 먹는 동안에 흔히 나타나는 불쾌한 냄새나 맛을 의미하며, 식육의 안전성에는 전혀 문제가 없으나 소비자들이 식육을 선택하는 과정에서 가장 중요하게 생각하는 것이 색 다음으로 냄새이기 때문에 수퇘지의 웅취를 제거하는 작업은 매우 중요하다.
웅취의 주 원인 물질은 스카톨(skatole)과 안드로스테론(androsterone)으로, 스카톨은 장내 박테리아의 단백질이 분해되어 만들어진 화학물질로서 사람의 배설물에도 들어있다. 스카톨은 간에서 분해가 되는데 안드로스테론이 분해를 방해한다. 즉, 분해되지 않은 스카톨이 특히 지방 부분에 쌓이게 되며, 돼지고기를 익히는 과정에서 공기 중으로 날아가며 사라지는데 이 냄새가 바로 웅취이다.
수 세기 동안 웅취를 예방하기 위해 돼지에게 거세(castration)를 시행해 왔으며, 수퇘지의 거세는 생후 약 2~3주에 실시된다. 일부 국가(네덜란드, 스위스, 노르웨이)에서는 거세에 따른 통증과 스트레스를 줄여주기 위해 전신 또는 국부 마취제를 사용하기도 하나, 최근 동물보호단체로부터 마취 여부와 관계없이 거세에 대한 비판을 받아왔다.
수퇘지 거세에 대한 비판이 높아지자 호주와 뉴질랜드에서는 1998년 상용화된 화이자(Pfizer) 사의 면역적 거세 백신 '임프로박(Improvac)'의 접종이 시작되었으며, 미국, EU, 일본, 스위스, 호주, 브라질 등 세계 여러 국가에서 판매되었고, 국내에는 2006년 품목허가를 취득한 바 있다. 면역적 거세 백신은 웅취 억제를 위해 돼지의 면역계를 활용하는 매우 안전하고 효율적인 해결책이 될 수 있다. 상기 백신은 돼지의 면역계를 자극하여 성선자극호르몬방출호르몬(Gonadotropin-releasing hormone; GnRH)에 대한 특이 항체를 생성함으로써 고환의 기능을 억제하여 웅취의 원인이 되는 물질이 생성 및 축적되지 않도록 해준다. 이에 대해 면역계를 이용하여 외과적 수술인 거세와 동일한 효과를 나타낸다는 점에서 면역 거세라는 표현을 사용한다.
그러나 국내의 경우에는 면역적 거세 방법에 의한 웅취 제거나 육질 개선만으로는 거세 판정기준에 100% 적합하지 않고, 외과적 거세법과 비교하여 매우 고비용(외과적 거세법이 두당 100원이라면, 면역적 거세법은 두당 5,000원)이 지출되기 때문에 해당 백신의 시장 진출이 실패로 끝난바 있다.
그럼에도 불구하고 면역적 거세 방법은 웅취 제거뿐만 아니라 외과적 거세법 실시 후 나타날 수 있는 성장 능력의 저하, 스트레스 및 통증으로 인한 면역 억제를 유발하지 않기 때문에 결국 이를 사용한 농가의 생산성 향상에 도움을 줄 수 있으며, 동물복지라는 세계적 추세에 역행하지 않기 위해서라도 기존의 외과적 거세법을 면역적 거세법으로 대체할 필요성이 힘을 얻고 있다. 이에 높은 접종 비용, 등급 판정 시 불확실성, 안전성 이슈 등 기존의 면역 거세 백신의 한계를 극복하고 순수 국내 기술을 활용하여 실제 적용 가능한 웅취 제거용 백신의 개발 필요성이 점점 높아지고 있는 실정이다.
본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 인위적으로 성선자극호르몬방출호르몬(Gonadotropin-releasing hormone; GnRH)의 항원성을 향상시키기 위하여 캐리어(carrier) 단백질과 융합한 웅취 제거용 재조합 단백질을 포함하는 백신을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 웅취 제거 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CTB 및 n 개의 GnRH가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 웅취를 제거하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CTB 및 n 개의 GnRH가 융합되고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 재조합 단백질의 웅취 제거 용도를 제공한다.
더욱이, 본 발명은 CTB 및 n 개의 GnRH가 융합되고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 재조합 단백질의 웅취 제거에 이용되는 백신을 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 GnRH은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 n은 6일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 n이 6일 경우 GnRH는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 GnRH는 n이 2 이상일 때, 각각 알라닌-글라이신-알라닌 링커(alanine-glycine-alanine linker)로 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc2)이 추가로 융합될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 pFc2는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 pFc2는 GnRH의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 BiP(chaperone binding protein)가 추가로 융합될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 BiP는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 BiP는 CTB의 N-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)이 추가로 융합될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 HDEL은 서열번호 11의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 HDEL은 GnRH의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 BiP, CTB, GnRH, pFc2 및 HDEL이 순차적으로 융합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 애주번트는 에멀시겐(Emulsigen)-계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 거세 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동물은 개, 고래, 고양이, 고릴라, 거위, 기니피그, 꿩, 낙타, 노루, 노새, 닭, 당나귀, 돌고래, 돼지, 라마, 말, 물소, 사슴, 소, 순록, 알파카, 야크, 양, 염소, 오랑우탄, 오리, 원숭이, 페럿, 쥐, 칠면조, 타조 또는 토끼일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HDEL 유전자를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 12의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 포함하는, 웅취 제거용 백신 조성물 등에 관한 것으로서, GnRH의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 재조합 단백질을 이용하여 이를 투여한 개체에 GnRH에 대한 항체를 유도하였고, 이를 통해 고환의 위축 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명은 낮은 비용, 높은 안전성 및 최소한의 부작용으로 수퇘지를 면역적으로 거세하여 웅취를 제거하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질의 제조를 위한 발현 카세트(expression cassette)를 나타낸 도이다(BiP, chaperone binding protein; CTB, Cholera toxin B subunit; pFc2, porcine Fc fragment; HDEL, Histidine-Aspartic acid-Glutamic acid-Leucine).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질의 분리·정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 수컷 랫트에 투여한 일정을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 수컷 랫트에 3회 투여한 후 고환을 적출하여 크기를 비교한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 수컷 랫트에 3회 투여한 후 혈중 테스토스테론의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도로서, 상단 및 중단 그림은 스탠다드를, 하단 그림은 각 그룹의 측정 결과를 나타낸 도이다.
본 발명자들은 재조합 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH) 단백질을 4주령의 랫트에 접종한 후 그에 따른 고환의 크기 및 무게의 변화, 혈중 테스토스테론 농도의 변화를 분석하였다. 그 결과 본 발명의 재조합 GnRH 단백질로 백신화된 군이 대조군과 비교하여 고환의 크기 및 무게가 감소하고 혈중 테스토스테론의 농도가 감소하였음을 확인함으로써, 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 조성물이 면역 거세 효과 및 그에 따른 웅취 제거 효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH (Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “CTB(Cholera toxin B subunit)” 또는 “콜레라 독소 B 서브유닛”은 숙주 세포에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로서, 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되나, 서열번호 5의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 콜레라 독소는 A1 및 A2 서브유닛과 5개의 B 서브유닛이 결합한 형태의 복합체이며, 콜레라 독소의 내재화 및 활성화를 위해 CTB가 점막 면역계(mucosal immune system)의 M 세포(microfold cell)에 결합한다. 이때, CTB는 세포막 이중층의 GM1-갱글리오시드(ganglioside)와 특이적으로 반응하여 결합한 후에 CTB에 결합되어 있는 A 서브유닛 또는 항원 단백질이 세포막을 통과하게 한다. CTB는 점막 장벽을 통과하는 결합 항원의 흡수 증가 및 결합 항원의 효율적인 제시를 통해 항원의 면역원성을 개선하여 점막 면역 강화를 위한 강력한 점막 애주번트(adjuvant) 및 수송체(carrier) 분자로서 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오타이드”는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산디에스터(phosphodiester) 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 또한, 예를 들면 뉴클레오타이드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “GnRH(gonadotropin-releasing hormone)”란 성선자극호르몬방출호르몬을 의미하는 것으로서, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GnRH이나, GnRH에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 GnRH는 서열번호 1의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GnRH는 10개의 아미노산으로 구성되며, 모든 동물에서 거의 동일한 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. GnRH는 시상하부에서 생성되어 뇌하수체에 작용함으로써 성 호르몬인 FSH 및 LH의 생성을 촉진시키는데, GnRH를 항원으로 이용하여 동물에 접종할 경우 GnRH를 인식하는 항체가 형성되며, 상기 항체가 체내에서 존재하는 GnRH를 제거함으로써 수컷 및 암컷 동물의 성 성숙이 차단되어 거세 효과가 발생하게 되고, 이로써 웅취가 제거되는 효과가 나타나는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “재조합 단백질” 또는 “융합된 재조합 단백질”은 2종 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 CTB와 GnRH가 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 상기와 같이 융합된 재조합 단백질은 각각의 파트너가 결정된 후 화학적으로 합성하거나 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, CTB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 GnRH를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 연결한 융합 유전자를 세포 발현 시스템에서 발현시켜 수득할 수 있다.
본 발명의 재조합 단백질에 사용되는 GnRH는 GnRH 아미노산 서열의 한 카피(one copy) 보다는 둘 또는 그 이상의 카피(two or more copies)를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 다중 카피(multiple copy)를 갖는 경우 GnRH에 대한 면역원성을 더욱 증강시킬 수 있으므로, GnRH의 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열이 2개 이상의 다량체를 취할 수 있다. GnRH의 개수는 발현 벡터 내에서 수용 가능하다면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 2개 내지 20개, 보다 바람직하게는 2개 내지 10개가 연결된 다량체 형태를 취할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 6개가 연결된 육량체를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 GnRH 단백질이 연속적으로 여섯 번 반복되도록 제작하였다. 상기 여섯 개의 GnRH이 연결된 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 이러한 융합 재조합 단백질은 CTB와 GnRH가 직접 연결되거나 링커와 같은 아미노산 연결자를 통해 연결될 수 있다. 또한, GnRH가 여러 카피 포함되는 경우에도 각 GnRH는 직접 연결되거나 링커와 같은 연결자를 통해 연결될 수 있다. 링커를 통해 연결되는 경우 이에 의한 전체 면역원성(immunogenicity)을 감소시키지 않는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어 “링커”란, CTB와 GnRH를 연결하여 재조합 단백질을 만드는 경우 또는 수 개의 GnRH를 연결시키는 경우, 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시켜 결합시킨 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩타이드를 의미한다. 링커는 면역반응을 최소화할 수 있는 것이라면 그 종류나 아미노산 개수는 제한이 없으나, 바람직하게는 아미노산 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 아미노산 1개 내지 5개가 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 각 단백질을 연결시키기 위해 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 있는 제한 효소 부위의 서열을 사용하거나 알라닌-글라이신-알라닌(AGA) 링커를 사용하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 “백신(vaccine)”은, 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방 또는 특정 항원에 대한 항체를 유도하기 위하여 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 비인간 동물로서, 그 예는 후술하였다.
본 발명의 “백신 조성물”은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스터 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수도 있으나, 상기 열거한 투여 방법에 국한되지는 않으며, 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 체액성 또는 선택적으로 세포-매개성 면역 반응 및/또는 상기 두 면역반응의 조합을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 면역 거세용 백신 조성물은 항원, 약제학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들로 구성될 수 있고, 면역학적 효과량으로 투여한다. 본 명세서에서 사용된 용어, “면역학적 효과량”이란 면역 거세 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며 면역반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc2)이 추가로 융합된 것일 수 있다. 상기 pFc2는 GnRH의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 “Fc 단편(Fc fragment)”이란, 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 돼지의 Fc 단편이나, 재조합 단백질과 융합되었을 때 재조합 단백질의 발현량 및 용해성을 증가시키는 Fc 단편이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 6의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 BiP(chaperone binding protein)가 추가로 융합된 것일 수 있다. 상기 BiP는 GnRH 또는 CTB의 N-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 “BiP(chaperone binding protein)”는 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용된 것으로서, 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP이나, 재조합 단백질과 융합되었을 때 재조합 단백질을 소포체로 이동시키는 BiP라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 BiP는 서열번호 8의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 BiP는 발현될 때 또는 발현된 후 펩타이드의 일부가 잘려나가 일부 펩타이드만이 남을 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)이 추가로 융합된 것일 수 있다. 상기 HDEL은 GnRH 또는 pFc2의 C-말단 방향에 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 “HDEL”은 히스티딘-아스파트산-글루탐산-류신으로 이루어진 표적 펩타이드 서열을 의미하는 것으로서, 상기 HDEL은 재조합 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 분비되는 것을 방지하거나 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 한다. 상기 HDEL은 서열번호 11의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 BiP, CTB, GnRH, pFc2 및 HDEL이 순차적으로 융합된 것일 수 있고, 이에 따른 상기 재조합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 상기 융합 순서 또는 아미노산 서열에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 웅취(boar taint) 제거에 탁월한 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 백신 조성물에는 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 애주번트 (adjuvant)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “애주번트(Adjuvant)”란, 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성이 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 “애주번트”는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트에 통합되거나 상기 애주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다. 적절한 애주번트의 예로, 알루미늄 하이드록사이드, 프로이드 완전 또는 불완전 애주번트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 에멀시겐(Emulsigen)-계 애주번트로서 DDA(dimethyldioctadecyl ammonium bromide)를 포함하는 에멀시겐-D 애주번트를 사용하였다.
본 발명에 따른 재조합 단백질은 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 융합된 재조합 단백질의 변이체를 포함한다. 재조합 단백질의 변이체란 정상 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath et al., 1979). 또한, 상기 재조합 단백질은 인산화(phosphorylation), 메틸화(methylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다. 상기 변이체 또는 수식체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이지만, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질은 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 방법을 통해 생산할 수 있으며, 바람직하게는 재조합 벡터를 이용하여 이를 숙주세포에 형질전환시켜 이로부터 발현된 단백질을 분리, 정제하여 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
재조합 벡터는 통상 외래 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “외래 DNA”란, 외래종으로부터 기원되는 DNA를 의미하거나, 동일한 종으로부터 기원되는 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태를 의미하며, 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 코딩한다. 재조합 벡터는 숙주세포에서 형질전환된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 상기 재조합 벡터는 개체의 세포 내에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물(construct)로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역(UTR), 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 6 카피의 GnRH 유전자 단편이 포함된 pCAMBIA13000 벡터에 CTB 유전자 단편을 삽입하여 제조한 재조합 벡터를 담배 식물( Nicotiana benthamiana)에 형질전환하였다. 상기 벡터는 35S 프로모터와 HSP(heat shock protein) 종결자 시스템을 가지고 있으며, 담배 식물에서 단백질을 대량 생산하기에 유용한 벡터이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “벡터(vector)”란, 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 유전체(genome) 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 용어 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HDEL 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열이 추가로 더 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “형질전환(transformation)”이란, 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism 또는 transformant)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 유기체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 유기체이며, 상기 유기체는 본 발명의 목적을 달성하기 위한 것이라면 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 웅취 제거 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물을 이용한 웅취 제거 방법은 동물 종에 상관없이 인간을 제외한 모든 동물에 적용 가능하다. 상기 동물은 포유동물이 바람직하며, 예컨대 개, 고래, 고양이, 고릴라, 거위, 기니피그, 꿩, 낙타, 노루, 노새, 닭, 당나귀, 돌고래, 돼지, 라마, 말, 물소, 사슴, 소, 순록, 알파카, 야크, 양, 염소, 오랑우탄, 오리, 원숭이, 페럿, 쥐, 칠면조, 타조 또는 토끼를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 투여는 2회 이상 실시하는 것이 바람직하다. 예컨대, 1차 접종(initial vaccination) 후에 부스터 접종(booster injections)을 1주 내지 10주 간격으로 1회 내지 4회 정도 실시할 수 있으나, 이는 해당 동물의 종류에 따라 당업자가 적절하게 변형하여 실시할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: BiP-CTB-GnRH-pFc2-HDEL 융합 단백질의 발현 및 정제
GnRH에 대한 면역원성을 유도하기 위해 도 1에 나타낸 바와 같이, GnRH에 CTB, pFc2, BiP 및 HDEL을 융합한 재조합 GnRH를 발현시키기 위한 벡터를 제작하였다. 10개의 아미노산으로 구성된 GnRH은 6개가 연속되도록 하여 알라닌-글라이신-알라닌(AGA) 링커로 연결하였다. 6개가 연결된 GnRH의 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 3에 나타내었다. 또한, CTB에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 4 및 서열번호 5에, pFc2에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 6 및 서열번호 7에, BiP에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 8 및 서열번호 9에, HDEL에 대한 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타내었으며, 발현 카세트(cassette)의 전체 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 12 및 서열번호 13에 나타내었다.
상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스( Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물의 잎에 접종하여 일과성 발현(transient expression)을 하였다. 식물 잎으로부터 총단백질(Total protein)을 추출하여 원심 분리한 후, 용액에 포함되어 있는 수용성(soluble) 형태의 단백질을 protein A-sepharose column을 장착한 AKTA prime(GE Healthcare, 미국)을 이용하여 pFc2 융합 GnRH 단백질을 분리하였다.
실시예 2: 재조합 GnRH 단백질 농도 확인
상기 실시예 1에서 분리·정제한 재조합 GnRH 단백질의 농도를 확인 및 측정하기 위해 농도를 알고 있는 BSA(bovine serum albumin)를 스탠다드(standard)로 하여 SDS-PAGE 및 브래드포드 정량분석(bradford assay)을 수행하였다. 분리 정제한 재조합 GnRH 단백질을 1, 2 μl 로딩하고 정량을 위해 0.5, 1, 2 μg의 BSA를 포함시켰다. Gel은 쿠마씨 블루 염색(Coomassie blue staining)을 통해 밴드를 최종적으로 확인하였다. 브래드포드 정량분석은 BSA를 표준시료로 사용하여 스탠다드 커브(standard curve)를 그려 계산식을 만들고, GnRH의 UV 값을 대입하여 농도를 계산하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 재조합 GnRH 단백질이 잘 발현되어 분리·정제되었음을 확인하였으며, GnRH 재조합 단백질의 농도가 약 2 μg/μl 인 것을 확인하였다. 상기와 같이 확인된 재조합 GnRH 단백질을 하기 실시예 3의 동물 실험에 사용하였다.
실시예 3: 재조합 GnRH 단백질의 투여 효과 확인
3.1. 실험동물, 투여 조건 및 일정
재조합 GnRH 단백질의 면역 거세 효과를 확인하기 위해 4주령 수컷 SD(Sprague Dawley) 랫트에 하기 표 1에 기재된 투여 조건으로, 도 3에 나타낸 일정에 따라 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질이 포함된 백신 조성물을 투여하였다. 대조군은 동일한 양의 PBS(phosphate-buffered saline)를 투여하였고, 실험군은 상기 백신 조성물 100μg/180μl 및 Emulsigen®-D 애주번트 20μl을 투여하였다(하기 표 1 참조). 입고된 4주령 랫트를 4일 정도 안정화 시킨 후, 14일 내지 15일의 투여 간격으로 총 3회 투여하였다. 채혈은 각각 투여 전 및 실험 종료 시에 시행하였으며, 3차 투여 후 4주가 경과한 시점에서 고환을 적출하여 무게 및 크기를 측정하였고, 혈중 테스토스테론(testosterone)의 농도를 측정하였다.
대조군 실험군 (재조합 GnRH 단백질)
투여 항원 PBS 180 μl 100 μg / 180 μl
애주번트 20 μl 20 μl
실험 개체수 3 3
3.2. 고환의 육안 평가
본 발명에 따른 백신 조성물의 3차 투여 후 4주가 경과한 시점에서 고환을 적출하여 육안 평가를 실시하였다. 결과는 하기 표 2 및 도 4에 나타내었다.
Figure PCTKR2020008420-appb-img-000001
상기 표 2 및 도 4에 나타난 바와 같이, 비접종 대조군과 비교하여 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 접종군은 고환의 무게 및 길이가 유의하게 감소하였음을 확인하였다. 또한 무게 비율에서 확인할 수 있는 바와 같이 개체의 총 체중 대비 고환의 무게가 차지하는 비율은 백신 접종군이 현저하게 낮은 것으로 나타났으며, 백신 접종군의 고환 평균 길이도 비접종군 대비 64% 내지 86% 수준으로 나타났다.
상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 조성물의 투여에 의해 성공적으로 면역적 거세가 되었음을 확인한 것이다.
3.3. 테스토스테론(testosterone) ELISA 결과
본 발명에 따른 백신 조성물의 3차 투여 후 4주가 경과한 시점에서 채혈하여 혈중 테스토스테론의 농도를 측정하였다. 측정은 Elabscience®의 ELISA 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 구체적으로, 테스토스테론이 코팅되어 있는 플레이트에 50 μL의 혈청을 넣고 바로 동일한 양의 biotinylated Detection 항체를 넣어주었다. 37℃에서 45분간 반응시킨 후 350 μL의 washing buffer를 이용하여 3회 세척하였다. 이어서, 100 μL의 HRP conjugate 용액을 넣고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 상술한 과정과 동일하게 세척을 5번 진행한 후 90 μL의 기질액을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 그 후 50 μL의 반응정지액을 넣고 ELISA 기계를 통해 450 nm 파장에서 OD값을 측정하였다. 혈중 테스토스테론의 실제양을 정량하기 위해서 테스토스테론 스탠다드 단백질을 0.1, 0.4, 1.6, 5, 20 ng/ml로 포함하여 반응을 진행하였다. 이를 통해 얻은 OD 값으로 스탠다드 그래프를 만들고 여기에 앞서 얻은 샘플의 OD 값을 대입하여 테스토스테론을 정량하였다. 그 결과는 하기 표 3 및 도 5에 나타내었다.
스탠다드(ng/ml) OD450 nm 그룹 투여 개체 OD450 nm
0 1.852 비접종대조군 PBS 1 0.171
0.1 1.037 2 0.150
0.4 0.850 3 0.194
1.6 0.559 백신접종군 CTB-GnRH100 μg 1 0.491
5 0.302 2 0.540
20 0.154 3 0.530
그 결과 상기 표 3 및 도 5에 나타난 바와 같이, 비접종 대조군과 비교하여 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 접종군은 혈중 테스토스테론의 농도가 현저하게 감소한 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과 상기 실시예 3.2.의 결과와 일치하는 것으로서 본 발명에 따른 재조합 GnRH 단백질을 포함하는 백신 조성물의 투여에 의해 성공적으로 면역적 거세가 되었으며, 이에 따라 웅취가 제거됨을 확인한 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 CTB(Cholera toxin B subunit) 및 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 포함하는, 웅취 제거용 백신 조성물 등에 관한 것으로서, GnRH의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 재조합 단백질을 이용하여 이를 투여한 개체에 GnRH에 대한 항체를 유도하였고, 이를 통해 고환의 위축 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명은 낮은 비용, 높은 안전성 및 최소한의 부작용으로 수퇘지를 면역적으로 거세하여 웅취를 제거하는데 이용될 수 있는바, 산업적 이용 가치가 클 것으로 예상된다.

Claims (30)

  1. CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고,
    상기 n은 1 내지 20의 정수인, 웅취 제거용 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GnRH는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CTB는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 n은 6인 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 GnRH는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 GnRH는 n이 2 이상일 때, 각각 알라닌-글라이신-알라닌(alanine-glycine-alanine) 링커로 연결된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc2)이 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 pFc2는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 pFc2는 GnRH의 C-말단 방향에 융합되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 BiP(chaperone binding protein)가 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 BiP는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 BiP는 CTB의 N-말단 방향에 융합되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)이 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 HDEL은 서열번호 11의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 CTB는 GnRH의 N-말단 방향에 융합되고, 상기 HDEL은 GnRH의 C-말단 방향에 융합되는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 BiP, CTB, GnRH, pFc2 및 HDEL이 순차적으로 융합된 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 백신 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 애주번트는 에멀시겐(Emulsigen)-계인 것을 특징으로 하는, 면역 거세용 백신 조성물.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 웅취 제거 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 동물은 개, 고래, 고양이, 고릴라, 거위, 기니피그, 꿩, 낙타, 노루, 노새, 닭, 당나귀, 돌고래, 돼지, 라마, 말, 물소, 사슴, 소, 순록, 알파카, 야크, 양, 염소, 오랑우탄, 오리, 원숭이, 페럿, 쥐, 칠면조, 타조 또는 토끼인, 동물의 웅취 제거 방법.
  22. 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 GnRH 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 CTB 유전자를 포함하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 BiP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HDEL 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 12의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 웅취 제거용 재조합 벡터.
  27. 제22항의 재조합 벡터를 이용하여 제조한 웅취 제거용 재조합 단백질.
  28. 제22항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  29. CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합되고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 재조합 단백질의 웅취 제거 용도.
  30. CTB(Cholera toxin B subunit) 및 n 개의 GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)가 융합되고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 재조합 단백질의, 웅취 제거에 이용되는 백신을 생산하기 위한 용도.
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