KR101217269B1 - ＳＴＦ２-ＧｎＲＨ 융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 거세용 백신 조성물 및 이를 이용한 동물의 면역 거세 방법 - Google Patents

ＳＴＦ２-ＧｎＲＨ 융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 거세용 백신 조성물 및 이를 이용한 동물의 면역 거세 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 STF2(Salmonella typhimurium flagellin fljB) 및 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 융합 재조합 단백질, 상기 융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 거세용 백신 조성물 및 이를 이용한 동물의 면역 거세 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 재조합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

ＳＴＦ２-ＧｎＲＨ 융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 거세용 백신 조성물 및 이를 이용한 동물의 면역 거세 방법{Vaccine composition for immunocastration comprising STF2-GnRH fusion recombinant protein and method for animal immunocastration using the same}
본 발명은 STF2(Salmonella typhimurium flagellin fljB) 및 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 융합 재조합 단백질, 상기 융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 거세용 백신 조성물 및 이를 이용한 동물의 면역 거세 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 재조합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
면역거세(immunocastration)란 면역 반응을 유도하여 동물의 생식 기능을 없애는 것으로, 경제적인 이유와 동물학대 방지 측면에서 외과적 거세에 대한 대안으로 제안되어 왔다. 동물의 거세는 성적 충동으로 야기되는 배회, 땅파기, 성적 행동, 난폭한 행동 등을 감소시키고, 고환암, 전립선암 및 직장암 등을 방지하기 위한 건강상의 목적과, 동물의 과도한 개체 증가를 방지하고 그 이용가치를 높이기 위한 목적으로 행해진다. 외과적 거세는 간단하고 쉬운 방법이지만 동물에게 매우 심각한 고통 및 스트레스를 발생시키기 때문에 동물복지 차원에서 문제가 되므로, 최근 스위스, 노르웨이, 벨기에, 네덜란드 등의 유럽국가의 경우 동물의 물리적 거세를 금지하기로 결정하였으며, 오스트레일리아는 외과적으로 웅돈을 거세하는 대신에 면역거세를 시행하는 최초의 국가가 되었고, 우리나라에서도 이와 유사한 조치를 검토하고 있다(Thun R et al., Journal of Physiology and Pharmacology, 57, pp.189-194, 2006).
면역거세(Immunocastration) 방법은 대부분 성선자극호르몬-분비호르몬(gonadotropin-releasing hormone, 이하 GnRH)에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 백신을 이용하여 실시되고 있다.
GnRH는 10 개의 아미노산으로 이루어진 호르몬으로, 모든 동물에서 거의 동일한 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. GnRH는 시상하부에서 생성되어 뇌하수체에 작용함으로써 성 호르몬인 FSH(follicle stimulating hormone) 및 LH(luteinizing hormone) 의 생성을 촉진시키기 때문에, 시상하부에서 GnRH의 생성을 원천적으로 차단할 경우 거세효과가 발생한다는 연구 결과가 보고되고 있다. GnRH를 항원으로 이용하여 동물에 접종하면 백신을 접종 받은 동물에서는 GnRH를 인식하는 항체가 형성되는데, GnRH를 인식하는 항체가 체내에서 생성되는 GnRH를 제거하여 수컷 및 암컷 동물의 성 성숙을 차단함으로써 거세효과를 발휘한다는 것이다(Adams TE, Animal Reproduction Science, 88, 127-139, 2005).
그러나 GnRH는 동물에서 생성되는 자체 단백질이기 때문에 정상적인 동물의 면역체계에서는 GnRH를 자가항원으로 인식하여 GnRH에 대한 항체를 형성하지 않는다. 따라서 GnRH를 인식하는 항체를 형성시키기 위해서 인위적으로 과량의 GnRH를 투여하거나, GnRH의 항원성을 향상시키기 위해서 캐리어(carrier) 단백질과 융합시켜 투여하는 방법이 시도되고 있다. 최근에 호주에 있는 CSL이라는 회사에서는 캐리어 단백질로서 KLH를 사용하여 거세 백신을 개발한 바 있다. 이 외에도, Pfizer 사가 면역거세 백신으로 Improvac를 개발한 바 있으나, 강력한 면역반응을 유도하지 못하는 단점을 갖고 있다.
또한, WO92/19746은 GnRH 또는 그의 유사체 및 T-세포 에피토프(T-cell epitope)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 이용한 동물의 면역거세 방법을 개시하고 있고, WO02/22659는 GnRH-I 및 GnRH-Ⅱ 를 이용한 돼지의 면역거세방법을 개시하고 있고, US5837268는 류코톡신(leukotoxin) 및 GnRH 를 포함하는 키메릭 단백질(chimeric protein)을 이용하여 GnRH에 대한 면역원성을 개선하는 방법을 개시하고 있으나, 동물에게서 보다 강력한 면역반응을 유도하여 거세 효과를 달성할 수 있는 백신에 대한 요구가 현재까지 계속되고 있다.
한편, STF2(Salmonella typhimurium flagellin fljB) 는 TLR 5(Toll-like receptor 5) 의 리간드로 작용하는 물질로서 후천성 면역 반응(adaptive immune response)의 활성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Huleatt J W et al., Vaccine, 25, 763-775, 2007).
본 발명자들은 GnRH의 항원성을 향상시키고 모든 동물에게 적용 가능한 면역거세백신을 개발하기 위하여 노력한 결과, STF2 와 GnRH 를 융합시킨 융합 재조합 단백질을 제조할 수 있었고, 상기 융합 재조합 단백질을 접종한 랫트에서 항체의 역가, 고환의 크기 및 무게 변화, 고환조직에서의 정자형성 억제 등을 평가한 결과 거세 효과가 우수하므로, 상기 융합 재조합 단백질을 동물의 면역 거세 백신으로 개발할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 STF2 및 GnRH가 융합된 융합 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 거세용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물의 면역 거세 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 STF2 및 GnRH가 융합된 융합 재조합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "STF2(Salmonella typhimurium flagellin fljB)" 는 TLR 5의 리간드로 작용하는 물질로서 후천성 면역 반응의 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 바람직하게, 본 발명에서 STF2는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.
본 발명에서 용어, "GnRH(gonadotropin-releasing hormone)"는 성선자극호르몬-분비호르몬으로서, 10 개의 아미노산으로 이루어지며, 모든 동물에서 거의 동일한 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. 바람직하게, 본 발명에서 GnRH은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다. GnRH는 시상하부에서 생성되어 뇌하수체에 작용함으로써 성 호르몬인 FSH 및 LH 의 생성을 촉진시키는데, GnRH를 항원으로 이용하여 동물에 접종할 경우 GnRH를 인식하는 항체가 형성되며, 상기 항체가 체내에서 존재하는 GnRH를 제거함으로써 수컷 및 암컷 동물의 성 성숙이 차단되어 거세효과가 발생하게 된다.
본 발명에서 용어, "융합 재조합 단백질"은 2종 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질을 말하며, 본 발명에서는 STF2 와 GnRH가 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 이러한 융합 재조합 단백질은 각각의 파트너가 결정된 후 화학적으로 합성하거나 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, STF2를 코딩하는 유전자 서열과 GnRH를 코딩하는 유전자 서열을 연결한 융합 유전자를 세포 발현 시스템에서 발현시켜 수득할 수 있다.
본 발명의 융합 재조합 단백질에 사용되는 GnRH는 GnRH 아미노산 서열의 한 카피(one copy) 보다는 둘 또는 그 이상의 카피(two or more copies)를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 다중 카피(multiple copy)를 갖는 경우 GnRH에 대한 면역원성을 더욱 증강시킬 수 있으므로, GnRH 의 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열이 2개 이상의 다량체를 취할 수 있다. GnRH 의 개수는 발현 벡터 내에서 수용 가능하다면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 2개 내지 20개, 보다 바람직하게는 2개 내지 10개가 연결된 다량체 형태를 취할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 6개가 연결된 육량체를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적이 실시예에서는 GnRH 단백질 조각이 연이어 여섯 번 반복되도록 제작하였다.
이러한 융합 재조합 단백질은 STF2 와 GnRH 가 직접 연결되거나 링커와 같은 연결자를 통해 연결될 수 있다. 또한, GnRH 가 여러 카피 포함되는 경우에도 각 GnRH 는 직접 연결되거나 링커와 같은 연결자를 통해 연결될 수 있다. 링커를 통해 연결되는 경우 이에 의한 전체 면역원성(immunogenicity)을 감소시키지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "링커"란 STF2 와 GnRH 를 연결하여 재조합 융합 단백질을 만드는 경우 또는 수 개의 GnRH 를 연결시키는 경우, 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시켜 결합시킨 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록, 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩티드를 말한다. 링커는 면역반응을 최소화할 수 있는 것이라면 그 종류나 아미노산 개수는 제한이 없으나, 바람직하게는 아미노산 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 아미노산 1개 내지 5개가 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 각 단백질을 연결시키기 위해 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 있는 제한 효소 부위의 서열을 사용하였다.
본 발명에서 용어, “면역원성”이란 세포성 면역 및 체액성 면역 면역 반응 모두를 유도하여 이물질에 대해 대처하는 능력을 말하며, 이러한 면역반응을 유도하는 물질을 면역원이라 한다. 본 발명은 면역원성 물질로서 STF2 와 GnRH 모두를 갖는 융합 재조합 단백질을 사용한다.
본 발명의 융합 재조합 단백질은 이의 정상형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 융합 재조합 단백질의 변이체를 포함한다. 융합 재조합 단백질의 변이체란 정상 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 또한, 상기 융합 재조합 단백질은 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다. 상기 변이체 또는 수식체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이지만, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 것이다.
본 발명자들은 STF2 유전자와 6 카피의 GnRH 유전자를 융합시켜 융합 재조합 단백질을 발현할 수 있는 STF2-6xGnRH 유전자 단편을 제작하였다. STF2 유전자 단편을 얻기 위해 BamH I 과 Bgl II, 6 카피의 GnRH 유전자 단편을 얻기 위해 BamH I 과 Bgl II 을 이용하였으며, 6카피의 GnRH 유전자 단편이 포함된 pQE40 벡터에 STF2 유전자 단편을 삽입한 후 대장균 M15 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. DNA 시퀀싱 및 SDS-PAGE 를 통해 STF2 와 GnRH 이 연결되어 있는 올바른 클론임을 확인하였으며, 이렇게 발현되는 단백질의 크기는 약 62kD 임을 확인하였다(도 3).
따라서, 본 발명의 구체적인 실시 양태에 따라 6 카피의 GnRH 와 STF2 가 연결된 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 융합 재조합 단백질이 제공될 수 있으며, 이는 서열번호 5의 염기서열에 의해 코딩된 것일 수 있다.
본 발명의 융합 재조합 단백질은 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 방법을 통해 생산할 수 있으며, 바람직하게는 재조합 벡터를 이용하여 이를 숙주세포에 형질전환시켜 이로부터 발현된 단백질을 분리, 정제하여 생산할 수 있다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 재조합 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 방법으로 본 발명의 융합 재조합 단백질을 생산하는 과정은 다음 단계를 포함한다.
첫째, 융합 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계이다. 융합 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자로서, 대표적으로 서열번호 5의 염기서열을 가지는 유전자를 예시할 수 있다.
외래 유전자를 삽입하기 위한 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터는 복제기점, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 코스미드의 복제 기점을 포함하며, 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편이 복제될 수 있는 레플리콘이다. 발현 벡터는 단백질을 합성하는데 사용되도록 개발되었다.
재조합 벡터는 통상 외래 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 본원에서 “외래 DNA”란 외래종으로부터 기원되는 DNA를 의미하거나, 동일한 종으로부터 기원되는 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태를 의미하며, 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 코딩한다. 재조합 벡터는 숙주세포에서 형질전환된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 상기 재조합 벡터는 개체의 세포 내에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5’ 말단 및 3’ 말단의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 STF2 유전자의 증폭 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터에 연결(ligation)하여 사용하였고, STF6-6xGnRH을 발현시키기 위하여 pQE40 발현 벡터를 사용하였다.
둘째, 상기 재조합 벡터를 사용해서 숙주세포를 형질전환 시킨 후 배양하는 단계이다. 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있다.
상기 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포는 원핵 세포와 진핵 세포 모두를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있는 숙주세포의 예이다. 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다
셋째, 융합 재조합 단백질의 발현을 유도 및 축적하는 단계이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 유도인자 IPTG를 사용하여 단백질 발현을 유도하였고 유도시간은 단백질의 양이 최대화될 수 있도록 조절하였다.
마지막으로, 융합 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계이다. 일반적으로 재조합적으로 생산된 단백질은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 융합 재조합 단백질 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 및 정제 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 6카피의 GnRH 유전자 단편이 포함된 pQE40 벡터에 STF2 유전자 단편을 삽입하여 제조한 재조합 벡터를 대장균 M15 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. pQE40 벡터는 파아지 T5 프로모터로 구성된 프로모터와 IPTG를 유도제로 사용하는 lac 오퍼레이터 시스템을 가지고 있는, 대장균에서 단백질을 대량 생산하기에 유용한 벡터이다. STF2-6xGnRH 는 불용성이므로 8M 요소로 변성시킨 후 히스티딘 태그(tag) 단백질용 Ni-NTA 수지를 이용하는 크로마토그래피를 이용하여 STF2-6xGnRH 융합 재조합 단백질을 정제하였다.
상기한 바와 같이 발현 및 정제한 융합 재조합 단백질을 4주령의 랫트에 접종한후 그에 따른 고환의 크기 변화, 고환의 무게 변화, 항체의 역가, 및 고환조직에서의 정자형성 억제 여부를 분석하였다. 그 결과 본 발명의 융합 재조합 단백질로 백신화된 그룹이 대조군에 비해 고환의 크기 및 무게가 감소하고, GnRH 에 대한 항체 역가가 높으며, 랫트 고환조직이 심하게 위축되어 있음을 확인하였다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 거세용 백신 조성물에 관한 것이다.
면역원이 보이는 반응의 크기와 관찰된 개체의 비율을 비교하면 우수한 효과를 보이는 백신으로 사용될 수 있는지 여부를 판단할 수 있다. 본 발명에서는 면역 거세용 백신이라는 원래의 발명의 목적에 적합하게 (a) 고환의 크기 및 무게 변화 추이 관찰, (b) 혈청 내 항체 역가 관찰 및 (c) 고환조직에서의 정자형성 억제 여부 관찰을 통해 면원반응 효과를 검정하고 항원의 우수한 형태를 입증하였다.
구체적으로, 16마리의 4주령 랫트를 4개 그룹으로 분류하고 그룹 1, 2 및 3에는 각각 400 ug, 200 ug 및 100 ug 의 STF2-GnRH를 접종하였으며, 그룹 4는 대조군으로 아무런 처치를 하지 않았다. 1차 접종 후 2주 간격으로 3회에 걸쳐 동일한 양의 재조합단백질을 각 그룹의 랫트에 접종하였다. 모든 랫트로부터 백신을 접종하기 전에 채혈을 하였으며 마지막 접종 후 2주째 채혈을 한 후 안락사를 시키고 고환 및 부고환을 적출하였다. 그 결과, 재조합 단백질 STF2-GnRH를 투여한 그룹 1, 2 및 3 랫트의 고환이 대조군에 비해 매우 작아져 있었으며(도 4) 고환 및 부고환 무게는 대조군에 비해 57%, 65% 및 58%에 불과하였고(표 11), STF2-GnRH를 접종한 그룹 1, 2 및 3의 랫트에서는 백신 접종 후 2주부터 GnRH에 특이적인 항체가 형성되었다(도 5). 또한 고환의 조직을 검사한 결과 대조군의 랫트는 정상적인 정세관 구조를 보유하고 있었으며, 정세관 내의 일차 및 이차 정모세포와 정자세포 등도 정상적이었음에 반하여, STF2-GnRH를 접종한 그룹 1, 2 및 3의 랫트 고환조직에서는 정세관이 심하게 위축되어 있었으며 정세관 내의 일차 및 이차 정모세포와 정자세포가 발달되어 있지 않았다(도 6).
상기 결과는 본 발명의 STF2-GnRH 융합 재조합 단백질이 면역원성이 높으며 효과적인 백신 조성물로 사용될 수 있음을 입증하는 것이다.
본 발명의 면역 거세용 백신 조성물은 항원, 약제학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들로 구성될 수 있고, 면역학적 효과량으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "면역학적 효과량"이란 면역 거세 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며 면역반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다.
담체는 당 분야에 공지의 것으로 안정화제, 희석제, 완충액을 포함할 수 있다. 적절한 안정화제는 솔비톨, 락토즈, 만니톨, 전분, 당, 덱스트란 및 포도당 같은 탄수화물; 알부민 또는 카제인 같은 단백질 등을 포함할 수 있다. 적절한 희석제에는 염, Hanks 균형 염, 링거액 등을 포함한다. 적절한 완충액에는 알칼리 금속 인산염, 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 토금속 탄산염 등을 포함한다. 또한 백신에는 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 면역 아쥬반트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 적절한 면역 아쥬반트에는 아쥬번트의 예는 알루미늄 히드록시드, 프로이드 완전 또는 불완전 아쥬반트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 공지의 투여 경로를 통하여 투여된다. 이와 같은 방법에는 경구, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강 경로를 이용할 수 있지만 이에 국한되지는 않으며, 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 체액성 또는 선택적으로 세포-매개성 면역 반응 및/또는 상기 두 면역반응의 조합을 유도할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물의 다양한 양태는 Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., Mach Publishing, Easton, Pennsylvania, U.S.A.를 참조할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 융합 재조합 단백질을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물의 면역 거세 방법에 관한 것이다.
본 발명의 백신 조성물을 이용한 면역 거세 방법은 동물 종에 상관없이 인간을 제외한 모든 동물에 적용 가능하다. 상기 동물은 포유동물이 바람직하며, 예컨대 개, 소, 사람, 토끼, 염소, 양, 산양, 쥐, 말, 사슴, 원숭이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 하이에나, 들개, 치타, 표범, 재규어, 코끼리, 물소, 살쾡이, 고슴도치, 두더지, 돼지, 다람쥐, 청설모, 오소리, 너구리, 오리너구리, 나무늘보, 반달곰, 흰곰, 불곰, 팬더, 날다람쥐, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 노루, 코뿔소, 담비, 수달, 바다표범, 물개, 물곰, 바다코끼리, 고래 또는 돌고래를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 투여는 2 회 이상 실시하는 것이 바람직하다. 예컨대, 1차 예방접종(initial vaccination) 후에 추가접종(booster injections)을 1-10 주 간격으로 1-4 회 정도 실시할 수 있으나, 이는 해당 동물의 종류에 따라 당업자가 적절하게 변형하여 실시할 수 있다.
본 발명의 STF2-GnRH 융합 재조합 단백질은 우수한 항원성을 가지고 있어 GnRH에 대한 항체 형성 효과 및 이에 따른 강력한 동물의 성성숙 억제효과를 나타내므로, 동물의 성성숙을 예방 및 억제하기 위한 면역거세용 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 1518 bp의 STF2 유전자의 PCR 산물의 전기 영동 사진을 나타낸 것으로, 레인 1은 1Kb DNA ladder 를 나타내고 레인 2는 STF2 를 나타낸다.
도 2는 STF2 유전자를 포함하는 1527 bp PCR 산물의 전기 영동 사진을 나타낸 것으로, 레인 1은 1Kb DNA ladder 를 나타내고 레인 2는 STF2 를 나타낸다.
도 3은 SDS-PAGE 를 이용하여 STF2-GnRH 융합 재조합 단백질 발현 및 정제를 확인한 것으로, M은 표준 단백질 마커를 나타내고, 레인 1은 IPTG 를 넣기 전, 레인 2는 IPTG를 넣은 후, 레인 3은 Ni-NTA 레진을 이용하여 크로마토그래피를 실시한 후, 레인 4 및 5는 세척 단계인 C1-2, 레인 6 내지 레인 9는 단백질 용출(elution) 단계인 D1 - D4 를, 레인 10 내지 레인 13은 단백질 용출(elution) 단계인 E1- E4 를 나타낸다.
도 4는 STF2-GnRH 융합 재조합 단백질을 접종한 실험군과 대조군에서의 고환 사진을 나타낸 것이다. I 은 STF2-6xGnRH 400ug을 접종한 그룹의 고환 사진을 나타내고, II 는 STF2-6xGnRH 200ug을 접종한 그룹의 고환 사진을 나타내고, III 은 STF2-6xGnRH 100ug 접종한 그룹의 고환 사진을 나타내고, IV 는 대조군으로 아무것도 접종하지 않은 그룹의 고환 사진을 나타낸다. 사진에 표시된 검정색 실선은 10 mm 를 나타낸다.
도 5는 GnRH 에 대한 항체 역가를 나타내는 그래프로서, 세로축은 OD 값을 나타내고 가로축은 접종 후 시간을 나타낸다.
도 6은 고환 조직 검사 결과를 나타낸 것으로, I 은 STF2-6xGnRH 400ug을 접종한 그룹의 고환 조직사진이고, II 는 STF2-6xGnRH 200ug을 III 은 STF2-6xGnRH 100ug을 접종한 그룹의 고환 조직사진이고, IV 는 대조군으로 아무것도 접종하지 않은 그룹의 고환 조직 사진이다. a, b, c, d 는 100x 로 e, f, g, h 는 400x 로 찍은 고환 조직 사진을 나타낸다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. STF2 - GnRH 융합 재조합 단백질의 제조
1-1. swGnRH 3 카피( copy )의 클로닝
돼지 유래의 swGnRH는 10개의 아미노산으로 구성되어 있으며 DNA 염기서열 및 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
하기 표 1에 기재된 swGnRH 3 카피 유전자의 5' 말단에 Bgl II 및 3' 말단에 Eco RI 제한 효소 부위를 포함하고 있는 백본 I 올리고머(backbone I oligomer)유전자 또는 swGnRH 3 카피 유전자의 5' 말단에 Eco RI 및 3' 말단에 Hind III 제한효소 사이트를 포함하고 있는 백본 II 올리고머(backbone II oligomer)를 증폭시키기 위해서, 하기 표 2에 기재된 swGnRH back I F Bgl II 프라이머, swGnRH back I R Kpn I, swGnRH back II F Kpn I 및 swGnRH back II R Hind III를 이용하여 클로닝을 수행하였다.
swGnRH 서열 서열번호
유전자 5'-GAA CAT TGG TCA TAT GGA CTA CGG CCG GGA-3' 3
단백질 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly 4
유전자 염기서열 서열번호
swGnRH 백본 I 올리고머 5'-GGAAGATCT BglII GAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGA ATTCCGG EcoRI -3' 7
swGnRH 백본 II 올리고머 5'-CCGGAATTC EcoRI GAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAAA GCTTGGG HindIII -3' 8
유전자 프라이머 서열 서열번호
swGnRH back I F Bgl II 5'-GGAAGATCT BglII GAACATTGGTC-3' 9
swGnRH back I R Kpn I 5'-CGGGGTACC KpnI TCCCGGCCGTA-3' 10
swGnRH back II F Kpn I 5'-CGGGGTACC KpnI GAACAtTGGTCATATGGACTAC-3' 11
swGnRH back II R Hind III 5'-CCCAAGCTT HindIII TCCCGGCC-3' 12
1차 PCR은 TGradient (Biometra, Germany)을 사용하여 하기 표 3에 나타나는 바와 같이 PCR 반응액의 조성물을 총 50ul 부피로 하여 실시하였다. PCR 증폭의 변성단계는 95℃에서 5분 동안 실시하였고, 결합단계는 55℃에서 30분 동안 실시하였으며, 신장단계는 72℃에서 30분 동안 수행하였다. 이후 증폭된 각각의 PCR 산물, 즉 swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 및 swGnRH 백본 II 올리고머를 이용하여 증폭된 유전자를 Gel SV 키트(Genall 사)를 사용하여 정제하였고, 정제된 swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 및 swGnRH 백본 II 올리고머 유전자를 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 하기 표 4에 나타나는 바와 같이 PCR 반응액의 조성물을 총 50ul 부피로 하여 실시하였다. PCR 증폭의 초기 변성단계는 95℃에서 5분 동안 실시하였고, 증폭 단계는 95℃(변성)에서 1분, 55℃(결합)에서 30초, 72℃(신장)에서 45초를 1사이클로 하여 30사이클로 실시하였으며, 최종 신장단계는 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 이후 STF2와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였고, PCR의 산물인 swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 또는 swGnRH 백본 II 올리고머 유전자를 통해 증폭된 유전자가 삽입된 TA 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다(이하, swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 및 swGnRH 백본 II 올리고머 유전자를 swGnRH 3 카피(copy)유전자라 명명함). 이 때, DH5a 대장균 내에 존재하는 TA 플라스미드는 Plasmid SV mini 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3 카피(copy)유전자가 TA 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 TA 플라스미드의 제한효소 부분 중 swGnRH 3 카피(copy)유전자의 주변에 위치한 Hind III를 이용하여 절단하였으며, swGnRH 3 카피(copy)유전자는 약 110bp 부근에서 특이 밴드로 관찰되었다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3 카피(copy)/TA 재조합 플라스미드를 획득할 수 있다.
재료 용량
증류수 35.5ul
dNTP 2.5Mmol (Fermentas) 2ul
swGnRH/TA back I R Kpn I 또는
swGnRH/TA back II R Hind III (20pM)		 1ul
swGnRH/TA 백본 I 또는
swGnRH/TA 백본 II 올리고머 (20pM)		 5ul
버퍼 10X 5ul
Taq 합성효소(Supertherm) 0.5ul(2.5 unit)
재료 용량
증류수 35.5ul
dNTP 2.5Mmol (Fermentas) 2ul
swGnRH/TA back I F Bgl II 또는
swGnRH/TA back II F Kpn I (20pM)		 1ul
swGnRH/TA back I R Kpn I 또는
swGnRH/TA back II R Hind III (20pM)		 1ul
swGnRH/TA 백본 I 또는
swGnRH/TA 백본 II 올리고머의 1차 PCR 산물		 5ul
버퍼 10X 5ul
Taq 합성효소(Supertherm) 0.5ul(2.5 unit)
1-2. swGnRH 3 카피( copy ) 제조
swGnRH 유전자를 3 카피(copy)를 포함하는 pQE40 벡터를 만들기 위해서 swGnRH 유전자를 3 카피(copy)를 제조하였다.
단백질 발현 벡터인 pQE40 플라스미드 DNA를 추출한 후 Bgl II (Takara) 및 Kpn I (Takara) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이후 상기의 방법으로 절단된 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, Gel SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 1-1에서 제조한 swGnRH 3카피/TA 플라스미드 DNA를 Bgl II (Takara) 및 Kpn I (Takara) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이후 상기의 방법으로 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGnRH 3 카피는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조된 pQE40 플라스미드 DNA와 swGnRH 3 카피 DNA를 핵산결합효소인 T4 리가아제(New England Biolabs)를 이용하여 결합시킨 후 이 재조합 플라스미드를 SG 13009 대장균(Qiagen) 내로 열 충격 방법(heat shock method)을 이용하여 형질전환하였다. 그 후 형질전환된 대장균을 LB 배지 상에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양기에서 배양하였다. 이후 swGnRH 3 카피 DNA가 삽입된 pQE40 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pQE40 플라스미드는 Plasmid SV mini 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3 카피 DNA가 pQE40 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA 시퀀싱을 통해 swGnRH 3 카피(copy) DNA 염기서열을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3 카피(copy) 유전자가 삽입된 재조합 pQE40 플라스미드를 획득할 수 있었다(이하, 이를 'pGnRH3'이라 명명함).
1-3. swGnRH 6 카피( copy ) 제조
swGnRH 유전자를 6 카피를 포함하는 pQE40 벡터를 만들기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1-2 에서 획득한 pGnRH3 플라스미드 DNA를 Kpn I (Takara) 및 Hind III (Takara) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pGnRH3 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 1-1 에서 제조한 swGnRH 3 카피/TA 재조합 플라스미드 DNA를 Kpn I(Takara) 및 Hind III (Takara) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGnRH 3 카피 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조된 pGnRH3 플라스미드 DNA와 swGnRH 3 카피 DNA를 실시예 1-2와 동일한 방법으로 클로닝하였다. 그 후 swGnRH 3카피DNA가 삽입된 pGnRH3 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG13009 대장균 내에 존재하는 pGnRH3 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3 카피 DNA가 pGnRH3 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA 시퀀싱을 통해 swGnRH 6 카피 DNA 염기서열을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3 카피 유전자가 추가로 삽입된 재조합 pGnRH6 플라스미드를 획득할 수 있었다 (이하, 이를 'pGnRH6'이라 명명함).
1-4. STF2 유전자의 서브 클로닝
STF2 유전자를 증폭하기 위해 STF2 정방향 프라이머 (5'-ATGGCACAAGTAATCAACACTAAC-3' 서열번호 13) 및 STF2 역방향 프라이머(5'-ACGTAACAGAGACAGCACGTTCTGC-3' 서열번호 14)를 사용하였으며, Salmonella typhimurium의 DNA를 정제하여 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하였다. 사용한 PCR 조성(표 5) 및 PCR 조건(표 6)는 다음과 같으며, 1518 bp의 STF2 유전자의 PCR 증폭 산물을 도 1에 나타내었다.
재료 용량
증류수 39.5ul
dNTP 2.5Mmol (Takarka) 2ul
정방향 프라이머 1ul
역방향 프라이머 1ul
주형 5ul
버퍼 10x 5ul
Taq 합성효소 (Takara) 0.5ul(2.5 unit)
PCR 단계 온도 (oC) 시간 사이클
초기 변성(Preactivation) 95 5분 1
변성(Denaturation) 95 30초
30
결합(Annealing) 55 30초
신장(Extension) 72 90초
최종 신장(Final extension) 72 10분 1
증폭한 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(Real Bio Tech Corporation) 에 연결(ligation)하였고 HIT 컴피턴트 세포 (DH5a Real Bio Tech corporation)에 형질전환 하였다. 형질전환된 E. coli를 X gal 과 IPTG 가 접종되어 있는 암피실린이 포함되어 있는LB 플레이트에서 하룻동안 배양한 후 화이트 콜로니를 선발하였다. 선발된 콜로니를 암피실린이 포함되어 있는 LB broth에서 하룻밤 배양 후 플라스미드DNA를 추출하고 DNA 시퀀싱을 통해 STF2유전자가 클로닝된 것을 확인하였다.
TA 클로닝 벡터 안에 들어 있는 STF2 유전자를 6 카피의 GnRH 가 클로닝 되어있는 단백질 발현용 벡터인 pQE 벡터에 삽입하기 위하여, 다음과 같이 제한 효소를 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행 하였다.
STF2pQEBamH I 정방향 프라이머;
5'-GGATCC BamH I GCACAAGTAATCAACACTAAC-3'(서열번호 15)
STF2pQEBgl II 역방향 프라이머;
5'-AGATCT Bgl II ACGTAACAGAGACAGCACGTTCTGC-3'(서열번호 16)
사용한 PCR 조성(표 7) 및 PCR 조건(표 8)는 다음과 같으며, STF2 유전자를 포함하는 1527 bp PCR 증폭 산물을 도 2에 나타내었다.
재료 용량
증류수 39.5ul
dNTP 2.5Mmol (Takarka) 2ul
정방향 프라이머 1ul
역방향 프라이머 1ul
STF2 를 포함하는 벡터 DNA 1ul
버퍼 10x 5ul
Taq 합성효소 (Takara) 0.5ul(2.5 unit)
PCR 단계 온도 (oC) 시간 사이클
초기 변성(Preactivation) 95 5분 1
변성(Denaturation) 95 1분
30
결합(Annealing) 55 30초
신장(Extension) 72 45초
최종 신장(Final extension) 72 10분 1
1-5. STF2 - GnRH 발현 벡터 제작
증폭한 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(Real Bio Tech Corporation) 에 연결(ligation) 하였고 HIT 컴피턴트 세포(DH5a Real Bio Tech corporation)에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 X gal 과 IPTG 가 접종되어 있는 암피실린이 포함되어 있는 LB 배지에서 하룻동안 배양한 후 콜로니를 선발하였다. 선발된 콜로니를 암피실린이 포함되어 있는 LB broth에서 하룻밤 배양 후 플라스미드 DNA를 추출하였으며, 그 후 DNA 시퀀싱을 통해 제한효소 자리가 포함된 STF2유전자가 클로닝된 것을 확인하였다.
STF2 유전자가 클로닝 되어 있는 TA 벡터를 BamH I (NEB) 과 Bgl II (NEB) 제한 효소를 이용하여 절단하여 1% 아가로스 겔에 전기 영동을 실시하여 gel extraction kit (Dokdo, Korea)를 이용하여 STF2 부분만을 취하였다. 6 카피의 GnRH 유전자가 클로닝 되어 있는 pQE40 벡터를 BamH I (NEB) 과 Bgl II (NEB) 제한 효소를 이용하여 절단한 후, 1% 아가로스 겔에 전기 영동을 실시하여 Gel SV 키트(Genall)를 이용하여 pQE 40 벡터에 있던 DHFR 을 제외 한 6개의 GnRH 만을 포함하고 있는 단백질 발현 벡터를 선별하였다. 그 후 6개의 GnRH 만을 포함하고 있는 단백질 발현 벡터에 STF2 유전자를 핵산결합효소인 T4 리가아제 (New England Biolabs,)를 이용해서 삽입하여 STF2와 6 카피의 GnRH 유전자가 융합된 단백질 발현 벡터를 제작하였다. 그 후 M15 컴피턴트 세포(Qiagen) 에 형질전환을 실시하고 암피실린과 카나마이신이 포함되어 있는 LB 플레이트에서 16 시간 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양한 후 콜로니를 PCR 을 실시하여 스크리닝한 후 DNA 시퀀싱을 통해 STF2-6xGnRH 가 클로닝되어 있는 콜로니를 확인하였다. DNA 시퀀싱을 통해 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 확인하였다.
1-6. STF2 - GnRH 단백질 발현 및 정제
STF2-GnRH 단백질은 QIAexpressionist (Qiagen) 프로토콜에 따라 아래와 같이 발현(expression) 및 정제(purification)를 실시하였다. 시퀀싱을 통해 확인된 STF2-6xGnRH가 들어있는 stock을 하룻밤 배양한 후 배양 산물20ml를 LB broth Amp(+), Kana(+) 1L에 접종해서 OD 600값이 0.5에 도달할 때까지 배양 후 IPTG 1mM을 넣고 단백질 발현을 유도하였으며 4-5 시간 동안 배양하였다. 그 후 원심분리를 실시하여 펠렛을 얻은 후 -20℃ 에서 하루 밤 보관 후 용해(lysis) 버퍼를 이용하여 펠렛을 용해시킨 후 다시 원심분리를 실시하여 상층액을 취해 Ni-NTA 레진과 실온에서 1시간 동안 교반(shaking)한 후 컬럼에 내렸다. 그 후 pH6.3의 세척 (washing) 버퍼인 C버퍼로 두 번 세척한 후 pH5.9의 용출 (elution) 버퍼인 D버퍼로 4번 용출하고 pH 4.5 의 용출 (elution) 버퍼인 E 버퍼로 용출하였다. 그 후SDS-PAGE 를 이용하여 발현 및 정제를 확인한 결과 약 62KD의 밴드가 확인 되었다(도 3).
세척 버퍼의 조성(표 9) 및 용출 버퍼의 조성(표 10)은 다음과 같다.
버퍼 C (1리터)
100mM NaH2PO4 13.8 g NaH2PO4 ·H2O (분자량 137.99 g /mol)
10mM Tris-Cl 1.2 g Tris base ( 분자량 121.1 g/mol)
8M 요소 480.5 g ( 분자량 60.06 g/mol)
HCl 를 사용하여 pH 6.3 으로 조정
버퍼 D (1 리터)
100mM NaH2PO4 13.8 g NaH2PO4 ·H2O (분자량 137.99 g /mol)
10mM Tris-Cl 1.2 g Tris base ( 분자량 121.1 g/mol)
8M 요소 480.5 g ( 분자량 60.06 g/mol)
HCl 를 사용하여 pH 5.9 로 조정
버퍼 E (1 리터)
100mM NaH2PO4 13.8 g NaH2PO4 ·H2O (분자량 137.99 g /mol)
10mM Tris-Cl 1.2 g Tris base ( 분자량 121.1 g/mol)
8M 요소 480.5 g ( 분자량 60.06 g/mol)
HCl 를 사용하여 pH 4.5 로 조정
실시예 2. 랫트 에서의 STF2 - GnRH 백신의 효능 확인
2-1. 고환의 크기 및 무게 측정
총 16마리의 4주령 수컷 Spraque Dawley (SD) 랫트를 4마리씩 4개의 그룹으로 구성하였다; 그룹 1; STF2-GnRH 400 ug, 그룹 2; STF2-GnRH 200 ug, 그룹 3; STF2-GnRH 100 ug, 그룹 4; 대조군.
그룹 1, 2 및 3은 STF2-GnRH 백신을 농도 별로 차이를 두었고, 그룹 4는 대조 군으로 아무것도 접종하지 않았다. 백신의 접종은 5 주령의 랫트에 1차 접종을 실시하고 2주 간격으로 세 번의 추가 접종을 실시하였다. 모든 그룹의 랫트는 접종 전에 미정맥에서 채혈을 하였고 마지막 백신접종 2주 후 안락사 하기 전에 복대정맥에서 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 혈청 분리를 실시하여 추후 ELISA를 이용한 GnRH 항체 검사에 사용하였다. 안락사를 실시한 후 고환 및 부고환을 절제하여 무게와 크기를 측정하고 포르말린에 조직을 고정하여 조직 검사를 실시하였다.
그 결과, STF2-6xGnRH 백신을 접종한 그룹인 그룹 1, 2 및 3의 랫트와 비접종 그룹인 그룹 4의 랫트의 고환크기를 비교한 결과 백신을 접종한 그룹의 랫트 고환이 매우 작아져 있음을 육안적으로 확인할 수 있었다 (도 4).
또한, 각 그룹의 랫트 고환 및 부고환의 무게를 잰 결과는 표 11과 같았고, 접종을 하지 않은 그룹의 랫트에 비해 접종을 한 그룹의 랫트 고환무게가 약 40% 이상 적은 것이 확인되었다.
그룹 백신 고환 및 부고환의 무게(쌍)(g)
I STF2-6xGnRH 400ug 3.04 (± 1.66)
II STF2-6xGnRH 200ug 3.45 (± 1.67)
III STF2-6xGnRH 100ug 3.07 (± 1.72)
IV 대조군 5.28 (± 0.25)
2-2. 혈청 내 항체 역가 측정
각각의 접종 전과 안락사 전에 채혈한 혈액에 존재하는 GnRH 에 대한 항체를 측하기 위하여, KLH-GnRH 단백질을 코팅버퍼 (carbonate/bicarbonate buffer, pH 9.6) 에 10ug/ml 의 농도로 희석한 후 96웰 ELISA 플레이트(SPL)에 웰 당 50ul씩 분주한 후 4 ℃에 하룻밤 동안 반응시켰다. 세척 버퍼 (PBST (Phosphate buffered saline tween 20)로 350 ul씩 3회 세척 후 차단(blocking) 버퍼(5% skim milk-PBST) 를 웰 당 100ul씩 넣어 준 후 37 ℃ 에서 2시간 동안 반응 시켰다. 그 후 세척 버퍼 (PBST (Phosphate buffered saline tween 20)로 350 ul씩 3회 세척 후 랫트의 혈청을 희석(dilution) 버퍼 (2.5% skim milk-PBST)에 40x로 희석하여 각 웰 당 100ul씩 넣어준 후 37 ℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 세척 버퍼 (PBST (Phosphate buffered saline tween 20)로 350 ul씩 5회 세척 후 HRP (horseradish peroxidase) 접합된 항-랫트 항체 (Bethyl) 를 희석(dilution) 버퍼 (2.5% skim milk-PBST)에 10000x 로 희석한 후 각 웰 당 100ul씩 넣어준 후 37 ℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 세척 버퍼 PBST (Phosphate buffered saline tween 20)로 350 ul씩 5회 세척 후 TMB 용액 (KPL) 를 각 웰 당 50 ul 씩 넣어 10분간 반응시켰다. 그 후 각 웰 당 50 ul의 반응정지용액(stop solution, 1M HCl)을 넣어 준 후 ELISA 리더기로 450nm 의 파장으로 수치를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 접종을 하지 않은 그룹은 항체가 형성되지 않은 것에 반해 접종 그룹의 랫트는 2차 접종 이후부터 항체 역가가 증가하였다. 그러나 백신의 농도에 따른 항체형성의 증가현상은 관찰되지 않았다.
2-3. 고환조직에서의 정자 형성 억제
각 그룹의 고환의 조직 검사를 위하여, 안락사를 실시한 후 돼지에서 떼어낸 고환조직 10 mm3 을 10% 포르말린에 24-48시간 고정(fixation) 시켰다. 고정 후 조직을 칼날로 2mm 두께로 잘라내어 조직 카세트에 넣어 조직 처리 기계에 넣어 조직을 처리하였다. 그런 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 파라핀 블록을 만들어 미세 조직 칼날(micro tome)로 파라핀 블록을 섹션하여 슬라이드를 얻었다. 슬라이드는 자일렌 (xylene) 에 3분, 100% 에탄올에 3분, 95% 에탄올에 3분, 80% 에탄올에 3분 순서대로 넣은 후 증류수로 1분간 세척하였다. 세척 후 헤마토실린 (hematoxylin)에 3분간 염색 후 증류수로 세척하였다. 세척 후 에오신(eosin) 30초간 염색 후 95% 에탄올, 100% 에탄올 각각 3분씩 넣은 후 자일렌에 넣어 염색을 마쳤다. 염색 후 얻은 슬라이드에 커버 글라스를 덮어 최종 슬라이드 제작을 마친 후 현미경으로 관찰하여 조직학적 특징을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 대조군인 그룹 4의 고환조직은 정세관(seminiferous tubule, ST) 가장 바깥층에 존재하는 정조세포(spermatogonia)와 그 안쪽으로 순차적으로 일차 및 이차 정모세포(primary, secondary spermatocyte), 정자세포(spermatid), 꼬리를 가지고 있는 정자가 배열되어 있고 정상적인 크기의 정세관으로 이루어져 있으며 정세관 사이의 간극이 치밀하며 결합 조직에는 라이디히 세포(leydig cell)가 존재하며 혈관이 발달되어 있었다. 이에 반해, 백신 접종군인 그룹 1, 2 및 3의 고환 조직은 대부분의 정세관이 심하게 위축 되어 있었고, 정세관을 구성하는 정조세포의 괴사로 인해 일차, 이차 정모세포, 정자세포로의 발달이 이루어지지 않아서 형태학적으로 정모세포 이후의 단계가 관찰되지 않았으며, 정세관 사이의 결합조직을 이루는 간질세포인 라이디히 세포의 수가 적으며, 상당히 심한 고환 조직의 손상을 관찰할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. STF2(Salmonella typhimurium flagellin fljB) 및 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 융합된 융합 재조합 단백질을 포함하는, 항체 형성능이 증진된 면역 거세용 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 STF2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 면역 거세용 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것인 면역 거세용 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서, STF2 및 GnRH 가 링커를 통하여 융합된 것인 면역 거세용 백신 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 가 1개 내지 20개 연결된 것인 면역 거세용 백신 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 GnRH 가 6개 연결된 것인 면역 거세용 백신 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 GnRH 가 각각 링커를 통하여 연결된 것인 면역 거세용 백신 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 것인 면역 거세용 백신 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 아쥬반트(adjuvant)를 추가적으로 포함하는 백신 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 면역 거세 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 동물은 개, 소, 사람, 토끼, 염소, 양, 산양, 쥐, 말, 사슴, 원숭이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 하이에나, 들개, 치타, 표범, 재규어, 코끼리, 물소, 살쾡이, 고슴도치, 두더지, 돼지, 다람쥐, 청설모, 오소리, 너구리, 오리너구리, 나무늘보, 반달곰, 흰곰, 불곰, 팬더, 날다람쥐, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 노루, 코뿔소, 담비, 수달, 바다표범, 물개, 물곰, 바다코끼리, 고래 또는 돌고래인 면역 거세 방법.
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