CN102159240A - 基于狂犬病毒的重组免疫避孕组合物及其使用方法 - Google Patents

基于狂犬病毒的重组免疫避孕组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文描述了含有编码免疫避孕蛋白，例如促性腺激素释放激素(GnRH)或透明带3(ZP3)的异源核酸序列的重组狂犬病毒。本文公开的重组狂犬病毒通过反向遗传学回收，复制高效，在接种的动物中引发狂犬病毒中和抗体和免疫避孕肽特异性抗体，并保护接种的动物抵抗野生型狂犬病毒的激惹。此外，还提供了免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并在同时抑制动物生育力的方法，所述方法包括给药包含上述一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物。

Description

基于狂犬病毒的重组免疫避孕组合物及其使用方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2008年9月17日提交的美国临时申请No.61/097,748的优先权，所述临时申请在此以其全文引为参考。
技术领域
本公开涉及作为免疫避孕组合物用于控制野生和驯养动物的种群增长并保护动物抵抗狂犬病毒感染的重组狂犬病毒。
背景技术
狂犬病是对公共卫生的重要威胁，每年引起50,000至60,000人死亡(世界卫生组织(World Health Organization)，2003年4月)。人类被狂犬病毒感染主要是通过患狂犬病的驯养和野生动物的叮咬。在发展中国家，约94％的人类狂犬病死亡是由狗造成的。狗狂犬病仍然在非洲、亚洲和南美洲的大多数国家的动物中流行，并且在这些国家中，大多数人类的患病死亡由狗造成。因此，在驯养和野生动物中控制狂犬病毒感染，不仅将在这些动物中降低死亡率，而且将降低人类暴露的风险。
狂犬病毒由被感染动物的叮咬或抓伤引起的破裂皮肤传播。暴露于狂犬病毒导致其侵入外周无髓鞘的神经末梢，然后通过逆向轴突运输传播，专门在神经元中进行复制，并最终达到中枢神经系统(CNS)。CNS的感染引起细胞机能障碍和死亡(Rupprecht和Dietzschold，Lab Invest.57：603，1987)。因为狂犬病毒直接在细胞间传播，因此它大多避开免疫识别(Clark和Prabhakar，“狂犬病”(Rabies)，在Olson等主编的《病毒性疾病的比较病理学》中(Comparative Pathology of Viral Disease)2：165，Boca Raton，FL，CRC Press，1985)。
使用旧式的捕捉、监禁和安乐死方法控制狗的种群是不人道的，并且不被公众接受。犬类狂犬病防控和自由放养狗的适合的种群管理，对于最终消灭疾病来说是至关重要的。已经提出了各种手段来打断犬类的繁殖周期，包括动物的手术切除卵巢/阉割、化学绝育和免疫避孕。例如，作为用于狗的免疫避孕肽，促性腺激素释放激素(GnRH)已被当作一种手段。但是，到目前为止的研究显示，GnRH需要被合成并与载体蛋白(或佐剂)结合才具有免疫原性。必需的生产放大在满足现代疫苗供应的法规和经济要求方面，可能有问题。因此，构建一种在动物中单次给药后能够诱导适合的针对狂犬病毒和免疫避孕靶两者的双重免疫应答的疫苗，将是理想的。
此外，在过去30年间，免疫避孕研究还未能产生一种商业化产品。技术限制是主要因素之一。因此，对于工程化改造的、具有表达适合的免疫避孕基因的能力的新的狂犬病毒疫苗，存在长期以来没有被感觉到的需要。这种类型的疫苗将是用于野生和驯养动物包括狗的狂犬病预防和种群控制两者的理想候选物。
发明概述
本文公开了包含编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列的重组狂犬病毒。重组狂犬病毒使用反向遗传学回收，在培养物中高效复制，并引发高滴度的狂犬病毒中和抗体，引发免疫避孕蛋白特异性抗体，并在接种的动物中提供针对狂犬病毒激惹的保护作用。
本文提供了重组狂犬病毒，其中重组狂犬病毒的基因组包含编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列。在某些实施方案中，免疫避孕蛋白是促性腺激素释放激素(GnRH)或透明带3(ZP3)，例如狗ZP3。在某些实施方案中，重组狂犬病毒的基因组包含编码ZP3的核酸序列和编码GnRH的核酸序列。
还提供了包含本文描述的一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物。还提供了包含第一种重组狂犬病毒和第二种重组狂犬病毒的免疫原性组合物，其中第一种重组狂犬病毒的基因组包含GnRH核酸序列，并且第二种重组狂犬病毒的基因组包含ZP3核酸序列。
还提供了通过向动物给药治疗有效量的包含本文公开的一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物，来免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物生育力的方法。
从下面几个实施方案的详细描述并同时参考附图，上述以及其他的特点和优点将变得更加明显。
附图简述
图1是四种重组ERAZP3病毒的示意图。G*表示在糖蛋白(G)的333位氨基酸处的突变。ZP-表示狗的透明带基因。
图2A是狂犬病毒糖蛋白的示意图。箭头指示了一个或两个GnRH拷贝插入的位置。通过反向遗传学成功地回收到在每个这些位置带有插入的GnRH的重组病毒(Ecto＝胞外结构域；SP＝信号肽；TM＝跨膜；IIb、II、IIa、WB+和III是指抗原性位点)。图2B是重组狂犬病毒ERA-3-GnRH的示意图。
图3A是列出了包含狗ZP3(DZP3)、GnRH或两者的示例性重组狂犬病毒的表。病毒描述指示了ZP3和/或GnRH在病毒基因组中插入的位置(G3＝具有G333突变的糖蛋白)。图3B是显示了未接种的小鼠(对照)或用ERA-N-GnRH(5号病毒)、ERA-3-GnRH(7号病毒)或ERA-G3-2GnRH(8号病毒)接种的小鼠的存活率的图。每组小鼠随后用致死剂量的狂犬病毒激惹。
图4是蛋白凝胶的照片，显示了与匙孔血蓝蛋白(KLH)结合的GnRH或2GnRH肽。蛋白在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离。GnRH-KLH和2GnRH-KLH分别显示在第2和4道中。第1和6道含有分子量标志物。第3和5道显示了KLH标准品。
图5A是亲代ERA和重排的ERAg3p基因组的示意图。为了产生ERAg3p，将ERA基因组中的G基因重新定位在P基因前面，并在333位氨基酸残基处从AGA(命名为G)突变成GAG(命名为G*)。图5B是一步生长曲线，显示了重排的ERAg3p病毒的生长特性。回收的ERAg3p病毒以及亲代ERA病毒进行了生长。图5C是比较ERA与ERAg3p的毒力的线图。在脑内注射后，ERAg3p不引起任何3周龄小鼠的死亡。
图6是显示了ERAg3p狂犬病毒G基因中GnRH或2GnRH编码序列的插入位点的示意图。SP＝信号肽；TM＝跨膜；CT＝胞质尾巴；N＝糖蛋白的氨基末端，以及C＝糖蛋白的羧基末端。
图7A是显示为了产生ERA-N-GnRH、ERA-N-2GnRH、ERA-IIa-GnRH和ERA-C-GnRH，GnRH在ERAg3p基因组中的插入位点的示意图。图7B是线图，显示了带有GnRH的ERAg3p病毒的回收和生长特性。从12个构建物中的4个中成功回收了重组病毒。回收到的病毒含有插入到紧靠糖蛋白的信号序列、IIa抗原性位点或胞外结构域与跨膜结构域之间的连接处后的氨基末端处的GnRH。
图8A是电泳凝胶的照片，显示了纯化的ERA-N-2GnRH(第1道)、ERA-N-GnRH(第2道)和ERA-IIa-GnRH(第3道)。纯化的病毒在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离。第4和5道含有来自狂犬病毒ERA的纯化的糖蛋白和纯化的核蛋白作为对照。图8B是纯化的ERA-N-2GnRH(第2道)和ERA-N-GnRH(第3道)的Northern印迹照片。第1和4道含有RNA分子量标志物。
图9是线图，显示了带有GnRH的ERAg3p病毒在小鼠模型中的安全性和效力。肌肉内注射ERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH或ERA-IIa-GnRH后，在小鼠中没有观察到明显的副作用。在接种后三周，用约2.5-10.0MICLD50狗/丛林狼(coyote)街狂犬病毒的致死剂量激惹的所有小鼠都存活。对照小鼠(注射空白对照剂)在激惹后8至10天之间死亡。在2个月时结束实验之前，存活的小鼠保持健康。
图10A-10D是Western印迹，显示了GnRH-KLH和2GnRH-KLH偶联物与用带有GnRH的ERA病毒免疫的小鼠血清和GonaConTM血清的反应。对于每个印迹来说，第1和2道分别含有GnRH-KLH和2GnRH-KLH。显示的是来自狂犬病毒ERA-IIa-GnRH免疫的小鼠血清(A)；来自RV
ERA-N-GnRH免疫的小鼠血清(B)；来自ERA-N-2GnRH免疫的小鼠血清(C)；和针对GonaConTM的兔血清(D)。在小鼠和兔血清之间没有检测到针对GnRH偶联物的差异。
序列表
在随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用如37C.F.R.1.822中所定义的用于核苷酸碱基的标准字母缩写和用于氨基酸的三字母编码来显示。每个核苷序列仅显示了一条链，但是对所显示链的任何指称应该理解为包括了互补链。在随附的序列表中：
SEQ ID NO：1是通过反向遗传学回收的重组狂犬病毒ERA的核苷酸序列。4370-4372位核苷酸从aga突变成gag，在G蛋白中引入了Arg到Glu的氨基酸改变。
SEQ ID NO：2是狂犬病毒ERA的N蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是狂犬病毒ERA的P蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是狂犬病毒ERA的M蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是狂犬病毒ERA的G蛋白的氨基酸序列。333位氨基酸残基处Arg到Glu的变化是一个减毒突变。
SEQ ID NO：6是狂犬病毒ERA的L蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7和8分别是狗透明带3(ZP3)的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：9-26是用于产生狗ZP3的片段A的寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO：27-46是用于产生狗ZP3的片段B的寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO：47和48分别是GnRH的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：49和50分别是在紧接19个氨基酸的G蛋白信号序列后插入单个GnRH拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为G-N-GnRH。
SEQ ID NO：51和52分别是在紧接19个氨基酸的G蛋白信号序列后插入两个GnRH拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为G-N-2GnRH。
SEQ ID NO：53和54分别是在紧接G蛋白的221位氨基酸(IIa位点)后插入单个GnRH拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为GnRH-p3或G-IIa-GnRH。
SEQ ID NO：55是GnRH肽1780的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56是GnRH肽1781的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57是2GnRH(GnRH编码序列的两个串联拷贝)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：58和59是用于将GnRH编码序列插入到狂犬病毒G基因中的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：60和61是用于将串联的GnRH(2GnRH)编码序列插入到狂犬病毒G基因中的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：62是狗ZP3的核苷酸序列，于2004年8月5日保存在GenBank登记号NM 001003224下。
SEQ ID NO：63和64分别是具有插入到糖蛋白的胞外结构域与跨膜结构域的连接处(1374位核苷酸、458位氨基酸之后)的一个GnRH拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为G-C-GnRH。
详细描述
I.简介
狂犬病是全球关注的重要公共卫生问题。在大多数情况下，人类通过患狂犬病的驯养或野生动物的叮咬感染上狂犬病毒。在发展中国家，94％的由狂犬病引起的人类死亡是狗造成的。在拉丁美洲、亚洲和非洲国家中，流浪或未接种的狗是狂犬病的首要储主。此外，在美国，目前有数百万流浪或野生猫。因此，在世界范围内，对于防止狂犬病和控制狂犬病易感动物特别是狗的种群两者都存在着需求。
当前的动物种群控制方法包括使用免疫避孕疫苗。免疫避孕涉及刺激针对生殖细胞或生殖激素的免疫应答以阻止妊娠。免疫避孕是用于害虫和种群过度丰富的野生哺乳动物(例如浣熊或鹿)的种群控制的人道方法。大量研究聚焦于使用透明带糖蛋白3(ZP3)，它是精子用于使卵受精的主要受体。但是，ZP3或其他免疫避孕蛋白的给药，以前需要共同给药佐剂和/或加强剂量以引发针对蛋白的足够的免疫应答，以便抑制受精。因此，目前的免疫避孕方法具有显著局限性，特别是对于野生动物种群来说。
本文公开的免疫原性组合物和方法，提供了同时保护接种动物抵抗狂犬病和通过抑制生育力来控制动物种群的手段。本文中描述了包含至少一种编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列的重组狂犬病毒。在具体实例中，免疫避孕蛋白是GnRH或ZP3。在某些情况下，重组狂犬病毒包含GnRH和ZP3两者。可选地，可以用两种不同的重组狂犬病毒免疫动物，一种包含GnRH，第二种包含ZP3。因为免疫避孕蛋白编码在狂犬病毒的基因组中，因此当产生重组狂犬病毒粒子时，免疫避孕肽复合在病毒粒子中(结构蛋白)，或包含在病毒粒子内(非结构蛋白)。通过将免疫避孕蛋白复合在狂犬病毒粒子中，不需要佐剂来引发针对狂犬病毒和免疫避孕蛋白两者的免疫应答。
II.缩写
Figure BPA00001330814600071
Figure BPA00001330814600081
III.术语
除非另有指明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以在下述文献中发现：Benjamin Lewin，《基因V》(Genes V)，由牛津大学出版社(Oxford University Press)出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等主编，《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular Biology)，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers主编，《分子生物学和生物技术：详尽桌面参考》(Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference)，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了便于评阅本公开的各种实施方案，提供了下列具体术语的解释：
佐剂：非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或介质。佐剂可以包括其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬液；或油包水乳液，其中抗原溶液乳化在矿物油中(例如Freund不完全佐剂)，有时包含有杀死的分枝杆菌(Freund完全佐剂)以进一步增加抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的寡核苷酸)也可以用作佐剂(例如参见美国专利No.6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如辅助刺激分子。示例性的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。
给药：当在本文中使用时，向对象给药组合物是指提供、施加或使组合物与对象进行接触。给药可以通过多种途径中的任一种进行，例如表面、口服、皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、鞘内和肌肉内。在本文描述的某些实施方案中，免疫原性组合物通过口服途径给药于动物。
动物：活的多细胞有脊椎生物体，该类别包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物。术语“动物”包括人类和兽医对象，例如人类、非人类灵长动物、狗、猫、马、浣熊、蝙蝠、大鼠、小鼠、狐狸、松鼠、负鼠、丛林狼、狼和奶牛。当在本文中使用时，“对象”可以与“动物”互换。当在本文中使用时，“驯养动物”是指任何已被人类驯化、通常用作役用动物、食物来源或作为宠物的动物。许多驯养动物是选择育种的，使得它们与野生动物不同。当在本文中使用时，“野生动物”是指任何生活在自然界中未被驯养状态的动物。
抗体：包括一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白(或蛋白复合体)。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其反过来定义了免疫球蛋白类型，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
基本的免疫球蛋白(抗体)结构单元一般是四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N-末端定义了约100至110个或以上氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。
当在本文中使用时，术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白以及大量性质明确的片段。例如，与靶蛋白(或蛋白或融合蛋白中的表位)结合的Fab、Fv和单链Fv(SCFv)，也将是该蛋白(或表位)的特异性结合剂。这些抗体片段如下：(1)Fab，通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以获得完整轻链和一条重链的一部分而产生的含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段；(2)Fab’，通过用木瓜蛋白酶处理完整抗体，然后进行还原以产生完整轻链和一部分重链而获得的抗体分子片段；从每个抗体分子获得两个Fab’片段；(3)(Fab’)2，通过用木瓜蛋白酶处理完整抗体并且不进一步还原而获得的抗体片段；(4)F(ab’)2，两个Fab’片段通过两个二硫键结合在一起的二聚体；(5)Fv，含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的遗传工程改造的片段；以及(6)单链抗体，含有通过适合的多肽连接物相连的轻链可变区和重链可变区作为遗传融合的单链分子的遗传工程改造的分子。制造这些片段的方法是常规的(参见例如Harlow和Lane，《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies：A Laboratory Manual)，CSHL，New York，1999)。
在本公开的方法和组合物中使用的抗体可以是单克隆或多克隆的。仅仅作为示例，单克隆抗体可以按照Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256：495-97，1975)或其衍生方法从鼠杂交瘤制备。用于单克隆抗体生产的详细步骤描述在Harlow和Lane，《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies：A Laboratory Manual)，CSHL，New York，1999中。
抗体结合亲和性：单个抗体结合位点与配体(例如抗原或表位)之间的结合强度。抗体结合位点X对配体Y的亲和性用解离常数(Kd)表示，其是占据溶液中存在的一半结合位点X所需的Y的浓度。较小的(Kd)表示X与Y之间较强或较高的亲和相互作用，并且占据位点需要较低的配体浓度。一般来说，抗体结合亲和性可以受到抗体互补位所识别的表位中一个或多个氨基酸的改变、修饰和/或取代的影响。
在一个实例中，通过在Ag-ELISA测定法中进行终点滴定来测量抗体结合亲和性。如果与未改变的表位相比，特定抗体对修饰/取代的表位的终点滴度相差至少4倍，例如至少10倍、至少100倍或以上，则抗体结合亲和性被抗体互补位所识别的表位中一个或多个氨基酸的修饰和/或取代显著降低(或可测量地降低)。
抗原：能够在动物中刺激抗体产生或T-细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物、包括由异源免疫原诱导的产物发生反应。
减毒：在活病毒例如狂犬病毒的情形下，如果病毒感染细胞或对象的能力和/或其产生疾病的能力被降低(例如消除)，则该病毒被减毒。典型情况下，减毒病毒保留了至少一些在给药于具有免疫能力的对象后引发免疫应答的能力。在某些情况下，减毒病毒能够引发保护性免疫应答而不引起感染的任何迹象或症状。
cDNA(互补DNA)：缺少内部非编码区段(内含子)和决定转录的调控序列的一段DNA。cDNA在实验室中通过从细胞提取的信使RNA进行反转录来合成。
表位：抗原决定簇。它们是抗原性、即引发特异性免疫应答的分子上的特定化学基团，例如连续或不连续的肽序列。抗体基于抗体的三维结构和匹配(或同族)的表位三维结构与特定抗原性表位结合。
生育力：是指动物产生后代的能力。当在本文中使用时，“抑制生育力”是指降低繁殖的速率或阻止繁殖。
固定：固定狂犬病毒是已在宿主中经历过连续传代以使病毒的毒力稳定的狂犬病毒毒株。固定狂犬病毒包括但不限于CVS、ERA、PV、SAD-B19和HEP-Flury毒株(Anilionis等，Nature 294：275-278，1981；Morimoto等，Virol.173：465-477，1989)。
融合蛋白：通过从编码两个不同(异源)蛋白的至少一部分的核酸序列工程化改造的核酸序列的表达而产生的蛋白。为了产生融合蛋白，核酸序列必须在相同的阅读框内并且不含内部终止密码子。
促性腺激素释放激素(GnRH)：负责卵泡刺激激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)从垂体前叶释放的肽类激素。GnRH由下丘脑合成和释放，并移动到垂体以介导FSH和LH的释放。GnRH前体蛋白含92个氨基酸，并在哺乳动物中被加工成十肽。GnRH也被称为GNRH1、促黄体生成激素释放激素(LHRH)、促性腺素释放素原-1和促性腺素释放素原-1前体。术语“GnRH”包括GnRH类似物和变体，包括含有取代、缺失或插入的GnRH分子。哺乳动物GnRH的核苷酸和氨基酸序列在本文中分别显示为SEQ ID NO：47和48。
异源的：当在本文中使用时，“异源核酸序列”是源自于不同来源或物种的核酸序列。在本文描述的某些实施方案中，异源核酸序列是编码ZP3的核酸序列。在其他实施方案中，异源核酸序列是编码GnRH的核酸序列。在重组狂犬病毒的情形下，异源核酸序列是不源自于狂犬病毒的任何核酸序列。
杂交：寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键键合、包括Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合进行杂交。一般来说，核酸由含氮碱基组成，所述含氮碱基是嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合被称为“碱基配对”。更具体来说，A将与T或U形成氢键，G将与C成键。“互补”是指在不同核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。
“可特异性杂交”和“特异性互补”是表明存在足够的互补性程度，使得在寡核苷酸(或其类似物)与DNA或RNA靶之间发生稳定和特异性结合的术语。寡核苷酸或寡核苷酸类似物不需要与其靶序列100％互补才可特异性杂交。当寡核苷酸或类似物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且存在足够的互补性程度以避免在特异性结合所需的条件下、例如在体内测定法或系统的情形下在生理条件下，寡核苷酸或类似物与非靶序列的非特异性结合时，寡核苷酸或类似物可特异性杂交。这样的结合被称为特异性杂交。
产生特定严紧性程度的杂交条件将根据所选的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而变。一般来说，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交的严紧性，尽管清洗时间也影响严紧性。关于获得特定严紧性程度所需的杂交条件的计算，在下列文献中讨论过：Sambrook等主编，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，第9和11章；以及Ausubel等，《分子生物学简短方法》(Short Protocols in Molecular Biology)，第四版，John Wiley&Sons，Inc.，1999。
出于本公开的目的，“严紧条件”包含只有当杂交分子与靶序列之间存在少于25％的错配时才能发生杂交的条件。“严紧条件”可以分解成更精确定义的具体严紧水平。因此，当在本文中使用时，“适度严紧”条件是具有高于25％序列错配的分子将不杂交的条件；“中度严紧”条件是具有高于15％错配的分子将不杂交的条件；“高度严紧”条件是具有高于10％错配的序列将不杂交的条件。“非常高度严紧”条件是具有高于6％错配的序列将不杂交的条件。
“特异性杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物中时(例如总细胞DNA或RNA)，分子仅仅或基本上仅仅与所述特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。特异性杂交也可以发生在不同严紧条件下。
免疫应答：免疫系统的细胞例如B-细胞、T-细胞、巨噬细胞或多型核细胞对刺激例如抗原的响应。免疫应答可以包括参与宿主防御应答的任何身体细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。当在本文中使用时，保护性免疫应答是指保护对象免于感染(防止感染或阻止与感染相关的疾病的发展)的免疫应答。
免疫：通过例如接种向对象提供针对疾病(例如传染病)的保护。
免疫避孕蛋白：是指能够在对象中引发导致对象生育力抑制或丧失的免疫应答的蛋白或蛋白片段(也称为“抗原”)。
免疫原：在适合条件下能够在动物中刺激免疫应答、例如抗体的产生或T-细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。
免疫原性组合物：该术语在本文中使用时，是指可用于在脊椎动物中刺激或引发特异性免疫应答(或免疫原性应答)的组合物。免疫原性组合物包括重组狂犬病毒，例如表达异源蛋白(例如ZP3和/或GnRH)的重组狂犬病毒。在某些实施方案中，免疫原性应答是保护性的或提供保护性免疫，因为它能使脊椎动物更好地抵抗免疫原性组合物所针对的生物体(例如狂犬病毒)引起的感染或疾病发展。当免疫原性组合物包含免疫避孕肽时，引发的免疫原性应答阻止或降低雌性动物妊娠的风险。
不希望受到具体理论的限制，据信由免疫原性组合物诱导的免疫原性应答可能源自于特异性针对免疫原性组合物中提供的一个或多个表位的抗体的产生。可选地，应答可以包含针对免疫原性组合物中提供的一个或多个表位的基于T辅助细胞或细胞毒性细胞的应答。所有这三种应答可以源自于原初细胞或记忆细胞。免疫原性组合物类型的一个具体实例是疫苗。
在某些实施方案中，免疫原性组合物的“有效量”或“免疫刺激性量”是当给药于对象时，足以产生可检测的免疫应答的量。这样的应答可以包括例如特异性针对免疫原性组合物中提供的一个或多个表位的抗体的产生。可选地，应答可以包含针对免疫原性组合物中提供的一个或多个表位的基于T辅助细胞或CTL的应答。所有这三种应答可以源自于原初细胞或记忆细胞。在其他实施方案中，免疫原性组合物的“保护性有效量”是当给药于动物时，足以为动物提供保护性免疫的量。
抑制或治疗疾病：在例如具有疾病风险的对象中抑制疾病或病症的全面发展。疾病的具体实例是狂犬病。“治疗”是指在疾病或病理状况已开始发展后改善其迹象或症状的治疗性干预。当在本文中使用时，术语“改善”对于疾病、病理状况或症状来说，是指治疗的任何可观察到的有益效应。有益效应可以表现为例如在易感对象中疾病的临床症状的延迟发作，疾病的某些或所有临床症状的严重性降低，疾病发展更慢，疾病复发的数量减少，对象的总体健康或状况的改进，或本技术领域公知的特定疾病所特有的其他参数。
分离的：“分离的”或“纯化的”生物组分(例如核酸、肽、蛋白、蛋白复合物或粒子)已经与所述组分天然存在于其中的生物体细胞中的其他生物组分，也就是说其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白基本上分离开、从中生产出来或纯化出来。因此，已被“分离”或“纯化”的核酸、肽和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。术语还包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白，以及化学合成的核酸或蛋白。术语“分离的”或“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它打算作为相对性术语。因此，例如，分离的生物组分是其中生物组分比生物组分在细胞内其天然环境中或其他生产容器中更加富集的生物组分。优选情况下，制备物被纯化，使得生物组分占制备物中生物组分总含量的至少50％，例如至少70％、至少90％、至少95％或以上。
标记物：直接或间接与另一个分子结合以便于该分子的检测的可检测化合物或组合物。标记物的具体的非限制性实例包括荧光标签、酶连接或放射活性同位素。
核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的正义和反义链和合成形式，以及上述的混合聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一种类型的核苷酸的修饰形式。本文中使用的术语“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另有指明，否则核酸分子的长度通常为至少10个碱基。术语包括DNA的单链和双链形式。多核苷酸可以包括天然存在的和通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸连键连接在一起的修饰的核苷酸中的任一种或两种。
开放阅读框(ORF)：编码氨基酸的没有任何内部终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成肽/多肽/蛋白/多蛋白。
可操作连接：当第一个核酸序列被放置成与第二个核酸序列功能上相关时，第一个核酸序列与第二个核酸序列可操作连接。例如，启动子与编码序列可操作连接，是启动子影响编码序列的转录或表达。一般来说，可操作连接的DNA序列是毗邻的，并且当需要连接两个蛋白编码区时，位于同一个阅读框中。如果存在内含子，可操作连接的DNA序列可以不毗邻。
可药用载体：可用于本公开的可药用载体是常规的。由E.W.Martin主编的《Remington药物学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)，描述了适合于一种或多种治疗性化合物或分子、蛋白或与这些蛋白结合的抗体以及其他药剂的药物递送的组合物和制剂。
一般来说，载体的性质将取决于所使用的具体给药方式。例如，肠胃外剂型通常包含可注射流体，其含有可药用和生理可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等作为介质。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)来说，常规的无毒性固体载体可以包括例如药品级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，被给药的药物组合物可以包含少量无毒性的辅助物质，例如润湿或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
质粒：能够在宿主细胞中自主复制的环状核酸分子。
多肽：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，其中对于许多生物应用来说L-异构体是优选的。本文中使用的术语“多肽”或“蛋白”打算包含任何氨基酸分子，并包括修饰的氨基酸分子。术语“多肽”具体来说打算覆盖天然存在的蛋白以及重组或合成生产的蛋白。
保守氨基酸取代是在进行取代时对原始蛋白的性质具有最小干扰的取代，即蛋白的结构以及特别是功能被保留并且不被这种取代显著改变。保守取代的实例显示如下。
Figure BPA00001330814600181
Figure BPA00001330814600191
保守取代一般维持(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。
氨基酸典型地根据其侧链分类成一个或多个类别，包括极性、疏水、酸性、碱性和芳香族。极性氨基酸的实例包括具有侧链官能团例如羟基、巯基和酰胺的氨基酸以及酸性和碱性氨基酸。极性氨基酸包括但不限于天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、硒半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。疏水或非极性氨基酸的实例包括具有非极性脂族侧链的残基，例如但不限于亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸。碱性氨基酸残基的实例包括具有碱性侧链例如氨基或胍基的残基。碱性氨基酸残基包括但不限于精氨酸、高赖氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸残基的实例包括具有酸性侧链官能团例如羧基的残基。酸性氨基酸残基包括但不限于天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括具有芳香族侧链基团的氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括但不限于二苯基丙氨酸、组氨酸、2-萘基丙氨酸、五氟苯丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。值得注意的是，某些氨基酸被分类在一个以上的组中，例如组氨酸、色氨酸和酪氨酸被分类为极性和芳香族氨基酸两类中。分类在每个上述组中的其他氨基酸对于本领域技术人员来说是公知的。
一般来说，预计产生蛋白性质的最大变化的取代将是非保守取代，例如其中(a)亲水残基例如丝氨酰基或苏氨酰基取代(或被取代成)疏水残基例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被取代成)任何其他残基；(c)具有电正性侧链的残基例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基取代(或被取代成)电负性残基例如谷氨酰基或天冬酰基；或(d)具有大体积侧链的残基例如苯丙氨酸取代(或被取代成)不具有侧链的残基例如丙氨酸的变化。
探针和引物：探针包含连有可检测标记物或其他报告分子的分离的核酸分子。典型的标记物包括放射活性同位素、酶的底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。用于标记的方法和适合于各种不同目的的标记物的选择准则，在例如下列文献中讨论：Sambrook等主编，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)第二版，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989和Ausubel等，《分子生物学简短方法》(Short Protocols in Molecular Biology)第四版，John Wiley&Sons，Inc.，1999。
引物是长度为6个核苷酸以上的、与例如连续的互补核苷酸或待扩增序列杂交的短的核酸分子，例如DNA寡核苷酸。更长的DNA寡核苷酸长度可以约为10、12、15、20、25、30或50个核苷酸或以上。引物可以通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火，在引物与靶DNA链之间形成杂合体，然后通过DNA聚合酶使引物沿着靶DNA链延伸。引物对可用于通过例如聚合酶链反应(PCR)或本技术领域已知的其他核酸扩增方法扩增核酸序列。其他扩增方法包括在美国专利No.5,744,311中公开的链置换扩增；在美国专利No.6,033,881中公开的无转录等温扩增；在WO 90/01069中公开的修复链反应扩增；在EP-A-320308中公开的连接酶链反应扩增；在5,427,930中公开的缺口填补连接酶链反应扩增；以及在美国专利No.6,025,134中公开的NASBATM RNA无转录扩增。
制备和使用核酸探针和引物的方法描述在例如下列文献中：Sambrook等主编，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)第二版，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；Ausubel等，《分子生物学简短方法》(Short Protocols in Molecular Biology)第四版，John Wiley&Sons，Inc.，1999；以及Innis等，《PCR方案，方法与应用指南》(PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1990。扩增引物对可以从已知序列推衍出来，例如通过使用用于该目的的计算机程序例如Primer(0.5版，
Figure BPA00001330814600211
1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)进行。本领域技术人员将会认识到特定探针或引物的特异性随着其长度而增加。因此，为了获得更高特异性，可以选择包含至少20、25、30、35、40、45、50个或以上靶核苷酸序列的连续核苷酸的探针和引物。
蛋白：由基因表达的、由氨基酸构成的生物分子，特别是多肽。
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它打算作为相对性术语。因此，例如，纯化的蛋白制备物是其中目标蛋白比其在细胞内天然环境中更纯的制备物。一般来说，蛋白制备物被纯化，使得蛋白占制备物总蛋白含量的至少50％。
狂犬病毒(RV)：具有负链正义极性的不分段RNA基因组的弹状病毒科的成员。狂犬病毒是狂犬病毒属(Lyssavirus genus)的原型。狂犬病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)毒株是源自于1935年在美国阿拉巴马从患狂犬病的狗首先分离到的Street-Alabama-Dufferin(SAD)毒株的毒株。在将SAD RV在小鼠脑、幼仓鼠肾(BHK)细胞和鸡胚中多次传代后，得到ERA毒株。ERA毒株的完整基因组序列公开在PCT申请号WO 2007/047459中，通过反向遗传学回收的ERA毒株的序列在本文中显示为SEQ ID NO：1。
重组的：重组核酸、蛋白或病毒是具有非天然存在的序列或具有通过将两个分开的序列区段人工组合而制造的序列的重组核酸、蛋白或病毒。这种人工组合通常通过化学合成或更通常通过分离的核酸区段的人工操作、例如通过遗传工程技术来实现。在某些实施方案中，重组狂犬病毒使用反向遗传学，例如在PCT公开号WO 2007/047459中描述的反向遗传学系统来产生。在某些实例中，重组狂犬病毒在病毒毒力因子例如糖蛋白中包含一个或多个突变。在其他实例中，重组狂犬病毒包含异源基因，例如编码免疫避孕肽(例如ZP3或GnRH)的序列。
反向遗传学：是指将突变(例如缺失、插入或点突变)引入生物体或病毒的基因组中以确定突变的表型效应的方法。例如，在特定病毒基因中引入突变能够使人们确定该基因的功能。
序列同一性：根据序列之间的相似性来表示的两个核酸序列、或两个氨基酸序列之间的相似性，也称为序列同一性。序列同一性通常根据百分同一性(或相似性或同源性)来度量；百分数越高，两个序列越相似。
序列比对用于比较的方法在本技术领域中是公知的。各种程序和比对算法描述在下列文献中：Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.，2：482，1981)；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48：443，1970)；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.，85：2444，1988)；Higgins和Sharp(Gene，73：237-44，1988)；Higgins和Sharp(CABIOS，5：151-53，1989)；Corpet等(Nuc.Acids Res.，16：10881-90，1988)；Huang等(Comp.Appls.Biosci.，8：155-65，1992)；以及Pearson等(Meth.Mol.Biol.，24：307-31，1994)。Altschul等(Nature Genet.，6：119-29，1994)提出了关于序列比对方法和同源性计算的详细考虑
比对工具ALIGN(Myers和Miller，CABIOS 4：11-17，1989)或LFASTA(Pearson和Lipman，1988)可用于执行序列比较(Internet Program1996，W.R.Pearson和弗吉尼亚大学(the University of Virginia)，“fasta20u63”2.0u63版，公布日期1996年9月)。ALIGN将整个序列进行相互比较，而LFASTA比较局部相似性区域。这些比对工具及其相应的指南可以在国际互联网上在NCSA网站获得。可选地，为了比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，可以使用设置为缺省参数(缺口存在值(gap existence cost)为11，每个残基的缺口值(per residue gap cost)为1)的缺省的BLOSUM62矩阵，利用“Blast 2sequences”功能。当对短肽(小于约30个氨基酸)进行比对时，应该使用设置为缺省参数(空缺口(open gap)为9，延伸缺口(extension gap)罚分为1)的PAM30矩阵，使用“Blast 2sequences”功能来进行。BLAST序列比较系统可以从例如NCBI网站获得；参见例如Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-10，1990；Gish和States，Nature Genet.，3：266-72，1993；Madden等，Meth.Enzymol.，266：131-41，1996；Altschul等，Nucleic acidsRes.，25：3389-402，1997；以及Zhang和Madden，Genome Res.，7：649-56，1997。
在某些情况下，蛋白的直系同源物(等同于其他物种的蛋白)的特征在于，当使用设定为缺省参数的ALIGN在整个长度上与特定蛋白的氨基酸序列进行比对时，具有大于75％的计算序列同一性。当用该方法评估时，与参比序列具有更高相似性的蛋白将显示出增加的百分同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％的序列同一性。此外，可以在所公开的融合蛋白的一个或两个结合结构域的全长上对序列同一性进行比较。
当对于明显小于全长的序列进行序列同一性比较时，同源的序列典型将在10-20的短窗口内具有至少80％序列同一性，并且取决于它们与参比序列的相似性，可以具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。在如此短的窗口内的序列同一性可以使用LFASTA确定；方法描述在NCSA网站上。本领域技术人员将会认识到，这些序列同一性范围的提供仅仅是为了指导；完全可能获得位于所提供的范围之外的非常显著的同源物。与描述蛋白类似的同源性概念同样适用于核酸。两个核酸分子密切相关的另一个可选指示是两个分子在严紧条件下彼此杂交。
然而，由于遗传密码的简并性，不显示出高度同一性的核酸序列也可能编码相似的氨基酸序列。应该理解，可以利用这种简并性制造核酸序列的变化，以产生各自编码基本上相同蛋白的多个核酸序列。
治疗有效量：足以在用特定药剂治疗的对象中实现所需效应的该药剂的量。例如，这可以是可用于在对象中引发免疫应答和/或用于阻止狂犬病毒感染的重组狂犬病毒的量。理想情况下，在本发明的上下中，重组狂犬病毒的治疗有效量是足以在对象中增加对狂犬病毒引起的感染的抗性、预防、改善和/或治疗所述感染，并且在对象中不引起显著细胞毒性效应的量。可用于在对象中增加对感染的抗性、预防、改善和/或治疗所述感染的重组狂犬病毒的有效量，将取决于例如待治疗的对象、治疗组合物给药的方式和其他因素。在某些实施方案中，本文描述的重组狂犬病毒包含编码免疫避孕蛋白的核酸序列。对于这些组合物来说，治疗有效量也可以是指抑制生育力，例如在雌性动物中阻止妊娠或降低妊娠率所需的重组狂犬病毒的量。
载体：被导入到宿主细胞中从而产生被转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制原点(参与DNA合成起始的DNA序列)。载体也可以包括一个或多个可选择标志物基因和本技术领域已知的其他遗传元件。
病毒：在活细胞内部繁殖的微小感染性生物体。病毒典型地基本上由蛋白外壳包围的单个核酸核心构成，并具有只在活细胞内部复制的能力。“病毒复制”是通过发生至少一个病毒生命周期来产生额外病毒。病毒可以破坏宿主细胞的正常功能，使细胞采用病毒所确定的方式发挥作用。例如，病毒感染可能导致细胞产生细胞因子或对细胞因子做出响应，而未感染的细胞通常将不会如此。
透明带3(ZP3)：在卵的表面上表达的用作精子受精作用的主要受体的糖蛋白。ZP3也被称为透明带糖蛋白3、透明带蛋白C(ZPC)、精子受体和透明带精子结合蛋白3。当在本文中使用时，ZP3是指来自任何动物物种、包括但不限于人、狗、猪、小鼠或大鼠的ZP3。在本文中提供了ZP3的示例性序列，包括狗ZP3(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：62)。术语“ZP3”包括ZP3类似物和变体，包括突变或截短的ZP3。
除非另有解释，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域内的普通专业人员所通常理解的相同的意义。单数术语包括其复数形式，除非上下文明确指明不是如此。同样地，单词“或”打算包含“和”，除非上下文明确指明不是如此。因此，“包含A或B”意味着包括A、或B、或A和B。还应该理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子重量或分子质量值都是近似值，并且提供它们是出于描述的目的。尽管与本文所述的相似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但在下文中描述了适合的方法和材料。在本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，在此以其全文引为参考。在有冲突的情况下，以本发明的说明书、包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不打算是限制性的。
IV.几个实施方案的概述
本文中公开了使用以前描述的反向遗传学系统，可以成功地回收包含编码免疫避孕肽的异源序列的重组狂犬病毒。在某些实例中，免疫避孕肽是GnRH或ZP3。在非人类动物中进行的研究，证实了本文描述的重组狂犬病毒引发高滴度的特异性针对狂犬病毒的中和抗体、诱导免疫避孕肽特异性抗体、保护动物抵抗狂犬病毒激惹，并且不产生不利副作用。据信，它们将在它们所给药的动物中提供避孕效应。
本文提供了重组狂犬病毒，其中重组狂犬病毒的基因组包含编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列。在某些实施方案中，免疫避孕蛋白是促性腺激素释放激素(GnRH)或透明带3(ZP3)。在某些实施方案中，重组狂犬病毒的基因组包含编码GnRH的核酸序列和编码ZP3的核酸序列。一般来说，重组狂犬病毒使用反向遗传学系统、例如在PCT公开号WO 2007/047459中公开的系统产生。但是，包含编码免疫避孕肽的异源核酸序列的任何重组狂犬病毒都可以考虑。
在某些实施方案中，重组狂犬病毒的基因组源自于狂犬病毒ERA毒株。在具体实例中，ERA毒株包含显示为SEQ ID NO：1的核苷酸序列。尽管在本文中示例了ERA毒株，但任何适合的狂犬病毒毒株都可以使用。适合的狂犬病毒毒株可以由本技术领域的专业人员选择。狂犬病毒毒株的实例包括但不限于CVS、ERA、PV、SAD-B19和HEP-Flury、SAG1、SAG2和RC-HL。
在某些实施方案中，重组狂犬病毒的基因组被工程化改造，使得狂犬病毒基因序列重新排列。在某些实例中，糖蛋白(G)基因重新定位于N和P基因之间，使得狂犬病毒基因采取下述次序：3′-N-G-P-M-L-5′(参见图5A)。这种类型的病毒，当源自于ERA毒株时，在本文中被称为ERAg3p。尽管在本文中示例了G基因的重新定位，但狂犬病毒基因的任何其他重排都可以考虑，只要能够使用反向遗传学回收到重组病毒即可。
在某些实施方案中，狂犬病毒毒株是减毒毒株。在某些实例中，重组狂犬病毒的糖蛋白在333位氨基酸位置包含Glu(SEQ ID NO：5)。其他狂犬病毒减毒突变在本技术领域中是已知的，并可以与本文提供的组合物和方法一起使用。
ZP3核酸序列可以是来自任何动物物种、例如人类、猪、大鼠、小鼠或狗的ZP3。在某些实施方案中，ZP3核酸序列是狗的ZP3核酸序列。在某些实例中，狗ZP3核酸序列是SEQ ID NO：7。在某些实施方案中，GnRH核酸序列是SEQ ID NO：47。掺入到重组狂犬病毒中的ZP3核酸序列不一定与本技术领域中已知的或本文公开的ZP3核酸序列100％同一。类似地，掺入到重组狂犬病毒中的GnRH核酸序列可以来自于任何动物物种，并且不一定与本技术领域中已知的或本文公开的GnRH核酸序列100％同一。相反，ZP3或GnRH核酸序列只需要能够在重组狂犬病毒所给药的动物中引发免疫应答。在某些实施方案中，ZP3核酸序列与SEQ ID NO：7至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一。在某些实施方案中，GnRH核酸序列与SEQ ID NO：47至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一。
在某些实施方案中，重组狂犬病毒包含ZP3或GnRH核酸序列的单个拷贝，或每个序列的单个拷贝。在其他实施方案中，重组狂犬病毒包含ZP3或GnRH核酸序列(或另一种免疫避孕肽)的多个拷贝，例如ZP3和GnRH核酸序列中的一个或两个的2、3、4、5、6、7、8或9个拷贝。当使用ZP3和/或GnRH核酸序列的多个拷贝时，可以将拷贝插入到重组狂犬病毒的基因组中，使得序列毗邻。可选地，ZP3或GnRH核酸序列的多个拷贝可以插入到狂犬病毒基因组中的不同位置处，例如在不同基因中或相同基因中的不同位点处。
在某些实施方案中，将编码免疫避孕肽的异源序列插入到狂犬病毒糖蛋白基因中或与其相邻。在具体实例中，将异源序列插入到糖蛋白的信号序列后。在其他实施方案中，将异源序列插入到糖蛋白的抗原性位点IIa处或附近(例如紧接其后)。在其他实施方案中，将异源序列插入到糖蛋白的胞外结构域与跨膜结构域之间。在具体实例中，将异源核酸序列插入到糖蛋白基因的信号序列(SEQ ID NO：49的1-57位核苷酸)之后。在某些情况下，当GnRH序列被插入到该位点处时，糖蛋白基因包含SEQ ID NO：49(单个GnRH拷贝)或SEQ ID NO：51(两个串联的GnRH拷贝)的核酸序列。在某些实例中，当GnRH序列被插入到糖蛋白基因的抗原性位点IIa处(SEQ ID NO：53的663位)时，糖蛋白基因包含SEQ ID NO：53的核酸序列。在某些实例中，当GnRH序列被插入到糖蛋白的胞外结构域与跨膜结构域的连接处(SEQID NO：63的1374位核苷酸之后)时，糖蛋白基因包含SEQ ID NO：63的核酸序列。在其他具体实例中，将ZP3核酸序列插入到狂犬病毒的P与M基因之间。在某些实施方案中，重组狂犬病毒是图3A或表3中列出的狂犬病毒。
本文中还提供了包含一种或多种本文所述的重组狂犬病毒的免疫原性组合物。还提供了包含第一种重组狂犬病毒和第二种重组狂犬病毒的免疫原性组合物，其中第一种重组狂犬病毒的基因组包含GnRH核酸序列，并且第二种重组狂犬病毒的基因组包含ZP3核酸序列。第一种重组狂犬病毒可以是包含编码本文所述GnRH核酸序列的任何重组狂犬病毒。第二种重组狂犬病毒可以是包含编码本文所述ZP3核酸序列的任何重组狂犬病毒。在某些实施方案中，免疫原性组合物还包含可药用载体。在某些实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂。
还提供了免疫非人类动物以对抗狂犬病毒感染并抑制动物生育力的方法，所述方法包含向动物给药治疗有效量的包含一种或多种本文描述的重组狂犬病毒的免疫原性组合物。组合物可以使用任何适合途径给药。在某些实施方案中，免疫原性组合物口服给药，例如通过食物诱剂。动物可以是任何对狂犬病毒感染易感并需要种群控制的动物。在某些实施方案中，动物是驯养动物。在其他实施方案中，动物是野生动物。在某些实施方案中，动物是狗、猫、大鼠、小鼠、蝙蝠、狐狸、浣熊、松鼠、负鼠、丛林狼或狼。
本文还提供了包含具有编码一种或多种免疫避孕肽的基因组的一种或多种重组狂犬病毒的组合物在制药中的应用，所述药物用于免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物的生育力。还提供了包含具有编码一种或多种免疫避孕肽的基因组的一种或多种重组狂犬病毒的组合物，在免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物的生育力的方法中的应用。
V.狂犬病毒致病性的决定因子
狂犬病毒(RV)是弹状病毒——具有负链正义极性的不分段RNA病毒。在弹状病毒科中，狂犬病毒是狂犬病毒属的原型。RV由两种组要结构组分构成，核衣壳或核糖核蛋白(RNP)与围绕RNP核心的双层膜形式的包膜。所有弹状病毒的感染性组分都是RNP核心，其由被核蛋白(N)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)和磷蛋白(P)的组合所包裹的负链RNA基因组构成。RNP周围的膜包含位于膜的内部的两种蛋白——跨膜糖蛋白(G)和基质(M)蛋白。因此，病毒基因组编码这5种蛋白：三种RNP中的蛋白(N、L和P)，基质蛋白(M)和糖蛋白(G)。
各种狂犬病毒毒株的致病性的分子决定因子还没有完全阐明。RV致病性属于多基因事件(Yamada等，Microbiol.Immunol.50：25-32，2006)。例如，RV基因组中的一些位置如果发生突变，将影响病毒的转录或复制，降低毒力。在N基因中磷酸化位点的389位丝氨酸残基(Wu等，J.Virol.76：4153-4161，2002)或L基因中高度保守的C基序的GDN核心序列(Schnell和Conzelmann，Virol.214：522-530，1995)的突变，显著降低RV转录和复制。
G蛋白、也称为刺突(spike)蛋白，参与RV的细胞附着和膜融合。G蛋白的330到340位氨基酸区域(被称为抗原性位点III)已被鉴定为对某些RV毒株的毒力是重要的。几项研究支持下述概念，即固定RV毒株的致病性由糖蛋白的333位氨基酸残基处精氨酸或赖氨酸的存在所决定(Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：70-74，1983；Tuffereau等，Virol.172：206-212，1989)。
这种现象似乎至少适用于固定狂犬病毒，例如CVS、ERA、PV、SAD-B19和HEP-Flury毒株(Anilionis等，Nature 294：275-278，1981；Morimoto等，Virol.173：465-477，1989)。例如，在糖蛋白的333位处具有与Arg不同的氨基酸的狂犬病疫苗病毒，描述在下列文献中：WO00/32755(描述了其中G蛋白Arg333密码子中的所有三个核苷酸与亲代病毒相比发生改变，使得333位的Arg被取代成另一种氨基酸的RV突变体)；欧洲专利350398(描述了源自于RV的Bern SAD毒株的无致病力RV突变体SAG1，其中糖蛋白333位的Arg已被取代成Ser)；以及欧洲专利申请583998(描述了减毒的RV突变体SAG2，其中G蛋白中333位的Arg已被Glu取代)。
其他毒株例如RC-HL毒株，在G的333位处具有精氨酸残基，但是在成年小鼠中不引起致命感染(Ito等，Microl.Immunol.38：479-482，1994；Ito等，J.Virol.75：9121-9128，2001)。因此，整个G可能对RV的毒力有贡献，尽管决定因子或区域目前还没有被鉴定。
G基因编码唯一诱导病毒中和抗体的蛋白。已知RV糖蛋白的至少三种状态：负责受体结合的天然状态(N)，膜融合过程的起始步骤中需要的活性疏水状态(A)(Gaudin，J.Cell Biol.150：601-612，2000)，以及融合无活性构象(I)。G蛋白的正确折叠和成熟对于免疫识别来说发挥重要作用。ERA G细胞外结构域中三个可能的糖基化位置出现在Asn37、Asn247和Asn319残基处(Wojczyk等，Glycobiology.8：121-130，1998)。G的非糖基化不仅影响构象，而且抑制蛋白在细胞表面的呈递。
以前已经证实(参见PCT公开号WO 2007/047459)，G的表达增强了抗RV免疫应答。此外，在RV ERA糖蛋白的333位氨基酸位置引入Arg向Glu的突变，产生了减毒病毒(被称为ERAg3)。该减毒病毒能够在动物中引发显著滴度的中和抗体，并提供针对野生型病毒激惹的保护作用。此外，正如在PCT公开号WO 2007/047459中所描述的，包含具有G333突变的糖蛋白的两个拷贝的重组RV，由于其引发高滴度中和抗体而不发病或致死的能力，作为疫苗特别有用。在本文的某些实例中，在糖蛋白中包含G333突变的重组狂犬病毒，被用于工程化含有ZP3和/或GnRH的免疫避孕组合物。但是，本领域技术人员将会认识到，使用PCT公开号WO 2007/047459中公开的以及下文概述的反向遗传学系统，许多重组狂犬病毒中的任一种可用于掺入异源序列。
VI.狂犬病毒反向遗传学系统
RNA不能通过分子生物学方法容易地直接操作。传统的RNA病毒疫苗来自于天然减毒的分离株，其难以控制并提供不可预测的结果。反向遗传学技术能够将RNA病毒作为DNA操作，其可以按照周密计划的设计进行突变、缺失或重新构建。可以仔细地、独立地和协调地研究每个基因的功能，这有利于疫苗开发。反向遗传学包括将RNA病毒基因组反转录成cDNA，并将其克隆在载体例如质粒中。在转染宿主细胞后，载体被转录成RNA，其被也可以由质粒提供的病毒结构蛋白包裹。被包裹的RNA形成核糖核蛋白复合体，其产生可以被回收的病毒粒子。
基于狂犬病毒ERA毒株的有效反向遗传学系统描述在PCT公开号WO 2007/047459中。该狂犬病反向遗传学系统可用于各种目的，包括以确定方式减毒ERA病毒以用于疫苗开发，和产生ERA病毒载体用于表达例如用于免疫避孕的蛋白包括ZP3和GnRH的异源蛋白。
PCT公开号WO 2007/047459中公开的反向遗传学系统是基于全长转录质粒加上大量辅助质粒(例如五种辅助质粒)。辅助质粒编码N、P、L蛋白和任选的G蛋白，以及T7聚合酶。尽管G蛋白对于病毒拯救来说不是必需的，但是当包含在转染中时它提高了病毒回收效率或病毒出芽。
转录包含哺乳动物细胞中可用的细胞RNA依赖性RNA聚合酶II，以及由pNLST7质粒提供的T7RNA聚合酶两者。双重聚合酶导致高且稳定的病毒回收效率。
在转录质粒中，锤头和丁型肝炎病毒核酶位于狂犬病毒(例如ERA毒株)反基因组cDNA的两侧，使得能够通过转录产生反基因组病毒RNA的真实5’和3’末端。锤头序列的前10个核苷酸被设计成与反义基因组序列的前10个核苷酸互补。
两种修饰的T7RNA聚合酶构建物支持比以前使用的野生型T7RNA聚合酶更有效的病毒回收。一个T7RNA聚合酶从第一个ATG突变成AT。第二个T7RNA聚合酶在来自亲代T7的第一个ATG之后融合有来自于SV40病毒大T抗原的8个氨基酸的核定位信号(NLS)。添加NLS导致T7RNA聚合酶主要出现在核中。在NLS修饰的质粒的转染机制后，DNA/转染反应物复合物结合到细胞表面。通过胞吞作用，复合物被摄入到内体/溶酶体中，并且将DNA释放到胞质溶胶中。在不存在NLS的情况下，大部分被转染的质粒保留在胞质溶胶中，并且只有少部分释放出的DNA达到核，在那里转录成DNA。在蛋白合成后，NLST7RNA聚合酶被运输回到细胞核，并且核中的辅助质粒(具有T7/CMV启动子)将被NLST7和细胞的聚合酶II两者转录。因此，合成了更多的辅助质粒的mRNA和全长pTMF的cRNA或其衍生物，导致高效的病毒回收。
在NLST7被CMV启动子的最初表达后，NLST7聚合酶结合到pT7以转录NLST7基因。尽管转录本在核中修饰，但合成了更多的NLST7mRNA，导致了NLST7聚合酶的更多表达。NLST7聚合酶的pT7以及全长反基因组转录单位在NLST7聚合酶的控制之下，所述NLST7聚合酶起到“自体基因”的作用。在T7RNA聚合酶在核中表达后，被转染的T7构建物继续转录全长RNA模板，用于N蛋白包裹和/或L蛋白结合，增加了病毒回收效率。
除了编码N蛋白的质粒pTN之外，T7聚合酶和所有其他质粒位于CMV和T7转录调控元件两者的控制之下。编码核酸的N蛋白置于T7启动子的控制之下，并且基于IRES(内部核糖体结合位点)以不依赖于cap的方式翻译。如果将所有质粒克隆在CMV启动子控制之下，单独的细胞RNA聚合酶II可以帮助RV的回收。在PCT公开号WO2007/047459中所公开的ERA反向遗传学系统中，只有pTN在T7启动子的控制之下并以不依赖于cap的方式翻译。所有其他构建物都在CMV和T7转录调控元件两者的控制之下。典型情况下，在RV中，N的合成是丰富的，并且N、P和L之间的比例约为50∶25∶1。为了在RV反向遗传学中模拟野生型病毒转录和装配，N的表达应该是最高的。在NLST7聚合酶和IRES翻译方式的辅助下，在质粒转染后N蛋白被有效表达。因为在哺乳动物细胞中不存在T7转录起始信号，这降低了与宿主细胞中的管家基因对转录的竞争，并导致T7转录效率的增加。
此外，如PCT公开号WO 2007/047459中所述，为了增加病毒蛋白的生产，可以构建辅助质粒以包含对于每种蛋白编码序列的翻译效率优化过的Kozak序列。在ERA反向遗传学系统中转染后5天后，不用进一步扩增，被拯救的病毒可靠地、可重复地生长到107FFU/ml。
可以使用例如在PCT公开号WO 2007/047459中公开的反向遗传学系统，设计出具有用于疫苗接种的有利性质的重组狂犬病毒。具有突变糖蛋白的修饰毒株特别适合用作免疫原性组合物。这种RV反向遗传学系统还能使狂犬病毒载体系统用于外源(异源)基因表达。已证实，额外的转录单位在掺入到ERA RV基因组中之后，在两个不同位置中是有功能的。因此，RV反向遗传学系统提供了导入用于免疫避孕的异源蛋白的手段。在某些实例中，异源蛋白是ZP3、GnRH或两者。
VII.免疫避孕
本文提供了在其基因组中包含编码一种或多种免疫避孕蛋白的异源核酸序列的重组狂犬病毒。免疫避孕蛋白是指能够在对象中引发免疫应答、导致抗原所给药的对象中生育力的抑制或丧失的任何蛋白或蛋白片段(也称为“抗原”)。考虑到了将本文描述的重组狂犬病毒用于非人类动物的接种。
免疫避孕涉及针对精子、卵或生殖激素的接种，以阻止受精或配子的产生(Cooper和Larsen，Reproduction 132：821-828，2006)。以前测试到的用于免疫避孕的免疫原包括精子抗原、完整精子、乳酸脱氢酶(LDH-C4；一种精子特异性蛋白)、受精抗原-1(FA-1；一种精子特异性蛋白)、精子蛋白56(sp56)、细粒蛋白(睾丸/附睾蛋白)、卵母细胞抗原(例如透明带)、促性腺激素核黄素载体蛋白、催乳激素、多育曲菌素、促性腺激素和促性腺激素释放激素(Delves等，TrendsImmunol.23：213-219，2002；O’Hern等，Vaccine 15(16)：1761-1766，1997；Zhu和Naz，Proc.Natl.Acad.Sci.94(9)：4704-4709，1997；Hardy和Mobbs，Mol.Reprod.Dev.52(2)：216-224，1999；Hardy等，Reproduction Supplement 60：19-30，2002；O’Rand等，Science 306：1189-1190，2004；Cooper和Larsen，Reproduction 132：821-828，2006)。
大量的免疫避孕研究聚焦于使用透明带(ZP)或GnRH。但是在每种情况下，伴随ZP或GnRH蛋白必需给药佐剂以便引发足够抑制被治疗动物的生育力的免疫应答。本文中公开了包含ZP和/或GnRH的重组狂犬病毒可以用作免疫避孕组合物。狂犬病毒粒子的超抗原样特点允许在不存在佐剂的情况下使用包含免疫避孕蛋白的重组狂犬病毒。
促性腺激素释放激素(GnRH)
长期以来，已认识到GnRH(也称为促黄体激素释放激素或LHRH)在动物生育力的调控中发挥中心作用。GnRH的完全加工形式是十肽，其在所有哺乳动物中具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)。在其他非哺乳动物包括禽类中也已鉴定到密切相关的GnRH化合物，并且在爬行类和两栖类中鉴定到了GnRH的受体。在雄性和雌性中，GnRH从下丘脑释放到血流中并通过血液移动到垂体，它在那里诱导促性腺激素促黄体生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的释放。这两种促性腺激素反过来作用于性腺，诱导甾类生成和配子发生。在生长的雄性动物中，促性腺激素促进睾丸发育和睾丸甾类的合成。在生长的雌性动物中，刺激卵巢发育和其中的卵泡发育、卵巢甾类的合成和排卵。从性腺释放到循环中的甾类也作用于各种其他组织(美国专利公开号No.2006/0013821)。
已经描述了各种GnRH免疫原性类似物，并且它们适合与本文提供的组合物和方法一起使用。GnRH的免疫原性类似物包括在GnRH氨基酸序列中含有1至5个氨基酸残基的取代、缺失或插入的化合物，及其二聚体或多聚体，所述化合物保留了在动物中诱导或刺激特异性针对GnRH的抗体的产生。取代和插入可以使用天然或非天然氨基酸来实现，并且取代优选是使用维持与原始氨基酸基本上相同的电荷和疏水性的氨基酸进行的保守取代。GnRH的免疫原性类似物包括在例如美国专利No.5,484,592、6,284,733、4,608,251、5,759,551和5,403,586以及PCT公开号WO 88/05308中所描述的。
透明带(ZP)
ZP是在受精过程中调节精子-卵相互作用的围绕哺乳动物卵的非细胞糖蛋白包衣。ZP的结构使其成为作为避孕靶的理想候选物，因为改变其结构能够阻止妊娠(美国专利公开号No.2004/0202674)。
ZP免疫已经有效地降低许多哺乳动物的受精率(Willis等，J.Equine Vet.Sci.14：364-370，1994；Kirkpatrick等，J.Reprod.Immunol.35：43-51，1996；Brown等，J.Reprod.Immunol.35：43-51，1997；Brown等，J.Reprod.Immunol.35：53-64，1997；美国专利No.6,027,727)。两个独立的报告指出，猪透明带(pZP)在家养猫中是有效的免疫避孕剂，但是需要多剂加强剂(Ivanova等，Theriogenology 43：969-981，1995；Bradley等，J.Biochem.73：91-101，1999)。
猪透明带也已用于基于脂质体的降低某些哺乳动物的生育力的免疫避孕疫苗中，多年效率为90-100％(PCT公开号WO 93/25231)。但是，在这种基于脂质体的疫苗中使用pZP作为单一给药疫苗，在猫中是无效的(Gorman等，Theriogenology 58：135-149，2002)。
来自各种不同物种的ZP3序列在本技术领域中是公知的，包括狗ZP3(Genbank登记号NM 001003224，2004年8月5日保存)；猪ZP3(Genbank登记号D45065，1995年1月24日保存；Genbank登记号NM 213893，2004年5月20日保存)；小鼠ZP3(Genbank登记号BC103585，2005年8月22日保存；Genbank登记号BC099465，2005年7月21日保存；Genbank登记号BC103584，2005年8月22日保存)；大鼠ZP3(Genbank登记号BC127488，2006年12月22日保存)；以及人类ZP3(Genbank登记号BC113949，2006年2月25日保存；Genbank登记号X56777，1993年6月16日保存；Genbank登记号M60504，1993年8月4日保存；Genbank登记号A18567，1994年7月21日保存)。每个上面列出的Genbank登记号在此引为参考。在本文的具体实例中，ZP3序列是狗ZP3序列(SEQ ID NO：7)。但是，能够在疫苗接种的动物中引发免疫应答的任何ZP3序列能够与本文提供的组合物和方法一起使用。
VIII.狂犬病毒免疫避孕组合物的给药和使用
本文提供的的重组狂犬病毒包含至少一个编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列。因此，包含这种重组狂犬病毒的免疫避孕组合物具有双重功能：(i)保护接种疫苗的动物抵抗狂犬病毒感染，以及(ii)通过抑制动物的生育力控制动物种群。因此，考虑到了将本文提供的免疫避孕组合物用于非人类动物。在某些情况下，重组狂犬病毒给药于驯养动物。在其他情况下，重组狂犬病毒给药于野生动物。可以使用狂犬病毒免疫避孕组合物的非人类动物可以包括但不限于狗、猫、大鼠、小鼠、蝙蝠、狐狸、浣熊、松鼠、负鼠、丛林狼或狼。特别是对于野生动物来说，优选口服、例如通过食物诱剂给药免疫原性组合物。
免疫原性制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并使用常规制药技术制备。这样的技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂进行复合。一般来说，通过将活性成分与液体载体均匀紧密地进行结合来制备制剂。适合于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以包含可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与目标受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可以包含悬浮剂和增稠剂。制剂可以以单剂或多剂容器、例如密封安瓿或小玻璃瓶的形式存在，并可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需在即将使用前添加无菌液体载体例如注射用水。临时制备的注射溶液和悬液可以从本领域技术人员通常使用的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。
在某些实施方案中，单位剂量制剂是包含所给药成分的一剂或单位或其适合级份的制剂。应该理解，除了上面具体提到的成分之外，本文包含的制剂还可以包含其他本领域技术人员常用的药剂。
本文提供的组合物，包括可用作免疫原性组合物的组合物，可以通过不同途径给药，例如口服包括颊和舌下、直肠、肠胃外、气溶胶、鼻、肌肉内、皮下、真皮内和表面。它们可以不同形式给药，包括但不限于溶液、乳液和悬液、微球、粒子、微粒、纳粒和脂质体。在优选实施方案中，免疫原性组合物口服给药。在某些实例中，口服给药包括在食物诱剂中给药组合物。
给药体积将随着给药途径而变。本领域技术人员将会了解不同给药途径的适合体积。
给药可以通过单剂或多剂药剂来实现。在本发明的情形中，给药于动物的药剂应该足以随时间诱导有益的治疗性响应，例如防止RV感染和阻止繁殖。所需剂量将随着例如动物的物种而变。
每剂药剂中免疫原性组合物的量被选为诱导免疫刺激性或免疫保护性应答而没有明显不利副作用的量。这样的量将随着使用的具体组合物及其给药方式而变。初始剂量可以在约1μg至约1mg的范围内，其中某些实施方案在约10μg至约800μg的范围内，并且其他实施方案在约25μg至约500μg的范围内。在初次给药免疫原性组合物后，对象可以接受一次或多次相隔足够时间的加强剂给药。加强剂给药可以在约1μg至约1mg的范围内，其他实施方案具有约10μg至约750μg的范围，其他具有约50μg至约500μg的范围。为了维持所需水平的保护性免疫，可能需要以1-5年、例如3年的时间间隔进行周期性加强。在优选实施方案中，动物接受单剂免疫原性组合物。
含有免疫原性组合物的食物诱剂的制备也在本技术领域的普通技术范围内。例如，含有活RV疫苗的食物诱剂的制备公开在下述文献中：Wandeler等(Rev.Infect.Dis.10(suppl.4)：649-653，1988)，Aubert等，(pp.219-243，在Lyssaviruses(Rupprecht等主编)中，Springer-Verlag，New York，1994)，以及Fu等(pp.607-617，在《新一代疫苗》(New Generation Vaccines)第二版中)，(Levine等主编)，Marcel Dekker，Inc.，New York，1997)。
本文提供了药物组合物(也称为免疫原性或免疫刺激性组合物)，其包含单独的或与可药用载体组合的治疗有效量的重组RV。在某些实施方案中，重组RV包含异源蛋白，例如ZP3和/或GnRH。
可药用载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。载体和组合物可以是无菌的，并且制剂适合于给药方式。组合物也可以含有少量润湿或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放剂型或粉剂。组合物可以使用传统粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。口服剂型可以包括标准载体例如药品级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。可以使用任何常用药物载体例如无菌盐水溶液或芝麻油。介质也可以包含常规的药用辅助物质例如调整渗透压的可药用盐、缓冲剂、防腐剂等。其他可用于本文提供的组合物和方法的介质包括生理盐水和芝麻油。
本文描述的RV可以单独或与其他增强抗原性的治疗剂组合使用。例如，重组病毒可以与佐剂、例如Freund不完全佐剂或Freund完全佐剂一同给药。
任选地，一种或多种细胞因子例如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ，一种或多种生长因子例如GM-CSF或G-CSF，一种或多种分子例如OX-40L或41BBL，或这些分子的组合，可以用作生物佐剂(参见例如Salgaller等，1998，J.Surg.Oncol.68(2)：122-38；Lotze等，2000，Cancer J.Sci.Am.6(Suppl 1)：S61-6；Cao等，1998，StemCells 16(Suppl 1)：251-60；Kuiper等，2000，Adv.Exp.Med.Biol.465：381-90)。这些分子可以系统(或局部)给药于宿主。
已知多种用于在体外和体内诱导细胞应答的手段。脂类已被鉴定为能够在辅助引发体内针对各种抗原的CTL的药剂。例如，正如美国专利No.5,662,907中所述，棕榈酸残基可以连接到赖氨酸残基的α和ε氨基上，然后连接(例如通过一个或多个连接残基例如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)到免疫原性肽上。然后可以将脂化的肽以胶束形式直接注射、掺入到脂质体中或乳化在佐剂中。作为另一个实例，大肠杆菌脂蛋白例如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酰基-丝氨酸，当与适合的肽共价连接时，能够用于引发肿瘤特异性CTL(参见Deres等，Nature 342：561，1989)。此外，因为中和抗体的诱导也可以使用与显示出适合表位的肽偶联的同样分子来引发，因此在认为需要时，可以将两种组合物组合以同时引发体液和细胞介导的应答。
提供了下列实施例用于说明某些具体的特点和/或实施方案。这些实施例不应该被解释为将本公开限制于所描述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：使用狗ZP3的基于狂犬病毒ERA的免疫避孕研究
本实施例描述了包含重组狂犬病毒ERA毒株和狗透明带3(ZP3)的免疫避孕组合物的开发。基于猪透明带(pZP)糖蛋白的免疫避孕研究已在不同动物、包括狗中进行了尝试。据报道，pZP复合物在多种物种中作为免疫避孕剂有效。但是，由于pZP复合物是完整猪卵巢的混合物，副作用并不罕见。因此，将犬类ZP3糖蛋白在大肠杆菌中表达，并克隆狗ZP3基因作为DNA疫苗候选物。基本原理是开发能够同时控制狂犬病毒和狗种群的基于狂犬病毒ERA的免疫避孕疫苗。已证实，狂犬病毒ERA是用于表达异源基因的理想载体。此外已证明修饰的ERA病毒在各种动物物种中作为口服疫苗候选物有效(参见PCT公开号WO 2007/047459)。
全长狗ZP3通过化学法合成并通过聚合酶链反应(PCR)组装。狗ZP3长度为1278个碱基对，编码426个氨基酸的蛋白。合成的基因在本文中显示为SEQ ID NO：7；氨基酸序列显示为SEQ ID NO：8。为了合成狗ZP3基因，将全长狗ZP3基因分成两个片段进行合成，它们被称为A和B片段。A片段(619个碱基对)从ATG起始密码子开始到单一NdeI识别位点结束，使用18种寡核苷酸组装(表1)。B片段(670个碱基对)从单一NdeI识别位点开始并继续到终止密码子(TAA)，由20个寡核苷酸组装(表1)。用于设计寡核苷酸的方法是基于使用DNAWorks程序的“内侧向外基因合成(inside-out gene synthesis)”(Hoover和Lubkowski，Nucleic Acids Res.30(10)：e43，2002)。
在A和B片段成功合成后，将它们仔细地测序以校正在PCR反应过程中引入的任何可能突变。一个从C到T的沉默突变(其不改变氨基酸序列)被故意保留以将合成的基因与模板基因(Genbank登记号NM 001003224，2004年8月5日保存，SEQ ID No：62)区分开。用于合成A和B片段的寡核苷酸显示在表1中。
表1、用于合成狗ZP3的寡核苷酸
Figure BPA00001330814600411
Figure BPA00001330814600421
在合成狗ZP3基因后，将其克隆在pTMF构建物中(ERA全长基因组cDNA构建物，参见PCT公开号WO 2007/047459)P-M基因间区域中用于病毒回收。通过已建立的用于疫苗研究的反向遗传学系统(PCT公开号WO 2007/047459)，回收了四种重组ERA-狗ZP3病毒(ERAZP3、ERAg3ZP3、ERA2g3ZP3和ERAZP3T；参见图1)。ERAZP3含有ZP3序列和野生型ERA G蛋白编码序列。ERAg3ZP3和ERA2g3含有ZP3序列和一个或两个拷贝(分别)的G333突变糖蛋白编码序列。ERAZP3T含有截短的ZP3和野生型ERA G蛋白编码序列。截短的ZP3包含ZP3的79到1044位核苷酸的缺失(SEQ ID NO：7)。
四种重组ERA-狗ZP3病毒毒株在幼仓鼠肾(BHK)细胞和BSR细胞(BHK-21细胞的一个克隆)两者中生长与野生型ERA病毒类似，例外的是ERA2g3ZP3，其在前三轮感染中相对于野生型ERA病毒生长较慢。被感染小鼠进行的初步中和试验显示，ERAZP3T产生高达714的中和抗体(NA)滴度。
为了在原核和真核系统两者中表达狗ZP3基因以用于免疫研究，将狗ZP3克隆在pEF载体(用于哺乳动物细胞表达；Invitrogen)和pET28载体(用于原核表达；Novagen)中。间接荧光测定(IFA)的初步数据显示，狗ZP3在BSR细胞中表达良好，正如通过His-tag单克隆抗体染色所证实的。
使用基于狂犬病毒ERA的狗ZP3重组病毒的体外和体内结果概述如下。ERAZP3病毒在生物反应器中生长到109病灶形成单位(FFU)/ml，并与亲本ERA同样好地复制。在纯化的ERAZP3病毒粒子中，狗ZP3表达成非结构蛋白。ERAZP3狂犬病毒在BSR细胞中生长到109FFU/ml，通过梯度超离心进行纯化。通过SDS-PAGE对纯化的重组病毒进行分析。清楚显示了5条病毒结构蛋白条带。在重组ERAZP3狂犬病毒中，ZP3蛋白表达成非结构蛋白。为了在ERAZP3病毒免疫的小鼠中检测ZP3抗体，进行了使用pcDNA/ZP3表达蛋白的Western印迹。将BSR细胞用pcDNA/ZP3质粒转染。48小时后，收获转染的BSR细胞并将其裂解。通过SDS-PAGE，然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，对上清液进行分析。分析使用了标准的Western印迹方案。检测到了具有对应于ZP3大小的50kD分子量的特定蛋白。
在小鼠模型中，当肌肉内或口服给药时，ERAZP3诱导了针对狂犬病毒的强烈免疫应答。被免疫的小鼠获得对抗病毒激惹的保护，而对照死亡。通过间接荧光染色检测狗ZP3抗体。对约60只小鼠肌肉内注射50μl重组病毒(每只小鼠5×106FFU)。以7、14和28天的时间间隔对小鼠进行加强。评估了狂犬病毒抗体应答。狂犬病毒中和抗体非常高，达到超过5IU。将小鼠安乐死，并收集血清用于针对ZP3蛋白的IFA和Western印迹。在两种测试中观察到了阳性结果。
在仓鼠模型中，肌肉内给药的ERAZP3诱导了针对狂犬病毒的强烈免疫应答。被免疫的仓鼠在激惹时受到保护。通过IFA检测了狗ZP3抗体。在小鼠或仓鼠模型中没有观察到不利效应。
实施例2：使用GnRH的基于狂犬病毒ERA的免疫避孕初步研究
本实施例描述了含有插入到相对于狂犬病毒糖蛋白(G)不同位置处的促性腺激素释放激素(GnRH)序列的重组狂犬病毒的开发和测试。
已证明，GnRH作为免疫避孕肽对狗有效。但是，以前必需将GnRH与载体蛋白(或佐剂)相连才具有免疫原性。满足大量疫苗接种和质量控制的产品的规模放大，使得合成化学方法不能接受用于商业化应用。
通过体外肽分析，用于GnRH整合到糖蛋白中的适合位置可用于重组疫苗研究。由于狂犬病毒粒子的超抗原样性质，佐剂是不需要的。因为狂犬病毒在细胞培养中高效生长，生产的规模放大没有限制。因此，工程化改造以包含GnRH的狂犬病毒，是用于同时控制狂犬病和狗种群的理想候选物。
在体外测试到GnRH肽针对兔抗GnRH血清具有免疫原性。选择了狂犬病毒糖蛋白中的多个位置用于插入GnRH序列(SEQ ID NO：47)(参见图2)。对于病毒回收来说，N末端、抗原性位点IIa和胞外结构域与胞质结构域之间的连接处，被鉴定为理想的插入位点。所有重组病毒通过已建立的反向遗传学系统(PCT公开号WO 2007/047459)回收。根据GnRH插入位点，拯救的病毒被命名为ERA-N-GnRH、ERA-IIa-GnRH和ERA-C-GnRH。这三种病毒与亲代野生型ERA同样好地复制，除了ERA-IIa-GnRH病毒之外，在细胞培养物中达到109FFU/ml的滴度。在病毒传代后，插入的GnRH在糖蛋白基因中稳定。在狗中进行的使用肌肉内给药的初步实验证实了针对狂犬病的足够的免疫应答，没有可检测到的不利效应。
为了增加GnRH肽的免疫原性，将串联排列的两个GnRH基因拷贝克隆到N(ERA-N-2GnRH)和IIa(ERA-GnRH-p3)位点中。在ERA-N-GnRH病毒中，GnRH序列(SEQ ID NO：47)被插入到紧接狂犬病毒糖蛋白的19个氨基酸的信号序列之后。ERA-N-GnRH的核苷酸和氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO：49和50。为了产生ERA-N-2GnRH，将串联的两个GnRH拷贝插入到紧接狂犬病毒糖蛋白的19个氨基酸的信号序列之后(SEQ ID NO：51和52)。为了产生ERA-GnRH-p3，将GnRH序列插入到狂犬病毒糖蛋白中221位氨基酸残基(IIa抗原性位点)之后(SEQ ID NO：53和54)。通过反向遗传学成功回收了所有三种病毒，并且通过Northern印迹证明GnRH基因在所有构建物中稳定表达。此外，除了ERA-GnRH-p3生长较慢之外，所有构建物生长与亲代狂犬病毒同样好。在肌肉内注射后，在狗中测试了ERA-N-GnRH病毒，没有不利效应。这些结果证明，紧接狂犬病毒糖蛋白中信号序列之后的N-末端，是用于插入GnRH的理想位置。
为了确定包含GnRH的重组狂犬病毒是否能够引发针对狂犬病毒感染的保护性免疫，进行了野生型狂犬病毒激惹研究。对小鼠肌肉内注射5x105FFU的ERA-N-GnRH、ERA-3-GnRH(N-G3-GnRH-P-M-L)或ERA-G3-2GnRH(N-G3/2GnRH-P-M-L)，然后用致死剂量的狂犬病毒激惹(图3)。所有接种疫苗的动物在狂犬病毒激惹中存活。相反，没有对照小鼠(未接种疫苗的原初小鼠)在狂犬病毒激惹中存活。这些结果证实，基于重组狂犬病毒的免疫避孕疫苗能够在动物中有效引发保护性狂犬病毒免疫应答。
实施例3：用于狂犬病毒和免疫避孕的组合疫苗
本实施例描述了编码GnRH的重组ERA狂犬病毒的构建和表征。
材料与方法
GnRH肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)的的合成和偶联
化学合成了GnRH十肽(肽1780，GnRH；SEQ ID NO：55)和串联的两个GnRH拷贝(肽1781，2GnRH；SEQ ID NO：56)，并通过高效液相色谱(HPLC)进行纯化。在验证后，将肽1780和1781与KLH偶联。KLH从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)购买，并通过SDS-PAGE分析偶联效率。蛋白标志物SeeBlueTM和标志物12从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买。Precision Plus蛋白梯从Bio-Rad(Hercules，CA)获得。将蛋白在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离。
G基因在RV ERA基因组中P基因的前方重新定位以及重新排列病毒的致病性
具有重新定位在P基因前方的G基因的重排RV ERA基因组，与以前描述的反向遗传学方法相似地进行构建(Wu和Rupprecht，Virus Res.131：95-99，2008；Wu等，Virus Res.129：91-103，2007)。通过突变(Wu等，J Virol.76：4153-61，2002)，将RV G的333位氨基酸残基(SEQ ID NO：5)从精氨酸(AGA)改变成谷氨酸(GAG)。工程化的病毒被命名为ERAg3p。在细胞培养物中测定了突变的病毒的生长特性。BSR细胞(BHK细胞系的一个克隆)生长在增补有10％胎牛血清(Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA)的Dulbecco最低基本培养基中。将RV ERAg3p感染的BSR细胞在34℃下在5％CO2培养箱中温育。CELLineTM1000生物反应器来自于INTEGRA Bioscience AG(瑞士)。通过反转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)验证了在BSR细胞中超过100次连续感染传代中指定位置处的突变和重排的RV基因组的稳定性。将RV ERA或ERAg3p脑内(i.c)注射到10只三周龄ICR雌性小鼠(Charles River Laboratory)中。用作未感染对照的10只相同种类和年龄的健康小鼠以同样方式注射PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)。将RV ERAg3p的毒力与亲代ERA物种的毒力进行平行比较。每天检查动物并记录疾病的征兆。患病动物通过CO2中毒、然后通过颈椎脱位进行安乐死。取出小鼠脑用于RV诊断。
将GnRH的编码序列插入到RV ERAg3p病毒G基因的不同位置中
将GnRH(或2GnRH)的编码序列插入到RV ERAg3p中G基因的6个不同位置中。在RV ERAg3p中具有确定突变的G基因被称为G*。用于将GnRH或2GnRH插入到G*中的引物序列显示在表2中。突变按照以前的描述进行(Wu和Rupprecht，Virus Res.131：95-99，2008)。最终的12个G*基因构建物使用ABI 3730DNA分析仪通过测序进行验证。
表2、用于将GnRH或2GnRH插入到G*中的引物
Figure BPA00001330814600481
带有GnRH的ERAg3p病毒的回收和性质研究
带有与G*基因框内融合的GnRH(或2GnRH)的12个构建物，用于按照以前报道的方案进行病毒回收(Wu和Rupprecht，Virus Res.131：95-99，2008；Wu等，Virus Res.129：91-103，2007)。如果病毒在第一轮转染中没有被拯救，重复另外两次试验。直接荧光测定(DFA)的阴性结果被解释为表明GnRH插入到G基因中的位点不是最适。使用生物反应器温育将拯救的病毒进一步在BSR细胞中生长至高滴度，用于表征。
GnRH在RV ERAg3p病毒中的表达
使用TRIZOLTM反应试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从带有GnRH的ERAg3p病毒感染的BSR细胞提取总RNA。按照标准方法合成地高辛(Dig)标记的反义寡核苷酸GnRH探针。Dig核酸检测试剂盒从Roche(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Penzberg，德国)购买。用于Northern印迹分析的方案以前已描述过(Wu和Rupprecht，Virus Res.131：95-99，2008；Wu等，Virus Res.129：91-103，2007；Wu等，J Virol.76：4153-61，2002)。RNA分子量标志物1从Roche(Roche，Indianapolis，IN)获得。用于从被感染细胞培养物纯化RV的步骤根据以前的描述进行修改(Thomas等，Virology 25：271-275，1965；Sokol等，J Virol.2：836-849，1968)。简单来说，对约200ml来自细胞培养物的病毒上清液进行过滤(0.22μm孔径)以除去可能的细胞碎片。病毒粒子通过以22,500xg超离心1小时(Beckman，SW 28)进行沉淀。将沉淀在2ml 0.5mM Tris缓冲液(pH 7.2)中在4℃下重悬浮过夜，并上样到蔗糖梯度，以24,000xg离心约1小时(Beckman，SW 41)。收集梯度中的病毒带，用于SDS-PAGE分析。预染的蛋白分子量标准品从GIBCO(Carlsbad，CA)购买。
在小鼠模型中使用带有GnRH的RV ERAg3p病毒的安全性和抗狂犬病的效力
将三周龄ICR雌性小鼠(Charles River Laboratory)分成四组，每组10只动物。第1组用RV ERA-N-2GnRH接种，第2组用ERA-N-GnRH接种，第3组用ERA-IIa-GnRH接种，第4组(作为对照)用PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)接种。对于每只小鼠，将50μl每种病毒(6.0x106FFU)或PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4，对照)肌肉内(i.m)注射到左腿的腓肠肌中。在接种后三周，将存活的动物用致死剂量的50μl约2.5-10.0MICLD50狗/丛林狼RV街毒(MD5951)通过相同途径肌肉内注射到右腿中进行激惹。在激惹后两个月分析病毒对动物的安全性和效力。
来自用带有GnRH的RV ERAg3p病毒免疫的小鼠的血清抗GnRH-KLH和2GnRH-KLH偶联物的反应
将10只3周龄ICR雌性小鼠(Charles River Laboratory)在左腿腓肠肌中肌肉内注射50μl(6.0x106FFU)ERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH或ERA-IIa-GnRH进行免疫。在疫苗接种后三周，在使动物镇静后通过眼眶后途径收集血清。将血清维持在-20℃下用于进一步分析。将GnRH-KLH和2GnRH-KLH偶联物在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，用于针对被免疫动物血清的Western印迹。简单来说，在凝胶电泳后，将GnRH-KLH和2GnRH-KLH转移到PVDF膜上，用于在1x酪蛋白缓冲液(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)中在室温下阻断30分钟。将被免疫动物血清(在1X酪蛋白反应物中1∶200稀释)与膜在室温下温育30分钟。在1X酪蛋白Tris缓冲液中清洗三次(每次3分钟)后，加入1∶1000稀释的生物素酰化的抗小鼠IgG(H+L)抗体(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)，在室温下继续温育30分钟。染色试剂盒是来自Vector Laboratories Inc.(Burlingame，CA)的ABC系统。
GonaConTM免疫的兔血清抗带有GnRH的RV ERAg3p病毒的反应
GonaConTM免疫的兔血清从USDA国立野生动物研究中心(National Wildlife Research Center，USDA)获得。用于检测重组RV-ERAg3p病毒中的GnRH肽的间接荧光测定法(IFA)按照下述进行。在一个6孔板(Becton Dickinson Labware，NJ)中，将ERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH或ERA-IIa-GnRH病毒感染的BSR细胞(37℃感染48小时)在4％福尔马林PBS(Protocol
Figure BPA00001330814600511
Fisher Scientific Company LLC，Kalamazoo，Inc)中，在室温下固定30分钟。向固定的BSR细胞加入以1∶200在PBS(0.01M，pH 7.4)中稀释的GonaConTM免疫的兔血清，并在37℃下温育30分钟。在同样的PBS中清洗三次(每次3分钟)后，加入1∶200稀释的FITC偶联的山羊抗兔IgG(H+L)抗体，并在37℃下温育30分钟。染色结果在UV显微镜下记录。对于使用GonaConTM免疫的兔血清针对纯化的带有GnRH的RV ERA病毒的Western印迹来说，按照与上述相同的方案进行。
结果
GnRH肽与KLH的合成以及偶联
合成了在氨基末端带有额外半胱氨酸(C，序列中的斜体)的GnRH肽(用粗体表示)：NH2-CEHWSYGLRPG-COOH(SEQ ID NO：55)和2GnRH肽(用粗体表示)：NH2-CEHWSYGLRPGEHWSYGLRPG-COOH(SEQ ID NO：56)。使用微量HPLC和MALDI质谱分析证实了肽1780和1781的纯度。然后将KLH通过额外的氨基末端C残基与1780和1781肽偶联。偶联效率通过SDS-PAGE验证(图4)。
重排的RV ERAg3p的生长特征和致病性
在P基因前具有重新定位的G基因的重排的ERA基因组，按照与Wu等以前描述的方法(Virus Res.129：91-103，2007)相似的方法进行构建。G基因的333位氨基酸残基从AGA向GAG的突变描述在别处(Wu和Rupprecht，Virus Res.131：95-99，2008)。在生物反应器温育中，回收的ERAg3p与亲代ERA病毒生长同样良好，在被感染的BSR细胞中达到4.2x109FFU/ml(图2B)。将ERAg3p颅内接种到3周龄小鼠中，不引起狂犬病的任何迹象或其他不利副作用。但是，亲代ERA病毒杀死所有通过同样途径接种的小鼠(图2C)，因此，将减毒的ERAg3p病毒用作骨架，用于随后在免疫避孕研究中插入GnRH编码序列。
将GnRH编码序列插入到RV ERAg3p病毒中G基因的不同位置中
根据以前鉴定的抗原性表位，选择了RV ERAg3p中G*基因的6个位置用于插入GnRH编码序列：紧接信号序列之后、抗原性位点II、抗原性位点IIa、抗原性位点WB+、抗原性位点III和胞外结构域与跨膜结构域之间的连接处(参见图6)(Coulon等，J.Gen.Virol.64：693-696，1983；Seif等，J.Virol.53：926-934，1985；Prehaud等，J.Virol.62：1-7，1988)。将GnRH的编码序列(GAACACTGGAGCTACGGTTTGAGACCCGGG；SEQ ID NO：47)通过突变导入到上述6个位置中。串联连接的2GnRH编码序列(GAACACTGGAGCTACGGTTTGAGACCCGGGGAACACTGGAGCTACGGTTTGAGACCCGGG；SEQ ID NO：57)也以类似方式导入到G*基因中。最终的12个G*基因构建物通过DNA测序验证，并被成功地克隆在用于病毒回收的RV ERAg3p全长质粒中。在重组狂犬病毒中回收到的四种G*基因构建物(参见表3)的核苷酸和氨基酸序列显示为SEQ ID NO：49和50(G-N-GnRH)、SEQ ID NO：51和52(G-N-2GnRH)、SEQ ID NO：53和54(G-IIa-GnRH)以及SEQ ID NO：63和64(G-C-GnRH)。
带有GnRH的ERAg3p病毒的回收和表征
带有与G基因框内融合的GnRH或(2GnRH)的12种G*构建物(图6)的每种，被成功克隆在RV ERAg3p基因组中P基因的前面。在进行病毒回收之前，验证每种构建物的全长序列是正确的。从12种构建物的4种中成功回收了重组病毒，其中GnRH被插入在紧接糖蛋白的信号序列(回收到的病毒被命名为RV ERA-N-GnRH或ERA-N-2GnRH)、IIa位点(RV ERA-IIa-GnRH)或胞外与跨膜结构域之间的连接处(RV ERA-C-GnRH)之后的氨基末端处(参见下面的表3)。如果在第一轮回收中没有检测到病毒，在两个独立试验中重复用于病毒拯救的质粒转染试验。回收到的RV ERA-N-GnRH、ERA-N-2GnRH和ERA-C-GnRH在细胞培养物中生长良好，但是ERA-IIa-GnRH病毒不能高效生长，并且滴度比其对应物低约100倍(图7B)。
表3.带有GnRH的ERAg3p病毒的回收
  病毒构建物   G基因构建物   回收病毒
  ERA-N-GnRH   G-N-GnRH   是
  ERA-N-2GnRH   G-N-2GnRH   是
  ERA-II-GnRH   G-II-GnRH   否
  ERA-II-2GnRH   G-II-2GnRH   否
  ERA-IIa-GnRH   G-IIa-GnRH   是
  ERA-IIa-2GnRH   G-IIa-2GnRH   否
  ERA-WB+GnRH   G-WB+GnRH   否
  ERA-WB+2GnRH   G-WB+2GnRH   否
  ERA-III-GnRH   G-III-GnRH   否
  ERA-III-2GnRH   G-III-2GnRH   否
  ERA-C-GnRH   G-C-GnRH   是
  ERA-C-2GnRH   G-C-2GnRH   未测试
GnRH在RV ERAg3p病毒中的表达
插入在G蛋白的胞外与跨膜结构域之间的GnRH可能不处在暴露于病毒表面的最适位置中。因此，本文描述的下列研究聚焦于RVERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH和ERA-IIa-GnRH。通过纯化病毒的SDS-PAGE，通过考马斯亮蓝染色出了典型的5条带图谱(图8A)。从凝胶中切下来自RV ERA-N-GnRH和ERA-N-2GnRH的G蛋白条带，用于蛋白序列分析。在三个独立试验中，证实了G蛋白的氨基末端在与GnRH肽融合后被阻断。但是，在ERA-N-2GnRH和ERA-N-GnRH病毒两者中，使用Northern印迹在融合的G mRNA中检测到了GnRH(图8B)。
在小鼠模型中使用带有GnRH的RV ERAg3p病毒的安全性和抗狂犬病的效力
在用RV ERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH或ERA-IIa-GnRH接种的小鼠中，没有观察到明显的副作用或行为变化。在接种后3周，对存活的动物使用致死剂量的约2.5-10.0MICLD50狗/丛林狼RV街毒进行激惹。所有对照小鼠发展出典型的狂犬病迹象，并在8到10天之间安乐死。通过DFA在脑中检测到RV抗原。在带有GnRH的RV ERAg3p组中的存活小鼠没有发展出狂犬病的任何征兆，并在2个月的实验结束前保持健康(图9)。
使用带有GnRH的RV ERAg3p病毒免疫的小鼠血清抗GnRH-KLH和2GnRH-KLH偶联物的反应
为了比较使用带有GnRH的RV ERA病毒免疫的小鼠血清与GonaConTM免疫的兔血清(来自USDA)抗GnRH-KLH和2GnRH-KLH的反应性，将肽偶联物在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离。在Western印迹中，带有GnRH的RV ERA免疫的小鼠血清和GonaConTM免疫的兔血清两者都识别GnRH-KLH和2GnRH-KLH偶联物(图10)。但是，每种偶联物在血清学中显示出几个条带，表明在肽连接中不均匀或不可控制的加工。
GonaConTM免疫的兔血清与带有GnRH的RV ERAg3p病毒的反应
在IFA中，在ERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH和ERA-IIa-GnRH感染的BSR细胞中观察到了典型的细胞膜荧光。染色图案与RV感染的细胞中狂犬病G蛋白的图案相符。在使用纯化的病毒与GonaConTM免疫的兔血清的Western印迹分析中，G蛋白条带被染色，其表明了GnRH肽与RV糖蛋白的融合。
实施例4：ERA-GnRH在犬类中的体内研究
本实施例描述了ERA-GnRH疫苗构建物(例如本文中公开的)在狗中的测试，以建立安全性和效能。在狗中测试重组ERA-GnRH病毒，用于对狂犬病效能和用于种群控制的免疫避孕效果进行双重评估。假定在一次用药后，ERA-GnRH将在3年内引发狂犬病毒中和抗体并稳定被免疫狗的种群数量。将ERA-GnRH给药于约100只狗(50只雄性和50只雌性)，并将另外20只狗用作对照。重组狂犬病毒以约107FFU/ml的剂量肌肉内给药，或以约108FFU/ml的剂量口服给药。据信，大约70％的被免疫动物将在一年内保持不育，并且幼仔数量将下降至少50％。
实施例5：使用基于狂犬病毒的免疫避孕剂对狗进行疫苗接种
本实施例描述了在未接触过狂犬病毒的狗上进行的基于狂犬病毒的免疫避孕疫苗接种研究。在本实验中包含了7组未接触过狂犬病的、具有完全生育能力的流浪成年狗。血清中不存在狂犬病毒中和抗体(VNA)，被用于确证动物未接触过狂犬病。组由20只动物组成，每组具有1∶1的雄性与雌性比例，以确保可以在每个组中实现雄性和雌性的统计学显著性。在实验开始前排除妊娠。此外，在雄性和雌性中犬传染性生殖道肿瘤必须被排除。所有动物被隔离检疫(至少40天)，并进行强制性的完全除虫。
两个组(每组20只动物)在第0天接种1mL重组狂犬病毒(本文所公开的)，并在第21天给药单剂加强剂。一组肌肉内(i.m)接种，另一组口服接种。另外两个组(每组20只动物)在第0天通过i.m或口服给药接种单剂1mL重组狂犬病毒。对照组(每组20只动物)通过肌肉内或口服(滴注)接受安慰剂(细胞培养基，与病毒增殖中使用的相同)。第三组——避孕对照组，通过i.m注射接受GonaConTM(GnRH免疫避孕疫苗)。所有组进行相应标记(例如通过使用不同颜色的颈圈或使用表明组号的纹身)。试验和对照组概述如下。
第1组：20只动物(10只雄性和10只雌性)，在第0和21天通过i.m途径接种1mL构建物。
第2组：20只动物(10只雄性和10只雌性)，在第0和21天通过口服途径接种1mL构建物。
第3组：20只动物(10只雄性和10只雌性)，在第0天通过i.m途径接种一次1mL构建物。
第4组：20只动物(10只雄性和10只雌性)，在第0天通过口服途径接种一次1mL构建物。
第5组：20只动物(10只雄性和10只雌性)，通过i.m途径接种1mL细胞培养基。
第6组：20只动物(10只雄性和10只雌性)，通过口服途径接种1mL细胞培养基。
第7组：避孕对照组，20只动物(10只雄性和10只雌性)，通过i.m途径接种1mL GonaConTM。
笼养
出于隔离的目的，使用大笼子或狗舍(例如5米×5米)来集中饲养，每个狗舍最多10只狗。雄性和雌性总是被分开，以避免当雌性发情时在雄性之间发生争斗。此外，狗舍或笼子将足以保护所有狗免于日晒雨淋。全时提供淡水。
取样方案和监测
出于筛选目的，从疫苗接种候选者获取血清样品(如果需要将测试多达200只或更多的狗)，以选择140只不具有抗狂犬病抗体的适合动物(两种性别的处于育龄的狗)(参见表4)。
在整个实验期间，每周从所有120只狗(第1到6组)获取血清样品(第0、7、14、28天，以及如果可能，6个月后)，以测量VNA滴度和免疫避孕响应。
避孕激惹
将所有组中的动物与健康的有生育力的成年狗交配。理想情况下，在第3和4组中，交配将在疫苗接种后4周(第28天)进行。对于在第21天接受加强免疫的动物来说，动物将在加强剂后14到21天之间交配。每5只雌性狗使用一只健康种狗。安慰剂对照组中的雄性可以用作接种疫苗的狗的种狗，这些组中的雌性狗也进行交配。
表4.研究前的时间表(第1-8周)
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表5.研究的时间表(第9-24周和直到6个月)
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1重组狂犬病毒；2疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)；
3狂犬病毒中和抗体
预期约70％的被免疫动物将在一年内保持不育，并且幼仔数将降低至少50％。此外据信超过80％的动物在研究结束时将从致死剂量的狂犬病毒激惹中存活。
实施例6：重组狂犬病毒免疫避孕疫苗在啮齿动物模型中的体内安全性、免疫原性和效能评估
本研究的第一阶段将在小鼠中测试狂犬病毒免疫避孕(GnRH)疫苗抗狂犬病毒感染的效能。将20只4周龄小鼠分为雄性(n＝10)和雌性(n＝10)组(每种疫苗20只小鼠，疫苗为GonaConTM和疫苗与GonaConTM的组合)，并在第0天接受实验生物物质(50μl，通过肌肉内注射到左腓肠肌中)。在第7、14和28天，通过下颌下收集技术从所有小鼠收集血液，并测试狂犬病毒中和抗体(VNA)、抗GnRH抗体和睾酮与雌激素的存在。将具有可检测水平的狂犬病毒中和抗体的小鼠，在疫苗接种后第28天在右侧腓肠肌中用狂犬病毒激惹。动物在出现狂犬病的最初临床征兆时将被安乐死。收集脑和生殖器官用于组织学检查。
分组：1)包含1-8个整合的GnRH拷贝的活重组疫苗(8x20只小鼠)；2)包含整合的GnRH的失活重组疫苗(20只小鼠)；3)商购疫苗(20只小鼠)；4)GonaConTM(20只小鼠)；5)包含整合的GnRH的活重组疫苗+GonaConTM(20只小鼠)；6)商购疫苗+GonaConTM(20只小鼠)；7)包含整合的GnRH的失活重组疫苗+GonaConTM(20只小鼠)；8)给药PBS的对照组(10只小鼠)。
预期结果：预期到3个月的观察期结束时，至少80％的被免疫动物将存活，并且没有狂犬病征兆。
实施例7：在啮齿动物中的肌肉内避孕试验
如上所述进行疫苗接种。每个组包含每种性别的10只小鼠。在接种后第7、14和28天对动物取血，以测量抗狂犬病毒和GnRH的VNA以及雌性小鼠中的孕酮和雄性小鼠中的睾酮。在第30天，重组疫苗组中的每只小鼠与相反性别的对照小鼠(未接种疫苗，可育)在新舍中配对(每组共40只小鼠)。对这20对保持观察。在配对后每两天检查雌性的妊娠情况。
为了测量诱导的免疫应答的持久性以及与不育的关联性，如果雌性在前18天没有妊娠的话，将成对小鼠继续保持在一起6个月(或直到雌性妊娠)。每两周通过下颌下途径对小鼠取血。在安乐死后检查雌性性器官以检查妊娠。
预期结果：预期到3个月结束时，至少80％的雌性不会妊娠，并且预期至少80％的雄性不会使未免疫雌性受孕。血清学响应将与生育比率相关。将选择两种或以上重组狂犬病毒用于口服避孕研究。
如果通过肌肉内途径有效(在两种性别的接种动物中不育)，那么将评估通过口服给药的疫苗的免疫原性和效能。实验设计将与i.m避孕试验类似。
实施例8：在狗模型中的体内免疫原性和安全性研究
效能试验(肌肉内给药)：将在雄性和雌性狗中测试重组免疫避孕疫苗抗狂犬病毒感染的效能以及它们诱导针对GnRH的免疫应答的能力。每组由8只动物组成(4只雄性和4只雌性)。在第一阶段中，在啮齿动物模型中被证明有效并具有免疫原性的各种所选疫苗，将进行i.m给药。将在第0天、随后在前两个月每周一次或两次以及此后每月一次收集血液。测试血清中狂犬病毒中和抗体和抗GnRH抗体的存在。也将测量GnRH、孕酮和睾酮的水平。对照组的4只狗将接受安慰剂注射。每个组中的4只动物(以前用所产生的狂犬病疫苗构建物中具有已证明的狂犬病毒中和抗体滴度的一种构建物接种过)将在接种后第28天，在右侧腓肠肌中用狂犬病毒接种。对动物进行观察，并在首次出现狂犬病临床征兆时将其安乐死(静脉内注射巴比妥酸衍生物)。收集脑和生殖器官用于组织学检查。实验组的设计将取决于这些疫苗在啮齿动物模型中的试验结果。由于以前的疫苗接种，预计所有实验动物将存活。
分组(每组8只狗)：1)包含整合的GnRH的活重组疫苗；2)包含整合的GnRH的失活重组疫苗；3)商购疫苗；4)GonaConTM；5)狂犬病疫苗+GonaConTM；6)APHIS/NWRC重组GnRH-VLP；以及7)对照组(4只狗)。免疫避孕疫苗实验的第一阶段将需要最多52-60只动物。取决于使用i.m给药疫苗的安全性、免疫原性、效能实验的结果，也将测试所选的包含整合的GnRH的活减毒疫苗的口服给药。
预期结果：预计到1年的观察期结束时，至少80％的被免疫动物将存活而没有狂犬病的任何征兆，并且预计至少某些实验组具有明显的抗GnRH抗体滴度和明显降低的孕酮和睾酮水平。
在狗中的避孕试验：在效能试验中被证明在上述啮齿动物和狗中具有免疫原性的、最好的包含整合的GnRH的实验疫苗的效能也将被测试，以检测其在肌肉内给药后在雌性狗中诱导不育的能力。处理和对照组将分别由10和5只动物组成。
预期结果：预计到1年的观察期结束时，至少80％的被免疫动物保持不育，具有明显的抗GnRH抗体滴度和降低的孕酮和睾酮水平。预期至少50％的对照动物成功繁殖。
本公开提供了包含免疫避孕蛋白的重组狂犬病毒。本公开还提供了同时保护非人类动物抵抗狂犬病毒感染和抑制动物生育力的方法。显然，所描述的方法的准确详细情况可以被改变或修改，而不背离所描述的公开内容的精神。我们要求保护在下面的权利要求书的范围和精神内的所有这种修改和改变。
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Claims (41)

1.一种重组狂犬病毒，其中重组狂犬病毒的基因组包含狂犬病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)基因以及编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列，其中免疫避孕蛋白选自促性腺激素释放激素(GnRH)和透明带3(ZP3)。
2.权利要求1的重组狂犬病毒，其中基因组包含编码GnRH的核酸序列和编码ZP3的核酸序列。
3.权利要求1或2的重组狂犬病毒，其中G基因被重新定位在重组狂犬病毒基因组中N基因与P基因之间。
4.权利要求1-3任一项的重组狂犬病毒，其中基因组源自于狂犬病毒ERA株。
5.权利要求4的重组狂犬病毒，其中ERA株的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1。
6.权利要求1-5任一项的重组狂犬病毒，其中狂犬病毒糖蛋白包含在第333位氨基酸位置(根据SEQ ID NO：5编号)上的Glu。
7.权利要求1-6任一项的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列与SEQ ID NO：47有至少95％的同一性。
8.权利要求7的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列包括SEQ IDNO：47。
9.权利要求7的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列由SEQ IDNO：47构成。
10.权利要求1-6任一项的重组狂犬病毒，其中ZP3核酸序列是狗的ZP3核酸序列。
11.权利要求10的重组狂犬病毒，其中狗的ZP3核酸序列与SEQID NO：7有至少95％的同一性。
12.权利要求10的重组狂犬病毒，其中狗的ZP3核酸序列包括SEQ ID NO：7。
13.权利要求10的重组狂犬病毒，其中狗的ZP3核酸序列由SEQID NO：7构成。
14.权利要求1-13任一项的重组狂犬病毒，其包含两个拷贝的GnRH核酸序列。
15.权利要求1-13任一项的重组狂犬病毒，其包含两个拷贝的ZP3核酸序列。
16.权利要求14或15的重组狂犬病毒，其中两个拷贝是毗邻的。
17.权利要求14或15的重组狂犬病毒，其中两个拷贝不是毗邻的。
18.权利要求1-17任一项的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列插入到狂犬病毒糖蛋白基因内。
19.权利要求18的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列插入到糖蛋白基因的信号序列(SEQ ID NO：49的1-57位核苷酸)之后。
20.权利要求19的重组狂犬病毒，其中糖蛋白基因包括SEQ IDNO：49或SEQ ID NO：51的核酸序列。
21.权利要求18的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列插入到紧接糖蛋白基因的抗原性位点IIa(SEQ ID NO：53的第663位核苷酸)之后。
22.权利要求21的重组狂犬病毒，其中糖蛋白基因包括SEQ IDNO：53的核酸序列。
23.权利要求18的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列插入到糖蛋白基因的胞外结构域与跨膜结构域的连接处(SEQ ID NO：63的第1374位核苷酸之后)。
24.权利要求23的重组狂犬病毒，其中糖蛋白基因包括SEQ IDNO：63的核酸序列。
25.权利要求1-17任一项的重组狂犬病毒，其中ZP3核酸序列插入到狂犬病毒的P与M基因之间。
26.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-25任一项的重组狂犬病毒。
27.权利要求26的免疫原性组合物，其还包含可药用载体。
28.权利要求26或27的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
29.一种免疫原性组合物，其包含第一种重组狂犬病毒和第二种重组狂犬病毒，其中第一种重组狂犬病毒的基因组包含GnRH核酸序列，并且第二种重组狂犬病毒的基因组包含ZP3核酸序列。
30.权利要求29的免疫原性组合物，其中第一种重组狂犬病毒是权利要求1-9、14和16-24任一项的狂犬病毒。
31.权利要求29或30的免疫原性组合物，其中第二种重组狂犬病毒是权利要求1-6、10-13、15-17和25任一项的重组狂犬病毒。
32.权利要求29-31任一项的免疫原性组合物，其还包含可药用载体。
33.权利要求29-32任一项的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
34.一种免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物生育力的方法，所述方法包括向动物给药治疗有效量的权利要求26-33任一项的免疫原性组合物。
35.权利要求34的方法，其中免疫原性组合物经口服给药。
36.权利要求35的方法，其中免疫原性组合物通过食物诱剂给药。
37.权利要求34-36任一项的方法，其中动物是驯养动物。
38.权利要求34-36任一项的方法，其中动物是野生动物。
39.权利要求34-36任一项的方法，其中动物是狗、猫、大鼠、小鼠、蝙蝠、狐狸、浣熊、松鼠、负鼠、丛林狼或狼。
40.权利要求26-33任一项的组合物在制备用于免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物的生育力的药物中的应用。
41.权利要求26-33任一项的组合物，其用于免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物的生育力的方法中。
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