JP7233116B2 - 雄臭除去用組み換えタンパク質およびこれを含むワクチン組成物 - Google Patents
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Description
本発明の組み換えタンパク質に使用されるGnRHは、GnRHアミノ酸配列の1コピー(one copy)よりは、2またはそれ以上のコピー(two or more copies)を有することが好ましい。このような多重コピー(multiple copy)を有する場合、GnRHに対する免疫原性をさらに増強させることができるので、GnRHのアミノ酸配列、好ましくは配列番号1のアミノ酸配列が2個以上の多量体を取ることができる。GnRHの個数は、発現ベクター内で受け入れ可能であれば、特別な制限はないが、好ましくは2個~20個、より好ましくは2個~10個が連結された多量体の形態を取ることができ、さらに好ましくは6個が連結された六量体を使用することができる。本発明の具体的な実施例では、GnRHタンパク質が連続的に6回繰り返されるように製作した。前記6個のGnRHが連結されたポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列からなり得るが、これに制限されるものではない。
GnRHに対する免疫原性を誘導するために、図1に示されたように、GnRHにCTB、pFc2、BiPおよびHDELを融合した組み換えGnRHを発現させるためのベクターを製作した。10個のアミノ酸から構成されたGnRHは、6個が連続するようにしてアラニン-グリシン-アラニン(AGA)リンカーで連結した。6個が連結されたGnRHのアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号2および配列番号3に示した。また、CTBに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号4および配列番号5に、pFc2に対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号6および配列番号7に、BiPに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号8および配列番号9に、HDELに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号10および配列番号11に示し、発現カセット(cassette)の全体アミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号12および配列番号13に示した。
前記実施例1で分離・精製した組み換えGnRHタンパク質の濃度を確認および測定するために、濃度を知っているBSA(bovine serum albumin)をスタンダード(standard)としてSDS-PAGEおよびブラッドフォード定量分析(bradford assay)を行った。分離精製した組み換えGnRHタンパク質を1、2μlローディングし、定量のために0.5、1、2μgのBSAを含ませた。Gelは、クマシーブルー染色(Coomassie blue staining)を通じてバンドを最終的に確認した。ブラッドフォード定量分析は、BSAを標準時料として使用してスタンダードカーブ(standard curve)を描いて計算式を作り、GnRHのUV値を代入して濃度を計算した。
3.1.実験動物、投与条件および日程
組み換えGnRHタンパク質の免疫去勢効果を確認するために、4週齢の雄性SD(Sprague Dawley)ラットに下記表1に記載された投与条件で、図3に示された日程によって本発明による組み換えGnRHタンパク質が含まれたワクチン組成物を投与した。対照群は、同じ量のPBS(phosphate-buffered saline)を投与し、実験群は、前記ワクチン組成物100μg/180μlおよびEmulsigen(登録商標)-Dアジュバント20μlを投与した(下記表1参照)。入舎した4週齢のラットを約4日間安定化させた後、14日~15日の投与間隔で総3回投与した。採血は、それぞれ、投与前および実験終了時に実施し、3次投与後4週が経過した時点で睾丸を摘出して、重さおよびサイズを測定し、血中テストステロン(testosterone)の濃度を測定した。
本発明によるワクチン組成物の3次投与後に4週が経過した時点で睾丸を摘出して、肉眼評価を実施した。結果は、下記表2および図4に示した。
本発明によるワクチン組成物の3次投与後に4週が経過した時点で採血して、血中テストステロンの濃度を測定した。測定は、Elabscience(登録商標)のELISAキットを用いて製造社の指針によって行った。具体的に、テストステロンがコートされているプレートに50μLの血清を入れ、すぐに同じ量のbiotinylated Detection抗体を入れた。37℃で45分間反応させた後、350μLの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。次に、100μLのHRP conjugate溶液を入れ、37℃で30分間培養した。上述した過程と同一に洗浄を5回進めた後、90μLの基質液を添加した後、37℃で15分間培養した。その後、50μLの反応停止液を入れ、ELISA機械を通じて450nmの波長でOD値を測定した。血中テストステロンの実際量を定量するために、テストステロンスタンダードタンパク質を0.1、0.4、1.6、5、20ng/mlで含んで反応を進めた。これを通じて得られたOD値でスタンダードグラフを作って、これに先立って得られたサンプルのOD値を代入してテストステロンを定量した。その結果は、下記表3および図5に示した。
Claims (17)
- 結合免疫グロブリンタンパク(BIP)、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、n個のGnRH(Gonadotropin-releasing hormone)、ブタ免疫グロブリンFc断片、及びHDEL(His-Asp-Glu-Leu)が融合した組み換えタンパク質を有効成分として含み、前記nは、1~20の整数であり、
該BIPが配列表の配列番号8のアミノ酸配列からなり、該CTBが配列表の配列番号4のアミノ酸配列からなり、該GnRHが配列表の配列番号1のアミノ酸配列からなり、該ブタ免疫グロブリンFcフラグメントが配列表の配列番号6のアミノ酸配列からなる、雄臭除去用ワクチン組成物。 - 前記nは、6であることを特徴とする、請求項1に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記GnRHは、配列番号2のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項2に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記GnRHは、nが2以上であるとき、それぞれ、アラニン-グリシン-アラニン(alanine-glycine-alanine)リンカーで連結されたことを特徴とする、請求項1に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記CTBは、GnRHのN-末端方向に融合し、前記ブタ免疫グロブリンFc断片は、GnRHのC-末端方向に融合することを特徴とする、請求項1に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記CTBは、GnRHのN-末端方向に融合し、前記BiPは、CTBのN-末端方向に融合することを特徴とする、請求項1に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記CTBは、GnRHのN-末端方向に融合し、前記HDELは、GnRHのC-末端方向に融合することを特徴とする、請求項1に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記組み換えタンパク質は、BiP、CTB、GnRH、ブタ免疫グロブリンFc断片、およびHDELが順次に融合したものであることを特徴とする、請求項1に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記組み換えタンパク質は、配列表の配列番号12のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項8に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 前記ワクチン組成物は、アジュバント(adjuvant)をさらに含むことを特徴とする、請求項1~9のいずれか1項に記載の雄臭除去用ワクチン組成物。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載のワクチン組成物をギニアピッグ又はブタに投与する段階を含む、動物の雄臭除去方法。
- 配列表の配列番号8のアミノ酸配列からなるBiPをコードするポリヌクレオチド、配列番号3の塩基配列からなるGnRH遺伝子、配列番号5の塩基配列からなるCTB遺伝子、配列表の配列番号6のアミノ酸配列からなるブタ免疫グロブリンFc断片をコードするポリヌクレオチド、及び配列表の配列番号11の塩基配列からなるHDEL遺伝子を順に含み、請求項1の組換えタンパク質をコードする、雄臭除去用組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターは、配列番号12のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは配列番号13の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項12に記載の雄臭除去用組み換えベクター。
- 結合免疫グロブリンタンパク(BIP)、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、n個のGnRH(Gonadotropin-releasing hormone)、ブタ免疫グロブリンFc断片、及びHDEL(His-Asp-Glu-Leu)が融合しており、該nは、1~20の整数であり、
該BIPが配列表の配列番号8のアミノ酸配列からなり、該CTBが配列表の配列番号4のアミノ酸配列からなり、該GnRHが配列表の配列番号1のアミノ酸配列からなり、該ブタ免疫グロブリンFcフラグメントが配列表の配列番号6のアミノ酸配列からなる、雄臭除去用組み換えタンパク質。 - 請求項12に記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換体。
- 請求項14に記載の雄臭除去用組み換えタンパク質を、ギニアピッグ又はブタの雄臭除去の為に使用する方法。
- 雄臭除去に用いられるワクチンを製造する為の、請求項14に記載の組換えタンパク質の使用。
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