JP5894695B1 - ウズラの卵アレルギーの抗原 - Google Patents

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Abstract

【課題】ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原、ウズラの卵に対するアレルギーの診断方法及び診断キット、抗原を含む医薬組成物、並びに抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列において数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質である、ウズラの卵に対するアレルギーの原因となるウズラ由来の抗原、ウズラの卵に対するアレルギーの診断方法及び診断キット、抗原を含む医薬組成物、並びに抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品。【選択図】なし

Description

本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原に関する。本発明はまた、ウズラの卵に対するアレルギーの診断キット、診断用組成物、および診断方法に関する。本発明はまた、当該抗原を含む医薬組成物、及び当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品に関する。
アレルギー患者の血清および組織中では、特定の抗原に特異的なＩｇＥ抗体が産生される。このＩｇＥ抗体と特定の抗原の相互作用により生じた生理学的結果によりアレルギー反応が惹起される。
従来のアレルギー検査薬においては、単にアレルゲン候補の食品・材料等をすりつぶして抗原試薬を作成していることが多い（特許文献１）。このように従来の抗原試薬は、必ずしもアレルギー反応を引き起こす特定の抗原タンパク質（アレルゲンコンポーネント）を単独で含有するものではなく、複数のタンパク質成分を含むものである。したがって、従来の抗原試薬においては、アレルゲンコンポーネントごとに含有量が異なっていた。このため、従来の抗原試薬中に含まれる多数のタンパク質の中で、ＩｇＥ抗体との結合について陽性反応が判定可能な閾値を超える含有量のタンパク質がアレルゲンコンポーネントであった場合にのみ、アレルギー検査における陽性反応を検出することが可能であった。逆に、食品等のアレルゲン中の含有量が少ないアレルゲンコンポーネントにＩｇＥ抗体が結びつく患者については、従来のアレルギー検査薬を用いても陽性反応が判定できない状態であった。
また、アレルギー反応の症状や重篤度は、アレルゲンコンポーネントの含有量とは必ずしも相関しない。アレルゲン候補の食品・材料中に微量に含まれるアレルゲンコンポーネントに患者のＩｇＥ抗体が反応する場合であってもアレルギー症状が現れたり、重篤度に関与したりする場合がある。
したがって、アレルギー検査の信頼度を高めるためには、アレルゲン候補の食品・材料において、アレルゲンコンポーネントを網羅的に特定する必要がある。
一方、タンパク質の分離・精製に関しては、従来、細胞抽出物などからタンパク質や核酸を分離・精製する方法が種々に検討されてきている。塩濃度を利用した透析、遠心分離などはその一例であるといえる。
また、タンパク質や核酸の残基が有する電荷や、分子量の違いを利用した精製方法も多数検討されている。電荷を利用した精製方法としては、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーや等電点電気泳動を例示できる。分子量の違いを利用した精製方法としては遠心分離、分子量ふるいによるカラムロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を例示できる。
近年、少量のサンプルから多様なタンパク質を分離精製する方法として、１次元目に等電点電気泳動を行い、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う２次元電気泳動法が用いられている。出願人らはこれまでに、分離能が高い２次元電気泳動法を開発してきた（特許文献２〜５）。
特開２００２−２８６７１６ 特開２０１１−３３５４４ 特開２０１１−３３５４６ 特開２０１１−３３５４７ 特開２０１１−３３５４８
本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原を提供する。本発明はまた、ウズラの卵に対するアレルギーの診断方法および診断キットを提供する。本発明はまた、当該抗原を含む医薬組成物、及び当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するためにウズラの卵に対するアレルギーの原因抗原特定について鋭意研究を行った。その結果、ウズラ卵アレルギーを有する患者の血清中のＩｇＥ抗体が特異的に結合する抗原を特定することに成功した。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
（１）ウズラ由来の抗原であって、以下からなる群より選択され、そしてウズラの卵に対するアレルギーの原因となる、前記抗原：
（ａ）配列番号１および／または配列番号２で示されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号１および／または配列番号２において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１および／または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９、からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、あるいは、配列番号１、２、４〜９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｇ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９をすべて含むアミノ酸配列、あるいは配列番号１、２、４〜９において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をすべて含む、タンパク質；
（ｈ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９をすべて含むアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｉ）配列番号１１および配列番号１２を含むアミノ酸配列、あるいは、配列番号１１および配列番号１２において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質；
（ｊ）配列番号１１および配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２）ウズラ由来の抗原であって、以下からなる群より選択され、そしてウズラの卵に対するアレルギーの原因となる、前記抗原：
（ａ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号１および／または配列番号２において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１４において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｅ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、あるいは、配列番号１３、１５および１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質；
（ｆ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｇ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６をすべて含むアミノ酸配列、あるいは、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をすべて含む、タンパク質；
（ｈ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６をすべて含むアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも６０％の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｉ）配列番号１７および配列番号１６を含むアミノ酸配列、あるいは、配列番号１７および配列番号１６において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質；
（ｊ）配列番号１７および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（３）上記（１）または（２）に記載の抗原を含む、ウズラの卵に対するアレルギーの診断キット。
（４）対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を上記（１）または（２）に記載の抗原に接触させる、ここで当該試料はＩｇ抗体が含まれる溶液である；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される；
を含む、前記方法。
（５）上記（１）または（２）に記載の抗原を含む、ウズラの卵に対するアレルギーの診断用組成物。
（６）上記（１）または（２）に記載の抗原を含む、医薬組成物。
（７）ウズラの卵に対するアレルギーを治療するための、上記（６）に記載の医薬組成物。
（８）上記（１）または（２）に記載の抗原が除去されていることを特徴とするウズラ卵またはウズラ卵加工品。
本発明により、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原を提供することができる。本発明においてウズラ卵アレルギーを引き起こす抗原（アレルゲンコンポーネント）が同定されたことから、ウズラの卵に対するアレルギーの高感度な診断方法および診断キット、当該抗原を含む医薬組成物、ならびに当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品を提供することができる。
図１は、ウズラ卵の卵黄および卵白に含まれるタンパク質について、２次元電気泳動によるタンパク質の泳動パターンを示すゲルの写真である。左側の写真はウズラ卵黄のタンパク質の２次元電気泳動パターンであり、右側の写真はウズラ卵白のタンパク質の２次元電気泳動パターンである。それぞれの写真の左側のバンドは、分子量マーカーのバンドである。 図２は、ウズラ卵の卵黄および卵白に含まれるタンパク質の二次元電気泳動パターンに対してイムノブロットを行った結果を示す写真である。上段はウズラ卵黄のタンパク質についてのイムノブロットであり、下段はウズラ卵白のタンパク質についてのイムノブロットである。右側はウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットであり、左側は健康被験者の血清を用いたイムノブロットである。矢印は、ウズラ卵アレルギーの患者の血清が特異的に反応したスポットを示す。 図３は、インヒビション試験の結果を示すイムノブロットの写真である。上段右側は、ウズラ卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、鶏卵卵黄でインヒビションを行ったウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットである。矢印は、ウズラ卵アレルギーの患者の血清が特異的に反応したスポットを示す。上段左側は、ウズラ卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、鶏卵卵黄でインヒビションを行った健康被験者の血清を用いたイムノブロットである。下段右側は、鶏卵卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、ウズラ卵黄でインヒビションを行ったウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットであり、下段左側は鶏卵卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、ウズラ卵黄でインヒビションを行った健康被験者の血清を用いたイムノブロットである。
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
本明細書においてアレルギーとは、ある抗原に感作されている生体に、再びその抗原が入った場合に起こる、生体に不都合な過敏反応を示す状態をいう。食物におけるアレルギー疾患の多くにおいて、血液および組織で抗原に特異的なＩｇＥ抗体が産生される。ＩｇＥ抗体は、肥満細胞または好塩基球と結合する。当該ＩｇＥ抗体に特異的な抗原が再びアレルギー疾患患者の体内に入ると、当該抗原は肥満細胞または好塩基球と結合したＩｇＥ抗体と組み合わさり、そして当該ＩｇＥ抗体が細胞表面で架橋し、ＩｇＥ抗体−抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これらの生理学的効果として、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、好酸球遊走因子または各種ロイコトリエン等の放出が挙げられる。これらの放出物質は、ＩｇＥ抗体と特定の抗原の組み合わせにより起こるアレルギー反応を惹起する。特定の抗原によるアレルギー反応は、上記の経路を通じて現れる。
本明細書においてウズラの卵に対するアレルギーとは、ウズラの卵に含まれるタンパク質等を抗原として生じるアレルギー反応を有する状態をいう。ウズラの卵に対するアレルギーは、ウズラの卵に含まれる抗原と接触した場合、あるいは当該抗原を摂取した場合に、アレルギー反応を生じ得る。一般的に食物を摂取した場合に生じるアレルギー反応を特に食物アレルギーという。ウズラの卵に対するアレルギーは食物アレルギーであってもよい。
本明細書において抗原とは、アレルギー反応を惹起させる物質であり、アレルゲンコンポーネントとも称される。抗原は好ましくはタンパク質である。
本明細書において、タンパク質は、天然のアミノ酸がペプチド結合により連結された構造を有する分子である。タンパク質に含まれるアミノ酸の数は特に限定されないが、２〜５０個程度のアミノ酸がペプチド結合により連結されたタンパク質を、ペプチドと呼ぶことがある。また、アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。本明細書で用いるタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている表記法に基づき、アミノ酸の一文字表記で表され、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
抗原の特定
ウズラの卵に含まれるタンパク質について、上記の手法を利用してウズラの卵に対するアレルギーの原因となる抗原の特定を行った。具体的には、ウズラ卵黄のタンパク質を下記の条件で２次元電気泳動に供した。
１次元目の電気泳動は、等電点電気泳動用ゲルとして、ゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内であって、ゲルのｐＨ範囲が３〜１０であり、泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配が、ゲルの全長を１とし、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５〜７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合において、ａが０．１５〜０．３の範囲内、ｂが０．４〜０．７の範囲内、ｃが０．１５〜０．３の範囲内であるゲルを用いて、具体的には、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社（以下、ＧＥ社と省略する）製のＩＰＧゲルImmobiline Drystrip (pH3-10NL)を用いて等電点泳動を行った。電気泳動機器は、ＧＥ社製のIPGphorを用いた。電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで定電圧工程を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流変化幅が５μＡであった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。
２次元目の電気泳動は、泳動方向基端部のゲル濃度が３〜６％に設定され、泳動方向先端側の部分のゲル濃度が泳動方向基端部のゲル濃度よりも高く設定されたポリアクリルアミドゲルを用いて、具体的にはlife technologies社製のNuPAGE 4-12% Bris-Tris Gels IPG well mini 1mmを用いてSDS-PAGEを行った。電気泳動機器は、life technologies社製のXCell SureLock Mini-Cellを用いた。泳動緩衝液として５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡを用い、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
その結果、ウズラ卵黄のタンパク質について上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量４５ｋＤａ付近、等電点５〜９に現れるスポット（以下、当該スポットを構成するタンパク質を「スポット１の抗原」と記載する）、および分子量３５ｋＤａ付近、等電点７〜１２に現れるスポット（以下、当該スポットを構成するタンパク質を「スポット２の抗原」と記載する）が、ウズラの卵に対するアレルギーの患者のＩｇＥ抗体に特異的に結合することを明らかにした。
抗原
・スポット１の抗原
スポット１の抗原について質量分析による配列同定を行った結果、以下のアミノ酸配列が検出された。
SFKPVYTDVPIEK（配列番号１）
SCNVIVAQDCTEHPK（配列番号２）
TFAVTRNIEDLAASK（配列番号４）
MTPVLLPEAVPDIMK（配列番号５）
FDGEILK（配列番号６）
HNELLMPNHK（配列番号７）
LNRNPTIDGEESTCYSVDPVLK（配列番号８）
VGFHCFPK（配列番号９）
KSVHAAFIKNVPLYYLIGEHALRMSFKPVYTDVPIEKIQVTIQAGDQAPTKM（配列番号１０）
ここで、配列番号１は配列番号１０のアミノ酸２５〜３７に相当する配列である。
また、上記のスポットについて質量分析計から得られた質量データをＮＣＢＩで解析したところ、メレアグリス・ガロパボ（Meleagris gallopavo）由来のvitellogenin-1-likeタンパク質（配列番号３）がヒットした。配列番号１は配列番号３のアミノ酸１２６〜１３８、配列番号２は配列番号３のアミノ酸７５０〜７６４、配列番号４は配列番号３のアミノ酸１０〜２４、配列番号５は配列番号３のアミノ酸２５〜３９、配列番号６は配列番号３のアミノ酸８４６〜８５２、配列番号７は配列番号３のアミノ酸８７５〜８８４、配列番号８は配列番号３のアミノ酸９１６〜９３７、配列番号９は配列番号３のアミノ酸９５２〜９５９、配列番号１０は配列番号３のアミノ酸１０２〜１５３にそれぞれ相当する。
さらに、配列番号３の一部であって、配列番号１、４、５および１０を含む配列として配列番号１１（配列番号３のアミノ酸１−１５３）を、配列番号２および６〜９を含む配列として配列番号１２（配列番号３のアミノ酸７５０〜９５９）を、それぞれ定めた。
したがって、スポット１の抗原は、以下（１ａ）−（１ｊ）の通りであってよい。
（１ａ）配列番号１および／または配列番号２で示されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号１および／または配列番号２において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質。
（１ｂ）配列番号１および／または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号３において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１ｄ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１ｅ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、あるいは、配列番号１、２、４〜１０からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質。
（１ｆ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１ｇ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９をすべて含むアミノ酸配列、あるいは配列番号１、２、４〜９において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をすべて含む、タンパク質。
（１ｈ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９をすべて含むアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１ｉ）配列番号１１および配列番号１２を含むアミノ酸配列、あるいは、配列番号１１および配列番号１２において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質。
（１ｊ）配列番号１１および配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
上記（１ａ）〜（１ｊ）のタンパク質には、リン酸化や糖鎖修飾、アミノアシル化、開環、脱アミノ化などにより当該タンパク質のアミノ酸残基が修飾を受けているタンパク質もまた、含まれる。
上記（１ａ）〜（１ｊ）のタンパク質は、上記「抗原の特定」の項目に記載した条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａ、好ましくは分子量４０ｋＤａ〜４７ｋＤａ、より好ましくは分子量４２〜４７ｋＤａ付近のスポットとして現れるタンパク質であってよい。当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、等電点５〜９、好ましくは６〜８のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。あるいは、当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａ、好ましくは分子量４０ｋＤａ〜４７ｋＤａ、より好ましくは分子量４２〜４７ｋＤａ付近、および等電点５〜９、好ましくは６〜８のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。
好ましくは、上記（１ａ）〜（１ｊ）のタンパク質は、ウズラの卵に対するアレルギーの原因となる。
・スポット２の抗原
スポット２の抗原について、質量分析による配列同定を行った。その結果、以下のアミノ酸配列が検出された。
PRMQVFVTNLTDSSK（配列番号１３）
LCADASVLNAHK（配列番号１５）
TVQLAGVDSK（配列番号１６）
また、上記のスポットについて質量分析計から得られた質量データをＮＣＢＩで解析したところ、メレアグリス・ガロパボ（Meleagris gallopavo）由来のvitellogenin-2タンパク質（配列番号１４）がヒットした。配列番号１３は配列番号１４のアミノ酸１４１７〜１４３１、配列番号１５は配列番号１４のアミノ酸１４３４〜１４４５、配列番号１６は配列番号１４のアミノ酸１７７９〜１７８８、にそれぞれ相当する。
さらに、配列番号１４の一部であって、配列番号１３及び１５を含む配列として配列番号１７（配列番号１４のアミノ酸１４１７−１４４５）を定めた。
したがって、スポット２の抗原は、以下（２ａ）−（２ｊ）の通りであってよい。
（２ａ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号１３において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質。
（２ｂ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２ｃ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１４において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２ｄ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２ｅ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、あるいは、配列番号１３、１５および１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質。
（２ｆ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２ｇ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６をすべて含むアミノ酸配列、あるいは、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をすべて含む、タンパク質。
（２ｈ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６をすべて含むアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２ｉ）配列番号１７および配列番号１６を含むアミノ酸配列、あるいは、配列番号１７および配列番号１６において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、を含むタンパク質。
（２ｊ）配列番号１７および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは７０％、８０％、９０％または９５％の同一性、を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
上記（２ａ）〜（２ｊ）のタンパク質には、リン酸化や糖鎖修飾、アミノアシル化、開環、脱アミノ化などにより当該タンパク質のアミノ酸残基が修飾を受けているタンパク質もまた、含まれる。
上記（２ａ）〜（２ｊ）のタンパク質は、上記「抗原の特定」の項目に記載した条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、好ましくは分子量３０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、より好ましくは分子量３２〜３７ｋＤａ付近のスポットとして現れるタンパク質であってよい。当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、等電点７〜１２、好ましくは８〜１０のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。あるいは、当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、好ましくは分子量３０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、より好ましくは分子量３２〜３７ｋＤａ付近および等電点７〜１２、好ましくは８〜１０のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。
好ましくは、上記（２ａ）〜（２ｊ）のタンパク質は、ウズラの卵に対するアレルギーの原因となる。
本明細書において、アミノ酸配列について「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された」という場合は、対象となるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸（例えば、アミノ酸配列の全長に対して４０％、好ましくは３０％、２０％、１０％または５％のアミノ酸）が欠失しているか、他のアミノ酸置換されているか、他のアミノ酸が挿入されているか、および／または他のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列をいう。
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。以下に、アミノ酸残基の保存的置換について置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、
Ｅ群：セリン、スレオニン
Ｆ群：フェニルアラニン、チロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができる。例えば、不用意な糖鎖修飾を排除するために上記のＢ、Ｄ、Ｅ群のアミノ酸をそれ以外の群のアミノ酸に置換してもよい。または、３次構造でタンパク質中に折りたたまれることを防ぐためにシステインを欠失させるか、他のアミノ酸に置換してもよい。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（J. Kyte 及びR. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982）を考慮して、アミノ酸を置換してもよい。
本明細書において、２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）、及びＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894；Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI（Infomax）等のプログラムを用いて決定することもできる。
抗原は、ウズラ卵黄から当業者に周知のタンパク質精製方法を組み合わせて分離・精製することによって得てもよい。または、抗原は、当業者に周知の遺伝子組換え技術により抗原を組換えタンパク質として発現させ、そして当業者に周知のタンパク質精製方法により分離・精製することによって得てもよい。
タンパク質の精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGEなど分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
遺伝子組換え技術によるタンパク質の調製は、抗原をコードする核酸を含む発現ベクターを調製し、当該発現ベクターを適切な宿主細胞中に遺伝子導入または形質転換により導入し、当該宿主細胞を組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養し、そして当該宿主細胞中で発現された組換えタンパク質を回収することにより行う。
「ベクター」は、それに連結させた核酸を宿主細胞内に導入するために用いることが可能な核酸であり、「発現ベクター」はベクターにより導入された核酸がコードするタンパク質の発現を導くことが可能なベクターである。ベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が含まれる。当業者は、使用する宿主細胞の種類に応じて、組換えタンパク質の発現に適切な発現ベクターを選択することができる。
「宿主細胞」は、ベクターにより遺伝子導入または形質転換を受ける細胞である。宿主細胞は、使用するベクターに応じて当業者が適切に選択することができる。宿主細胞は、例えば、大腸菌（E. coli）などの原核生物由来のであることが可能である。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、本発明の抗原は、原核細胞内での組換えタンパク質の発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。このＮ末端メチオニンは、発現後に組換えタンパク質から切り離すこともできる。あるいは、酵母などの単細胞真核生物、植物細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）などの、真核生物由来の細胞であることが可能である。
発現ベクターの宿主細胞への遺伝子導入または形質転換は、当業者に公知の手法により適宜行うことができる。また、当業者は、宿主細胞の種類に応じて組換えタンパク質の発現に適する条件を適宜選択し、宿主細胞を培養することにより組換えタンパク質を発現させることができる。そして、組換えタンパク質を発現した宿主細胞をホモジナイズし、得られたホモジネートから上述したタンパク質の精製方法を適宜組み合わせて行うことにより、組換えタンパク質として発現された抗原を分離・精製することができる。
診断キット・診断方法
本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原に接触させる；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される；
を含む、前記方法を提供する。
対象から得られた試料とは、対象から採取されたＩｇ抗体、より好ましくはＩｇＥ抗体、が含まれる溶液である。そのような溶液には、例えば、血液、唾液、痰、鼻水、尿、汗、涙が含まれる。対象から得られた試料は、抗原に接触させる前に、試料中のＩｇ抗体濃度を高めるための前処理が施されていてもよい。試料の前処理としては、例えば血液から血清を得ることが含まれてもよい。特に好ましい態様において、上記工程（ｉ）は、対象から得られた血清中のＩｇＥ抗体と抗原を接触させることにより行われる。
対象から得られた試料と抗原との接触およびその結合の検出は、既知の方法により行うことが可能である。そのような方法には、例えば、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorvent Assay）、サンドイッチ免疫測定法、イムノブロット、免疫沈降法による検出を用いることができる。これらはいずれも、抗原に対象のＩｇＥ抗体を接触させて結合させ、抗原に特異的に結合したＩｇＥ抗体に対して酵素標識した二次抗体を作用させ、酵素の基質（通常は、発色あるいは発光試薬）を加えて酵素反応の生成物を検出することにより、抗原と対象のＩｇＥ抗体の結合を検出する手法である。
抗原は、単離された抗原が担体に固定されている状態であってもよい。この場合は上記工程（ｉ）および（ｉｉ）においてＥＬＩＳＡやサンドイッチ免疫測定法が利用でき、また、上記工程（ｉ）では、対象から得られた試料を抗原を固定した面に接触させることにより行う。単離された抗原は、ウズラ卵黄から当業者に周知のタンパク質精製方法を組み合わせて分離・精製することによって、または遺伝子組換え技術により調製することによって得てもよい。
また、抗原は２次元電気泳動により分離した状態からイムノブロットによる検出を行ってもよい。２次元電気泳動は、１次元目に等電点電気泳動、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行うことで、タンパク質試料を分離する手法である。この場合、２次元電気泳動の条件は、本願発明の抗原が分離できる条件であれば特に限定されない。例えば、上記「抗原の特定」の項目において記載した２次元電気泳動の条件を利用できる。あるいは、上述の特許文献１〜４の記載を参考にして電気泳動の条件を定めることもでき、例えば、以下：
（Ａ）１次元目の等電点電気泳動ゲルとして、ゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内であって、ゲルのｐＨ範囲が３〜１０であり、泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配が、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５〜７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合において、「ａ＜ｂ］及び「ｂ＞ｃ」の関係を満たす；
（Ｂ）（Ａ）の場合であって、ゲルの全長を１とした場合、ａが０．１５〜０．３の範囲内、ｂが０．４〜０．７の範囲内、ｃが０．１５〜０．３の範囲内である；
（Ｃ）１次元目の等電点電気泳動において、検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分あたりの泳動変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇行程を始める；
（Ｄ）（Ｃ）の場合に、電圧上昇工程の最終電圧を３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内とする；
（Ｅ）１次元目の等電点電気泳動ゲルの長手方向のゲル長が５〜１０ｃｍであって、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度を３〜６％とする；および
（Ｆ）（Ｅ）の場合に、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向先端側の部分のゲル濃度が、泳動方向基端部のゲル濃度よりも高く設定する；
からなる群より選択される少なくとも１つを満たす条件で２次元電気泳動を行うことができる。
上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原は、ウズラの卵に対するアレルギーの患者のＩｇＥ抗体と特異的に結合する抗体である。したがって、対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される。
本発明はまた、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含むウズラの卵に対するアレルギーの診断キットを提供する。本発明の診断キットは、上記のウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法、または下記の診断方法に用いてもよい。本発明の診断キットは、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含むほか、酵素標識された抗ＩｇＥ抗体および当該酵素の基質となる発色基質または発光基質を含んでいてもよい。また、蛍光標識された抗ＩｇＥ抗体を用いてもよい。本発明の診断キットにおいて、抗原は担体に固定化された状態で提供されてもよい。本発明の診断キットはまた、診断のための手順についての説明書や当該説明を含むパッケージと共に提供されてもよい。
本発明はまた、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含むウズラの卵に対するアレルギーの診断用組成物を提供する。本発明の診断用組成物は、下記の診断方法に用いることができる。本発明の診断用組成物は、必要に応じて本発明の抗原とともに一般的に用いられる、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。
一態様において、本発明は、対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原に接触させる；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであると判断する；
ことを含む、前記方法を提供する。ここにおいて（ｉ）および（ｉｉ）の各工程は、ウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法の各工程について説明したとおりに行われる。
別の態様において、本発明は、対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断する方法であって、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を対象に投与することを含む、前記方法を提供する。当該方法は、皮膚に抗原を適用することを特徴とする皮膚テストの形式で行ってもよい。皮膚テストには、皮膚上に診断用組成物を適用した後に、出血しない程度に微少な傷をつけることで皮膚に抗原を浸透させて皮膚反応を観察するプリックテスト、診断用組成物を適用した上に皮膚を少し引っ掻いて反応を観察するスクラッチテスト、クリームや軟膏などの形態の診断用組成物を皮膚に適用して反応を観察するパッチテスト、抗原を皮内に投与して反応を観察する皮内テスト、などの形態が含まれる。抗原を適用した部分の皮膚に腫れなどの皮膚反応が生じた場合、その対象はウズラの卵に対するアレルギーを有すると診断する。ここで、皮膚に適用する抗原の量は、例えば、１回あたり１００μｇ以下の用量であってよい。
また別の態様において、本発明はウズラの卵に対するアレルギーの診断に使用するための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を提供する。
さらなる別の態様において、本発明はウズラの卵に対するアレルギーの診断薬の製造のための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原の使用を提供する。
医薬組成物・治療方法
本発明は、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含む医薬組成物を提供する。一態様において、上記の医薬組成物は、ウズラの卵に対するアレルギーを治療するために用いられる。
本発明はまた、ウズラの卵に対するアレルギーの治療を必要とする患者に対して、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を投与することを含む、ウズラの卵に対するアレルギーを治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明はウズラの卵に対するアレルギーの治療に使用するための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を提供する。さらに別の態様において本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーの治療薬の製造のための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原の使用を提供する。
アレルギーの治療においては、患者に抗原を投与することで免疫寛容へと誘導することを目標とした、減感作療法がしばしば行われている。上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原は、ウズラの卵に対するアレルギーに対する減感作療法や負荷試験のための有効成分として用いることができる。
本発明の医薬組成物は、通常の投与経路により投与することができる。通常の投与経路には例えば、経口、舌下、経皮、皮内、皮下、血液内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内の投与が含まれる。
本発明の医薬組成物は、必要に応じて本発明の抗原と共に、一般的に用いられる薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、または各種の添加剤（例えば安定剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、保存剤、着色剤等）を常法により添加した医薬組成物として用いることができる。医薬組成物の剤型は、投与経路に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、注射剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、液剤、クリーム剤、ローション剤、等の形態であってよい。本発明の医薬組成物の投与量、投与回数および／または投与期間は、投与経路、症状、年齢や体重などの患者の特性等に応じて医師が適宜選択することができる。例えば、成人の場合、１回あたり１００μｇ以下の用量で投与してもよい。投与間隔は、例えば、毎日、毎週１回、月に２回、又は３ヶ月に１回程度であってよい。投与期間は例えば、数週間から数年であってよい。投与期間内において、投与量を段階的に増加させる投与方法であってもよい。
アレルゲン除去食品等
本発明は、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原が除去されていることを特徴とするウズラ卵またはウズラ卵加工品を提供する。
ウズラ卵またはウズラ卵加工品において本発明の抗原を除去する方法は限定されない。抗原の除去は、本発明の抗原が除去される限り、いかなる方法によって行われてもよい。
例えば、本発明の抗原が除去されたウズラ卵は、遺伝子ノックアウト技術を用いて、本発明の抗原の発現がノックアウトされたウズラ卵を調製してもよい。
本発明の抗原が除去されたウズラ卵加工品は、本発明の抗原が除去されたウズラ卵を原料とした加工品であってもよい。通常のウズラ卵を原料とする場合は、ウズラ卵加工品の調製前または調製後に本発明の抗原を除去する処理を行う。通常のウズラ卵を原料としたウズラ卵加工品において本発明の抗原を除去する方法として、例えば特許３６５３１３２に記載のように高圧処理および中性塩溶液による抗原タンパク質の溶出により除去する方法や、高温スチームをあてて食品のタンパク質成分を除去する方法が挙げられる。
以下に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって限定されない。
実施例１：タンパク質パターンの確認
下記の二次元電気泳動方法を使用して、うずら卵に含まれるタンパク質を調べた。
タンパク質の抽出
市販のうずら卵を購入し、卵白と卵黄に分けた。卵白、卵黄それぞれ１００μｌに、タンパク質抽出用試薬であるmammalian cell lysis kit；MCL1（SIGMA−ALDRICH社製）１０００μｌを加え、２５℃で１０分間、ボルテックスを使用して振とう抽出した。この振とう抽出の後、タンパク質抽出液を回収した。上記のmammalian cell lysis kit；MCL1の組成は下記の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミントリ酢酸）
２５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
０．５％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム
１％（ｖ／ｖ） Igepal CA-630（SIGMA−ALDRICH社製の界面活性剤(Octylphenoxy)polyethoxyethanol)
適量のプロテアーゼ阻害剤
その後、2D-CleanUPキット（ＧＥ社製）を使用して２回の沈殿操作を行った。第１回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿（ＴＣＡ沈殿）を回収した。第２回目の沈殿操作は、回収した前記ＴＣＡ沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿（検体）を回収した。
検体溶液の調製
得られた検体の一部（タンパク質重量として３０μｇ）を、１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）１５０μｌに溶解し、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
７Ｍ チオ尿素
２Ｍ 尿素
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ：
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホナート
０．５％（ｖ／ｖ） ＩＰＧバッファー；ＧＥ社製
適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）
１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透
１次元目等電点電気泳動用ゲル（ＧＥ社製：ＩＰＧゲルImmobiline Drystrip (pH3-10NL)）を前記した１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨張用検体溶液）１４０μｌに浸漬し、一晩室温にて浸透させた。
本実施例においては、電気泳動機器としてＧＥ社製のIPGphorを使用した。
泳動トレーにシリコンオイルを満たした。検体を浸透させたゲルの両端に水で湿らせた濾紙を設け、ゲルをシリコンオイルに覆われるよう、泳動トレーにセットし、ゲルとの間に当該濾紙を挟んだ状態で電極をセットした。
等電点電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで定電圧工程を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流変化幅が５μＡであった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。
等電点電気泳動ゲルのＳＤＳ平衡化
上記の１次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、１５分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ 尿素
３０％（ｖ／ｖ） グリセロール
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１％（ｗ／ｖ） ＤＴＴ
次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、１５分・室温にて振とうし、ＳＤＳ平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ 尿素
３０％（ｖ／ｖ） グリセロール
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
２．５％（ｗ／ｖ） ヨードアセトアミド
２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本実施例においては、電気泳動機器としてlife technologies社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。２次元目泳動用ゲルはlife technologies社製NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
５０ｍＭ ＭＯＰＳ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１ｍＭ ＥＤＴＡ
また、本実施例においては泳動用緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製）と適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェル中を十分に上記泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次に、ウェルの中に充分に溶解させた接着用アガロース溶液を添加した。次に、ＳＤＳ平衡化したゲルをアガロース中に浸漬させ、ピンセットでＳＤＳ平衡化したゲルと２次元目泳動用ゲルを密着させた。当該両ゲルが密着した状態でアガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
ゲルの蛍光染色
SYPRO Ruby（life technologies社製）を用いてゲルの蛍光染色を行った。
まず、使用する密閉容器を事前に９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで十分に洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ機器から泳動後の２次元目泳動用ゲルを取り外して、洗浄した密閉容器におき、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液に３０分間浸漬する処理を２回行った。その後、当該水溶液を水に置換し、１０分間浸漬した。次に、２次元目泳動用ゲルを４０ｍｌのSYPRO Rubyに浸漬し、室温で一晩振とうした。次に、SYPRO Rubyを除き、２次元目泳動用ゲルを水で洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液で３０分間振とうした。更に当該水溶液を水に置換し、３０分以上振とうした。
解析
上記一連の処理を施した２次元目泳動用ゲルをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。２次元電気泳動の結果を図１に示す。図の左側には、分子量マーカーのバンドが見られ、バンドの位置が特定の分子量（ＫＤａ）を示す。
実施例２：イムノブロットでの抗原確認
イムノブロットでの抗原確認は、実施例１に記載した手順を「２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ」まで行った後、以下の「メンブレンへの転写」「イムノブロット」「解析」の操作を行うことにより行った。
メンブレンへの転写
メンブレンへの転写は、以下の転写装置及び転写用緩衝液を用いて行った。
転写装置：XCell SureLock Mini-Cell およびXCell IIブロットモジュール（life technologies社製）
転写用緩衝液： NuPAGEトランスファーバッファー（×２０）（life technologies社製）をmilliQ水で20倍希釈して使用した。
具体的には以下の手順に従って二次元電気泳動ゲル中のタンパク質をメンブレン（ＰＶＤＦ膜）へ転写した。
（１）ＰＶＤＦ膜を、１００％メタノールに浸漬し、次にmilliQ水に浸漬し、その後、転写用緩衝液に移して、ＰＶＤＦ膜の親水化処理を行った。
（２）スポンジ、ろ紙、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥが終わったゲル、親水化処理済みＰＶＤＦ膜、ろ紙、スポンジの順でセットし、転写装置中、３０Ｖ定電圧で１時間通電した。
イムノブロット
メンブレンのイムノブロットを、１次抗体としてウズラの卵に対するアレルギーを有する患者の血清または健康被験者の血清を用いて行った。このウズラ卵アレルギーの患者は、鶏卵に対してはアレルギー反応を示さず、ウズラの卵に対してのみアレルギー反応を示す患者である。
メンブレンのイムノブロットは、以下の手順に従って行った。
（１）転写したメンブレンを５％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液（非イオン界面活性剤Tween 20を０．３％含むＰＢＳバッファー）中、室温で１時間振とうした。
（２）１次抗体として、３％血清／５％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液中、室温で１時間静置した。
（３）ＰＢＳＴ溶液で洗浄した（５分×３回）。
（４）２次抗体として抗ヒトＩｇＥ−ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）を３％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液で２５００倍に希釈した溶液中、室温で１時間静置した。
（５）ＰＢＳＴ溶液で洗浄した（５分×３回）。
（６）Pierce Western Blotting Substrate Plus（Thermo社製）で、５分間静置した。
解析
上記一連の処理を施したメンブレンをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。
ウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットを、対照である健康被験者の血清を用いたイムノブロットと比較した。ウズラ卵黄のイムノブロットにおいてウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いた場合に、健康被験者の血清を用いた場合とは異なる４箇所のスポットが検出された（図２）。
実施例３：インヒビション試験
実施例２においてウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いた場合に検出されたスポットが、ウズラ卵黄に特異的なスポットであることを確認するために、実施例２のイムノブロットを行う前に、鶏卵卵黄を用いたインヒビション試験を行った。
具体的には、実施例２のイムノブロットの工程（２）の前に、血清７５μｌに鶏卵卵黄のＭＣＬ１抽出物（タンパク質量で１ｍｇ）を混和して室温で１時間静置したものを血清として用いて、実施例２と同様にイムノブロットを行った。
その結果、分子量４５ｋＤａ付近、等電点５〜９のスポット、および分子量３５ｋＤａ付近、等電点７〜１２のスポットが、ウズラ卵アレルギーの患者の血清が、ウズラ卵黄のタンパク質に対して特異的に結合するものであることが明らかとなった（図３上段）。すなわち、これら２つのスポットは、ウズラの卵に対するアレルギーの抗原を示すものであることが裏付けられた。
また、より正確を期すため、鶏卵卵黄についての２次元ゲル電気泳動に対して、ウズラ卵黄でインヒビションを行ったイムノブロットも行った。
具体的には、鶏卵卵黄について、実施例１と同様の手順で２次元ゲル電気泳動を行った。そして、実施例２のイムノブロットの工程（２）の前に血清７５μｌにウズラ卵黄のＭＣＬ１抽出物（タンパク質量で１ｍｇ）を混和して室温で１時間静置したものを血清として用いて、実施例２と同様にイムノブロットを行った。
ウズラ卵アレルギーの患者の血清を予めウズラ卵黄で処理した場合には、イムノブロットは健康被験者と同じパターンを示し、ウズラ卵アレルギーの患者に特異的なスポットは現れなかった（図３下段）。
実施例４：質量分析
実施例３で同定された２つのスポットを生じる抗原について、質量分析によるアミノ酸配列の同定を行った。
具体的には、以下の手順でタンパク質の抽出および質量分析を行った。
（１）ウズラ卵黄について、実施例２の手順に従ってタンパク質抽出、２次元電気泳動及びメンブレン転写を行い、０．００８％Direct blue／４０％エタノール・１０％酢酸で振とうにより染色した。
（２）その後、４０％エタノール・１０％酢酸で５分間の処理を３回行って脱色し、水で５分間洗浄後、風乾した。
（３）目的のスポットをきれいなカッター刃で切り取り、遠心チューブに入れた。５０μＬのメタノールでメンブレン親水処理後、１００μＬの水で２回洗浄後遠心除去し、２０μＬの２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３・５０％アセトニトリルを加えた。
（４）１ｐｍｏｌ／μＬリシルエンドペプチダーゼ（ＷＡＫＯ）１μＬを加え、３７℃で６０分間静置した後、溶液を新しい遠心チューブに回収した。２０μＬの２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３・７０％アセトニトリルをメンブレンに加え、室温にて１０分間浸し、さらに回収した。０．１％ギ酸、４％アセトニトリル１０μＬで溶解し、チューブに移した。
（５）回収した溶液を減圧乾燥した後、Ａ液（０．１％ギ酸、４％アセトニトリル溶液）１５μｌで溶解し、質量分析（ESI-TOF5600, AB Sciex社製）を行った。
（６）質量分析計から得られた質量データに基づくタンパク質の同定は、ＮＣＢＩをサーチすることで行った。
結果
本実施例の条件の２次元電気泳動で、分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａ、等電点５〜９の位置に現れるスポットについて、質量分析を行ったところ、配列番号１、２、４〜１０のアミノ酸配列が検出された。このスポットについて質量分析計から得られた質量データをＮＣＢＩで解析したところ、メレアグリス・ガロパボ（Meleagris gallopavo）由来のvitellogenin-1-likeタンパク質（配列番号３）がヒットした。
また、本実施例の条件の２次元電気泳動で、分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、等電点７〜１２の位置に現れるスポットについて、質量分析を行ったところ、配列番号１３、１５及び１６のアミノ酸配列が検出された。このスポットについて質量分析計から得られた質量データをＮＣＢＩで解析したところ、メレアグリス・ガロパボ（Meleagris gallopavo）由来のvitellogenin-2タンパク質（配列番号１４）がヒットした。
本発明により、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原、ウズラの卵に対するアレルギーの診断方法および診断キット、当該抗原を含む医薬組成物、ならびに当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品を提供することができる。

Claims (7)

  1. ウズラの卵に対するアレルギーの診断キットであって、二次元電気泳動において分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点５〜９のスポットとして現れ、そして、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むウズラ由来のタンパク質、を抗原として含む、前記診断キット。
  2. ウズラの卵に対するアレルギーの診断キットであって、二次元電気泳動において分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点７〜１２のスポットとして現れ、そして、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むウズラ由来のタンパク質、を抗原として含む、前記診断キット。
  3. 対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
    （ｉ）対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はＩｇ抗体が含まれる溶液である；
    （ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
    （ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される；
    を含み、ここで当該抗原は以下のウズラ由来のタンパク質：
    （１）二次元電気泳動において分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点５〜９のスポットとして現れ、そして、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；または
    （２）二次元電気泳動において分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点７〜１２のスポットとして現れ、そして、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質；
    である、前記方法。
  4. ウズラの卵に対するアレルギーの診断用組成物であって、以下のウズラ由来のタンパク質：
    （１）二次元電気泳動において分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点５〜９のスポットとして現れ、そして、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；または
    （２）二次元電気泳動において分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点７〜１２のスポットとして現れ、そして、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質；
    を抗原として含む、前記診断用組成物。
  5. 以下のウズラ由来のタンパク質：
    （１）二次元電気泳動において分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点５〜９のスポットとして現れ、そして、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；または
    （２）二次元電気泳動において分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点７〜１２のスポットとして現れ、そして、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質；
    を含む、医薬組成物。
  6. ウズラの卵に対するアレルギーを治療するための、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 抗原が除去されていることを特徴とするウズラ卵加工品であって、ここで当該抗原は以下のウズラ由来のタンパク質：
    （１）二次元電気泳動において分子量３５ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点５〜９のスポットとして現れ、そして、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；または
    （２）二次元電気泳動において分子量３０ｋＤａ〜５０ｋＤａおよび等電点７〜１２のスポットとして現れ、そして、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質；
    である、前記ウズラ卵加工品。
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