WO2016190376A1 - ウズラの卵アレルギーの抗原 - Google Patents

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WO2016190376A1
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antigen
protein
seq
amino acid
quail
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PCT/JP2016/065522
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佳世子 松永
晶子 矢上
近藤　康人
和宏 原
政志 中村
祐治 青木
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ホーユー株式会社
学校法人藤田学園
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L15/00—Egg products; Preparation or treatment thereof
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a novel antigen for allergy to quail eggs.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit, diagnostic composition, and diagnostic method for allergy to quail eggs.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the antigen, a quail egg or a quail egg processed product from which the antigen has been removed, and a tester for determining the presence or absence of the antigen.
  • IgE antibodies specific for specific antigens are produced in the serum and tissues of allergic patients. Allergic reactions are triggered by the physiological results produced by the interaction of this IgE antibody with a specific antigen.
  • a conventional antigen reagent does not necessarily contain a specific antigen protein (allergen component) that causes an allergic reaction alone, but includes a plurality of protein components. Accordingly, in the conventional antigen reagent, the content differs for each allergen component. For this reason, in allergic tests, only when allergen components contain a protein whose content exceeds a threshold that allows a positive reaction to be determined for binding to an IgE antibody among many proteins contained in a conventional antigen reagent. It was possible to detect a positive reaction. Conversely, patients with IgE antibodies bound to an allergen component with a low content in allergens such as foods were in a state where a positive reaction could not be determined even using conventional allergy testing agents.
  • allergic symptoms and severity of allergic reactions do not necessarily correlate with the allergen component content. Even when the patient's IgE antibody reacts with allergen components contained in a trace amount in the food / material of the allergen candidate, allergic symptoms may appear or may be related to the severity.
  • purification methods using the difference in charge and molecular weight of protein and nucleic acid residues have been studied.
  • Examples of the purification method using charges include column chromatography using an ion exchange resin and isoelectric focusing.
  • Examples of the purification method using the difference in molecular weight include centrifugation, column chromatography by molecular weight sieving, and SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis).
  • JP 2002-286716 A JP2011-33544 JP2011-33546A JP2011-33547 JP2011-33548
  • the present invention provides a novel antigen for allergy to quail eggs.
  • the present invention also provides a diagnostic method and diagnostic kit for allergy to quail eggs.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing the antigen, a quail egg or a quail egg processed product from which the antigen has been removed, and a tester for determining the presence or absence of the antigen.
  • the present inventors have conducted intensive research on identifying allergens causing allergies to quail eggs. As a result, the inventors succeeded in identifying an antigen that specifically binds to an IgE antibody in the serum of a patient having quail egg allergy. Based on this finding, the present invention has been completed.
  • the present invention may be as follows.
  • a kit for diagnosis of allergy to quail eggs wherein at least one of the following proteins (1) or (2): (1) (1A) Vitellogenin-1 (Vitellogenin-1) protein or a variant thereof, and any one of the following proteins (1A-a) to (1A-e): (1A-a) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in SEQ ID NO: 18; (1A-b) a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18; (1A-c) a protein comprising an amino acid sequence encoded by a base sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in SEQ ID NO: 17; (1A-d) a protein comprising an amino acid sequence encoded by a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 17; or (1A-e) complementary to the following proteins (1) or (2): (1) (1
  • a composition for diagnosing allergies to quail eggs wherein the composition comprises at least one of the proteins specified as (1) or (2) in [1] as an antigen.
  • a method for providing an index for diagnosing allergy to a quail egg of a subject comprising the following steps: (I) contacting a sample obtained from a subject with an antigen, wherein the sample is a solution containing Ig antibodies; (Ii) detecting binding between the IgE antibody and the antigen in a sample obtained from the subject; (Iii) if binding of the subject IgE antibody to the antigen is detected, an indication is provided that the subject is allergic to quail eggs; Wherein the antigen is at least one of the proteins identified as (1) or (2) in [1] above.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one of the proteins specified as (1) or (2) in [1] above.
  • Presence / absence of an antigen that causes allergy to quail eggs in a subject comprising an antibody that binds to at least one of the proteins specified as (1) or (2) in [1] above Tester for judging.
  • a quail-derived antigen which is a protein specified as (1) or (2) in [1] above and causes allergy to quail eggs.
  • the present invention can provide a novel antigen for allergy to quail eggs. Since an antigen (allergen component) causing quail egg allergy is identified in the present invention, a highly sensitive diagnostic method and diagnostic kit for allergy to quail eggs, a pharmaceutical composition containing the antigen, and a quail from which the antigen has been removed A processed egg or quail egg product and a tester for determining the presence or absence of the antigen can be provided.
  • an antigen allergen component
  • a highly sensitive diagnostic method and diagnostic kit for allergy to quail eggs a pharmaceutical composition containing the antigen, and a quail from which the antigen has been removed
  • a processed egg or quail egg product and a tester for determining the presence or absence of the antigen can be provided.
  • FIG. 1 is a photograph of a gel showing a protein migration pattern by two-dimensional electrophoresis for proteins contained in egg yolk and egg white of quail eggs.
  • the photograph on the left is a two-dimensional electrophoresis pattern of quail egg yolk protein
  • the photograph on the right is a two-dimensional electrophoresis pattern of quail egg white protein.
  • the band on the left side of each photograph is a molecular weight marker band.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of immunoblotting performed on a two-dimensional electrophoresis pattern of proteins contained in egg yolk and egg white of quail eggs.
  • the upper row is an immunoblot for quail egg yolk protein
  • the lower row is an immunoblot for quail egg white protein.
  • the right side is an immunoblot using serum from a quail egg allergy patient
  • the left side is an immunoblot using serum from a healthy subject. Arrows indicate spots where sera from patients with quail egg allergy specifically reacted.
  • FIG. 3 is a photograph of an immunoblot showing the results of an inhibition test.
  • the upper right side is an immunoblot using serum from a quail egg allergic patient who has been incubated with chicken egg yolk against a two-dimensional electrophoresis pattern of quail egg yolk protein. Arrows indicate spots where sera from patients with quail egg allergy specifically reacted.
  • the upper left is an immunoblot using the serum of a healthy subject who has been incubated with chicken egg yolk against a two-dimensional electrophoresis pattern of quail egg yolk protein.
  • the lower right side is an immunoblot using the serum of a quail egg allergic patient that has been incubated with quail egg yolk against the two-dimensional electrophoresis pattern of chicken egg yolk protein
  • the lower left side is the two-dimensional chicken egg yolk protein. It is an immunoblot using the serum of the healthy test subject who performed the electrophoresis pattern with quail yolk.
  • allergy refers to a state in which a hypersensitivity reaction unfavorable to the living body, which occurs when the antigen enters the living body sensitized to a certain antigen again.
  • IgE antibodies specific for antigens are produced in blood and tissues. IgE antibodies bind to mast cells or basophils. When the antigen specific to the IgE antibody enters the body of the allergic disease patient again, the antigen is combined with the IgE antibody bound to mast cells or basophils, and the IgE antibody is cross-linked on the cell surface. -Produces the physiological effects of antigen interactions.
  • allergy to quail eggs refers to a state having an allergic reaction caused by using proteins contained in quail eggs as antigens. Allergy to quail eggs can cause an allergic reaction when in contact with an antigen contained in quail eggs or when the antigen is ingested. In general, an allergic reaction that occurs when food is ingested is called food allergy.
  • the allergy to quail eggs may be food allergy.
  • an antigen is a substance that induces an allergic reaction and is also referred to as an allergen component.
  • the antigen is preferably a protein.
  • a protein is a molecule having a structure in which natural amino acids are linked by peptide bonds.
  • the number of amino acids contained in the protein is not particularly limited, but a protein in which about 2 to 50 amino acids are linked by peptide bonds may be called a peptide.
  • L form is shown unless otherwise specified.
  • the protein or peptide amino acid sequence notation used herein is based on standard usage and conventions commonly used in the art and is represented by a single letter of amino acid, the left direction is the amino terminal direction, and The right direction is the carboxy terminal direction.
  • Antigen identification With regard to proteins contained in quail eggs, antigens that cause allergies to quail eggs were identified using the above-described method. Specifically, quail egg yolk protein was subjected to two-dimensional electrophoresis under the following conditions.
  • the first dimension electrophoresis is an isoelectric focusing gel
  • the gel length is in the range of 5-10 cm
  • the gel pH range is 3-10
  • the pH gradient of the gel with respect to the migration direction is
  • a gel length up to pH 5 is a
  • a gel length of pH 5-7 is b
  • a gel length of pH 7 or higher is c
  • a is in the range of 0.15-0.3
  • b Is a gel having a range of 0.4 to 0.7
  • c is in a range of 0.15 to 0.3.
  • Isoelectric focusing was carried out using an IPG gel Immobiline® Drystrip® (pH 3-10NL).
  • IPGphor manufactured by GE was used as the electrophoresis apparatus.
  • the upper limit of the current value of the electrophoresis apparatus is set to 75 ⁇ A per gel, and the voltage program is (1) a constant voltage process is performed at a constant voltage of 300 V up to 750 Vhr (the current change width for 30 minutes before the end of the process is (2) Gradually increase the voltage to 1000V over 300Vhr, (3) Gradually increase the voltage to 5000V over 4500Vhr, and (4) then the total Vhr to 12000 at 5000V constant voltage Until then, isoelectric focusing of the first dimension was performed.
  • the gel concentration at the base end of the migration direction is set to 3 to 6%, and the gel concentration at the tip end in the migration direction is set higher than the gel concentration at the base end of the migration direction.
  • SDS-PAGE was performed using NuPAGE 4-12% Bris-Tris Gels IPG well mini 1 mm manufactured by Life Technologies.
  • As an electrophoresis instrument XCell SureLock Mini-Cell manufactured by life Technologies was used.
  • electrophoresis was performed at 200 V constant voltage for about 45 minutes.
  • spots appearing at isoelectric points 5 to 9 in the vicinity of a molecular weight of 45 kDa (hereinafter referred to as “spot 1”)
  • spot 2 antigen a spot appearing at an isoelectric point of 7 to 12
  • spot 2 antigen is an allergy to quail eggs. It was shown to bind specifically to the patient's IgE antibody.
  • SFKPVYTDVPIEK (SEQ ID NO: 1) TFAVTRNIEDLAASK (SEQ ID NO: 2) MTPVLLPEAVPDIMK (SEQ ID NO: 3) KSVHAAFIK (SEQ ID NO: 4) PVYTDVPIEK (SEQ ID NO: 6) IQVTIQAGDQAPTKM (SEQ ID NO: 7) ALPHDKPFASGYLK (SEQ ID NO: 8) DWETNYDFK (SEQ ID NO: 9) EETNVITVSSK (SEQ ID NO: 10) IQVTIQAGDQAPTK (SEQ ID NO: 11) NTIQNVLQAWYGPDEK (SEQ ID NO: 12) RLISSLQSGIGRQLTK (SEQ ID NO: 13) SVHAAFIK (SEQ ID NO: 14) TFAVTRNIEDLAA (SEQ ID NO: 1) TFAVTRNIEDLAASK (SEQ ID NO: 2) MTPVLLPEAVPDIMK (SEQ ID NO:
  • the mass data obtained from the mass spectrometer (mass data for SEQ ID NOs: 1 to 16) were analyzed against the NCBI protein data, and vitellogenin-1 (Coturnix japonica) -derived vitellogenin-1 ( vitellogenin-1) protein (SEQ ID NO: 18) was identified as part of the protein.
  • SEQ ID NO: 1 is amino acids 329 to 341 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 2 is amino acids 213 to 228 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 3 is amino acids 229 to 243 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 4 is amino acids 305 to 313
  • SEQ ID NO: 6 is amino acids 332 to 341 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 7 is amino acids 342 to 356 of SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 8 is amino acids 20 to 33 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 9 is amino acids of SEQ ID NO: 18.
  • SEQ ID NO: 10 is amino acids 203-213 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 11 is amino acids 342-355 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 12 is amino acids 47-62 of SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NO: 13 is SEQ ID NO: 18
  • Amino acids 68 to 83 SEQ ID NO: 14 are amino acids 306 to 313 of SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 15 is SEQ ID NO: 18.
  • Amino acids 214-226, SEQ ID NO: 16 correspond respectively to amino acids 175-190 of SEQ ID NO: 18.
  • the antigen of spot 1 may be any of (1A-a) to (1A-e) and (1B) below.
  • (1A-a) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in SEQ ID NO: 18.
  • (1Ab) 70% or more, preferably 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 , A protein comprising 99% or more amino acid sequence.
  • (1A-c) a protein comprising an amino acid sequence encoded by a base sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in SEQ ID NO: 17.
  • (1A-d) 70% or more of identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, preferably 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by 99% or more of the base sequence.
  • (1A-e) A protein comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • a protein comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 16 and 18, preferably at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, A protein comprising 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 or all sequences. More preferably a protein comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 6, 8-16 and 18, preferably at least 2, 3, 4, 5, 6, A protein comprising 7, 8, 9, 10, 11, 12 or all sequences.
  • amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 16 and 18 one or several amino acids may be deleted, substituted, inserted or added.
  • the amino acid residues of the protein are modified by phosphorylation, sugar chain modification, aminoacylation, ring opening, deamination, etc. Proteins that are also included.
  • the proteins (1A-a) to (1A-e) and (1B) have molecular weights of 35 kDa to 50 kDa in gels subjected to two-dimensional electrophoresis under the conditions described in the above-mentioned “Identification of antigen”, It may be a protein that appears as a spot with a molecular weight of 40 kDa to 47 kDa, more preferably a spot with a molecular weight of 42 to 47 kDa.
  • the protein may be a protein that appears as a spot having an isoelectric point of 5 to 9, preferably 6 to 8, in a gel when two-dimensional electrophoresis is performed under the above conditions.
  • the protein has a molecular weight of 35 kDa to 50 kDa, preferably a molecular weight of 40 kDa to 47 kDa, more preferably a molecular weight of 42 to 47 kDa, and an isoelectric point of 5 to 9 in a gel obtained by performing two-dimensional electrophoresis under the above conditions.
  • it may be a protein that appears as 6-8 spots.
  • the proteins (1A-a) to (1A-e) and (1B) above cause allergies to quail eggs.
  • LCADASVLNAHK SEQ ID NO: 19
  • TVQLAGVDSK SEQ ID NO: 20
  • AEAPSAVLNNLK SEQ ID NO: 21
  • GGLQLVVFADTDSVK SEQ ID NO: 22
  • SEQ ID NO: 19 is amino acids 50 to 61 of SEQ ID NO: 24
  • SEQ ID NO: 20 is amino acids 395 to 404 of SEQ ID NO: 24
  • SEQ ID NO: 21 is amino acids 191 to 202 of SEQ ID NO: 24
  • SEQ ID NO: 22 is amino acids 18 to 20 of SEQ ID NO: 24 32 respectively.
  • the antigen of spot 2 may be as follows (2A-a) to (2A-e) and (2B).
  • (2A-d) 70% or more of identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, preferably 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by 99% or more of the base sequence.
  • (2A-e) A protein comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, 22 and / or 24.
  • amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 19 to 22 and 24 one or several amino acids may be deleted, substituted, inserted or added.
  • the above proteins (2A-a) to (2A-e) and (2B) are modified by phosphorylation, sugar chain modification, aminoacylation, ring opening, deamination, etc. Proteins that are also included.
  • the proteins (2A-a) to (2A-e) and (2B) have molecular weights of 30 kDa to 50 kDa, when gels are subjected to two-dimensional electrophoresis under the conditions described in the above item “Identification of antigen”.
  • the protein may appear as a spot having a molecular weight of 30 kDa to 40 kDa, more preferably a molecular weight of 32 to 37 kDa.
  • the protein may be a protein that appears as a spot having an isoelectric point of 7 to 12, preferably 8 to 10 in a gel when two-dimensional electrophoresis is performed under the above conditions.
  • the protein has a molecular weight of 30 kDa to 50 kDa, preferably a molecular weight of 30 kDa to 40 kDa, more preferably around a molecular weight of 32 to 37 kDa and an isoelectric point of 7 to 12, in a gel obtained by performing two-dimensional electrophoresis under the above conditions.
  • it may be a protein that appears as 8-10 spots.
  • the proteins (2A-a) to (2A-e) and (2B) above cause allergies to quail eggs.
  • one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added” in the amino acid sequence
  • one or several amino acids for example, amino acid sequence
  • 40%, preferably 30%, 20%, 10% or 5% amino acids of the total length of the other amino acid substitutions, other amino acid substitutions, other amino acid insertions, and / or Or an amino acid sequence to which other amino acids are added.
  • substitution is preferably a conservative substitution.
  • a conservative substitution is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics, but any substitution that does not substantially change the structural characteristics of the original sequence. For example, any substitution may be made so long as the substituted amino acid does not destroy the helix present in the original sequence or other types of secondary structures characterizing the original sequence.
  • conservative substitution of amino acid residues is exemplified for each substitutable residue, but the substitutable amino acid residues are not limited to those described below.
  • Group A leucine, isoleucine, valine, alanine, methionine
  • B group aspartic acid
  • glutamic acid glutamic acid
  • C group asparagine
  • glutamine D group: lysine
  • arginine arginine
  • Group E Serine
  • Threonine Group F: Phenylalanine, Tyrosine
  • one member of the above types can be exchanged for another type of member.
  • the amino acids of the above groups B, D, and E may be substituted with amino acids of other groups.
  • cysteines may be deleted or substituted with other amino acids to prevent folding in the protein with tertiary structure.
  • the hydropathic index of amino acids J.P.
  • J.P. which is a measure of hydrophobicity / hydrophilicity for amino acids, so that the hydrophilic / hydrophobic balance is maintained or the hydrophilicity is increased to facilitate synthesis.
  • Kyte and R. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982), amino acids may be substituted.
  • the percent identity between two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity can also be determined using a computer program.
  • Examples of such computer programs include BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)), ClustalW, and the like.
  • various conditions (parameters) for identity search by the BLAST program are described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • nucleotides when “one or several nucleotides are deleted, substituted, inserted or added” in the base sequence, one or several nucleotides (for example, base sequence) in the target base sequence 30%, preferably 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2% or 1% amino acids) are deleted or substituted with other nucleotides Or a nucleotide sequence in which other nucleotides are inserted and / or other nucleotides are added. It is preferable that no frame shift occurs in the sequence encoding the amino acid due to the deletion, substitution, insertion or addition of the nucleotide.
  • the percent identity of two base sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity can also be determined using a computer program.
  • sequence comparison computer program examples include the BLASTN program (Altschul et available from the website of the National Library of Medicine: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html). al. (1990) J. ol Mol. Biol. 215: 403-10): Version 2.2.7, WU-BLAST 2.0 algorithm or the like. Standard default parameter settings for WU-BLAST 2.0 can be those described in the following Internet site: http://blast.wustl.edu.
  • under stringent conditions means to hybridize under moderately or highly stringent conditions.
  • moderately stringent conditions can be easily determined by those skilled in the art having general techniques based on, for example, the length of DNA. The basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  • moderately stringent conditions are as hybridization conditions: 1 ⁇ SSC to 6 ⁇ SSC, 42 ° C. to 55 ° C., more preferably 1 ⁇ SSC to 3 ⁇ SSC, 45 ° C. to 50 ° C.
  • the most preferable conditions are 2 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • the hybridization solution contains, for example, about 50% formamide
  • a temperature 5 to 15 ° C. lower than the above temperature is adopted.
  • Cleaning conditions include 0.5 ⁇ SSC to 6 ⁇ SSC, 40 ° C. to 60 ° C.
  • 0.05% to 0.2%, preferably about 0.1% SDS may generally be added.
  • Highly stringent conditions can also be readily determined by one skilled in the art based on, for example, the length of the DNA.
  • highly stringent conditions include hybridization and / or washing at higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • the hybridization conditions are 0.1 ⁇ SSC to 2 ⁇ SSC, 55 ° C.
  • Washing conditions include 0.2 ⁇ SSC to 2 ⁇ SSC, 50 ° C. to 68 ° C., more preferably 0.2 ⁇ SSC, 60 to 65 ° C.
  • the antigen may be obtained by separating and purifying from quail egg yolk in combination with protein purification methods well known to those skilled in the art.
  • the antigen may be obtained by expressing the antigen as a recombinant protein by a gene recombination technique well known to those skilled in the art, and separating and purifying it by a protein purification method well known to those skilled in the art.
  • Protein purification methods include, for example, methods using solubility such as salting out, solvent precipitation, methods using molecular weight differences such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-PAGE, ion exchange chromatography and hydroxylation. Methods that use charge such as apatite chromatography, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, methods that use the difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, isoelectric focusing, etc. For example, a method using the difference in electric points can be used.
  • an expression vector containing a nucleic acid encoding an antigen is prepared, the expression vector is introduced into an appropriate host cell by gene transfer or transformation, and the host cell is transformed into a recombinant protein. Culturing under conditions suitable for expression and recovering the recombinant protein expressed in the host cell.
  • a “vector” is a nucleic acid that can be used to introduce a nucleic acid linked thereto into a host cell, and an “expression vector” can direct the expression of a protein encoded by the nucleic acid introduced by the vector. It is a vector. Vectors include plasmid vectors, viral vectors and the like. One skilled in the art can select an appropriate expression vector for expression of the recombinant protein depending on the type of host cell used.
  • a “host cell” is a cell that is subjected to gene transfer or transformation with a vector.
  • the host cell can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the vector to be used.
  • the host cell can be derived from a prokaryotic organism such as, for example, E. coli.
  • the antigen of the present invention may contain an N-terminal methionine residue to facilitate expression of the recombinant protein in the prokaryotic cell. This N-terminal methionine can also be cleaved from the recombinant protein after expression.
  • it can be a cell derived from a eukaryote such as a unicellular eukaryote such as yeast, a plant cell, or an animal cell (eg, human cell, monkey cell, hamster cell, rat cell, mouse cell or insect cell). It is.
  • a eukaryote such as a unicellular eukaryote such as yeast, a plant cell, or an animal cell (eg, human cell, monkey cell, hamster cell, rat cell, mouse cell or insect cell). It is.
  • Gene transfer or transformation of an expression vector into a host cell can be appropriately performed by a method known to those skilled in the art.
  • those skilled in the art can express the recombinant protein by appropriately selecting conditions suitable for the expression of the recombinant protein according to the type of the host cell and culturing the host cell.
  • the host cell which expressed the recombinant protein is homogenized,
  • the antigen expressed as a recombinant protein can be isolate
  • the present invention is a method for providing an index for diagnosing allergy to quail eggs, and comprises the following steps: (I) contacting the sample obtained from the subject with the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2; (Ii) detecting binding between the IgE antibody and the antigen in a sample obtained from the subject; (Iii) if binding of the subject IgE antibody to the antigen is detected, an indication is provided that the subject is allergic to quail eggs; The method is provided.
  • the sample obtained from the subject is a solution containing Ig antibody collected from the subject, more preferably IgE antibody.
  • IgE antibody collected from the subject
  • solutions include, for example, blood, saliva, sputum, runny nose, urine, sweat, tears.
  • Sample pretreatment may include, for example, obtaining serum from blood.
  • the step (i) is performed by contacting an antigen with IgE antibody in serum obtained from the subject.
  • the contact between the sample obtained from the subject and the antigen and the detection of the binding can be performed by a known method.
  • a known method for example, detection by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorvent Assay), sandwich immunoassay, immunoblotting, or immunoprecipitation can be used.
  • the target IgE antibody is brought into contact with and bound to the antigen, and an enzyme-labeled secondary antibody is allowed to act on the IgE antibody specifically bound to the antigen, whereby the enzyme substrate (usually color development or luminescence).
  • This is a technique for detecting the binding between an antigen and a target IgE antibody by adding a reagent) and detecting the product of the enzyme reaction.
  • detection by a measuring method capable of evaluating the binding between an antigen and an IgE antibody such as surface plasmon resonance (SPR), can also be used.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the antigen may be in a state where the isolated antigen is immobilized on a carrier.
  • ELISA sandwich immunoassay
  • immunochromatography immunochromatography
  • surface plasmon resonance etc.
  • an antigen is immobilized on the sample obtained from the subject. This can also be done by bringing the surface into contact.
  • the isolated antigen may be obtained by separating and purifying from quail egg yolk by a combination of protein purification methods well known to those skilled in the art, or by preparing by gene recombination techniques.
  • the antigen may be detected by immunoblotting from a state separated by two-dimensional electrophoresis.
  • Two-dimensional electrophoresis is a technique for separating protein samples by performing isoelectric focusing in the first dimension and SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) in the second dimension.
  • the conditions for two-dimensional electrophoresis are not particularly limited as long as the antigens of the present invention can be separated.
  • the two-dimensional electrophoresis conditions described in the item “Identification of antigen” can be used.
  • electrophoresis conditions can be determined with reference to the descriptions in Patent Documents 1 to 4 described above, for example:
  • (A) As a first-dimension isoelectric focusing gel, the gel length is in the range of 5 to 10 cm, the pH range of the gel is 3 to 10, and the gel pH gradient with respect to the migration direction is up to pH 5. Satisfying the relationship of “a ⁇ b” and “b> c”, where a is the gel length of b, the gel length of pH 5-7 is b, and the gel length of pH 7 or higher is c;
  • (B) In the case of (A), when the total length of the gel is 1, a is in the range of 0.15 to 0.3, b is in the range of 0.4 to 0.7, and c is 0.
  • a constant voltage step is performed by applying a constant voltage having a value in the range of 100 V to 600 V for each gel containing a specimen, and the change width of electrophoresis per 30 minutes of electrophoresis is Start the voltage increasing process to increase the voltage from the constant voltage after being in the range of 5 ⁇ A;
  • the final voltage in the voltage raising step is within the range of 3000V to 6000V;
  • the gel length in the longitudinal direction of the first-dimension isoelectric focusing gel is 5 to 10 cm, and the gel concentration at the proximal end in the migration direction of the second-dimensional electrophoresis gel is 3 to 6%;
  • the gel concentration at the distal end portion in the migration direction of the second-dimensional electrophoresis gel is set higher than the gel concentration at the proximal end portion in the migration direction;
  • Two-dimensional electrophoresis can be performed
  • the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2 is an antibody that specifically binds to an IgE antibody of an allergic patient against quail eggs.
  • an indication is provided that the subject is allergic to quail eggs.
  • the present invention also provides a diagnostic kit for allergy to quail eggs containing the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2.
  • the diagnostic kit of the present invention may be used in a method for providing an index for diagnosing allergy to the quail eggs or the following diagnostic method.
  • the diagnostic kit of the present invention may contain the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2 as well as an enzyme-labeled anti-IgE antibody and a chromogenic substrate or luminescent substrate serving as the substrate of the enzyme. Alternatively, a fluorescently labeled anti-IgE antibody may be used.
  • the antigen may be provided in a state immobilized on a carrier.
  • the diagnostic kit of the present invention may also be provided together with instructions for a procedure for diagnosis and a package containing the instructions.
  • the diagnostic kit includes a companion diagnostic agent for allergies to quail eggs.
  • a companion diagnostic agent is used to identify patients who are expected to be effective in drugs, identify patients who are at risk of serious side effects of drugs, or optimize treatments using drugs (determination of dosages, judgment of discontinuation, etc.) ), For the purpose of examining the reactivity of the drug.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing allergy to quail eggs containing the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2.
  • the diagnostic composition of the present invention can be used in the following diagnostic methods.
  • the diagnostic composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive generally used with the antigen of the present invention, if necessary.
  • the invention is a method of diagnosing allergy to a quail egg in a subject, comprising the following steps: (I) contacting the sample obtained from the subject with the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2; (Ii) detecting binding between the IgE antibody and the antigen in a sample obtained from the subject; (Iii) if binding of the subject IgE antibody to the antigen is detected, it is determined that the subject is allergic to quail eggs; Providing the method.
  • steps (i) and (ii) are performed as described for each step of the method for providing an index for diagnosing allergy to quail eggs.
  • the present invention provides a method for diagnosing allergy to a quail egg of a subject, comprising administering the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2 to the subject.
  • the method may be performed in the form of a skin test characterized by applying an antigen to the skin.
  • the skin test after applying the diagnostic composition on the skin, the prick test and diagnostic composition were applied to observe the skin reaction by infiltrating the skin with the antigen by making a minute wound so as not to bleed. Scratch test to observe reaction by scratching skin a little, patch test to observe reaction by applying diagnostic composition such as cream or ointment to skin, and observe reaction by administering antigen intradermally Includes forms such as an intradermal test.
  • the subject is diagnosed as having an allergy to a quail egg.
  • the amount of the antigen applied to the skin may be, for example, a dose of 100 ⁇ g or less per one time.
  • the present invention provides the above-mentioned spot 1 antigen or spot 2 antigen for use in diagnosis of allergy to quail eggs.
  • the present invention provides the use of the spot 1 antigen or spot 2 antigen for the manufacture of a diagnostic agent for allergy to quail eggs.
  • composition / Treatment Method provides a pharmaceutical composition comprising the above-mentioned spot 1 antigen or spot 2 antigen.
  • the pharmaceutical composition is used to treat allergies to quail eggs.
  • the present invention also provides a method for treating allergy to quail eggs, comprising administering the spot 1 antigen or spot 2 antigen to a patient in need of treatment for allergy to quail eggs. .
  • the present invention provides the spot 1 antigen or spot 2 antigen for use in treating allergy to quail eggs. In yet another aspect, the present invention provides the use of the above spot 1 antigen or spot 2 antigen for the manufacture of a therapeutic agent for allergy to quail eggs.
  • desensitization therapy is often performed with the goal of inducing immune tolerance by administering an antigen to a patient.
  • the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2 can be used as an active ingredient for desensitization therapy or stress test for allergy to quail eggs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by a usual administration route.
  • Common routes of administration include, for example, oral, sublingual, transdermal, intradermal, subcutaneous, intravascular, intranasal, intramuscular and intraperitoneal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant, excipient, or various additives (for example, a stabilizer, a solubilizing agent, milk, etc.) that are generally used together with the antigen of the present invention as necessary.
  • a suspending agent, a buffering agent, a preservative, a coloring agent, etc. can be used as a pharmaceutical composition added by a conventional method.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the administration route. For example, it may be in the form of tablets, capsules, troches, sublingual tablets, injections, intranasal sprays, poultices, solutions, creams, lotions, and the like.
  • the dosage, frequency and / or administration period of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected by a doctor according to the administration route, symptoms, patient characteristics such as age and weight, and the like. For example, in the case of an adult, it may be administered at a dose of 100 ⁇ g or less per dose.
  • the dosing interval may be, for example, about once a week, once a week, twice a month, or about once every three months.
  • the administration period can be, for example, several weeks to several years. It may be an administration method in which the dosage is increased stepwise within the administration period.
  • Tester The present invention provides a tester comprising an antibody against at least one of the above-mentioned spot 1 antigen or spot 2 antigen.
  • the antibody can be prepared by a conventional method. For example, it may be prepared by immunizing a mammal such as a rabbit with the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2.
  • the antibody may be an Ig antibody, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or an antigen-binding fragment thereof (eg, Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′).
  • the antibody may be provided in a form bound to a carrier.
  • the carrier is not particularly limited as long as it is a carrier that can be used for detecting the binding between the antibody and the antigen. Any carrier known to those skilled in the art can be utilized.
  • Examples of the method for examining the presence or absence of an antigen include the following methods. -A tester containing the prepared Ig antibody is brought into contact with a sample obtained from a food or the like, and the binding between the Ig antibody and the antigen in the sample is detected using, for example, an ELISA method. A method for determining that the antigen remains in the target food or the like when binding is detected; -A method in which food is soaked in filter paper and the antibody solution is reacted so as to detect the antigen contained therein.
  • a primer having a base sequence complementary to at least one of the base sequences represented by SEQ ID NO: 17 or 23 Includes a tester for determining the presence or absence of an antigen.
  • the primer is complementary to, for example, 25 residues, 20 bases, 15 bases, 12 bases at the 5 ′ end of at least one sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 or 23. Has a base sequence.
  • a tester containing a prepared primer is brought into contact with DNA or mRNA extracted from a food material to detect the presence or absence of the DNA of the antigen, and patients who are allergic to quail eggs eat it.
  • a method for testing whether a variety is available.
  • the above tester is used for examining the presence or absence of an antigen in an object such as a food or a food production line.
  • the tester may be used for quality inspection of a production line by a manufacturer and a product before shipment, or may be used for checking the presence or absence of an antigen in the target food by the eater himself.
  • the present invention provides quail eggs or processed products of quail eggs, in which the antigen of spot 1 or the antigen of spot 2 is removed.
  • the method for removing the antigen of the present invention in quail eggs or processed quail eggs is not limited.
  • the removal of the antigen may be performed by any method as long as the antigen of the present invention is removed.
  • a quail egg from which expression of the antigen of the present invention has been knocked out may be prepared using a gene knockout technique from the quail egg from which the antigen of the present invention has been removed.
  • any method known to those skilled in the art can be used as the gene knockout technique.
  • Oishi, et al. (Scientific Reports, Vol.6, Article number: 23980, 2016, doi: 10.1038 / srep23980) applied CRISPER / Cas9, a genome editing technology, to chick primordial germ cells, and developed an ovomucoid. It describes obtaining genetically deleted individuals.
  • a similar technique may be applied to quails to obtain quail eggs from which the antigen of the present invention has been removed.
  • the processed quail egg product from which the antigen of the present invention has been removed may be a processed product made from quail eggs from which the antigen of the present invention has been removed.
  • a treatment for removing the antigen of the present invention is performed before or after preparation of processed quail eggs.
  • a method of removing the antigen of the present invention in a processed product of quail eggs using raw quail eggs as a raw material for example, as described in Patent 36553132, a method of removing by antigen protein elution with high-pressure treatment and neutral salt solution, A method of removing protein components of food by applying steam.
  • Example 1 Confirmation of protein pattern Proteins contained in quail eggs were examined using the following two-dimensional electrophoresis method.
  • precipitation was performed twice using a 2D-CleanUP kit (manufactured by GE).
  • TCA trichloroacetic acid
  • TCA precipitation was recovered.
  • acetone was added to the recovered TCA precipitate to perform precipitation, and the precipitate (specimen) obtained by the operation was recovered.
  • DeStreak Rehydration Solution a swelling buffer for gel for first-dimensional isoelectric focusing.
  • a specimen solution for second-order isoelectric focusing was used.
  • the composition of DeStreak Rehydration Solution is as follows. 7M thiourea 2M urea 4% (w / v) CHAPS: 3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate 0.5% (v / v) IPG buffer; appropriate amount of BPB (bromophenol blue) manufactured by GE
  • First-order isoelectric focusing of the first-dimension isoelectric focusing gel The first-dimension isoelectric focusing gel (GE: IPG gel Immobiline Drystrip (pH 3-10NL)) described above
  • the sample solution for electrophoresis was immersed in 140 ⁇ l and allowed to permeate overnight at room temperature.
  • IPGphor manufactured by GE was used as an electrophoresis apparatus.
  • the electrophoresis tray was filled with silicon oil.
  • a filter paper moistened with water was provided at both ends of the gel infiltrated with the specimen, and the gel was set on an electrophoresis tray so as to be covered with silicone oil, and an electrode was set with the filter paper sandwiched between the gel and the gel.
  • the upper limit of the current value of the isoelectric focusing device is set to 75 ⁇ A per gel, and the voltage program is set to (1) a constant voltage step to 750 Vhr at a constant voltage of 300 V (current for 30 minutes before the end of the step) (2) The voltage was gradually increased to 1000V over 300Vhr), (3) the voltage was gradually increased to 5000V over 4500Vhr, and (4) the total Vhr at 5000V constant voltage thereafter. The first-dimension isoelectric focusing was performed until the value reached 12000.
  • the composition of the equilibration buffer containing the alkylating agent is as follows. 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) 6M urea 30% (v / v) glycerol 2% (w / v) SDS 2.5% (w / v) iodoacetamide
  • Second dimension SDS-PAGE In this example, XCell SureLock Mini-Cell manufactured by life technologies was used as an electrophoresis apparatus. As the gel for the second dimension electrophoresis, NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gels manufactured by life technologies was used. In addition, an electrophoresis buffer having the following composition was prepared and used. 50 mM MOPS 50 mM Tris base 0.1% (w / v) SDS 1 mM EDTA
  • an agarose solution for adhesion in which 0.5% (w / v) agarose S (manufactured by Nippon Gene) and an appropriate amount of BPB (bromophenol blue) were dissolved in the electrophoresis buffer was used.
  • the sealed container to be used was thoroughly washed with 98% (v / v) ethanol in advance.
  • Remove the gel for the second dimensional electrophoresis after electrophoresis from the SDS-PAGE instrument, place it in a washed sealed container, and immerse it in an aqueous solution containing 50% (v / v) methanol and 7% (v / v) acetic acid for 30 minutes was performed twice. Thereafter, the aqueous solution was replaced with water and immersed for 10 minutes.
  • the 2D gel was immersed in 40 ml of SYPRO Ruby and shaken overnight at room temperature.
  • the two-dimensional gel for electrophoresis subjected to the above-described series of treatments was subjected to a fluorescence image scan using Typhoon 9400 (manufactured by GE).
  • the result of two-dimensional electrophoresis is shown in FIG. On the left side of the figure, a molecular weight marker band is seen, and the position of the band indicates a specific molecular weight (KDa).
  • Example 2 Antigen confirmation by immunoblot
  • Antigen confirmation by immunoblot was carried out by performing the procedure described in Example 1 up to "second-dimensional SDS-PAGE", and then performing the following "transfer to membrane” This was performed by performing the operations of “blotting” and “analysis”.
  • Transfer to the membrane Transfer to the membrane was performed using the following transfer device and transfer buffer.
  • Transcriptor XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module (life technologies)
  • Transfer buffer NuPAGE transfer buffer ( ⁇ 20) (manufactured by life technologies) was diluted 20 times with milliQ water and used.
  • the protein in the two-dimensional electrophoresis gel was transferred to a membrane (PVDF membrane) according to the following procedure.
  • PVDF membrane was dipped in 100% methanol, then dipped in milliQ water, then transferred to a transfer buffer solution, and the PVDF membrane was hydrophilized.
  • Sponge, filter paper, gel after 2D SDS-PAGE, hydrophilized PVDF membrane, filter paper, and sponge were set in this order, and energized for 1 hour at a constant voltage of 30 V in the transfer device.
  • Immunoblotting of the immunoblot membrane was performed using the serum of a patient having an allergy to quail eggs or the serum of a healthy subject as the primary antibody.
  • This quail egg allergic patient is a patient who does not show an allergic reaction to chicken eggs and shows an allergic reaction only to quail eggs.
  • the immunoblotting of the membrane was performed according to the following procedure.
  • (1) The transferred membrane was shaken in a 5% skim milk / PBST solution (PBS buffer containing 0.3% of the nonionic surfactant Tween 20) at room temperature for 1 hour.
  • (2) The primary antibody was allowed to stand at room temperature for 1 hour in a 3% serum / 5% skim milk / PBST solution.
  • Anti-human IgE-HRP horsedish peroxidase
  • (5) Washed with PBST solution (5 minutes ⁇ 3 times).
  • (6) The mixture was allowed to stand for 5 minutes with Pierce Western Blotting Substrate Plus (manufactured by Thermo).
  • Immunoblots using serum from patients with quail egg allergy were compared with immunoblots using serum from healthy subjects as controls.
  • the quail egg yolk immunoblot when using the serum of a quail egg allergic patient, four spots different from the case of using the serum of a healthy subject were detected (FIG. 2).
  • Example 3 Inhibition Test In order to confirm that the spot detected when using serum from a quail egg allergic patient in Example 2 is a spot specific to quail egg yolk, Before performing immunoblotting, an inhibition test using chicken egg yolk was performed.
  • Example 2 75 ⁇ l of serum was mixed with chicken egg yolk MCL1 extract (1 mg in protein amount) and allowed to stand at room temperature for 1 hour as serum. And immunoblotting was performed in the same manner as in Example 2.
  • Example 2 chicken egg yolk was subjected to two-dimensional gel electrophoresis in the same procedure as in Example 1. Before the immunoblotting step (2) in Example 2, 75 ⁇ l of serum was mixed with quail egg yolk MCL1 extract (1 mg in protein amount) and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Immunoblot was performed as in Example 2.
  • Example 4 Mass Spectrometry The amino acid sequence was identified by mass spectrometry for the antigen that produced the two spots identified in Example 3.
  • protein extraction and mass spectrometry were performed according to the following procedure.
  • Quail egg yolk was subjected to protein extraction, two-dimensional electrophoresis and membrane transfer according to the procedure of Example 2, and stained by shaking with 0.008% Direct blue / 40% ethanol / 10% acetic acid.
  • the target spot was cut out with a clean cutter blade and placed in a centrifuge tube.
  • Mass spectrometry was performed on the spot appearing at the position of isoelectric point 5-9 by molecular weight 35 kDa-50 kDa by two-dimensional electrophoresis under the conditions of this example, and amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-16 were detected. It was.
  • the mass data obtained from the mass spectrometer for this spot was analyzed by NCBI, it was identified to be a part of the vitellogenin-1 protein (SEQ ID NO: 18) derived from quail (Coturnix japonica).
  • a novel antigen for allergy to quail eggs a diagnostic method and diagnostic kit for allergy to quail eggs, a pharmaceutical composition containing the antigen, a quail egg or a quail egg processed product from which the antigen has been removed, and the antigen It is possible to provide a tester for determining the presence or absence.

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Abstract

本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原、ウズラの卵に対するアレルギーの診断方法および診断キット、当該抗原を含む医薬組成物、ならびに当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品を提供する。

Description

ウズラの卵アレルギーの抗原
　本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原に関する。本発明はまた、ウズラの卵に対するアレルギーの診断キット、診断用組成物、および診断方法に関する。本発明はまた、当該抗原を含む医薬組成物、当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品、及び当該抗原の有無を判定するためのテスターに関する。
　アレルギー患者の血清および組織中では、特定の抗原に特異的なＩｇＥ抗体が産生される。このＩｇＥ抗体と特定の抗原の相互作用により生じた生理学的結果によりアレルギー反応が惹起される。
　従来のアレルギー検査薬においては、単にアレルゲン候補の食品・材料等をすりつぶして抗原試薬を作成していることが多い（特許文献１）。このように従来の抗原試薬は、必ずしもアレルギー反応を引き起こす特定の抗原タンパク質（アレルゲンコンポーネント）を単独で含有するものではなく、複数のタンパク質成分を含むものである。したがって、従来の抗原試薬においては、アレルゲンコンポーネントごとに含有量が異なっていた。このため、従来の抗原試薬中に含まれる多数のタンパク質の中で、ＩｇＥ抗体との結合について陽性反応が判定可能な閾値を超える含有量のタンパク質がアレルゲンコンポーネントであった場合にのみ、アレルギー検査における陽性反応を検出することが可能であった。逆に、食品等のアレルゲン中の含有量が少ないアレルゲンコンポーネントにＩｇＥ抗体が結びつく患者については、従来のアレルギー検査薬を用いても陽性反応が判定できない状態であった。
　また、アレルギー反応の症状や重篤度は、アレルゲンコンポーネントの含有量とは必ずしも相関しない。アレルゲン候補の食品・材料中に微量に含まれるアレルゲンコンポーネントに患者のＩｇＥ抗体が反応する場合であってもアレルギー症状が現れたり、重篤度に関与したりする場合がある。
　したがって、アレルギー検査の信頼度を高めるためには、アレルゲン候補の食品・材料において、アレルゲンコンポーネントを網羅的に特定する必要がある。
　一方、タンパク質の分離・精製に関しては、従来、細胞抽出物などからタンパク質や核酸を分離・精製する方法が種々に検討されてきている。塩濃度を利用した透析、遠心分離などはその一例であるといえる。
　また、タンパク質や核酸の残基が有する電荷や、分子量の違いを利用した精製方法も多数検討されている。電荷を利用した精製方法としては、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーや等電点電気泳動を例示できる。分子量の違いを利用した精製方法としては遠心分離、分子量ふるいによるカラムロマトグラフィーやＳＤＳ－ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を例示できる。
　近年、少量のサンプルから多様なタンパク質を分離精製する方法として、１次元目に等電点電気泳動を行い、２次元目にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う２次元電気泳動法が用いられている。出願人らはこれまでに、分離能が高い２次元電気泳動法を開発してきた（特許文献２～５）。
特開２００２－２８６７１６ 特開２０１１－３３５４４ 特開２０１１－３３５４６ 特開２０１１－３３５４７ 特開２０１１－３３５４８
　本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原を提供する。本発明はまた、ウズラの卵に対するアレルギーの診断方法および診断キットを提供する。本発明はまた、当該抗原を含む医薬組成物、当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品、及び当該抗原の有無を判定するためのテスターを提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決するためにウズラの卵に対するアレルギーの原因抗原特定について鋭意研究を行った。その結果、ウズラ卵アレルギーを有する患者の血清中のＩｇＥ抗体が特異的に結合する抗原を特定することに成功した。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
　すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
　［１］ウズラの卵に対するアレルギーの診断キットであって、以下（１）または（２）のタンパク質の少なくとも一つ：
（１）（１Ａ）ビテロゲニン－１（Vitellogenin-1）タンパク質又はその変異体であって、以下の（１Ａ－ａ）～（１Ａ－ｅ）のいずれかのタンパク質：
（１Ａ－ａ）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ａ－ｂ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ａ－ｃ）配列番号１７において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ａ－ｄ）配列番号１７で示される塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；もしくは
（１Ａ－ｅ）配列番号１７で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（１Ｂ）配列番号１～１６および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質；
（２）（２Ａ）ビテロゲニン－２（Vitellogenin-2）タンパク質又はその変異体であって、以下の（２Ａ－ａ）～（２Ａ－ｅ）のいずれかのタンパク質：
（２Ａ－ａ）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ａ－ｂ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ａ－ｃ）配列番号２３において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ａ－ｄ）配列番号２３で示される塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；もしくは
（２Ａ－ｅ）配列番号２３で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（２Ｂ）配列番号１９～２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質；
を抗原として含む、前記診断キット。
　［２］ウズラの卵に対するアレルギーの診断用組成物であって、上記［１］において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つを抗原として含む、前記診断用組成物。
　［３］対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はＩｇ抗体が含まれる溶液である；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される；
を含み、ここで当該抗原は、上記［１］において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法。
　［４］上記［１］において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つを含む医薬組成物。
　［５］ウズラの卵に対するアレルギーを治療するための、上記［４］に記載の医薬組成物。
　［６］抗原が除去又は低減されていることを特徴とするウズラ卵又はウズラ卵加工品であって、当該抗原は上記［１］において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記卵または卵加工品。
　［７］上記［１］において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つと結合する抗体を含むことを特徴とする、対象物におけるウズラの卵に対するアレルギーの原因となる抗原の有無を判定するためのテスター。
　［８］配列番号１７または２３で示される塩基配列の少なくとも１つと相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする、対象物におけるウズラの卵に対するアレルギーの原因となる抗原の有無を判定するためのテスター。
　［９］上記［１］において（１）又は（２）として特定されるタンパク質であり、そしてウズラの卵に対するアレルギーの原因となる、ウズラ由来の抗原。
　本発明により、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原を提供することができる。本発明においてウズラ卵アレルギーを引き起こす抗原（アレルゲンコンポーネント）が同定されたことから、ウズラの卵に対するアレルギーの高感度な診断方法および診断キット、当該抗原を含む医薬組成物、当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品、ならびに当該抗原の有無を判定するためのテスターを提供することができる。
図１は、ウズラ卵の卵黄および卵白に含まれるタンパク質について、２次元電気泳動によるタンパク質の泳動パターンを示すゲルの写真である。左側の写真はウズラ卵黄のタンパク質の２次元電気泳動パターンであり、右側の写真はウズラ卵白のタンパク質の２次元電気泳動パターンである。それぞれの写真の左側のバンドは、分子量マーカーのバンドである。 図２は、ウズラ卵の卵黄および卵白に含まれるタンパク質の二次元電気泳動パターンに対してイムノブロットを行った結果を示す写真である。上段はウズラ卵黄のタンパク質についてのイムノブロットであり、下段はウズラ卵白のタンパク質についてのイムノブロットである。右側はウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットであり、左側は健康被験者の血清を用いたイムノブロットである。矢印は、ウズラ卵アレルギーの患者の血清が特異的に反応したスポットを示す。 図３は、インヒビション試験の結果を示すイムノブロットの写真である。上段右側は、ウズラ卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、鶏卵卵黄でインヒビションを行ったウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットである。矢印は、ウズラ卵アレルギーの患者の血清が特異的に反応したスポットを示す。上段左側は、ウズラ卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、鶏卵卵黄でインヒビションを行った健康被験者の血清を用いたイムノブロットである。下段右側は、鶏卵卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、ウズラ卵黄でインヒビションを行ったウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットであり、下段左側は鶏卵卵黄タンパク質の２次元電気泳動パターンに対して、ウズラ卵黄でインヒビションを行った健康被験者の血清を用いたイムノブロットである。
　以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
　本明細書においてアレルギーとは、ある抗原に感作されている生体に、再びその抗原が入った場合に起こる、生体に不都合な過敏反応を示す状態をいう。食物におけるアレルギー疾患の多くにおいて、血液および組織で抗原に特異的なＩｇＥ抗体が産生される。ＩｇＥ抗体は、肥満細胞または好塩基球と結合する。当該ＩｇＥ抗体に特異的な抗原が再びアレルギー疾患患者の体内に入ると、当該抗原は肥満細胞または好塩基球と結合したＩｇＥ抗体と組み合わさり、そして当該ＩｇＥ抗体が細胞表面で架橋し、ＩｇＥ抗体－抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これらの生理学的効果として、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、好酸球遊走因子または各種ロイコトリエン等の放出が挙げられる。これらの放出物質は、ＩｇＥ抗体と特定の抗原の組み合わせにより起こるアレルギー反応を惹起する。特定の抗原によるアレルギー反応は、上記の経路を通じて現れる。
　本明細書においてウズラの卵に対するアレルギーとは、ウズラの卵に含まれるタンパク質等を抗原として生じるアレルギー反応を有する状態をいう。ウズラの卵に対するアレルギーは、ウズラの卵に含まれる抗原と接触した場合、あるいは当該抗原を摂取した場合に、アレルギー反応を生じ得る。一般的に食物を摂取した場合に生じるアレルギー反応を特に食物アレルギーという。ウズラの卵に対するアレルギーは食物アレルギーであってもよい。
　本明細書において抗原とは、アレルギー反応を惹起させる物質であり、アレルゲンコンポーネントとも称される。抗原は好ましくはタンパク質である。
　本明細書において、タンパク質は、天然のアミノ酸がペプチド結合により連結された構造を有する分子である。タンパク質に含まれるアミノ酸の数は特に限定されないが、２～５０個程度のアミノ酸がペプチド結合により連結されたタンパク質を、ペプチドと呼ぶことがある。また、アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。本明細書で用いるタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている表記法に基づき、アミノ酸の一文字表記で表され、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
　抗原の特定
　ウズラの卵に含まれるタンパク質について、上記の手法を利用してウズラの卵に対するアレルギーの原因となる抗原の特定を行った。具体的には、ウズラ卵黄のタンパク質を下記の条件で２次元電気泳動に供した。
　１次元目の電気泳動は、等電点電気泳動用ゲルとして、ゲル長が５～１０ｃｍの範囲内であって、ゲルのｐＨ範囲が３～１０であり、泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配が、ゲルの全長を１とし、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５～７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合において、ａが０．１５～０．３の範囲内、ｂが０．４～０．７の範囲内、ｃが０．１５～０．３の範囲内であるゲルを用いて、具体的には、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社（以下、ＧＥ社と省略する）製のＩＰＧゲルImmobiline Drystrip (pH3-10NL)を用いて等電点泳動を行った。電気泳動機器は、ＧＥ社製のIPGphorを用いた。電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで定電圧工程を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流変化幅が５μＡであった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。
　２次元目の電気泳動は、泳動方向基端部のゲル濃度が３～６％に設定され、泳動方向先端側の部分のゲル濃度が泳動方向基端部のゲル濃度よりも高く設定されたポリアクリルアミドゲルを用いて、具体的にはlife technologies社製のNuPAGE 4-12% Bris-Tris Gels IPG well mini 1mmを用いてSDS-PAGEを行った。電気泳動機器は、life technologies社製のXCell SureLock Mini-Cellを用いた。泳動緩衝液として５０ｍＭ　ＭＯＰＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡを用い、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
　その結果、ウズラ卵黄のタンパク質について上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量４５ｋＤａ付近、等電点５～９に現れるスポット（以下、当該スポットを構成するタンパク質を「スポット１の抗原」と記載する）、および分子量３５ｋＤａ付近、等電点７～１２に現れるスポット（以下、当該スポットを構成するタンパク質を「スポット２の抗原」と記載する）が、ウズラの卵に対するアレルギーの患者のＩｇＥ抗体に特異的に結合することを明らかにした。
　抗原
　・スポット１の抗原
　スポット１の抗原について質量分析による配列同定を行った結果、以下のアミノ酸配列が検出された。
SFKPVYTDVPIEK（配列番号１）
TFAVTRNIEDLAASK（配列番号２）
MTPVLLPEAVPDIMK（配列番号３）
KSVHAAFIK（配列番号４）
PVYTDVPIEK（配列番号６）
IQVTIQAGDQAPTKM（配列番号７）
ALPHDKPFASGYLK（配列番号８）
DWETNYDFK（配列番号９）
EETNVITVSSK（配列番号１０）
IQVTIQAGDQAPTK（配列番号１１）
NTIQNVLQAWYGPDEK（配列番号１２）
RLISSLQSGIGRQLTK（配列番号１３）
SVHAAFIK（配列番号１４）
TFAVTRNIEDLAA（配列番号１５）
VNAHVPVNVVATIQMK（配列番号１６）
　また、スポット１について、質量分析装置から得られた質量データ（配列番号１～１６についての質量データ）をＮＣＢＩのタンパク質データと照合して解析したところ、ウズラ（Coturnix japonica）由来のビテロゲニン－１（vitellogenin-1）タンパク質（配列番号１８）の一部であることが同定された。配列番号１は配列番号１８のアミノ酸３２９～３４１、配列番号２は配列番号１８のアミノ酸２１３～２２８、配列番号３は配列番号１８のアミノ酸２２９～２４３、配列番号４は配列番号１８のアミノ酸３０５～３１３、配列番号６は配列番号１８のアミノ酸３３２～３４１、配列番号７は配列番号１８のアミノ酸３４２～３５６、配列番号８は配列番号１８のアミノ酸２０～３３、配列番号９は配列番号１８のアミノ酸１～９、配列番号１０は配列番号１８のアミノ酸２０３～２１３、配列番号１１は配列番号１８のアミノ酸３４２～３５５、配列番号１２は配列番号１８のアミノ酸４７～６２、配列番号１３は配列番号１８のアミノ酸６８～８３、配列番号１４は配列番号１８のアミノ酸３０６～３１３、配列番号１５は配列番号１８のアミノ酸２１４～２２６、配列番号１６は配列番号１８のアミノ酸１７５～１９０にそれぞれ相当する。
　したがって、本願においてスポット１の抗原は、以下（１Ａ－ａ）～（１Ａ－ｅ）および（１Ｂ）のいずれかであってよい。
（１Ａ－ａ）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１Ａ－ｂ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１Ａ－ｃ）配列番号１７において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１Ａ－ｄ）配列番号１７で示される塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１Ａ－ｅ）配列番号１７で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１Ｂ）配列番号１～１６および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６種またはすべての配列を含むタンパク質。より好ましくは配列番号１、２、６、８～１６および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号１～１６および１８のいずれかで示されるアミノ酸配列は、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
　上記（１Ａ－ａ）～（１Ａ－ｅ）および（１Ｂ）のタンパク質には、リン酸化や糖鎖修飾、アミノアシル化、開環、脱アミノ化などにより当該タンパク質のアミノ酸残基が修飾を受けているタンパク質もまた、含まれる。
　上記（１Ａ－ａ）～（１Ａ－ｅ）および（１Ｂ）のタンパク質は、上記「抗原の特定」の項目に記載した条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３５ｋＤａ～５０ｋＤａ、好ましくは分子量４０ｋＤａ～４７ｋＤａ、より好ましくは分子量４２～４７ｋＤａ付近のスポットとして現れるタンパク質であってよい。当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、等電点５～９、好ましくは６～８のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。あるいは、当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３５ｋＤａ～５０ｋＤａ、好ましくは分子量４０ｋＤａ～４７ｋＤａ、より好ましくは分子量４２～４７ｋＤａ付近、および等電点５～９、好ましくは６～８のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。
　好ましくは、上記（１Ａ－ａ）～（１Ａ－ｅ）および（１Ｂ）のタンパク質は、ウズラの卵に対するアレルギーの原因となる。
　・スポット２の抗原
　スポット２の抗原について、質量分析による配列同定を行った。その結果、以下のアミノ酸配列が検出された。
LCADASVLNAHK（配列番号１９）
TVQLAGVDSK（配列番号２０）
AEAPSAVLNNLK（配列番号２１）
GGLQLVVFADTDSVK（配列番号２２）
　また、スポット２について、質量分析装置から得られた質量データ（配列番号１９～２２についての質量データ）をＮＣＢＩのタンパク質データと照合して解析したところ、ウズラ（Coturnix japonica）由来のビテロゲニン－２（vitellogenin-2）タンパク質（配列番号２４）の一部であることが同定された。配列番号１９は配列番号２４のアミノ酸５０～６１、配列番号２０は配列番号２４のアミノ酸３９５～４０４、配列番号２１は配列番号２４のアミノ酸１９１～２０２、配列番号２２は配列番号２４のアミノ酸１８～３２にそれぞれ相当する。
　したがって、スポット２の抗原は、以下（２Ａ－ａ）～（２Ａ－ｅ）および（２Ｂ）の通りであってよい。
（２Ａ－ａ）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２Ａ－ｂ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２Ａ－ｃ）配列番号２３において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２Ａ－ｄ）配列番号２３で示される塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２Ａ－ｅ）配列番号２３で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（２Ｂ）配列番号１９～２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも２、３、４種またはすべての配列を含むタンパク質。より好ましくは配列番号２１、２２および／または２４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号１９～２２および２４のいずれかで示されるアミノ酸配列は、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
　上記（２Ａ－ａ）～（２Ａ－ｅ）および（２Ｂ）のタンパク質には、リン酸化や糖鎖修飾、アミノアシル化、開環、脱アミノ化などにより当該タンパク質のアミノ酸残基が修飾を受けているタンパク質もまた、含まれる。
　上記（２Ａ－ａ）～（２Ａ－ｅ）および（２Ｂ）のタンパク質は、上記「抗原の特定」の項目に記載した条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３０ｋＤａ～５０ｋＤａ、好ましくは分子量３０ｋＤａ～４０ｋＤａ、より好ましくは分子量３２～３７ｋＤａ付近のスポットとして現れるタンパク質であってよい。当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、等電点７～１２、好ましくは８～１０のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。あるいは、当該タンパク質は、上記の条件で２次元電気泳動を行った際のゲルにおいて、分子量３０ｋＤａ～５０ｋＤａ、好ましくは分子量３０ｋＤａ～４０ｋＤａ、より好ましくは分子量３２～３７ｋＤａ付近および等電点７～１２、好ましくは８～１０のスポットとして現れるタンパク質であってもよい。
　好ましくは、上記（２Ａ－ａ）～（２Ａ－ｅ）および（２Ｂ）のタンパク質は、ウズラの卵に対するアレルギーの原因となる。
　本明細書において、アミノ酸配列について「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された」という場合は、対象となるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸（例えば、アミノ酸配列の全長に対して４０％、好ましくは３０％、２０％、１０％または５％のアミノ酸）が欠失しているか、他のアミノ酸置換されているか、他のアミノ酸が挿入されているか、および／または他のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列をいう。
　上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。以下に、アミノ酸残基の保存的置換について置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、
Ｅ群：セリン、スレオニン
Ｆ群：フェニルアラニン、チロシン
　非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができる。例えば、不用意な糖鎖修飾を排除するために上記のＢ、Ｄ、Ｅ群のアミノ酸をそれ以外の群のアミノ酸に置換してもよい。または、３次構造でタンパク質中に折りたたまれることを防ぐためにシステインを欠失させるか、他のアミノ酸に置換してもよい。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（J. Kyte 及びR. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982）を考慮して、アミノ酸を置換してもよい。
　本明細書において、２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）、及びＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894；Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI（Infomax）等のプログラムを用いて決定することもできる。
　本明細書において、塩基配列について「１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された」という場合は、対象となる塩基配列において、１個もしくは数個のヌクレオチド（例えば、塩基配列の全長に対して３０％、好ましくは２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％または１％のアミノ酸）が欠失しているか、他のヌクレオチドに置換されているか、他のヌクレオチドが挿入されているか、および／または他のヌクレオチドが付加されている塩基配列をいう。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入もしくは付加により、アミノ酸をコードする配列にフレームシフトを生じないことが好ましい。
　本明細書において、２つの塩基配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのような配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリズム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
　本明細書における「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６－７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。好ましくは、中程度にストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ、４２℃～５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ～３×ＳＳＣ、４５℃～５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ、４０℃～６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％～０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。高度にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ～２×ＳＳＣ、５５℃～６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ～１×ＳＳＣ、６０℃～６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ～２×ＳＳＣ、５０℃～６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０～６５℃が挙げられる。
　抗原は、ウズラ卵黄から当業者に周知のタンパク質精製方法を組み合わせて分離・精製することによって得てもよい。または、抗原は、当業者に周知の遺伝子組換え技術により抗原を組換えタンパク質として発現させ、そして当業者に周知のタンパク質精製方法により分離・精製することによって得てもよい。
　タンパク質の精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGEなど分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　遺伝子組換え技術によるタンパク質の調製は、抗原をコードする核酸を含む発現ベクターを調製し、当該発現ベクターを適切な宿主細胞中に遺伝子導入または形質転換により導入し、当該宿主細胞を組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養し、そして当該宿主細胞中で発現された組換えタンパク質を回収することにより行う。
　「ベクター」は、それに連結させた核酸を宿主細胞内に導入するために用いることが可能な核酸であり、「発現ベクター」はベクターにより導入された核酸がコードするタンパク質の発現を導くことが可能なベクターである。ベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が含まれる。当業者は、使用する宿主細胞の種類に応じて、組換えタンパク質の発現に適切な発現ベクターを選択することができる。
　「宿主細胞」は、ベクターにより遺伝子導入または形質転換を受ける細胞である。宿主細胞は、使用するベクターに応じて当業者が適切に選択することができる。宿主細胞は、例えば、大腸菌（E. coli）などの原核生物由来のであることが可能である。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、本発明の抗原は、原核細胞内での組換えタンパク質の発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。このＮ末端メチオニンは、発現後に組換えタンパク質から切り離すこともできる。あるいは、酵母などの単細胞真核生物、植物細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）などの、真核生物由来の細胞であることが可能である。
　発現ベクターの宿主細胞への遺伝子導入または形質転換は、当業者に公知の手法により適宜行うことができる。また、当業者は、宿主細胞の種類に応じて組換えタンパク質の発現に適する条件を適宜選択し、宿主細胞を培養することにより組換えタンパク質を発現させることができる。そして、組換えタンパク質を発現した宿主細胞をホモジナイズし、得られたホモジネートから上述したタンパク質の精製方法を適宜組み合わせて行うことにより、組換えタンパク質として発現された抗原を分離・精製することができる。
　診断キット・診断方法
　本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原に接触させる；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される；
を含む、前記方法を提供する。
　対象から得られた試料とは、対象から採取されたＩｇ抗体、より好ましくはＩｇＥ抗体、が含まれる溶液である。そのような溶液には、例えば、血液、唾液、痰、鼻水、尿、汗、涙が含まれる。対象から得られた試料は、抗原に接触させる前に、試料中のＩｇ抗体濃度を高めるための前処理が施されていてもよい。試料の前処理としては、例えば血液から血清を得ることが含まれてもよい。特に好ましい態様において、上記工程（ｉ）は、対象から得られた血清中のＩｇＥ抗体と抗原を接触させることにより行われる。
　対象から得られた試料と抗原との接触およびその結合の検出は、既知の方法により行うことが可能である。そのような方法には、例えば、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorvent Assay）、サンドイッチ免疫測定法、イムノブロット、免疫沈降法による検出を用いることができる。これらはいずれも、抗原に対象のＩｇＥ抗体を接触させて結合させ、抗原に特異的に結合したＩｇＥ抗体に対して酵素標識した二次抗体を作用させ、酵素の基質（通常は、発色あるいは発光試薬）を加えて酵素反応の生成物を検出することにより、抗原と対象のＩｇＥ抗体の結合を検出する手法である。あるいは、表面プラズモン共鳴（SPR）等の、抗原とＩｇＥ抗体の結合を評価可能な測定方法による検出を用いることもできる。
　抗原は、単離された抗原が担体に固定されている状態であってもよい。この場合は上記工程（ｉ）および（ｉｉ）においてＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、イムノクロマト法、表面プラズモン共鳴等が利用でき、また、上記工程（ｉ）では、対象から得られた試料を抗原を固定した面に接触させることによっても行うことができる。単離された抗原は、ウズラ卵黄から当業者に周知のタンパク質精製方法を組み合わせて分離・精製することによって、または遺伝子組換え技術により調製することによって得てもよい。
　また、抗原は２次元電気泳動により分離した状態からイムノブロットによる検出を行ってもよい。２次元電気泳動は、１次元目に等電点電気泳動、２次元目にＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行うことで、タンパク質試料を分離する手法である。この場合、２次元電気泳動の条件は、本願発明の抗原が分離できる条件であれば特に限定されない。例えば、上記「抗原の特定」の項目において記載した２次元電気泳動の条件を利用できる。あるいは、上述の特許文献１～４の記載を参考にして電気泳動の条件を定めることもでき、例えば、以下：
（Ａ）１次元目の等電点電気泳動ゲルとして、ゲル長が５～１０ｃｍの範囲内であって、ゲルのｐＨ範囲が３～１０であり、泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配が、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５～７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合において、「ａ＜ｂ］及び「ｂ＞ｃ」の関係を満たす；
（Ｂ）（Ａ）の場合であって、ゲルの全長を１とした場合、ａが０．１５～０．３の範囲内、ｂが０．４～０．７の範囲内、ｃが０．１５～０．３の範囲内である；
（Ｃ）１次元目の等電点電気泳動において、検体を含むゲル１本につき１００Ｖ～６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分あたりの泳動変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇行程を始める；
（Ｄ）（Ｃ）の場合に、電圧上昇工程の最終電圧を３０００Ｖ～６０００Ｖの範囲内とする；
（Ｅ）１次元目の等電点電気泳動ゲルの長手方向のゲル長が５～１０ｃｍであって、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度を３～６％とする；および
（Ｆ）（Ｅ）の場合に、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向先端側の部分のゲル濃度が、泳動方向基端部のゲル濃度よりも高く設定する；
からなる群より選択される少なくとも１つを満たす条件で２次元電気泳動を行うことができる。
　上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原は、ウズラの卵に対するアレルギーの患者のＩｇＥ抗体と特異的に結合する抗体である。したがって、対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される。
　本発明はまた、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含むウズラの卵に対するアレルギーの診断キットを提供する。本発明の診断キットは、上記のウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法、または下記の診断方法に用いてもよい。本発明の診断キットは、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含むほか、酵素標識された抗ＩｇＥ抗体および当該酵素の基質となる発色基質または発光基質を含んでいてもよい。また、蛍光標識された抗ＩｇＥ抗体を用いてもよい。本発明の診断キットにおいて、抗原は担体に固定化された状態で提供されてもよい。本発明の診断キットはまた、診断のための手順についての説明書や当該説明を含むパッケージと共に提供されてもよい。
　別の態様において、上記の診断キットは、ウズラの卵に対するアレルギーについてのコンパニオン診断薬を含む。コンパニオン診断薬とは、医薬品の効果が期待される患者の特定または医薬品の重篤な副作用リスクを有する患者の特定、あるいは医薬品を用いた治療の最適化（用法用量の決定や投与中止の判断等）、のために当該医薬品の反応性を検討するために用いるものである。
　本発明はまた、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含むウズラの卵に対するアレルギーの診断用組成物を提供する。本発明の診断用組成物は、下記の診断方法に用いることができる。本発明の診断用組成物は、必要に応じて本発明の抗原とともに一般的に用いられる、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。
　一態様において、本発明は、対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原に接触させる；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであると判断する；
ことを含む、前記方法を提供する。ここにおいて（ｉ）および（ｉｉ）の各工程は、ウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法の各工程について説明したとおりに行われる。
　別の態様において、本発明は、対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断する方法であって、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を対象に投与することを含む、前記方法を提供する。当該方法は、皮膚に抗原を適用することを特徴とする皮膚テストの形式で行ってもよい。皮膚テストには、皮膚上に診断用組成物を適用した後に、出血しない程度に微少な傷をつけることで皮膚に抗原を浸透させて皮膚反応を観察するプリックテスト、診断用組成物を適用した上に皮膚を少し引っ掻いて反応を観察するスクラッチテスト、クリームや軟膏などの形態の診断用組成物を皮膚に適用して反応を観察するパッチテスト、抗原を皮内に投与して反応を観察する皮内テスト、などの形態が含まれる。抗原を適用した部分の皮膚に腫れなどの皮膚反応が生じた場合、その対象はウズラの卵に対するアレルギーを有すると診断する。ここで、皮膚に適用する抗原の量は、例えば、１回あたり１００μｇ以下の用量であってよい。
　また別の態様において、本発明はウズラの卵に対するアレルギーの診断に使用するための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を提供する。
　さらなる別の態様において、本発明はウズラの卵に対するアレルギーの診断薬の製造のための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原の使用を提供する。
　医薬組成物・治療方法
　本発明は、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を含む医薬組成物を提供する。
　一態様において、上記の医薬組成物は、ウズラの卵に対するアレルギーを治療するために用いられる。
　本発明はまた、ウズラの卵に対するアレルギーの治療を必要とする患者に対して、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を投与することを含む、ウズラの卵に対するアレルギーを治療する方法を提供する。
　別の態様において、本発明はウズラの卵に対するアレルギーの治療に使用するための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原を提供する。さらに別の態様において本発明は、ウズラの卵に対するアレルギーの治療薬の製造のための上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原の使用を提供する。
　アレルギーの治療においては、患者に抗原を投与することで免疫寛容へと誘導することを目標とした、減感作療法がしばしば行われている。上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原は、ウズラの卵に対するアレルギーに対する減感作療法や負荷試験のための有効成分として用いることができる。
　本発明の医薬組成物は、通常の投与経路により投与することができる。通常の投与経路には例えば、経口、舌下、経皮、皮内、皮下、血液内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内の投与が含まれる。
　本発明の医薬組成物は、必要に応じて本発明の抗原と共に、一般的に用いられる薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、または各種の添加剤（例えば安定剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、保存剤、着色剤等）を常法により添加した医薬組成物として用いることができる。医薬組成物の剤型は、投与経路に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、注射剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、液剤、クリーム剤、ローション剤、等の形態であってよい。本発明の医薬組成物の投与量、投与回数および／または投与期間は、投与経路、症状、年齢や体重などの患者の特性等に応じて医師が適宜選択することができる。例えば、成人の場合、１回あたり１００μｇ以下の用量で投与してもよい。投与間隔は、例えば、毎日、毎週１回、月に２回、又は３ヶ月に１回程度であってよい。投与期間は例えば、数週間から数年であってよい。投与期間内において、投与量を段階的に増加させる投与方法であってもよい。
　テスター
　本発明は、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原の少なくとも一つに対する抗体を含むテスターを提供する。
　当該抗体は、常法により作製することができる。例えば、ウサギなどの哺乳動物を上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原で免疫することにより作製してもよい。当該抗体は、Ｉｇ抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’）であってもよい。
　また、上記のテスターにおいて、当該抗体は担体に結合した形で提供されていてもよい。担体は、抗体と抗原の結合の検出に利用可能な担体であれば特に限定されない。当業者に公知の任意の担体が利用できる。
　抗原含有の有無を調べる方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
・作製したＩｇ抗体を含むテスターを食品等から得られた試料に接触させて、例えばＥＬＩＳＡ法等を用いて当該Ｉｇ抗体と試料中の抗原との結合を検出し、当該Ｉｇ抗体と抗原との結合が検出された場合に、対象食品等に当該抗原が残留していると判断する方法；
・ろ紙などに食品をしみこませ、そこに含まれる抗原を検出するように、抗体溶液を反応させる方法。
　本発明の別の態様において、配列番号１７または２３で示される塩基配列の少なくとも１つと相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする、対象物におけるウズラの卵に対するアレルギーの原因となる抗原の有無を判定するためのテスターを含む。非限定的に、上記プライマーは例えば、配列番号１７または２３で示される塩基配列の少なくとも１つの配列の５’末端の、好ましくは、２５残基、２０塩基、１５塩基、１２塩基と相補的な塩基配列を有する。
　抗原含有の有無を調べる方法としては、例えば、作製したプライマーを含むテスターを、食材から抽出したDNAやmRNAと接触させて、抗原のDNAの有無を検出し、ウズラの卵に対するアレルギーの患者が食べられる品種かどうかを試験する方法が挙げられる。
　一態様において、上記のテスターは、食品中または食品製造ライン中などの対象物中の抗原含有の有無を調べるために用いられる。上記テスターは、製造業者による製造ラインおよび出荷前製品の品質検査用として用いてもよく、喫食者自身による対象食品の抗原含有の有無のチェック用として用いてもよい。
　アレルゲン除去食品等
　本発明は、上記スポット１の抗原またはスポット２の抗原が除去されていることを特徴とするウズラ卵またはウズラ卵加工品を提供する。
　ウズラ卵またはウズラ卵加工品において本発明の抗原を除去する方法は限定されない。抗原の除去は、本発明の抗原が除去される限り、いかなる方法によって行われてもよい。
　例えば、本発明の抗原が除去されたウズラ卵は、遺伝子ノックアウト技術を用いて、本発明の抗原の発現がノックアウトされたウズラ卵を調製してもよい。
　遺伝子ノックアウト技術は、当業者に公知の手法のいずれかを用いることができる。例えば、Oishi, et al.（Scientific Reports, Vol.6, Article number: 23980, 2016, doi:10.1038/srep23980）は、ゲノム編集技術であるCRISPER/Cas9をニワトリの始原生殖細胞に適用して、オボムコイド遺伝子欠失個体を得ることを記載している。同様の手法をウズラに適用して、本発明の抗原が除去されたウズラ卵を得てもよい。
　本発明の抗原が除去されたウズラ卵加工品は、本発明の抗原が除去されたウズラ卵を原料とした加工品であってもよい。通常のウズラ卵を原料とする場合は、ウズラ卵加工品の調製前または調製後に本発明の抗原を除去する処理を行う。通常のウズラ卵を原料としたウズラ卵加工品において本発明の抗原を除去する方法として、例えば特許３６５３１３２に記載のように高圧処理および中性塩溶液による抗原タンパク質の溶出により除去する方法や、高温スチームをあてて食品のタンパク質成分を除去する方法が挙げられる。
　以下に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって限定されない。
　実施例１：タンパク質パターンの確認
　下記の二次元電気泳動方法を使用して、うずら卵に含まれるタンパク質を調べた。
　タンパク質の抽出
　市販のうずら卵を購入し、卵白と卵黄に分けた。卵白、卵黄それぞれ１００μｌに、タンパク質抽出用試薬であるmammalian cell lysis kit；MCL1（SIGMA－ALDRICH社製）１０００μｌを加え、２５℃で１０分間、ボルテックスを使用して振とう抽出した。この振とう抽出の後、タンパク質抽出液を回収した。上記のmammalian cell lysis kit；MCL1の組成は下記の通りである。
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５
１ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミントリ酢酸）
２５０ｍＭ　ＮａＣｌ
０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
０．５％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム
１％（ｖ／ｖ）　Igepal CA-630（SIGMA－ALDRICH社製の界面活性剤(Octylphenoxy)polyethoxyethanol)
適量のプロテアーゼ阻害剤
　その後、2D-CleanUPキット（ＧＥ社製）を使用して２回の沈殿操作を行った。第１回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿（ＴＣＡ沈殿）を回収した。第２回目の沈殿操作は、回収した前記ＴＣＡ沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿（検体）を回収した。
　検体溶液の調製
　得られた検体の一部（タンパク質重量として３０μｇ）を、１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）１５０μｌに溶解し、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
７Ｍ　チオ尿素
２Ｍ　尿素
４％（ｗ／ｖ）　ＣＨＡＰＳ：
３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホナート
０．５％（ｖ／ｖ）　ＩＰＧバッファー；ＧＥ社製
適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）
　１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透
　１次元目等電点電気泳動用ゲル（ＧＥ社製：ＩＰＧゲルImmobiline Drystrip (pH3-10NL)）を前記した１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨張用検体溶液）１４０μｌに浸漬し、一晩室温にて浸透させた。
　本実施例においては、電気泳動機器としてＧＥ社製のIPGphorを使用した。
　泳動トレーにシリコンオイルを満たした。検体を浸透させたゲルの両端に水で湿らせた濾紙を設け、ゲルをシリコンオイルに覆われるよう、泳動トレーにセットし、ゲルとの間に当該濾紙を挟んだ状態で電極をセットした。
　等電点電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで定電圧工程を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流変化幅が５μＡであった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。
　等電点電気泳動ゲルのＳＤＳ平衡化
　上記の１次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、１５分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ　尿素
３０％（ｖ／ｖ）　グリセロール
２％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ
１％（ｗ／ｖ）　ＤＴＴ
　次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、１５分・室温にて振とうし、ＳＤＳ平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ　尿素
３０％（ｖ／ｖ）　グリセロール
２％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ
２．５％（ｗ／ｖ）　ヨードアセトアミド
　２次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　本実施例においては、電気泳動機器としてlife technologies社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。２次元目泳動用ゲルはlife technologies社製NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
５０ｍＭ　ＭＯＰＳ
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基
０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ
１ｍＭ　ＥＤＴＡ
　また、本実施例においては泳動用緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製）と適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥのウェル中を十分に上記泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次に、ウェルの中に充分に溶解させた接着用アガロース溶液を添加した。次に、ＳＤＳ平衡化したゲルをアガロース中に浸漬させ、ピンセットでＳＤＳ平衡化したゲルと２次元目泳動用ゲルを密着させた。当該両ゲルが密着した状態でアガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
　ゲルの蛍光染色
　SYPRO Ruby（life technologies社製）を用いてゲルの蛍光染色を行った。
　まず、使用する密閉容器を事前に９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで十分に洗浄した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ機器から泳動後の２次元目泳動用ゲルを取り外して、洗浄した密閉容器におき、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液に３０分間浸漬する処理を２回行った。その後、当該水溶液を水に置換し、１０分間浸漬した。次に、２次元目泳動用ゲルを４０ｍｌのSYPRO Rubyに浸漬し、室温で一晩振とうした。次に、SYPRO Rubyを除き、２次元目泳動用ゲルを水で洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液で３０分間振とうした。更に当該水溶液を水に置換し、３０分以上振とうした。
　解析
　上記一連の処理を施した２次元目泳動用ゲルをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。２次元電気泳動の結果を図１に示す。図の左側には、分子量マーカーのバンドが見られ、バンドの位置が特定の分子量（ＫＤａ）を示す。
　実施例２：イムノブロットでの抗原確認
　イムノブロットでの抗原確認は、実施例１に記載した手順を「２次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥ」まで行った後、以下の「メンブレンへの転写」「イムノブロット」「解析」の操作を行うことにより行った。
　メンブレンへの転写
　メンブレンへの転写は、以下の転写装置及び転写用緩衝液を用いて行った。
転写装置：XCell SureLock Mini-Cell およびXCell IIブロットモジュール（life technologies社製）
転写用緩衝液： NuPAGEトランスファーバッファー（×２０）（life technologies社製）をmilliQ水で20倍希釈して使用した。
　具体的には以下の手順に従って二次元電気泳動ゲル中のタンパク質をメンブレン（ＰＶＤＦ膜）へ転写した。
　（１）ＰＶＤＦ膜を、１００％メタノールに浸漬し、次にmilliQ水に浸漬し、その後、転写用緩衝液に移して、ＰＶＤＦ膜の親水化処理を行った。
　（２）スポンジ、ろ紙、２次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥが終わったゲル、親水化処理済みＰＶＤＦ膜、ろ紙、スポンジの順でセットし、転写装置中、３０Ｖ定電圧で１時間通電した。
　イムノブロット
　メンブレンのイムノブロットを、１次抗体としてウズラの卵に対するアレルギーを有する患者の血清または健康被験者の血清を用いて行った。このウズラ卵アレルギーの患者は、鶏卵に対してはアレルギー反応を示さず、ウズラの卵に対してのみアレルギー反応を示す患者である。
　メンブレンのイムノブロットは、以下の手順に従って行った。
（１）転写したメンブレンを５％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液（非イオン界面活性剤Tween 20を０．３％含むＰＢＳバッファー）中、室温で１時間振とうした。
（２）１次抗体として、３％血清／５％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液中、室温で１時間静置した。
（３）ＰＢＳＴ溶液で洗浄した（５分×３回）。
（４）２次抗体として抗ヒトＩｇＥ－ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）を３％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液で２５００倍に希釈した溶液中、室温で１時間静置した。
（５）ＰＢＳＴ溶液で洗浄した（５分×３回）。
（６）Pierce Western Blotting Substrate Plus（Thermo社製）で、５分間静置した。
　解析
　上記一連の処理を施したメンブレンをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。
　ウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いたイムノブロットを、対照である健康被験者の血清を用いたイムノブロットと比較した。ウズラ卵黄のイムノブロットにおいてウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いた場合に、健康被験者の血清を用いた場合とは異なる４箇所のスポットが検出された（図２）。
　実施例３：インヒビション試験
　実施例２においてウズラ卵アレルギーの患者の血清を用いた場合に検出されたスポットが、ウズラ卵黄に特異的なスポットであることを確認するために、実施例２のイムノブロットを行う前に、鶏卵卵黄を用いたインヒビション試験を行った。
　具体的には、実施例２のイムノブロットの工程（２）の前に、血清７５μｌに鶏卵卵黄のＭＣＬ１抽出物（タンパク質量で１ｍｇ）を混和して室温で１時間静置したものを血清として用いて、実施例２と同様にイムノブロットを行った。
　その結果、分子量４５ｋＤａ付近、等電点５～９のスポット、および分子量３５ｋＤａ付近、等電点７～１２のスポットが、ウズラ卵アレルギーの患者の血清が、ウズラ卵黄のタンパク質に対して特異的に結合するものであることが明らかとなった（図３上段）。すなわち、これら２つのスポットは、ウズラの卵に対するアレルギーの抗原を示すものであることが裏付けられた。
　また、より正確を期すため、鶏卵卵黄についての２次元ゲル電気泳動に対して、ウズラ卵黄でインヒビションを行ったイムノブロットも行った。
　具体的には、鶏卵卵黄について、実施例１と同様の手順で２次元ゲル電気泳動を行った。そして、実施例２のイムノブロットの工程（２）の前に血清７５μｌにウズラ卵黄のＭＣＬ１抽出物（タンパク質量で１ｍｇ）を混和して室温で１時間静置したものを血清として用いて、実施例２と同様にイムノブロットを行った。
　ウズラ卵アレルギーの患者の血清を予めウズラ卵黄で処理した場合には、イムノブロットは健康被験者と同じパターンを示し、ウズラ卵アレルギーの患者に特異的なスポットは現れなかった（図３下段）。
　実施例４：質量分析
　実施例３で同定された２つのスポットを生じる抗原について、質量分析によるアミノ酸配列の同定を行った。
　具体的には、以下の手順でタンパク質の抽出および質量分析を行った。
（１）ウズラ卵黄について、実施例２の手順に従ってタンパク質抽出、２次元電気泳動及びメンブレン転写を行い、０．００８％Direct blue／４０％エタノール・１０％酢酸で振とうにより染色した。
（２）その後、４０％エタノール・１０％酢酸で５分間の処理を３回行って脱色し、水で５分間洗浄後、風乾した。
（３）目的のスポットをきれいなカッター刃で切り取り、遠心チューブに入れた。５０μＬのメタノールでメンブレン親水処理後、１００μＬの水で２回洗浄後遠心除去し、２０μＬの２０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３・５０％アセトニトリルを加えた。
（４）１ｐｍｏｌ／μＬリシルエンドペプチダーゼ（ＷＡＫＯ）１μＬを加え、３７℃で６０分間静置した後、溶液を新しい遠心チューブに回収した。２０μＬの２０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３・７０％アセトニトリルをメンブレンに加え、室温にて１０分間浸し、さらに回収した。０．１％ギ酸、４％アセトニトリル１０μＬで溶解し、チューブに移した。
（５）回収した溶液を減圧乾燥した後、Ａ液（０．１％ギ酸、４％アセトニトリル溶液）１５μｌで溶解し、質量分析（ESI-TOF5600, AB Sciex社製）を行った。
（６）質量分析計から得られた質量データに基づくタンパク質の同定は、ＮＣＢＩをサーチすることで行った。
　結果
　本実施例の条件の２次元電気泳動で、分子量３５ｋＤａ～５０ｋＤａ、等電点５～９の位置に現れるスポットについて、質量分析を行ったところ、配列番号１～～１６のアミノ酸配列が検出された。このスポットについて質量分析計から得られた質量データをＮＣＢＩで解析したところ、ウズラ（Coturnix japonica）由来のvitellogenin-1タンパク質（配列番号１８）の一部であることが同定された。
　また、本実施例の条件の２次元電気泳動で、分子量３０ｋＤａ～５０ｋＤａ、等電点７～１２の位置に現れるスポットについて、質量分析を行ったところ、配列番号１９～２２のアミノ酸配列が検出された。このスポットについて質量分析計から得られた質量データをＮＣＢＩで解析したところ、ウズラ（Coturnix japonica）由来のvitellogenin-2タンパク質（配列番号２４）の一部であることが同定された。
　本発明により、ウズラの卵に対するアレルギーの新規抗原、ウズラの卵に対するアレルギーの診断方法および診断キット、当該抗原を含む医薬組成物、当該抗原が除去されたウズラ卵またはウズラ卵加工品、ならびに当該抗原の有無を判定するためのテスターを提供することができる。

Claims (9)

  1. 　ウズラの卵に対するアレルギーの診断キットであって、以下（１）または（２）のタンパク質の少なくとも一つ：
    （１）（１Ａ）ビテロゲニン－１（Vitellogenin-1）タンパク質又はその変異体であって、以下の（１Ａ－ａ）～（１Ａ－ｅ）のいずれかのタンパク質：
    　（１Ａ－ａ）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（１Ａ－ｂ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（１Ａ－ｃ）配列番号１７において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（１Ａ－ｄ）配列番号１７で示される塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；もしくは
    　（１Ａ－ｅ）配列番号１７で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
    　（１Ｂ）配列番号１～１６および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質；
    （２）（２Ａ）ビテロゲニン－２（Vitellogenin-2）タンパク質又はその変異体であって、以下の（２Ａ－ａ）～（２Ａ－ｅ）のいずれかのタンパク質：
    　（２Ａ－ａ）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（２Ａ－ｂ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（２Ａ－ｃ）配列番号２３において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（２Ａ－ｄ）配列番号２３で示される塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；もしくは
    　（２Ａ－ｅ）配列番号２３で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
    　（２Ｂ）配列番号１９～２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質；
    を抗原として含む、前記診断キット。
  2. 　ウズラの卵に対するアレルギーの診断用組成物であって、請求項１において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つを抗原として含む、前記診断用組成物。
  3. 　対象のウズラの卵に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
    （ｉ）対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はＩｇ抗体が含まれる溶液である；
    （ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
    （ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がウズラの卵に対するアレルギーであることの指標が提供される；
    を含み、ここで当該抗原は、請求項１において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法。
  4. 　請求項１において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つを含む医薬組成物。
  5. 　ウズラの卵に対するアレルギーを治療するための、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　抗原が除去又は低減されていることを特徴とするウズラ卵又はウズラ卵加工品であって、当該抗原は請求項１において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記卵または卵加工品。
  7. 　請求項１において（１）又は（２）として特定されるタンパク質の少なくとも一つと結合する抗体を含むことを特徴とする、対象物におけるウズラの卵に対するアレルギーの原因となる抗原の有無を判定するためのテスター。
  8. 　配列番号１７または２３で示される塩基配列の少なくとも１つと相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする、対象物におけるウズラの卵に対するアレルギーの原因となる抗原の有無を判定するためのテスター。
  9. 　請求項１において（１）又は（２）として特定されるタンパク質であり、そしてウズラの卵に対するアレルギーの原因となる、ウズラ由来の抗原。
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