JP5433341B2 - 等電点電気泳動方法及び粗雑物除去の判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、等電点電気泳動方法及び粗雑物除去の判定方法に関する。更に詳しくは本発明は、電圧、電流の段階的な設定を適切に行い得る等電点電気泳動方法、その際にゲルの乾燥を防止できる等電点電気泳動方法及び粗雑物除去の判定方法に関する。この等電点電気泳動方法は、２次元電気泳動の１次元目としても適用できる。

なお、本発明において「粗雑物」とは、等電点電気泳動の検体中に含まれる荷電性の物質であって、分離・精製の対象とならないものをいう。例えば、分離・精製の対象が蛋白質である場合は、リン脂質、ゲノムＤＮＡやＲＮＡを含む核酸、脂肪酸、金属イオン、抽出用の界面活性剤等が粗雑物に含まれる。

従来、細胞抽出物などから蛋白質や核酸を分離・精製する方法が種々に検討されてきている。塩濃度を利用した析出、遠心分離などはその一例であるといえる。

また、蛋白質や核酸の残基が有する電荷や、分子量の違いを利用した精製方法も多数検討されている。電荷を利用した精製方法としては、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーや等電点電気泳動を例示できる。分子量の違いを利用した精製方法としては遠心分離、分子量篩によるカラムクロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥを例示できる。

近年、少量のサンプルから多様な蛋白質を分離精製する方法として、１次元目に等電点電気泳動を行い、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う２次元電気泳動法が用いられている。

特表２００２−５０３８１３号公報。 この特許文献１は、肝細胞性のガンの診断のために被験者の血清又は血漿について行う２次元電気泳動を開示している。

David R.M.Grahamet al. 「Improvements in two-dimensional gelelectrophoresis by utilizing a low cost "in-house" neutral pH sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis system」 Proteomics 2005,5,2309-2314。 この非特許文献１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む２次元電気泳動における「イン−ハウス・システム」と称する一定の改良について開示している。

等電点電気泳動によって検体に含まれる多数の分離対象物質を分離・精製する場合、検体の調製過程で粗雑物を除去する操作が行われるのが一般的であるが、当該粗雑物を検体から完全に除去するのは難しい。

等電点電気泳動では一般的に、電気泳動の早期に一定の低電圧で行う泳動工程（定電圧工程）によって粗雑物の除去を図り、次いで電圧を上昇させて行く工程（電圧上昇工程）に移るが、従来は、この定電圧工程を予め設定した一定の時間で終了させていた。

例えば、従来の手法である、３００Ｖ定電圧で３０分の泳動を行った後に電圧をあげるという一連の工程で行われた等電点電気泳動ではブロードしたスポットが見られるので、スポットの分離能や検出限界について改善の余地がある。ブロードの原因は、検体に残留している粗雑物をゲル中から十分に除去する前に電圧を上昇し始めてしまうために、泳動機器や分離対象物質に悪影響が及んでいることにある、と考えられる。即ち、上記従来の手法におけるブロードの原因は、等電点電気泳動における定電圧工程の時間が不足したからであると考えられる。しかし、この問題を解決するために、無原則に定電圧工程の時間を長くして行くと、等電点電気泳動全体のスループットが落ちてしまう。即ち、定電圧工程の適切な終了時点の指標が求められる。又、同様の意味で、粗雑物除去の良好な判定方法が求められる。

ところで、粗雑物である荷電性の物質は、ゲル中を移動するため、その動きを電流として捉えることができる。よって、電流の変化を指標にして定電圧工程の適切な終了時点、換言すれば粗雑物の除去の完了を判定することができる。即ち、単位時間あたりの電流変化幅を基準として、適切な定電圧工程を設定することができるし、また、適切な定電圧工程が行われたことが判定できると考えられる。

また、等電点電気泳動においては、電圧（Ｖ）と当該電圧を加えた時間（ｈｒ）の積であるＶｈｒを指標として用いることができる。適切な定電圧工程によって粗雑物を十分に除いた後、比較的高い電圧で等電点電気泳動を行えば、高スループットを実現できる。一方、比較的高い電圧で泳動を行う場合は熱を発生するので、ゲルが乾かないようにする措置も必要である。

そこで本発明は、適切な定電圧工程の設定により効率的に粗雑物を除去すると共に高スループットを実現し、加えてゲルの乾燥を防止した等電点電気泳動方法を提供すること、並びに適切な定電圧工程が行われたことを確認するために有用な粗雑物除去の判定方法を提供することを、解決すべき課題とする。

（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇工程を始める、等電点電気泳動方法である。

なお、上記の第１発明では、発明の効果を阻害しない限りにおいて、前記の定電圧工程に先だって任意の電圧印加工程を行うことも可能である。

（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に記載の等電点電気泳動方法において、電圧上昇工程の最終電圧が３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内である、等電点電気泳動方法である。

（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に記載の等電点電気泳動方法において、電極とゲルの間に水で湿らせた通電性の保水材を挟む、等電点電気泳動方法である。

第３発明において「水で湿らせた」とは、保水材全体に水が行きわたっているが、当該保水材を持ち上げたときに水の滴下がない状態を指す。「保水材」とは、限定はされないが、例えばろ紙をいう。

（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係る等電点電気泳動方法が、２次元電気泳動における１次元目の電気泳動として行うものである、等電点電気泳動方法である。

（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった時点で検体中の粗雑物が除去されたと判定する、粗雑物除去の判定方法である。

（第１発明）
第１発明によって、検体中の粗雑物を効率的に除去する等電点電気泳動方法が提供される。

第１発明では、電圧上昇工程の前に１００Ｖ〜６００Ｖという低い定電圧で定電圧工程を行う。等電点電気泳動の定電圧工程において比較的弱い定電圧をかけ、正に荷電した粗雑物は陰極に素早く移動させ、負に荷電した粗雑物は陽極に素早く移動させることで、泳動機器や検体中の分離対象物質に負荷をかけずにゲルから粗雑物を除くことができると考えられる。

第１発明の特徴は、粗雑物の除去を電流の測定によって判定することである。定電圧工程における電流量は、高い電流量が測定される段階、電流量が低下していく段階（ある程度の粗雑物が電極へ移動し終わった段階）、安定した電流量が測定される段階（粗雑物が除去された段階）のように変化していくと考えられる。即ち、定電圧工程の開始後は電流量に起伏が見られても、泳動を続けていくと電流量は安定するので、単位時間あたりの電流変化幅により電流の安定を判定し、もって粗雑物の除去を判定できる。具体的な判定基準として、ゲル１本につき泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内であれば、電流量の変化が小さいので電流量は安定しているといえる。そして、電流の安定（即ち、粗雑物の除去）を確認してから電圧上昇工程を始めれば、不十分な定電圧工程となることはなく、かつ、長すぎる定電圧工程となることもない。よって、効率的に粗雑物を除去する定電圧工程となる。

（第２発明）
第２発明の特徴は、最終電圧を３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内という高い電圧にすることである。等電点電気泳動においては、電圧（Ｖ）と当該電圧を加えた時間（ｈｒ）の積であるＶｈｒを指標として用いることができる。最終電圧を３０００Ｖ〜６０００Ｖという高い値に設定することで、より短い泳動時間で高いＶｈｒ値を得ることができる。よって、等電点電気泳動の高スループットを実現できる。

（第３発明）
等電点電気泳動においては、等電点電気泳動用ゲルに電極が接触する。特に、第２発明においては最終電圧が３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内という高い値になっているため熱が発生し易い。よって、電極付近のゲル中の水の蒸発によりゲルが乾かないようにする工夫が必要とされる。電極とゲルの間に水で湿らせたろ紙等の保水材を挟むことで、等電点電気泳動における電極付近のゲルの乾燥を抑制することができる。また、保水材に粗雑物が効率的に吸収され、粗雑物の除去も良好となると考えられる。

（第４発明）
第１発明〜第３発明のいずれかに係る等電点電気泳動方法を２次元電気泳動における１次元目の電気泳動として行うことにより、第１発明〜第３発明の効果を確保した２次元電気泳動を行うことができる。

（第５発明）
第５発明により、単位時間あたりの電流変化幅を判定基準として、検体中の粗雑物が有効に除去された時点を過不足なく決定できる。第１発明に関して前記したように、定電圧工程においては、検体に残存した粗雑物がゲルから除かれるまでの間に、高い電流量が測定される段階、電流量が低下していく段階（ある程度の粗雑物が電極へ移動し終わった段階）、安定した電流量が測定される段階（粗雑物が除去された段階）のように変化していくと考えられる。即ち、定電圧工程の開始後は電流量に起伏が見られても、泳動を続けていくと電流量は安定するので、単位時間あたりの電流変化幅により電流の安定を判定し、もって粗雑物の除去を判定できる。この内の「安定した電流量」の具体的な判定基準として、ゲル１本につき泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内であれば、電流量の変化が小さいので電流量は安定しているといえる。ゆえに、粗雑物が除去できたと判定することができる。

この第５発明の判定結果は、同様に処理された同様の検体を用いて同一条件下で再度の等電点電気泳動を行う際に、そのまま利用することができる。即ち、その際には、既に得られた判定結果に基づいて、定電圧工程の終了時点を例えば電気泳動装置に自動プログラミングすることが可能である。

第１実施例に係る２次元電気泳動の結果を示す。

第１実施例に対する比較例に係る２次元電気泳動の結果を示す。

単位時間あたりの電流変化幅を説明するグラフである。

次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下、「本発明」とは、上記第１発明〜第５発明を一括して称するものである。

〔単位時間あたりの電流変化幅〕
本発明における「単位時間あたりの電流変化幅」について図３を用いて説明する。図３における縦軸は電流（μＡ）であり、横軸は定電圧での等電点電気泳動の泳動時間（分）である。単位時間をｘ分間として、任意に定めたｎ分からｍ分までのｘ分間の電流を測定していき、当該ｘ分間の電流の変化幅（縦軸方向の変化幅）が、５μＡの範囲内、より好ましくは３μＡの範囲内であれば、等電点電気泳動を開始してｍ分間を経過した時点において電流は安定したと判定でき、粗雑物の除去ができたと判定できる。

〔等電点電気泳動用ゲル〕
本発明において用いられる等電点電気泳動用ゲルは、単独に等電点電気泳動を行うためのゲルであっても良いし、２次元電気泳動における１次元目の等電点電気泳動に用いるゲルであっても良い。

ゲルの種類は、等電点電気泳動用ゲルとして利用できるものである限りにおいて限定されないが、例えば、ポリアクリルアミドゲルを好ましく例示することができる。

等電点電気泳動用ゲルの形態は特に限定されない。しかし、棒状、円柱状を好ましい形態として例示することができる。さらに、これらの形態であれば２次元電気泳動の２次元目ゲルへの備え付けも簡便である。

等電点電気泳動用ゲルは、例えば、両性担体（キャリアアンフォライト）をポリアクリルアミドゲルに添加して、電場をかけて所望のｐＨ勾配を形成する手法や、種々の等電点の側鎖を持つアクリルアミド誘導体等のモノマー誘導体を用いてポリアクリルアミドゲル等のゲル作成と同時にｐＨ勾配を固定的に形成する手法（ＩＰＧ法）により作成したゲルが好ましく用いられる。

等電点電気泳動用ゲルのゲル長やｐＨ範囲及びｐＨ勾配等は必ずしも限定されない。しかし、ゲルのゲル長が長くなるほど通電による抵抗は大きくなる。よって、ゲル長を無制限に長くすると、泳動中にゲルの温度が上昇して、分離対象物質の等電点がずれたり、最悪の事態としてゲルが燃えてしまうという問題が起こりうる。そうなった場合、スポットの検出に悪影響が及ぶ。このような観点に加え、ゲル長の短縮化に基づく電気泳動時間の短縮、高スループット化のために、ゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内、特に５〜８ｃｍの範囲内であることが好ましい。

ゲルのｐＨの範囲は、例えば３〜１０にわたるものとすることができる。泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配も限定されないが、好ましくは、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５〜７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合に「ａ＜ｂ」及び「ｂ＞ｃ」の関係を満たすものであり、より好ましくは、ゲルの全長を１とした場合に、ａが０．１５〜０．３の範囲内、ｂが０．４〜０．７の範囲内、ｃが０．１５〜０．３の範囲内であるものであり、とりわけ好ましくは、「ａ+ｃ≦ｂ」の関係を満たすものである。このようなゲルのｐＨ勾配の設定は、例えば生物細胞の抽出物に含まれる各種蛋白質の等電点の分布が、蛋白質の種類においても、その量においてもｐＨ５〜７の領域に相対的に集中していることに対応したものであり、実質的に高分離能を損なうことなくゲル長を短縮化できる。

〔等電点電気泳動方法〕
等電点電気泳動は、検体中の蛋白質等の分離対象物質が有する等電点を利用して分離を行う。正に荷電した分離対象物質は陰極側に移動し、他方、負に荷電した分離対象物質は陽極側に移動する。そして、等電点（ｐＩ）と等しいｐＨのゲルの位置で分離対象物質の正味の電荷がゼロとなり、泳動を止める。よって泳動開始後は荷電状態の化合物が移動するので、電流が流れることとなる。

本発明において、泳動に用いられる機器は特に限定されない。しかし、ゲル長５〜１０ｃｍのゲルの使用に合致した電気泳動用機器が好ましく、ゲル長５〜８ｃｍのゲルの使用に合致した電気泳動用機器が特に好ましい。また、電圧又は電流を測定する装置は特に限定されない。あらかじめ電圧及び電流測定機能を備えた等電点電気泳動機器を用いることが好ましい。

本発明においては、電気泳動の早い段階において、ゲル１本につき、好ましくは１００Ｖ〜６００Ｖ、特に好ましくは２００Ｖ〜４００Ｖの範囲内の値の定電圧での泳動を行い、好ましくはゲル１本につき単位時間である泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内、特に好ましくは３μＡの範囲内となった後に電圧上昇工程を始め、当該電圧上昇工程の最終電圧が好ましくは３０００Ｖ〜６０００Ｖ、更に好ましくは４０００Ｖ〜５８００Ｖ、特に好ましくは５０００Ｖ〜５５００Ｖの範囲内とすることが望ましい。また、分離対象物質の等電点がずれないように、泳動中はゲルの温度を一定に保つことが好ましい。電圧と泳動時間の積であるＶｈｒ値は、８０００〜１５０００の範囲内となることが好ましい。

上記の実施形態により、以下の効果を期待できる。即ち、電圧上昇工程が始まる前に好ましくは１００Ｖ〜６００Ｖ、特に好ましくは２００Ｖ〜４００Ｖという低い定電圧で定電圧工程を行うことで、正に荷電した粗雑物は陰極に素早く移動させ、負に荷電した粗雑物は陽極に素早く移動させることで、泳動機器や検体中の分離対象物質に負荷をかけずにゲルから粗雑物を除くことができる。又、単位時間あたりの電流変化幅により粗雑物の除去を判定できるので、不十分な定電圧工程となることはなく、かつ、長すぎる定電圧工程を行うこともない。更に、最終電圧を好ましくは３０００Ｖ〜６０００Ｖ、更に好ましくは４０００Ｖ〜５８００Ｖ、特に好ましくは５０００Ｖ〜５５００Ｖという高い値に設定することで、より短い泳動時間で高いＶｈｒ値を得ることができ、等電点電気泳動の高スループットを実現できる。

定電圧工程によって粗雑物の影響を除けたか否かは、単位時間あたりの電流変化幅を指標として判定することが好ましいのは上記の通りである。定電圧工程における電流量は、高い電流量が測定される段階、電流量が低下していく段階（ある程度の粗雑物が電極へ移動し終わった段階）、安定した電流量が測定される段階（粗雑物が除去された段階）のように変化していくと考えられる。即ち、泳動開始後は電流量に起伏が見られるが泳動を続けていくと電流は安定するので、単位時間あたりの電流変化幅により電流の安定を判定し、もって粗雑物の除去を判定できる。

本発明においては、ゲルと電極の間に、ゲル中の水の移動の影響を軽減するための措置を講じることが好ましい。電極とゲルの間に水で湿らせた通電性の保水材を挟むことが特に好ましい。当該水で湿らせた通電性の保水材としては、水で湿らせたろ紙を好ましく例示することができる。

本発明においては、電圧上昇工程における電圧上昇の態様は特に限定されないが、電圧の上昇を徐々に行うことが好ましい。具体的には、電気泳動装置の電流値の上限をゲル１本につき４０〜８０μＡの範囲内の値で設定する。そして、定電圧工程での印加電圧から電圧上昇工程での最終電圧まで、ゲル温度が一定に保たれるようにして、電圧を上昇させることが好ましい。

〔２次元電気泳動〕
上記等電点電気泳動方法は、２次元電気泳動における１次元目の電気泳動として行うこともできる。この場合、２次元目の電気泳動は、必ずしも限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥであることが好ましい。２次元電気泳動を行う場合、等電点電気泳動に続いて、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われるので、以下、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて説明する。

〔２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、検体に界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、検体に含まれる蛋白質の高次構造を解くと共に、蛋白質のアミノ酸残基の荷電もＳＤＳによって相対的に減少させたもとで、分子篩い効果を利用して電気泳動を行うものである。よって、１次元目電気泳動を完了したゲルは予めＳＤＳ平衡化処理等を施されることが好ましい。

１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスでは、接着用（封入用）アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃である高融点アガロースを用い、かつ、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に前記１次元目電気泳動ゲルを設置することが好ましい。

上記の実施形態によって、２次元目電気泳動中に発生する熱により接着用アガロースのゲル化が弱くなる（ゲルがゆるくなる）ことが防止される。従って、そのような不具合に起因する２次元目電気泳動での検出スポットの広がり、検出限界の上昇、検出蛋白質の減少等の不具合を抑制できる。又、接着用アガロースの先入れにより、高融点アガロースが２次元目電気泳動用ゲルと接触して迅速に冷却されるため、ＳＤＳ平衡化緩衝液に尿素を加えていた場合でも、その熱分解が起こりにくい。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う機器は特に限定されない。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うＰＡＧ（ポリアクリルアミドゲル）に関し、モノマーであるアクリルアミドと架橋剤の総濃度（Ｔ％）や、アクリルアミドと架橋剤の総重量中で架橋剤が占める割合（Ｃ％）等は特に限定されない。

〔２次元目電気泳動用ゲル基端部のゲル濃度〕
１次元目電気泳動用ゲルのゲル長が短く設定されている場合には、２次元目として行うＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、その電気泳動用ゲルにおける泳動方向基端部のゲル濃度が３〜６％程度の低濃度であることが好ましい。ゲル濃度とは、直接的には当該ゲルの重合反応時のモノマー濃度を意味するが、重合反応時のモノマー濃度が高い程ゲルの網目構造は密になるので、実質的にはゲルの網目構造の密度を意味する。

上記の実施形態によれば、次の効果を期待できる。即ち、１次元目等電点電気泳動用ゲルのゲル長を、例えば５〜１０ｃｍ程度と短くすると、１次元目の電気泳動時間を短縮してハイスループット化等が可能となる一方、蛋白質のスポットの相互間隔がコンパクトになり、スポット中の蛋白質濃度も高くなる。これに対して２次元目電気泳動用ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度が高い（ゲルの網目が密である）と、スポット中に濃縮された蛋白質の２次元目電気泳動用ゲルへの移行に対して高いバリア性を示し、蛋白質の移行漏れが顕著になったり、スポットが泳動方向に対して横向きにブロードしてしまう。上記の実施形態により、このような不具合を抑制できる。

〔検体の調製〕
等電点電気泳動に適用される検体は特に限定されないが、動物、植物、微生物由来の抽出物や、化学、生化学的に合成された化合物、蛋白質、核酸等を含む種々の検体が適用できる。検体が生物細胞、特に動物細胞、とりわけヒト細胞の抽出物であることが好ましい。

上記したゲルのｐＨ勾配の設定は、例えば生物細胞の抽出物に含まれる各種蛋白質の等電点の分布が、蛋白質の種類においても、その量においてもｐＨ５〜７の領域に相対的に集中していることに対応したものであり、実質的に高分離能を損なうことなくゲル長を短縮化できる。

ゲル中においては分子量により泳動の速度が異なるが、ナトリウムイオン等の分子量の小さい物質は篩にかからないので素早くゲル中を移動する。また、ゲノムＤＮＡは分子量が大きいが、大きく負に荷電しているため、陽極に素早く移動する。検体の調製においては、機器への負荷を軽減し、定電圧工程を短くし、また、ゲル中のスポットの詰まりを抑制するため、分離・精製の対象とならない粗雑物を除くことが好ましい。そのために、透析、沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、親水−疎水相互作用を利用した分画等、種々の前処理を適用することができる。蛋白質が分離・精製の対象となる場合は、酸による沈殿及び有機溶媒による沈殿を好ましく例示できる。ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）による沈殿及びアセトンによる沈殿を更に好ましい手法として例示できる。

分離・精製に供される検体は、等電点電気泳動に使用するゲルの膨潤用の緩衝液に溶解して膨潤用検体溶液とし、ゲルの膨潤とともにゲル中に検体を取り込ませることができる。また、検体を適当な溶液に溶解し、膨潤後のゲルに適用することもできる。

このような等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成においては、ゲル全体に膨潤用検体溶液を適用した後、当該ゲルにオイルを流し込むことが行われるが、その際、従来のようにゲル表面に油性成分を流し込むのではなく、ゲルの長手方向の側端部から、とりわけゲルの長手方向の両側の側端部から同時に、油性成分を流し込むという方法が特に好ましい。油性成分としては、シリコンオイル又はミネラルオイル、とりわけ前者が好ましい。

上記の実施形態により、油性成分はゲルの側端部から中央部に向かって広がりゲルを覆う。油性成分がゲルを覆った状態でしばらく放置すると、検体は効率的にゲルに取り込まれる。その際、ゲルの側端部から中央部に向かって広がる油性成分によって膨潤用検体溶液がはじかれるため、膨潤用検体溶液のゲルへの染み込みが促進され、検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了する。従来のようにゲル表面に油性成分を流し込んだ場合、油性成分がゲルから広がるので、その流れに押されてはじかれた、染み込みきれていない膨潤用検体溶液の一部がゲルから拡散してしまい、検出できる蛋白質等の減少及びゲルの膨潤不足につながっていたと考えられるが、上記の実施形態によれば、このような検体成分の脱落を生じない。

以下に本発明の実施例と比較例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例、比較例によって限定されない。

〔第１実施例〕
(蛋白質の抽出)
ヒトケラチノサイトからなる再構成３次元培養皮膚（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製の商品名LabCyte EPI-MODEL 12）の培養物１枚（約１ｃｍ^２）を、蛋白質抽出液であるmammalian cell lysis kit；MCL1（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）５００μｌに浸漬し、４℃で２時間、ｖｏｌｔｅｘを使用して振とう破砕した。この振とう破砕の後、蛋白質抽出液を回収した。上記のmammalian cell lysis kit；MCL1の組成は下記の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ
２５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
０．５％（ｗ／ｖ） Deoxycholic acid sodium salt
１％（ｖ／ｖ） Igepal CA-630（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製の界面活性剤(Octylphenoxy)polyethoxyethanol）
適量のProtease Inhibitor
その後、2D-CleanUPキット〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社（以下、ＧＥ社と省略する）製〕を使用して２回の沈殿操作を行った。第１回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にＴＣＡを加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿（ＴＣＡ沈殿）を回収した。第２回目の沈殿操作は、回収した前記ＴＣＡ沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿（検体）を回収した。回収した当該検体は全量５００μｇであった。

（検体溶液の調製）
得られた検体の一部３０μｇを１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）１３０μｌに溶解し、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
７Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ
２Ｍ Ｕｒｅａ
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ：
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
０．５％（ｖ／ｖ） ＩＰＧbuffer；ＧＥ社製
適量のDeStreakReagent；ＧＥ社製
適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）
（１次元目等電点電気泳動用ゲルの調製）
前記したＩＰＧ法により、本実施例で用いる１次元目の等電点電気泳動用ゲル（ポリアクリルアミドゲル）を調製した。このゲルは長さが７ｃｍで径が０．３ｃｍの棒状ゲルであり、Ｔ=４％、Ｃ＝３％であって、ｐＨの範囲を３〜１０に設定した。

（１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透）
上記の１次元目等電点電気泳動用ゲルを前記した１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）１３０μｌに浸漬した後、シリコンオイルを流し込み、シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩、室温にて検体溶液をゲルに浸透させた。その後、当該シリコンオイルは廃棄した。

（一次元目の等電点電気泳動）
本実施例においては、電気泳動機器としてＧＥ社製のIPGphorとCup Loading Manifold Light Kitを使用した。本電気泳動機器は、電圧及び電流測定機能を備えるものであり、等電点電気泳動における電圧及び電流は本泳動機器を用いて測定した。

検体を浸透させたゲルの両端に水で湿らせたろ紙を設け、電極はゲルとの間に当該ろ紙を挟んだ状態でセットした。その後、ゲル及び濾紙の全体をシリコンオイルで浸漬した。

等電点電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、（１）３００Ｖ定電圧で泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となるまで合計１５０分間の定電圧工程を行い、（２）電圧上昇工程として３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。

（等電点電気泳動ゲルのＳＤＳ平衡化）
上記の１次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、１５分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１％（ｗ／ｖ） ＤＴＴ
次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、１５分・室温にて振とうし、ＳＤＳ平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
２．５％（ｗ／ｖ） Iodoacetamide
（２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
本実施例においては、電気泳動機器としてInvitrogen社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。２次元目泳動用ゲルはInvitrogen社製NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
５０ｍＭ ＭＯＰＳ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１ｍＭ ＥＤＴＡ
又、本実施例においては上記泳動用緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製：融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃のいわゆる高融点アガロース）と適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥのｗｅｌｌ中を十分に上記泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次に、ｗｅｌｌの中に充分に溶解させた接着用アガロース溶液を添加した。次に、ＳＤＳ平衡化したゲルをアガロース中に浸漬させ、ピンセットでＳＤＳ平衡化したゲルと２次元目泳動用ゲルを密着させた。当該両ゲルが密着した状態でアガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。

（ゲルの蛍光染色）
SyproRuby（Invitrogen社製）を用いてゲルの蛍光染色を行った。

まず、使用するタッパーを事前に９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで十分に洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ機器から泳動後の２次元目泳動用ゲルを取り外して、洗浄したタッパーにおき、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液に３０分間浸漬する処理を２回行った。その後、当該水溶液を水に置換し、１０分間浸漬した。次に、２次元目泳動用ゲルを４０ｃｃのSyproRuby（Invitrogen社製）に浸漬し、室温で一晩振とうした。次に、SyproRubyを除き、２次元目泳動用ゲルを水で洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液で３０分間振とうした。更に当該水溶液を水に置換し、３０分以上振とうした。

（解析）
上記一連の処理を施した２次元目泳動用ゲルをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。２次元電気泳動の結果を図１に示す。図１の左端はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用されたマーカーである。

〔第２実施例〕
第２実施例では、２Ｄ−ＤＩＧＥを行った。第２実施例においては、第１実施例に記載した手順の内、「（検体溶液の調製）」の項の手順を下記「（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）」の項の手順に変更し、又、「（ゲルの蛍光染色）」のプロセスを省略した以外は、第１実施例と同様の手順の操作を行った。

（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）
得られた検体の全量を下記の組成の溶液１００μｌに溶解した。
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
２Ｍ ThioUrea
７Ｍ Urea
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ
溶解したサンプル２０μｇに対しCydye（ＧＥ社製）１６０ｐｍｏｌを添加し、その溶液の入った容器を氷上で３０分間静置した。その後１０ｍＭリジン水溶液を０．５μｌ添加して更に１０分間、容器を氷上で静置した。このような処理を行った後、溶液を等電点電気泳動に適した量である１３０μｌまでDeStreak Rehydration Solutionでメスアップした。メスアップ後充分に攪拌し、氷上で１０分以上静置して、１次元目の等電点電気泳動用の検体溶液とした。

〔第１実施例に対する比較例〕
本比較例では、第１実施例における「（一次元目の等電点電気泳動）」の項の以下の変更点以外は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と同様に行った。

本比較例における等電点電気泳動は、（１）まず、３００Ｖ定電圧で合計３０分間の定電圧工程を行った（当該３０分間における電流変化幅は４５μＡであった）。（２）次に、電圧上昇工程として、３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるようにした。

本比較例の定電圧工程（上記（１）の工程）は、単位時間あたりの電流変化幅が４５μＡと大きい、即ち電流量の変化（低下）が大きな傾きを示している状態で定電圧工程を終了している。よって、ゲル中の粗雑物は十分に除けていないと判断できる。

本比較例における２次元電気泳動の結果を図２に示す。図２の左端はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用されたマーカーである。図２に対して図１では、明確にスポットが現れており、かつ、スポット同士の分離も良い。一方で、図２では、等電点電気泳動の総Ｖｈｒが第１実施例と等しいにも関わらず、分離能や検出限界について満足できる結果ではなかった。

第１実施例は、単位時間あたりの電流変化幅を判定基準とした定電圧工程を行っているので、効率的に粗雑物を除去できている。よって、第１実施例の定電圧工程は過不足のないものであり、等電点電気泳動の高スループットを実現している。また、ゲルの乾燥は認められなかった。

本発明によって、適切な定電圧工程の設定により効率的に粗雑物を除去すると共に高スループットを実現し、加えてゲルの乾燥を防止した等電点電気泳動方法、並びに適切な定電圧工程が行われたことを確認するために有用な粗雑物除去の判定方法が提供される。

Claims (6)

1. ２次元電気泳動における１次元目の電気泳動として行う等電点電気泳動方法であって、
   等電点電気泳動用ゲルのゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内であり、
   検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇工程を始めることを特徴とする等電点電気泳動方法。
2. 前記等電点電気泳動方法において、電圧上昇工程の最終電圧が３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の等電点電気泳動方法。
3. 前記等電点電気泳動方法において、電極とゲルの間に水で湿らせた通電性の保水材を挟むことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の等電点電気泳動方法。
4. 前記検体が、蛋白質を含む動物、植物、又は微生物由来の抽出物であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の等電点電気泳動方法。
5. 前記等電点電気泳動方法におけるＶｈｒ値が８０００〜１５０００の範囲内であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の等電点電気泳動方法。
6. ２次元電気泳動における１次元目の電気泳動として行う等電点電気泳動方法において、
   等電点電気泳動用ゲルのゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内であり、
   検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった時点で上記定電圧工程を終了可能と判定する方法。