JP2022157411A - 牛乳アレルギーの新規抗原 - Google Patents
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Abstract
Description
[態様1]
以下の(E1)-(E25)のポリペプチドの少なくとも一つを含む、アレルギーの診断キット:
(E1)配列番号27-58、および1115のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E2)配列番号59-97のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E3)配列番号98-144のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E4)配列番号145-195のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E5)配列番号196-254、および1116-1118のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E6)配列番号255-288のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E7)配列番号289-333、および1119-1120のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E8)配列番号334-352のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E9)配列番号353-376、および1121-1122のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E10)配列番号377-384のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E11)配列番号385-411のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E12)配列番号412-450のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E13)配列番号451-500、および1123-1124のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E14)配列番号501-604、および1125-1127のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E15)配列番号605-632、および1128のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E16)配列番号633-673のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E17)配列番号674-693のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E18)配列番号694-757、および1129のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E19)配列番号758-791のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E20)配列番号792-868、および1130のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E21)配列番号869-927のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E22)配列番号928-996のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E23)配列番号997-1037のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E24)配列番号1038-1075のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;あるいは
(E25)配列番号1076-1114、および1131のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[態様2]
アレルギーの診断用組成物であって、態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも1つを含む、前記診断用組成物。
[態様3]
対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程:
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は、態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つである、前記方法。
[態様4]
態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つであり、そして、アレルギーの原因となる、前記抗原。
[態様5]
態様4に記載の抗原の少なくとも一つを含む組成物。
[態様6]
アレルギーを治療するための、態様5に記載の組成物。
[態様7]
態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つと結合する抗体を含む、対象物における抗原の有無を判定するためのテスター組成物。
[態様8]
態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチド、をコードする核酸の塩基配列の一部及び/またはその相補鎖の一部を含むプライマー、を少なくとも1つ含む、対象物における抗原の有無を判定するためのテスター組成物。
[態様9]
態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドを含む、対象におけるIgE抗体の有無を判定するためのテスター組成物。
[態様10]
態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの原料・加工品中の有無を判定する方法であって、前記原料・加工品中に態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドを検出する、ことを含む、前記方法。
[態様11]
抗原が除去又は低減されている、原料または加工品であって、当該抗原は態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つである、前記原料または加工品。
[態様12]
抗原が除去若しくは低減されている原料または加工品の製造方法であって、当該原料または加工品の製造過程で抗原が除去若しくは低減されていることを確認するステップを有し、ここで当該抗原は態様1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つである、前記製造方法。
牛乳に含まれるタンパク質を下記の条件で2次元電気泳動に供し、牛乳に対するアレルギーの抗原の特定を行った。
各スポットについて質量分析による配列同定を行った。質量分析装置から得られた質量データをUniprot、NCBIのタンパク質データと照合して解析した。その結果、スポット1~14の各スポットが公知の配列と一致することが判明した。
各スポットの情報を以下の表1にまとめた。
(1)イムノグロブリンMヘビーチェインシクリートリーフォーム(Immunoglobulin M heavy chain secretory form)(スポット1);
(2)ベータ1メタルバインディンググロブリン(Beta-1 metal-binding globulin)(スポット2及び3);
(3)ラクトペルオキシダーゼ(Lactoperoxidase)(スポット4);
(4)Igヘビーチェィンプレカーサー(Ig heavy chain precursor (B/MT.4A.17.H5.A5))(スポット5);
(5)ペリリピン(Perilipin)(スポット6);
(6)ポリメリックイムノグロブリンレセプター(Polymeric immunoglobulin receptor)(スポット7);
(7)C3-ベータ-c(C3-beta-c)(スポット8);
(8)イムノグロブリンライトチェインラムダジーンクラスター(Immunoglobulin light chain, lambda gene cluster)(スポット9);
(9)グリコプロテイン2(Glycoprotein 2)(スポット10);
(10)ラクトアドヘリン(Lactadherin)(スポット11);
(11)ジンク-アルファ2-グリコプロテイン(Zinc-alpha-2-glycoprotein)(スポット12);
(12)イントラセルラーコレステロールトランスポーター2(Intracellular cholesterol transporter 2)(スポット13);
(13)アポリポプロテインA-IV(Apolipoprotein A-IV)(スポット14)。
グループ1(signal transduction機能):タンパク質(1)、(2)、(3)、(4)、(5);
グループ2(immune system機能):タンパク質(1)、(4)、(6)、
(7)、(8);
グループ3(glycoprotein機能):タンパク質(9)、(10)、(11);
グループ4(cholesterol binding機能):タンパク質(12)、(13)。
(1-b)配列番号2において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1-c)配列番号2で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1-d)配列番号1において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1-e)配列番号1で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(1-f)配列番号1で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(2-b)配列番号4において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2-c)配列番号4で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2-d)配列番号3において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2-e)配列番号3で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(2-f)配列番号3で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(3-b)配列番号6において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3-c)配列番号6で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3-d)配列番号5において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3-e)配列番号5で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(3-f)配列番号5で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(4-b)配列番号8において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4-c)配列番号8で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4-d)配列番号7において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4-e)配列番号7で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(4-f)配列番号7で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(5-b)配列番号10において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5-c)配列番号10で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5-d)配列番号9において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5-e)配列番号9で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(5-f)配列番号9で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(6-b)配列番号12において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6-c)配列番号12で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6-d)配列番号11において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6-e)配列番号11で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(6-f)配列番号11で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(7-b)配列番号14において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7-c)配列番号14で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7-d)配列番号13において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7-e)配列番号13で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(7-f)配列番号13で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(8-b)配列番号16において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8-c)配列番号16で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8-d)配列番号15において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8-e)配列番号15で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(8-f)配列番号15で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(9-b)配列番号18において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9-c)配列番号18で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9-d)配列番号17において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9-e)配列番号17で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(9-f)配列番号17で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(10-b)配列番号20において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10-c)配列番号20で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10-d)配列番号19において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10-e)配列番号19で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(10-f)配列番号19で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(11-b)配列番号22において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(11-c)配列番号22で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(11-d)配列番号21において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(11-e)配列番号21で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(11-f)配列番号21で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(12-b)配列番号24において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12-c)配列番号24で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12-d)配列番号23において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12-e)配列番号23で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(12-f)配列番号23で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(13-b)配列番号26において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(13-c)配列番号26で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(13-d)配列番号25において1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(13-e)配列番号25で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(13-f)配列番号25で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
A群:ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、グリシン、システイン、プロリン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、
E群:セリン、スレオニン
F群:フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある1つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができる。例えば、不用意な糖鎖修飾を排除するために上記のB、D、E群のアミノ酸をそれ以外の群のアミノ酸に置換してもよい。または、3次構造でタンパク質中に折りたたまれることを防ぐためにシステインを欠失させるか、他のアミノ酸に置換してもよい。あるいは、親水性/疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性/親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数(J. Kyte 及びR. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982)を考慮して、アミノ酸を置換してもよい。
本発明は、対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程:
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は上記(1)~(13)の抗原として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法を提供する。
(A)1次元目の等電点電気泳動ゲルとして、ゲル長が5~10cmの範囲内であって、ゲルのpH範囲が3~10であり、泳動方向に対するゲルのpH勾配が、pH5までのゲル長をa、pH5~7のゲル長をb、pH7以上のゲル長をcとした場合において、「a<b]及び「b>c」の関係を満たす;
(B)(A)の場合であって、ゲルの全長を1とした場合、aが0.15~0.3の範囲内、bが0.4~0.7の範囲内、cが0.15~0.3の範囲内である;
(C)1次元目の等電点電気泳動において、検体を含むゲル1本につき100V~600Vの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動30分あたりの泳動変化幅が5μAの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇行程を始める;
(D)(C)の場合に、電圧上昇工程の最終電圧を3000V~6000Vの範囲内とする;
(E)1次元目の等電点電気泳動ゲルの長手方向のゲル長が5~10cmであって、2次元目電気泳動ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度を3~6%とする;および
(F)(E)の場合に、2次元目電気泳動ゲルの泳動方向先端側の部分のゲル濃度が、泳動方向基端部のゲル濃度よりも高く設定する;
からなる群より選択される少なくとも一つを満たす条件で2次元電気泳動を行うことができる。
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであると判断する;
ことを含み、ここで当該抗原は上記(1)~(13)の抗原として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法を提供する。ここにおいて(i)および(ii)の各工程は、アレルギーを診断するための指標を提供する方法の各工程について説明したとおりに行われる。
本発明は、上記(1)~(13)の抗原の少なくとも一つを含む組成物を提供する。
本発明は、上記(1)~(13)の抗原の少なくとも一つに対する抗体を含むテスター組成物を提供する。
・作製したIg抗体を含むテスター組成物を原料・加工品等から得られた試料に接触させて、例えばELISA等を用いて当該Ig抗体と試料中の抗原との結合を検出し、当該Ig抗体と抗原との結合が検出された場合に、対象原料・加工品等に当該抗原が含まれると判断する方法。
・ろ紙などに原料・加工品をしみこませ、そこに含まれる抗原を検出するように、抗体溶液を反応させる方法。
本発明は、上記(1)~(13)の抗原の少なくとも一つに対する抗体を、原料・加工品(液体を含む)とを接触させることを含む、上記(1)~(13)の抗原の対象物質中の有無を判定する方法を含む。
本発明は、上記(1)~(13)の抗原の少なくとも一つが除去又は低減されていることを特徴とする原料または加工品を提供する。一態様において、「原料または加工品」は、「牛乳または牛乳加工品」であり、「牛肉または牛肉加工品」であってもよい。
本発明は、抗原が除去または低減されている原料または加工品の製造方法であって、当該原料または加工品の製造過程で抗原が除去又は低減されていることを確認するステップを有する、ここで当該抗原は上記(1)~(13)の抗原の少なくとも一つである、前記製造方法を提供する。
実施例1-3に示すとおり特定した抗原について、実施例4に示すとおり、エピトープおよびそのエピトープ内でアレルギー患者のIgE抗体との結合性に重要なアミノ酸を特定した。
(2)ベータ1メタルバインディンググロブリン(Beta-1 metal-binding globulin)タンパク質由来:(E3)、(E4)、(E5)、(E6)、(E7)、(E8);
(3)ラクトペルオキシダーゼ(Lactoperoxidase)タンパク質由来:(E9)、(E10);
(4)Igヘビーチェィンプレカーサー(Ig heavy chain precursor (B/MT.4A.17.H5.A5))タンパク質由来:(E14)、(E15);
(5)ペリリピン(Perilipin)タンパク質由来:(E16)、(E17);
(6)ポリメリックイムノグロブリンレセプター(Polymeric immunoglobulin receptor)タンパク質由来:(E11)、(E12);
(7)C3-ベータ-c(C3-beta-c)タンパク質由来:(E13);
(8)イムノグロブリンライトチェインラムダジーンクラスター(Immunoglobulin light chain, lambda gene cluster)タンパク質由来:(E23);
(9)グリコプロテイン2(Glycoprotein 2)タンパク質由来:(E20)、(E21);
(10)ラクトアドヘリン(Lactadherin)タンパク質由来:(E22);
(11)ジンク-アルファ2-グリコプロテイン(Zinc-alpha-2-glycoprotein)タンパク質由来:(E18)、(E19);
(12)イントラセルラーコレステロールトランスポーター2(Intracellular cholesterol transporter 2)タンパク質由来:(E24);
(13)アポリポプロテインA-IV(Apolipoprotein A-IV)タンパク質由来:(E25)。
(E2)配列番号59-97のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E3)配列番号98-144のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E4)配列番号145-195のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E5)配列番号196-254、および1116-1118のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E6)配列番号255-288のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E7)配列番号289-333、および1119-1120のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E8)配列番号334-352のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E9)配列番号353-376、および1121-1122のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E10)配列番号377-384のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E11)配列番号385-411のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E12)配列番号412-450のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E13)配列番号451-500、および1123-1124のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E14)配列番号501-604、および1125-1127のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E15)配列番号605-632、および1128のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E16)配列番号633-673のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E17)配列番号674-693のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E18)配列番号694-757、および1129のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E19)配列番号758-791のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E20)配列番号792-868、および1130のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E21)配列番号869-927のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E22)配列番号928-996のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E23)配列番号997-1037のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E24)配列番号1038-1075のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E25)配列番号1076-1114、および1131のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
本発明は、対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程:
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一つであるポリペプチド、または2以上の上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドがスペーサーを介してもしくは介さずに連結されたポリペプチドである、前記方法を提供する。
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであると判断する;
ことを含み、ここで当該抗原は上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドして特定されるポリペプチドの少なくとも一つである、前記方法を提供する。ここにおいて(i)および(ii)の各工程は、アレルギーを診断するための指標を提供する方法の各工程について説明したとおりに行われる。
本発明は、上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一つを含む組成物を提供する。
本発明は、上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一つに対する抗体を含むテスター組成物を提供する。
・ろ紙などに原料・加工品等をしみこませ、そこに含まれる上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出するように、抗体溶液を反応させる方法。
本発明は、上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドの原料・加工品中の有無を判定する方法を含む。当該方法は、原料・加工品中に上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列の全体又は部分を有するポリペプチドを検出することを含む。
本発明は、上記(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一つが除去又は低減されていることを特徴とする原料または加工品を提供する。
本発明は、(E1)-(E25)のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一つがが除去又は低減されている原料または加工品の製造方法であって、当該加工品の製造過程で抗原が除去又は低減されていることを確認するステップを有する、前記製造方法を提供する。
実施例1:タンパク質パターンの確認
下記の二次元電気泳動方法を使用して、牛乳(Bos taurus由来乳汁)に含まれるタンパク質を調べた。
牛乳に含まれるタンパク質の抽出及び精製は次のように行った。牛乳に、尿素バッファーを加えてタンパク質を抽出した。尿素バッファーの組成は以下の通りである。
30mM Tris
2M チオ尿素
7M 尿素
4%(w/v) CHAPS:
3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホナート
適量の希塩酸
蒸留水を加えて全体を100mLに調整した。pHは8.5であった。その後、2D-CleanUPキット(GE社製)を使用して2回の沈殿操作を行った。第1回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にTCA(トリクロロ酢酸)を加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿(TCA沈殿)を回収した。第2回目の沈殿操作は、回収した前記TCA沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿(検体)を回収した。
得られた検体の一部(タンパク質重量として100μg)を、1次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution(GE社製)150μlに溶解し、1次元目等電点電気泳動用の検体溶液(膨潤用検体溶液)とした。DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
7M チオ尿素
2M 尿素
4%(w/v) CHAPS
0.5%(v/v) IPGバッファー;GE社製
適量のBPB(ブロモフェノールブルー)
1次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透
1次元目等電点電気泳動用ゲル(GE社製:IPGゲルImmobiline Drystrip (pH3-10NL))を前記した1次元目等電点電気泳動用の検体溶液(膨張用検体溶液)140μlに浸漬し、一晩室温にて浸透させた。
上記の1次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、15分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
6M 尿素
30%(v/v) グリセロール
2%(w/v) SDS
1%(w/v) DTT
次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、15分・室温にて振とうし、SDS平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
6M 尿素
30%(v/v) グリセロール
2%(w/v) SDS
2.5%(w/v) ヨードアセトアミド
2次元目のSDS-PAGE
本実施例においては、電気泳動機器としてlife technologies社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。2次元目泳動用ゲルはlife technologies社製NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
50mM MOPS
50mM Tris塩基
0.1%(w/v) SDS
1mM EDTA
また、本実施例においては泳動用緩衝液に0.5%(w/v)のアガロースS(ニッポンジーン社製)と適量のBPB(ブロモフェノールブルー)を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。
SYPRO Ruby(life technologies社製)を用いてゲルの蛍光染色を行った。
上記一連の処理を施した2次元目泳動用ゲルをTyphoon9500(GE社製)を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。牛乳に含まれるタンパク質について、2次元電気泳動の結果を図1に示す。各図のゲルの写真の左側には、分子量マーカーのバンドが見られ、バンドの位置が特定の分子量(KDa)を示す。
イムノブロットでの抗原確認は、実施例1に記載した手順を「2次元目のSDS-PAGE」まで行った後、以下の「メンブレンへの転写」「イムノブロット」「解析」の操作を行うことにより行った。
メンブレンへの転写は、以下の転写装置及び転写用緩衝液を用いて行った。
転写装置:XCell SureLock Mini-Cell およびXCell IIブロットモジュール(life technologies社製)
転写用緩衝液: NuPAGEトランスファーバッファー(×20)(life technologies社製)をmilliQ水で20倍希釈して使用した。
メンブレンのイムノブロットを、1次抗体として牛乳に対するアレルギーを有する患者の血清または非牛乳アレルギー被験者の血清を用いて行った。
(1)転写したメンブレンをPierce(登録商標)Fast Blocking Buffer (Thermo社製)(以下、「Fast Block」と記載)中、室温で1時間振とうした。
(2)1次抗体として、10%血清/Fast Block溶液中、室温で1時間静置した。
(3)PBST溶液(非イオン性界面活性剤Tween(登録商標)20を0.1%含むPBSバッファー)で洗浄した(5分×3回)。
(4)2次抗体として抗ヒトIgE-HRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)をFast Block溶液で5000倍に希釈した溶液中、室温で1時間振とうした。
(5)PBST溶液で洗浄した(5分×3回)。
(6)Pierce Western Blotting Substrate Plus(Thermo社製)で、5分間静置した。
上記一連の処理を施したメンブレンをTyphoon9500(GE社製)を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。
上記の各スポットを生じる抗原について、質量分析によるアミノ酸配列の同定を行った。
(1)牛乳について、実施例1及び2の手順に従ってタンパク質抽出、2次元電気泳動及びメンブレン転写を行い、0.008%Direct blue/40%エタノール・10%酢酸で振とうにより染色した。
(2)その後、40%エタノール・10%酢酸で5分間の処理を3回行って脱色し、水で5分間洗浄後、風乾した。
(3)目的のスポットをきれいなカッター刃で切り取り、遠心チューブに入れた。50μLのメタノールでメンブレン親水処理後、100μLの水で2回洗浄後遠心除去し、20μLの20mM NH4HCO3・50%アセトニトリルを加えた。
(4)1pmol/μLリシルエンドペプチダーゼ(WAKO)1μLを加え、37℃で60分間静置した後、溶液を新しい遠心チューブに回収した。20μLの20mM NH4HCO3・70%アセトニトリルをメンブレンに加え、室温にて10分間浸し、さらに回収した。0.1%ギ酸、4%アセトニトリル10μLで溶解し、チューブに移した。
(5)回収した溶液を減圧乾燥した後、A液(0.1%ギ酸、4%アセトニトリル溶液)15μlで溶解し、質量分析(ESI-TOF6600, AB Sciex社製)を行った。
(6)質量分析計から得られた質量データに基づくタンパク質の同定は、Uniprot、NCBIをサーチすることで行った。
各スポットのアミノ酸配列を検出した、さらに、各スポットについて、質量分析計から得られた質量データをUniprot,NCBIで解析したところ、各スポットは表1に示すタンパク質であることが同定された。
牛乳のアレルゲンコンポーネントのエピトープ
牛乳のアレルゲンコンポーネントのエピトープについて、以下の手順によりエピトープの同定を行った。
牛乳のアレルギーコンポーネントとして特定したアミノ酸配列に対応するオーバーラップペプチド(長さ:15アミノ酸)のライブラリーによって、エピトープマッピングを行った。具体的には、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、及び26のアミノ酸配列に基づいてオーバーラップペプチドのライブラリーを調製した。
384ウェル合成プレート中のアミノ修飾セルロースディスク上で、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学反応を利用して、ペプチド合成を段階的に行った。すなわち、Fmoc基がアミノ基に結合したアミノ酸をジメチルホルムアミド(DMF)中のN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の溶液で活性化し、前記セルロースディスクに滴下してセルロースディスク上のアミノ基へ前記Fmoc基結合アミノ酸を結合させ(カップリング)、未反応のアミノ基を無水酢酸によりキャッピングしてDMFにより洗浄し、さらにピペリジンで処理してDMFにより洗浄して、セルロースディスク上のアミノ基に結合したアミノ酸のアミノ基からFmoc基を除去した。前記セルロースディスク上のアミノ基に結合したアミノ酸に対して、上記カップリング、キャッピング、およびFmoc基の除去を反復して行うことにより、アミノ末端を伸長させてペプチド合成を行った。
上記「(1)ペプチドの合成」で得られた目的のペプチドが結合したセルロースディスクを96ウェルプレートに移し、アミノ酸の側鎖の脱保護のため、トリフルオロ酢酸(TFA)、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン(TIPS)、および水の側鎖脱保護混合液で処理した。その後、脱保護されたセルロース結合ペプチドを、TFA、ペルフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)、TIPS、および水の混合液で溶解し、テトラブチルメチルエーテル(TBME)で沈殿させ、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に再懸濁し、NaCl、クエン酸Na、および水の混合液と混合し、スライドスポット用ペプチド溶液を得た。
上記「(2)アミノ修飾セルロースディスクの溶解」で得られたスライドスポット用ペプチド溶液を、Intavisスライドスポッティングロボットを用いて、Intavis CelluSpots(商標)スライド上にスポットし、これを乾燥させてペプチドアレイを調製した。
(1)ペプチドを、Pierce Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo社製)中で、室温で1時間振盪した。
(2)2%血清/Pierce Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo社製)
中で、4℃で一晩振盪した。
(3)PBST(非イオン界面活性剤Tween(登録商標) 20を3%含むPBSバッファ
ー)で5分洗浄した(×3回)。
(4)抗ヒトIgE抗体-HRP(1:20,000、Pierce Protein-Fr
ee(PBS)Blocking Buffer(Thermo社製))を添加し、室温で1時間振盪した。
(5)PBSTで5分洗浄した(×3回)。
(6)Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate(Thermo社製)を添
加し、室温で5分間振盪した。
(7)Amersham Imager 600を使用して、上記(1)~(6)の処理を施し
たペプチドの化学発光を測定した。
上記(A)により患者特異的に血清中IgE抗体が結合したペプチドの配列(配列番号27、59、98、145、196、255、289、334、353、377、385、412、451、501、605、633、674、694、758、792、869、928、997、1038、1076)を基に、当該ペプチドの配列および当該ペプチドの配列を含むアレルギーコンポーネントのアミノ酸配列における当該ペプチドの前後の配列を付加した配列において、オーバーラップペプチド断片(長さ:10アミノ酸)のライブラリーを作成し、エピトープマッピングを行った。
上記(A)で同定したアミノ酸配列について、アラニングリシンスキャンと呼ばれる手法(非特許文献1)により、アミノ末端側から1アミノ酸ずつアラニン(元のアミノ酸がアラニンの場合はグリシン)に置換したペプチド断片のライブラリーを、上記と同様の手法で調製し、上記と同様の手法で患者の血清中のIgE抗体が結合するか否かを各ペプチド断片について評価した。アラニングリシン置換により患者のIgE抗体への結合性が喪失あるいは著しく減少した位置のアミノ酸は、本来の抗原性の発現のために重要なアミノ酸、または本来の抗原性の発現に影響するアミノ酸と判断し、患者のIgE抗体への結合性が喪失あるいは著しく減少しなかったアミノ酸は、本来の抗原性の発現のためには重要ではなく、置換が可能なアミノ酸と判断した。
上記表2の、牛乳の各タンパク質について見出された各エピトープ配列中におけるIgE抗体との結合維持に重要なアミノ酸以外のアミノ酸を、任意のアミノ酸(X)とした鍵配列について、表2-26に記載の、各患者が同時に有するアレルゲン食材に対して同配列を有するタンパク質をBLASTで検索した結果、一例として表2の「交差確認食物」の列に記載の各食物の配列に含まれるアミノ酸配列がヒットした。
Claims (12)
- 以下の(E1)-(E25)のポリペプチドの少なくとも一つを含む、アレルギーの診断キット:
(E1)配列番号27-58、および1115のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E2)配列番号59-97のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E3)配列番号98-144のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E4)配列番号145-195のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E5)配列番号196-254、および1116-1118のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E6)配列番号255-288のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E7)配列番号289-333、および1119-1120のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E8)配列番号334-352のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E9)配列番号353-376、および1121-1122のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E10)配列番号377-384のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E11)配列番号385-411のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E12)配列番号412-450のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E13)配列番号451-500、および1123-1124のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E14)配列番号501-604、および1125-1127のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E15)配列番号605-632、および1128のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E16)配列番号633-673のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E17)配列番号674-693のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E18)配列番号694-757、および1129のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E19)配列番号758-791のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E20)配列番号792-868、および1130のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E21)配列番号869-927のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E22)配列番号928-996のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E23)配列番号997-1037のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(E24)配列番号1038-1075のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;あるいは
(E25)配列番号1076-1114、および1131のアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド。 - アレルギーの診断用組成物であって、請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも1つを含む、前記診断用組成物。
- 対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程:
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は、請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つである、前記方法。 - 請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つであり、そして、アレルギーの原因となる、前記抗原。
- 請求項4に記載の抗原の少なくとも一つを含む組成物。
- アレルギーを治療するための、請求項5に記載の組成物。
- 請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つと結合する抗体を含む、対象における抗原の有無を判定するためのテスター組成物。
- 請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチド、をコードする核酸の塩基配列の一部及び/またはその相補鎖の一部を含むプライマー、を少なくとも1つ含む、対象物における抗原の有無を判定するためのテスター組成物。
- 請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドを含む、対象におけるIgE抗体の有無を判定するためのテスター組成物。
- 請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの原料・加工品中の有無を判定する方法であって、前記原料・加工品中に請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドを検出する、ことを含む、前記方法。
- 抗原が除去又は低減されている、原料または加工品であって、当該抗原は請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つである、前記原料または加工品。
- 抗原が除去若しくは低減されている原料または加工品の製造方法であって、当該原料または加工品の製造過程で抗原が除去若しくは低減されていることを確認するステップを有し、ここで当該抗原は請求項1において(E1)~(E25)として特定されるポリペプチドの少なくとも一つである、前記製造方法。
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