KR102102031B1 - 메추리알 알레르기의 항원 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 메추리알에 대한 알레르기의 신규 항원, 메추리알에 대한 알레르기의 진단 방법 및 진단 키트, 해당 항원을 포함하는 의약 조성물, 및 해당 항원이 제거된 메추리알 또는 메추리알 가공품을 제공한다.

Description

메추리알 알레르기의 항원{QUAIL EGG ALLERGY ANTIGEN}

본 발명은, 메추리알에 대한 알레르기의 신규 항원에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 메추리알에 대한 알레르기의 진단 키트, 진단용 조성물, 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 해당 항원을 포함하는 의약 조성물, 해당 항원이 제거된 메추리알 또는 메추리알 가공품, 및 해당 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터에 관한 것이다.

알레르기 환자의 혈청 및 조직 중에서는, 특정 항원에 특이적인 IgE 항체가 산생(産生)된다. 이 IgE 항체와 특정 항원의 상호작용에 의해 발생한 생리학적 결과에 의해 알레르기 반응이 야기된다.

종래의 알레르기 검사약에 있어서는, 단지 알레르겐 후보의 식품·재료 등을 갈아서 으깨어 항원 시약을 작성한 것이 많다(특허문헌 1). 이와 같이 종래의 항원 시약은, 반드시 알레르기 반응을 일으키는 특정 항원 단백질(알레르겐 컴퍼넌트)을 단독으로 함유하는 것은 아니고, 복수의 단백질 성분을 포함하는 것이다. 따라서, 종래의 항원 시약에 있어서는, 알레르겐 컴퍼넌트마다 함유량이 상이했다. 이 때문에, 종래의 항원 시약중에 포함되는 다수의 단백질 중에서, IgE 항체와의 결합에 관하여 양성 반응을 판정 가능한 문턱값을 초과하는 함유량의 단백질이 알레르겐 컴퍼넌트였을 경우에만, 알레르기 검사에 있어서의 양성 반응을 검출하는 것이 가능했다. 반대로, 식품 등의 알레르겐 중의 함유량이 적은 알레르겐 컴퍼넌트에 IgE 항체가 결합되는 환자에 관하여는, 종래의 알레르기 검사약을 사용해도 양성 반응을 판정할 수 없는 상태였다.

또한, 알레르기 반응의 증상이나 위중도는, 알레르겐 컴퍼넌트의 함유량과는 반드시 상관되지 않는다. 알레르겐 후보의 식품·재료 중에 미량으로 포함되는 알레르겐 컴퍼넌트에 환자의 IgE 항체가 반응하는 경우이어도 알레르기 증상이 나타나거나, 위중도에 관여하거나 하는 경우가 있다.

따라서, 알레르기 검사의 신뢰도를 높이기 위해서는, 알레르겐 후보의 식품·재료에 있어서, 알레르겐 컴퍼넌트를 망라하여 특정할 필요가 있다.

한편, 단백질의 분리·정제에 관해서는, 종래, 세포 추출물 등으로 단백질이나 핵산을 분리·정제하는 방법이 여러 가지로 검토되어 왔다. 소금 농도를 이용한 투석, 원심분리 등은 그 일례라고 할 수 있다.

또한, 단백질이나 핵산의 잔기(殘基)가 가지는 전하나, 분자량의 차이를 이용한 정제 방법도 다수 검토되고 있다. 전하를 이용한 정제 방법으로서는, 이온교환 수지를 이용한 컬럼크로마토그래피나 등전점 전기 영동을 예시할 수 있다. 분자량의 차이를 이용한 정제 방법으로서는 원심분리, 분자량체에 의한 컬럼크로마토그래피나 SDS-PAGE(도데실황산나트륨-폴리아크릴아마이드겔 전기 영동)를 예시할 수 있다.

최근, 소량의 샘플로부터 다양한 단백질을 분리 정제하는 방법으로서, 1차원의 등전점 전기 영동을 실시하고, 2차원의 SDS-PAGE를 실시하는 2차원 전기 영동법이 사용되고 있다. 출원인들은 지금까지, 분리 능력이 높은 2차원 전기 영동법을 개발해 왔다(특허문헌 2∼5).

특허문헌 1: 일본국 특허공개공보 특개2002-286716 특허문헌 2: 일본국 특허공개공보 특개2011-33544 특허문헌 3: 일본국 특허공개공보 특개2011-33546 특허문헌 4: 일본국 특허공개공보 특개2011-33547 특허문헌 5: 일본국 특허공개공보 특개2011-33548

본 발명은, 메추리알에 대한 알레르기의 신규 항원을 제공한다. 본 발명은 또한, 메추리알에 대한 알레르기의 진단 방법 및 진단 키트를 제공한다. 본 발명은 또한, 해당 항원을 포함하는 의약 조성물, 해당 항원이 제거된 메추리알 또는 메추리알 가공품, 및 해당 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터를 제공한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 메추리알에 대한 알레르기의 원인 항원 특정에 관하여 예의 연구를 실시했다. 그 결과, 메추리알 알레르기를 가지는 환자의 혈청 중의 IgE 항체가 특이적으로 결합하는 항원을 특정하는 것에 성공했다. 해당 지견(知見)에 근거하여, 본 발명은 완성되었다.

즉, 일 태양(態樣)에 있어서, 본 발명은 이하와 같으면 된다.

[1]메추리알에 대한 알레르기의 진단 키트로서, 이하 (1) 또는 (2)의 단백질의 적어도 하나:

(1)(1A)비텔로제닌-1(Vitellogenin-1) 단백질 또는 그 변이체로서, 이하의 (1A-a)∼(1A-e) 중 어느 하나의 단백질:

(1A-a)서열번호 18에 있어서 1 또는 수개(數箇)의 아미노산이 결실(缺失), 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(1A-b)서열번호 18로 나타내는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(1A-c)서열번호 17에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(1A-d)서열번호 17로 나타내는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 혹은

(1A-e)서열번호 17로 나타내는 염기 서열에 대해 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트(stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)하는 핵산에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는

(1B)서열번호 1∼16 및 18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 단백질;

(2)(2A)비텔로제닌-2(Vitellogenin-2) 단백질 또는 그 변이체로서, 이하의 (2A-a)∼(2A-e) 중 어느 하나의 단백질:

(2A-a)서열번호 24에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(2A-b)서열번호 24로 나타내는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(2A-c)서열번호 23에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(2A-d)서열번호 23으로 나타내는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 혹은

(2A-e)서열번호 23으로 나타내는 염기 서열에 대해 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는

(2B)서열번호 19∼22 및 24로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 단백질;

을 항원으로서 포함하는, 상기 진단 키트.

[2]메추리알에 대한 알레르기의 진단용 조성물로서, 상기 [1]에 있어서 (1) 또는 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나를 항원으로서 포함하는, 상기 진단용 조성물.

[3]대상의 메추리알에 대한 알레르기를 진단하기 위한 지표를 제공하는 방법으로서, 이하의 공정:

(i)대상으로부터 얻어진 시료를 항원에 접촉시킨다, 여기서 해당 시료는 Ig 항체가 포함되는 용액이다;

(ii)대상으로부터 얻어진 시료 중의 IgE 항체와 해당 항원과의 결합을 검출한다;

(iii)대상의 IgE 항체와 해당 항원과의 결합이 검출된 경우, 대상이 메추리알에 대한 알레르기인 것의 지표가 제공된다;

를 포함하고, 여기서 해당 항원은, 상기 [1]에 있어서 (1) 또는 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나인, 상기 방법.

[4]상기 [1]에 있어서 (1) 또는 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나를 포함하는 의약 조성물.

[5]메추리알에 대한 알레르기를 치료하기 위한, 상기 [4]에 기재된 의약 조성물.

[6]항원이 제거 또는 저감되어 있는 것을 특징으로 하는 메추리알 또는 메추리알 가공품으로서, 해당 항원은 상기 [1]에 있어서 (1) 또는 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나인, 상기 알 또는 알 가공품.

[7]상기 [1]에 있어서 (1) 또는 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나와 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상물에 있어서의 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 되는 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터.

[8]서열번호 17 또는 23으로 나타내는 염기 서열의 적어도 하나와 상보적인 염기 서열을 가지는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상물에 있어서의 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 되는 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터.

[9]상기 [1]에 있어서 (1) 또는 (2)로서 특정되는 단백질이며, 그리고 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 되는, 메추리 유래의 항원.

본 발명에 의해, 메추리알에 대한 알레르기의 신규 항원을 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서 메추리알 알레르기를 일으키는 항원(알레르겐 컴퍼넌트)이 동정(同定)된 점에서, 메추리알에 대한 알레르기의 고감도 진단 방법 및 진단 키트, 해당 항원을 포함하는 의약 조성물, 해당 항원이 제거된 메추리알 또는 메추리알 가공품, 및 해당 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터를 제공할 수 있다.

[도 1]도 1은, 메추리알의 난황 및 난백에 포함되는 단백질에 관하여, 2차원 전기 영동에 의한 단백질의 영동패턴을 나타내는 겔의 사진이다. 좌측의 사진은 메추리알 난황(卵黃)의 단백질의 2차원 전기 영동 패턴이며, 우측의 사진은 메추리알 난백(卵白)의 단백질의 2차원 전기 영동 패턴이다. 각각의 사진의 좌측의 밴드는, 분자량 마커의 밴드이다.
[도 2]도 2는, 메추리알의 난황 및 난백에 포함되는 단백질의 2차원 전기 영동 패턴에 대하여 임뮤노블로트(immunoblot)를 실시한 결과를 나타내는 사진이다. 상단은 메추리알 난황의 단백질에 관한 임뮤노블로트이며, 하단은 메추리알 난백의 단백질에 관한 임뮤노블로트이다. 우측은 메추리알 알레르기 환자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트이며, 좌측은 건강 피험자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트이다. 화살표는, 메추리알 알레르기 환자의 혈청이 특이적으로 반응한 스포트를 나타낸다.
[도 3]도 3은, 인히비션(inhibition) 시험의 결과를 나타내는 임뮤노블로트의 사진이다. 상단 우측은, 메추리알 난황 단백질의 2차원 전기 영동 패턴에 대하여, 계란 난황으로 인히비션을 실시한 메추리알 알레르기 환자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트다. 화살표는, 메추리알 알레르기 환자의 혈청이 특이적으로 반응한 스포트를 나타낸다. 상단 좌측은, 메추리알 난황 단백질의 2차원 전기 영동 패턴에 대하여, 계란 난황으로 인히비션을 실시한 건강 피험자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트이다. 하단 우측은, 계란 난황 단백질의 2차원 전기 영동 패턴에 대하여, 메추리알 난황으로 인히비션을 실시한 메추리알 알레르기 환자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트며, 하단 좌측은 계란 난황 단백질의 2차원 전기 영동 패턴에 대하여, 메추리알 난황으로 인히비션을 실시한 건강 피험자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트이다.

이하에 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 발명에 관련되어 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 것으로 한다.

본 명세서에 있어서 알레르기란, 어느 항원에 감작(感作)되어 있는 생체에, 다시 그 항원이 들어간 경우에 일어나는, 생체에 좋지 않은 과민 반응을 나타내는 상태를 말한다. 음식에 있어서의 알레르기 질환의 대부분에 있어서, 혈액 및 조직에서 항원에 특이적인 IgE 항체가 산생(産生)된다. IgE 항체는, 비만세포 또는 호염기구(好鹽基球)와 결합한다. 해당 IgE 항체에 특이적인 항원이 다시 알레르기 질환 환자의 체내에 들어가면, 해당 항원은 비만세포 또는 호염기구와 결합한 IgE 항체와 조합되고, 그리고 해당 IgE 항체가 세포 표면에서 가교하여, IgE 항체-항원 상호작용의 생리학적 효과를 발생한다. 이들의 생리학적 효과로서, 히스타민, 세로토닌, 헤파린, 호산구 유주인자 또는 각종 류코트리엔 등의 방출을 들 수 있다. 이들 방출 물질은, IgE 항체와 특정 항원의 조합에 의해 일어나는 알레르기 반응을 야기한다. 특정 항원에 의한 알레르기 반응은, 상기의 경로를 통해 나타난다.

본 명세서에 있어서 메추리알에 대한 알레르기란, 메추리알에 포함되는 단백질 등을 항원으로 하여 발생하는 알레르기 반응을 가지는 상태를 말한다. 메추리알에 대한 알레르기는, 메추리알에 포함되는 항원과 접촉한 경우, 혹은 해당 항원을 섭취한 경우에, 알레르기 반응을 발생시킬 수 있다. 일반적으로 음식을 섭취한 경우에 발생하는 알레르기 반응을 특히 음식 알레르기라고 한다. 메추리알에 대한 알레르기는 음식 알레르기이어도 된다.

본 명세서에 있어서 항원이란, 알레르기 반응을 야기시키는 물질이며, 알레르겐 컴퍼넌트라고도 칭해진다. 항원은 바람직하게는 단백질이다.

본 명세서에 있어서, 단백질은, 천연의 아미노산이 펩티드 결합에 의해 연결된 구조를 가지는 분자이다. 단백질에 포함되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 2∼50개 정도의 아미노산이 펩티드 결합에 의해 연결된 단백질을, 펩티드라고 부르는 경우가 있다. 또한, 아미노산에 관하여 광학 이성체가 있을 수 있는 경우는, 특별히 명시하지 않으면 L체를 나타낸다. 본 명세서에서 사용하는 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열의 표기법은, 표준적 용법 및 당업계에서 관용되고 있는 표기법에 근거하여, 아미노산의 한 글자 표기로 표시되며, 좌방향은 아미노 말단 방향이고, 그리고 우방향은 카복시 말단 방향이다.

항원의 특정

메추리알에 포함되는 단백질에 관하여, 상기의 수법을 이용하여 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 되는 항원의 특정을 실시했다. 구체적으로는, 메추리알 난황의 단백질을 하기의 조건으로 2차원 전기 영동에 제공했다.

1차원의 전기 영동은, 등전점 전기 영동용 겔로서, 겔 길이가 5∼10cm인 범위 내로서, 겔의 pH 범위가 3∼10이고, 영동방향에 대한 겔의 pH 구배(句配)가, 겔의 전체 길이를 1로 하고, pH5까지의 겔 길이를 a, pH5∼7의 겔 길이를 b, pH7 이상의 겔 길이를 c로 했을 경우에 있어서, a가 0.15∼0.3의 범위 내, b가 0.4∼0.7의 범위 내, c가 0.15∼0.3의 범위 내인 겔을 사용하여, 구체적으로는, GE 헬스케어 바이오사이언스 가부시키가이샤(이하, GE사로 약칭한다)제의 IPG 겔 Immobiline Drystrip(pH3-10NL)를 사용하여 등전점 영동을 실시했다. 전기 영동 기기는, GE사제의 IPGphor를 사용했다. 전기 영동 기기의 전류값의 상한을 겔 1개당 75μA로 설정하고, 전압 프로그램을, (1)300V 정전압에서 750Vhr까지 정전압 공정을 실시하고(해당 공정 종료 전의 영동 30분간의 전류 변화폭이 5μA였다), (2)300Vhr에 걸쳐 1000V까지 서서히 전압을 상승시키고, (3)4500Vhr에 걸쳐 5000V까지 서서히 전압을 더 상승시키고, (4)그 후 5000V 정전압에서 총Vhr가 12000이 될 때까지, 1차원의 등전점 전기 영동을 실시했다.

2차원의 전기 영동은, 영동방향 기단부의 겔 농도가 3∼6%로 설정되고, 영동방향 선단측 부분의 겔 농도가 영동방향 기단부의 겔 농도보다도 높게 설정된 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여, 구체적으로는 life technologies사제의 NuPAGE 4-12% Bris-Tris Gels IPG well mini 1mm를 사용하여 SDS-PAGE를 실시했다. 전기 영동 기기는, life technologies사제의 XCell SureLock Mini-Cell를 사용했다. 영동 완충액으로서 50mM MOPS, 50mM Tris 염기, 0.1%(w/v) SDS, 1mMEDTA를 사용하여, 200V 정전압에서 약 45분간 영동을 실시했다.

그 결과, 메추리알 난황의 단백질에 관하여 상기의 조건에서 2차원 전기 영동을 실시했을 때의 겔에 있어서, 분자량 45kDa 부근, 등전점 5∼9에 나타나는 스포트(이하, 해당 스포트를 구성하는 단백질을 「스포트 1의 항원」이라고 기재한다), 및 분자량 35kDa 부근, 등전점 7∼12에 나타나는 스포트(이하, 해당 스포트를 구성하는 단백질을 「스포트 2의 항원」이라고 기재한다)가, 메추리알에 대한 알레르기의 환자의 IgE 항체에 특이적으로 결합하는 것을 밝혔다.

항원

·스포트 1의 항원

스포트 1의 항원에 관하여 질량 분석에 의한 서열 동정을 실시한 결과, 이하의 아미노산 서열이 검출되었다.

SFKPVYTDVPIEK(서열번호 1)

TFAVTRNIEDLAASK(서열번호 2)

MTPVLLPEAVPDIMK(서열번호 3)

KSVHAAFIK(서열번호 4)

PVYTDVPIEK(서열번호 6)

IQVTIQAGDQAPTKM(서열번호 7)

ALPHDKPFASGYLK(서열번호 8)

DWETNYDFK(서열번호 9)

EETNVITVSSK(서열번호 10)

IQVTIQAGDQAPTK(서열번호 11)

NTIQNVLQAWYGPDEK(서열번호 12)

RLISSLQSGIGRQLTK(서열번호 13)

SVHAAFIK(서열번호 14)

TFAVTRNIEDLAA(서열번호 15)

VNAHVPVNVVATIQMK(서열번호 16)

또한, 스포트 1에 관하여, 질량 분석 장치로부터 얻어진 질량 데이터(서열번호 1∼16에 관한 질량 데이터)를 NCBI의 단백질 데이터와 조합(照合)하여 해석한바, 메추리(Coturnix japonica) 유래의 비텔로제닌-1(vitellogenin-1) 단백질(서열번호 18)의 일부인 것이 동정되었다. 서열번호 1은 서열번호 18의 아미노산 329∼341, 서열번호 2는 서열번호 18의 아미노산 213∼228, 서열번호 3은 서열번호 18의 아미노산 229∼243, 서열번호 4는 서열번호 18의 아미노산 305∼313, 서열번호 6은 서열번호 18의 아미노산 332∼341, 서열번호 7은 서열번호 18의 아미노산 342∼356, 서열번호 8은 서열번호 18의 아미노산 20∼33, 서열번호 9는 서열번호 18의 아미노산 1∼9, 서열번호 10은 서열번호 18의 아미노산 203∼213, 서열번호 11은 서열번호 18의 아미노산 342∼355, 서열번호 12는 서열번호 18의 아미노산 47∼62, 서열번호 13은 서열번호 18의 아미노산 68∼83, 서열번호 14는 서열번호 18의 아미노산 306∼313, 서열번호 15는 서열번호 18의 아미노산 214∼226, 서열번호 16은 서열번호 18의 아미노산 175∼190에 각각 상당한다.

따라서, 본원에 있어서 스포트 1의 항원은, 이하 (1A-a)∼(1A-e) 및 (1B) 중 어느 하나이어도 된다.

(1A-a)서열번호 18에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(1A-b)서열번호 18로 나타내는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(1A-c)서열번호 17에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(1A-d)서열번호 17로 나타내는 염기 서열과 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상인 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(1A-e)서열번호 17로 나타내는 염기 서열에 대해 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(1B)서열번호 1∼16 및 18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 단백질, 바람직하게는 해당 아미노산 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16종 또는 모든 서열을 포함하는 단백질. 보다 바람직하게는 서열번호 1, 2, 6, 8∼16 및 18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 단백질, 바람직하게는 해당 아미노산 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12종 또는 모든 서열을 포함하는 단백질. 여기에 있어서, 서열번호 1∼16 및 18 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열은, 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가되어 있어도 된다.

상기 (1A-a)∼(1A-e) 및 (1B)의 단백질에는, 인산화나 당쇄수식(糖鎖修飾), 아미노아실화, 개환, 탈아미노화 등에 의해 해당 단백질의 아미노산 잔기가 수식을 받고 있는 단백질도 또한, 포함된다.

상기 (1A-a)∼(1A-e) 및 (1B)의 단백질은, 상기 「항원의 특정」 항목에 기재한 조건에서 2차원 전기 영동을 실시했을 때의 겔에 있어서, 분자량 35kDa∼50kDa, 바람직하게는 분자량 40kDa∼47kDa, 보다 바람직하게는 분자량 42∼47kDa 부근의 스포트로서 나타나는 단백질이어도 된다. 해당 단백질은, 상기의 조건에서 2차원 전기 영동을 실시했을 때의 겔에 있어서, 등전점 5∼9, 바람직하게는 6∼8의 스포트로서 나타나는 단백질이어도 된다. 혹은, 해당 단백질은, 상기의 조건에서 2차원 전기 영동을 실시했을 때의 겔에 있어서, 분자량 35kDa∼50kDa, 바람직하게는 분자량 40kDa∼47kDa, 보다 바람직하게는 분자량 42∼47kDa 부근, 및 등전점 5∼9, 바람직하게는 6∼8의 스포트로서 나타나는 단백질이어도 된다.

바람직하게는, 상기 (1A-a)∼(1A-e) 및 (1B)의 단백질은, 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 된다.

·스포트 2의 항원

스포트 2의 항원에 관하여, 질량 분석에 의한 서열 동정을 실시했다. 그 결과, 이하의 아미노산 서열이 검출되었다.

LCADASVLNAHK(서열번호 19)

TVQLAGVDSK(서열번호 20)

AEAPSAVLNNLK(서열번호 21)

GGLQLVVFADTDSVK(서열번호 22)

또한, 스포트 2에 관하여, 질량 분석 장치로부터 얻어진 질량 데이터(서열번호 19∼22에 관한 질량 데이터)를 NCBI의 단백질 데이터와 조합(照合)하여 해석한바, 메추리(Coturnix japonica) 유래의 비텔로제닌-2(vitellogenin-2) 단백질(서열번호 24)의 일부인 것이 동정되었다. 서열번호 19는 서열번호 24의 아미노산 50∼61, 서열번호 20은 서열번호 24의 아미노산 395∼404, 서열번호 21은 서열번호 24의 아미노산 191∼202, 서열번호 22는 서열번호 24의 아미노산 18∼32에 각각 상당한다.

따라서, 스포트 2의 항원은, 이하 (2A-a)∼(2A-e) 및 (2B)와 같아도 된다.

(2A-a)서열번호 24에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(2A-b)서열번호 24로 나타내는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(2A-c)서열번호 23에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(2A-d)서열번호 23으로 나타내는 염기 서열과 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상인 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(2A-e)서열번호 23으로 나타내는 염기 서열에 대해 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(2B)서열번호 19∼22 및 24로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 단백질, 바람직하게는 해당 아미노산 서열의 적어도 2, 3, 4종 또는 모든 서열을 포함하는 단백질. 보다 바람직하게는 서열번호 21, 22 및/또는 24로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질. 여기에 있어서, 서열번호 19∼22 및 24 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열은, 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가되어 있어도 된다.

상기 (2A-a)∼(2A-e) 및 (2B)의 단백질에는, 인산화나 당쇄수식, 아미노아실화, 개환, 탈아미노화 등에 의해 해당 단백질의 아미노산 잔기가 수식을 받고 있는 단백질도 또한, 포함된다.

상기 (2A-a)∼(2A-e) 및 (2B)의 단백질은, 상기 「항원의 특정」 항목에 기재된 조건에서 2차원 전기 영동을 실시했을 때의 겔에 있어서, 분자량 30kDa∼50kDa, 바람직하게는 분자량 30kDa∼40kDa, 보다 바람직하게는 분자량 32∼37kDa 부근의 스포트로서 나타나는 단백질이어도 된다. 해당 단백질은, 상기의 조건에서 2차원 전기 영동을 실시했을 때의 겔에 있어서, 등전점 7∼12, 바람직하게는 8∼10의 스포트로서 나타나는 단백질이어도 된다. 혹은, 해당 단백질은, 상기의 조건에서 2차원 전기 영동을 실시했을 때의 겔에 있어서, 분자량 30kDa∼50kDa, 바람직하게는 분자량 30kDa∼40kDa, 보다 바람직하게는 분자량 32∼37kDa 부근 및 등전점 7∼12, 바람직하게는 8∼10의 스포트로서 나타나는 단백질이어도 된다.

바람직하게는, 상기 (2A-a)∼(2A-e) 및 (2B)의 단백질은, 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 된다.

본 명세서에 있어서, 아미노산 서열에 관하여 「1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가되었다」라고 하는 경우는, 대상이 되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 혹은 수개의 아미노산(예를 들면, 아미노산 서열의 전체 길이에 대하여 40%, 바람직하게는 30%, 20%, 10% 또는 5%의 아미노산)이 결실되어 있거나, 다른 아미노산 치환되어 있거나, 다른 아미노산이 삽입되어 있거나, 및/또는 다른 아미노산이 부가되어 있는 아미노산 서열을 말한다.

상기 중, 치환은, 바람직하게는 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 특정의 아미노산 잔기를 유사한 물리 화학적 특징을 가지는 잔기로 치환하는 것이나, 원래의 서열의 구조에 관한 특징을 실질적으로 변화시키지 않으면 어떠한 치환이어도 되고, 예를 들면, 치환 아미노산이, 원래의 서열에 존재하는 나선을 파괴하거나, 원래의 서열을 특징짓는 다른 종류의 2차 구조를 파괴하거나 하지 않으면 어떠한 치환이어도 된다. 이하에, 아미노산 잔기의 보존적 치환에 관하여 치환 가능한 잔기별로 분류하여 예시하지만, 치환 가능한 아미노산 잔기는 이하에 기재되어 있는 것으로 한정되는 것은 아니다.

A군: 로이신, 이소로이신, 바린, 알라닌, 메티오닌

B군: 아스파라긴산, 글루탐산

C군: 아스파라긴, 글루타민

D군: 리딘, 아르기닌,

E군: 세린, 트레오닌

F군: 페닐알라닌, 티로신

비보존적 치환의 경우는, 상기 종류 중, 어느 1개의 멤버와 다른 종류의 멤버를 교환할 수 있다. 예를 들면, 부주의한 당쇄수식을 배제하기 위해 상기의 B, D, E군의 아미노산을 그 이외의 군의 아미노산으로 치환해도 된다. 또는, 3차 구조에서 단백질 중에 접혀 들어가는 것을 방지하기 위하여 시스테인을 결실시키거나, 다른 아미노산으로 치환해도 된다. 혹은, 친수성/소수성의 밸런스가 유지되도록, 또는 합성을 용이하게 하기 위해 친수도를 올리도록, 아미노산에 관한 소수성/친수성의 지표인 아미노산의 하이드로퍼시(hydropathy) 지수(J. Kyte 및 R. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol. 157, p.105-132, 1982)를 고려하여, 아미노산을 치환해도 된다.

본 명세서에 있어서, 2개의 아미노산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 %를 결정할 수도 있다. 그러한 컴퓨터 프로그램으로서는, 예를 들면, BLAST(Altschul 외, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)), 및 ClustalW 등을 들 수 있다. 특히, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은, Altschul 외(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재된 것으로, 미국 바이오테크놀러지 정보 센터(NCBI)나 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹 사이트로부터 공적으로 입수할 수 있다(BLAST 메뉴얼, Altschul 외 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul 외). 또한, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver. 7(제네틱스), DINASIS Pro(히타치 소프트), Vector NTI(Infomax) 등의 프로그램을 이용하여 결정할 수도 있다.

본 명세서에 있어서, 염기 서열에 관하여 「1 혹은 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가되었다」라고 하는 경우는, 대상이 되는 염기 서열에 있어서, 1개 혹은 수개의 뉴클레오티드(예를 들면, 염기 서열의 전체 길이에 대하여 30%, 바람직하게는 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2% 또는 1%의 아미노산)가 결실되어 있거나, 다른 뉴클레오티드로 치환되어 있거나, 다른 뉴클레오티드가 삽입되어 있거나, 및/또는 다른 뉴클레오티드가 부가되어 있는 염기 서열을 말한다. 상기 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 혹은 부가에 의해, 아미노산을 코드하는 서열에 프레임 시프트를 발생하지 않는 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서, 2개의 염기 서열의 동일성 %는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 %를 결정할 수도 있다. 그러한 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로서는, 예를 들면, 미국 국립 의학도서관의 웹 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html로부터 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10): 버젼 2.2.7, 또는 WU-BLAST2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST2.0에 관한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「스트린젠트한 조건하」란, 중간 정도 또는 고도로 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 중간 정도로 스트린젠트한 조건으로서는, 예를 들면, DNA의 길이에 근거하여, 일반 기술을 가지는 당업자에 의해, 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 기본적인 조건은, Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3판, 제6-7장, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 나타나 있다. 바람직하게는, 중간 정도로 스트린젠트한 조건은, 하이브리다이제이션 조건으로서 1×SSC∼6×SSC, 42℃∼55℃의 조건, 보다 바람직하게는, 1×SSC∼3×SSC, 45℃∼50℃의 조건, 가장 바람직하게는, 2×SSC, 50℃의 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션 용액 중에, 예를 들면, 약 50%의 폼아마이드를 포함하는 경우에는, 상기 온도보다 5 내지 15℃낮은 온도를 채용한다. 세정 조건으로서는, 0.5×SSC∼6×SSC, 40℃∼60℃를 들 수 있다. 하이브리다이제이션 및 세정시에는, 일반적으로, 0.05%∼0.2%, 바람직하게는 약 0.1% SDS를 첨가해도 된다. 고도로 스트린젠트한 조건도 또한, 예를 들면 DNA의 길이에 근거하여, 당업자에 의해, 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 일반적으로, 고도로 스트린젠트(하이스트린젠트)한 조건으로서는, 중간 정도로 스트린젠트한 조건보다도 높은 온도 및/또는 낮은 염(鹽) 농도에서의 하이브리다이제이션 및/또는 세정을 포함한다. 예를 들면, 하이브리다이제이션 조건으로서 0.1×SSC∼2×SSC, 55℃∼65℃의 조건, 보다 바람직하게는, 0.1×SSC∼1×SSC, 60℃∼65℃의 조건, 가장 바람직하게는, 0.2×SSC, 63℃의 조건을 들 수 있다. 세정 조건으로서 0.2×SSC∼2×SSC, 50℃∼68℃, 보다 바람직하게는, 0.2×SSC, 60∼65℃를 들 수 있다.

항원은, 메추리알 난황으로부터 당업자에게 주지의 단백질 정제 방법을 조합하여 분리·정제함으로써 얻어도 된다. 또는, 항원은, 당업자에게 주지의 유전자 재조합 기술에 의해 항원을 재조합 단백질로서 발현시키고, 그리고 당업자에게 주지의 단백질 정제 방법에 의해 분리·정제함으로써 얻어도 된다.

단백질의 정제 방법으로서는, 예를 들면, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE 등 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피나 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

유전자 재조합 기술에 의한 단백질의 조제는, 항원을 코드하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 조제하고, 해당 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 중에 유전자 도입 또는 형질 전환에 의해 도입하고, 해당 숙주 세포를 재조합 단백질의 발현에 적당한 조건하에서 배양하고, 그리고 해당 숙주 세포 중에서 발현된 재조합 단백질을 회수함으로써 실시한다.

「벡터」는, 그에 연결시킨 핵산을 숙주 세포 내에 도입하기 위하여 사용하는 것이 가능한 핵산이고, 「발현 벡터」는 벡터에 의해 도입된 핵산이 코드하는 단백질의 발현을 이끄는 것이 가능한 벡터이다. 벡터에는, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등이 포함된다. 당업자는, 사용하는 숙주 세포의 종류에 따라, 재조합 단백질의 발현에 적절한 발현 벡터를 선택할 수 있다.

「숙주 세포」는, 벡터에 의해 유전자 도입 또는 형질 전환을 받는 세포이다. 숙주 세포는, 사용하는 벡터에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 숙주 세포는, 예를 들면, 대장균(E. coli) 등의 원핵생물 유래인 것이 가능하다. 대장균과 같은 원핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명의 항원은, 원핵 세포 내에서의 재조합 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 N말단 메티오닌 잔기를 포함하도록 해도 된다. 이 N말단 메티오닌은, 발현 후에 재조합 단백질로부터 분리할 수도 있다. 혹은, 효모 등의 단세포 진핵생물, 식물 세포, 동물 세포(예를 들면, 사람 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포 또는 곤충 세포) 등의, 진핵생물 유래의 세포인 것이 가능하다.

발현 벡터의 숙주 세포로의 유전자 도입 또는 형질 전환은, 당업자에게 공지의 수법에 의해 적절히 실시할 수 있다. 또한, 당업자는, 숙주 세포의 종류에 따라 재조합 단백질의 발현에 적당한 조건을 적절히 선택하고, 숙주 세포를 배양함으로써 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 그리고, 재조합 단백질을 발현시킨 숙주 세포를 호모지나이즈(homogenize)하여, 얻어진 호모지네이트(homogenate)로부터 상술한 단백질의 정제 방법을 적절히 조합하여 실시함으로써, 재조합 단백질로서 발현된 항원을 분리·정제할 수 있다.

진단 키트 ·진단 방법

본 발명은, 메추리알에 대한 알레르기를 진단하기 위한 지표를 제공하는 방법으로서, 이하의 공정:

(i)대상으로부터 얻어진 시료를 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원에 접촉시킨다;

(ii)대상으로부터 얻어진 시료 중의 IgE 항체와 해당 항원과의 결합을 검출한다;

(iii)대상의 IgE 항체와 해당 항원의 결합이 검출된 경우, 대상이 메추리알에 대한 알레르기인 것의 지표가 제공된다;

를 포함하는, 상기 방법을 제공한다.

대상으로부터 얻어진 시료란, 대상으로부터 채취된 Ig 항체, 보다 바람직하게는 IgE 항체가 포함되는 용액이다. 그러한 용액에는, 예를 들면, 혈액, 타액, 가래, 콧물, 오줌, 땀, 눈물이 포함된다. 대상으로부터 얻어진 시료는, 항원에 접촉시키기 전에, 시료 중의 Ig 항체 농도를 높이기 위한 전처리가 실시되어 있어도 된다. 시료의 전처리로서는, 예를 들면 혈액으로부터 혈청을 얻는 것이 포함되어도 된다. 특히 바람직한 태양(態樣)에 있어서, 상기 공정(i)은, 대상으로부터 얻어진 혈청 중의 IgE 항체와 항원을 접촉시킴으로써 실시된다.

대상으로부터 얻어진 시료와 항원과의 접촉 및 그 결합의 검출은, 기존의 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다. 그러한 방법에는, 예를 들면, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorvent Assay), 샌드위치 면역 측정법, 임뮤노블로트, 면역 침강법에 의한 검출을 이용할 수 있다. 이들은 모두, 항원에 대상의 IgE 항체를 접촉시켜 결합시키고, 항원에 특이적으로 결합한 IgE 항체에 대하여 효소 표식한 2차 항체를 작용시키고, 효소의 기질(통상은, 발색 혹은 발광 시약)을 가하여 효소 반응의 생성물을 검출함으로써, 항원과 대상의 IgE 항체의 결합을 검출하는 수법이다. 혹은, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 등의, 항원과 IgE 항체의 결합을 평가 가능한 측정 방법에 의한 검출을 이용할 수도 있다.

항원은, 단리된 항원이 담체에 고정되고 있는 상태이어도 된다. 이 경우는 상기 공정 (i) 및 (ii)에 있어서 ELISA, 샌드위치 면역 측정법, 임뮤노 크로마토법, 표면 플라즈몬 공명 등을 이용할 수 있고, 또한, 상기 공정 (i)에서는, 대상으로부터 얻어진 시료를 항원을 고정한 면에 접촉시키는 것에 의해서도 실시할 수 있다. 단리된 항원은, 메추리알 난황으로부터 당업자에게 주지의 단백질 정제 방법을 조합하여 분리·정제하는 것에 의해, 또는 유전자 재조합 기술에 의해 조제하는 것에 의해 얻어도 된다.

또한, 항원은 2차원 전기 영동에 의해 분리된 상태로부터 임뮤노블로트에 의한 검출을 실시해도 된다. 2차원 전기 영동은, 1차원의 등전점 전기 영동, 2차원의 SDS-PAGE(SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)를 실시함으로써, 단백질 시료를 분리하는 수법이다. 이 경우, 2차원 전기 영동의 조건은, 본원 발명의 항원을 분리할 수 있는 조건이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 「항원의 특정」 항목에 있어서 기재한 2차원 전기 영동의 조건을 이용할 수 있다. 혹은, 상술한 특허문헌 1∼4의 기재를 참고로 하여 전기 영동의 조건을 정할 수도 있으며, 예를 들면, 이하:

(A)1차원의 등전점 전기 영동 겔로서, 겔 길이가 5∼10cm의 범위 내로, 겔의 pH 범위가 3∼10이고, 영동방향에 대한 겔의 pH 구배가, pH5까지의 겔 길이를 a, pH5∼7의 겔 길이를 b, pH7 이상의 겔 길이를 c로 한 경우에 있어서, 「a＜b」 및 「b＞c」의 관계를 만족한다;

(B)(A)의 경우로, 겔의 전체 길이를 1로 했을 경우, a가 0.15∼0.3의 범위 내, b가 0.4∼0.7의 범위 내, c가 0.15∼0.3의 범위 내이다;

(C)1차원의 등전점 전기 영동에 있어서, 검체를 포함하는 겔 1개에 대해 100V∼600V의 범위 내의 값의 정전압 인가에 의한 정전압 공정을 실시하고, 영동 30분당 영동 변화폭이 5μA의 범위 내가 된 후에 상기 정전압으로부터 전압을 상승시키는 전압 상승 공정을 시작한다;

(D)(C)의 경우에, 전압 상승 공정의 최종 전압을 3000V∼6000V의 범위 내로 한다;

(E)1차원의 등전점 전기 영동 겔의 길이 방향의 겔 길이가 5∼10cm로서, 2차원 전기 영동 겔의 영동방향 기단부의 겔 농도를 3∼6%로 한다; 및

(F)(E)의 경우에, 2차원째 전기 영동 겔의 영동방향 선단측 부분의 겔 농도가, 영동방향 기단부의 겔 농도보다도 높게 설정한다;

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 만족하는 조건에서 2차원 전기 영동을 실시할 수 있다.

상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원은, 메추리알에 대한 알레르기 환자의 IgE 항체와 특이적으로 결합하는 항체이다. 따라서, 대상의 IgE 항체와 해당 항원의 결합이 검출된 경우, 대상이 메추리알에 대한 알레르기인 것의 지표가 제공된다.

본 발명은 또한, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 포함하는 메추리알에 대한 알레르기 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 진단 키트는, 상기의 메추리알에 대한 알레르기를 진단하기 위한 지표를 제공하는 방법, 또는 하기의 진단 방법에 사용해도 된다. 본 발명의 진단 키트는, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 포함하는 것 외에, 효소 표식된 항IgE 항체 및 해당 효소의 기질이 되는 발색 기질 또는 발광 기질을 포함하고 있어도 된다. 또한, 형광 표식된 항IgE 항체를 이용해도 된다. 본 발명의 진단 키트에 있어서, 항원은 담체에 고정화된 상태로 제공되어도 된다. 본 발명의 진단 키트는 또한, 진단을 위한 순서에 관한 설명서나 해당 설명을 포함하는 패키지와 함께 제공되어도 된다.

다른 태양에 있어서, 상기의 진단 키트는, 메추리알에 대한 알레르기에 관한 컴패니언(companion) 진단약을 포함한다. 캠패니언 진단약이란, 의약품의 효과가 기대되는 환자의 특정 또는 의약품의 위중한 부작용 리스크를 가지는 환자의 특정, 혹은 의약품을 사용한 치료의 최적화(용법 용량의 결정이나 투여 중지의 판단 등)를 위해 해당 의약품의 반응성을 검토하기 위하여 사용하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 포함하는 메추리알에 대한 알레르기 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 진단용 조성물은, 하기의 진단 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 진단용 조성물은, 필요에 따라 본 발명의 항원과 함께 일반적으로 사용되는, 약학적으로 허용되는 담체나 첨가제를 포함하고 있어도 된다.

일태양에 있어서, 본 발명은, 대상의 메추리알에 대한 알레르기를 진단하는 방법으로서, 이하의 공정:

(i)대상으로부터 얻어진 시료를 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원에 접촉시킨다;

(ii)대상으로부터 얻어진 시료 중의 IgE 항체와 해당 항원의 결합을 검출한다;

(iii)대상의 IgE 항체와 해당 항원의 결합이 검출된 경우, 대상이 메추리알에 대한 알레르기라고 판단한다;

를 포함하는, 상기 방법을 제공한다. 여기에 있어서 (i) 및 (ii)의 각 공정은, 메추리알에 대한 알레르기를 진단하기 위한 지표를 제공하는 방법의 각 공정에 관하여 설명했던 대로 실시된다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은, 대상의 메추리알에 대한 알레르기를 진단하는 방법으로서, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 상기 방법을 제공한다. 해당 방법은, 피부에 항원을 적용하는 것을 특징으로 하는 피부 테스트의 형식으로 실시해도 된다. 피부 테스트에는, 피부 위에 진단용 조성물을 적용한 후에, 출혈하지 않을 정도로 미소한 상처를 냄으로써 피부에 항원을 침투시켜 피부 반응을 관찰하는 프릭 테스트, 진단용 조성물을 적용한 후에 피부를 조금 세게 긁어 반응을 관찰하는 스크래치 테스트, 크림이나 연고 등의 형태의 진단용 조성물을 피부에 적용하여 반응을 관찰하는 패치 테스트, 항원을 피내(皮內)에 투여하여 반응을 관찰하는 피내 테스트 등의 형태가 포함된다. 항원을 적용한 부분의 피부에 붓기 등의 피부 반응이 발생한 경우, 그 대상은 메추리알에 대한 알레르기를 가진다고 진단한다. 여기서, 피부에 적용하는 항원의 양은, 예를 들면, 1회당 100μg 이하의 용량이어도 된다.

또 다른 태양에 있어서, 본 발명은 메추리알에 대한 알레르기의 진단에 사용하기 위한 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 제공한다.

또 다른 태양에 있어서, 본 발명은 메추리알에 대한 알레르기 진단약 제조를 위한 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원의 사용을 제공한다.

의약 조성물·치료 방법

본 발명은, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

일태양에 있어서, 상기의 의약 조성물은, 메추리알에 대한 알레르기를 치료하기 위해 사용된다.

본 발명은 또한, 메추리알에 대한 알레르기의 치료를 필요로 하는 환자에 대하여, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 투여하는 것을 포함하는, 메추리알에 대한 알레르기를 치료하는 방법을 제공한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 메추리알에 대한 알레르기의 치료에 사용하기 위한 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원을 제공한다. 또 다른 태양에 있어서 본 발명은, 메추리알에 대한 알레르기의 치료약의 제조를 위한 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원의 사용을 제공한다.

알레르기의 치료에 있어서는, 환자에게 항원을 투여함으로써 면역 관용으로 유도하는 것을 목표로 한, 감감작(減感作) 요법이 자주 행해지고 있다. 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원은, 메추리알에 대한 알레르기에 대한 감감작 요법이나 부하 시험을 위한 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 통상의 투여 경로에 의해 투여할 수 있다. 통상의 투여 경로에는 예를 들면, 경구, 설하, 경피, 피내, 피하, 혈액내, 비강내, 근육내, 복강내의 투여가 포함된다.

본 발명의 의약 조성물은, 필요에 따라 본 발명의 항원과 함께, 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 아쥬반트(adjuvant), 부형제, 또는 각종의 첨가제(예를 들면 안정제, 용해 보조제, 유탁화제, 완충제, 보존제, 착색제 등)를 상법(常法)에 의해 첨가한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 의약 조성물의 제형은, 투여 경로에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 정제, 캡슐제, 트로키, 설하정, 주사제, 비강내 분무제, 파프제, 물약, 크림제, 로션제 등의 형태이어도 된다. 본 발명의 의약 조성물의 투여량, 투여 회수 및/또는 투여 기간은, 투여 경로, 증상, 연령이나 체중 등의 환자의 특성 등에 따라 의사가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 성인의 경우, 1회당 100μg 이하의 용량으로 투여해도 된다. 투여 간격은, 예를 들면, 매일, 매주 1회, 월 2회, 또는 3개월에 1회 정도이어도 된다. 투여 기간은 예를 들면, 수주간부터 수년이어도 된다. 투여 기간 내에 있어서, 투여량을 단계적으로 증가시키는 투여 방법이어도 된다.

테스터

본 발명은, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원 중 적어도 하나에 대한 항체를 포함하는 테스터를 제공한다.

해당 항체는, 상법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 토끼 등의 포유 동물을 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원으로 면역함으로써 제작해도 된다. 해당 항체는, Ig 항체, 폴리크로날 항체, 단일 클론 항체, 또는 그들의 항원 결합 플래그먼트(예를 들면, Fab, F(ab')₂, Fab')이어도 된다.

또한, 상기의 테스터에 있어서, 해당 항체는 담체에 결합된 형태로 제공되고 있어도 된다. 담체는, 항체와 항원의 결합의 검출에 이용 가능한 담체이면 특별히 한정되지 않는다. 당업자에게 공지의 임의의 담체를 이용할 수 있다.

항원 함유의 유무를 조사하는 방법으로서는, 예를 들면, 이하의 방법을 들 수 있다.

·제작한 Ig 항체를 포함하는 테스터를 식품 등에서 얻어진 시료에 접촉시켜, 예를 들면 ELISA법 등을 이용하여 해당 Ig 항체와 시료 중의 항원과의 결합을 검출하고, 해당 Ig 항체와 항원과의 결합이 검출되었을 경우에, 대상 식품 등에 해당 항원이 잔류하고 있다고 판단하는 방법;

·여과지 등에 식품을 스며들게 하고, 거기에 포함되는 항원을 검출하도록, 항체 용액을 반응시키는 방법.

본 발명의 다른 태양에 있어서, 서열번호 17 또는 23으로 나타내는 염기 서열의 적어도 1개와 상보적인 염기 서열을 가지는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상물에 있어서의 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 되는 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터를 포함한다. 비한정적으로, 상기 프라이머는 예를 들면, 서열번호 17 또는 23으로 나타내는 염기 서열의 적어도 1개의 서열의 5' 말단의, 바람직하게는, 25 잔기, 20 염기, 15 염기, 12 염기와 상보적인 염기 서열을 가진다.

항원 함유의 유무를 조사하는 방법으로서는, 예를 들면, 제작한 프라이머를 포함하는 테스터를, 식품 재료로부터 추출한 DNA나 mRNA와 접촉시켜, 항원의 DNA의 유무를 검출하고, 메추리알에 대한 알레르기 환자가 먹을 수 있는 품종인가 아닌가를 시험하는 방법을 들 수 있다.

일태양에 있어서, 상기의 테스터는, 식품 중 또는 식품 제조 라인 중 등의 대상물 중의 항원 함유의 유무를 조사하기 위해 사용된다. 상기 테스터는, 제조업자에 의한 제조 라인 및 출하 전 제품의 품질 검사용으로서 사용해도 되고, 끽식자(喫食者) 자신에 의한 대상 식품의 항원 함유 유무의 체크용으로 사용해도 된다.

알레르겐 제거 식품 등

본 발명은, 상기 스포트 1의 항원 또는 스포트 2의 항원이 제거되어 있는 것을 특징으로 하는 메추리알 또는 메추리알 가공품을 제공한다.

메추리알 또는 메추리알 가공품에 있어서 본 발명의 항원을 제거하는 방법은 한정되지 않는다. 항원의 제거는, 본 발명의 항원이 제거되는 한, 어떠한 방법에 의해 실행되어도 된다.

예를 들면, 본 발명의 항원이 제거된 메추리알은, 유전자 녹아웃 기술을 이용하여, 본 발명의 항원의 발현이 녹아웃된 메추리알을 조제해도 된다.

유전자 녹아웃 기술은, 당업자에게 공지의 수법 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 예를 들면, Oishi, et al.(Scientific Reports, Vol. 6, Article number: 23980, 2016, doi: 10.1038/srep23980)는, 게놈 편집 기술인 CRISPER/Cas9를 닭의 시원 생식 세포에 적용하여, 오봄코이드 유전자 결실 개체를 얻는 것을 기재하고 있다. 동일한 수법을 메추리에 적용하여, 본 발명의 항원이 제거된 메추리알을 얻어도 된다.

본 발명의 항원이 제거된 메추리알 가공품은, 본 발명의 항원이 제거된 메추리알을 원료로 한 가공품이어도 된다. 통상의 메추리알을 원료로 하는 경우는, 메추리알 가공품의 조제 전 또는 조제 후에 본 발명의 항원을 제거하는 처리를 실시한다. 통상의 메추리알을 원료로 한 메추리알 가공품에 있어서 본 발명의 항원을 제거하는 방법으로서, 예를 들면 특허 3653132에 기재된 바와 같이 고압 처리 및 중성 염용액에 의한 항원 단백질의 용출에 의해 제거하는 방법이나, 고온 스팀을 쐬어 식품의 단백질 성분을 제거하는 방법을 들 수 있다.

실시예

이하에 본 발명의 실시예를 설명한다. 본 발명의 기술적 범위는, 이들의 실시예에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1: 단백질 패턴의 확인

하기의 이차원 전기 영동 방법을 사용하여, 메추라기알에 포함되는 단백질을 조사했다.

단백질의 추출

시판의 메추라기알을 구입하여, 난백과 난황으로 나누었다. 난백, 난황 각각 100μl에, 단백질 추출용 시약인 mammalian cell lysis kit; MCL1(SIGMA-ALDRICH사제) 1000μl를 첨가하고, 25℃에서 10분간, 볼텍스를 사용하여 진탕 추출했다. 이 진탕 추출 후, 단백질 추출액을 회수했다. 상기의 mammalian cell lysis kit; MCL1의 조성은 하기와 같다.

50mM Tris-HCl pH7.5

1mM EDTA(에틸렌디아민트리아세트산)

250mM NaCl

0.1%(w/v) SDS(도데실 황산나트륨)

0.5%(w/v) 데옥시콜산 나트륨

1%(v/v) Igepal CA-630(SIGMA-ALDRICH사제의 계면활성제(Octylphenoxy) polyethoxyethanol)

적당량의 프로테아제 저해제

그 후, 2D-CleanUP 키트(GE사제)를 사용하여 2회의 침전 조작을 실시했다. 제1회째의 침전 조작은, 회수한 상기 단백질 추출액에 TCA(트리클로로아세트산)를 첨가하여 침전을 실시하고, 해당 조작으로 발생한 침전(TCA 침전)을 회수했다. 제2회째의 침전 조작은, 회수한 상기 TCA 침전에 아세톤을 첨가하여 침전을 실시하고, 해당 조작으로 얻어진 침전(검체)을 회수했다.

검체 용액의 조제

얻어진 검체의 일부(단백질 중량으로서 30μg)를, 1차원 등전점 전기 영동용 겔의 팽윤용 완충액인 DeStreak Rehydration Solution(GE사제) 150μl에 용해하고, 1차원 등전점 전기 영동용의 검체 용액(팽윤용 검체 용액)으로 했다. DeStreak Rehydration Solution의 조성은 이하와 같다.

7M 티오 요소

2M 요소

4%(w/v) CHAPS:

3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]프로판술포네이트

0.5%(v/v) IPG 버퍼; GE사제

적당량의 BPB(브로모페놀 블루)

1차원 등전점 전기 영동용 겔로의 검체의 침투

1차원 등전점 전기 영동용 겔(GE사제: IPG 겔 Immobiline Drystrip(pH3-10NL))를 상기의 1차원 등전점 전기 영동용의 검체 용액(팽창용 검체 용액) 140μl에 침지하고, 하룻밤 실온에서 침투시켰다.

본 실시예에 있어서는, 전기 영동 기기로서 GE사제의 IPGphor를 사용했다.

영동 트레이에 실리콘 오일을 채웠다. 검체를 침투시킨 겔의 양단에 물로 적신 여과지를 설치하고, 겔을 실리콘 오일에 덮이도록, 영동 트레이에 세트하고, 겔과의 사이에 해당 여과지를 끼운 상태로 전극을 세트했다.

등전점 전기 영동 기기의 전류값의 상한을 겔 1개당 75μA로 설정하여, 전압 프로그램을, (1)300V 정전압에서 750Vhr까지 정전압 공정을 실시하고(해당 공정 종료 전의 영동 30분간의 전류 변화폭이 5μA이었다), (2)300Vhr에 걸쳐 1000V까지 서서히 전압을 상승시키고, (3)또한 4500Vhr에 걸쳐 5000V까지 서서히 전압을 상승시키고, (4)그 후 5000V 정전압으로 총Vhr가 12000이 될 때까지, 1차원의 등전점 전기 영동을 실시했다.

등전점 전기 영동 겔의 SDS 평형화

상기의 1차원의 등전점 전기 영동을 실시한 후, 등전점 전기 영동 기기에서 겔을 분리하여, 환원제를 포함하는 평형화 완충액에 해당 겔을 침지하고, 15분·실온에서 진탕했다. 상기 환원제를 포함하는 평형화 완충액의 조성은 이하와 같다.

100mM Tris-HCl(pH8.0)

6M 요소

30%(v/v) 글리세롤

2%(w/v) SDS

1%(w/v) DTT

다음으로, 상기 환원제를 포함하는 평형화 완충액을 제거하고, 겔을 알킬화제를 포함하는 평형화 완충액에 침지하고, 15분·실온에서 진탕하여, SDS 평형화한 겔을 얻었다. 상기 알킬화제를 포함하는 평형화 완충액의 조성은 이하와 같다.

100mM Tris-HCl(pH8.0)

6M 요소

30%(v/v) 글리세롤

2%(w/v) SDS

2.5%(w/v) 요오드아세트아마이드

2차원의 SDS - PAGE

본 실시예에 있어서는, 전기 영동 기기로서 life technologies사제의 XCell SureLock Mini-Cell를 사용했다. 2차원 영동용 겔은 life technologies사제 NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gels를 사용했다. 또한, 이하의 조성의 영동용 완충액을 조제하여, 사용했다.

50mM MOPS

50mM Tris염기

0.1%(w/v) SDS

1mM EDTA

또한, 본 실시예에 있어서는 영동용 완충액에 0.5%(w/v)의 아가로스S(닛뽄진사제)와 적당량의 BPB(브로모페놀 블루)를 용해시킨 접착용 아가로스 용액을 사용했다.

SDS-PAGE의 웰 중을 충분히 상기 영동용 완충액으로 세정한 후, 해당 세정에 사용한 완충액을 제거했다. 다음으로, 웰 중에 충분히 용해시킨 접착용 아가로스 용액을 첨가했다. 다음으로, SDS 평형화한 겔을 아가로스 중에 침지시켜, 핀셋으로 SDS 평형화한 겔과 2차원 영동용 겔을 밀착시켰다. 해당 양(兩) 겔이 밀착된 상태로 아가로스가 충분히 굳어진 것을 확인하고, 200V 정전압으로 약 45분간 영동을 실시했다.

겔의 형광 염색

SYPRO Ruby(life technologies사제)를 사용하여 겔의 형광 염색을 실시했다.

우선, 사용하는 밀폐 용기를 사전에 98%(v/v)의 에탄올로 충분히 세정했다. SDS-PAGE 기기로부터 영동 후의 2차원 영동용 겔을 분리하여, 세정한 밀폐 용기에 두고, 50%(v/v) 메탄올 및 7%(v/v) 아세트산 함유 수용액에 30분간 침지하는 처리를 2회 실시했다. 그 후, 해당 수용액을 물로 치환하고, 10분간 침지했다. 다음으로, 2차원 영동용 겔을 40ml의 SYPRO Ruby에 침지하고, 실온에서 하룻밤 진탕했다. 다음으로, SYPRO Ruby를 제거하고, 2차원 영동용 겔을 물로 세정한 후, 10%(v/v) 메탄올 및 7%(v/v) 아세트산 함유 수용액으로 30분간 진탕했다. 해당 수용액을 물로 치환하여, 30분 이상 더 진탕했다.

해석

상기 일련의 처리를 실시한 2차원 영동용 겔을 Typhoon9400(GE사제)를 사용한 형광 이미지의 스캔에 제공했다. 2차원 전기 영동의 결과를 도 1에 나타낸다. 도면의 좌측에는, 분자량 마커의 밴드를 볼 수 있고, 밴드의 위치가 특정의 분자량(KDa)을 나타낸다.

실시예 2: 임뮤노블로트에서의 항원 확인

임뮤노블로트에서의 항원 확인은, 실시예 1에 기재한 순서를 「2차원의 SDS-PAGE」까지 실시한 후, 이하의 「멤브레인으로의 전사」 「임뮤노블로트」 「해석」의 조작을 실시하는 것에 의해 실시했다.

멤브레인으로의 전사

멤브레인으로의 전사는, 이하의 전사 장치 및 전사용 완충액을 사용하여 실시했다.

전사 장치: XCell SureLock Mini-Cell 및 XCell II 블롯 모듈(life technologies사제)

전사용 완충액: NuPAGE 트랜스퍼 버퍼(×20)(life technologies사제)를 milliQ수로 20배 희석하여 사용했다.

구체적으로는 이하의 순서에 따라 이차원 전기 영동 겔 중의 단백질을 멤브레인(PVDF막)에 전사했다.

(1)PVDF막을, 100% 메탄올에 침지하고, 다음으로 milliQ수에 침지하고, 그 후, 전사용 완충액으로 옮겨, PVDF막의 친수화 처리를 실시했다.

(2)스펀지, 여과지, 2차원의 SDS-PAGE가 끝난 겔, 친수화 처리 완료 PVDF막, 여과지, 스펀지의 순서로 세트하고, 전사 장치 중, 30V 정전압으로 1시간 통전했다.

임뮤노블로트

멤브레인의 임뮤노블로트를, 1차 항체로서 메추리알에 대한 알레르기를 가지는 환자의 혈청 또는 건강 피험자의 혈청을 사용하여 실시했다. 이 메추리알 알레르기 환자는, 계란에 대해서는 알레르기 반응을 나타내지 않고, 메추리알에 대해서만 알레르기 반응을 나타내는 환자이다.

멤브레인의 임뮤노블로트는, 이하의 순서에 따라 실시했다.

(1)전사한 멤브레인을 5% 스킴밀크/PBST 용액(비이온 계면활성제 Tween 20을 0.3%포함하는 PBS 버퍼) 중, 실온에서 1시간 진탕했다.

(2)1차 항체로서, 3% 혈청/5% 스킴밀크/PBST 용액 중, 실온에서 1시간 정치했다.

(3)PBST 용액으로 세정했다(5분×3회).

(4)2차 항체로서 항인간 IgE-HRP(세이요우 와사비 퍼옥시다아제)를 3% 스킴밀크/PBST 용액으로 2500배로 희석한 용액 중, 실온에서 1시간 정치했다.

(5)PBST 용액으로 세정했다(5분×3회).

(6)Pierce Western Blotting Substrate Plus(Thermo사제)로, 5분간 정치했다.

해석

상기 일련의 처리를 실시한 멤브레인을 Typhoon9400(GE사제)를 사용한 형광 이미지의 스캔에 제공했다.

메추리알 알레르기 환자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트를, 대조(對照)인 건강 피험자의 혈청을 사용한 임뮤노블로트와 비교했다. 메추리알 난황의 임뮤노블로트에 있어서 메추리알 알레르기 환자의 혈청을 사용한 경우에, 건강 피험자의 혈청을 사용한 경우와는 상이한 4개소(箇所)의 스포트가 검출되었다(도 2).

실시예 3: 인히비션 시험

실시예 2에 있어서 메추리알 알레르기 환자의 혈청을 사용한 경우에 검출된 스포트가, 메추리알 난황에 특이적인 스포트인 것을 확인하기 위하여, 실시예 2의 임뮤노블로트를 실시하기 전에, 계란 난황을 사용한 인히비션 시험을 실시했다.

구체적으로는, 실시예 2의 임뮤노블로트의 공정(2)의 전에, 혈청 75μl에 계란 난황의 MCL1 추출물(단백질량으로 1mg)을 혼화하여 실온에서 1시간 정치한 것을 혈청으로서 사용하고, 실시예 2와 동일하게 임뮤노블로트를 실시했다.

그 결과, 분자량 45kDa 부근, 등전점 5∼9의 스포트, 및 분자량 35kDa 부근, 등전점 7∼12의 스포트가, 메추리알 알레르기 환자의 혈청이, 메추리알 난황의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 것인 점이 분명해졌다(도 3 상단). 즉, 이들 2개의 스포트는, 메추리알에 대한 알레르기의 항원을 나타내는 것인 점이 뒷받침되었다.

또한, 보다 정확을 기하기 위해, 계란 난황에 관한 2차원 겔 전기 영동에 대하여, 메추리알 난황으로 인히비션을 실시한 임뮤노블로트도 실시했다.

구체적으로는, 계란 난황에 관하여, 실시예 1과 동일한 순서로 2차원 겔 전기 영동을 실시했다. 그리고, 실시예 2의 임뮤노블로트의 공정(2) 전에 혈청 75μl에 메추리알 난황의 MCL1 추출물(단백질량으로 1mg)을 혼화하여 실온에서 1시간 정치한 것을 혈청으로서 사용하고, 실시예 2와 동일하게 임뮤노블로트를 실시했다.

메추리알 알레르기 환자의 혈청을 미리 메추리알 난황으로 처리한 경우에는, 임뮤노블로트는 건강 피험자와 동일한 패턴을 나타내고, 메추리알 알레르기 환자에게 특이적인 스포트는 나타나지 않았다(도 3 하단).

실시예 4: 질량 분석

실시예 3에서 동정된 2개의 스포트를 발생하는 항원에 관하여, 질량 분석에 의한 아미노산 서열의 동정을 실시했다.

구체적으로는, 이하의 순서로 단백질의 추출 및 질량 분석을 실시했다.

(1)메추리알 난황에 관하여, 실시예 2의 순서에 따라 단백질 추출, 2차원 전기 영동 및 멤브레인 전사를 실시하고, 0.008% Direct blue/40% 에탄올·10% 아세트산에서 진탕에 의해 염색했다.

(2)그 후, 40% 에탄올·10% 아세트산에서 5분간의 처리를 3회 실시하여 탈색하고, 물로 5분간 세정 후, 바람으로 건조했다.

(3)목적의 스포트를 깨끗한 커터칼날로 절취하고, 원심 튜브에 넣었다. 50μl의 메탄올로 멤브레인 친수 처리 후, 100μl의 물로 2회 세정 후 원심 제거하고, 20μl의 20mM NH₄HCO₃·50% 아세토니트릴을 첨가했다.

(4)1pmol/μL 리실엔도펩티다아제(WAKO) 1μl를 가하고, 37℃에서 60분간 정치한 후, 용액을 새로운 원심 튜브로 회수했다. 20μl의 20mM NH₄HCO₃·50% 아세토니트릴을 멤브레인에 가하고, 실온에서 10분간 담가, 더 회수했다. 0.1% 폼산, 4% 아세토니트릴 10μl로 용해하고, 튜브로 옮겼다.

(5)회수한 용액을 감압 건조한 후, A액(0.1% 폼산, 4% 아세토니트릴 용액) 15μl로 용해하고, 질량 분석(ESI-TOF5600, AB Sciex사제)을 실시했다.

(6)질량 분석계로부터 얻어진 질량 데이터에 근거하는 단백질의 동정은, NCBI를 서치함으로써 실시했다.

결과

본 실시예의 조건의 2차원 전기 영동으로, 분자량 35kDa∼50kDa, 등전점 5∼9의 위치에 나타나는 스포트에 관하여, 질량 분석을 실시한바, 서열번호 1∼16의 아미노산 서열이 검출되었다. 이 스포트에 관하여 질량 분석계로부터 얻어진 질량 데이터를 NCBI로 해석한바, 메추리(Coturnix japonica) 유래의 vitellogenin-1 단백질(서열번호 18)의 일부인 것이 동정되었다.

또한, 본 실시예의 조건의 2차원 전기 영동으로, 분자량 30kDa∼50kDa, 등전점 7∼12의 위치에 나타나는 스포트에 관하여, 질량 분석을 실시한바, 서열번호 19∼22의 아미노산 서열이 검출되었다. 이 스포트에 관하여 질량 분석계로부터 얻어진 질량 데이터를 NCBI로 해석한바, 메추리(Coturnix japonica) 유래의 vitellogenin-2 단백질(서열번호 24)의 일부인 것이 동정되었다.

산업상의 이용 가능성

본 발명에 의해, 메추리알에 대한 알레르기의 신규 항원, 메추리알에 대한 알레르기의 진단 방법 및 진단 키트, 해당 항원을 포함하는 의약 조성물, 해당 항원이 제거된 메추리알 또는 메추리알 가공품, 및 해당 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터를 제공할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Hoyu Co., Ltd. FUJITA HEALTH UNIVERSITY <120> QUAIL EGG ALLERGY ANTIGEN <130> FA1621-16079 <150> JP 2015-105856 <151> 2015-05-25 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Conturnix japonica <400> 1 Ser Phe Lys Pro Val Tyr Thr Asp Val Pro Ile Glu Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Conturnix japonica <400> 2 Thr Phe Ala Val Thr Arg Asn Ile Glu Asp Leu Ala Ala Ser Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Conturnix japonica <400> 3 Met Thr Pro Val Leu Leu Pro Glu Ala Val Pro Asp Ile Met Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 4 Lys Ser Val His Ala Ala Phe Ile Lys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 5 Lys Ser Val His Ala Ala Phe Ile Lys <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 6 Pro Val Tyr Thr Asp Val Pro Ile Glu Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 7 Ile Gln Val Thr Ile Gln Ala Gly Asp Gln Ala Pro Thr Lys Met 1 5 10 15 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 8 Ala Leu Pro His Asp Lys Pro Phe Ala Ser Gly Tyr Leu Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 9 Asp Trp Glu Thr Asn Tyr Asp Phe Lys 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 10 Glu Glu Thr Asn Val Ile Thr Val Ser Ser Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 11 Ile Gln Val Thr Ile Gln Ala Gly Asp Gln Ala Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 12 Asn Thr Ile Gln Asn Val Leu Gln Ala Trp Tyr Gly Pro Asp Glu Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 13 Arg Leu Ile Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ile Gly Arg Gln Leu Thr Lys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 14 Ser Val His Ala Ala Phe Ile Lys 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 15 Thr Phe Ala Val Thr Arg Asn Ile Glu Asp Leu Ala Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 16 Val Asn Ala His Val Pro Val Asn Val Val Ala Thr Ile Gln Met Lys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 1068 <212> DNA <213> Coturnix japonica <220> <221> CDS <222> (1)..(1068) <400> 17 gac tgg gag act aac tat gac ttc aag gaa atc cta aaa aag ctg tca 48 Asp Trp Glu Thr Asn Tyr Asp Phe Lys Glu Ile Leu Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 gac tgg aag gca ctc cct cat gac aaa cct ttt gca tca ggt tac ttg 96 Asp Trp Lys Ala Leu Pro His Asp Lys Pro Phe Ala Ser Gly Tyr Leu 20 25 30 aag atg ttt ggc caa gag ttg atc ttt gga gga ctt gat aaa aac acc 144 Lys Met Phe Gly Gln Glu Leu Ile Phe Gly Gly Leu Asp Lys Asn Thr 35 40 45 atc caa aat gta ctg cag gca tgg tat gga cct gat gaa aaa atc cct 192 Ile Gln Asn Val Leu Gln Ala Trp Tyr Gly Pro Asp Glu Lys Ile Pro 50 55 60 tca ata agg agg tta atc agt agc ctt caa agt ggc ata gga agg caa 240 Ser Ile Arg Arg Leu Ile Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ile Gly Arg Gln 65 70 75 80 ttg acc aag gct tta ctg tcc tct gag att cgt cgt att gtg cct acc 288 Leu Thr Lys Ala Leu Leu Ser Ser Glu Ile Arg Arg Ile Val Pro Thr 85 90 95 tgt gtt ggg ttc cca atg gag acc agc ttc tat tac tct tct gtc aca 336 Cys Val Gly Phe Pro Met Glu Thr Ser Phe Tyr Tyr Ser Ser Val Thr 100 105 110 aaa gca gca gga aat gtt caa gtg caa att aca cct tct cca aga tct 384 Lys Ala Ala Gly Asn Val Gln Val Gln Ile Thr Pro Ser Pro Arg Ser 115 120 125 gat ttc aga ttg aca gag tta cta aat tcc aac att agg ctg cga tcc 432 Asp Phe Arg Leu Thr Glu Leu Leu Asn Ser Asn Ile Arg Leu Arg Ser 130 135 140 aaa atg agt ctg agc atg gct aaa cat atg acc ttt gta gtt ggg atc 480 Lys Met Ser Leu Ser Met Ala Lys His Met Thr Phe Val Val Gly Ile 145 150 155 160 aac aca aac ttg att cag gca ggg ttg gaa gca cac acc aaa gta aat 528 Asn Thr Asn Leu Ile Gln Ala Gly Leu Glu Ala His Thr Lys Val Asn 165 170 175 gct cat gta cct gtg aat gtt gtt gcc act att caa atg aag gaa aaa 576 Ala His Val Pro Val Asn Val Val Ala Thr Ile Gln Met Lys Glu Lys 180 185 190 agt atc aaa gct gaa att ccg cca tgc aaa gaa gag act aat gta att 624 Ser Ile Lys Ala Glu Ile Pro Pro Cys Lys Glu Glu Thr Asn Val Ile 195 200 205 act gta agc tct aag aca ttt gct gtt aca cga aat att gaa gac ttg 672 Thr Val Ser Ser Lys Thr Phe Ala Val Thr Arg Asn Ile Glu Asp Leu 210 215 220 gct gct agt aaa atg act cca gtt ctt cta cct gaa gca gtg cct gac 720 Ala Ala Ser Lys Met Thr Pro Val Leu Leu Pro Glu Ala Val Pro Asp 225 230 235 240 ata atg aag atg tcc ttt gac tcg gat tct gca tca ggc gag act gat 768 Ile Met Lys Met Ser Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Gly Glu Thr Asp 245 250 255 aac atc agg gac aga cag tct gta gaa gat gtt tca tcg gaa aat tcc 816 Asn Ile Arg Asp Arg Gln Ser Val Glu Asp Val Ser Ser Glu Asn Ser 260 265 270 ttc tcc ttt gga cat tct tct tcc tgg aag gag cca ttt gtt cag tcc 864 Phe Ser Phe Gly His Ser Ser Ser Trp Lys Glu Pro Phe Val Gln Ser 275 280 285 atg tgc tct aat gca agt aca ttt ggg gtt caa gtg tgc att gag aag 912 Met Cys Ser Asn Ala Ser Thr Phe Gly Val Gln Val Cys Ile Glu Lys 290 295 300 aaa agt gta cat gca gca ttt atc aaa aat gtg cct ctt tat tac ttt 960 Lys Ser Val His Ala Ala Phe Ile Lys Asn Val Pro Leu Tyr Tyr Phe 305 310 315 320 att gga gaa cat gac ctt aga atg agc ttc aag cca gtc tac aca gat 1008 Ile Gly Glu His Asp Leu Arg Met Ser Phe Lys Pro Val Tyr Thr Asp 325 330 335 gta cct att gaa aaa ata caa gtc aca att cag gca gga gat caa gct 1056 Val Pro Ile Glu Lys Ile Gln Val Thr Ile Gln Ala Gly Asp Gln Ala 340 345 350 cct aca aaa atg 1068 Pro Thr Lys Met 355 <210> 18 <211> 356 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 18 Asp Trp Glu Thr Asn Tyr Asp Phe Lys Glu Ile Leu Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 Asp Trp Lys Ala Leu Pro His Asp Lys Pro Phe Ala Ser Gly Tyr Leu 20 25 30 Lys Met Phe Gly Gln Glu Leu Ile Phe Gly Gly Leu Asp Lys Asn Thr 35 40 45 Ile Gln Asn Val Leu Gln Ala Trp Tyr Gly Pro Asp Glu Lys Ile Pro 50 55 60 Ser Ile Arg Arg Leu Ile Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ile Gly Arg Gln 65 70 75 80 Leu Thr Lys Ala Leu Leu Ser Ser Glu Ile Arg Arg Ile Val Pro Thr 85 90 95 Cys Val Gly Phe Pro Met Glu Thr Ser Phe Tyr Tyr Ser Ser Val Thr 100 105 110 Lys Ala Ala Gly Asn Val Gln Val Gln Ile Thr Pro Ser Pro Arg Ser 115 120 125 Asp Phe Arg Leu Thr Glu Leu Leu Asn Ser Asn Ile Arg Leu Arg Ser 130 135 140 Lys Met Ser Leu Ser Met Ala Lys His Met Thr Phe Val Val Gly Ile 145 150 155 160 Asn Thr Asn Leu Ile Gln Ala Gly Leu Glu Ala His Thr Lys Val Asn 165 170 175 Ala His Val Pro Val Asn Val Val Ala Thr Ile Gln Met Lys Glu Lys 180 185 190 Ser Ile Lys Ala Glu Ile Pro Pro Cys Lys Glu Glu Thr Asn Val Ile 195 200 205 Thr Val Ser Ser Lys Thr Phe Ala Val Thr Arg Asn Ile Glu Asp Leu 210 215 220 Ala Ala Ser Lys Met Thr Pro Val Leu Leu Pro Glu Ala Val Pro Asp 225 230 235 240 Ile Met Lys Met Ser Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Gly Glu Thr Asp 245 250 255 Asn Ile Arg Asp Arg Gln Ser Val Glu Asp Val Ser Ser Glu Asn Ser 260 265 270 Phe Ser Phe Gly His Ser Ser Ser Trp Lys Glu Pro Phe Val Gln Ser 275 280 285 Met Cys Ser Asn Ala Ser Thr Phe Gly Val Gln Val Cys Ile Glu Lys 290 295 300 Lys Ser Val His Ala Ala Phe Ile Lys Asn Val Pro Leu Tyr Tyr Phe 305 310 315 320 Ile Gly Glu His Asp Leu Arg Met Ser Phe Lys Pro Val Tyr Thr Asp 325 330 335 Val Pro Ile Glu Lys Ile Gln Val Thr Ile Gln Ala Gly Asp Gln Ala 340 345 350 Pro Thr Lys Met 355 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Conturnix japonica <400> 19 Leu Cys Ala Asp Ala Ser Val Leu Asn Ala His Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Conturnix japonica <400> 20 Thr Val Gln Leu Ala Gly Val Asp Ser Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 21 Ala Glu Ala Pro Ser Ala Val Leu Asn Asn Leu Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 22 Gly Gly Leu Gln Leu Val Val Phe Ala Asp Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 1212 <212> DNA <213> Coturnix japonica <220> <221> CDS <222> (1)..(1212) <400> 23 act cca gtg tta gct gct ttt ctc cat ggc att agt aac agt aag aag 48 Thr Pro Val Leu Ala Ala Phe Leu His Gly Ile Ser Asn Ser Lys Lys 1 5 10 15 aaa gga ggt ctc cag ctt gtg gta ttt gct gat acc gac tct gtc aag 96 Lys Gly Gly Leu Gln Leu Val Val Phe Ala Asp Thr Asp Ser Val Lys 20 25 30 cca cgg atg cag gta ttt gtg aca gac ctc aca gat tca agc aag tgg 144 Pro Arg Met Gln Val Phe Val Thr Asp Leu Thr Asp Ser Ser Lys Trp 35 40 45 aaa ctc tgt gca gat gct tcg gtc ctc aat gct cac aag gca gtg gct 192 Lys Leu Cys Ala Asp Ala Ser Val Leu Asn Ala His Lys Ala Val Ala 50 55 60 tac ctg aaa tgg ggc tgg aat tgc cgg gac tac aag gtt tct act gag 240 Tyr Leu Lys Trp Gly Trp Asn Cys Arg Asp Tyr Lys Val Ser Thr Glu 65 70 75 80 ctg gta act gga cgg ttt gct ggg cat cct gct gca caa gtg aag ctg 288 Leu Val Thr Gly Arg Phe Ala Gly His Pro Ala Ala Gln Val Lys Leu 85 90 95 gag tgg ccc aag gtt cct tca ggt gtc aga tca atg gct gaa tgg ttt 336 Glu Trp Pro Lys Val Pro Ser Gly Val Arg Ser Met Ala Glu Trp Phe 100 105 110 tac agg ttt gtt cct ggg gct gca ttt atg ttg ggt ttc tct gag aga 384 Tyr Arg Phe Val Pro Gly Ala Ala Phe Met Leu Gly Phe Ser Glu Arg 115 120 125 act ggc aag aat cct tct cga caa gcc agg gtg gtt gtg gct cta act 432 Thr Gly Lys Asn Pro Ser Arg Gln Ala Arg Val Val Val Ala Leu Thr 130 135 140 tct cca agg aca tgt gat att gtt gcc aag ctg cct gat ata acc ctc 480 Ser Pro Arg Thr Cys Asp Ile Val Ala Lys Leu Pro Asp Ile Thr Leu 145 150 155 160 tat caa aaa gcc atg agg ctt cct cta tca ctc cct gtg ggt ccg agg 528 Tyr Gln Lys Ala Met Arg Leu Pro Leu Ser Leu Pro Val Gly Pro Arg 165 170 175 atc cca gct tca gag ctg cag cct cca atc tgg aat gtc ttt gct gaa 576 Ile Pro Ala Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ile Trp Asn Val Phe Ala Glu 180 185 190 gcc ccc tct gca gtg ctc aac aat ttg aaa gct cgc tgc tca gtt tcg 624 Ala Pro Ser Ala Val Leu Asn Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Val Ser 195 200 205 cac aac aag atc aca acc ttt aat gga gtc aag ttc aac tac tct atg 672 His Asn Lys Ile Thr Thr Phe Asn Gly Val Lys Phe Asn Tyr Ser Met 210 215 220 cca gga aac tgc tac cac atc ttg gct cag gac tgc agc tct gaa ctt 720 Pro Gly Asn Cys Tyr His Ile Leu Ala Gln Asp Cys Ser Ser Glu Leu 225 230 235 240 aag ttc ctg gtg acg atg aaa aat gct gat gaa act aca aac ctt aaa 768 Lys Phe Leu Val Thr Met Lys Asn Ala Asp Glu Thr Thr Asn Leu Lys 245 250 255 gcc atc aac atc aag att ggc agt cat gaa att gat atg cat cct gtg 816 Ala Ile Asn Ile Lys Ile Gly Ser His Glu Ile Asp Met His Pro Val 260 265 270 aat gga cag gtg aaa ttg ctg gtg gat ggg gct gag agc ccc aca gcc 864 Asn Gly Gln Val Lys Leu Leu Val Asp Gly Ala Glu Ser Pro Thr Ala 275 280 285 aac att tcc ctc gta tct gct ggt gct tct cta tgg att cgt aat gaa 912 Asn Ile Ser Leu Val Ser Ala Gly Ala Ser Leu Trp Ile Arg Asn Glu 290 295 300 aac caa ggg ctt gta ctt gtt ggc cca gcc tat ggt atc gat aca atg 960 Asn Gln Gly Leu Val Leu Val Gly Pro Ala Tyr Gly Ile Asp Thr Met 305 310 315 320 tac ttc aat gga caa aca ttc tgg att caa gtt cct tta tgg atg gca 1008 Tyr Phe Asn Gly Gln Thr Phe Trp Ile Gln Val Pro Leu Trp Met Ala 325 330 335 ggg aaa aca tgt gga atc tgt gga aaa tat gac gca gaa tac aaa cag 1056 Gly Lys Thr Cys Gly Ile Cys Gly Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Lys Gln 340 345 350 gag tat tgg atg ccc aat gga tat tta gct aaa gat tgc gtg agc ttt 1104 Glu Tyr Trp Met Pro Asn Gly Tyr Leu Ala Lys Asp Cys Val Ser Phe 355 360 365 ggt cat tct tgg atc ttg gaa gaa acg ccc tgt aga gga gct tgt aaa 1152 Gly His Ser Trp Ile Leu Glu Glu Thr Pro Cys Arg Gly Ala Cys Lys 370 375 380 ctg cat cgt tcg ttt gtg aag ctt gag aag acg gtt cag ctt gcg ggt 1200 Leu His Arg Ser Phe Val Lys Leu Glu Lys Thr Val Gln Leu Ala Gly 385 390 395 400 gtt gat tcc aag 1212 Val Asp Ser Lys <210> 24 <211> 404 <212> PRT <213> Coturnix japonica <400> 24 Thr Pro Val Leu Ala Ala Phe Leu His Gly Ile Ser Asn Ser Lys Lys 1 5 10 15 Lys Gly Gly Leu Gln Leu Val Val Phe Ala Asp Thr Asp Ser Val Lys 20 25 30 Pro Arg Met Gln Val Phe Val Thr Asp Leu Thr Asp Ser Ser Lys Trp 35 40 45 Lys Leu Cys Ala Asp Ala Ser Val Leu Asn Ala His Lys Ala Val Ala 50 55 60 Tyr Leu Lys Trp Gly Trp Asn Cys Arg Asp Tyr Lys Val Ser Thr Glu 65 70 75 80 Leu Val Thr Gly Arg Phe Ala Gly His Pro Ala Ala Gln Val Lys Leu 85 90 95 Glu Trp Pro Lys Val Pro Ser Gly Val Arg Ser Met Ala Glu Trp Phe 100 105 110 Tyr Arg Phe Val Pro Gly Ala Ala Phe Met Leu Gly Phe Ser Glu Arg 115 120 125 Thr Gly Lys Asn Pro Ser Arg Gln Ala Arg Val Val Val Ala Leu Thr 130 135 140 Ser Pro Arg Thr Cys Asp Ile Val Ala Lys Leu Pro Asp Ile Thr Leu 145 150 155 160 Tyr Gln Lys Ala Met Arg Leu Pro Leu Ser Leu Pro Val Gly Pro Arg 165 170 175 Ile Pro Ala Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ile Trp Asn Val Phe Ala Glu 180 185 190 Ala Pro Ser Ala Val Leu Asn Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Val Ser 195 200 205 His Asn Lys Ile Thr Thr Phe Asn Gly Val Lys Phe Asn Tyr Ser Met 210 215 220 Pro Gly Asn Cys Tyr His Ile Leu Ala Gln Asp Cys Ser Ser Glu Leu 225 230 235 240 Lys Phe Leu Val Thr Met Lys Asn Ala Asp Glu Thr Thr Asn Leu Lys 245 250 255 Ala Ile Asn Ile Lys Ile Gly Ser His Glu Ile Asp Met His Pro Val 260 265 270 Asn Gly Gln Val Lys Leu Leu Val Asp Gly Ala Glu Ser Pro Thr Ala 275 280 285 Asn Ile Ser Leu Val Ser Ala Gly Ala Ser Leu Trp Ile Arg Asn Glu 290 295 300 Asn Gln Gly Leu Val Leu Val Gly Pro Ala Tyr Gly Ile Asp Thr Met 305 310 315 320 Tyr Phe Asn Gly Gln Thr Phe Trp Ile Gln Val Pro Leu Trp Met Ala 325 330 335 Gly Lys Thr Cys Gly Ile Cys Gly Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Lys Gln 340 345 350 Glu Tyr Trp Met Pro Asn Gly Tyr Leu Ala Lys Asp Cys Val Ser Phe 355 360 365 Gly His Ser Trp Ile Leu Glu Glu Thr Pro Cys Arg Gly Ala Cys Lys 370 375 380 Leu His Arg Ser Phe Val Lys Leu Glu Lys Thr Val Gln Leu Ala Gly 385 390 395 400 Val Asp Ser Lys

Claims (10)

1. 메추리알에 대한 알레르기의 진단 키트로서, 이하 (1) 또는 (2)의 단백질의 적어도 하나:
   (1) 2차원전기영동에 있어서, 분자량 35kDa~50kDa 및 등전점 5~9의 스포트로서 나타나는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 메추리 유래의 단백질;
   (2) 2차원전기영동에 있어서, 분자량 30kDa~50kDa 및 등전점 7~12의 스포트로서 나타나는, 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 메추리 유래의 단백질;
   을 항원으로서 포함하는, 상기 진단 키트.
2. 삭제
3. 메추리알에 대한 알레르기의 진단용 조성물로서, 청구항 1에 있어서 (1) 혹은 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나를 항원으로서 포함하는, 상기 진단용 조성물.
4. 대상의 메추리알에 대한 알레르기를 진단하기 위한 지표를 제공하는 방법으로서, 이하의 공정:
   (i)대상으로부터 얻어진 시료를 항원에 접촉시킨다, 여기서 해당 시료는 IgE 항체가 포함되는 용액이다;
   (ii)대상으로부터 얻어진 시료 중의 IgE 항체와 해당 항원과의 결합을 검출한다;
   (iii)대상의 IgE 항체와 해당 항원과의 결합이 검출된 경우, 대상이 메추리알에 대한 알레르기인 것의 지표가 제공된다;
   를 포함하고, 여기서 해당 항원은, 청구항 1에 있어서 (1) 혹은 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나인, 상기 방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 청구항 1에 있어서 (1) 혹은 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나를 포함하는 메추리알로부터, 상기 단백질이 제거 또는 저감되어 있는 것을 특징으로 하는 메추리알 또는 메추리알 가공품.
8. 청구항 1에 있어서 (1) 혹은 (2)로서 특정되는 단백질의 적어도 하나와 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상물에 있어서의 메추리알에 대한 알레르기의 원인이 되는 항원의 유무를 판정하기 위한 테스터.
9. 삭제
10. 삭제

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