JP7038386B2 - 魚アレルギーの抗原 - Google Patents
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Description
(1)(1A)α-アクチニン-3(Alpha-actinin-3)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(1A-a)~(1A-e)のいずれかのタンパク質:
(1A-a)配列番号2において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1A-b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1A-c)配列番号1において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1A-d)配列番号1で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(1A-e)配列番号1で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(1B)配列番号2または3のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2)(2A)EEF1A2バインディングプロテイン-ライク(EEF1A2 binding protein-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(2A-a)~(2A-e)のいずれかのタンパク質:
(2A-a)配列番号5において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2A-b)配列番号5で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2A-c)配列番号4において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2A-d)配列番号4で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(2A-e)配列番号4で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(2B)配列番号5~8からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(3)(3A)α-1,4-グルカンホスホリラーゼ(Alpha-1,4-glucan phosphorylase)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(3A-a)~(3A-e)のいずれかのタンパク質:
(3A-a)配列番号10において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3A-b)配列番号10で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3A-c)配列番号9において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3A-d)配列番号9で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(3A-e)配列番号9で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(3B)配列番号10~16からなる群より選択されるアミノ酸配列の
少なくとも1つを含むタンパク質;
(4)(4A)エロンゲーションファクター2(Elongation factor 2)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(4A-a)~(4A-e)のいずれかのタンパク質:
(4A-a)配列番号19において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4A-b)配列番号19で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4A-c)配列番号18において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4A-d)配列番号18で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(4A-e)配列番号18で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(4B)配列番号19~24からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むタンパク質;
(5)(5A)ヒートショックコグネート70kDaプロテイン(Heat shock cognate 70 kDa protein)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(5A-a)~(5A-e)のいずれかのタンパク質:
(5A-a)配列番号26において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5A-b)配列番号26で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5A-c)配列番号25において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5A-d)配列番号25で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(5A-e)配列番号25で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(5B)配列番号26~31からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むタンパク質;
(6)(6A)セロトランスフェリン(Serotransferrin)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(6A-a)~(6A-e)のいずれかのタンパク質:
(6A-a)配列番号33において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6A-b)配列番号33で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6A-c)配列番号32において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6A-d)配列番号32で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(6A-e)配列番号32で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(6B)配列番号33~41からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(7)(7A)ミオシンバインディングプロテインH-ライク(Myosin binding protein H-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(7A-a)~(7A-e)のいずれかのタンパク質:
(7A-a)配列番号43において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7A-b)配列番号43で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7A-c)配列番号42において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7A-d)配列番号42で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(7A-e)配列番号42で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(7B)配列番号43~54からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(8)(8A)デスミン(フラグメント)(Desmin (Fragment))またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(8A-a)~(8A-e)のいずれかのタンパク質:
(8A-a)配列番号56において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8A-b)配列番号56で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8A-c)配列番号55において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8A-d)配列番号55で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(8A-e)配列番号55で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(8B)配列番号56~59からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(9)(9A)キャッピングプロテイン(アクチンフィラメント)マッスルZ-ラインベータ(Capping protein (Actin filament) muscle Z-line beta)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(9A-a)~(9A-e)のいずれかのタンパク質:
(9A-a)配列番号61において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9A-b)配列番号61で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9A-c)配列番号60において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9A-d)配列番号60で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(9A-e)配列番号60で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(9B)配列番号61~68からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
を抗原として含む、前記診断キット。
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象が魚アレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は、上記[1]において(1)~(9)として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法。
(10)(10A)ミオシンヘビーチェイン,ファストスケレタルマッスル-ライク(myosin heavy chain, fast skeletal muscle-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(10A-a)~(10A-e)のいずれかのタンパク質:
(10A-a)配列番号70において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10A-b)配列番号70で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10A-c)配列番号69において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10A-d)配列番号69で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(10A-e)配列番号69で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(10B)配列番号70~108からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(11)(11A)グリコーゲンホスホリラーゼ,マッスルフォーム-ライク(glycogen phosphorylase, muscle form-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(11A-a)~(11A-e)のいずれかのタンパク質:
(11A-a)配列番号110において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(11A-b)配列番号110で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(11A-c)配列番号109において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(11A-d)配列番号109で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(11A-e)配列番号109で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(11B)配列番号110~119からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(12)(12A)ミオシン-バインディングプロテインC,ファスト-タイプ-ライク(myosin-binding protein C, fast-type-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(12A-a)~(12A-e)のいずれかのタンパク質:
(12A-a)配列番号121において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12A-b)配列番号121で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12A-c)配列番号120において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12A-d)配列番号120で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(12A-e)配列番号120で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(12B)配列番号121~136からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(13)(13A)ATPシンターゼサブユニットβ,ミトコンドリアル(ATP synthase subunit beta, mitochondrial)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(13A-a)~(13A-e)のいずれかのタンパク質:
(13A-a)配列番号138において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(13A-b)配列番号138で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(13A-c)配列番号137において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(13A-d)配列番号137で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(13A-e)配列番号137で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(13B)配列番号138~142からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(14)(14A)L-ラクテートデヒドロゲナーゼAチェイン-ライク(L-lactate dehydrogenase A chain-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(14A-a)~(14A-e)のいずれかのタンパク質:
(14A-a)配列番号144において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(14A-b)配列番号144で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(14A-c)配列番号143において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(14A-d)配列番号143で示される塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(14A-e)配列番号143で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(14B)配列番号144~149からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
を抗原として含む、前記診断キット。
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象が魚アレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は、上記[9]において(10)~(14)として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法。
魚に含まれるタンパク質について、上記の手法を利用して魚に対するアレルギーの抗原の特定を行った。具体的には、魚の身からタンパク質を抽出し、下記の条件で2次元電気泳動に供した。
スポット1:分子量80~160kDa、pI3.0~7.0
スポット2:分子量110~260kDa、pI4.0~8.0
スポット3:分子量80~160kDa、pI4.0~10.0
スポット4:分子量80~160kDa、pI5.0~11.0
スポット5:分子量50~110kDa、pI3.0~7.0
スポット6:分子量60~110kDa、pI4.0~8.0
スポット7:分子量40~80kDa、pI4.0~8.0
スポット8:分子量40~80kDa、pI3.0~7.0
スポット9:分子量20~50kDa、pI3.0~7.0
スポット10:分子量160~300、pI3.0~7.0
スポット11:分子量80~160、pI4.0~8.0
スポット12:分子量100~160、pI4.0~7.0
スポット13:分子量30~70、pI3.0~7.0
スポット14:分子量20~50、pI5.0~9.0
(1)スポット1の抗原
スポット1について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号3のアミノ酸配列が検出された。
(1A-a)配列番号2において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(1A-b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(1A-c)配列番号1において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(1A-d)配列番号1で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(1A-e)配列番号1で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(1B)配列番号2または3のアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列のすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号2または3で示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット2について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号6~8のアミノ酸配列が検出された。
(2A-a)配列番号5において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(2A-b)配列番号5で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(2A-c)配列番号4において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(2A-d)配列番号4で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(2A-e)配列番号4で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(2B)配列番号5~8からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号5~8のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット3について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号11~16のアミノ酸配列が検出された。
(3A-a)配列番号10において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(3A-b)配列番号10で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(3A-c)配列番号9において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(3A-d)配列番号9で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(3A-e)配列番号9で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(3B)配列番号10~16からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5、6種またはすべての配列を含むタンパク質。さらに好ましくは、配列番号10、12、13、15、および16からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号10~16のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット4について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号20~24のアミノ酸配列が検出された。
(4A-a)配列番号19において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(4A-b)配列番号19で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(4A-c)配列番号18において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(4A-d)配列番号18で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(4A-e)配列番号18で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(4B)配列番号19~24からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号19~24のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット5について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号27~31のアミノ酸配列が検出された。
(5A-a)配列番号26において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(5A-b)配列番号26で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(5A-c)配列番号25において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(5A-d)配列番号25で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(5A-e)配列番号25で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(5B)配列番号26~31からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号26~31のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット6について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号34~41のアミノ酸配列が検出された。
(6A-a)配列番号33において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(6A-b)配列番号33で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(6A-c)配列番号32において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(6A-d)配列番号32で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(6A-e)配列番号32で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(6B)配列番号33~41からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5,6、7、8種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号33~41のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット7について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号44~54のアミノ酸配列が検出された。
(7A-a)配列番号43において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(7A-b)配列番号43で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(7A-c)配列番号42において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(7A-d)配列番号42で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(7A-e)配列番号42で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(7B)配列番号43~54からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5,6、7、8、9、10、11種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号43~54のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット8について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号57~59のアミノ酸配列が検出された。
(8A-a)配列番号56において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(8A-b)配列番号56で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(8A-c)配列番号55において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(8A-d)配列番号55で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(8A-e)配列番号55で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(8B)配列番号56~59からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号56~59のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット9について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号62~68のアミノ酸配列が検出された。
(9A-a)配列番号61において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(9A-b)配列番号61で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(9A-c)配列番号60において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(9A-d)配列番号60で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(9A-e)配列番号60で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(9B)配列番号61~68からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5、6、7種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号61~68のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット10について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号71~108のアミノ酸配列が検出された。
(10A-a)配列番号70において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(10A-b)配列番号70で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(10A-c)配列番号69において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(10A-d)配列番号69で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(10A-e)配列番号69で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(10B)配列番号70~108からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号70~108のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット11について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号111~119のアミノ酸配列が検出された。
(11A-a)配列番号110において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(11A-b)配列番号110で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(11A-c)配列番号109において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(11A-d)配列番号109で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(11A-e)配列番号109で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(11B)配列番号110~119からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号110~119のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット12について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号122~136のアミノ酸配列が検出された。
(12A-a)配列番号121において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(12A-b)配列番号121で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(12A-c)配列番号119において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(12A-d)配列番号119で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(12A-e)配列番号119で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(12B)配列番号121~136からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号121~136のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット13について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号139~142のアミノ酸配列が検出された。
(13A-a)配列番号138において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(13A-b)配列番号138で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(13A-c)配列番号137において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(13A-d)配列番号137で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(13A-e)配列番号137で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(13B)配列番号138~142からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号138~142のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
スポット14について質量分析による配列同定を行った結果、配列番号145~149のアミノ酸配列が検出された。
(14A-a)配列番号144において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
(14A-b)配列番号144で示されるアミノ酸配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(14A-c)配列番号143において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(14A-d)配列番号143で示される塩基配列と同一性が70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(14A-e)配列番号143で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(14B)配列番号144~149からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質、好ましくは当該アミノ酸配列の少なくとも2、3、4、5種またはすべての配列を含むタンパク質。ここにおいて、配列番号144~149のいずれかで示されるアミノ酸配列は、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されていてもよい。
A群:ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、
E群:セリン、スレオニン
F群:フェニルアラニン、チロシン
本発明は、対象の魚アレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程:
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象が魚アレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は上記(1)~(9)の抗原として特定されるタンパク質の少なくとも一つ、または上記(10)~(14)の抗原として特定されるタンパク質の少なくとも一つ、である、前記方法を提供する。
(A)1次元目の等電点電気泳動ゲルとして、ゲル長が5~10cmの範囲内であって、ゲルのpH範囲が3~10であり、泳動方向に対するゲルのpH勾配が、pH5までのゲル長をa、pH5~7のゲル長をb、pH7以上のゲル長をcとした場合において、「a<b]および「b>c」の関係を満たす;
(B)(A)の場合であって、ゲルの全長を1とした場合、aが0.15~0.3の範囲内、bが0.4~0.7の範囲内、cが0.15~0.3の範囲内である;
(C)1次元目の等電点電気泳動において、検体を含むゲル1本につき100V~600Vの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動30分あたりの泳動変化幅が5μAの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇行程を始める;
(D)(C)の場合に、電圧上昇工程の最終電圧を3000V~6000Vの範囲内とする;
(E)1次元目の等電点電気泳動ゲルの長手方向のゲル長が5~10cmであって、2次元目電気泳動ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度を3~6%とする;および
(F)(E)の場合に、2次元目電気泳動ゲルの泳動方向先端側の部分のゲル濃度が、泳動方向基端部のゲル濃度よりも高く設定する;
からなる群より選択される少なくとも一つを満たす条件で2次元電気泳動を行うことができる。
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象が魚に対するアレルギーであると判断する;
ことを含み、ここで当該抗原は上記(1)~(9)の抗原として特定されるタンパク質の少なくとも一つ、または上記(10)~(14)の抗原として特定されるタンパク質の少なくとも一つ、である、前記方法を提供する。ここにおいて(i)および(ii)の各工程は、魚に対するアレルギーを診断するための指標を提供する方法の各工程について説明したとおりに行われる。
本発明は、上記(1)~(9)の抗原の少なくとも一つ、または上記(10)~(14)の抗原の少なくとも一つ、を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、上記(1)~(9)の抗原の少なくとも一つ、または上記(10)~(14)の抗原の少なくとも一つ、に対する抗体を含むテスターを提供する。
・作製したIgE抗体を含むテスターを食品・食材等から得られた試料に接触させて、例えばELISA法等を用いて当該IgE抗体と試料中の抗原との結合を検出し、当該IgE抗体と抗原との結合が検出された場合に、対象食品・食材等に当該抗原が残留していると判断する方法。
・食品・食材等からタンパク質を抽出し、電気泳動して抗原のスポットバンドがあるかどうかを抗体により検出する方法。
・ろ紙などに食品・食材等をしみこませ、そこに含まれる抗原を検出するように、抗体溶液を反応させる方法。
本発明は、上記(1)~(9)の抗原の少なくとも一つ、または上記(10)~(14)の抗原の少なくとも一つ、が除去または低減されていることを特徴とする魚、魚卵、当該魚もしくは当該魚卵加工品、または当該魚卵を産むもしくは当該魚卵から生まれた魚を提供する。
下記の二次元電気泳動方法を使用して、サケに含まれるタンパク質を調べた。
サケに含まれるタンパク質の抽出及び精製は次のように行った。サケの身に、可溶化剤(Mammalian Lysis Buffer (MCLI), SIGMA社)を加えてタンパク質を抽出した後、尿素バッファーを添加してタンパク質抽出液を得た。尿素バッファーの組成は以下の通りである。
30mM Tris
2M チオ尿素
7M 尿素
4%(w/v) CHAPS:
3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホナート
適量の希塩酸
蒸留水を加えて全体を100mLに調整した。pHは8.5であった。
その後、タンパク質重量として25μgずつを混合して抽出液を得た。
得られた検体の一部(タンパク質重量として40μg)を、1次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution(GE社製)150μlに溶解し、1次元目等電点電気泳動用の検体溶液(膨潤用検体溶液)とした。DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
7M チオ尿素
2M 尿素
4%(w/v) CHAPS
0.5%(v/v) IPGバッファー;GE社製
適量のBPB(ブロモフェノールブルー)
1次元目等電点電気泳動用ゲル(GE社製:IPGゲルImmobiline Drystrip (pH3-10NL))を前記した1次元目等電点電気泳動用の検体溶液(膨張用検体溶液)140μlに浸漬し、一晩室温にて浸透させた。
上記の1次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、15分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
6M 尿素
30%(v/v) グリセロール
2%(w/v) SDS
1%(w/v) DTT
100mM Tris-HCl(pH8.0)
6M 尿素
30%(v/v) グリセロール
2%(w/v) SDS
2.5%(w/v) ヨードアセトアミド
本実施例においては、電気泳動機器としてlife technologies社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。2次元目泳動用ゲルはlife technologies社製NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
50mM MOPS
50mM Tris塩基
0.1%(w/v) SDS
1mM EDTA
SYPRO Ruby(life technologies社製)を用いてゲルの蛍光染色を行った。
上記一連の処理を施した2次元目泳動用ゲルをTyphoon9500(GE社製)を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。サケの身に含まれるタンパク質について、2次元電気泳動の結果を図1A左図に示す。ゲルの写真の左側には、分子量マーカーのバンドが見られ、バンドの位置が特定の分子量(KDa)を示す。
イムノブロットでの抗原確認は、実施例1に記載した手順を「2次元目のSDS-PAGE」まで行った後、以下の「メンブレンへの転写」「イムノブロット」「解析」の操作を行うことにより行った。
メンブレンへの転写は、以下の転写装置及び転写用緩衝液を用いて行った。
転写装置:XCell SureLock Mini-Cell およびXCell IIブロットモジュール(life technologies社製)
転写用緩衝液:NuPAGEトランスファーバッファー(×20)(life technologies社製)をmilliQ水で20倍希釈して使用した。
(1)PVDF膜を、100%メタノールに浸漬し、次にmilliQ水に浸漬し、その後、転写用緩衝液に移して、PVDF膜の親水化処理を行った。
(2)スポンジ、ろ紙、2次元目のSDS-PAGEが終わった2次元目泳動用ゲル、親水化処理済みPVDF膜、ろ紙、スポンジの順でセットし、転写装置中、30V定電圧で1時間通電した。
メンブレンのイムノブロットを、1次抗体として魚に対するアレルギーを有する患者1の血清または非魚アレルギー被験者の血清を用いて行った。この魚アレルギーの患者1は、魚による即時型アレルギーと診断された患者である。なお、この患者は、サケ、アジ、アナゴ、クロダイ、サバ、タイ、タラ、ハマチに対してアレルギー症状を発症し、プリックテストで陽性を示した。
(1)転写したメンブレンを5%スキムミルク/PBST溶液(非イオン界面活性剤Tween(登録商標) 20を0.1%含むPBSバッファー)中、室温で1時間振とうした。
(2)1次抗体として、5%血清/5%スキムミルク/PBST溶液中、室温で1時間静置した。
(3)PBST溶液で洗浄した(5分×3回)。
(4)2次抗体として抗ヒトIgE-HRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)を5%スキムミルク/PBST溶液で5000倍に希釈した溶液中、室温で1時間静置した。
(5)PBST溶液で洗浄した(5分×3回)。
(6)Pierce Western Blotting Substrate Plus(Thermo社製)で、5分間静置した。
上記一連の処理を施したメンブレンをTyphoon9500(GE社製)を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。
スポット1:分子量90~120kDa、pI3.0~6.0
スポット2:分子量120~160kDa、pI4.0~7.0
スポット3:分子量90~120kDa、pI5.0~8.0
スポット4:分子量90~120kDa、pI6.0~8.0
スポット5:分子量60~90kDa、pI3.0~6.0
スポット6:分子量70~100kDa、pI5.0~7.0
スポット7:分子量40~70kDa、pI4.0~7.0
スポット8:分子量40~70kDa、pI4.0~7.0
スポット9:分子量20~50kDa、pI4.0~7.0
上記の9つのスポットを生じる抗原について、質量分析によるアミノ酸配列の同定を行った。
(1)サケの身について、実施例1及び2の手順に従ってタンパク質抽出、2次元電気泳動及びメンブレン転写を行い、0.008%Direct blue/40%エタノール・10%酢酸で振とうにより染色した。
(2)その後、40%エタノール・10%酢酸で5分間の処理を3回行って脱色し、水で5分間洗浄後、風乾した。
(3)目的のスポットをきれいなカッター刃で切り取り、遠心チューブに入れた。50μLのメタノールでメンブレン親水処理後、100μLの水で2回洗浄後遠心除去し、20μLの20mM NH4HCO3・50%アセトニトリルを加えた。
(4)1pmol/μLリシルエンドペプチダーゼ(WAKO)1μLを加え、37℃で60分間静置した後、溶液を新しい遠心チューブに回収した。20μLの20mM NH4HCO3・70%アセトニトリルをメンブレンに加え、室温にて10分間浸し、さらに回収した。0.1%ギ酸、4%アセトニトリル10μLで溶解し、チューブに移した。
(5)回収した溶液を減圧乾燥した後、A液(0.1%ギ酸、4%アセトニトリル溶液)15μlで溶解し、質量分析(ESI-TOF6600, AB Sciex社製)を行った。
(6)質量分析計から得られた質量データに基づくタンパク質の同定は、NCBIまたはUniProtをサーチすることで行った。
各スポットについて、質量分析を行ったところ、以下のアミノ酸配列が検出された。
スポット1:配列番号3で示されるアミノ酸配列
スポット2:配列番号6~8で示されるアミノ酸配列
スポット3:配列番号11~17で示されるアミノ酸配列
スポット4:配列番号20~24で示されるアミノ酸配列
スポット5:配列番号27~31で示されるアミノ酸配列
スポット6:配列番号34~41で示されるアミノ酸配列
スポット7:配列番号44~54で示されるアミノ酸配列
スポット8:配列番号57~59で示されるアミノ酸配列
スポット9:配列番号62~68で示されるアミノ酸配列
スポット1:α-アクチニン-3(Alpha-actinin-3)(NCBIのタンパク質アクセッション番号XP_014051545.1、DNAアクセッション番号XM_014196070.1)(アミノ酸配列:配列番号2、それをコードする塩基配列:配列番号1)
スポット2:EEF1A2バインディングプロテイン-ライク(EEF1A2 binding protein-like)(UniProtのタンパク質アクセッション番号B5RI29、DNAアクセッション番号ACH85270.1)(アミノ酸配列:配列番号5、それをコードする塩基配列:配列番号4)
スポット3:α-1,4-グルカンホスホリラーゼ(Alpha-1,4-glucan phosphorylase)(UniProtのタンパク質アクセッション番号B5DG55、DNAアクセッション番号ACH70729.1)(アミノ酸配列:配列番号10、それをコードする塩基配列:配列番号9)
スポット4:エロンゲーションファクター2(Elongation factor 2)(UniProtのタンパク質アクセッション番号C0H9N2、DNAアクセッション番号ACN10751.1)(アミノ酸配列:配列番号19、それをコードする塩基配列:配列番号18)
スポット5:ヒートショックコグネート70kDaプロテイン(Heat shock cognate 70 kDa protein)(UniProtのタンパク質アクセッション番号B5X3U6、DNAアクセッション番号ACI33977.1)(アミノ酸配列:配列番号26、それをコードする塩基配列:配列番号25)
スポット6:セロトランスフェリン(Serotransferrin)(UniProtのタンパク質アクセッション番号P79815、DNAアクセッション番号BAA13759.1)(アミノ酸配列:配列番号33、それをコードする塩基配列:配列番号32)
スポット7:ミオシンバインディングプロテインH-ライク(Myosin binding protein H-like)(UniProtのタンパク質アクセッション番号B5DG45、DNAアクセッション番号ACH70719.1)(アミノ酸配列:配列番号43、それをコードする塩基配列:配列番号42)
スポット8:デスミン(フラグメント)(Desmin (Fragment))(UniProtのタンパク質アクセッション番号Q8UWF1、DNAアクセッション番号CAC83053.1)(アミノ酸配列:配列番号56、それをコードする塩基配列:配列番号55)
スポット9:キャッピングプロテイン(アクチンフィラメント)マッスルZ-ラインベータ(Capping protein (Actin filament) muscle Z-line beta)(UniProtのタンパク質アクセッション番号B5DFX6、DNAアクセッション番号ACH70650.1)(アミノ酸配列:配列番号61、それをコードする塩基配列:配列番号60)
サケ以外のアジ、アナゴ、クロダイ、サバ、タイ、タラ、ハマチ、ウナギ、およびヒラメの9種の魚の身を用い、実施例1および実施例2に記載した手順と同様の手順により、抗原の確認を行った。
アジ:スポット1、3~5、8、および9
アナゴ:スポット1、3、5、および9
クロダイ:スポット1~6、8、および9
サバ:スポット1、3、5、8、および9
タイ:スポット1、3~6、8、および9
タラ:スポット1、3、5、7~9
ハマチ:スポット1、3~5、8、9
ウナギ:スポット1、3、4、6、9
ヒラメ:スポット1、4、6
実施例2と同様に、魚アレルギー患者の血清を用いたイムノブロットを、対照である非魚アレルギー被験者の血清を用いたイムノブロットと比較した。サケの身に含まれるタンパク質について魚アレルギー患者2の血清を用いて行ったイムノブロット(図1B左図)において、実施例2で検出された9つのスポットのうちの7つ(スポット1~6、9)のほか、非魚アレルギー被験者の血清を用いた場合(図3)とは異なり、かつ公知のサケアレルゲンタンパク質とは異なる3つのスポット(スポット11、12、14)が新たに検出された。検出された合計10のスポットをイムノブロット上に示す(図1B左図)。
スポット11:分子量90~110、pI6.5~7.0
スポット12:分子量120~140、pI5.0~6.0
スポット14:分子量30~40、pI6.5~7.5
実施例3と同様に、新たに検出された上記の3つのスポットを生じる抗原について、質量分析によるアミノ酸配列の同定を行った。
スポット11:配列番号111~119で示されるアミノ酸配列
スポット12:配列番号122~136で示されるアミノ酸配列
スポット14:配列番号145~149で示されるアミノ酸配列
スポット11:グリコーゲンホスホリラーゼ,マッスルフォーム-ライク(glycogen phosphorylase, muscle form-like)(NCBIのタンパク質アクセッション番号XP_013984904.1、DNAアクセッション番号XM_014129429.1)(アミノ酸配列:配列番号110、それをコードする塩基配列:配列番号109)
スポット12:ミオシン-バインディングプロテインC,ファスト-タイプ-ライク(myosin-binding protein C, fast-type-like)(NCBIのタンパク質アクセッション番号XP_014014310.1、DNAアクセッション番号XM_014158835.1)(アミノ酸配列:配列番号121、それをコードする塩基配列:配列番号120)
スポット14:L-ラクテートデヒドロゲナーゼAチェイン-ライク(L-lactate dehydrogenase A chain-like)(NCBIのタンパク質アクセッション番号XP_014003141.1、DNAアクセッション番号XM_014147666.1)(アミノ酸配列:配列番号144、それをコードする塩基配列:配列番号143)
実施例2と同様に、魚アレルギー患者の血清を用いたイムノブロットを、対照である非魚アレルギー被験者の血清を用いたイムノブロットと比較した。サケの身に含まれるタンパク質について魚アレルギー患者3の血清を用いて行ったイムノブロット(図1B右図)において、実施例2で検出された9つのスポットのうちの2つ(スポット7、8)のほか、非魚アレルギー被験者の血清を用いた場合(図3)とは異なり、かつ公知のサケアレルゲンタンパク質とは異なる2つのスポット(スポット10、13)が新たに検出された。検出された合計4つのスポットをイムノブロット上に示す(図1B右図)。
スポット10:分子量200~230、pI4.5~5.5
スポット13:分子量45~55、pI4.0~5.5
実施例3と同様に、新たに検出された上記の2つのスポットを生じる抗原について、質量分析によるアミノ酸配列の同定を行った。
スポット10:配列番号71~108で示されるアミノ酸配列
スポット13:配列番号139~142で示されるアミノ酸配列
さらに、各スポットについて、質量分析計から得られた質量データをNCBIで解析したところ、それぞれのスポットは以下のタンパク質であることが同定された。
スポット10:ミオシンヘビーチェイン,ファストスケレタルマッスル-ライク(myosin heavy chain, fast skeletal muscle-like)(NCBIのタンパク質アクセッション番号XP_014039990.1、DNAアクセッション番号XM_014184515.1)(アミノ酸配列:配列番号70、それをコードする塩基配列:配列番号69)
スポット13:ATPシンターゼサブユニットβ,ミトコンドリアル(ATP synthase subunit beta, mitochondrial)(NCBIのタンパク質アクセッション番号XP_014007238.1、DNAアクセッション番号XM_014151763.1)(アミノ酸配列:配列番号138、それをコードする塩基配列:配列番号137)
アジ、アナゴ、サケ、サバ、タイ、およびタラの6種の魚の身を用いて、実施例4と同様に、抗原の確認を行った。魚アレルギー患者4の血清を用いたイムノブロットを、対照である非魚アレルギー被験者の血清を用いたイムノブロットと比較した。6種の魚の身それぞれに含まれるタンパク質について魚アレルギー患者4の血清を用いて行ったイムノブロット(図4)において、非魚アレルギー被験者の血清を用いた場合(図3)とは異なり、サケにおいて魚アレルギー患者1~3の血清で得られた合計14のスポットの一部に相当するスポットが検出された。
アジ:スポット1、3、4、8、10、11、および14
アナゴ:スポット1、4、10、および11
サケ:スポット2、8、および10~14
サバ:スポット4、8、10、11、13、および14
タイ:スポット1、4、6、8、10、および13
タラ:スポット1、5、8、10、11、および13
Claims (8)
- 魚アレルギーの診断キットであって、以下(2)、(7)、(10)、および(12)のタンパク質の少なくとも一つ:
(2)(2A)EEF1A2バインディングプロテイン-ライク(EEF1A2 binding protein-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(2A-a)~(2A-e)のいずれかのタンパク質:
(2A-a)配列番号5において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2A-b)配列番号5で示されるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2A-c)配列番号4において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2A-d)配列番号4で示される塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(2A-e)配列番号4で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(2B)配列番号5~8からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(7)(7A)ミオシンバインディングプロテインH-ライク(Myosin binding protein H-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(7A-a)~(7A-e)のいずれかのタンパク質:
(7A-a)配列番号43において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7A-b)配列番号43で示されるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7A-c)配列番号42において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7A-d)配列番号42で示される塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(7A-e)配列番号42で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(7B)配列番号43~54からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(10)(10A)ミオシンヘビーチェイン,ファストスケレタルマッスル-ライク(myosin heavy chain, fast skeletal muscle-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(10A-a)~(10A-e)のいずれかのタンパク質:
(10A-a)配列番号70において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10A-b)配列番号70で示されるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10A-c)配列番号69において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10A-d)配列番号69で示される塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(10A-e)配列番号69で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(10B)配列番号70~108からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
(12)(12A)ミオシン-バインディングプロテインC,ファスト-タイプ-ライク(myosin-binding protein C, fast-type-like)またはその変異体であって、魚に対するアレルギーの抗原である、以下の(12A-a)~(12A-e)のいずれかのタンパク質:
(12A-a)配列番号121において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12A-b)配列番号121で示されるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12A-c)配列番号120において1または数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(12A-d)配列番号120で示される塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;もしくは
(12A-e)配列番号120で示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(12B)配列番号121~136からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むタンパク質;
を抗原として含む、前記診断キット。 - 魚アレルギーの診断用組成物であって、請求項1において(2)、(7)、(10)、および(12)として特定されるタンパク質の少なくとも一つを抗原として含む、前記診断用組成物。
- 対象の魚アレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程:
(i)対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はIgE抗体が含まれる溶液である;
(ii)対象から得られた試料中のIgE抗体と当該抗原との結合を検出する;
(iii)対象のIgE抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象が魚アレルギーであることの指標が提供される;
を含み、ここで当該抗原は、請求項1において(2)、(7)、(10)、および(12)として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法。 - 抗原が除去または低減されていることを特徴とする魚加工品であって、当該抗原は請求項1において(2)、(7)、(10)、および(12)として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記魚加工品。
- 請求項1において(2)、(7)、(10)、および(12)として特定されるタンパク質の少なくとも一つと結合する抗体を含むことを特徴とする、対象物における魚抗原の有無を判定するためのテスター。
- 配列番号4、42、69、または120で示される塩基配列の少なくとも1つの一部と相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする、対象物における魚に対するアレルギーの原因となる抗原の有無を判定するためのテスター。
- 魚由来の抗原であって、請求項1において(2)、(7)、(10)、および(12)として特定されるタンパク質の少なくとも一つであり、そして魚に対するアレルギーの原因となる、前記抗原。
- 請求項7の抗原を含む組成物。
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