TWI250164B - Highly purified cytokine activating factor and methods of use - Google Patents

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1250164 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（） 與相關申請之交互參照 依據35 U.S.C § 119(e)，自美國臨時申請序號 60/145,317，申請日 1999 年 7 月 23 日，標題「Highly Purified Cytokine Activating Factor and Methods of Use」， 及自美國臨時申請序號60/197,619，申請日2000年4月1 4 日’標題「Highly Purified Cytokine Activating Factor and Methods of Use」，本申請要求優先權之利益。美國臨時申 請序號60/145,3 17與60/197,619已合併於此以爲參照，並視 其爲本揭露之，^部。 發明背景 生物性因子，如輔酶、輔因子、維生素及其他，在生物 性轉換過程中扮演重要角色。它們通常只占整個細胞中之 小量（1 X 1 0 5 _ 1 X 1 〇 6 )。而由正常細胞將此生物性因子 分離與純化是困難的工作。 南免疫卵已被開發並顯示能過度生產抗體及一定的生物 性因子。因爲高免疫作用之產生係藉由將多價細菌抗原注 射至靶動物，自這些經高免疫的動物之卵中所發現生物性 因子之量，無法再增加其強度等級。因此，高免疫卵中生 物性因子之小量，使生物性因子難於純化，並且就其而 言，需要有一有效過程以分離、純化或者生產此種生物性 因子。 正常的免疫系統係處於平衡下，其中原炎性及抗炎性細 胞與分子被精細地調控，而促進正常宿主免疫防衛但不破 壞宿主組織。-互此種精細調控平衡受擾，非特異性刺激 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------· -4- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 -----B7___ 五、發明說明（2 ) 作用及活化作用，將導致所生產與釋放的潛在破壞性免疫 性與炎性分子之量的增加。如此，原炎性細胞激素之過量 生產或在錯誤的生物條件下細胞激素之生產，係有關多種 疾病之死亡率與病狀，尤其如瘧疾、敗血病、類風濕性關 節炎、腸炎症、癌症及AIDS。 細胞激素爲多能胜肽，其藉由與特異性細胞受體結合而 以自分泌/周分泌方式作用。其分泌在決定免疫反應之持續 期間及強度上是很重要的。舉例言之，在小鼠，不同的 C D 4 + T幫助者（T h )選殖系之次套组，所分泌者係古典上 稱爲Thl與Th2細胞激素。Thl細胞生產介白素_2(il-2) 與干擾素r (IFN_ r )並促進細胞性免疫反應。Th2細胞生 產IL-4、IL-5、IL-6及IL-10並支持免疫球蛋白分泌細胞 之活化作用。在發炎過程中，細胞激素如IL-1々、il_6& 腫瘤壞死因子從（TNF _從）在發炎部位被釋出。這些細胞 激素具有多效作用並介導與發炎關連的廣泛症狀。 一種關鍵細胞激素，TNF -泛，亦稱作惡病質，爲i 7千遒 耳呑之蛋白質，其係由157胺基酸組成，主要由單核球生 產，並能活化巨噬細胞。TNF -從顯出具有弑瘤活性及多數 主要器官系統之多種生理作用。在中樞神經系統，TNF_從 涉及發燒、厭食及改變腦下垂體荷爾蒙釋放。在心臟血管 系統，TNF-泛參與休克、急性呼吸困難及微血管漏損症 (原凝血作用）。TNF - α有助於腎臟之急性腎小管壞死與腎 炎和胃腸系統之局部缺血、結腸炎及肝壞死。其亦爲涉及 發炎過程之關鍵細胞激素。 — 7 --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5-

1250164 A7 B7 五、發明說明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 鳥綱之多屬，如難（gallus domesticus)、火難、及鴨，能 在血及卵中生產抗體對抗造成鳥類疾病之免疫原，及對抗 其他免疫原。舉例言之，LeBacq-Verheyden et al. (Immunology 27 : 683 (974))及 Leslie，G.A.，et al. (J. Med· 130 : 1337 (1969))，曾定量分析了難的免疫球蛋白。 Poison et al. (Immunological Communications 9 : 495-514 (1980 ))將母難免疫後對抗數種蛋白質及蛋白質之天然混合 物，並在其卵黃中測得IgY抗體。Fertel et al· (Biochemical and Biophysical Research Communications 102 ： 1028 ： 1033 (198 1))將母雞免疫後對抗前列腺素並在其卵黃中測得抗 體。Jensenius et al.( Journal of Immunological Methods 46 : 63-68 (1981 ))提供一用於免疫診斷學上分離卵黃IgG之方 法。Poison et al.(Immunological Communications 9 : 475· 493 (1980))描述自受多種植物病毒免疫之母雞卵黃中分離 抗體。 美國專利號4,357,272揭露由衍自高免疫母難之卵黃中分 離抗體。抗體反應係藉重複注射衍自植物病毒、人類 IgG、破傷風抗毒素、蛇抗毒素、及Serameba而謗發。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 美國專利號4,550,019揭露自母難之卵黃中分離謗發的抗 體，其係藉由具最少30,000之分子或粒子重量的免疫原之 高免疫作用。用於將難高免疫之免疫原係由植物病毒、人 類免疫球蛋白、破傷風毒素、及蛇毒液之中選出。 美國專利號4,748,018揭露哺乳類被動免疫之方法，其包 括注射投給取自鳥類卵中之純化抗體，該鳥類經過對抗對 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐1 1250164

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 應抗原免疫，而其中哺廟# M ^ 得對該_之免疫力。 美國專利號5J72,999，p諠、、| 由對 a Μ I 4；w/v、 痕，度—DCV-Bi〇l〇gics，揭露藉 田對爻忒者投給高免疫的卵 省十故w <、 Γ和/或礼或其分量，而預防、抵 ^肖或降低受試者之慢性冒 - fNSAm^i# a ㈢％失凋或非類固醇抗炎藥謗導的 (NSAID謗導的）胃腸傷害。 發明概要 本發明係基於本發明者 > 恭 耆 < 發現，在卵中，特別在取自高 免疫動物之卵中，有转昱,地s、产 八免疫_控活性，當其投給受試 動物，特別是哺乳類時，在哕a 了 杜邊又武動物中會活化細胞激素 生產作用。 更特別。I，本發明係針對可取自鳥類之即之高純度細 胞激素活化因子^胞激素活化因予可的黃或㈣兩者 所分離之分量高度純化。細胞激素活化因子亦可用重組方 式或化學合成而生產。 本發月之具體實施例係關於分離的細胞激素活化因子 (CAF)蛋白。此蛋白包含選自以下所組之群的胺基酸序 列：（a)選自SEQIDNO: 1與SEQIDN(): 6之群的胺基酸 序列；及，（b)含有（a)之胺基酸序列之任一最少9連續的 胺基酸殘基之胺基酸序列。本發明之分離的CAF蛋白能上 調控腫瘤壞死因子a(TNFi〇、介白素 介白素- 6(IL_6)之表達，且/或下調控轉型生長因子^ (TGF y5 )之表達。較佳具體實施例中，本發明之分離的蛋 白，係包含具（a)之胺基酸序列之任一最少約15連續的胺 基酸殘基之胺基酸序列，且更佳者爲（a)之胺基酸序列之任 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — -LI-----------------訂---------^vw. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（ 一最少約20連續的胺基酸殘基、且甚而更佳者爲最少約25 連續的胺基酸殘基。另一具體實施例中，本發明之分離的 蛋白，係包含具SEQ ID NO : 6之至少約5 〇連續的胺基酸殘 基之胺基酸序列。 本發明之一具體實施例中，本發明之分離的蛋白所含之 胺基酸序列，其在（a)之胺基酸序列之至少15胺基酸上， 與（a)之胺基酸序列至少約65 %相同。較佳者爲，該蛋白所 含之胺基酸序列’其在（a)之胺基酸序列之至少15胺基酸 上，與（a)之胺基酸序列至少約75 %相同。另一具體實施例 中，該蛋白所含之胺基酸序列，其在SEq ID N〇 : 6之胺基 酸序列之66胺基酸上，與SEQ ID NO : 6至少約6 0 %相 同。尚有一具體實施例，編碼該蛋白之核酸序列，與編碼 選自SEQ ID NO : 1與SEQ ID NO : 6之群的胺基酸序列之 核酸序列’能在高緊迫條件下雜交。最佳具體實施例中， 本發明之分離的CAF蛋白，包含選自seQIDNO: 1與SEQ ID NO : 6所構成之群的胺基酸序列，且其最佳者爲seq id NO : 6 0 一具體實施例中，本發明之分離的CAF蛋白具有一種或 多種以下生化特徵：（a)具至少一種生物活性次單元，其能 通過3000MW切除過濾器；（b)溫度增爲至少約50X：仍安 定；（OpH自約2至約1〇仍安定；（d)爲水溶性；（e)爲非 類固醇；（f)帶負電；（g)爲實質上非極性；和/或，（11)具 約254愛微米之a max。本發明之分離的蛋白當口服投給時 有生物活性。本發明之分離的蛋白在鳥類卵之卵白或卵黃 本紙張尺錢时關家標準（CNS)A4規 —•L------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -8 - 1250164

五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 兩者中自然存在。如以上所入 白，ΐ "寸娜，本發明之分離的CAF蛋 -較佳者能上調控腫瘤壞死因子,（TNFi〇、介白素. 々（IL-ip)和/或介白素- 6(il_ Φ , n X表達。一具體實施例 中’本發明之分離的Caf蛋白，能下咱

⑽…之表達。 蛋白…控轉型生長因D 本發明之一具體實施例，係關於分離的抗 明之分離的CAF蛋白選擇地結合。 /…、本發 本發明還有一具體實施例係關於組成物。此組成物包括 樂學可接受的載劑及如上所述之本發明之細胞激素活化因 子（CAF)蛋白。-具體實施例中，藥學可接受的載劑爲選 自以下所組之群的食品：（a)其選爲富含CAF蛋白之高免疫 卵；和，（b)以高免疫卵製品之最少分量所生產之食品，"其 :分量與高免疫卵製品相較含有多量之CAF蛋白。合適^ 咼免疫卵 <分量包括，但不限於：液狀卵黃、液狀卵白、 粉狀卵黃、粉狀卵白、及高免疫卵製品之水溶性分量。 一具體實施例中，本發明之組成物的劑型係選自液體、 氣溶膠、膠囊、錠劑、丸劑、散劑、凝膠及細粒之群。另 一具體實施例中，藥學可接受的載體包含控制釋放配方。 尚有一具體實施例，該藥學可接受的載體係選自以下所組 之群：水、磷酸緩衝鹽水、Ringer氏溶液、右旋醣溶液、 血清包含溶液、Hank氏溶液、其他水性生理平衡溶液、 油、酯、乙二醇、生物相容的聚合物、聚合性基質、膠 囊、微膠囊、微粒子、大量製劑、滲透，筒、擴散器材、 脂體、脂球、細胞、及細胞膜。 -9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ^ --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 五、發明說明（7 ) 本發明尚有一具體實施例係關於調控動物中免疫反應之 方法。此方法包括將含有先前提出的本發明之細胞激素活 化因子（CAF)蛋白之組成物，投給動物之步驟。較佳者爲 該組成物包括藥學可接受的載劑。就一方面而言，該組成 物I投給劑量爲每公斤體重動物自約i亳微克至約4〇〇毫克 的CAF蛋白。較佳的投藥途徑包括，但不限於：口服、靜 脈給藥、腹膜給藥、肌肉給藥、皮下給藥、經皮傳遞、氣 管給藥、吸入方式、由導尿管灌注、栓劑投給、及直接注 射至組織。一具體實施例中，該組成物包含含有Caf蛋白 之食品。較佳的具體實施例中，該動物爲哺乳類。 較佳者其该組成物之投給能藉動物細胞上調控腫瘤壞死 因子從（TNF從）、介白素和/或介白素 6)怎表達。就一方面而言，該組成物之投給能藉動物細胞 下調控轉型生長因子A (TGFy5 )之表達。 本發明之另一具體實施例係關於治療動物癌症之方法。 此方法包括將含有先前提出的本發明之細胞激素活化因子 (CAF)蛋白之組成物，投給具有爲發展癌症風險之動物之 步驟。較佳者之該組成物之投給劑量爲每公斤體重動物自 約1毫微克至約400毫克的CAF蛋白。較佳的投藥途徑包 括，但不限於：口服、靜脈給藥、腹膜給藥、肌肉給藥、 皮下給藥、經皮傳遞、氣管給藥、吸入方式、由導尿管灌 注、栓劑投給、及直接注射至癌病組織或其鄰近部位。一 具體實施例中，該組成物包含含有CAF蛋白之食品。 較佳者之該組成物之投給產生選自以下所組之群的結 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨； ‘ --------訂---------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 五、發明說明（8 ) =癌病症狀〈減輕、與癌病關連腫瘤之減小、與癌病關 、、腫瘤之減除、轉移性癌症之預防、癌症之預防及對抗癌 症之致效細胞免疫性之刺激。 本發明尚有一具體實施例係關於分離的核酸分子。此核 酸分子所含核酸序列係選自以下之組：⑷編碼某蛋白之核 鉍，琢蛋白含有選自以下所構成之群的胺基酸序列：⑴選 自SEQIDN0: i.sEQDNo · 6所構成之群的胺基酸序 列^及，（11)含有（i)之胺基酸序列之任一最少9連續的胺 基酸殘基之胺基酸序列；及，（1})與〇)之核酸序列完全互 補的核酸序列。較佳地，由（a)之核酸序列所編碼之蛋白能 上調控腫瘤壞死因子從（TNFi〇、介白素 或介白素-6(IL-6)之表達。較佳具體實施例中，核酸分子 所含核酸序列，其編碼之胺基酸序列係選自SEQ ID n〇 : i 與 SEQ ID NO : 6 之群。 本發明之一具體實施例係關於重組核酸分子，其含有先 前提出的本發明之分離的核酸分子。本發明尚有一具體實 施例係關於重組細胞，其含有先前提出的本發明之分離的 核酸分子，其中該細胞表達該核酸分子。本發明尚有一具 體實施例係關於先前提出的本發明之分離的核酸分子。 圖式簡述 圖1爲數位化圖像顯示玻器内分析中3,〇〇〇遒耳呑分子量 通透物對細胞激素謗導作用之效果。 圖2爲數位化圖像顯示玻器内分析中3,000遒耳吞分子量 通透物對TNF α謗導作用之效果。 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） iiaf (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（9 ) 圖3爲PL- 100 3,000道耳吞分子量通透物之HPLC色譜。 圖4爲數位化圖像顯示3,000道耳吞分子量通透物之Q Sepharose分量對THP · 1細胞中TNF π謗導作用之效果。 圖5爲Q Sepharose管柱上CAF活性分量之HPLC色譜。 圖6爲得自Q Sepharose管柱之CAF 1活性分量之固相萃取 色譜。 圖7爲數位化圖像顯示玻器内分析中固相萃取分量對TNF 從謗導作用之效果0 圖8爲固相萃取之CAF活性分量之HPLC色譜。 圖9爲數位化圖像顯示玻器内分析中分部萃取分量對TNF 從謗導作用之效果0 圖10爲得自分部萃取之水溶性分量之HPLC色譜。 圖11爲水溶性分量之C18HPLC分離作用之HPLC色譜。 圖12爲純化的CAF之之HPLC色譜。 圖13爲數位化圖像顯示玻器内分析中CAF對IL-1卢謗導 作用之效果。 圖1 4爲顯示CAF紅外光譜之色譜。 圖1 5顯示SPE-GFII序列與難卵黃生成素11前驅物之校準 與定位。 圖1 6爲描繪闡釋CAF純化步驟之圖式。 圖1 7爲數位化圖像顯示以不同卵分量處理之THP - 1細胞 中細胞激素RNA水平。 圖18爲數位化圖像顯示藉卵之3000道耳吞通透物分量之 TNF以活化作用之動力學。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 10 五、發明說明（ 圖1 9爲數位化圖像顯示由CAF b之三種細胞激素之謗導 作用。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 圖2 0爲數位化圖像顯示由CAF b之轉型生長因子点之抑 制作用。 發明詳述 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明大體上係關於新穎細胞激素活化因子（、含 有細胞激素活化因子（CAF )之組成物、及使用該組成物以 調節免疫系統之方法。本發明之組成物可包括含有重組方 式生產的CAF、合成方式（即，化學）生產的CAF、或純化 的C AF之組成物，且/或本發明之組成物可爲含有c AF之天 然食品，且較佳地，包括富含CAF存在之天然食品或其分 量，如富含的分量之選擇過程或生產。此天然食品包括高 免疫卵製品，該卵製品包括富含CAF之高免疫卵製品之分 量。本發明人發現了此新穎蛋白，CAF，能上調控腫瘤壞 死因子a(TNFa)、介白素-6(IL-6)和介白素-ly5(IL-l 卢）之表達，並能下調控轉型生長因子卢（TGF )之表達。 因此，本發明之CAF蛋白可用以通盤地調節（即，調控）免 疫系統，所藉者爲調節此等細胞激素之表達及生產或受這 些細胞激素影響之細胞。此外，因TNF從、IL_1卢與IL_6 典型地被認爲是原炎性細胞激素，且因tgf々典型地被認 爲是抗炎性細胞激素’故本發明之CAF蛋白有助於治療免 疫反應與細胞之刺激之狀況，其所欲者爲對原炎性細胞激 素之反應’包括但不限於，細菌感染、敗血病及癌症。 本發明之CAF最初由本發明人發現爲高免疫卵製品中所 -13- 本紙張尺度過用ΐ國國豕ί示罕（CNS)A4規格（21〇 X 297公董） 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 11 五、發明說明（） 產之組份。將較佳的免疫原混合物投給，較佳地以注射方 式，至產卵動物以謗導免疫反應並生產高免疫卵製品，該 製品含有本發明之細胞激素活化因子，但不須含有特異性 免疫原，該免疫原已知能藉活化特殊細胞激素、或藉謗導 能謗導特殊細胞激素之因子的生產，而調節免疫系統。因 此’吾人意外地在高免疫卵製品中找到此種細胞激素活化 因子，製品係得自經免疫對抗混合的抗原疫苗之動物，該 疫苗當投給受試者時被預期能對有效調節免疫系統。再 者，本發明之前，未知產卵動物之高免疫作用能造成本發 明之新穎細胞激素活化因子之生產，其具有能夠調控動物 中細胞激素生產及免疫系統細胞分化之性質。以本發明人 所知，本發明之前，此處所述細胞激素活化因子未曾被鑑 另ιΐ、純化、描緣特徵、或定序。 本發明之細胞激素活化因子可由卵分離並純化，所用者 爲超過濾法、Q Sepharose離子交換色譜法、固相萃取法、 分部萃取法及逆相C i s HPLC技術（見實例1)。分析性 HPLC、玻器内細胞激素表達研究、及生物試驗數據均證明 了生物活性細胞激素活化因子之純化作用。再者，一如所 述，使用此中提供的序列資訊，可將細胞激素活化因子分 離、選殖、重组地生產、或合成地生產。 定義 除非另有指述，以下定義適用整份申請文件： 「高免疫作用」一詞係指暴露於一種或多種免疫原（例， 抗原），如此引發的免疫反應在自然未暴露狀態仍能保持。 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公f )

If (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂------,—— 1250164 A7

五、發明說明（12 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 免疫原」一詞係指某物質，其能謗導體液性抗體和/或 細胞介導的免疫反應而非免疫耐受性。該詞意指，刺激免 疫反應及與其產物，如抗體，反應之能力。 「組合何生的免疫原」一詞指涉藉組合合成方式，在免 疫原中生成分子多樣性之過程。 「生物工程的免疫原」一詞指涉某免疫原，其係得自基 因選殖技術和基因操控或化學合成之過程。 「基因疫苗」一詞指涉某核酸疫苗，其一般藉重組技術 生產’且其能謗發免疫反應。 、「卵」或「卵製品」等詞各指任一完整之卵（桌，高免疫 或其他）或自其衍生之任一產物或分量。 「桌卵」<「桌卵製品」等詞各指完整之卵，或自其衍 生（任一產物或分量，該卵係得自不爲高免疫狀態之產卵 動物。 「问免疫卵」或「南免疫卵製品」等詞各指完整之卵， 或自其何生心任一產物或分量，該卵係得自處於高免疫狀 態之產卵動物。 「超^水平」一詞係指，水平超過不爲高免疫狀態之產 卵動物之卵中所發現者。 「免疫凋控卵」一詞係指，含有此中揭露的細胞激素活 化因子之卵或卵分量。 「免疫反應」一詞一般指涉細胞介導的或細胞性免疫反 應（即，由包括T淋巴球、B淋巴球和巨噬細胞之免疫系統 的細胞所介導的免疫反應）與/或體液性免疫反應（即，由抗 •15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) !,!!%------ —訂--------- 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 131250164 A7 B7 五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 體介導的免疫反應）。 「動物」-詞指涉動物界之任一㈣。依據本發明 疫之較佳動物包括任何脊椎動物之鳥綱，其包括但不限 於，雞、火雞、和鴨。依據本發明而治療之較佳動物包括 任何脊椎動物之鳥綱與哺乳綱，其包括但不限於，靈長 類、齧齒類、家冨和馴養的寵物。家畜包括被 有用產物的哺乳類（例’綿羊能生產羊毛）。預防疾=或症 狀之較佳動物包括人、犬、貓、小鼠、大鼠、綿羊、牛、 馬和豬，人類爲其特別佳者。 「靶動物」一詞指涉某動物其功能如產卵動物。 「受試動物」一詞指涉被投給本發明含CAF之組成物 動物，該組成物包含純化的CAF、合成地生產的CAF、 組地生產的CAF、或由靶動物所產之CAF富含的卵或卵 品。受試動物亦可參照如患者。 「細胞激素活化因子」或「CAF」等辭一般用於指涉 發明之因子在任一純度階段（例，包括爲卵之組份、爲半〜 化的蛋白、爲高度純化的蛋白、爲重組蛋白或爲化學合成 蛋白）並具對細胞激素活化因子此中所述的生化、物理、 構和/或功能特徵（例，生物活性）。應注意者爲如本發明 高純度C AF亦可參照如Γ c AF b」（見實例1 )。 「高純度細胞激素活化因子」或Γ高純度CAF」一詞 指至少爲實例1中對CAF b所述純度之細胞激素活化因子 「細胞激素活化因子富含的」或Γ CAF富含的」之產 或組成物一同指涉某產物或組成物，相較於未經純化、 的 重 製 本 純 結 之 物 處 丨丨*------------------訂-----.— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 五、發明說明（14 ) 理與/或生產步驟之產物或組成物中之細胞激素活化因子的 水平，其係經純化、處理與/或生產而在富含的、或最終產 物中’含有較大的細胞激素活化因子之水平。因此，一具 姐實施例中，CAF存於初始產物或組成物中，相對於該產 物或組成物中其他組份，純化、處理與/或生產之步驟會增 加CAF之量，典型上係由初始產物減除或減少某些組份之 里。另一具體實施例中，初始產物並不含有Caf或含有 C AF <初始量，而C AF富含的產物或組成物係藉添加純化 的、重組的、合成地生產的CAF至初始產物或組成物而製 成。此種CAF富含的組成物將詳細討論於後。組成物或產 物對CAF之增冨方法對嫻熟其藝者將爲明顯易見的。 關於化合物（例，本發明之蛋白或核酸分子）之「分離 的」一詞，指涉將化合物自其天然周圍環境移出（即，受人 類操控）。如此，「分離的」並不反映至該化合物被純化的 範園。 「蛋白」一詞可與Γ多肽」一詞交換使用，雖然後者用 詞係典型用以指涉具實質上線性二級結構之相對小的蛋 白。「蛋白」或「多肽」一詞包括全長蛋白、融合蛋白， 或此蛋白之任一同源物。 「CAF蛋白之同源物」（即，「CAF同源物」詞組包括 CAF蛋白，其中至少一個或數個，但不限於一個或數個， 胺基酸係被删除（例，蛋白之截短變體，像是胜肽或分 量）、插入、倒轉、取代與/或衍生（例，藉由糖醯化作用、 磷醯化作用、乙醯化作用、肉豆蔻醯化作用、苯基化作 17- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐 事 頁 訂 f 1250164 A7 B7 五、發明說明（15 ) 用、軟脂酯化作用、醯胺化作用及/或糖醯磷脂肌醇之加成 作用）。較佳地，CAF同源物具CAF生物活性。 與本發明之CAF蛋白參照的「生物上活動的」或「生物 活性」詞組，係指涉CAF蛋白之任何功能性活性，且典型 地’為自然發生CAF蛋白之功能活性。特別言之，參照 CAF蛋白之生物活性，較佳的指涉為CAF蛋白之能力，具 犯上凋控（着導、刺激、增強、增加）細胞激素之表達，該 細胞激素包括腫瘤壞死因子α (TNF α )、介白素“冷（IL - j 冷）和/或介白素-6 (I L - 6 )。應注意者為如此中詳述之自然 發生CAF蛋白可上調控TNFa、11_1/5與11_6中任一者之 表達。CAF生物活性亦可包括下調控（抑制、減少、壓制） 轉型生長因子沒（TGF沒）表達之能力。CAF蛋白之生物活 性亦包括，但不限於，使CAF結合至受體或至另一蛋白、 DNA、碳水化合物份额或脂質份额之能力，其導致或促成 以上所鑑別的一種生物活性。 蛋白質之”生物活性次單位”係具有生物活性全長蛋白質 或多體蛋白質之部份（即片段、功能部位或單體）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 「擬似物」一同用於指涉任一胜肽或非胜肽化合物，其 能模擬自然發生胜肽之生物活性，通常因為該擬似物所^ 基本結構能模仿自然發生胜肽之基本結構和/或具有該自然 發生胜肽之明顯生物屬性。擬似物可包括，但不限於：具 原型之實質修飾的胜肽，像是與自然發生胜肤之無侧鍵相 似性（例如此修飾作用能使其易受降解）；抗個體型與/或催 化性抗體、或其分量；分離之蛋白的非蛋白性部分（例，铲 水化合物結構）；4合成或天然有機分τ，例如，包括核^ 及經組合化學鑑別之藥物。 -18 !25〇164

五、發明說明（ 16 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 有關本發明之蛋白之「安定的」 隊絲从m 士 a匕丄 货' 知涉蛋白抵抗 :而降解之成因爲溫度之增減、PH之增 減孤/辰度 <増減、氧化作用與/或還原作用、去 :、及/或抵抗其他形式之化學降解作用與蛋白二= =。更特定言之，決定某蛋白是否安定，係在給定修件 下ί、測錢白生物活性之任-可測量的水平，較佳者 測孩蛋白影響細胞TNF汉、IL- 1々邊TT a、 ^ 、 A 1JL - 6之任一可測量的 増加之能力。較佳地，被認爲安定的 於：定 條件後仍保持其生物活性至少10%纟“巧泰路於，-疋 a甘^ v 〇/°者，相較於暴露該條件 則八生物活性（例，正常條件下之其生物活性），更佳地 至少25%者，甚而更佳地爲至少5G%者。某蛋白之安定性 =涉蛋白具上述的技之能力’不論在儲存期間或使用 期間。 「核酸分子」詞组基本上指涉實體核酸分子且「核酸序 列」詞組基本上指涉該核酸分子上核答酸之序列。狹而， 此二詞組可交換地使用，特別在核酸分子或核酸序列能編 碼蛋白時。 /重组分子」或「重组核酸分子」$組基本上指涉某核 酸分子運作性連接至轉錄控制序列。 「運作性連接」@組指涉爲將核酸分子連接至轉錄控制 序列，此法使該分子在轉染（即，轉型、轉導、轉染、共 轆、共導）入宿主細胞時能被表達。 「轉綠控制序列」詞組指涉控制轉綠作用之起始、延 長、與終止之任一序列。特別重要的轉綠控制序列爲其能 丨； . --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -19 1250164

發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 控制轉錄起始作用者，如啟 7、 4心動子、增強子、操作子及墨抑 子序列。 轉染作用」@用於指涉能將外生性核酸分 重 組核酸分子）插入細胞之任-方法。「轉型作用」-詞可與 轉染作用」4父換使用，當此詞用於指涉爲核酸分子 至微生物細胞之人壤你K! 等作用，而微生物如細菌與酵母菌。徽 生物系統中，「轉型作用」—詞用於描述由微^ = ^ 生性核酸所致之遺傳的改變，且基本上與「轉染作用」一 詞同義。然而，動物細胞中，轉型作用已獲得第二意義， 其可指涉爲，例如培養中細胞成爲癌性後之生長性質之改 變。因此，爲避免混淆，「轉染作用」一詞，較佳地用於 有關至動物細胞之外生性核酸之入導作用，而「轉型作 用」一詞於此用以普遍地包含動物細胞之轉染作用與微生 物細胞之轉型作用兩者，該詞之範圍係關於至細胞之外生 性核酸之入導作用。因此，轉染技術包括，但不限於，轉 型作用、電孔法、微注射法、脂染法、吸收作用、感染作 用及原形融合法。 有關此中所述的核酸或胺基酸序列之「連貫的」或「連 續的」一詞，可交換使用並指涉其在未斷損序列中之連接 狀態。舉例言之，含有第二序列之3 〇連貫的（或連續的）胺 基酸之第一序列，係指第一序列包括未斷損的3 〇胺基酸之 序列，其相同於第二序列中3 0胺基酸之序列。類似地，具 與第二序列Γ 100 %相同性」之第一序列，係指第一序列確 切地與第二序列配對而在核甞酸或胺基酸間無空隙。 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） i . ------------1—- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 Δ7 Α7 Β7 18 五、發明說明（） 關於百分比（％)相同性，除非另有指述，係指涉二個或 多個胺基酸或核酸序列間同源係之評價，其執行係使用： (l)BLAST 2.0 基 本 BLAST 同 源 性 檢 索 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST、，以標準預設參數使 用blastp於胺基酸檢索及blastn於核酸檢索，其中查詢序列 按預設係經低複雜性區域之過濾（述於Altschul, S.F·， Madden，T.L·，Schaaffer，A.A.，Zhang，J·，Zhang，Z·，Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST ： a new generation of protein database search programs. "Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402，此中併入完 整文件作爲參照）；（2) BLAST 2校準（使用以下所述參數） (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST )；或（3 ) BLAST 2.0 與 BLAST 2兩者。應注意的是，由於BLAST 2.0基本BLAST與 BLAST 2間之標準參數具些許差異，二特異序列使用 BLAST 2程式會識另丨J爲具顯著同源性，而在BLAST 2.0基本 BLAST中使用該序列之一爲查詢序列所執行之檢索，不會 將第二序列鍵別爲最相配者。二特異序列可使用BLAST序 列與彼此較準，如述於Tatusova and Madden, (1999)，"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett. 174 : 247-250，此中併入 完整文件作爲參照。BLAST 2序列校準係使用BLAST 2.0 演算法執行於blastp或blastn中，以執行該二序列間之 Gapped BLAST檢索（BLAST 2.0)，其容許最後校準中空隙 (刪除或插入）之入導作用。此處爲闡明之目的，將使用以 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ；-----*-------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（19 ) 下就標準參數執行BLAST 2序列校準： 就blastn，使用 0 BLOSUM62 矩陣：

Reward for match = 1 Penalty for mismatch:· 2 Open gap (5) and extension gap (2) penalties gap x dropoff (50) expect (10) word size (11) filter (on) 就blastp，使用 OBLOSUM62矩陣：

Open gap (11) and extension gap (1) penalties gap x dropoff (50) expect (10) word size (3) filter (on) 〇 關於「雜交條件」係指涉標準雜交條件，在該條件下核 酸分子係用以鑑別類似核酸分子。此種標準條件之例揭露 於 Sambrook et al·，Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press，1989 0 Sambrook et al·，ibid. 係於此中併入完整文件作爲參照（特別見於頁碼9 · 3 1 -9.62)。此外，計算適當的雜交與洗滌條件，以達到容許 不同程度之核苷酸誤配之算式，其例揭露於Meinkothetal·, 1984，Anal· Biochem. 138, 267-284 ; Meinkoth et al_，ibid. 係於此中併入完整文件作爲參照。嫻熟此藝之人可使用 Meinkoth et al·，ibid.中該算式，以計算適當的雜交與洗滌 條件，而達到核甞酸誤配之特別水平。此條件將視所形成 之雜交爲DNA : RNA或DNA : DNA而改變。就DNA : DNA雜交所計算的熔化溫度較DNA : RNA雜交者低1 〇 °C。 經由範例，特別的具體實施例中，DNA : DNA之緊迫雜交 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -.1,---¾-------- 丨訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（2Q ) 條件，包括在離子強度爲6X SSC(0.9MNa+)在溫度爲約 20°C與約30°C間（例，低緊迫條件）之雜交作用，更佳者爲 約28°C與約40°C間（例，較緊迫條件），及甚而更佳者爲約 3 5°(：與約45°(：間（例，更加緊迫條件）。特別的具體實施例 中，DNA : RNA之緊迫雜交條件，包括在離子強度爲6X SSC(0.9M Na+)在溫度爲約30°C與約45X：間之雜交作用， 更佳者爲約3 8 Ό與約5 0 °C間，及甚而更佳者爲約4 5。(：與 約5 5 °C間。此等數値係基於計算大於約100核甞酸之分子 之溶化溫度、0 %甲醯胺及約4 0 %之G + C含量。再者，丁 m 可依之前所提Sambrook et al·，頁碼9 · 3 1至9 · 62而在經驗上 計算。 關於「低緊迫雜交作用」（與洗滌條件）係指涉某條件， 其容許核酸分子之分離作用，該核酸分子具有至少約4〇 % 核酸序列相同於雜交反應中用爲探針之核甞酸序列分子 (即，使用Meinkoth et al·，ibid·算式所定核苷酸之誤配，容 許其爲約60%或更少之條件）。 關於「中緊迫雜交作用」（與洗滌條件）係指涉某條件， 其容許核酸分子之分離作用，該核酸分子具有至少約6 〇 % 核酸序列相同於雜交反應中用爲探針之核嘗酸序列分子 (即，使用Meinkoth et al·，ibid·算式所定核苷酸之誤配，容 許其爲約40%或更少之條件）。 關於「高緊迫雜交作用」（與洗滌條件）係指涉某條件， 其容許核酸分子之分離作用，該核酸分子具有至少約8 〇 0/〇 核酸序列相同於雜交反應中用爲探針之核替酸序列分子 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _1;-------------------訂---------. {請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 21 五、發明說明（） (即，使用Meinkoth et al·，ibid ·算式所定核：y：酸之誤配，容 許其爲約2 0 %或更少之條件）。 關於「頗高緊迫雜交作用」（與洗滌條件）係指涉某條 件，其容許核酸分子之分離作用，該核酸分子具有至少約 9 0%核酸序列相同於雜交反應中用爲探針之核苷酸序列分 子（即，使用Meinkoth et al·，ibid·算式所定核苷酸之誤配， 容許其爲約10%或更少之條件）。 「調節」一詞或此詞之衍生詞，意指改變、調控或由一 狀態變化至另一狀態，且包括任一可測量的特徵中可測量 的或可觀測的增加或減少，及/或由一特徵至另一不同特徵 之改變。 Γ藥學可接受的載劑」詞組指涉爲藥學可接受的賦形 劑、配方和/或藥學可接受的傳遞媒劑，其適用於投給本發 明之組成物至適當的玻器内、活體外或活體内部位。藥學 可接受的載劑可致能本發明之組成物以任一適當的劑型生 產/提供而使用，包括但不限於，液體、氣溶膠、膠囊、錠 劑、丸劑、散劑、凝膠及細粒。有些藥學可接受的載劑包 括細胞、膜、脂質配方（包括視給患者投藥方法在當場製成 固狀或膠狀之脂質），抗體配方，食物配方（例，任一可食 的產品或製劑）及重組病毒。較佳的載體亦爲可生物降解的 (即，可生物腐蝕的）。 「藥學可接受的賦形劑」包括賦形劑或配方，其能傳輸 或協助傳輸，但不會將組成物特異地靶定細胞（此中亦指涉 爲非乾定載體）。藥學可接受的賦形劑之範例包括，但不限 -24- 本紙張尺度適用τ國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ 297公釐） _—|----!— 1-----—訂-----— (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 五、發明說明（22 於水、:磷酸緩衝鹽水、Ringer氏溶液、右旋醣溶液、血清 包含溶液、Hank氏溶液、其他水係生理平衡溶液、油、酯 及乙二醇。水性载劑可包含適當的輔助物，其必須接近接 受者（生理條件，舉例言之，藉增強化學安定性與等張 性。適δ的輔助物包括，舉例言之，醋酸鈉、氣化鈉、乳 酸鈉、軋化鉀、氯化鈣、及其他用於生產磷酸緩衝液、 Tris緩衝液、與重碳酸緩衝液之輔助物。輔助物亦包括保 存劑，如乙基硫汞水楊酸鈉，一一或鄰-甲酚、福馬林及苯 甲酸。 「控制釋放媒劑」爲藥學可接受的載劑之一型，其能以 爻控制的方式，將本發明之組成物或蛋白釋放至患者或培 養體。控制釋放配方包含在控制釋放媒劑中之本發明之化 合物（例，CAF蛋白（包括同源物）、抗體、核酸分子、或擬 似物）。適當的控制釋放媒劑包括，但不限於，生物相容的 聚合物、其他聚合性基質、膠囊、微膠囊、微粒子、大量 製劑、滲透唧筒、擴散器材、脂體、脂球、細胞、及經皮 傳遞系統。 「藥學可接受的傳遞媒劑」係爲藥學可接受的載劑，其 能將本發明之組成物或蛋白傳遞至靶部位。較佳地，藥學 可接受的傳遞媒劑能將該組成物乾定（即，定向、選擇地傳 遞）至靶部位。「靶部位」係指涉患者之某部位爲吾人所欲 傳遞组成物者。舉例言之，靶部位可爲任何細胞或組織， 其係以直接注射或傳遞而受乾定，所使用者爲人造或天然 脂質包含傳遞媒劑（例，脂體）、抗體、病毒載體、或其他 丨： --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -25 1250164 A7 B7 23 五、發明說明（ 傳遞媒劑’包括核糖酵素。天然脂質包含傳遞媒劑包括細 胞和細胞膜。人造脂質包含傳遞媒劑包括脂體和膠粒。化 合物爲蛋白時（例，CAF蛋白），適當的傳遞媒劑包括，但 不限於，抗體、脂體和細胞（例，表現該蛋白之重組細 胞）。化合物爲重組核酸分子時，適當的傳遞媒劑包括，但 不限於脂體、病毒載體、金粒子、聚離胺酸/DNA分子 共轭物、人造染色體或其他傳遞媒劑，包括核糖酵素。 「脂體」一詞指涉含有脂質組成物之傳遞媒劑，其能將 核敗为子或蛋白傳遞至患者之特殊的、或選擇的部位。含 脂質組成物之脂體能與靶定細胞之漿膜相融合而將核酸分 子傳遞入細胞。適於與本發明使用之脂體包括任何脂體。 本發明之較佳的脂體包括，例如，其常用於基因傳遞方法 者而嫻熟其藝者所知。更佳的脂體包含具有多陽離子脂質 組成物之脂體及/或具有與聚乙烯乙二醇結合之膽固醇骨架 t脂體。使用此藝中標準方法，可使脂體與本發明之核酸 分子相錯合。 「病毒載體」一詞指涉用於本發明之分離的核酸分子， 其中Μ核酸分子係包裹於病毒外套而容許dna進入細胞。 有數種病毒载體可使用，包括，但不限於，其係基於阿法 病毒、痘病毒、腺病毒、皰療病毒、慢病毒、腺關聯病毒 及反轉錄病毒。 「投給」-詞意指提供受試者某物質之任何方法（例，將 物質導入受試者），包括活體内或活體外投給方法。活體内 投給万法包括’但不限於，靜脈投給法、腹膜投給法、肌 丨1·----------ΛΈ. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂---------· 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 26- 1250164

發明說明（ A才又…法冠狀動脈投給法、動脈投給法（例，入至頸動 脈）、皮下投給法、經皮傳遞、皮下投给法、動脈投給法、 心室投給法、吸入法（例，氣溶膠）、大腦、鼻、口、眼、 肺投給法、經導尿管灌注法、栓劑投給法、及直接注射至 組織。活體外係指涉在患者外部執行部分調控步驟，比如 以重組分子轉染由患者移出之細胞群聚，該重組分子含有 編碼本發明之CAF蛋白之核酸序列，在該重組分子隨後由 受轉染細胞所表達之條件下，並將該受轉染細胞回至患 者。達成此轉染之方法包括，但不限於，轉染法、病毒感 染法、電孔法、脂染法、細菌轉移法、球形融合法、及吸 收法。活體外方法特別適用於當靶細胞易於由患者移出並 移入。 「治療利益」一詞不必然指涉治癒特殊疾病或症狀，毋 寧爲，較佳地其所包含之結果可包括疾病或症狀之緩解、 疾病或症狀之減除、疾病或症狀關聯症候之降低、因原發 性疾病或症狀之發生所導致續發性疾病或症狀（例，因原發 性癌症所致之轉移性癌症）之預防或緩解、及/或該疾病或 症狀之預防。 有關疾病或症狀之「保護作用」一詞，係指涉降低該疾 病症候、降低該疾病發生率、及/或降低該疾病嚴重度。保 護患者或受試者可指涉爲本發明之組成物之能力，將其投 給患者時，能預防疾病之發生並/或治癒或緩解疾病症候、 徵象或原因。如此，保護患者免予疾病，包括預防疾病發 生（預防性處置）與治療患有疾病之患者（治療性處置）。 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ——·---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（25 ) 「預防作用」一詞意指疾病之進程被降低及/或減除，或 疾病之起始被減除（預防性治療）。 「治療」一祠係指，失調之症候（包括疼痛）與/或失調之 病原性起源的起始，被延遲、減低、或完全預防，或若出 現的症候被改善或完全減除。舉例言之，以CAF組成物治 療癌症，不只壓抑人類和其他動物中失調之症候，尚且作 用如預防劑而對抗接受者中出現之失調。 「疾病」一詞指涉任何自哺乳類正常健康狀況之偏差， 且其所包括狀態爲疾病症候出現及已發生偏差之狀況但症 候仍不明顯之時。 「某」或「某個」實體係指涉一或多之該實體。如此， 「某」（或「某個」）、「一或多」與「至少一」等詞在此 可交換使用。 匕含」、「包括」、及Γ具有」等詞可交換使用。 發明説明 本發明之-具體實施例係關於分離的細胞激素活化因子 (CAF)蛋白。t關分離的CAF蛋白包括全長蛋白、截斷的 蛋白（即，全長蛋白之分量）、融合蛋白或此蛋白之任一 同源物。CAF同源物已^義於上。較佳地，caf同源物具 CAF生物活性，线義於上。特別而言，本發明之同 源物較佳地具有之生物性包括上調控(增加、刺激、謗導、 增強）腫瘤壞死因子e(TNFi〇、介白素·…^点）和/ 或介白素-6(IL-6)表達之能力及/或下調控（減少、抑制、 避免、降低）轉型生長因子川㈣）表達之能力。此 _ ------------------訂---------. (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -28- 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（） 活性可藉此藝中測量細胞激素之適當方法來測量，包括但 不限於’免疫分析（包括酵素連結免疫吸收分析或 ELISA)、放射免疫分析、及RNA分析（見實例）。CAF蛋白 之生物活性亦可包括，但不限於：使Caf結合至受體或至 另一蛋白、DNA、碳水化合物份額或脂質份額之能力，其 導致或促成以上所鑑的一種生物活性。蛋白結合與另一份 額之能力的測量方法係爲嫻熟其藝者之能力所及處。再 者’使用此中提供的指引，以嫻熟其藝者之能力所及，能 修飾野生型CAF (例，胺基酸SEQ ID Nos : 1或6 )之核酸與/ 或胺基酸，並能測試具此修釋之同源物的一種或多種CAF 生物活性。舉例言之，決定CAF謗導或抑制細胞激素表達 能力之方法係述於實例段。 有關分離的CAF蛋白可包括某蛋白，其係實質上純化自 天然來源（例，依據本發明之高免疫卵）、重組地生產的 CAF及/或合成地生產的C AF。特別較佳的本發明之cAF蛋 白包含選自SEQ ID NO ·· 1與/或SEQ ID NO : 6之胺基酸序 列。SEQ ID NO _· 1係跨展自SEQ ID NO: 6之胺基酸1-30 且係爲SEQ ID NO : 6之N 端分量。SEQ ID NO : 6據信爲 本發明之CAF蛋白之全長胺基酸序列，其係純化自高免疫 卵。 一具體實施例中，CAF蛋白包括某蛋白所具之胺基酸序 列，其包含SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 6之最少9連續的 胺基酸殘基（即，9連續的胺基酸殘基具有與SEQ ID NO : 1 或SEQ ID NO : 6之9連續的胺基酸殘基之1〇〇%相同性）。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -1.-------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7

五、發明說明（27 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此蛋白可被參照爲含有SEQ ID N0 : 1與/或SEQ NO : 6 之蛋白之同源物（例，CAF同源物），但亦包括含有SEQ ID N〇:【與/或SEQIDN〇: 6之蛋白（例，自然發生caf蛋 白）。較佳具體實施例中，CAF蛋白之同源物所具胺基酸序 列含有最少12、其更佳者爲最少約15、其更佳者爲最少約 2〇、其更佳者爲最少約25之SEQ ID N〇 : 1與/或沾(5 ID NO 6之連續胺基酸殘基。另一較佳具體實施例中，cAF 同源物所具胺基酸序列含有最少約3〇、其更佳者爲最少約 35、其更佳者爲最少約4〇、其更佳者爲最少約45、其更 佳者爲最少約5 〇、其更佳者爲最少約5 5、其更佳者爲最少 約6 0、其更佳者爲最少約6 5之SEQ ι〇 N〇 : 6之連續胺基 酸殘基。 CAF蛋白同源物可包括核酸序列編碼之蛋白，該核酸序 列包括最少27、其較佳者爲最少3 6、其更佳 45、其更佳者爲最少6〇、其更佳者爲最少以編碼seq id NO · 1與/或SEQ ID NO : ό之核酸序列之連續核甞酸。另 一具體實施例中，CAF蛋白同源物可包括核酸序列編碼之 蛋白，孩核酸序列包含最少9〇、其更佳者爲最少ι〇5、其 更佳者爲最少120、其更佳者爲最少135、其更佳者爲最； 150、其更佳者爲最少165、其更佳者爲最少18〇、其更佳 者爲最少195編碼SEQ ID Ν〇 : 6之核酸序列之連續核甞 酸。 如以上所討論，CAF蛋白同源物較佳地具有可測量的 CAF生物；舌性（即，具生物活性）。然而，某些具體實施例 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -^1* 1— ^1 ^1 ^1 ^1 ϋ I ϋ 一一口， ϋ ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 28 五、發明說明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中’ CAF蛋白、包括CAF同源物，係用於有助鑑別CAF與 CAF相關蛋白之抗體製備或寡核甞酸開發（例，若用抗體或 寡核甞酸以達篩選/選擇CAF增富分量之高免疫卵製品之目 的）、選殖編碼C AF之核酸序列（若用寡核甞酸）、及/或鑑 別與CAF結合之蛋白或核酸。此等具體實施例中，cAF蛋 白是否具有生物活性並不特別重要，而是CAF蛋白有助此 等方法本身即具CAF生物活性之範園。 一具體實施例中，CAF蛋白（例，CAF蛋白同源物）所含 胺基酸序列最少約65%相同於SEQ ID NO : 1與/或SEQ ID NO : 6，其各別地在 SEQ id NO : 1 與 / 或 SEQ ID NO : 6 上’最少約1 5連續胺基酸，更佳者爲在其上最少約2 〇胺基 酸、更佳者爲在其上最少約25胺基酸。較佳地，CAF蛋白 所含胺基酸序列最少約70%、更佳者爲最少約75%、更佳 者爲最少約8 0 %、更佳者爲最少約8 5 %、更佳者爲最少約 9 0。/。、更佳者爲最少約95%相同於SEq m N〇 : 1與/或 SEQ ID NO : 6，其各別地在 SEq ID no : i 與 / 或 SEq m 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 NO : 6上，最少約15連續胺基酸，更佳者爲在其上最少約 20胺基酸、更佳者爲在其上最少約25胺基酸。另一具體實 施例中’ CAF蛋白所含胺基酸序列最少約6 5 %、更佳者爲 最少約70%、更佳者爲最少約75%、更佳者爲最少約 8 0%、更佳者爲最少約85%、更佳者爲最少約9〇%、甚而

更佳者爲最少約95%相同於SEQ ID NO : 6，在SEQ ID NO : 6上之最少約30連續胺基酸、更佳者爲在其上最少約 35胺基酸、更佳者爲在其上最少約4〇胺基酸、更佳者爲在 -31 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 一· B7 __ 29 " ' *---— 五、發明說明（） 其上最少約45胺基酸、更佳者爲在其上最少約5〇胺基酸、 更佳者爲在其上最少約55胺基酸、甚而更佳者爲在其上最 少約6 0胺基酸。 另一具體實施例中，CAF蛋白所含胺基酸序列最少約 6 0〇/〇相同於 SEQ ID NO : 6，在 SEQ ID NO : 6 上最少 66胺 基酸、更佳者爲在其上最少約67胺基酸、更佳者爲在其上 最少約68胺基酸、更佳者爲在其上最少約69胺基酸。較佳 地，CAF蛋白所含胺基酸序列最少約6 5 %更佳者爲最少約 7〇°/。、更佳者爲最少約75%、更佳者爲最少約8〇%、更佳 者爲最少約8 5 %、更佳者爲最少約9 〇 %、甚而更佳者爲最 少約95〇/〇相同於SEQ ID NO : 6，在SEQ ID NO : 6上之最 少66胺基酸、更佳者爲其上最少約67胺基酸、更佳者爲其 上最少約6 8胺基酸、更佳者爲其上最少約6 9胺基酸。決定 百分比相同性之方法已述於前。 另一具體實施例中，CAF蛋白，括及CAF蛋白同源物， 其包括之蛋白所具胺基酸序列係充分類似於天然Caf蛋白 胺基酸序列，而編碼同源物之核甞酸序列在中、高或頗高 緊迫條件下（已述於前），能夠和（即，與）編碼天然caf蛋 白之核苷酸序列（即，與編碼CAF天然胺基酸序列之核酸股 之互補股）雜交。此等條件已定義於前。較佳地，編碼caf 蛋白同源物之核酸分子所含核酸序列，在中、高或頗高緊 迫條件下，能與編碼某蛋白之核酸序列互補股雜交，該蛋 白含有代表SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 6之胺基酸序 列。編碼本發明之CAF蛋白之核酸序列之核酸序列互補 •32· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I: --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7____— 五、發明說明（） 股，係指涉該核酸股之核酸序列爲互補於編碼CAF之股。 雙股DNA最好編碼含有單股DNA之給定胺基酸序列，且其 互補股所具序列互補於該單股DNA。如此，本發明之核酸 分子可爲雙股抑或單股，且包括其核酸分子在緊迫雜交條 件下，與編碼胺基酸序列SEQ ID NO ·· 1與/或SEQ ID NO : 6之核酸序列，及與編碼胺基酸序列SEq id NO : 1與/或 SEQ ID NO : 6之核酸序列之互補股，形成安定雜交物。推 演互補序列之方法係爲嫻熟此藝者所知。應注意的是，由 於胺基酸序列與核酸序列技術並非完全無誤，故此中呈現 之序列’其最佳者代表本發明之CAF蛋白之明顯的序列。 CAF蛋白同源物可爲自然對偶變異或自然突變之結果。 本發明之CAF蛋白同源物亦可使用此藝中已知技術來生 產，包括但不限於，對蛋白直接進行修飾或對編碼該蛋白 之基因進行修飾，後者使用例如古典或重組DNA技術造成 隨機或靶定突變生成。編碼CAF之核酸所自然發生的對偶 交異’係某基因在基因組中基本上相同的基因座發生，該 基因編碼SEQ ID NO : 1與/或SEq ID N〇 : 6之胺基酸序 列，但由於如突變或重組等自然變異之發生，該基因具有 相似但不相同的序列。自然對偶變異物典型上編碼之蛋白 所具生物活性，係相似於與原基因編碼之蛋白者，當兩者 進行比較時。某類爲偶變異物可編碼相同的蛋白但具有相 異的核酸序列，其係由於該基因碼之簡併作用。對偶變異 =可在祕因之5，或3,未轉譯區域中（例，在調控控制區 -’）包含父替物。對偶變異物爲嫻熟其藝者所習知，並 I ： *-------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -33 - ^50164

五、 發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 預期在給定的單套基因組之細菌種中，和/或二或多細 之群中被發現。 CAF蛋白包括基因融合（其例爲，用以過度表達重組蛋白 之可溶、活性形式）、突變原化基因（如，基因具密碼子修 飾以增強基因轉錄與轉譯）、與截斷基因（如，基因具移除 的區域以產生生物上活性的分量或全長蛋白之次單元）之表 達產物。應注意的是，本發明之CAF蛋白與蛋白同源物， 包括不具CAF活性之蛋白。此等蛋白係助於，舉例而言， 抗體之生產。 u 本發明之分離的CAF蛋白，包括全長蛋白、截斷的蛋 白、其他同源物、及融合蛋白，可以直前方式鑑別：（1)由 蛋白上凋控TNF從、IL_10和/或il-6並/或下調控TGF 表達I能力；（2)由蛋白之生化與結構性質（例、分子量、 級結構、安定性特徵）；（3 )由蛋白之與對抗C AF蛋白之 抗體的選擇性結合；（4 )由蛋白與其他CAF胺基酸與核酸序 列t同源性，如自高免疫卵以外之其他來源的CAF胺基酸 與核酸序列。本發明之蛋白與/或同源物之最小尺寸，爲該 尺寸足以具有CAF生物活性或，當該蛋白不需具有此種活 性，仍足以助於與本發明之CAF蛋白關聯的另一目的，比 如與自然發生CAF蛋白結合之抗體的生產。如此，本發明 心CAF蛋白或同源物之最小尺寸，爲該尺寸適於形成最少 一表位而能被抗體所辨識，且典型地爲最少8至3 〇胺基酸 之長度（包括8與30間增量爲一胺基酸之任一長度），而較 佳的尺寸係取決於所欲求此蛋白之全長、多價（即，每區域 -34 本紙張尺錢财關家辟(CN^?i^r〇x 297公釐） in .-------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具一功能而具一種以上區域之融合蛋白）、或功能性部分。 除非實作的限制，沒有限制此蛋白之最大尺寸，而該蛋白 可包括CAF蛋白（包括CAF同源物）之部分或全長CAF。 本發明亦包括融合蛋白，其包括附著至一或多融合區段 < C AF包含區域（包括C AF蛋白之同源物）。適當的融合區 段以本發明之用途包括，但不限於，區段其可[增強蛋白 之安定性；提供其他欲求的生物活性（例，細胞激素）及/或 輔助CAF蛋白之純化（例，親合性色譜法）。適當的融合區 段可爲任何尺寸之區域其具欲求的功能（例，分給增加的安 定性、可溶性、作用或生物活性；及/或簡化蛋白之純化作 用）。融合區段可與蛋白之CAF包含區域之胺與/或羧端結 合，並可爲易感開裂而致能CAF蛋白之直前恢復。融合蛋 白較佳地由培養經融合核酸分子轉染之重組細胞而製得， 該分子所編碼之蛋白包括附著於CAF包含區域之羧與/或胺 終端之融合區段。 本發明亦包括CAF蛋白之擬似物。如於此處使用，「擬 似物」一詞用於指涉任一胜肽或非胜肽化合物，其能模擬 自然胜肽之生物活性，通常因爲該擬似物所具基本結構能 模仿自然發生胜肽之基本結構和/或具有該自然發生胜肽之 明顯生物屬性。擬似物可包括，但不限於：具原型之實質 修飾的胜肽，像是與自然發生胜肽之無側鏈相似性（例如此 修飾作用能使其易受降解）；抗個體型與/或催化性抗體、 或其分量；分離之蛋白的非蛋白性部分（例，碳水化合物結 構）；或合成或天然有機分子，例如，包括核酸及經組合化 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •I; --------------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 33 五、發明說明（） 學鑑別之藥物。 使用此藝中已知之多種方法可設計、選擇並/或是鑑別此 等擬似物。有助設計擬似物之藥物設計或助於本發明之其 他治療性化合物之多種方法，已揭露於Maulik et al.，1997, Molecular Biotechnology : Therapeutic Applications and Strategies，Wiley_Liss，Inc.，其於此中併入完整文件作爲參 照。CAF擬似物可得自於，舉例而言，分子多樣性策略（能 容許大型、化學上多樣的分子文庫之快速建構的相關策略 之組合）、天然或合成化合物之文庫、特別自化學或組合文 庫（即，不同序列或尺寸但具相似建築模塊之化合物文庫） 或藉理性、定向或隨機藥物設計。實例見於前Maulik et al. 0 分子多樣性策略中，大型化合物文庫之合成，舉例言 之，係由胜肽、寡核苷酸、碳水化合物和/或合成性有機分 子，所用者爲生物、酵素與/或化學方法。發展分子多樣性 策略之緊要參數包括次單元多樣性、分子尺寸、及文庫多 樣性。篩選此等文庫之一般目標係利用組合性選擇之序列 性應用，以獲得對欲求之靶的高親合性配位子，而後藉隨 機抑或定向設計策略以最優化該前導分子。分子多樣性之 方法已詳述於Maulik et al., ibid. 0

Maulik et al.,亦揭露，舉例而言，定向設計法，其中使 用者自適當選擇的段片之段片文庫，指向創造新穎分子之 過程；隨機設計法，其中使用者使用基因的或其他演算法 以隨機地突變分量及其組合，而同時應用選擇判準以評價 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨：-------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 π 34 五、發明說明（） 候選配位子之合適度；及網格基礎法，其中使用者計算三 維受體結構與小分量探針間交互作用能量，接著將合適的 探針位點連結在一起。 依據本發明，CAF蛋白可衍自任何動物，且特別自哺乳 或鳥綱脊椎動物之動物。較佳地，CAF蛋白係衍自脊椎動 物鳥綱之產卵動物。較佳的CAF蛋白包括自高免疫難、火 雞、或鴨分離得CAF蛋白。特別佳之分離的CAF蛋白爲衍 自高免疫難卵之CAF蛋白。 如前所論，本發明之CAF蛋白可藉任何適於生產蛋白或 胜肽之方法而生產。特別佳的本發明之CAF蛋白之生產方 法爲化學合成方法。舉例言之，此等方法包括悉知的化學 程序，比如溶液或固相胜肽合成，或在溶液中起始於經傳 統溶液方法而耦合的蛋白分量之半合成。此等方法爲此藝 中所習知，且可發現於一般該領域中之課本或文章如： Merrifield，1997，Methods Enzymol. 289 : 3-13 ; Wade et al., 1993，Australas Biotechnol. 3(6) : 332-336 ； Wong et al·， 1991，Experientia 47(11-12) : 1123-1129 ; Carey et al·，1991，

Ciba Found Symp. 158 : 187-203 ； Plane et al·，1990,

Biologicals 18(3) : 147-157 ; Bodanszky，1985, Int. J. Pept. Protein Res. 25(5) : 449-474 ; or H. Dugas and C. Penney, BIOORGANIC CHEMISTRY，（1981) at pages 54-92，其全部 係於此中併入完整文件作爲參照。舉例言之，胜肽之可合 可藉固相方法，其係利用可購得的胜肽合成器與製造者提 供者提供的合成循環。熟諳此藝者明白固相合成亦可使用 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨 7=—·—--------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 35 五、發明說明（） FMOC策略及TFA/清掃器開裂混合物而完成。 若欲求較大量之CAF蛋白，可使用重組DNA技術生產該 蛋白，雖然對於此種較小尺寸之蛋白（即，胜肽），胜肽合 成爲一般較佳者。蛋白可被重組地生產，藉由在有效生產 該蛋白之條件下，培養能表達該蛋白之細胞（即，藉由表達 編碼該蛋白之重組核酸分子，詳述於後），並恢復該蛋白。 有效培養條件包括，但不限於，有效的培養基、生物反應 器、溫度、pH與氧條件，其容許蛋白生產。有效培養基係 指涉任一培養基，其中被培養細胞生產本發明之CAF蛋 白。此等培養基包括水性培養基，其具可同化的碳、氮與 磷酸來源、及適當的鹽、礦物質、金屬與其他營養物，比 如維生素。重組細胞（即，表達編碼CAF蛋白之核酸分子的 細胞）可被培養在傳統的發酵生物反應器、搖動燒瓶、試 管、微滴定碟、培養m。培養可在適於重組細胞之溫度、 pH及氧含量下進行。此等培養條件係屬既熟此藝者之專 業。此等技術爲藝中悉知，並述於例如Sambrook et al·， 1988, Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York or Current Protocols in Molecular Biology (1989) and supplements 0 取決於用於生產的載體與宿主系統，結果本發明之重組 CAF蛋白可保留在重組細胞；被分泌至培養基；被分泌至 二細胞膜間空間，如大腸桿菌之周漿空間；或被保留在細 胞或病毒膜之外侧表面上。「恢復該蛋白」詞組指涉爲收 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Lit-------- —訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（） 集含有該蛋白之完整培養基而不須牵連額外的分離或純化 步驟。本發明之CAF蛋白可使用多種標準蛋白純化技術而 純化，例如，但不限於，親合力色譜、離子交換色譜、過 滤、電泳、厭水性交互作用色譜、凝膠過濾色譜、逆相色 譜、刀豆球蛋白A色譜、色聚焦及差別性可溶化作用。本 發明之蛋白以「實質上純的」形式收取較佳。如此處所 用，「實質上純的」指涉某純度其容許該蛋白之有效用途 作爲生物催化劑、其他試劑、或投給受試者之用。舉例而 言，如實例1所述的含有CAF之水溶性分量，被視爲實質上 純的且適於投給患者。 尚有一具體實施例中，本發明之CAF蛋白可高度地純化 自適當的來源，包括但不限於，以一種或多種免疫原，且 特別以細菌抗原或其合成性等價物，而受高免疫的類之 卵。本發明人已發現本發明之細胞激素活化因子，在高免 疫卵中有超常水平的存在。高度純化的卵細胞激素活化因 子可被分離自全卵、卵黃和卵白。自卵黃高度純化之CAF 顯示，相較由卵白高度純化之CAF，具更高免疫調控活 性。 由卵的大規模CAF純化過程典型地使用4 0公斤的高免疫 卵黃（例，述於美國專利號5,772,999之PL-100或S-100卵 黃）作爲起點。CAF之高度純化所用技術有超過濾法、Q Sepharose離子交換色譜法、固相萃取法及另外的方法，如 簡述於下並詳述於實例段者。 細胞激素活化因子可被高度純化自全卵、卵黃或卵白。 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨丨·丨---------·裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7

五、發明說明（37 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 較佳的咼純化過程之實例如下： !·卵黃脱脂； 2· #黃30〇〇遒耳吞分子量通透物製備； 3.以離子或陰離子交換色譜法分離分量； 4 ·固相萃取； 5.固相萃取分量之分部萃取； 6 · HPLC分離；和 7·細胞激素謗導活性之生物分析。 以下爲此程序之更詳細的描述： 步驟1 : 細胞激素活化因子可被高度純化自全卵、卵黃或卵白。 車父佳的具體實施例中，其組成物係純化自卵黃。以熟諳此 二者μ知之方法’將脂質邵分自全卵或卵黃中移除。舉例 而吕，若爲噴霧乾燥的卵黃粉末，可用溶劑（丙烷、丁烷或 己:fe或二元溶劑）、超臨界C〇2、酵素及其類似物以完成去 脂’若爲液狀卵黃，可用揭露於Lee(美國專利號5,367,054) 之辛紅为離方法（CAPS )以完成去脂。脂肪無須自卵白中移 除’如此液狀或粉狀形式之卵白可用述於以下實例之傳統 方法直接加熱或溶離。全卵、卵黃或卵白而後較佳地處理 爲液狀或粉狀形式，並進一步處理以得到水溶性分量。（見 實例）。 步驟2 : 自全卵、卵黃或卵白所得水溶性分量，使用配有3,〇〇〇道 耳呑分子量切除膜之超過濾系統，使其進行超過濾。超過 -40- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐_)_ I ^ .—11 ------—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 125〇164

五、 發明說明（ —- μ程序將具有大於約3，〇〇〇道耳呑分子量之分子，分離自具 有小於約3,000道耳吞分子量者。應注意的是，由於在二級 結構容許下（即，實質上線狀的多肽/蛋白）顯著較大蛋白可 通過濾、器，故3000遒耳呑切除爲約略値。經過濾後，將所 知含有小於約3,000道耳吞分子量之分子的超過濾物，康 乾、秤重、並製備供生物分析測試及進一步分離。 μ等步驟在實例1與圖式中詳細提出者將不在此重覆。 本發明之高純度細胞激素活化因子具有以下物理/化學特 徵（即，鑑別特徵）： a·具最少一生物活性次單元，其能通過3〇〇〇道耳吞分子 量切除超過濾過濾器； b .溫度增爲至少約5 0 °C仍安定（具可測量的生物活性）； c. pH自約2至約10仍安定（具可測量的生物活性）； d ·爲水溶性； e ·爲非類固醇； f.帶負電； g ·爲實質上非極性；和， h.具約254毫微米之；l max。 此外，本發明之高純度細胞激素活化因子具有以下生化/ 功能特徵： a·在受試動物中具免疫調控活性； b _存在於鳥類之卵的卵白與卵黃兩者中； c·其自卵黃分離者較其自卵白分離者，典型地具較大免 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I:-------------------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164

I--1—:---I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 疫調控活性； d .在玻器内能謗導細胞激素表達，且特別地在玻器内能 謗導腫瘤壞死因子a(TNFa〇、介白素_；^(IL_ly3) 和/或介白素_6(IL-6)之表達；和/或 e·能下調控轉型生長因子冷（Tgf yg )之表達。 再者，本發明之CAF蛋白具有謗導巨噬細胞與/或單核球 世系之細胞分化之能力。 3,000道耳吞分子量係推演自該組成物之分離與純化，其 中分離與純化過程所用超過濾膜不容許大於3,〇〇〇遒耳吞之 分子經其而過。高純度細胞激素活化因子由於其尺寸小且 不受降解蛋白之酵素所降解（基於活體内分析，其中該蛋白 在口服投給後展現生物活性，從而暴露於消化酵素），故最 初被懷疑爲非蛋白性及非類固醇。並且，該組成物口服有 活性。不受理論束縛，本發明人相信該高純度細胞激素活 化因子之小型安定形式，能促進其自消化遒之吸收。最 後，高純度細胞激素活化因子是熱安定的，此特徵不見於 多數蛋白。然而，現在已知高純度細胞激素活化因子確實 爲蛋白，其具有以上鑑別的安定性特徵。此一發現是令人 驚訝的並進一步證明本發明之高純度細胞激素活化因子之 優點爲咼度適於括含在配方、加工食品、及疫苗，包括口 服疫苗與配方。 本發明之再一具體實施例包括編碼CAF蛋白之核酸分 子。本發明之核酸分子包括某核酸分子其包含編碼任一= 離的CAF蛋白，包括上述的CAF同源物。較佳的本發明之 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ^-----‘-------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7

1250164 五、發明說明（4〇 ) AF核酸刀子包含編碼某蛋白之核酸序列，該蛋白所含胺 基酸序列含有最少9、其更佳者爲最少12、其更佳者^最 少約15、其更佳者爲最少約2〇、其更佳者爲最少約以之 SEQIDN0: 1與/或SEQIDN〇:6之連續胺基酸殘基另 一具體實施例中，較佳的CAF核酸分子所編碼之蛋白所含 胺基酸序列含有最少約3G、其更佳者爲最少约35、其更佳 者爲最少約40、其更佳者爲最少約45、其更佳者爲最少约 5〇、其更佳者爲最少約55、其更佳者爲最少約6〇、其更 佳者爲最少約65之SEQ ID NO : 6之連續胺基酸殘基。 具m實施例中，該等核酸分子所包括之分離的核酸分 子，在中緊迫條件下、其更佳者爲高緊迫條件、甚而更佳 者爲頗鬲緊迫條件，與編碼自然發生CAF之核酸序列之互 補股（即，包括編碼CAF之自然生發對偶變異物）雜交。較 佳地，編碼本發明之CAF蛋白之分離的核酸分子，所含核 酸序列在中、高或頗高緊迫條件下，與編碼某蛋白之核酸 序列之互補股相雜交，該蛋白含有由SEQ ID N〇 : 1與/或 SEQ ID NO ·· 6所代表之胺基酸序列。 本發明之一具體實施例中，編碼本發明之Caf蛋白之核 酸分子所含核酸序列，其編碼之胺基酸序列最少約65%相 同於SEQ ID NO : 1與/或SEQ ID NO : 6，其各別地在SEQ ID NO : 1與/或SEQ ID N0 : 6上，最少約Η連續胺基酸、 更佳者爲在其上最少約20胺基酸、更佳者爲在其上最少約 2 5胺基酸。較佳地，編碼本發明之CAF蛋白之核酸分子所 含核酸序列，其編碼之胺基酸序列最少約7〇%、更佳者爲 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -ϋ I* ί --訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 411250164 A7 B7 五、發明說明（） 最少約75%、更佳者爲最少、约8〇%、更佳者爲最少約 85%、更佳者爲最少約9。％、更佳者爲最少約㈣相同於 SEQmNO:…或 SEQIDN〇: 6，其各別地在 seqid NO: #/或SEQIDN0: 6上，最少約"連續胺基酸更 佳者爲在其上最少約20胺基酸、更佳者爲在其上最少約h 胺基酸。-具體實施例中，編碼本發明之caf蛋白之核酸 分子所含核酸序列，其編碼之胺基酸序列最少約65%、更 佳者爲最少約7〇%、更佳者爲最少約75%、更佳者爲最少 約80%、更佳者爲最少约85%、更佳者爲最少約9〇%、甚 而更佳者爲最少約95%相同於SEQidn〇: 6，在SEQm NO . 6上之最少約3 〇連續胺基酸、更佳者爲在其上最少約 35胺基酸、更佳者爲在其上最少約4〇胺基酸、更佳者爲在 其上最少約45胺基酸、更佳者爲在其上最少約5〇胺基酸、 更佳者爲在其上最少約55胺基酸、甚而更佳者爲在其上最 少約6 0胺基酸。 另一具體實施例中，編碼本發明之CAF蛋白之核酸分子 所含核酸序列，其編碼之胺基酸序列最少約6〇%相同於 SEQIDN0: 6，在SEQIDN〇: 6上之最少66胺基酸、更 佳者爲在其上最少約67胺基酸、更佳者爲在其上最少约Μ 胺基酸、更佳者爲在其上最少約69胺基酸。較佳地，編碼 本發明ICAF蛋白之核酸分子所含核酸序列，其編碼之胺 基酸序列最少約65%更佳者爲最少約7〇%、更佳者爲最少 约75%、更佳者爲最少約8〇%、更佳者爲最少約85%、更 佳者爲最少約90%、甚而更佳者爲最少约95%相同於seq -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21q χ 297公着y

It (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164

五、發明說明（42 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 出NO · 6，在SEQ IDNO: ό上之最少66胺基酸、更佳者 1在其上最少約67胺基酸、更佳者爲在其上最少約68胺基 酸、更佳者爲在其上最少約69胺基酸。決定百分比相同性 之方法已述於前。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依據本發明，分離的核酸分子爲自其天然周圍環境移出 (即，爻人類操控）之核酸分子，並可包括DN A、RN A、或 DNA或RNA，包括cDNA任一者之衍生物。如此，「分離 的」並不反映至該核酸分子被純化的範圍。分離的caf核 酸分子可包括，舉例而言，CAF基因、CAF基因之自然對 偶變異物、C AF編碼區域或其一部、及c AF編碼與/或調控 區域而經修飾者，該等修飾係由核甞酸之插入、刪除、取 代、及/或倒轉，其方式不會使修飾作用干擾到核酸分子之 能力，而能編碼本發明之CAF蛋白或在緊迫條件下與自然 基因分離物形成安定雜交物。本發明之分離的核酸分子並 不包括大於CAF基因之自然發生分子。因此，本發明將不 涵括含有CAF基因加上額外侧接序列之染色體與分子。本 發明之核酸分子之最小尺寸，爲該尺寸足以編碼具Caf生 物活性之蛋白，足以編碼含有最少一表位之Caf蛋白而與 抗體結合，足以形成探針或寡核苷酸引子而能與編碼自然 CAF蛋白之核酸分子之互補序列形成安定雜交（在低、中或 高緊迫條件下）。如此，編碼此一蛋白之核酸分子的尺寸， 可決定於核酸組成物和百分比同源性或核酸分子與互補序 列間之相同性，及決定於雜交條件本身（例，溫度、鹽濃 度、及甲醯胺濃度）。充作寡核菩酸引子或探針之核酸分子 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164

發明說明（ 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 <典型的尺寸，若該核酸分子是〇0：富含的，最小約12至 約15核甞酸之長度，若該核酸分子是Ατ富含的，則最小 約15至約18鹼基之長度。 ’ 分離的CAF核酸分子可包括簡併作用。如此處所用，核 甞酸簡併作用係指涉一胺基酸可被不同的核苷酸密碼子所 編碼之現象。從而，編碼本發明之CAF蛋白之核酸分子之 核酸序列，可因簡併作用而變化。應注意的是本發明之分 離的CAF核酸分子並非必須得編碼具CAF活性之蛋白。 CAF核酸分子可編碼像是截斷的、突變的或無活性的蛋 白。此等核酸分子與此等核酸分子所編碼之蛋白有助於選 殖其他CAF編碼核酸分子、例如偵測樣本中caf之存在、 或如抗體生產之其他目的。 依據本發明，有關CAF基因包括關於自然（即，野生 型）CAF基因之所有核酸序列，比如由該基因所編碼而控制 CAF蛋白生產的調控區域（比如，但不限於，轉錄、轉譯或 後轉譯控制區域），以及編碼區域本身。另一具體實施例 中，CAF基因可爲自然發生對偶變異物，所包括之序列相 似但不相同於編碼給定CAF蛋白之核酸序列。 本發明之分離的CAF核酸分子分離自其自然來源或使用 重組DNA技術（例，聚合酶鏈反應（PCR)擴增、選殖）或化 學合成而生產。生產合成性核酸分子之方法係爲此藝中所 悉知。舉例而T，由於CAF蛋白爲相對小的蛋白，能使用 傳統的、可購得的DNA合成器材生產編碼所欲求蛋白之 DNA序列。另者，亦可使用聚合酶鏈反應（pcR)技術或其 i」i!t (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂--------- 46- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 44 五、發明說明（） 他選殖技術，自許多物種之基因組DN A，特別是產卵動物 之卵，而製作編碼所欲求蛋白之DN A序列。此種方法係爲 此藝中所悉知（Sambrook et al·，supra)。 CAF核酸分子同源物（即，編碼CAF蛋白同源物）可使用 熟諳此藝者已知之數種方法（見，例如，Sambrook et al.)而 生產。舉例而言，使用不同的技術可修飾核酸分子，其法 包括但不限於，古典的突變生成與重組DNA技術（例，定點 突變生成、化學處理、限制酶開裂、核酸分量之捆紮及/或 PCR擴增），或核甞酸之合成及混合群組之捆紮以「建造」 核酸分子之混合物及其結合。對編碼CAF蛋白之重組核酸 分子之另一修飾方法爲基因曳步法（即，分子育殖法）（見， 例如，美國專利號 5,605,793 to Stemmer ; Minshull and Stemmer ； 1999，Curr. Opin. Chem. Biol. 3 ： 284-290 ；

Stemmer，1994, P.N.A.S. USA 91 : 10747-10751，其係於此 中併入完整文件作爲參照）。此技術可用以有效地在CAF蛋 白作用中入導多重同時正電荷。核酸分子同源物可藉由與 CAF基因雜交，或藉篩選由核酸分子所編碼蛋白之功能 (例，增加B細胞增殖之能力）而選擇。 較佳地，核酸分子爲重組核酸分子之一部。此重組核酸 分子包含一表達載體運作地連結至該核酸分子。重組核酸 分子將詳述於後。此具體實施例中，該核酸分子所編碼的 蛋白較佳地具有CAF生物活性。此一核酸分子可包括編碼 CAF蛋白同源物之核酸分子，並可因此而被指涉爲編碼自 然發生CAF之核酸序列之同源物（即，核酸序列同源物）。 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I—：----.-----裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印黎 五、發明說明（） 因此，本發明之一具體實施例包括重組核酸分子，其包 括最少一本發明之分離的核酸分子被插入於任一核酸載體 (例，重組載體）而適於選殖、定序、及/或者操控，比如將 该核酸分子表達或傳遞進入宿主細胞以形成重組細胞。此 載體包含異源性核酸序列，即是，該核酸序列並非自然見 於本發明之核酸分子之接鄰處，縱使該載體亦可包含調控 核酸序列（例，啓動子、未轉譯的區域）而自然見於本發明 之核酸分子之接鄰處（詳細討論於後）。載體可爲rNA或 DNA，原核性或眞核性，且典型地爲病毒或質體。該載體 可保留爲染色體外元素（例，質體）或其可被整合至染色 體。整個載體可適當地保留在宿主細胞中，或在一定條件 下’该曳體DNA可被刪除’而留下本發明之核酸分子。整 合的核酸分子可受染色體啓動子所控制、受原有的或質體 啓動子所控制、或受數種啓動子之組合所控制。該核酸分 子之單一或多重副本可整合至宿主細胞之染色體。 典型地’重組分子包括本發明之核酸分子其運作性連結 至一或多轉錄序列者。此等用詞已定義於前。如此處所 用’ 「重組分子」或「重組核酸分子」詞組基本上指涉核 酸分子其運作性連結至轉錄序列，當此核酸分子爲此中所 討論的重組分子時，可與「核酸分子」詞組交換使用。適 當的轉錄控制序列包括任一轉錄控制序列其可在最少一個 重組細胞中運作而助於表達本發明之Caf蛋白。多種此等 轉錄控制序列係爲熟諳此藝者所知。較佳的轉錄控制序列 包括其在細菌、眞菌（例，酵母菌）、昆蟲、植物或動物細 -48- 本紙張尺錢时關家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂---------. 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（） 胞。 本發明之重組分子，其可爲DNA或RNA，亦包括附加的 調控序列，比如轉譯調控序列、複製起始點、及其他相容 於該重組細胞之調控序列。一具體實施例中，本發明之重 組分子，包括其整合至宿主細胞染色體者，亦包含分泌信 號（即，信號區域核酸序列）而能使被表達的CaF蛋白分泌 自生產該蛋白之細胞。適當的信號區段包括與本發明之 CAF蛋白自然聯結的信號區段，或能使本發明之caf蛋白 定向分泌的異源性信號區段。另一具體實施例中，本發明 之重組分子包含先導序列而能使被表達的CAF蛋白傳遞並 插入至宿主細胞膜内。適當的先導序列包括與本發明之 CAF蛋白自然聯結的先導序列，或能使CAF蛋白定向傳遞 並差入細胞膜的異源性先導序列。 重組分子之一型式，此中指涉爲重組病毒，包括本發明 之重組核酸分子，其包裹於病毒外套中，並可在該病毒傳 遞至細胞後在細胞中被表達。可使用數種重組病毒粒子， 包括但不限於，阿法病毒、桿狀病毒、痘病毒、腺病毒、 胞療病毒、及反轉錄病毒。 本發明之一種或多種重组分子可用於生產本發明之受編 碼產物(例，CAF蛋白）。-具體實施例中，受編碼產物係 藉在有效生產該蛋白之條件下，如此中所述表達核酸分子 而生產。較佳的生產受編碼蛋白之方法係將宿主細胞以一 種或多種重組分子轉染而形成重組細胞。適於轉染的宿主 細胞包括，但不限於，任一可被轉染的細菌、眞菌（例，酵 丨； 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -49-

1250164 A7 B7 47 五、發明說明（ 母菌）、昆蟲、植物或動物細胞。宿主細胞可爲未受轉染之 細胞或已受至少一核酸分子轉染之細胞。 本發明亦包括分離的（即，由其自然周圍環境移出的）抗 體，其能與本發明之CAF蛋白（包括CAF同源物）或其擬似 物（例，CAF抗體）選擇地結合。如此中所用，「選擇地結 合至」一詞係指涉本發明之抗體，其優先地結合至本發明 之特定蛋白及其擬似物之能力。藉此藝中多種標準方法可 測量其結合，包括酵宿免疫分析法（例，ELISA)、免疫印 赫分析法等；其例見於Sambrook et al·，ibid。一具體實施 例中’ CAF抗體較佳地以降低蛋白活性之方式而選擇地結 合至CAF蛋白，比如阻斷該蛋白與受體（即，cAf受體）、 另一蛋白或核酸分子之結合能力，或藉他法擾亂其作用機 理。 本發明之分離的抗體可包括血清，其所含者如抗體，或 受不同程度純化的抗體。本發明之抗體可爲多株或單株、 功能性等價物如抗體分量和經基因工程之抗體，包括單鏈 抗體或敗合性抗體，包括可與一個以上表位相結合的二特 異性抗體。 生產本發明之抗體的較佳方法包括（a)對動物投給本發明 之有效量的蛋白、胜肽或其擬似物，及（b)恢復該抗體。另 一具體實施例中，使用如迄今所揭露之生產本發明之CAF 蛋白的技術，以重組地生產本發明之抗體。抗體受激對抗 特定的蛋白或擬似物是有益的，因爲此種抗體並不受對抗 其他物質之抗體的實質上污染，其他物質會另外對於診斷 -50- 本紙張尺㈣用巾關家鮮(CNS)A4規格（210 x 297公釐） ------I — 111 --------訂- - ------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 1250164 五、發明說明（ 刀析、篩選分析、或若用於治療組成物中之副作用而引起 干擾。 本發明之另一具體實施例係關於含有本發明之細胞激素 活化因子之組成物。較佳地，組成物亦包括藥學可接受的 載劑，其已述於前。依據本發明，組成物包括含有本發明 之細胞激素活化因子之任一組成物（配方、產物），其中該 組成物中所存之CAF係爲純化的、重組地生產的、化學地 生產的、實質上純化的（即，與卵製品之其他組份相較，經 任何程度的純化而增其CAF量之任一高免疫卵）、或任何: 他CAF增冨的形式，特別是與無任何CAF選擇或選過程之 冋免疫卵相較（例，述於美國專利號5,772,999)。因此，本 發明之組成物並不涵括，相較於高免疫卵製品中caf均量 其未經選擇或篩選增富CAF者，及其未經任何其他增富 CAF含量之方法處理之卵製品。如此，組成物其包括之$ 疫卵製品所含本發明之CAF須經選擇、篩選、或生產爲^ 富者，比如藉由篩選免疫作用過程，以選擇高免疫的動物 和/或高免疫印製品，而其所含CAF量統計上顯著高於平均 高免疫即製品，·藉由篩選高免疫高免疫製品，使其相較於 高免疫即中CAF均量，具統計上顯著較高之caf含量；或 藉由增富CAF之高免疫卵製品（例，經分餘、純化、或以 源性C AF補充）。 因而’-具體實施例中’本發明之组成物係特別指向含 有兩免疫印及由其所產任一產物之组成物之生i，其係细 本發明之細胞激素活化因子增富的，並有助於免疫系統： -51 - 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 ---------------------訂 - ---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 1250164 A7 B7 五、發明說明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 調節。自然狀況下，此等食品可用以調節免疫系統而不需 擔心副作用，當然，除非是對卵不耐受者之過敏反應。較 佳地，高免疫卵係得自產卵動物，且其更佳者爲鳥類，其 以至少一種免疫原而經高免疫者。高免疫_製品可被選 擇、筛選或生產’而使其相較於以相同或不同免疫原所免 疫的相同品系產卵動物之高免疫卵中均量，具統計上顯著 較咼之CAF含量（例，ρ>〇·〇5)。高免疫卵製品最好如實例i 所述進一步分成富含CAF部份。 試舉其例，咼免疫卵製品之數個批量可被篩選而選擇其 即製品每乾重具最高水平細胞激素活化因子之高免疫印製 品者。再者，可監測高免疫作用過程以獲得細胞激素活化 因子之最大生產。偵測細胞激素活化因子之方法包括，但 不限於，產物中該因子之純化及量化，例如藉任一適於蛋 白純化及量化方法（示範的純化方法見實例段）。一具體實 施例中，高免疫卵製品中細胞激素活化因子之量，係使用 選擇地結合至該卵樣本中該蛋白的本發明之抗體來债測。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此外’可將該卵製品分餾並/或純化，以增富本發明之細 胞激素活化因子相對於該卵製品其他組份之存在，或相較 於初始卵製品中CAF之量，能增加最終產物中caf之量 (例，以重量計）。較佳地，餾分或純化產物中細胞激素活 化因子之量，相較於未經高免疫純化的食品中所存細胞激 素活化因子之量，係增富最少約5 %，更佳者爲最少約 1 0 %、更佳者爲最少約2 5 %、更佳者爲最少約5 〇 %、更佳 者爲最少約7 5 %、更佳者爲最少約1〇〇❶/❶。甚而更佳地，餾 52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） 1250164

五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 分或純化產物中細胞激素活化因子之量，相較於相較於初 始卵製中c AF之量，係增冨最少約2倍、更佳者爲最少約 3倍、更佳者爲最少約5倍、更佳者爲最少約1〇倍、更佳者 爲最少約50倍、更佳者爲最少約1〇〇倍、甚而更佳者爲最 V、’々500倍。一具體實施例中，本發明之細胞激素活化因 子係純化至實質上100%純度，故其可作爲實質上純的因子 被添加至此中所述之任一組成物。另一具體實施例中，本 發明 < 細胞激素活化因子係以重組方式或合成方式生產， 如此中別處所述。 產卵動物之高免疫作用過程係簡述於下。高免疫卵或卵 製品可由任何產卵動物所生產。較佳的產卵動物爲鳥綱之 一員，換言之爲鳥類。鳥綱之中，馴化的家禽較佳，但此 綱中其他成員，比如火難、鴨及鵝亦爲高免疫卵之適當來 源。 田 當藉由如週期性注射投給免疫原而將此等產卵動物帶至 免疫作用之特定狀態時，該動物將會產卵，當由某受試者 耗用時，該卵將具有益的性質，包括超常水平之細胞激素 活化因子，其能有效調節該受試者之免疫系統。 產即動物中僅只免疫敏感性之謗導是不足以引起即中細 胞激素活化因子之超常水平的表現，其所顯事實爲，桌即 不含此種超常水平，即便該等鳥類在對抗鳥類疾病之正常 免疫作用期間及在正常暴路於壤境因子期間内已經對抗多 種免疫原之敏感化。發明人發現只有在特定的高免疫作用 狀態中，其卵才具有欲求的超常水平之細胞激素活化因 -53· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} Μ ----« — — — — — — I— 1250164 A7 B7 五、發明說明（51 ) 子。 此種河免疫作用〈特定狀態，其中該_將具高水平之細 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 胞激素；ί：化因子，係較佳地藉由投給初始免疫作用，並隨 〈以足夠高劑量之特定免疫原或免疫原之混合物週期地追 加而達成。較佳的追加劑量應等於或大於該鳥類產生初級 Μ作用㈣劑量之5G%。如此，在低於某闕値時，在鳥 類中，不會產生Μ等性質，即便該鳥類已處於正常所謂免 疫狀態T。熟讀此藝者具有開發及維#高免疫狀態所要求 的知4，旎依據所用產卵動物之屬別與種系而改變所投給 免疫原之量，以維持該動物於高免疫狀態。進而言之，以 本發明所提供之CAF知識，免疫過程可另加修飾，比如增 加追加劑之次數或劑量、或選擇特定免疫原致使caf之生 產相較於未經暴露於此種選擇/篩選過程之平均高免疫卵是 增加的。 南免疫狀應係較佳地由免疫原或免疫之組合所生產。高 免疫作用係藉由多重暴露於多重免疫原、多重暴露於單一 免疫原、或單一暴露於免疫原之文庫。近乎任何免疫原都 可用於謗導咼免疫狀態，包括但不限於，細菌、病毒、原 生生物、過敏原、眞菌或細胞物質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 除了用自然發生免疫原之免疫作用外，亦可使用由組合 化學所合成地衍生的免疫原達成免疫作用。其基本策略爲 裝配化學建築模塊之多重組合以產生多樣性的分子群聚。 近來已有數種方法被開發有用寡聚物文庫（F〇(jor，s. et al.，

Science 251 : 767 (1991) ; Houghton，R· et al.，Nature 354 : -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 52 五、發明說明（） 82 (1991))以及小有機分子（Bunin，B & Ellman，J·，J. Am. Chem. Soc. 114 : 10997 (1992))之固相與溶液相之組合合 成。快速多重胜肽與寡聚物合成可作爲組合衍生免疫原之 來源。進而言之，替代策略可容許組合方式中有機建築模 塊至骨幹分子之加成作用而增進免疫原性。 產卵動物高免疫化之替代模式可用以代替免疫原性疫苗 並包括基因疫苗之使用。特別言之，任何DNA建構物（通常 由啓動區域與抗原編碼序列所組成）將觸發免疫反應。基因 疫苗所含抗原編碼載體、裸露DNA之分量、質量DNA、 DNA-RNA抗原、DNA-蛋白共軛物、DNA_脂體共軛物、 DNA表達文庫、及病毒與細菌DNA被傳遞以產生免疫反 應。DNA傳遞方法包括粒子轟擊、直接注射、病毒載體、 脂體和噴射注射，及其他。當應用這些傳遞方法時，可需 更小量且通常導致更持久的免疫原生產。當使用該等基因 過程，將DN A入導至鳥類的較佳方法係藉DN A之肌肉注射 至其胸肌。 DNA傳遞方法包括但不限於，粒子轟擊、直接注射、脂 體、噴射注射（Fynan，E.F. et al·，Proc· Natl. Acad. Sci· USA 90 : 11478· 11482 (1993 ))。編碼已知或未知免疫原、啓動 子區域（著名的CMV花椰菜鑲嵌病毒）及S V40細菌起點之核 酸，可在細菌中複製而生產用於DN A注射的質體DN A。雖 然數種DN A之非經腸投給途徑在難中是有效的，但較佳的 方法是對胸肌之肌肉注射。疫苗試驗係於產卵鳥類執行， 較佳者爲難。重複的免疫作用係以一至二週間隔給予，可 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨丨·丨—------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1250164 B7__ ^ , 53 五、發明說明（） 長至六個月。 較佳的DNA用量通常在直接注射爲50_300微克等級。用 於粒子轟擊時，藉添加2·5Μ CaCl2在金粒上共沉澱4_100__ 克DNA是較佳的。重複的免疫作用可藉此加速的〇ΝΑ包覆 粒子經皮給至活體動物。 用於將產卵動物帶至提高的免疫狀態所得最終的高免疫 即或卵製品而可投給受試者之較佳方法的詳細敘述係揭露 於美國專利號5,772,999並於此中併入完整文件作爲參照。 簡而言之，以下程序之範例係爲用於CAF純化之用途或爲 投給受試者之CAF增富食品之生產而將產卵動物帶至提高 的免疫狀態。應理解的是此一程序可修飾如討論於前者以 選擇或篩選增強的CAF生產。一般而言，該高免疫作用過 程所包括之步驟爲： 1·選擇一或多種抗原。 2 ·藉初級免疫作用引起產卵動物中免疫反應。 3 ·投給適當劑量之追加疫苗以謗導並維持高免疫狀態。 4 ·由維持在高免疫狀態之產卵動物收集並處理該卵以生產 高免疫卵製品。 步驟1可使用任何抗原或抗原之組合。抗原可爲細菌、病 毒、原生生物、眞菌、細胞、或任何其他物質而可使產即 動物免疫系統反應者。此步驟中重點爲該抗原必須能謗導 產卵動物中免疫與高免疫狀態。一較佳的疫苗爲多價細菌 抗原<混合物，係指涉爲系列1〇〇(s_1〇〇)疫苗（亦指涉爲 PL-10〇)。S_1〇〇疫苗中包括之細菌係列於美國專利號 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑽x 297公釐） --------訂---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 54 五、發明說明（ 5,772，"9(表1 )。此疫苗先前已述於美國專利號5，ι〇6,6ΐ8 與5,215,746並於此中併入完整文件作爲參照。另一使用上 較佳的疫苗爲EB-100E疫苗，其細節亦述於美國專利號 5,772,9"之實例1中。 步驟2疫田可爲死體或活體減毒疫苗且可藉任何引發免疫 反應之方法投給。其較佳者爲藉由經肌肉注射而投給抗原 I免疫作用。鳥類中用於注射之較佳肌肉爲胸肌。劑量較 佳地爲0.5-5毫克之抗原疫苗。其他可用的投給方法包括靜 脈注射、腹腔注射、直腸栓入或口服給藥。當DN A技術用 =高免疫作用過程，所需之量更少，通常爲1-1〇〇微克。 藉由熟叫免疫學之藝者所知之數種方法，可決定疫苗是否 引起產卵動物中免疫反應。該等實例包括酵素連結免疫吸 收刀析（ELIS A )、刺激性抗原之抗體的存在之測定、及被 設計以評價宿主免疫細胞反應抗原之能力的測定。謗導免 疫應達所需抗原之最小劑量係取決於所用接種程序，包括 所用杬原類型以及充作宿主之產卵動物的類型。 步驟3藉由在固定時間間隔重複追加投給適當劑量能較佳 地謗導並維持高免疫狀態。時間間隔較佳者係在六個月期 間中以二週爲間隔。然而，本質上追加給藥不會導致免疫 耐又〖生。亦可使用其他高免疫作用維持程序或程序之組 合’舉例如肌肉注射，於初級免疫作用，及靜脈注射於追 加庄射。其他程序包括同時投給微膠囊與液狀抗原、或肌 肉=射於初級免疫作用，及藉微膠囊方法以口服給藥或非 I腸給藥以追加劑量。初級高免疫作用之數種組合係爲熟 1------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 -57- Ϊ250164 五 、發明說明（ 55 此藝者所知。 ^驟4用於投給受試者或用於純化之高免疫卵可以多種方 式處理。其包括實質上由其本身(例，膠囊”所本 ”二之組成物之製備及投給受試者的食物中高免 或遵照此中他處所述之細胞激素活化因子之純 其他具體實施例中，本發明之組成物可包括純化的、重 、勺化于口成的、實質上純化的、或任何其他增富形式 之CAF，並與任何適當的藥學可接受的載劑相组合。依據 本發明之適當的藥學可接受的載劑包括以上所述之藥學可 接受的賦形劑、控制釋放媒劑、及藥學可接受的傳遞媒 劑。組成物可爲任何適於傳遞的劑型，包括但不限於，液 體、氣落膠、膠囊、錠劑、丸劑、散劑、凝膠及細粒。特 別適於非經腸給藥之CAF製劑包括無菌水性或非水性溶 液、懸浮液或乳液。非水性溶劑或媒劑之範例爲丙烯乙二 醇、聚乙晞乙二醇，蔬菜油如橄欖油及可注射的有機酯類 如油酸乙酯。 固體劑型中，CAF蛋白可與最少一種惰性稀釋劑如蔗 糖、乳糖或澱粉相掺合。此類劑型亦可包含，如爲正常實 作，惰性稀釋劑以外之附加物質。若爲膠囊、鍵劑、及丸 劑，該劑型亦可包含緩衝劑、pH敏感性聚合物、或其他緩 慢釋放封囊劑（即，控制釋放媒劑），其係典型地用作食物 與藥物產業中封囊組成物或任何其他控制釋放配方一… 與丸劑可另以腸衣被膜製備。 -58- 張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 訂 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 鍵劑 1250164

檠用、、，田胞激素活化因子之液體劑型包括藥學可接 :的乳液、落液、懸浮液、糖浆，劑、並含藥 惰性稀釋劑。除了惰性稀釋劑外，組成物亦可包括 濕關、錢、及料、及甜味劑。 7實施例中，組成物爲食品之型式。此具體實施例 一，就一方面而言，CAF增富卵、其任_caf增富分量、 ^度純化的CAF、重組CAF、和/或化學合成的㈤，被整 二入營養補充劑。雖然已知多種用於乾燥卵之方法，但喷 霧乾燥是較佳的方法。嘴霧乾燥印之過程係爲此藝所悉 :此種乾燥卵粉末，可以例如蛋白粉末、；舌力增進飲 料蛋白補充劑及任何其他營養性、運動員關聯的產品之 型式，併人飲料中。此外，㈣末可用於混合食材、活力 棒、糖果、餅乾等。本發明之CAF增富卵製品之較佳分量 包括’但不限於，液狀卵黃、液狀印白、粉狀卵黃、粉狀 卵白、和/或該高免疫卵製品之水溶性分量。 本發明i一具體實施例中，組成物可包括重組核酸分 子，其含有編碼此中所述於前之CAF蛋白（包括CAF之同源 物）與/或選擇地結合5 ρ Δ F疋A 4 4二μ ^ 比 -59 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------β---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 物）與/或選擇地結合至CAF蛋白之抗體的核酸序列 本發明之組成物可藉任何適當方法傳遞至細胞培養體（… 如在細胞激素分析中）或患者。此一方法之選擇將取決於被 投給或傳遞之化合物之類型（即，蛋白、核酸、擬似物）、 傳遞之模式（即，玻器内、活體内、活體外）及該化合物或 組成物之投給/傳遞欲達之目標。依據本發明，有效的給藥 準據（即，以有效的方式投給組成物）包含適當的劑量參數 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 五、發明說明（ 57 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 及投給模式’該模式可使組成物傳遞至欲求的位置（即，欲 求的細胞）與/或調控受試者之免疫反應。較佳地，可藉由 任何修飾受試動物中免疫系統之方法將本發明之組成物投 給雙試動物。 投藥途徑包括活體内、玻器内及活體外途徑。活體内途 技包括，但不限於，口服、鼻部、氣管内注射、吸入、經 皮、直腸、導尿管灌注、栓劑投給、直接注射至組織及非 經腸途徑。較佳的非經腸途徑可包括，但不限於、皮下、 皮内、靜脈内、肌肉内及腹膜内途徑。本發明之一具體實 =例中，含有本發明之CAF蛋白、抗體、擬似物、或核酸 分子之組成物係由非經腸途徑投給。靜脈内、腹膜内、皮 皮下及肌肉内給藥法可使用此藝中標準方法而達成。 氣溶膠（吸入法）傳遞法亦可使用此藝中標準方法而達成（其 例見於 Stribling et al·，Pr〇c Natl Sei· uSA 189 : 1127^ 11281，1992並於此中併入完整文件作爲參照）。另一且體 :施：中，含有本發明之CAF蛋白之組成物係以口服投 藉由將本發明之治療組成物與在動物腸中能抗消化酵 f降解之載劑相錯合而達成口服傳遞。應注意的是，本發 ，〈CAF蛋白係特別能抵抗消化酵素，因此，此-載劑可 =重要的。此類載劑之範例，包括塑性膠囊或錠劑，及 ^中所知者。此種途徑可包括上述的藥學可接受載劑之 以舌么外係指涉在患者外部執行部分調控步驟，比如 、、且刀子轉染由患者 、、 編碼本發明之“ Γ 群聚，孩重组分子含有 蛋白 < 核酸序列，在該重組分子隨後由受轉 60 ►裝------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — — — ¢. 本紙張尺度翻中關家彳 4規格（210 X 297公釐） 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 - --~~一_—瓜 _——— 五、發明說明（58 ) 染細胞所表達之條件下，並將該受轉染 細胞移回至患者。 —、、、成物彳又给佰主細胞之培養體的玻器内與活體外途徑可 藉以下万法完成，其包括但不限於，轉染法、轉型法、電 孔微注射法、脂染法、吸收法、原形融合法、蛋白攜 載W <使用、離子攜載劑之使用、用於細胞通透作用之清 潔劑心使用、及單純地在培養體中將化合物與靶細胞混合 (例，結合）。 二實施例中，已增富本發明之細胞激素活化因子並 自經南免疫動物所收集的高免疫即或其分f，係經處理而 生產高免疫卵製品，其能後續地投給受試動物。一具體實 施例中，可藉由直接對受試動物餵給該卵或其任何衍生物 以進仃給藥。應要注意的是，即爲天然食物成分爲其非毒 性及安全的。類似地，另一具體實施例中，實質上純化 的重組地生產的或合成地生產的細胞激素活化因子係以 旎夠後續投給動物之方式而較佳地製備。 當進行免疫系統之調節時，本發明之組成物係較佳地投 給焚試者，其用量在免疫學上有達成細胞激素（即，TNF 以、IL_ 10和/或^彳）表達的效果，及較佳地具細胞激素 活化作用和免疫調節作用。治療之期間與強度將取決於特 殊受試者及該受試者之是否存在的病況，若是，及受試者 病況之進展。組成物亦以能治療並/或預防該病況及該病況 之症狀之任一用量而供給。舉例言之，若投給caf增富高 免疫卵或由此生產之製品，可依該病況之特殊情勢，將$ 日用量範圍爲自少於一個至數個全卵的高免疫卵（或含有= -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) I 裝--------訂---------_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（9 ) 於一個至數個全卵之等價的高免疫卵製品）投給受試者。藉 此中所述方法及此藝中已知之其他方法，可將更有效能的 分量分離並濃縮。關於CAF增富高免疫卵或卵製品對受試 者之投藥，其給予受試者之高免疫卵或卵製品之較佳劑量 範圍係定於每公斤受試者體重1〇〇毫克至1〇公克間。 關於本發明之分離的細胞激素活化因子，包括高度純化 的CAF、重組CAF和/或化學合成的cAF，該高度純化的組 成物之較佳劑量範圍係定於每公斤受試者體重1毫微克與 400耄克間。較佳的具體實施例中，較佳劑量範圍係爲每 公斤受試者體重約0.01微克與約1〇〇毫克間。另一具體實施 例中，所投給蛋白或抗體之用量係爲每公斤患者體重約Q1 微克與100微克間。 當所傳遞的化合爲核酸分子時，適當的單一劑量是傳遞 每微克核能使母耄克整體組織蛋白表達出至少1微微克 蛋白。較佳適當的單一劑量是傳遞每微克核酸能使每毫克 整體組織蛋白表達出至少10微微克蛋白；更佳是傳遞每微 克核酸能使每毫克整體組織蛋白表達出至少50微微克蛋 白；及最佳是傳遞每微克核酸能使每毫克整體組織蛋白表 達出至少100微微克蛋白。裸露核酸疫苗之較佳單一劑量 範園爲自約1毫微克（ng)至約100微克，取決於投給途徑和 /或傳遞方法，其可由熟諳此藝者所決定。適當的傳遞方法 包括，舉例而言，藉由，氣溶膠化與/或局部用液滴之注射 法。一具體實施例中，純DNA建構物被覆於金粒表面（直徑 1至3微米）並以「基因槍」推進入皮膚細胞或肌肉中。對 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） " ------ ILI--------%裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1250164 B7 五、發明說明（Μ ) 患者所投給劑量之次數係取決於給藥之目標（例，受治療患 者個人之反應與疾病之程度），此對熟諳此藝者是明顯的。 因此’本發明之範圍中包含適當的劑量次數，其包括動物 中調控免疫反應、或調控疾病或狀況所需次數，該病況係 預期藉由原炎性細胞激素（TNF從、IL-ly5、IL_6)之上調 私與/或TGF卢之下调控。有效的活體内劑量參數可使用此 藝中標準方法而決定。此類方法包括，舉例而言，存活率 之決定、副作用（即，毒性）、細胞與體液免疫反應作用之 決定、及/或關於此種免疫反應作用在病況上的作用。 提供在動物中用於調節免疫反應之方法亦屬本發明之一 具體實施例。此具體實施例包括此中前述投給動物組成物 之步驟’該組成物含有本發明之細胞激素活化因子（CaF ) 蛋白。較佳的具體實施例中，該組成物含有藥學可接受的 載劑，如之前此中所述。此具體實施例中，本發明之組成 物可充作免疫系統之局邵或全身性刺激劑。其亦可預防並/ 或治療局部性與全身性細菌感染，且能充爲一般抗癌劑。 其亦可以特定傳遞試劑如組織特異性抗體而籤記，以便經 由靜脈内途徑傳遞至細菌感染或腫瘤形成之特定部位。其 亦可與可講得的特異性脂體或傳遞媒劑相混合，以便將其 經由細胞之細胞質與核膜傳遞，而因此促進在rNa水平 TNF從、IL - 1 >5、與/或IL 6表達之調控。適當的投給模 式，包括較佳的途徑與劑量，已述於前。較佳地，將本發 明之組成物對動物投給之劑量與途徑係藉增加TNF a、IL-1/?、與/或IL · 6表達且/或籍減低TGF/?表達而適於調控免 -63 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I,------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 五、發明說明（61 ) 疫反應。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之一具體實施例係關於動物中治療癌症之方法， 包含對具或爲發展中癌症危險之動物投給含有本發明之細 胞激素活化因子（CAF)蛋白之組成物。投藥之方法及該組 成物之細節已於前詳述。較佳地，投給該組成物能產生選 自以下所組之群的結果：癌病症狀之減輕、與癌症關連腫 瘤之減小、與癌症關連腫瘤之減除、轉移性癌症之預防、 癌症之預防及對抗癌症之致效細胞免疫性之刺激。 本發明尚有一具體實施例係關於動物中敗血病及/或敗血 性休克之治療或預防方法。此方法所包括之步驟爲對具或 發展中敗血病或敗血性休克危險之動物投給含有本發明之 細胞激素活化因子（CAF)蛋白之組成物。投藥之方法及該 組成物之細節已於前詳述。較佳地，投給該組成物能產生 選自以下所組之群的結果：敗血病或敗血性休克症狀之減 輕、敗血病或敗血性休克之預防及對抗敗血病或敗血性休 克相關聯之細菌抗原之致效細胞免疫性之刺激。 本發明之有益性質可參照以下證明本發明之實例而得 見。這些實例係供爲證明之目的且無意限制本發明之範 圍。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實例 實例1 以下實例證明本發明之細胞激素活化因子（CAF)之純 化、分離及定序。 細胞激素活化因子之純化 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 A7 B7 五、發明說明（ 62 C AF純化之總體概要 CAF最初係以七步驟自PL - 100純化600,000倍（圖1 6)， 且其在HPLC色譜上顯示爲同源性組份。CAF純化所經過程 係經由細胞激素分析（後述）藉分量分析CAF玻器内生物活 性而追蹤。第一步驟中全卵分出卵黃。該卵黃經脱脂作用 後，使用超過濾技術將CAF濃縮成3,000道耳呑（或更小）之 通透分量。應注意的是，由於在二級結構容許下（即，實質 上線狀的多肽/蛋白）顯著較大蛋白可通過濾器，故3000道 耳呑切除爲約略値。將通過3,000 MW切除過濾器之通透物 以Q Sepharose色譜而進一步分離。CAF似爲強負電性分 子，其與Q Sepharose管柱緊密地結合，並可用0.3M NaCl 洗提。次一步驟中，使用固相萃取法移除大量的NaCl。此 步驟亦藉移除其他更具極性組份而增加CAF之純化作用。 SPE之CAF活性分量含有水不溶性組份，由乙酸乙g旨及乙 醇所萃取，所餘者爲CAF之水溶性分量。最後，以逆相C18 HPLC與凝膠過濾HPLC將CAF分離至同源性組份。CAF純 化作用之總體產出估計爲約20%。全卵中CAF之量經計算 爲 3 - 5 ppm (表 1 ) 〇 表1 C AF純化作用表 步驟 機理_ 純化作用(倍） 產出(克) 全卵 1 100,000 卵黃 分量 2 50,000 65 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項

填 本 頁 訂 f 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（63 ) 3K過濾 尺寸 40 1，000 Q Sepharose 電荷 30 30 固相萃取 去鹽 8 2 分部萃取 分量 2 0.8 Ci8 HPLC 極性 3 0.2 _5释過濾 尺寸 5 0.02 〜600,000 純化過程之個別步驟更特別地敘述如下。 卵黃脱脂作用 噴霧乾燥的PL-100卵黃含有脂質、蛋白質、碳水化合 物、灰分、及許多生物因子，包括CAF。對卵黃施以辛酸 相萃取再加以離心，可移除脂質與水不溶性蛋白。水相中 可得CAF與其他水溶性組份。 用於P L - 100卵黃之脱脂緩衝劑之製備係將3 〇毫升冰醋 酸與100毫升辛酸溶於9公升超純水中。該缓衝劑之pH爲約 5.0。將卵黃材料加入緩衝劑中，並以24,000每分轉數在室 溫下摻合5分鐘使該混合物進一步均質化。將泡沫移除後 再另外將2 0毫升辛酸加入混合物中以補充辛酸。將該即混 合物保留在室溫下超過2小時使其能相分離。將凝聚物移 除，並將該卵混合物之水相在室溫下以2,190 X g離心2 〇分 鐘。將卵黃之表液以Whatman濾、紙（113 V，4 0 " m)過滤。 將該表液以2.0MNaOH調整至7.5。 卵黃3,000道耳吞分子量通透物之製備 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） II--------I I - I------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 Α7 Β7 五、發明說明（64 ) 脱脂的卵黃表液含有水溶性蛋白質及C AF。C AF可藉超 過滤方法由大分子量組份分離。此製備過程中，將卵黃表 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 液倒入22公升與過濾單元（3K MWCO, Amicon Model CH2 口即筒箱及Spiral Cartridge Adapter套件）相接的容器。在過 濾器入口及出口兩處之唧筒壓力保持在約3〇 psi。將具明 顯小於約3，0〇〇道耳呑分子量之組份（基於其通過3〇〇〇遒耳 呑切除過濾器之能力）收集爲通透物並凍乾使其乾燥而能儲 存’或冷凍後進一步用於CAF純化。所得約2 %之全即黃爲 3,000道耳呑通透物（此中亦指涉爲「3K通透物」）。追縱 CAF蛋白之存在能決定對抗TNF汉與IL- 1 之生物活性玻 器内分析（圖1與2)。並以膠原蛋白Π所謗導關節炎和氣囊 動物分析測試卵黃之3,000道耳呑M W通透物（數據未示 出）。以逆相C丨8 HPLC分析該3 Κ通透物以作純度決定（圖 3) ° Q Sepharose離子交換色譜 將3,000道耳呑通透物中CAF以陰離子Q Sepharose色譜法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 進一步純化。3,000道耳吞通透物之大半組份爲具正電荷之 分子’且其不與Q Sepharose結合。然而，此實例中，發現 到結合在Q Sepharose上之CAF係爲具有強負電荷之分子。 以Q Sepharose進行CAF之純化是非常有效率的方法。設定 Q Sepharose管柱，要用1，〇〇〇毫升dH20將2,000亳升Q Sepharose稀釋，並載至玻璃管柱（8x40公分）。内徑對長度 之比率爲1 : 5。色譜程序係在室溫下執行。以ρ η 7 5、流 速2,5 00毫升/小時4,000毫升水與8,000毫升20毫莫耳濃度 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（） 醋酸銨使管柱平衡。將20-3 0公升3,000道耳呑通透物以 1，5〇〇宅升/小時之流速用於q sepharose管柱。使用以下緩 衝劑在流速2,000毫升/小時以逐步洗提法將q sepharose洗 膝：（1)4,000毫升20毫莫耳濃渡醋酸銨，pH 7.5，用於洗 捺管柱及洗提任何未結合的分子；（2)4,〇〇〇毫升3〇〇毫莫耳 濃度醋酸銨，pH 6.5，用於洗提部分弱結合的分子；（3 ) 4,000毫升0.3莫耳濃度MaCl用於洗提CAF及其他分子；（4) 4,000毫升1.5莫耳濃度NaCl用於洗提更緊密結合的分子及 用於再生Q Sepharose管柱。在1，200毫升洗提劑後將〇.3莫 耳濃度NaCl部分收集於燒瓶中。爲進一步純化CAF，將0.3 莫耳濃度NaCl邵分進行固相萃取。決定出對抗tnf從與 IL _ 1 之生物活性玻器内分析（圖4 )。並以逆相c i 8 HPLC 分析該3,000道耳呑MW通透物（圖5)。 固相萃取（SPE) 取自Q Sepharose之0_3 M NaCl分量含CAF及多量鹽類。 引用固相萃取（SPE )方法以移除該鹽類並增加CAF純度。 固相萃取對液/液萃取而言爲方便、不貴、省時的選擇。此 種方法通常用於分析或分離目的上化合物之清潔與濃縮。 爲增加SPE上CAF之結合，將Q Sepharose分量以三氣醋酸 調整至pH 2.0。以交互作用條件對酸性分量在管柱中（5 χ 2 2公分）施以逆相C 1 s樹脂。在室溫下以40¾升/分之流速 將Q Sepharose分量載於SPE管柱。以254毫微米波長監測色 譜。CAF與其他組份被保留在充塞材料上且污染物大多通 過該管柱。將管柱用pH 2.0、800毫升水與pH 2.0、15〇/。 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） I.------------1------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ,66 五、發明說明（） 乙腈溶於水1，200毫升洗滌。保留在充塞管柱上之caf與其 他組份係以p Η 2.0、1〇〇 %乙腈洗滌（圖6 )。收集到小量的 CAF分量（亦指涉爲SPE分量）。將高度純化的CAF凍乾至乾 燥而適於進一步純化。決定出對抗TNF α與IL - 1 之生物 活性玻器内分析（圖7 )。並以逆相c i 8 HPLC分析該SPE分 量（圖8 )。 固相萃取分量之分部萃取 _弟一为邵萃取步驟（圖16) : Q Sepharose管柱之固相萃取 分量顯示出含有水不溶性組份（即，溶劑可溶性分量）。此 組份係藉以酸乙酯與乙醇萃取，而在水溶性分量中（即， SPE水落性分量）留下CAF。簡而言之，將1〇〇毫克固相萃 取分量加至10毫升乙酸乙酯並置於室溫下2〇分鐘。將混合 物移至玻璃離心管並以2,190 X g旋轉20分鐘。離心後可得 白色丸塊（SPE水溶性分量）。將乙酸乙酯移除並再次加入 10毫升乙酸乙酯以重複該步驟。其後，將5 〇毫升乙醇與 該丸塊混合並以2,190 X g離心20分鐘。 SPE水溶性分量顯示出動物關節炎模式中炎性反應之抑 制作用。破器内分析中，SPE水溶性分量（旋轉後之白色丸 塊）顯示能刺激THP1細胞中TNF α與IL-1 /?。對比而言， SPE水不;j性分量並不在玻器内分析中顯示出此種活性。 —一分邵萃取步驟（圖16):以5_0毫升20毫莫耳濃度 NH40Ac溶於含20%乙腈之水、pH 7 〇，進一步洗滌spE水 溶性分量，並以2，l9〇xg旋轉20分鐘。在中性pH，具有水 溶性分量（圖16，中性pH WSF)與水不溶性分量。將水溶 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） I. --------------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（） 性分量（在中性p Η )凍乾至乾燥而適於後述預備的HPLC之 CAF純化。雖然此中性ρΗ水不溶性分量實作上在中性pH 不溶於水，本發明人發現其在低pH係可溶於水，可因此指 涉爲酸性p Η水溶性分量。在酸性ρ η WSF中可確認對抗 TNF泛與IL _ 1冷之C AF生物活性玻器内分析（圖9)，並以逆 相C i 8 HPLC (圖1 〇 )進一步分析此CAF活性分量（即，圖 16 ’酸性pH WSF)。由於SPE水溶性分量（經旋轉之丸塊） 可溶於含0.1 %TFA、pH 2.0之水或於具高pH 12.0之水 中，但在pH 7.0之水中卻只具弱的水溶性（1 〇毫克/毫 升），這提示了可由胜肽中常見之胺基團及羧酸基團來處理 SPE水溶性分量。 C18 HPLC 分離 固相萃取之酸性p Η水溶性分量可見含有單一組份，其係 顯示於HPLC色譜（圖η)。此單一尖峰在前述細胞激素謗 導研究中被鑑別爲具CAF活性。以逆相C i 8 HPLC進一步將 此CAF增富分量分離爲三組份。此分離中使用shimadzu HPLC單元。其裝配了 SPD-M10A VP二極陣列偵測器、LC-6 AD液體色譜、SCL-10A VP除氣器、LPN-600低壓混合 器、及CTO-10A VP管柱爐。在具〇.1〇/0 TFA純水中將酸性 pH水溶性分量製備爲〗·〇毫克/毫升。在29°下以12.0毫升 /分之流速將3.0毫升樣本施於BTR IMPAQ C18管柱（1〇微 米，22x250亳米）。將20%-100%甲純以線性梯度溶於含 0_ 1 %三氟醋酸（TFA)之水充作移動相。將直接參照前述之 三分量收集而用於C AF分離。其係命名爲：C AF 〇、 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------*-----^^裂--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 v 68 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) C AF a、及C AF b。將分量中乙腈以旋轉蒸除法移除，並將 水份凍乾。含有HPLC色譜上所鑑別單一尖峰之分量CAF b (47分鐘-49.5分鐘）因而定出（圖12)。此分量亦顯示在玻 器内分析中之TNF沒與IL -1卢活性，指出C AF已備純化爲 CAFb之同源性組份（圖13)。 凝膠過濾HPLC分離 取自上述SPE與C i 8 HPLC步驟之多種分量之進一步純 化，係在上述Shimadzu HPLC設備中使用凝膠過濾HPLC而 進行。簡而言之，將樣品在流動條件下（緩衝劑：5 0毫莫 耳濃度 NH4OAc，pH 8.0。流速：1.0 毫升/分，20°C，20 分鐘）載於凝膠過濾HPLC管柱（250 X 9.4毫米，Zorbox GF-250 Bio系列）。將樣品溶於少於1.0毫克/毫升之流動緩衝 劑，並在每次執行時注射3 0微升。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 SPE水溶性分量：將SPE水溶性分量以少於1.0毫克/毫升 部分溶解於pH 8.0、50毫莫耳濃度NH4OAc。簡而言之， 將1 〇毫克SPE水溶性分量與缓衝劑混合。經10,000 rpm旋 轉5分鐘後收集表液。然後將丸塊再此與緩衝劑混合。將 第一表液施以GF250 HPLC管柱以決定分子質量。在GF250 管柱分離上具有三個主要分量。其爲530,000 〇&、122,000 Da、和1，240 Da。收集此三分量並;東乾至乾燥以便細胞激 素分析。530,000 Da與122,000 Da分子量能溶於第一溶離缓 衝劑中，且其不見於第二溶離緩衝劑。然而，1，240 Da尖 峰更能溶於第二溶離缓衝劑，指出了藉由在緩衝劑中溶離 1.0毫克SPE水溶性分量可將530,000 Da與122,000 Da大量 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 _ B7 五、發明說明（） 地移除。所剩的非溶離丸塊（即，SPE-GFII)實際上係爲具 l，240 Da分子量之極純化合物。 CAFb分量=將取自C18 HPLC分離作用之CAFb分量施於 凝膠過濾HPLC管柱（GF250)以測其分子量。發現到在GF 250 管柱上具有各爲 530,000 Da、122,000 Da、和40,000 Da 之三個主要分量。可藉2-巯乙醇與煮沸將530,000 Da與 122.000 Da分子量縮減爲700,000 Da之大型分子，指出了藉 由改變氧化還原條件可發生凝集作用。 gAFo、CAFa、CAFb :分析 CAF 〇、cAF a 與 CAFb 以比 較取自GF 250 HPLC管柱上酸性pH WSF之全部細胞激素陽 性CAF分量之分子量。CAFa在7.27分（分子量530,000 Da) 與8.391分（分子量122,000 Da)具有二尖锋。如以上討論， 匸八尸1)具有另一在9.483分（40,000 0乱）之尖峰。530,000 0與 122.000 Da之分子可縮減爲700,000 Da之分子，其類似於 SPE水溶性分量中所見者。然而，CAFb之獨特的40,000 Da 分量在還原條件下是安定的（表2 )。不受理論所限，這提示 了 CAFb之分子量40,000 Da之分子仍具有CAF之活性部 位，其可自活性CAF之較小分子凝集。由GF-250 HPLC所 分離的CAFb分量111(圖16)(分子量4〇,0〇0 Da)係命名爲 CAFb-GFII 〇 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------*—I —I----訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7_ 70 五、發明說明（） 表2 自HPLC C18管柱之CAF分量之比較 CAF 細胞激素分析 HPLC CF250 尖峰 TNF a IL-ly5 (分鐘） CAFo 8.621* CAFa - - 7.270* 8.391* CAFb + + 7.040* 8.621* 9.483** (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *此尖峰可被縮減爲大型分子（〜7.000分） * *此化合物在還原條件下是安定的。 SPE-GF II : SPE水萃取之表液亦以GF-250 HPLC分析。 吾人發現HPLC色譜上的二個尖峰（8.40分和12.22分）。該 二尖峰之分子量爲各約120,000 Da與2,000 Da。2,000 Da之 分子可見於C AF 〇、C AF a與C AF b，表示其爲不同的化合 物。其係命名爲SPE-GFII。 分量之生物活性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如上所述，整個純化過程，玻器内細胞激素活性（TNF α 與/或IL- 1 之謗導作用之測量）係用以監測純化過程並選 擇活性分量。多數實驗中，決定出SPE水溶性分量具有強 的CAF細胞激素活化活性。令人驚訝地，高度純化的CAFb 較SPE水溶性分量並不顯示強的或更佳的活性。不拘限於 理論，此指出了 CAFb在後續的純化過程中其型式已有改 變，且其對細胞激素之活性隨凝集作用之過程而減少。 CAF分量之特性描述 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 A7 B7 71 五、發明說明（）

分析性C18 HPLC (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將含CAF之分量以逆相高效液體色譜儀（HPLC) (Shimadzu 單元，SPD-M10A VP 二極陣列偵測器、LC-6 AD液體色譜、SCL-10A VP除氣器、LPN-600低壓混合 器、及CTO-lOA VP管柱爐）進行分析。將所有的分量在純 水中製備爲5.0毫克/毫升，並經0.2微米過濾單元過濾。將 每一樣品取20微升，在29 °C以1.0毫升/分鐘之速度，施用 於水對稱C! 8管柱（3.9 X 150毫米）。將0%_60%乙腈以線性 梯度溶於含0.1%三氟醋酸（TFA)之水充作移動相。 圖3顯示出取自脱脂PL - 100卵黃之3,000道耳呑分子量通 透物之分離作用的Max plot色譜。藉由使用同樣的分析條 件，亦可得上述純化步驟之後續分量（圖5、8、1 0及1 2 )。 C AF結構分析 蛋白聚醯基醯胺凝膠電泳（PAGE ) 使用SDS PAGE決定CAFb之分子量。結果顯示出CAFb爲 具約6,670 Da分子量之小型胜肽。然而，由於SDS PAGE之 可變性，使用SDS PAGE之CAFb分子量並不被視爲正確數 値，而僅爲分子量之估計値。 質譜（MS) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將SPE水溶性分量溶離於酸性水中（酸性p H WSF )並施於 逆相C18 HPLC預備管柱而行CAF分離。收集到三分量。其 係CAFo、CAFa、和CAFb。活性CAFb分量在玻器内分析 中刺激了 TNF α與IL · 1 活性。以質譜研究C AF b而決定 分子量。ESI-MS之結果顯示CAFb爲具15,500 Da分子量之 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（72) 蛋白。該CAF b分量之大分子量分子可肇因於純化過程中之 自然分子凝集作用，其發生可為去鹽之結果。 紅外光譜（IR) 紅外光譜結果顯示CAF b為具乳蛋白類似模式之酪蛋白之 多肽（圖1 4 )。IR結果亦證明C AF b為純化合物。 N端胺基酸序列 使用裝備HP G1314A可變波長偵測器之增強Hewlett-Packard G1005A N端定序器，以執行N端胺基酸定列。所 用技術對範圍自次微微莫耳至毫微莫耳水平之樣品能有效 率執行。決定出CAFb-GFII與SPE-GFII之N端胺基酸序 列。 CAFb 簡言之，將CAFb溶離於50微升水加50微升8M GuHCl。 使用Hewlett-Packard載入準據將約5 0微升樣品載於逆相樣 品管柱。以1毫升2% TFA洗滌樣品匣。初始定序中，主要 N端序列是非常顯著的3 0胺基酸之序列，且此中係以SEQ ID NO : 1代表。CAFb-GFII中亦決定出二次要序列，除了 喪失一和二N端殘基外，其係相同於主要序列（各指定為 SEQ ID NO : 2與SEQ ID NO : 3 )。初始序列數據顯示於 下：

CAFb-GFII 900 微微莫耳 H2N-AGSSHEVVPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISR (SEQ ID NO ： 1)

90 微微莫耳 H2N-s.hev.psl.qt..egsi.qly(a)gpl(s)r.n (SEQ ID -75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -lr.------------•裝------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂：--------1. A7 1250164 _____B7_ 五、發明說明（73 ) NO : 2)

90微微莫耳H2N-…hev.psl.·t…·s..q.…p(SEQIDNO:3) 隨後得到的附加序列，並決定出7 〇胺基酸多肽，此中以 SEQ ID NO : 6代表，咸信其代表全長CAFb蛋白： CAFb-GFII

900微微莫！h2N-AGS SHEWPSLLQTLLEGSIEQLYAGPISR

YNVDEMTSAALAEKKCIDELPPXHLKALVNLXKQIRTEA (SEQ ID NO ： 6) CAFb顯露為7 〇胺基酸之多肽，且CAFb之分子量經計算 為8,839 Da，如表3所顯示。由於在序列位置54與63之不 確定性，主要序列（SEQ ID NO : 6 )在這些位置並不被確仏 地指定。此多肽可為二聚物並形成15,〇〇〇 Da蛋白’如㊆邊 (M S )研究中所見者。該序列數據亦提示了初始CAFb在細 胞代謝過程之免疫作用中可被蛋白分解至小裂活性胜肤^ 出現在卵黃中之小型CAFb在純化過程中可凝集為大猶刀 子。 可知熟悉此藝者，使用基因碼與其中簡併之說明，將犯

夠推演出編碼SEQ ID NO : 6之核酸序列°編碼SEQ & 4 β。應理解 Ν Ο : 6之所有核酸序列係經本發明思慮並G各 者為，現在已知CAF蛋白之胺基酸序列，熟諳此藝奢使： 此藝中悉知之技術，已能夠鑑別、選殖並定序虜、爲’、、、、某 蛋白之核酸分子。舉例言之，熟悉此藝者可基於CAF妝、 酸序列製作簡併引子並由適當的文庫或其他合適的來”、 ______-76- ^ __^^ -- ' 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） —1----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 B7 74 五、發明說明（) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 聚合酶鏈反應擴增該核酸序列之全部或一部。藉由製備探 針與篩選cDNA文庫，例如視需要而用全長分子，可執行該 核酸分子之額外選殖。核酸定序技術係爲熟諳此藝者所悉 知0 表3 CAFb分子量之計算

位置 字母 胺基酸 分子量(道耳呑） R基團 1 A 丙胺酸 89 NP 2 G 甘胺酸 75 P 3 S 絲胺酸 105 P 4 S 絲胺酸 105 P 5 Η 組胺酸 155 PC 6 Ε 麵胺酸 147 NC 7 V 纈胺酸 117 NP 8 V 纈胺酸 117 NP 9 Ρ 脯胺酸 115 NP 10 S 絲胺酸 105 Ρ 11 L 白胺酸 131 NP 12 L 白胺酸 131 NP 13 Q 麩醯胺酸 146 P 14 T 穌胺酸 119 P 15 L 白胺酸 131 NP 16 L 白胺酸 131 NP 17 E 麩胺酸 147 NC 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 751250164 A7 B7 五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

18 G 甘胺酸 75 P 19 S 絲胺酸 105 P 20 I 異白胺酸 131 NP 21 E 麩胺酸 147 NC 22 Q 麩醯胺酸 146 P 23 L 白胺酸 131 NP 24 Y 酪胺酸 181 P 25 A 丙胺酸 89 NP 26 G 甘胺酸 75 P 27 P 脯胺酸 115 NP 28 I 異白胺酸 131 NP 29 S 絲胺酸 105 P 30 R 精胺酸 174 PC 31 Y 酪胺酸 181 P 32 N 天冬醯胺酸 132 P 33 V 纈胺酸 117 NP 34 D 天冬胺酸 133 NC 35 E 麩胺酸 147 NC 36 Μ 甲硫胺酸 149 NP 37 Τ 穌胺酸 119 P 38 S 絲胺酸 105 P 39 A 丙胺酸 89 NP 40 A 丙胺酸 89 NP 41 L 白胺酸 131 NP -78- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----I---訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 76 —1250164 A7 B7 五、發明說明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

42 A 丙胺酸 89 NP 43 E 麩胺酸 147 NC 44 L 白胺酸 131 NP 45 K 離胺酸 146 PC 46 K 離胺酸 146 PC 47 C 半胱胺酸 121 P 48 I 異白胺酸 131 NP 49 D 天冬胺酸 133 NC 50 E 麩胺酸 147 NC 51 L 白胺酸 131 NP 52 P 脯胺酸 115 NP 53 P 脯胺酸 115 NP 54 X 靜默殘基 120 55 Η 組胺酸 155 PC 56 L 白胺酸 131 NP 57 K 離胺酸 146 PC 58 A 丙胺酸 89 NP 59 L 白胺酸 131 NP 60 V 纈胺酸 117 NP 61 N 天冬醯胺酸 132 P 62 L 白胺酸 131 NP 63 X 靜默殘基 120 64 K 離胺酸 146 PC 65 Q 麩醯胺酸 146 P -79- 裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂：丨-------§. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 77 五、發明說明（） 66 I 異白胺酸 131 NP 67 R 精胺酸 174 PC 68 T 穌胺酸 119 P 69 E 越胺酸 147 NC 70 A 丙胺酸 89 NP 8839 P二極性不帶電 N P二非極性 PC=帶正電 NC =帶負電 CAFb之計算分子量近乎8,839 Da。

SPE-GFII SPE-GFII亦由N端定序。自循環1 〇開始可見其數據清楚 顯示此樣品中具二主要序列。一序列在此以SEQ ID NO : 4 代表，係鑑別爲已知之難卵黃生成素II前驅物之分量。其x 指示了某些醣醯化作用之發生位置。 SPE-GFII H2N-AViENLKARXxVSxNxIxTFNqVxFxYSMPA (SEQ ID NO ： 4) 藉由NIH所提供BLAST數據庫（進階BLAST、BLASTp、 nr、Expect= 10、Filtered)將該胜肽序列與其他已知序列比 較。 數據庫中同源性檢索 在CAF b - GFII之7 0胺基酸（SEQ ID NO : 6 )的相似性檢索 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） J----------裳--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 78 五、發明說明（） 中’比較了 518,3 13蛋白序列及162,653,948字母。結果顯示 了此CAF b - GFII分量爲一獨特序列，沒有一個相同的序列 對其具有任何顯著的同源性。對CAF具有最接近相同性之 蛋白’爲一可能的配位子結合蛋白RYD5之胺基酸序列，其 係分離自挪威大鼠（存取號S17449)。此94胺基酸蛋白質， 在SEQ ID NO : 6之1 6 6胺基酸殘基上，係5 1 %相同於SEQ ID NO : 6。該二序列所共享的最長連續序列上胺基酸有 五。該可能的配位子結合蛋白rYD5之功能似爲挪威大鼠嗅 鼠覺黏膜次區域中之配位子結合蛋白。因此，咸信本發明 心CAF與RYD5蛋白在結構及功能上並無相關。 SPE-GFII亦於BLAST數據庫中檢索。其經確認爲雞卵黃 生成素II前驅物（SEQ ID NO : 5)在1572至1602位置之經修 飾分量（圖1 5 )。藉對CAF所假設的相同現象，SPE-GFII之 尺寸可隨降解作用與凝集作用之過程而改變。卵黃生成素 II前驅物對許多分化過程中包括細胞激素之蛋白，是重要 的蛋白。經修飾的卵黃生成素11前驅物分量亦能在抗炎作 用之功能中扮演角色。 實例2 以下實例證明細胞激素活化因子（CAF)對細胞激素概徵 與活化作用之效果。 細胞激素分析係執行如下。 細胞之刺激作用 將人類THP 1細胞（巨嗟細胞/單核球起源）洗條，並以含 不同卵刀里之10¾升典血清RPMI培養基中有工X 1〇6細胞之 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公餐） · 1 meme ϋ ϋ ·ϋ ϋ ϋ^^ ϋ I — 1 Βϋ ·ϋ ϋ I — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 79 五、發明說明（）

密度，置於2 5毫升燒瓶中。使細胞該於潮濕c〇2培釀器中 生長4小時，而後將其拆碎並收集於5 0毫升離心管中。以 400 X g離心1 0分鐘使該細胞成爲丸塊，並溶解於750微升 TRIzol試劑（Gibco BRL)，再用於下述全體RNA之萃取。 自經處理細胞萃取RNA 依據TRIzol試劑準據（Gibco BRL)執行自PBL細胞丸塊中 萃取全體RNA。以紫外光分光光度計定量所萃取之全體 RNA，並於TBE緩衝劑中在1.0%瓊脂糖凝膠上分析288與 1 8 s帶以決定該製劑之品質。

自全體RNA合成cDNA 使用 RT-PCR 所用 cDNA Cycle® 套件（InVitrogen， Carlsbad，CA)，自每一樣品之5微克全體RNA合成第一股 cDNA。爲比較之目的，將使用泛蛋白性GAPDH mRNA以 半測數每一 cDNA製劑。 圖1 7描繪出經部分純化之多種卵分量處理的細胞之細胞 激素概徵。以P L - 100卵之3 k分量（2毫克/毫升）處理的細 胞，相較於以桌卵之3K分量處理者，其腫瘤壞死因子-從 (TNF-泛）之表達水平較高。同樣地，相較於桌卵，pL· 100中之較小範圍内，其介白素_ ii）水平較高。 使用3 k分量之本分析中，在這些細胞中並無可偵測的介白 素-6(IL-6)或介白素-10(IL_1〇)之謗導作用。應注意的 是’使用高純度CAFb之後續分析中，清楚地偵測到il-6 之謗導作用。PL-1〇〇全卵（1 〇毫克/毫升）中tnF_ π之水平 較桌卵中者略高，但其濃度較3k分量者更高。 • 82 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 裝！！ 丨訂------丨 — · ^11^· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（） 藉高免疫卵3k分量之TNF -泛活化作用之動力學 圖18描縿出藉PL-100卵黃之3k分量在ΤΗΡ_ 1細胞中之 TNF· α活化作用之動力學。藉PL_1〇〇 3k分量對TNF_ q 之謗導作用。在3 0分鐘後開始，在2小時達尖峰，其後掉 落並在8小時後到達基線水平。藉桌卵3 k分量對tnf 之 謗導作用係相等或略南於細胞中所見之正常水平。 THP - 1細胞内藉高免疫卵純化分量對分化之謗導作用 THP · 1細胞’其起源爲人類細胞之單核球/巨嗤細胞，受 衍自高免疫卵黃之3k分量處理，經分化作用而轉型。正常 而言’這些細胞在懸浮液中成簇生長且不接附於塑膠表 面。然而，在含有高免疫卵（此後指涉爲p L _ 100 ) 3 k分量之 無血清培養基中生長時，其分化爲纖維母細胞樣細胞並接 附於塑膠表面。以離子交換管柱（q Sepharose)進一步純化 並以200毫莫耳濃度氣化鈉洗提之3 k分量，在更低濃度下 (0.01耄克/ *升）引起THP - 1細胞分化。文獻中有數篇報告 提及TNF·以、IL-1從及IL-1卢之生產係關聯於單核球/巨 禮細胞起源細胞之抗增殖作用與分化作用。 藉CAF b之細胞激素表達之謗導作用 使用述於實例1之SPE水溶性分量與高純度CAFb分量以· 執行前述之細胞激素分析。圖1 9證明SPE水溶性分量與 C AF b製劑兩者會謗導TNF -從、IL-ly5及IL·6之表達作 用0 藉CAF b之TCJF /3之抑制作用 使用述於實例1之SPE水溶性分量與高純度CAFb分量以 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ϋ ammK 一 δ, a _1 ϋ ϋ I I I (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 ^_I___ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（ 81 執行前述之細胞激素分析。圖2 〇證明caF b而非SPE水溶性 分量’會抑制轉型生長因子0 (TGf a )之謗導作用。 已詳述本發明之多種具體實施例，顯然熟諳此藝者矸就 此等具體實施例進行修飾和改作。然而，吾人應明確理 解’此等修飾或改作皆屬本發明之範園，如以下申請專利 範圍爲中所提出者。 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） · I 1_ ϋ· >1 i_i (請先閱讀背面之涑意事頊存填寫本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250164 A7 _B7_ 五—·月說明（） <400> 2

Ser Xaa -His Glu Val Xaa Pro Ser Leu Xaa Gin Thr Xaa Xaa Glu Gly 1 5 10 -15

Ser lie Xaa Gin Leu Tyr Ala Gly Pro lie Ser Arg Xaa Asn 20 25 30 <210> 3 <211> 26 <212〉 PRT ^ <213> Gallus gallus <400〉 3

Xaa Xaa Xaa His Glu Val Xaa Pro Ser Leu Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Ser Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Pro 20 25 <210〉 4 <211> 31 .

<212〉 PRT <213〉 Gallus gallus <400〉 4 ,

Ala Val lie Glu Asn Leu Lys Ala Arg Xaa Xaa Val Ser Xaa Asn Xaa 1 5 10 - 15 lie Xaa Thr Phe Asn Gin Val Xaa Phe Xaa Tyr Ser Met Pro Ala 20 25 30

<210> 5 <211> 1850 <212> PRT <213>-Gallus gallus <400> 5

Met Arg Gly lie lie Leu Ala Leu Val Leu Thr Leu Val Gly Ser Gin 1 5 10 15

Lys Phe Asp lie Asp Pro Gly Phe Asn Ser Arg Arg Ser Tyr Leu Tyr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） —— — — ——I— ^ — — — — — — — I— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 84 五、發明說明（） 20 25 30

Asn Tyr Glu Gly Ser Met Leu Asn Gly Leu Gin Asp Arg Ser Leu Gly 35 40 45

Lys Ala Gly Val Arg Leu Ser Ser Lys Leu Glu lie Ser Gly Leu Pro 50 55 60

Glu Asn Ala Tyr Leu Leu Lys Val Arg Ser Pro Gin Val Glu Glu Tyr 65 70 ‘ 75，， 80

Asn Gly Val Trp Pro Arg Asp Pro Phe Thr Arg Ser Ser Lys lie Thr 85 90 95

Gin Val lie Ser Ser Cys Phe Thr Arg Leu Phe Lys Phe Glu Tyr Ser 100 105 110

Ser Gly Arg He Gly Asn lie Tyr Ala Pro Glu Asp Cys Pro Asp Leu 115 120 125

Cys Val Asn He Val Arg Gly lie Leu Asn Met Phe Gin Met Thr lie 130 135 140

Lys Lys Ser Gin Asn Val Tyr Glu Leu Gin Glu Ala Gly lie Gly Gly 145 150 155 160 lie Cys His Ala Arg Tyr Val lie Gin Glu cAsp Arg Lys Asn Ser Arg 165 170 175 lie Tyr Val Thr Arg Thr Val Asp Leu Asn Asn Cys Gin Glu Lys Val 180 185 190

Gin Lys Ser lie Gly Met Ala Tyr lie Tyr Pro Cys Pro Val Asp Val 195 200 205

Met Lys Glu Arg Leu Thr Lys Gly Thr Thr Ala Phe Ser Tyr Lys Leu 210 215 220

Lys Gin Ser Asp Ser Gly Thr Leu lie Thr Asp Val Ser Ser Arg Gin 225 230 235 240

Val Tyr Gin lie Ser Pro Phe Asn Glu Pro Thr Gly Val Ala Val Met 245 250 255 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 装·！丨I丨丨-訂--------— (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 85 五、發明說明)

Glu Ala Arg Gin Gin Leu Thr Leu Val Glu Val Arg Ser Glu Arg Gly 260 265 270 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Ser Ala Pro Asp Val Pro Met Gin Asn Tyr Gly Ser Leu Arg Tyr Arg 275 280 285

Phe Pro Ala Val Leu Pro Gin Met Pro Leu Gin Leu He Lys Thr Lys 290 295 300

Asn Pro Glu Gin Arg He Val Glu Thr Leu Gln^His lie Val Leu Asn 305 310 ^ 315 320

Asn Gin Gin Asp Phe His Asp Asp Val Ser Tyr Arg Phe Leu Glu Val 325 330 335

Val Gin Leu Cys Arg He Ala Asn Ala Asp Asn Leu Glu Ser lie Trp 340 345 350

Arg Gin Val Ser Asp Lys Pro Arg Tyr Arg Arg Trp Leu Leu Ser Ala 355 360 365

Val Ser Ala Ser Gly Thr Thr Glu Thr Leu Lys Phe Leu Lys Asn Arg 370 375 ^ 380

He Arg Asn Asp Asp Leu Asn Tyr lie Gin Thr Leu Leu Thr Val Ser 385 390 395 400

Leu Thr Leu His Leu Leu Gin Ala Asp Glu His Thr Leu Pro lie Ala 405 410 ^ 415

Ala Asp Leu Met Thr Ser Ser Arg lie Gin Lys Asn Pro Val Leu Gin 420 425 430 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Gin Val Ala Cys Leu Gly Tyr Ser Ser Val Val Asn Arg Tyr Cys Ser 435 440 445 ^

Gin Thr Ser Ala Cys Pro Lys Glu Ala Leu Gin Pro He His Asp Leu 450 455 460

Ala Asp Glu Ala lie Ser Arg Gly Arg Glu Asp Lys Met Lys Leu Ala 465 470 475 480

Leu Lys Cys lie Gly Asn Met Gly Glu Pro Ala Ser Leu.Lys Arg lie 485 490 495 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1250164 A7 B7 86 五、發明說明（)

Leu Lys Phe Leu Pro lie Ser Ser Ser Ser Ala -Ala Asp lie Pro Val 500 505 510 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

His lie Gin lie Asp Ala lie Thr Ala Leu Lys Lys He Ala Trp Lys 515 520 525

Asp Pro Lys Thr Val Gin Gly Tyr Leu lie Gin lie Leu Ala Asp Gin 530 535 540

Ser Leu Pro Pro Glu Val Arg Met Met Ala Cy§ Ala Val lie Phe Glu 545 550 555 560

Thr Arg Pro Ala Leu Ala Leu He Thr Thr lie Ala Asn Val Ala Met 565 570 575

Lys Glu Ser Asn Met Gin Val Ala Ser Phe Val Tyr Ser His Met Lys 580 585 590

Ser Leu Ser Lys Ser Arg Leu Pro Phe Met Tyr Asn lie Ser Ser Ala 595 600 605

Cys Asn lie Ala Leu Lys Leu Leu Ser Pro Lys Leu Asp Ser Met Ser 610 615 ; 620

Tyr Arg Tyr Ser Lys Val lie Arg Ala Asp Thr Tyr Phe Asp Asn Tyr 625 630 635 640

Arg Val Gly Ala Thr Gly Glu lie Phe Val Val Asn Ser Pro Arg Thr 645 650 655 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Met Phe Pro Ser Ala lie lie Ser Lys Leu Met Ala Asn Ser Ala Gly 660 665 670

Ser Val Ala Asp Leu Val Glu Val Gly lie Arg Val Glu Gly LeifAla 675 680 685

Asp Val lie Met Lys Arg Asn lie Pro Phe Ala Glu Tyr Pro Thr Tyr 690 695 700

Lys Gin lie Lys Glu Leu Gly Lys Ala Leu Gin Gly Trp Lys Glu Leu 705 710 715 720

Pro Thr Glu Thr Pro Leu Val Ser Ala Tyr Leu Lys lie Leu Gly Gin 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 87 五、發明說明-< ) 725 730 735

Glu Val Ala Phe lie Asn lie Asn Lys Glu Leu Leu Gin Gin Val Met 740 745 750

Lys Thr Val Val Glu Pro Ala Asp Arg Asn Ala Ala lie Lys Arg lie 755 760 765

Ala Asn Gin lie Arg Asn Ser lie Ala Gly Gin Trp Thr Gin Pro Val 770 775 ^ >780

Trp Met Gly Glu Leu Arg Tyr Val Val Pro Ser Cys Leu Gly Leu Pro 785 790 795 _

Leu Glu Tyr Gly Ser Tyr Thr Thr Ala Leu Ala Arg Ala Ala Val Ser 805 810 815

Val Glu Gly Lys Met Thr Pro Pro Leu Thr Gly Asp Phe Arg Leu Ser 820 825 830

Gin Leu Leu Glu Ser Thr Met Gin He Arg Ser Asp Leu Lys Pro Ser 835 840 845

Leu Tyr Val His Thr Val Ala Thr Met Gly Val Asn Thr Glu Tyr Phe 850 855 860

Gin His Ala Val Glu lie Gin Gly Glu Val Gin Thr Arg Met Pro Met 865 870 875 880

Lys Phe Asp Ala Lys lie Asp Val Lys Leu Lys Asn Leu Lys lie Glu 885 890 895

Thr Asn Pro Cys Arg Glu Glu Thr Glu lie Val Val Gly Arg His Lys 900 905 910

Ala Phe Ala Val Ser Arg Asn lie Gly Glu Leu Gly Val Glu Lys Arg 915 920 925

Thr Ser He Leu Pro Glu Asp Ala Pro Leu Asp Val Thr Glu Glu Pro 930 935 940

Phe Gin Thr Ser Glu Arg Ala Ser Arg Glu His Phe Ala Met Gin Gly 945 950 955 960 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） II---.------"41^ 裝--------訂---------ttw. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250164 A7 B7 88 五丁 說明()

Pro Asp Ser Met Pro Arg Lys Gin Ser His Ser Ser Arg Glu Asp Leu 965 970 975 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Arg Arg Ser Thr Gly Lys Arg Ala His Lys Arg Asp lie Cys Leu Lys 980 985 990

Met His His lie Gly Cys Gin Leu Cys Phe Ser Arg Arg Ser Arg Asp 995 1000 1005

Ala Ser Phe lie Gin Asn Thr Tyr Leu His Lys Leu lie Gly Glu His 1010 1015 ^ 1020

Glu Ala Lys lie Val Leu Met Pro Val His Thr Asp Ala Asp lie Asp 1025 1030 1035 1040

Lys lie Gin Leu Glu lie Gin Ala Gly Ser Arg Ala Ala Ala Arg lie 1045 1050 1055 lie Thr Glu Val Asn Pro Glu Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ser Ser Pro 1060 1065 1070

Tyr Glu Asp He Gin Ala Lys Leu Lys Arg lie Leu Gly lie Asp Ser 1075 1080 , 1085

Met Phe Lys Val Ala Asn Lys Thr Arg His Pro Lys Asn Arg Pro Ser 1090 1095 1100

Lys Lys Gly Asn Thr Val Leu Ala Glu Phe Gly Thr Glu Pro Asp Ala 1105 1110 1115 1120

Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ala Thr Ser Ser 1125 1130 1135 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Asn Arg Lys Lys Pro Met Asp Glu 1140 1145 1150 ^

Glu Glu Asn Asp Gin Val Lys Gin Ala Arg Asn Lys Asp Ala Ser Ser 1155 1160 1165

Ser Ser Arg Ser Ser Lys Ser Ser Asn Ser Ser Lys Arg Ser Ser Ser 1170 1175 1180

Lys Ser Ser Asn Ser Ser Lys Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1185 1190 1195 1200 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 91 1250164 A7 B7 89 五、發明說明（）

Ser Ser Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn 1205 1210 12-15 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg 1220 1225 1230

Ser Arg Ser Ser Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1235 1240 1245 . y

Ser Ser Ser Ser Lys Ser Ser Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1250 1255 1260

Lys Ser Ser Ser His His Ser His Ser His His Ser Gly His Leu Asn 1265 1270 1275 1280

Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser Val Ser His His Ser 1285 1290 1295

His Glu His His Ser Gly His Leu Glu Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser 1300 1305 1310

Ser Ser Ser Val Leu Ser Lys lie Trp Gly Arg His Glu lie Tyr Gin 1315 1320 1325

Tyr Arg Phe Arg Ser Ala His Arg Gin Glu Phe Pro Lys Arg Lys Leu 1330 1335 c 1340

Pro Gly Asp Arg Ala Thr Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Arg Ser Ser His 1345 1350 1355 1360 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Asp Thr Ser Arg Ala Ala Ser Trp Pro Lys Phe Leu Gly Asp He Lys 1365 1370 1375

Thr Pro Val Leu Ala Ala Phe Leu His Gly lie Ser Asn Asn Lys Lys 1380 1385 1390

Thr Gly Gly Leu Gin Leu Val Val Tyr Ala Asp Thr Asp Ser Val Arg 1395 1400 1405

Pro Arg Val Gin Val Phe Val Thr Asn Leu Thr Asp Ser Ser Lys Trp 1410 1415 1420

Lys Leu Cys Ala Asp Ala Ser Val Arg Asn Ala His Lys Ala Val Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 A7 B7 90 五、發明說明（ 1425 1430 1435 1440 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製

Tyr Val Lys Trp Gly Trp Asp Cys Arg Asp Tyr Lys Val Ser Thr Glu 1445 1450 1455

Leu Val Thr Gly Arg Phe Ala Gly His Pro Ala Ala Gin Val Lys Leu 1460 1465 1470

Glu Trp Pro Lys Val Pro Ser Asn Val Arg Ser Val Val Glu Trp Phe 14?5 1480 > 1485

Tyr Glu Phe Val Pro Gly Ala Ala Phe Met Leu Gly Phe Ser Glu Arg 1490 1495 1500

Met Asp Lys Asn Pro Ser Arg Gin Ala Arg Met Val Val Ala Leu Thr 1505 1510 1515 1520

Ser Pro Arg Thr Cys Asp Val Val Val Lys Leu Pro Asp lie lie Leu 1525 1530 1535

Tyr Gin Lys Ala Val Arg Leu Pro Leu Ser Leu Pro Val Gly Pro Arg 1540 1545 1550 lie Pro Ala Ser Glu Leu Gin Pro Pro lie Trp Asn Val Phe Ala Glu 1555 1560 1565

Ala Pro Ser Ala Val Leu Glu Asn Leu Lys'Ala Arg Cys Ser Val Ser 1570 1575 1580

Tyr Asn Lys lie Lys Thr Phe Asn Glu Val Lys Phe Asn Tyr Ser Met 1585 1590 1595 1600

Pro Ala Asn Cys Tyr His lie Leu Val Gin Asp Cys Ser Ser Glu Leu 1605 1610 1615

Lys Phe Leu Val Met Met Lys Ser Ala Gly Glu Ala Thr Asn Leu Lys 1620 1625 1630

Ala lie Asn lie Lys lie Gly Ser His Glu lie Asp Met His Pro Val 1635 1640 1645

Asn Gly Gin Val Lys Leu Leu Val Asp Gly Ala Glu Ser Pro Thr Ala 1650 1655 1660 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -93 — 1250164 A7 B7 91 五、發明說明（）

Asn lie Ser Leu lie Ser Ala Gly Ala Ser Leu Trp lie His Asn Glu 1665 1670 1675 1680 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Asn Gin Gly Phe Ala Leu Ala Ala Pro Gly His Gly He Asp Lys Leu 1685 1690 1695

Tyr Phe Asp Gly Lys Thr lie Thr lie Gin Val Pro Leu Trp Met Ala 1700 1705 1710

Gly Lys Thr Cys Gly lie Cys Gly Lys Tyr Asp Ala Glu Cys Glu Gin 1715 1720 ' 1725

Glu Tyr Arg Met Pro Asn Gly Tyr Leu Ala Lys Asn Ala Val Ser Phe 1730 1735 1740

Gly His Ser Trp He Leu Glu Glu Ala Pro Cys Arg Gly Ala Cys Lys 1745 1750 1755 1760

Leu His Arg Ser Phe Val Lys Leu Glu Lys Thr Val Gin Leu Ala Gly 1765 1770 1775

Val Asp Ser Lys Cys Tyr Ser Thr Glu Pro Val Leu Arg Cys Ala Lys 1780 1785' 1790

Gly Cys Ser Ala Thr Lys Thr Thr Pro Val Thr Val Gly Phe His Cys 1795 1800 1805

Leu Pro Ala Asp Ser Ala Asn Ser Leu Thr Asp Lys Gin Met Lys Tyr 1810 1815 1820 -

Asp Gin Lys Ser Glu Asp Met Gin Asp Thr Val Asp Ala His Thr Thr 1825 1830 1835 1840 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Cys Ser Cys Glu Asn Glu Glu Cys Ser Thr 1845 1850 ‘

<210〉 6 <211> 70 <212> PRT <213> Gallus gallus <400〉 6

Ala Gly Ser Ser His Glu Val Val Pro Ser Leu Leu Gin Thr Leu Leu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250164 A7 B7 — 五、發明說明（） 15 10 15

Glu Gly Ser lie Glu Gin Leu Tyr Ala Gly Pro lie Ser Arg Tyr Asn 20 25 30

Val Asp Glu Met Thr Ser Ala Ala Leu Ala Glu Leu Lys Lys Cys lie 35 40 45

Asp Glu Leu Pro Pro Xaa His Leu Lys Ala Leu Val Asn Leu Xaa Lys 50 55 4 60

Gin lie Arg Thr Glu Ala 65 70 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -95- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 I25(y 齡 14621號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(94年9月） 六、申請專利範圍 L -種分離的蛋白f，其包含選自由下列群組所組成之胺 基酸序列： a·選自SEQIDNO·· 1與处(510见）：6所組之群的胺基 酸序列；及 b.與（a)之胺基酸序列至少有9〇%同一性之胺基酸序 列； 其中該分離的蛋白質能向上調控腫瘤壞死因子α (TNF α)、介白素-1 点）或介白素_6(1]^6)之表現， 或向下調控轉型生長因子冷（TGF /3 )之表現。 2·如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質包 含與（a)之胺基酸序列至少有95%同一性之胺基酸序列。 3 ·如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質包 含 SEQ ID Ν0··1 及 SEQ ID N0:6。 4 ·如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質包 含 SEQ ID N0:6 〇 5 .如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質具 有至少一個生物活性次單元，其係通過一 3 〇 〇 〇道耳呑分 子量臨界值之超過濾過滤器。 6 .如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質在 高達至少5 0 °C下係為穩定的。 7.如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質在 pH值自2至1 〇間係為穩定的。 8 ·如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質在 經口服投予前及投予後具有生物活性。 65438-940923.DOC - 1 -

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1250164 申請專利範園 A8 B8 C8 D8 9.如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中該蛋白質係 自Ά存在於超免疫鳥類的卵之卵白及卵黃兩者中。 ·、 10·如申請專利範圍第i項之分離的蛋白質，係自然存在於鳥 類的卵之卵白及卵黃兩者中。 ''' 1 h如申請專利範圍第1項之分離的蛋白質，其中編碼該蛋白 質之核酸序列，與編碼選自SEQ ID NO : 1與SEQ ID N〇 ·· 6所組之群的胺基酸序列之核酸序列，能在高度嚴 苛條件下雜交。 12· —種分離的抗體，其係選擇性與根據申請專利範圍第1 , 之分離的蛋白質結合。 13· —種調控動物體免疫反應之醫藥組合物，其包含一醫藥 上可接受之載劑及一細胞激素活化因子（CAF)蛋白質，其 包括選自由下述所組成之群之胺基酸序列： a •選自SEQ ID NO : 1與SEQ ID NO : 6所組之群的胺基 酸序列；及 b .與（a)之胺基酸序列至少有9 0 %同一性之胺基酸序 列； 其中該分離的蛋白質能向上調控腫瘤壞死因子a (TNF α)、介白素-lyS(IL-ly3)或介白素-6(IL-6)之表現， 或向下調控轉型生長因子/5( TGF /5 )之表現。 14.如申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其中該蛋白質包 含與（a)之胺基酸序列至少有9 5 %同一性之胺基酸序列。 15·如申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其中該蛋白質包 含 SEQ ID ΝΟ:1 及 SEQ ID NO:6。 -2- 65438-940923.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐） 1250164 A8 B8

   A:申請專利範圍第13項之醫藥組合物，其中該蛋白質包 含 SEQ ID n0:6。 負包 如、I #專利&圍第1 3項之醫藥組合物，其中該醫藥上可 接文之載劑為選自以下所組之群之食品： a.係選擇以増富該CAF蛋白質之高免疫卵製品；及， 七b·具^免疫印製品之最少分量之食品，其中該分量相 t万、Θ回免疫卵製品，其所含該CAF蛋白質具增富之 *5* ° 18·”請專利範園第13項之醫藥組合物，其中該醫藥上可 接受之載劑包含的高免疫即製品之分量，相幸交於該高免 疫即製品，其所含該CAF蛋質白具增富之量。 19·如申請專利範圍第18項之醫藥組合物，其中該分量係選 自以下所組之群：液狀彡卩黃、液狀卵白、粉狀#黃、粉 狀卵白、及該高免疫卵製品之水溶性分量。 20·如申請專利範圍第13項之醫藥組合物，其中該組成物係 選自液體、氣溶膠、膠囊、錠劑、丸劑、散劑、凝膠及 細粒所組之群。 21·如申請專利範圍第丨3項之醫藥組合物，其中該藥學可接 受的載劑含有控制釋放配方。 22·如申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其中該醫藥上可 接爻之載劑係選自以下所組之群：水、磷酸緩衝鹽水、 Ringer氏落液、右旋醣溶液、血清包含溶液、Hank氏溶 液、其他水性生理平衡溶液、油、酯、乙二醇、生物相 容的聚合物、聚合性基質、膠囊、微膠囊、微粒子、大 65438-940923.DOC ^3 - 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(21〇X 297公釐） A B c D 1250164 六、申請專利範園 量製劑、滲透唧筒、擴散器材、脂體、脂球、細胞、及 細胞膜。 23·如申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其投予劑量為該 動物每公斤體重之自1毫微克至400毫克的CAF蛋白質。 24·如申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其投予途徑係選 自口服、靜脈給藥、腹膜給藥、肌肉給藥、皮下給藥、 經皮傳遞、氣管給藥、吸入方式、由導尿管灌注、检劑 投給、及直接注射至組織所組之群。 25·如申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其中動物為哺乳 類。 65438-940923.DOC -4-