CN113311082A - 一种芋螺毒素有关杂质的检测方法 - Google Patents

一种芋螺毒素有关杂质的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113311082A
CN113311082A CN202110555862.0A CN202110555862A CN113311082A CN 113311082 A CN113311082 A CN 113311082A CN 202110555862 A CN202110555862 A CN 202110555862A CN 113311082 A CN113311082 A CN 113311082A
Authority
CN
China
Prior art keywords
conotoxin
solution
impurities
detection
related impurities
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110555862.0A
Other languages
English (en)
Inventor
徐红岩
秦敬国
李阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GL BIOCHEM (SHANGHAI) Ltd
SHANGHAI GL POLYPEPTIDE CO Ltd
Jiangsu Jitai Peptide Industry Science And Technology Co ltd
Original Assignee
GL BIOCHEM (SHANGHAI) Ltd
SHANGHAI GL POLYPEPTIDE CO Ltd
Jiangsu Jitai Peptide Industry Science And Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GL BIOCHEM (SHANGHAI) Ltd, SHANGHAI GL POLYPEPTIDE CO Ltd, Jiangsu Jitai Peptide Industry Science And Technology Co ltd filed Critical GL BIOCHEM (SHANGHAI) Ltd
Priority to CN202110555862.0A priority Critical patent/CN113311082A/zh
Publication of CN113311082A publication Critical patent/CN113311082A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及一种芋螺毒素有关杂质的检测方法。主要解决现有缺少对芋螺毒素杂质分析方法的技术问题。本发明检测方法，包括以下步骤：（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到试品溶液；（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到对照品溶液；（3）以C18键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用乙腈和缓冲液为流动相，梯度洗脱；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；进样体积为20μl；柱温为45℃。本方法有效地解决了芋螺毒素有关杂质检测和分离的问题，能保证芋螺毒素中有关杂质的可控性，提高产品质量。

Description

一种芋螺毒素有关杂质的检测方法
技术领域
本发明涉及一种多肽分析检测方法，特别涉及一种芋螺毒素有关杂质的检测方法。
背景技术
芋螺毒素(CTX)，结构式如下：
Figure 390148DEST_PATH_IMAGE001
由海洋腹足纲软体动物芋螺的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物。每种芋螺的毒液中可能含50～200个活性多肽。不同种芋螺所含活性肽各不相同，理论上估计有5万多种不同活性肽存在于芋螺毒液中。芋螺毒素多数由10～40个氨基酸残基组成，富含两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，可作用于各种离子通道和受体的类型及亚型，是一种新型的天然麻醉剂。
对于以往芋螺毒素活性环肽的人工合成中，由于其结构复杂，人工合成的产率较小，纯度也低，合成的中间肽还需氧化折叠才能形成正确的构象。在合成过程中，为了更好的控制产品质量，须对杂质进行准确的分析。现有技术中，缺少对芋螺毒素杂质分析报道。
发明内容
本发明目的是提供一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，主要解决目前缺少芋螺毒素分析检测方法的技术问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，包括以下步骤：
（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml供试品溶液；
（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml对照品溶液；
（3）以C18键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用乙腈和缓冲液为流动相，梯度洗脱 ；检测波长为215nm ；流速为1 .0ml/min；进样体积为20μl；柱温为45℃。
所述缓冲液为三乙胺溶液。三乙胺溶液质量百分浓度为0.05%-0.1%，优选质量百分浓度0.05%。三乙胺缓冲液pH为2.5-4，pH值优选为2.5。
所述洗脱梯度为乙腈质量百分比12-14%。
洗脱后得到芋螺毒素杂质为：
IMP1序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRRITDACV；
IMP2序列为：RSSGRYCRSPYDRRRRYCRRIITDACV；
IMP3序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDCVV；
IMP4序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRIITDACV。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，该方法能将可能的降解杂质和工艺杂质与主成分有效分开，且灵敏度高，可应用于芋螺毒素的质量控制，有利于提高产品质量。常规检测方法很难检测缺失一个或者多一个氨基酸杂质，本发明可以有效解决检测问题，特别是对杂质IMP1和IMP4有很好的分离效果。
附图说明
图1为芋螺毒素样品检测局部放大图。
图2为实例1的空白溶液HPLC图。
图3为实例1的对照溶液第一针HPLC图。
图4为实例1的对照溶液第二针HPLC图。
图5为实例1的对照溶液第三针HPLC图。
图6为实例1的对照溶液第四针HPLC图。
图7为实例1的对照溶液第五针HPLC图。
图8为实例1的对照溶液第六针HPLC图。
图9为实例1的空白溶液HPLC图。
图10为实例1的芋螺毒素样品溶液第一针HPLC图。
图11为实例1的芋螺毒素样品溶液第二针HPLC图。
图12为实例2的空白溶液HPLC图。
图13为实例2的对照溶液第一针HPLC图。
图14为实例2的对照溶液第二针HPLC图。
图15为实例2的对照溶液第三针HPLC图。
图16为实例2的对照溶液第四针HPLC图。
图17为实例2的对照溶液第五针HPLC图。
图18为实例2的对照溶液第六针HPLC图。
图19为实例2的空白溶液HPLC图。
图20为实例2的芋螺毒素样品溶液第一针HPLC图。
图21为实例2的芋螺毒素样品溶液第二针HPLC图。
图22为实例3的空白溶液HPLC图。
图23为实例3的对照溶液第一针HPLC图。
图24为实例3的对照溶液第二针HPLC图。
图25为实例3的对照溶液第三针HPLC图。
图26为实例3的对照溶液第四针HPLC图。
图27为实例3的对照溶液第五针HPLC图。
图28为实例3的对照溶液第六针HPLC图。
图29为实例3的空白溶液HPLC图。
图30为实例3的芋螺毒素样品溶液第一针HPLC图。
图31为实例3的芋螺毒素样品溶液第二针HPLC图。
具体实施方式
实施例1
Figure 369606DEST_PATH_IMAGE002
进样序列
Figure 149343DEST_PATH_IMAGE003
实验步骤：
（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml供试品溶液；
（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml对照品溶液；
（3）按照上述色谱条件调节三乙胺溶液pH为2.5，按照进样序列依次进样得到HPLC检测图2-图11。洗脱后得到芋螺毒素杂质为：
IMP1序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRRITDACV；
IMP2序列为：RSSGRYCRSPYDRRRRYCRRIITDACV；
IMP3序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDCVV；
IMP4序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRIITDACV。
杂质和目标峰顺序见图1。
实施例2
Figure 357601DEST_PATH_IMAGE004
进样序列
Figure 234291DEST_PATH_IMAGE006
实验步骤：
（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml供试品溶液；
（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml对照品溶液；
（3）按照上述色谱条件调节三乙胺溶液pH为2.5，按照进样序列依次进样得到HPLC检测图12-图21。洗脱后得到芋螺毒素杂质为：
IMP1序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRRITDACV；
IMP2序列为：RSSGRYCRSPYDRRRRYCRRIITDACV；
IMP3序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDCVV；
IMP4序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRIITDACV。
杂质和目标峰顺序见图1。
实施例3
Figure 869802DEST_PATH_IMAGE007
进样序列
Figure 199153DEST_PATH_IMAGE008
实验步骤：
（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml供试品溶液；
（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml对照品溶液；
（3）按照上述色谱条件调节三乙胺溶液pH为4，按照进样序列依次进样得到HPLC检测图22-图31。洗脱后得到芋螺毒素杂质为：
IMP1序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRRITDACV；
IMP2序列为：RSSGRYCRSPYDRRRRYCRRIITDACV；
IMP3序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDCVV；
IMP4序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRIITDACV。
杂质和目标峰顺序见图1。

Claims (5)

1.一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到试品溶液；
（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到对照品溶液；
（3）以C18键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用乙腈和缓冲液为流动相，梯度洗脱 ；检测波长为215nm ；流速为1 .0ml/min；进样体积为20μl；柱温为45℃。
2.根据权利要求1所述的一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，其特征在于：缓冲液为三乙胺溶液。
3.根据权利要求2所述的一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，其特征在于：三乙胺溶液质量百分浓度为0.05%-0.1%。
4.根据权利要求2所述的一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，其特征在于：三乙胺缓冲液pH为2.5-4。
5.根据权利要求1所述的一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，其特征在于：洗脱梯度乙腈质量百分比12-14%。
CN202110555862.0A 2021-05-21 2021-05-21 一种芋螺毒素有关杂质的检测方法 Pending CN113311082A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110555862.0A CN113311082A (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种芋螺毒素有关杂质的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110555862.0A CN113311082A (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种芋螺毒素有关杂质的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113311082A true CN113311082A (zh) 2021-08-27

Family

ID=77374172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110555862.0A Pending CN113311082A (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种芋螺毒素有关杂质的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113311082A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103483439A (zh) * 2012-06-15 2014-01-01 海南大学 αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物及用途
CN110078810A (zh) * 2019-05-09 2019-08-02 江苏吉泰肽业科技有限公司 一种芋螺毒素的纯化方法
CN112010959A (zh) * 2019-05-31 2020-12-01 海南大学 αO-芋螺毒素肽GeXIVA新突变体、其药物组合物及用途
CN112353934A (zh) * 2020-11-23 2021-02-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种芋螺毒素药物组合物及其冻干制剂

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103483439A (zh) * 2012-06-15 2014-01-01 海南大学 αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物及用途
CN110078810A (zh) * 2019-05-09 2019-08-02 江苏吉泰肽业科技有限公司 一种芋螺毒素的纯化方法
CN112010959A (zh) * 2019-05-31 2020-12-01 海南大学 αO-芋螺毒素肽GeXIVA新突变体、其药物组合物及用途
CN112353934A (zh) * 2020-11-23 2021-02-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种芋螺毒素药物组合物及其冻干制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOHAMMED ABDEL-WAHAB ET AL.: "Isolation, structural identification and biological characterization of two conopeptides from the Conus pennaceus venom", 《BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY》 *
肖彩等: "中国南海织锦芋螺毒素的分离及鉴定", 《中国海洋药物杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Van Wandelen et al. Using quaternary high-performance liquid chromatography eluent systems for separating 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate-derivatized amino acid mixtures
US4558006A (en) A.T.C.C. HB8209 and its monoclonal antibody to erythropoietin
CN108333281A (zh) 一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法
US20220033487A1 (en) Methods of Producing Ustekinumab
Richter et al. A study of two types of ferritin from rat hepatomas
CN113311082A (zh) 一种芋螺毒素有关杂质的检测方法
CN111060696B (zh) 一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法
US10858406B2 (en) Conotoxin polypeptide κ-CPTx-bt105, and method for preparation thereof and application thereof
CN111505142B (zh) 一种多黏菌素b的氨基酸构型分析方法和n-多肽端序列测序方法
Rautiainen et al. Molecular and crystal properties of Bos d 2, an allergenic protein of the lipocalin family
US10633416B2 (en) Conotoxin polypeptide κ-CPTx-bt104, and method for preparation thereof and application thereof
CN113817686A (zh) 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用
JP6893214B2 (ja) インシュリン類似体のためのバイオ分析方法
CN110118847B (zh) 确定多位点peg修饰蛋白质修饰位点的分析方法
US10087216B2 (en) Conotoxin polypeptide κ-CPTx-bt101, and method for preparation thereof and application thereof
US10662228B2 (en) Conotoxin polypeptide κ-CPTx-bt103, and method for preparation thereof and application thereof
CN106432469B (zh) 人绒毛膜促性腺激素hCG β亚基的糖基化变体及包含其的hCG
US10858407B2 (en) Conotoxin polypeptide K-CPTX-BT102, and method for preparation thereof and application thereof
US20240060978A1 (en) Isoelectric focusing-based enrichment of charge variant species
CN109932444B (zh) 一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法
US5106760A (en) ATCC HB8209, its monoclonal antibody to erythropoietin and assay using same
CN108226362A (zh) 一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法
CN118147116A (zh) 一种重组羧肽酶b的纯化方法及其应用
Liu et al. Expression and purification of cysteine mutation isoforms of rat lipocalin‐type prostaglandin D synthase for nuclear magnetic resonance study
CN117849199A (zh) 一种特戊酸氯甲酯及其杂质特戊酸的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210827