JP2016525349A - 効率的な遺伝子送達用途のための非毒性hsvベクター及びその製造のための補完細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2013年7月17日に出願された米国仮特許出願第61/847,405号の優先権を主張し、該出願の内容全体が、全体として、本明細書中に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号PO1DK044935及び5RO1NS064988に基づく政府のサポートを利用してなされた。政府は、本発明における所定の権利を有する。
多数のウイルス性及び非ウイルス性遺伝的ベクターシステムのうち、単純ヘルペスウイルス(Herpes Simplex Virus, HSV)をベースとするベクターは、ヒトの患者における可能性のある治療上の使用を含め、遺伝子移入(transfer)ベクターとしての使用のために調査されてきた。HSVは、極めて広範囲のヒト及び動物細胞に感染可能な、複雑な非統合(non-integrating)DNAウイルスである。ウイルスゲノムは、80を超える遺伝子を含み、2つの固有のセグメント、UL及びUsで構成され、それぞれ重要な(critical)ディプロイド(diploid)遺伝子をコードする逆位リピート(inverted repeats)に隣接する。HSV複製の重要な特徴は、その遺伝子が次々に(in waves)発現することであり、カスケード調節(cascade regulation)と呼ばれる(Rajcani, Virus Genes, 28: 293-310 (2004))。不可欠な前初期(immediate-early, IE)遺伝子ICP27及びICP4の除去(removal)により、ウイルスの完全欠損(virus completely defective)状態、並びに、ウイルスゲノム複製に関与する初期(E)遺伝子及び子孫ウイルス粒子の組み立て(progeny virion assembly)において働く後期(L)遺伝子を発現できない状態となる。これらの複製欠損ウイルス(replication-defective viruses)は、補完細胞(complementing cells)において培養することができ、該補完細胞は、欠落したICP4及びICP27遺伝子産物を発現し(補完し(complement))、ウイルスゲノムが安定な核エピソーム(nuclear episome)として定着する(takes residence)非補完細胞にその後、感染させるために使用することが可能である。しかしながら、ICP0及びICP22 IE遺伝子を保存するベクターは、細胞に毒性(toxic)があるが、これらの遺伝子、特にICP0遺伝子の不活化(inactivation)又は欠失(deletion)は、導入遺伝子発現を妨げる。
本発明は、多種多様な組織又は細胞(特に哺乳類)において、有害なウイルス遺伝子を全く発現することなく、導入遺伝子をインビトロ又はインビボで発現するための機会をもたらす、HSVベクター操作(engineering)におけるブレイクスルーに関する。本発明のHSVベクターは、非補完細胞において有害なウイルス遺伝子を全く発現せず、それにもかかわらず活発な(vigorous)、持続性の(例えば、少なくとも28日間、及び好ましくは少なくとも60日間等、少なくとも14日間)導入遺伝子発現が可能である。HSVは、一般的な(general)又は細胞特異的なプロモータによって制御された大きなただ一つ又は複数の導入遺伝子発現カセットを、ベクターの統合(vector integration)をすることなく、高効率の感染特性で運ぶという性能(capability)に結び付く唯一のベクターであるため、それ自体が、ベクター技術における極めて重要なニッチ(niche)を埋める。本発明のベクターは、効率的なベクターがこれまでのところ全く利用可能でない肝臓等の組織への効率的な遺伝子の搬送を可能にするだろう。
以下の特許及び刊行物は、様々なHSVベクター技術に関するものであり、参照することによって本明細書中に組み込まれる。米国特許第5,658,724号は、ICP4及びICP27を欠損するHSV株、並びにその製造、増殖、及び使用のための方法に関する。米国特許第5,804,413号は、ICP4、ICP27、及びICP0をコードするDNAを含む細胞株に関する。米国特許第5,849,571号は、潜在活性(latency active)ヘルペスウイルスプロモータ及びその使用に関する。米国特許第5,849,572号は、LATプロモータを含むHSV-1ベクターに関する。米国特許第5,879,934号は、ICP4及びICP27遺伝子産物が欠損を有する(defective)ように、ICP4及びICP27遺伝子内にゲノム変異を含む組み換えHSVベクターに関する。米国特許第5,998,174号は、HSVベクターを作製する方法に関する。米国特許第6,261,552号は、天然の(native)TAATGARAT配列内に欠失又は変異を有するHSVゲノムを含み、これにより、前記ゲノムがHSV ICP4遺伝子産物を含む細胞内にある場合に、前記欠失又は変異が前記ゲノム内の天然の前初期遺伝子の発現の動態を遅延させるHSVベクターに関する。米国特許第7,078,029号は、ICP4遺伝子産物の存在下では、天然の前初期遺伝子が遅延された動態でゲノムから発現されるように、TAATGARAT配列に変異があるゲノムを有するHSVに関する。米国特許第7,531,167号は、ICP4、ICP27、及びUL55遺伝子のみに欠失を含むHSVベクターに関する。米国特許出願公開第2013/0096186号は、変異gB及び/又は変異gH糖タンパク質を含むHSVベクターに関する。国際特許出願公開第WO1999/06583号は、非天然のリガンドを含むエンベロープ(envelope)を含むHSVに関する。
本実施例は、本発明のHSVベクターを複製し、製造するための補完細胞株の開発(development)を説明する。
本実施例は、LAT遺伝子領域内に挿入された導入遺伝子を含むゲノムを含むHSVベクターであって、前初期遺伝子としてICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47を発現しないベクターの実施態様を説明する。
本実施例は、様々なHSVベクターコンストラクトの構造及び特性を列挙する。
本実施例は、JΔNI7-GFP及びJΔNI6-CAGGFPに感染させた細胞における導入遺伝子発現を実例で示す。JΔNI7-GFPにおけるCAG-GFPの位置を図1にLAT:CAG-GFPとして示し、JΔNI6-CAGGFPにおけるその位置をUL3/4:CAG-GFPとして図1に示す。更に、JΔNI7-GFP HSVのLAT領域の配列が、LAT領域内の様々な遺伝的エレメントの配列を含めて図8に説明される(配列番号1)。これらのベクター内のGFPがEGFPをコードすることは留意されるだろう。
本実施例は、U2OS-ICP4/ICP27細胞におけるJΔNI7-miR302GFP BACの2つの単離株(isolates)の作製を示す。
本実施例は、テトラサイクリン誘導プロモータ及びゲートウェイ組み換えカセットのHSVベクターのLAT遺伝子座への挿入のためのターゲッティングプラスミドの構築を説明する。
本実施例は、ICP27についての免疫蛍光(immunofluorescence)染色及び相補性分析(complementation assay)を実例で示す。
本実施例は、いくつかのHSVベクターの構築及び検査を示す。
細胞
ヒト骨肉種U2OS細胞(ATCC, Manassas, VA, USA)を、10%FBS及びペニシリン-ストレプトマイシン(penicillin-streptomycin)(P/S)を含有するDMEMにおいて増殖させた。ヒト新生児皮膚線維芽細胞(HDF)(ATCC、PCS-201-010)及びBJヒト包皮(foreskin)線維芽細胞(ATCC、CRL-2522)を10%胚性幹細胞適格(Qualified)FBS(Invitrogen)及びP/S含有DMEMにおいて培養した。Vero、Vero-7b(Krisky et al, Gene Ther. 5, 517-30 (1998))及び293T細胞を、5%FBS及びP/Sを含むDMEMにおいて培養した。ヒト肝細胞(hHEP)を単離し、説明された通りに培養した(Ueki et al., Hepatology 54, 216-28(2011);Yoshida et al., Hepatology 58, 163-75 (2013))。ヒト皮下前脂肪細胞(subcutaneous preadipocytes, hPAD)(PT-5020、Lonza)をPBM(商標)-2基礎培地(Basal Medium)(Lonza)で維持した。ヒト筋肉由来幹/前駆細胞(hMDSCs)を、説明通り培養した(Gao et al, Cell Transplant 22, 2393-408 (2013))。ヒト新生児角化細胞(hEK)(Invitrogen)をヒト角化細胞増殖サプリメント(Growth Supplement)を添加されたEpiLife(登録商標)培地で培養した(いずれもInvitrogenからのもの)。後根神経節(Dorsal root ganglia, rDRGs)を、15日目のラット胚から顕微解剖(micro-dissected)し、LeibovitzのL-15培地において30分間、37℃で一定の振盪を加えて3 mg/mlのI型コラゲナーゼ(type-I collagenase)(Sigma, St. Louis, MO)で解離し、ポリDリジン(lysine)(Sigma)コートされた(coated)カバースリップ(coverslips)上においてB27サプリメント(supplement)、Glutamax-I、Albumax-II、及びP/S(Gibco/Invitrogen、Grand Island、NY)を含有し、かつ、100 ng/ml 7.0S NGF(Sigma)を添加された500μlの既知組成のニューロベイサル培地(Neurobasal medium)において24-ウェルプレート中に、約105細胞/ウェルでプレーティングした(plated)。プレート後1〜3日において、培養物(cultures)は、上記培地において1〜2日間、10 μΜウリジン(uridine)及び10 μΜフルオロデオキシウリジン(fluorodeoxyuridine)(Sigma)で処理して、線維芽細胞及びグリア等の分裂細胞の増加を制限した。細胞を、その後、PBSで洗浄(wash)し、NGF-添加ニューロベイサル培地を用いて上述の通りインキュベートした(incubated)。ウイルス感染をプレーティングの10〜15日後に行った。
レンチウイルスICP4発現プラスミドpCDH-ICP4-puroを、プラスミドpCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(Systembio)の完全なHCMV IEプロモータを、ICP4プロモータ及びプラスミドS3からのコーディング領域で置き換えることによって構築した(該プラスミドS3は、pUC19のSphI部位に挿入されたpICP4-lox-pacからのSphIフラグメントからなる(Rasty et al., J Neurovirol. 3, 247-64 (1997))(GenBank JQ673480.1 HSV-1 KOS map positions 131 ,587-124,379; D. Krisky and J.C.G.,公表されていない))。レンチウイルスのICP27発現プラスミドpCDH-ICP27-SV40-blaを、最初に、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puroのピューロマイシン耐性カセットをpcDNA6/BioEase(商標)-DEST(Invitrogen)のブラストサイジン耐性カセットを用いて置き換えることによって構築して、pCDH-CMV-MCS-SV40-blaを作り出した(図5)。ICP27プロモータ及びコーディング領域を、その後、ICP27遺伝子及びEcoRV及びSacI部位の間の隣接配列(GenBank JQ673480.1 マップ位置110,580-115,666; D. Krisky and J.C.G.,公表されていない)を含むプラスミドPD7の、BamHI(マップ位置 113,244)及びSacIを用いた消化(digestion)によって単離し、単離されたフラグメントを、pCDH-CMV-MCS-SV40-blaにおいてCMVプロモータを置き換えるために使用した。もたらされたプラスミド、pCDH-ICP27-SV40-blaを、図5に示す。
本研究において生成され、かつ、ウイルス粒子に転換される全てのHSV-BACコンストラクトは、表2に列挙され、D. Leib(Dartmouth Medical School, NH)からの好意(kind gift)によるKOS-37 BAC(24)に由来した。全てのBAC操作を、説明通り、pRed/ET(Gene Bridges、 Heidelberg、 Germany)並びにpBAD-I-sceIプラスミド(kindly provided by N. Osterrieder, Free University of Berlin, Germany)又はE. coli株GS1783(from G. Smith, Northwestern University, Chicago, IL)のいずれかを用いたスカーレスレッド組み換え(scarless Red recombination)(Tischer et al., Methods Mol. Biol 634, 421-30(2010);Tischer et al., Biotechniques, 40, 191-97 (2006))、あるいはゲートウェイテクノロジーマニュアル(Gateway Technology Manual)(Invitrogen)(http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/gatewayman.pdf)によるインビトロゲートウェイ(GW)組み換えによって行った。全てのコンストラクトを、PCR分析、制限酵素消化物(restriction enzyme digests)のFIGE分析、及びターゲットされた(targeted)DNAシークエンシング(sequencing)によって確認した。レッド組み換えのためのターゲッティングプラスミドを記載された通り構築した(Tischer et al, Biotechniques, 40, 191-97 (2006))。I-SceI制限酵素認識部位(restriction site)(I-SceI-aphAIフラグメント)に隣接したカナマイシン耐性遺伝子を、以下に特定し、かつ、表1に列挙された異なるターゲッティングプライマーを用いるPCRによってpEPkan-S2(N. Osterriederから)(Tischer et al., Biotechniques, 40, 191-97(2006))から増幅した。ウイルスゲノムを標的とするプライマー部分(Primer portions)を、HSV-1株-17(GenBank JN555585.1)の配列に基づいて設計した。レッド組み換えのための全てのターゲッティングフラグメントを、Qiagenゲル抽出キット(extraction kit)(Qiagen)又はSpinSmart核酸準備及び精製カラム(Nucleic Acid Prep & Purification Columns)(Denville Scientific)によって精製した。以下に提供されたヌクレオチド部位(Nucleotide positions)は、HSV-1 KOS株のGenBank JQ673480配列に言及する。
JΔNI BAC DNAを、U2OSをベースとした補完細胞への導入によって感染性ウイルスに転換した。500 μlのOptiMEM(Invitrogen)におけるDNAを、1 μlリポフェクタミンプラス試薬(Lipofectamine Plus Reagent)(Invitrogen)を用いて5分間、室温でインキュベートし、6.25 μlリポフェクタミンLTX(Invitrogen)を加え、混合物を30分間、室温でインキュベートし、細胞に加えた。37℃、6時間のインキュベーション後、トランスフェクションミックス(transfection mix)を除去し、細胞を、一晩(overnight)、37℃で血清フリーの(serum-free)DMEMとともに培養し、33℃のインキュベータ(incubator)に移し、100%の細胞変性効果(CPE)を測定した。上清をタイトレーションし、その後、0.001 PFU/細胞の多重度(MOI)において順次(sequentially)により大きな培養物に感染させることによって増幅した。KNTc感染性ウイルスを、3 μlリポフェクタミンプラス試薬及び9μlのリポフェクタミンLTXを使用した4時間、37℃のVero細胞への導入によって作製し、0.01 PFU/細胞のMOIを、Vero細胞におけるKNTcウイルス増幅のために使用した。導入及び/又はウイルス増殖のための補完細胞は、以下の通りである:U2OS-ICP4(JΔNI2、JΔΝΙ3)、U2OS-ICP4/27(JΔNI5及び派生物)、及びVero-7b[QOZHGウイルス(ΔICP4, ΔICP27::HCMV IEp-GFP β-ICP22, β-ICP47 及びΔUL41::ICP0p-lacZ)(Chen et al., J. Virol. 74, 10132-41 (2000))]。U2OS-ICP4/27細胞に関して全てのウイルスストックをタイトレーションした(表2)。物理的力価(Physical titers)[ゲノムコピー(gc)/ml]を、以下に説明した通り、定量リアルタイムPCRによって決定した。感染させた細胞の蛍光画像を、Nikon Diaphot蛍光顕微鏡(fluorescence microscope)(Nikon, Melville, PA)を用いて40xの倍率(magnification)で撮影した。
24-ウェルプレートにおけるVero-7b、U2OS、U2OS-ICP4及びU2OS-ICP4/27細胞のレプリケートのウェルに、0.001の多重度(MOI)で2時間、感染させ、0.1 Mグリシン(glycine)(pH 3.0)で1分間処理して細胞外のウイルスを不活性化し、37℃及び5%CO2でインキュベートした。培地を日々採取し、標準プラーク分析(standard plaque assay)によってU2OS-ICP4/27細胞に関してタイトレーションした。
5 x 103 HDF及びVero細胞を96-ウェルプレートにおいて播種し、KOS、QOZHG又はJΔNIウイルスに25,000 gc/細胞で感染させた。細胞の生存率を、5日後に、基本的には説明された通りのMTT分析によって決定した(Uchida et al, J Virol. 87, 1430-42 (2013))。
説明した通り、細胞溶解物の調製(Cell lysate preparation)及びウェスタンブロッティングを行った(Miyagawa et al., PLoS One 4, e4634 (2009))。抗-ICP0ウサギポリクローナル(Polyclonal)抗体を、本発明者らの研究室(laboratory)において作製し、抗-ICP27(10-H44)は、フィッツジェラルドインダストリーズインターナショナル(Fitzgerald Industries International)(Concord, MA)からのものであり、抗-ICP22は、John Blahoからの好意によっており(Mt Sinai School of Medicine, NY)、抗-ICP4(10F1)は、サンタクルーズ生命工学(Santa Cruz Biotechnology)からのものであり、抗-α-チューブリン(T6793)は、シグマ(Sigma)からのものであった。同じICP4及びICP27抗体を用いる免疫蛍光を、基本的には説明された通り行い(Uchida et al, J. Virol. 83, 2951-61 (2009))、Nikon蛍光顕微鏡下で検証した。
qRT-PCRのため、全RNAを、一般的に、RNeasy kit(Qiagen)によって抽出した(extracted)。cDNAを、RETROscript(登録商標)Kit(Ambion)を用いて合成した(synthesized)。ステップワンプラス(StepOnePlus)リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)によってリアルタイムPCRを行った。少数の細胞のために、Cells-to-cDNA(商標)II Kit (Ambion)を、細胞の溶解及び逆転写のために使用した。18Sリボソームの(ribosomal)(r)RNAのための結果を使用して、データを正規化した。本研究において使用された全てのqRT-PCRプライマーを、表1に列挙する。
全ての値が平均(mean)+/-SDとして示される。ペアの間の違いを、マイクロソフトエクセル14.4.1を用いたスチューデントのt検定(Student's t test)によって分析した。0.05(P < 0.05)未満のP値を、統計的に有意であるとみなした。
ベクター操作及びウイルス増殖
細胞への検出可能な損傷(detectable damage)なく、欠損HSVベクター、JDββをマウス胚性幹細胞(mESC)へ効率的に形質導入することが、報告されている(Craft et al, Stem Cells 26, 3119-25 (2008))。JDββについて、HSVゲノムの内部リピート領域(「ジョイント」)及び2のIE遺伝子(ICP4及びICP22)を欠失させた。加えて、2の他のIE遺伝子(ICP0及びICP27)のプロモータを、ウイルスのチミジンキナーゼ(TK)初期(E又はβ)遺伝子プロモータのコピーで置き換えた。JDββを感染させた非補完細胞が示したIE遺伝子発現は極めて低かったが、ベクターは、胚様体(embryoid body)形成又は発生の転写プログラム(developmental transcription programs)を妨げることなく、mESCにおいて効率的な導入遺伝子発現が可能であった。多様な遺伝子の移入用途のための本ベクター骨格の利用を促進するために、レッドを介する組み換え(recombineering)を、細菌において行って(Tischer et al, Biotechniques 40, 191-97 (2006))、KOS-37 BAC、HSV-1株KOSの完全なゲノムを含む細菌人工染色体(BAC)から骨格であるJΔNI2(図9A)を導出した(Gierasch et al., Virol. Methods 135: 197-206(2006))。JΔNI2は、JDββと同じICP0及びICP27プロモータの置換配列に含まれるICP47プロモータを含むICP4及びジョイントを欠失させられ、及びICP22調節領域におけるコンセンサスVP16-結合(TAATGARAT)モチーフを欠失させて、ICP22発現の動態を初期遺伝子の発現動態に変化させた。感染を可視化し、ウイルス転写活性を測定するために、mCherryレポーター遺伝子発現カセットを、欠失されたICP4遺伝子座の位置に導入した。加えて、糖タンパク質B遺伝子を、高活性アリル(allele)である、gB:N/Tで置き換えて(Uchida et al., J. Virol 84: 12200-9(2010))、細胞へのウイルスの進入を増進させた(enhance)。非補完細胞における毒性ICP0及びICP27タンパク質の低レベル産生(low-level production)の可能性を除くため、ICP0(JΔNI3)あるいはICP0及びICP27(JΔNI5)(図9A)のための完全なコーディング配列を欠失させることによって、JΔNI2の2つの派生物も構築した。
等量のウイルスDNAを感染させた細胞の核へ送達するために必要な各ウイルスの相対量が評価された。様々なウイルスストックの生物学的及び物理的な力価を、U2OS-ICP4/27細胞における標準的なプラーク分析(standard plaquing assay)及びウイルス性糖タンパク質D遺伝子のためのqPCRによってそれぞれ決定し、プラーク形成単位(PFU)に対するゲノムコピー(gc)の約3倍の割合の差が、JΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5のウイルスストックの間においてみられた(表2)。HDFを、等量のPFU又は等量のgcの3のウイルスに感染させ、感染後2時間(h)(pi)の細胞核におけるHSVゲノムの数を、qPCRによって決定した。等量のgcを感染のために使用した場合、2 hpiの核におけるウイルスゲノムの数は、JΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5に感染させた細胞の間で同様であった(図10A)。これに対し、等量のPFUの感染は、核においてJΔNI2又はJΔNI3のゲノムと比較してより多数のJΔNI5のゲノムをもたらした(図10B)。従って、本調査の後半(the remainder)においては、gc数を、ウイルスインプットを標準化するために使用した。
野生型KOSウイルス及び前の、IE遺伝子を欠失したベクターである、QOZHG(ICP4-/ICP27-/β-ICP22/β-ICP47;(Chen et al., J. Virol. 74, 10132-41 (2000))と比較した非補完HDF及びVero細胞の生存率におけるJΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5感染の効果を最初に検証した。5日目(d)piに、KOS又はQOZHGに感染させた培養物におけるよりも約4〜5倍多い、25,000 gc/細胞の生存(viable)細胞が、JΔNIに感染させたHDF培養物に残ったが、JΔNI及びQOZHGに感染させたVero細胞の間には、より小さな差がみられた(図11A)。JΔNIウイルスのうち、JΔNI2は、JΔNI3(p = 0.0017)及び5(p = 0.0430)と比較して、HDFに対して多少毒性が強く、一方、Vero細胞に対する毒性は、JΔNI2からJΔNI3(p < 0.001)、JΔNI5(p < 0.001)へと減少した。これらの知見(findings)をIE遺伝子発現と関連づけるため、24 hpiにおける感染させたHDFのウェスタンブロットを、5のIEタンパク質のうちの4に対する抗体でプローブした(図11B)。JΔNI2及びJΔNI3は、いずれも残留(residual)ICP27発現を示し、両方のベクターにおけるICP27遺伝子の直前のTKプロモータは、これらの細胞においてサイレントではないが、IEタンパク質が、2〜3倍多いgc/細胞の使用にもかかわらず、JΔNI 5に感染させた細胞において全く検出されないことを示した(等量のPFU/細胞、表2参照)。KOS及びQOZHGパターンは、報告されたICP4によるICP0発現の下方調節と整合した(Douville et al, Virology 207, 107-16 (1995); Resnick et al., J. Virol. 63, 2497-503 (1989))。定量逆転写PCR(qRT-PCR)分析を使用して、ICP0 mRNAを、JΔNI2に感染させたHDFにおいて検出し、等量のgc/細胞でJΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5に感染させた12 hpiの細胞の間においてICP22及びICP27 mRNAのレベルが減少することを検出した(図11C)。これらの結果は、JΔNI2が、十分なレベルのICP0を製造して、ICP22及びICP27発現を強めたということを示唆し、IE遺伝子の漸進的な(progressive)欠失が、HSVベクターの細胞毒性を減少させるということを確認した(Krisky et al, Gene Ther. 5, 1593-603 (1998); Samaniego et al, J. Virol. 72, 3307-20 (1998); Samaniego et al, J. Virol. 71, 4614-25 (1997))。
JΔNIベクターの、欠失したICP4遺伝子座へmCherryレポーター遺伝子を導入された外来ヒトユビキチンC(UbC)プロモータ(p)の活性が、JΔNI2に感染させた細胞と比較して、JΔNI3及びJΔNIに感染させた細胞においても下方調節されるかを決定するために、感染させたHDFにおけるmCherry発現を検証した。5,000 gc/細胞での24 hpiには、mCherry蛍光がJΔNI2を感染した細胞において容易に検出可能であったが、JΔNI3を感染した細胞やJΔNI5を感染した細胞においては容易に検出可能でなかった(図12A)。qRT-PCRによる6 hpiにおけるmCherry mRNAレベルの測定により、JΔNI2に感染させた細胞及びJΔNI3に感染させた細胞の間における、UbCプロモータからの約(some)100倍の転写活性の減少、並びにJΔNI5に感染させた細胞における約5倍の更なる減少が明らかになった(図12B)。本実験において使用されたKNTcコントロールウイルス(control virus)は、複製可能(replication-competent)であり、UL3及びUL4の間の遺伝子間領域においてUbCp-mCherryカセットを含んでいた。これらのデータは、JΔNI2からの残留ICP0及びICP27発現(図11C)が、ウイルスゲノムの全体的な転写のサイレンシングを妨げるために十分であるが、これらの2つの遺伝子の欠失が、全ての天然のプロモータ活性(図11D)も外来(図12A、12B)プロモータ活性も実質的に除去するという解釈と整合した。HDFと対照的に、JΔNI3又はJΔNI5に感染させた標準的なU2OS細胞は、強いmCherry発現(図12C)を示し、U2OS細胞のICP0を補完する活性が、そうでなければサイレントなこれらのゲノムを活性化するために十分であったことを示す。ウイルスのICP0タンパク質が同じ活性を有することを確認するために、JΔNI5に感染させたHDFをICP0+QOZHGウイルス(図11B参照)に重複感染させた。図12Dに示すように、重複感染は、mCherry発現を誘導し、一方、モックの重複感染は、mCherry発現を誘導しなかった。総合すると、これらの結果は、ICP27は、少なくとも豊富なICP0発現又は補完活性の存在下においてサイレントなJΔNI5ゲノムを抑圧解除(derepress)するために必須ではないことを示し、JΔNI2に感染させたHDFにおける最小量のICP0発現は、ウイルスゲノムの至る所における制限された(limited)転写活性を維持するのに十分である(suffice)ことを示唆した。
神経細胞への感染時には、HSVは、ウイルスゲノムがLAT遺伝子座を除いて転写的にサイレントな潜伏状態(latent state)に入る。そうでなければサイレントなウイルスゲノムとの関係においてLAT遺伝子座が非神経細胞において同様に活性なままであるか否かを調べた。この目的を達成するために、CAGエンハンサ/プロモータ及びEGFP遺伝子(CAGp-GFP)からなる発現カセットを、JΔNI5のLATの2-kbイントロン領域に導入し、JΔNI7GFP(図13A)と呼ばれるベクターコンストラクトを作り出した。コントロールとして、同じCAGp-GFPカセットをJΔNI5のUL3-UL4遺伝子間領域に導入し、ベクターJΔNI6GFP(図13A)を作製した。UL3-UL4遺伝子間領域を導入遺伝子カセットの非破壊的挿入(non-disruptive insertion)のために使用し(Baines et al., J. Virol. 65, 938-44(1991); Menotti et al, J. Virol. 76, 5463-71 (2002))、該UL3-UL4遺伝子間領域は、LAT遺伝子座に近接するが、LAT遺伝子座の外部である。明細書中の他のところには、「JΔNI6GFP」を「JΔNI6-CAGGFP」として言及する(図1Aも参照)。感染性ウイルスをU2OS-ICP4/27細胞において作製し、新規のウイルスストックのgc:PFUの割合は、JΔNI5のそれと同様だった(表2)。JΔNI6-CAGGFP及びJΔNI7GFPの両方が、U2OS-ICP4/27細胞における増幅の間、豊富な緑色及び赤色蛍光を生じ、その導入遺伝子発現カセットの完全性(integrity)を確認した。これらのウイルスが非補完細胞においてEGFP導入遺伝子を発現することが可能であることを検証するために、HDFに感染させるgc/細胞を増加させていき、EGFP蛍光を、3 dpiに記録した(図13B)。JΔNI7GFPに感染させた細胞は、豊富な、ウイルス用量依存的EGFP発現を示し、一方、JΔNI6-CAGGFP感染では、最も高用量においてさえ、引き起こされた発現は限定的だった。より初期のJΔNI5感染に比べて、より高いウイルスインプットが用いられたにもかかわらず、mCherry発現は、極めて少ないままであった。これらの結果を、3及び5 dpiにおけるEGFP及びmCherry mRNAレベルのqRT-PCR測定によって確認し(図13C)、これらの結果は、JΔNI6-CAGGFP及びJΔNI7GFPウイルスゲノムは、JΔNI5ゲノムと同様に、感染させたHDFにおいてサイレントであるが、LAT遺伝子座は、転写的に活性のままであるという示唆と整合した。JΔNI7GFPに感染させた細胞におけるEGFP mRNAレベルは、少なくとも5 dpiにおいて3 dpiと同じくらい高いため(図13C)、細胞が十分に接触阻止(contact-inhibited)されている場合に、発現をより後期(later times)に検出可能であるかを調査した。結果は、発現がいくつかの細胞において少なくとも4週間持続され得るということを示した(図13D)。総合すると、これらの観察結果は、LAT遺伝子座が、全てのIE遺伝子発現の機能的な欠失に起因して非毒性であるHSVゲノムからの、持続性のある(durable)導入遺伝子発現のための特別な部位であることを示した。
潜伏期間中のLAT発現は、潜伏関連プロモータ(LAP)1及び2によって制御されるということが示された(Goins et al., J. Virol. 68, 2239-52 (1994); Zwaagstra et al., Virology 182, 287-97 (1991))。LAP1は、安定な2-kb LATイントロンに加工される(processed)約8.7-kbの、不安定なLATの一次転写産物の転写開始部位の上流に位置し、一方、LAP2は、第1エキソンにおいてLAP1の下流に位置し、2-kbイントロン領域に延びる。イントロンまで多少遠くに延びる、LAP2を含む領域は、LATP2と呼ばれている。プロモータとして作用するのに加え、LAP2/LATP2領域は、ニューロンにおける導入遺伝子発現のための位置に依存しない(position-independent)長期間の発現/エンハンサエレメントとして作用し得ることが示された(Berthomme et al, J. Virol. 74, 3613-22 (2000); Palmer et al., J Virol. 74, 5604-18 (2000))。しかしながら、LAT遺伝子座は、CTRLと呼ばれるCTCF結合部位が豊富な領域によって、潜伏の間、ウイルスゲノムの全体的なサイレンシングから保護され、該CTRLの1つは、LAP1の上流に位置し(CTRL1)、他のものは、LATP2のちょうど下流の2-kbイントロンに位置する(CTRL2)ことも報告されている(Blooom et al., Biochim. Biophys. Acta 1799, 246-56 (2010))。従って、JΔNI7GFPを感染させたHDFにおいて観察されたEGFP発現を可能にするLATP2及びCTRLエレメントの潜在的な役割が探索された。3のエレメントを、別々に、及び組み合わせにおいてJΔNI7GFPゲノム(図14A)から欠失させ、感染させたHDFにおけるレポーター遺伝子発現を検証した(図14B, 14C)。CTRL1(ΔC1)又はLATP2(ΔLP2)のいずれかの欠失は、緑色蛍光及びEGFP mRNAレベルにおける際立った減少を引き起こし、一方、CTRL2(ΔC2)の欠失は、小規模な(minor)効果のみがあった。両方のCTRL(ΔC12)の欠失は、CTRL1単独の欠失と同じ効果があるが、全ての3のエレメント(ΔC12LP2)の欠失は、JΔNI6-CAGGFPを感染させた細胞においてみられたレベルまで更に発現を減少させた。mCherry蛍光は、いかなる感染させた細胞においても全く検出されず(図14B)、異なる欠失がウイルスゲノムにおいて他の部位の抑圧解除(derepression)を引き起こさないことを示唆した。これらの結果は、ウイルスゲノムが全てのIE遺伝子を機能的に欠いているという状況で、転写のサイレンシングから連結された(linked)導入遺伝子を保護することにおいてCTRL1及びLATP2領域の両方が重要な役割を果たすことを示した。
IE遺伝子産物の非存在下におけるサイレンシングに対して、組み込まれた(embedded)導入遺伝子発現カセットを保護するために、LAT遺伝子座に結合した配列が十分であるかを決定するために、2のCTRL、LAP1及びLATP2を含む、JΔNI7GFPのLAT:CAGp-GFP領域に対応する制限フラグメント(restriction fragment)を、同じLAT領域を欠失させて天然の部位と新たな部位との間の組み換えを回避したJΔNI5派生物における2の異所性位置の1つに挿入した。第1に、ゲートウェイ(GW)組み換えカセットを、UL45及び46(JΔNI9GW)の間、あるいはLATを欠失させたJΔNI5ゲノムのUL50及びUL51(JΔNI10GW)の間の遺伝子間領域に導入し、その後、LAT:CAGp-GFPフラグメント又はLAT配列を有していないCAGp-GFPのみを、GWカセットとの組み換えによって導入した(図15A)。U2OS-ICP4/27細胞(表2)におけるウイルス作製に続いて、ベクターを、感染させたHDFにおけるレポーター遺伝子発現について検査した。3 dpiには、レポーターカセット(JΔNI9GFP及びJΔNI10GFP)の周囲(surrounding)にLAT配列を欠くベクターが、JΔNI6-CAGGFPコントロールベクターと同様に、感染させた細胞において低いレベルのEGFP蛍光(Fig15B)及びmRNA(図15C)を示し、2の遺伝子間の挿入部位が、UL3及びUL4の間の遺伝子間領域と同様に(図13)、転写的に抑制されることを示唆した。しかしながら、レポーターカセットがLAT配列に両側で隣接していた場合(ベクターJΔNI9LAT-GFP及びJΔNI10LAT-GFP)、EGFP発現がJΔNI7GFPに感染させた細胞にみられるレベルまで増加し(図15B)、LATに由来する領域の抗サイレンシング活性が、位置に依存しない態様で機能的(functional)であることを示した。この活性がLATP2及びいずれか又は両方のCTRLに依存するか(dependence)を確認するために、LATP2及びCTRLを欠失させた型(version)のLAT:CAGp-GFPフラグメントを、GW組み換えによってJΔNI10GWゲノムに導入した。欠失は、より初期のJΔNI7GFPΔC12LP2ベクター(図14A)のLAT領域におけるそれと同じであった。LATフリー(LAT-free)JΔNI 10GFPベクターを用いてみられたレベル(図15C、15D)まで十分に減少したわけではないが、欠失により、感染させたHDFにおけるEGFP発現が減少した。なぜΔC12LP2欠失が、JΔNI7GFP(約50倍、図14C)におけるものに比べて、ここではより小さな効果(約3.5倍)があるようにみえるのかは明確でない。しかしながら、これらの結果は、2のCTRL、LAP1及びLATP2を含むLAT遺伝子座の一部が、IE遺伝子発現の非存在下でウイルスゲノムの全体的なサイレンシングに対して位置に依存しない態様で組み込まれた導入遺伝子発現カセットを保護し得ることを明示し、少なくともCTRL1及びLATP2がこの活性において役割を果たすことを示す。
HDF以外のこれらの知見の適用可能性を評価するために、選択したベクターからのEGFP及びmCherry発現を他の細胞タイプにおいて検査した。qRT-PCRにより、3 dpiにおいて、JΔNI6-CAGGFPに感染させたヒト細胞に比べてより高いEGFP mRNAレベルが、JΔNI7GFPに感染させたヒト細胞においてみられた(図16B)。最も大きな差が、BJヒト包皮線維芽細胞(約35倍)においてみられ、HDF(約30倍、図13C)及びヒト肝細胞(hHEP)(約40倍)における差と同様であった。ヒト新生児角化細胞(hEK)が最も小さな差(約4.5倍)を示し、中間値(intermediate values)が、筋肉由来幹細胞(muscle-derived stem cells, hMDSC)(約10倍)及び前脂肪細胞(hPAD)(約7倍)においてみられた。胎児ラット(fetal rat)後根神経節(rDRG)ニューロンにおける2のベクターの比較で明らかになったのは、たったの約2.5倍の差だった。図16Aは、同じ感染条件下で行われた独立した実験からの3 dpiの典型的な蛍光画像を示す。図16Bにおけるドナーとは異なるここでのドナー(donor)からのhHEPを例外として、結果は、大部分が、qRT-PCRデータと整合した。興味深いことに、ヒト細胞は、どれも有意なmCherry蛍光を示さなかったが、JΔNI6-CAGGFPに感染させたラットDRG培養物及びJΔNI7GFPに感染させたラットDRG培養物の両方において豊富なmCherry発現がみられた。この観察結果が、神経細胞に特有であり、かつ、mCherry遺伝子の直前のプロモータ、ウイルスゲノムにおける発現カセットの位置、及び/又はラット起源の細胞の影響であり得るかはまだ分かっていない。hMDSCを、長期間、維持し、JΔNI7GFPに感染させた細胞において長期間(over time)EGFP発現を測定することを可能にした。図16Cに示す通り、EGFPは、JΔNI7GFPに感染させた細胞において感染後少なくとも4週間、容易に検出可能であったが、JΔNI6GFPに感染させた細胞においては、JΔNI7GFPに感染させたHDF(図13D)の観察結果と同様に、そうではなかった。
本実施例は、JΔNI8の構築及び特性を実例で示す。
本実施例は、長期間の試験におけるJΔNI7-GFPベクターからのインビボの発現を実例で示す。
本実施例は、感染させた初代星状膠(astrocytes)内のJΔNI7-GFPベクターからのmCherry導入遺伝子の発現に関する。
本実施例は、本発明のHSVベクターを補完し、かつ、ウイルスを増やす間、loxPに隣接する(loxP-flanked)BACカセットの切除も促進するための細胞株の生成を実例で示す。
Claims (59)
- 単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターであって、該単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターが、非補完細胞において毒性HSV遺伝子を発現せず、かつ、1以上の導入遺伝子を含むゲノムを含み、前記ベクターが非補完細胞において少なくとも28日間、導入遺伝子を発現することが可能である、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター。
- 前記ベクターが、培養されたヒト皮膚線維芽(HDF)非補完細胞において感染後少なくとも28日間(dpi)、導入遺伝子を発現することが可能である、請求項1に記載のHSVベクター。
- 前記導入遺伝子が、前記ゲノムの潜伏関連転写(LAT)遺伝子領域内に挿入され、前記ベクターが、前初期遺伝子としてICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47を発現しない、請求項1又は2に記載のHSVベクター。
- 前記導入遺伝子が前記ゲノムのICP4遺伝子座内に挿入され、かつ、前記ベクターが、前初期遺伝子として、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47を発現しない、請求項1〜3のいずれかに記載のHSV。
- 前記導入遺伝子がインシュレーター配列と操作可能に連結して前記ゲノム内に挿入され、前記ベクターが、前初期遺伝子として、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47を発現しない、請求項1〜4のいずれかに記載のHSVベクター。
- 前記インシュレーター配列がヘテロクロマチン形成から保護する遺伝的エレメントである、請求項5に記載のHSVベクター。
- 前記インシュレーター配列が、HSVクロマチン境界(CTRL/CTCF-結合/インシュレーター)エレメントCTRL1及びCTRL2、ニワトリ高感受性部位4インシュレーター(cHS4)、ヒトHNRPA2B1--CBX3ユビキタスクロマチンオープニングエレメント(UCOE)、及びヒトインターフェロンベータ遺伝子(IFNB1)からのスキャッフォールド/マトリックス結合領域(S/MAR)からなるグループから選択される、請求項5又は6に記載のHSVベクター。
- 前記導入遺伝子が、前記ゲノム内の前記インシュレーター配列の約5 kb内に挿入される、請求項5〜7のいずれかに記載のHSVベクター。
- 前記ゲノムの前記ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47遺伝子座のうちの1以上が、不活化欠失を含む、請求項3〜8のいずれかに記載のベクター。
- 前記ゲノム内の少なくともICP0、ICP4、及びICP27の不活化欠失を含む、請求項3〜9のいずれかに記載のベクター。
- 前記不活化欠失(複数可)の少なくとも1つが前記遺伝子座又は複数の該遺伝子座内のコーディング配列(複数可)の完全欠失である、請求項9又は10に記載のベクター。
- ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47遺伝子座のうちの1以上が、初期又は後期遺伝子として発現される、請求項3〜11のいずれかに記載のベクター。
- ICP22が初期遺伝子として発現される、請求項12に記載のベクター。
- 前記ゲノム内のICP22が初期プロモータの制御下にある、請求項13に記載のベクター。
- 前記導入遺伝子が前記ゲノム内においてインシュレーター配列に隣接する、請求項1〜14のいずれかに記載のHSVベクター。
- 前記ゲノムがクロマチン境界エレメントCTRL1及びCTRL2を含み、前記導入遺伝子が前記CTRL1及びCTRL2エレメントの両方の約4 kb内である、請求項1〜15のいずれかに記載のHSVベクター。
- 1以上の必須でない遺伝子を欠失させることを更に含む、請求項1〜16のいずれかに記載のベクター。
- 前記ベクターがUL41を発現しない、請求項1〜17のいずれかに記載のベクター。
- 前記ゲノム内のUL41の不活化欠失を含む、請求項18に記載のベクター。
- 前記ゲノムから内部リピート領域(ジョイント)を欠失させることを含む、請求項1〜19のいずれかに記載のベクター。
- 野生型HSVに関連する以下の遺伝的摂動:
(a)ICP0をコードする遺伝子の不活化欠失、
(b)ICP4をコードする遺伝子の不活化欠失、
(c)ジョイントの欠失、
(d)ICP22をコードする遺伝子が、初期プロモータの制御下であること、
(e)ICP27をコードする遺伝子の不活化欠失、及び
(f)プロモータ及びICP47をコードする遺伝子の開始コドンの欠失
を含む、請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。 - UL41における不活化欠失を更に含む、請求項21に記載のベクター。
- 前記ゲノムがCTRL1とCTRL2配列とLATP2又はLAP2エンハンサエレメントとを含むLAT遺伝子領域を含み、第1導入遺伝子が前記CTRL1及びCTRL2配列の間の前記LAT遺伝子領域に挿入される、請求項21又は22に記載のベクター。
- 前記第1導入遺伝子が、前記LATP2及びCTRL1エレメントの間の前記LAT遺伝子領域に挿入される、請求項23に記載のベクター。
- 前記第1導入遺伝子が、LATP2及びCTRL2エレメントの間の前記LAT遺伝子領域に挿入される、請求項23に記載のベクター。
- 野生型糖タンパク質と比較して感染性を強める変異糖タンパク質、又は非古典的受容体を介する細胞へのHSVの進入を誘導する変異糖タンパク質を含むエンベロープを含む、請求項1〜25のいずれかに記載のベクター。
- 前記ゲノムが、野生型糖タンパク質と比較して感染性を強める変異糖タンパク質、又はノンカノニカル受容体を介する細胞へのHSVの進入を誘導する変異糖タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項1〜26のいずれかに記載のベクター。
- 前記糖タンパク質がgB、gC、gD、gH、gK、又はその組み合わせである、請求項26又は27に記載のベクター。
- 前記ゲノムがICP4内の不活化欠失を含み、導入遺伝子が前記ICP4欠失の部位へ挿入される、請求項1〜28のいずれかに記載のベクター。
- 前記ゲノムが、LAT遺伝子領域以外の部位又はICP4遺伝子座以外の部位に挿入された発現カセットを更に含む、請求項1〜29のいずれかに記載のベクター。
- 導入遺伝子が哺乳動物の構成的なプロモータを含む、請求項1〜30のいずれかに記載のベクター。
- 導入遺伝子が細胞又は組織特異的プロモータを含む、請求項1〜30のいずれかに記載のベクター。
- 導入遺伝子がポリシストロニックである、請求項1〜32のいずれかに記載のベクター。
- 導入遺伝子がmicroRNAのための1以上の結合部位を含む、請求項1〜33のいずれかに記載のベクター。
- 前記ベクターがLAT遺伝子領域内に複数の導入遺伝子カセットを含み、該複数の導入遺伝子カセットがそれぞれ別個のプロモータ及びコーディング領域を含み、それぞれがモノシストロニック又はポリシストロニックのいずれかである、請求項1〜34のいずれかに記載のベクター。
- 1以上の前記導入遺伝子が、Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、L-myc、ドミナントネガティブp53、Nanog、Glis1、Lin28、TFIID、GATA4、Nkx2.5、Tbx5、Mef2C、Myocd、Hand2、SRF、Mesp1、SMARCD3、SERCA2a、Pax3、MyoD、Lhx2、FoxG1、FoxP2、Isl1、Ctip2、Tbr1、Ebf1、Gsx2、Srebp2、第VIII因子、第IX因子、ジストロフィン、CFTR、GlyRα1、エンケファリン、GADアイソフォーム、神経栄養因子、Ascl1、Nurr1、Lmx1A、Brn2、Myt1l、NeuroD1、FoxA2、Hnf4α、Foxa1、Foxa2又はFoxa3、microRNA、miRNAの組み合わせ、あるいは1以上のノンコーディングRNA(複数可)(ncRNA(s))をコードする、請求項1〜35のいずれかに記載のベクター。
- 前記ゲノムが、リコンビナーゼ酵素のための1又は2のコンセンサス配列を含む、請求項1〜36のいずれかに記載のHSVベクター。
- 前記ゲノムが、部位特異的リコンビナーゼ酵素のためのコンセンサス配列に隣接する細菌人工(BAC)染色体カセットを含む、請求項1〜37のいずれかに記載のHSVベクター。
- 部位特異的リコンビナーゼ酵素のためのコンセンサス配列が遺伝子間領域に挿入される、請求項37又は38に記載のHSVベクター。
- 潜伏関連転写(LAT)遺伝子領域内に挿入された1以上の導入遺伝子発現カセットの付加を伴うJΔNI5又はJΔNI8であるHSVベクターであって、ICP4におけるmCherry導入遺伝子が異なるコーディング配列で置き換えられる、HSVベクター。
- インシュレーター配列を含む1以上の導入遺伝子発現カセットの付加を伴うJΔNI5又はJΔNI8であるHSVベクターであって、該カセットが、潜伏関連転写(LAT)遺伝子領域以外の部位に挿入され、ICP4におけるmCherry導入遺伝子が異なるコーディング配列で置き換えられる、HSVベクター。
- 請求項1〜41のいずれか1項に記載の前記ベクターの製造のための補完細胞であって、前記補完細胞がU2OS細胞であり、該U2OS細胞が、HSVに感染した場合にトランスに発現されるICP4発現カセットを含む、補完細胞。
- 前記細胞がHSVに感染した場合に誘導可能にトランスに発現されるICP27発現カセットを更に含む、請求項42に記載の補完細胞。
- 前記補完細胞が、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を発現する、請求項42又は43に記載の補完細胞。
- 請求項42〜44のいずれかに記載の複数の細胞を含むクローン集団。
- 請求項42に記載の細胞集団にベクターDNAを導入すること、プラークが形成するまで前記集団を培養すること、請求項42に記載の、次第に大きさを増す、新鮮な細胞集団へ感染粒子を繰り返し移入することによるウイルスの増幅、及び90%細胞変性効果における前記細胞から前記ベクターを最終的に精製することを含む、請求項1〜41のいずれか1項に記載のベクターを増やすための方法。
- 少なくとも107 pfu/mlの、請求項1〜41のいずれかに記載の前記ベクターを含むストック。
- 前記ベクター内の1以上の前記導入遺伝子が前記細胞内に発現するように、非補完細胞を請求項1〜41のいずれか1項に記載のHSVベクターに感染させることを含む、導入遺伝子を発現させる方法。
- 前記細胞がインビボのものである、請求項48に記載の方法。
- 前記細胞が、肝細胞、肺細胞、上皮細胞、神経細胞、心臓細胞、筋細胞、幹細胞、又は癌細胞である、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞がインビトロのものである、請求項45に記載の方法。
- 1以上の前記導入遺伝子が、Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、L-Myc、ドミナントネガティブp53、Nanog、Glis1、Lin28、TFIID、mir-302/367、又は他のmiRNAのうちの1以上をコードし、これによって前記導入遺伝子発現下において、前記細胞が、人工多能性幹(iPS)細胞になる、請求項51に記載の方法。
- 1以上の前記導入遺伝子が、前記細胞を分化転換するための1以上の因子をコードする、請求項51に記載の方法。
- 前記細胞がヒトのものである、請求項48〜53のいずれかに記載の方法。
- 1以上の前記導入遺伝子が被験体の前記細胞内に発現されるように、前記被験体の細胞に感染させるために十分な量及び位置において、請求項1〜41のいずれか1項に記載の前記ベクターを前記被験体に投与することを含み、前記発現された導入遺伝子(複数可)が1以上の予防的に又は治療的に活性なタンパク質、ポリペプチド又はncRNAをコードする、被験体における疾患又は状態を治療する方法。
- 前記疾患又は状態が癌であり、前記発現された導入遺伝子(複数可)が腫瘍殺傷活性を強める物質をコードする、請求項55に記載の方法。
- 前記疾患又は状態が、筋ジストロフィー、循環器疾患、神経変性疾患、慢性痛、肺疾患、又は血友病である、請求項55に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項55〜57のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜41のいずれかに記載のベクター及び医薬的に許容可能な担体を含む、組成物。
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