BR112020021804A2 - genoma de herpes vírus recombinante, vírus herpes, composição, uso do vírus herpes, métodos para intensificar, aumentar, ampliar e/ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas da matriz extracelular dérmica, de uma ou mais proteínas de colágeno, o tecido mole de um sujeito, para melhorar a condição, qualidade e/ou aparência da pele, para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele, para aumentar e/ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele e para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento - Google Patents

genoma de herpes vírus recombinante, vírus herpes, composição, uso do vírus herpes, métodos para intensificar, aumentar, ampliar e/ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas da matriz extracelular dérmica, de uma ou mais proteínas de colágeno, o tecido mole de um sujeito, para melhorar a condição, qualidade e/ou aparência da pele, para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele, para aumentar e/ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele e para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento Download PDF

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Abstract

genoma de herpes vírus recombinante, vírus herpes,composição, uso do vírus herpes, métodos para intensificar, aumentar, ampliar e/ou suplementar osníveis de uma ou mais proteínas da matriz extracelular dérmica, de uma ou mais proteínas de colágeno, o tecido mole de um sujeito, para melhorar a condição, qualidade e/ou aparência da pele, para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele, para aumentar e/ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele e para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento. a presente divulgação fornece ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais proteínas cosméticas (por exemplo, uma ou mais proteínas de colágeno humanas); vírus que compreendem os ácidos nucleicos recombinantes; composições (por exemplo, formulações cosméticas) compreendendo os ácidos nucleicos recombinantes e/ou vírus; métodos de seu uso; e artigos de fabricação ou kits dos mesmos.

Description

1 / 236 GENOMA DE HERPES VÍRUS RECOMBINANTE, VÍRUS HERPES, COMPOSIÇÃO, USO DO VÍRUS HERPES, MÉTODOS PARA INTENSIFICAR, AUMENTAR, AMPLIAR E/OU SUPLEMENTAR OS
NÍVEIS DE UMA OU MAIS PROTEÍNAS DA MATRIZ EXTRACELULAR DÉRMICA, DE UMA OU MAIS PROTEÍNAS DE COLÁGENO, O TECIDO MOLE DE UM SUJEITO, PARA MELHORAR A CONDIÇÃO, QUALIDADE E/OU APARÊNCIA DA PELE, PARA REDUZIR O APARECIMENTO DE UMA OU MAIS DEPRESSÕES SUPERFICIAIS NA PELE, PARA AUMENTAR E/OU MELHORAR PELO MENOS UM DE TEXTURA, SUAVIDADE, ELASTICIDADE OU TENSÃO DA PELE E PARA DIMINUIR UM OU MAIS SINAIS DERMATOLÓGICOS DE ENVELHECIMENTO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. 62/663.476, depositado em 27 de abril de 2018, que está incorporado neste documento como referência na sua totalidade.
APRESENTAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] O conteúdo da seguinte submissão em arquivo de texto ASCII é incorporado aqui por referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequência (nome do arquivo: 761342000640SEQLIST.txt, data de registro: 26 de abril de 2019, tamanho: 437 KB )
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente divulgação se refere, em parte, a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais proteínas cosméticas (por exemplo, uma ou mais proteínas de colágeno humanas); a vírus que compreendem os ácidos nucleicos recombinantes; a composições (por exemplo, formulações cosméticas)
2 / 236 compreendendo os ácidos nucleicos recombinantes e / ou vírus; aos métodos de seu uso; e a artigos de fabricação ou kits dos mesmos.
FUNDAMENTOS
[004] A pele, como todos os órgãos do corpo humano, sofre alterações sequenciais e muitas vezes cumulativas com o passar do tempo. O envelhecimento da pele ocorre como resultado de vários fatores, incluindo alterações inerentes à pele, os efeitos da gravidade e dos músculos faciais que agem sobre a pele, perda ou deslocamento do tecido mole e perda da elasticidade do tecido. Curiosamente, o fenótipo “envelhecido” da pele pode ser acelerado por fatores ambientais, mais notavelmente, a exposição crônica à radiação ultravioleta (por exemplo, do sol). Clinicamente, o fenótipo de pele envelhecido pode ser descrito como enrugado, flácido e / ou geralmente menos elástico e resiliente do que sua contraparte jovem, embora existam variações dentro desse fenótipo entre o envelhecimento cronológico natural e o fotoenvelhecimento.
[005] A matriz extracelular dérmica (ECM) compreende a maior parte da pele e confere força e resiliência. O colágeno, um componente importante do tecido conjuntivo que fornece suporte à pele, diminui com o envelhecimento. Na pele envelhecida, as fibrilas de colágeno exibem altos níveis de degradação e fragmentação e são repostas por fibroblastos dérmicos em taxas decrescentes. Esses feixes de colágeno degradado e fragmentado tornam-se mais soltos e perdem força (interrompendo a organização estrutural da ECM dérmica), e inextricavelmente levam a uma manifestação “envelhecida” da pele.
[006] Vários produtos de cuidado da pele foram desenvolvidos para melhorar a aparência da pele humana. Rugas e dobras cutâneas são comumente tratadas com injeções dérmicas e subdérmicas de preenchimentos faciais estéticos; no entanto, essa abordagem superficial não aborda as mudanças estruturais subjacentes ao envelhecimento da pele, em particular, o dano ou
3 / 236 perda de colágeno. Assim, existe uma necessidade clara de estratégias alternativas para suplementar, fortalecer ou substituir componentes dérmicos da ECM (por exemplo, colágeno humano), em indivíduos que desejam combater ou reverter os efeitos fisiológicos do envelhecimento da pele.
[007] Todas as referências aqui citadas, incluindo os pedidos de patente, publicações de patentes, e números de acessão NCBI/UniProtKB/Swiss-Prot são aqui incorporadas por referência na sua totalidade, como se cada referência individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.
BREVE SUMÁRIO
[008] A fim de atender a essas e outras necessidades, são fornecidos neste documento ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, genomas virais de herpes recombinantes) que codificam uma ou mais proteínas cosméticas para uso em vírus (por exemplo, vírus herpes), composições, formulações, medicamentos e / ou métodos para aplicações estéticas / cosméticas (por exemplo, tratamento de rugas). Os presentes inventores demonstraram que os vírus atenuados recombinantes aqui descritos eram capazes de 1) transduzir de forma eficaz as células epidérmicas / dérmicas humanas e 2) expressar com sucesso o colágeno humano exógeno codificado (mRNA e proteína), onde a proteína poderia então se localizar na região apropriada em culturas organotípicas equivalentes à pele (ver, por exemplo, Exemplo 2). Além disso, os presentes inventores mostraram que os vírus descritos neste documento podem ser administrados com sucesso tanto topicamente quanto intradermicamente sem citotoxicidade significativa da célula hospedeira, permitindo que o colágeno humano expresso a partir desses vírus se localize na região apropriada da ECM dérmica após administração in vivo sem danos observáveis à pele (ver, por exemplo, Exemplos 3 e 7). Além disso, os presentes inventores demonstraram que várias espinhas dorsais de HSV diferentes podem ser usados para construir vírus que expressam colágenos humanos (ver, por
4 / 236 exemplo, Exemplo 2), que múltiplas estratégias podem ser empregadas para expressar com sucesso mais de uma proteína de colágeno humana de um único genoma recombinante (ver por exemplo, Exemplo 5), e que os vírus candidatos podem expressar com sucesso proteínas de colágeno humanas em múltiplos modelos relevantes in vitro e in vivo de envelhecimento de pele cronológico ou induzido por UV (ver por exemplo, Exemplos 6 e 7). Além disso, os presentes inventores demonstraram que os vírus aqui descritos podem ser engenheirados com sucesso para expressar outras proteínas cosméticas (por exemplo, lamininas humanas) tanto in vitro e in vivo, onde essas proteínas se localizam na região apropriada da ECM dérmica (ver, por exemplo, Exemplo 8). Sem desejar estar limitado pela teoria, os dados aqui descritos fornecem forte evidência de que os ácidos nucleicos recombinantes e / ou vírus da presente divulgação podem constituir um novo meio para distribuir proteínas cosméticas (por exemplo, proteínas de colágeno humanas, como Colágeno humano 1 e Colágeno humano 3) e, em particular, para suplementar ou substituir proteínas ECM dérmicas humanas naturais em aplicações estéticas (por exemplo, para reduzir o aparecimento de envelhecimento ou rugas induzidas por foto).
[009] Por conseguinte, certos aspectos da presente divulgação se referem a um genoma de vírus herpes recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína cosmética. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante compreende duas ou mais cópias do primeiro polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante é competente para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante é defeituoso na replicação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes recombinante é selecionado a partir de um genoma do vírus herpes simplex recombinante, um genoma do vírus da varicela zóster recombinante, um genoma do citomegalovírus humano recombinante,
5 / 236 um genoma do herpesvírus 6A recombinante, um genoma do herpesvírus 6B recombinante, um genoma do herpesvírus 7 recombinante, um genoma do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi recombinante e quaisquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes recombinante é um genoma do vírus herpes simplex recombinante. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma do vírus herpes simplex do tipo 1 recombinante (HSV-1), um genoma do vírus herpes simplex do tipo 2 (HSV-2) recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos.
[0010] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma do vírus herpes simplex tipo 1 recombinante (HSV- 1). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a mutação de inativação está em um gene do vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene do vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o gene do vírus herpes simplex é selecionado de Proteína Celular Infectada (ICP) 0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), Região Única Longa (UL) 41 e UL55. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no
6 / 236 gene UL41. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP0. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL55. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação na região de Junta. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma deleção da região de Junta. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo em um ou ambos os loci do gene viral ICP4.
[0011] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína cosmética é selecionada de uma primeira proteína de colágeno, uma primeira proteína de fibronectina, uma primeira proteína de elastina, uma primeira proteína lumicano, uma primeira proteína de vitronectina, um primeira proteína de receptor de vitronectina, uma primeira proteína laminina, uma primeira proteína neuromoduladora e uma primeira proteína fibrilina. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína cosmética compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de
7 / 236 sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21 e 53-64. Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma proteína de matriz extracelular estrutural (por exemplo, uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina, uma proteína de laminina, uma proteína de fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina ou uma proteína de laminina (por exemplo, uma proteína de colágeno humana, uma proteína de elastina humana, uma proteína de fibronectina humana ou uma proteína de laminina humana). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno é uma proteína de colágeno humana.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno é selecionada de um polipeptídeo de cadeia alfa-1(I) de colágeno (COL1-1), polipeptídeo de cadeia alfa-2(I) de colágeno (COL1-2 ), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(II) de colágeno (COL2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(III) de colágeno (COL3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IV) de colágeno (COL4- 1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(IV) de colágeno (COL4-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IV) de colágeno (COL4-3), polipeptídeo de cadeia alfa-4(IV) de colágeno (COL4-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(IV) de colágeno (COL4-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(IV) de colágeno (COL4-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(V) de colágeno (COL5-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (V) de colágeno (COL5-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(V) de colágeno (COL5-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VI) de colágeno (COL6-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(VI) de colágeno (COL6-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(VI) de colágeno (COL6-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-4(VI) de colágeno (COL6-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(VI) de colágeno (COL6-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(VI) de colágeno (COL6-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VIII) de colágeno
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(COL8), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IX) de colágeno (COL9-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (IX) de colágeno (COL9-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IX) de colágeno (COL9-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(X) de colágeno (COL10), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XI) de colágeno (COL11-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(XI) de colágeno (COL11-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XII) de colágeno (COL12), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIII) de colágeno (COL13), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XIV) de colágeno (COL14), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XV) de colágeno (COL15), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVI) de colágeno (COL16), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVII) de colágeno (COL17), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVIII) de colágeno (COL18), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIX) de colágeno (COL19), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XX) de colágeno (COL20), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXI) de colágeno (COL21), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXII) de colágeno (COL22), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIII) de colágeno (COL23), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIV) de colágeno (COL24), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXV) de colágeno (COL25), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XXVI) de colágeno (COL26), um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVII) de colágeno (COL27) e um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVIII) de colágeno (COL28). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 e COL17. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades que podem ser
9 / 236 combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno é COL3. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno é COL3 humana. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína cosmética não é um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno (COL7).
[0012] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo consiste essencialmente na primeira proteína cosmética. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo consiste na primeira proteína cosmética. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo compreende: (a) a primeira proteína cosmética; (b) uma outra proteína cosmética; e (c) um polipeptídeo ligante que liga (a) a (b). Em algumas modalidades, a outra proteína cosmética é selecionada de uma proteína de colágeno, uma proteína de fibronectina, uma proteína de elastina, uma proteína lumicano, uma proteína de vitronectina, uma proteína de receptor de vitronectina, uma proteína de laminina, uma proteína neuromoduladora e uma proteína de fibrilina. Em algumas modalidades, a outra proteína cosmética é uma proteína de matriz extracelular estrutural (por exemplo, uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina, uma proteína de laminina, uma proteína de fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a outra proteína cosmética é uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina ou uma proteína de laminina (por exemplo, uma proteína de colágeno humana, uma proteína de elastina humana, uma proteína de fibronectina humana ou uma proteína de
10 / 236 laminina humana). Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno (por exemplo, uma outra proteína de colágeno humana) é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4- 6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno (por exemplo, uma outra proteína de colágeno humana) é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética e a outra proteína cosmética são diferentes. Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é COL1-1 (por exemplo, COL1-1 humana) e a outra proteína cosmética é COL1-2 (por exemplo, COL1-2 humana). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% , pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada SEQ ID NOS: 28-31.
[0013] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico que compreende: (a) uma primeira estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo; (b) uma segunda ORF que codifica uma proteína cosmética adicional; e (c) um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) separando (a) e (b). Em algumas modalidades, a proteína cosmética adicional é selecionada de uma proteína de colágeno, uma proteína de fibronectina, uma proteína de elastina, uma proteína lumicano, uma proteína de vitronectina, uma proteína de receptor de vitronectina, uma proteína
11 / 236 de laminina, uma proteína neuromoduladora e uma proteína de fibrilina. Em algumas modalidades, a proteína cosmética adicional é uma proteína de matriz extracelular estrutural (por exemplo, uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina, uma proteína de laminina, uma proteína de fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a proteína cosmética adicional é uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina ou uma proteína de laminina (por exemplo, uma proteína de colágeno humana, uma proteína de elastina humana, uma proteína de fibronectina humana ou uma proteína de laminina humana). Em algumas modalidades, a proteína de colágeno adicional (por exemplo, uma proteína de colágeno humana adicional) é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno adicional (por exemplo, uma proteína de colágeno humana adicional) é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4- 1, COL4-2, COL6-1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética e a proteína cosmética adicional são diferentes. Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é COL1-1 (por exemplo, COL1-1 humana) e a proteína cosmética adicional é COL1-2 (por exemplo, COL1-2 humana). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica IRES tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23.
[0014] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com
12 / 236 qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes recombinante compreende ainda um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína cosmética.
Em algumas modalidades, a segunda proteína cosmética é selecionada de uma proteína de colágeno, uma proteína de fibronectina, uma proteína de elastina, uma proteína lumicano, uma proteína de vitronectina, uma proteína de receptor de vitronectina, uma proteína de laminina, uma proteína neuromoduladora e uma proteína de fibrilina.
Em algumas modalidades, a segunda proteína cosmética é uma proteína de matriz extracelular estrutural (por exemplo, uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina, uma proteína de laminina, uma proteína de fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a segunda proteína cosmética é uma proteína de colágeno, uma proteína de elastina, uma proteína de fibronectina ou uma proteína de laminina (por exemplo, uma proteína de colágeno humana, uma proteína de elastina humana, uma proteína de fibronectina humana ou uma proteína de laminina humana). Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno (por exemplo, uma segunda proteína de colágeno humana) é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno (por exemplo, uma segunda proteína de colágeno humana) é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda proteínas cosméticas são diferentes.
Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é COL1-1 (por exemplo, COL1-1 humana) e a segunda proteína cosmética adicional é COL1-2 (por exemplo, COL1-2 humana). Em algumas modalidades, a primeira proteína
13 / 236 cosmética é COL1-1 (por exemplo, COL1-1 humana) e a segunda proteína cosmética é COL3 (por exemplo, COL3 humana).
[0015] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes recombinante tem citotoxicidade reduzida quando introduzido em uma célula alvo, em comparação com um genoma do vírus herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula da epiderme e / ou derme. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula alvo é um fibroblasto.
[0016] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um vírus herpes compreendendo qualquer um dos genomas do vírus herpes recombinante aqui descritos. Em alguns aspectos, o vírus herpes é um vírus competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus herpes é defeituoso na replicação. Em algumas modalidades, o vírus herpes é atenuado. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus herpes tem citotoxicidade reduzida, em comparação com um vírus herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus herpes é selecionado de um vírus herpes simplex, um vírus varicela zoster, um citomegalovírus humano, um herpesvírus 6A, um herpesvírus 6B, um herpesvírus 7 e um herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus herpes é um vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex é um vírus herpes simplex do tipo 1 (HSV-1), um vírus herpes simplex do tipo 2 (HSV-2) ou quaisquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex é um vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1).
[0017] Outros aspectos da presente divulgação se referem a uma composição que compreende: (a) qualquer um dos genomas de vírus herpes
14 / 236 recombinante aqui descritos e / ou qualquer um dos vírus herpes aqui descritos; e (b) um excipiente. Em algumas modalidades, a composição é esterilizada. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é adequada para administração tópica, transdérmica, subcutânea, intradérmica, oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, retal, vaginal, inalada, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intraperitoneal, transmucosa, intravítrea, subrretiniana, intra-articular, periarticular, local ou epicutânea. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é adequada para administração intradérmica. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é adequada para injeção superficial. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é uma composição cosmética. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é um produto para o cuidado da pele.
[0018] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de qualquer um dos genomas do vírus herpes recombinante aqui descritos e / ou qualquer um dos vírus herpes aqui descritos como um medicamento (por exemplo, para uma indicação estética).
[0019] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de qualquer um dos genomas do vírus herpes recombinante aqui descritos e / ou qualquer um dos vírus herpes aqui descritos como uma terapia (por exemplo, como uma terapia estética ou cosmética).
[0020] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de qualquer um dos genomas do vírus herpes recombinante aqui descritos e / ou qualquer um dos vírus herpes aqui descritos na fabricação de um medicamento útil para o tratamento de um ou mais sinais ou sintomas de envelhecimento
15 / 236 dermatológico.
[0021] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas da matriz extracelular dérmica em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos vírus herpes aqui descritos e / ou qualquer uma das composições aqui descritas.
[0022] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas de colágeno em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos vírus herpes aqui descritos e / ou qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de colágeno são colágeno 3. Em algumas modalidades, os níveis de colágeno endógeno 3 são reduzidos como resultado do envelhecimento cronológico ou fotoenvelhecimento.
[0023] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar o tecido mole de um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos vírus herpes aqui descritos e / ou qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, a composição é injetada no tecido mole do sujeito.
[0024] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para melhorar a condição, qualidade e / ou aparência da pele em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos vírus herpes aqui descritos e / ou qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, a composição é administrada a um ou mais locais de dano solar ou outra exposição aos raios ultravioleta, textura áspera, flacidez da pele, rugas ou qualquer combinação dos mesmos.
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[0025] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos vírus herpes aqui descritos e / ou qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, uma ou mais depressões superficiais na pele são selecionadas do grupo que consiste em dobras nasolabiais, pés de galinha, linhas de expressão, linhas de preocupação, cicatrizes, linhas glabelares, ptose de sobrancelha, cavidades lacrimais, linhas nasojugal, linhas de coelho, ptose da bochecha / rosto médio, linhas de marionete, ondulações de papoula, linhas de sorriso, linhas de gargalhada, vincos do queixo, linhas do pescoço, faixas de platisma e quaisquer combinações dos mesmos.
[0026] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para aumentar e / ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos vírus herpes aqui descritos e / ou qualquer uma das composições aqui descritas.
[0027] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a pele do sujeito está envelhecendo. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a pele do sujeito está enrugada.
[0028] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos vírus herpes aqui descritos e / ou qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades,
17 / 236 a redução de um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento é indicada por: (a) tratamento, redução e / ou prevenção de linhas finas e / ou rugas; (b) redução do tamanho dos poros da pele; (c) melhora na espessura da pele, maciez e / ou esticamento; (d) melhora na maciez, elasticidade e / ou maciez da pele; (e) melhora no tom, brilho e / ou clareza da pele; (f) melhora na produção de procolágeno e / ou colágeno; (g) melhora da textura da pele e / ou promoção da retexturização; (h) melhora na aparência dos contornos da pele; (i) restauração do brilho e / ou da claridade da pele; (j) melhora da aparência da pele reduzida pelo envelhecimento e / ou menopausa; (k) melhora na hidratação da pele; (l) aumento da elasticidade e / ou resiliência da pele; (m) tratamento, redução e / ou prevenção ou flacidez da pele; (n) melhora da firmeza da pele; (o) redução de manchas pigmentares, manchas na pele e / ou cicatrizes (como cicatrizes de acne); (p) melhoria das propriedades ópticas da pele por difração de luz ou reflexão; ou (q) quaisquer combinações dos mesmos.
[0029] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus herpes ou composição é administrado topicamente, transdermicamente, subcutaneamente, epicutaneamente, intradermicamente, oralmente, sublingualmente, bucalmente, retalmente, vaginalmente, intravenosamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, por via intraóssea, intracardialmente, intraperitonealmente, por via transmucosa, por via intravítrea, sub-retinianamente, intra-articularmente, peri-articularmente, localmente ou via inalação para o sujeito. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus herpes ou composição é administrado intradermicamente ao sujeito. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus herpes ou composição é administrado por injeção superficial.
[0030] Outros aspectos da presente divulgação se referem a uma
18 / 236 composição que compreende: um vírus herpes simplex (HSV) que compreende um ácido nucleico recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína de colágeno humana e um excipiente. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do primeiro polinucleotídeo. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o HSV é com defeito de replicação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o HSV é competente para replicação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o HSV é um vírus herpes simplex tipo 1, um vírus herpes simplex tipo 2 ou quaisquer derivados dos mesmos.
[0031] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon do vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o amplicon do vírus herpes simplex é um amplicon HSV-1 ou um amplicon híbrido HSV-1. Em algumas modalidades, o amplicon híbrido HSV-1 é um amplicon híbrido HSV / AAV, um amplicon híbrido HSV / EBV e amplicon híbrido HSV / EBV / RV ou um amplicon híbrido HSV / Sleeping Beauty .
[0032] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um genoma do vírus herpes simplex recombinante. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma HSV-1 recombinante, um genoma HSV-2 recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em um gene do vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o gene do vírus herpes simplex é selecionado do grupo que consiste em Proteína Celular Infectada (ICP) 0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), Região Única Longa (UL) 41 e
19 / 236 UL55. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do(s) gene(s).
[0033] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro do locus de gene viral ICP22. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro do
20 / 236 locus de gene viral UL41. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o HSV tem citotoxicidade reduzida, em comparação com um vírus herpes simplex de tipo selvagem.
[0034] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana é selecionada de polipeptídeo de cadeia alfa-1(I) de colágeno (COL1- 1), polipeptídeo de cadeia alfa-2(I) de colágeno (COL1-2 ), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(II) de colágeno (COL2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(III) de colágeno (COL3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IV) de colágeno (COL4- 1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(IV) de colágeno (COL4-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IV) de colágeno (COL4-3), polipeptídeo de cadeia alfa-4(IV) de colágeno (COL4-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(IV) de colágeno (COL4-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(IV) de colágeno (COL4-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(V) de colágeno (COL5-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (V) de colágeno (COL5-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(V) de colágeno (COL5-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VI) de colágeno (COL6-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(VI) de colágeno (COL6-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(VI) de colágeno (COL6-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-4(VI) de colágeno (COL6-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(VI) de colágeno (COL6-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(VI) de colágeno (COL6-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VII) de colágeno (COL7) um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VIII) de colágeno (COL8), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IX) de colágeno (COL9-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (IX) de colágeno (COL9-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IX) de colágeno (COL9-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(X) de colágeno (COL10), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XI) de colágeno (COL11-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(XI) de colágeno (COL11-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XII) de colágeno (COL12), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XIII) de colágeno (COL13), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIV) de
21 / 236 colágeno (COL14), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XV) de colágeno (COL15), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVI) de colágeno (COL16), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVII) de colágeno (COL17), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVIII) de colágeno (COL18), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XIX) de colágeno (COL19), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XX) de colágeno (COL20), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXI) de colágeno (COL21), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXII) de colágeno (COL22), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIII) de colágeno (COL23), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIV) de colágeno (COL24), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XXV) de colágeno (COL25), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXVI) de colágeno (COL26), um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVII) de colágeno (COL27) e um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVIII) de colágeno (COL28). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7, e COL17. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a sequência de ácido nucleico que codifica a primeira proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS : 1-14. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das
22 / 236 modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana não é COL7.
[0035] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o primeiro polipeptídeo compreende: (a) a primeira proteína de colágeno humana; (b) uma outra proteína de colágeno humana; e (c) um polipeptídeo ligante que liga (a) a (b). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% , pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 28-31. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4- 1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9- 1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a outra proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%,
23 / 236 pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[0036] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico que compreende: (a) uma primeira estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo; (b) uma segunda ORF que codifica uma proteína de colágeno humana adicional; e (c) um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) separando (a) e (b). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica IRES tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9- 3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6- 1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de colágeno humana adicional tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Em
24 / 236 algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[0037] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o ácido nucleico recombinante compreende ainda um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9- 3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6- 1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a segunda proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo
25 / 236 menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda proteínas de colágeno humana são diferentes.
[0038] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o ácido nucleico recombinante é um genoma de vírus herpes simplex recombinante e em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo em uma ou em ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral UL41.
[0039] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o excipiente é adaptado para administração cutânea (sistêmica ou tópica), transdérmica, subcutânea e / ou intradérmica. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o excipiente compreende um gel de hidroxipropil metilcelulose. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o excipiente é
26 / 236 adaptado para administração intradérmica. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o excipiente compreende um tampão de fosfato. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o excipiente compreende glicerol. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o excipiente compreende um transportador de lipídeo. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o excipiente compreende um transportador de nanopartículas.
[0040] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é uma composição cosmética. Em algumas modalidades, a composição cosmética é um produto para o cuidado da pele.
[0041] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um kit que compreende qualquer uma das composições aqui descritas e instruções para administrar a composição.
[0042] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas de colágeno humanas em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições aqui descritas.
[0043] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar tecido mole de um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, a composição é injetada em um tecido mole do sujeito.
[0044] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para melhorar a qualidade, condição, e / ou aparência da pele em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma
27 / 236 quantidade eficaz de qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, a condição é selecionada de danos causados pelo sol, envelhecimento, exposição a UV, textura áspera, flacidez da pele, rugas e quaisquer combinações dos mesmos.
[0045] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, a administração da composição reduz o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito por pelo menos cerca de três meses, pelo menos cerca de seis meses, pelo menos cerca de nove meses ou pelo menos cerca de 12 meses. Em algumas modalidades, o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito é reduzido após a administração da composição, em comparação com o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito antes da administração da composição.
[0046] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para aumentar e / ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, a pele do sujeito mantém pelo menos um de uma textura, suavidade, elasticidade ou tensão aumentada e / ou melhorada por pelo menos cerca de três meses, pelo menos cerca de seis meses, pelo menos cerca de nove meses, ou pelo menos cerca de 12 meses após a administração da composição. Em algumas modalidades, pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele do sujeito é aumentada e / ou melhorada após a administração da composição, em comparação com a textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele do sujeito antes da administração da composição.
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[0047] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a pele do sujeito está envelhecendo. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a pele do sujeito está enrugada.
[0048] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades, a redução de um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento é selecionada de: (a) tratamento, redução e / ou prevenção de linhas finas e / ou rugas; (b) redução do tamanho dos poros da pele; (c) melhora na espessura da pele, maciez e / ou esticamento; (d) melhora na maciez, elasticidade e / ou maciez da pele; (e) melhora no tom, brilho e / ou clareza da pele; (f) melhora na produção de procolágeno e / ou colágeno; (g) melhora da textura da pele e / ou promoção da retexturização; (h) melhora na aparência dos contornos da pele; (i) restauração do brilho e / ou da claridade da pele; (j) melhora da aparência da pele reduzida pelo envelhecimento e / ou menopausa; (k) melhora na hidratação da pele; (l) aumento da elasticidade e / ou resiliência da pele; (m) tratamento, redução e / ou prevenção ou flacidez da pele; (n) melhora da firmeza da pele; (o) redução de manchas pigmentares, manchas na pele e/ou cicatrizes de acne); (p) melhoria das propriedades ópticas da pele por difração de luz ou reflexão; e (q) quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento no sujeito são reduzidos após a administração da composição, em comparação com um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento no sujeito antes da administração da composição.
[0049] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com
29 / 236 qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é administrada por via cutânea (sistemicamente ou topicamente), transdermicamente, subcutaneamente ou intradermicamente ao sujeito. Em algumas modalidades, as composições são administradas por injeção intravenosa. Em algumas modalidades, uma composição de anticorpo do sujeito é administrada por via intracranial. Em algumas modalidades, uma composição de anticorpo do sujeito é administrada por via oral. Em algumas modalidades, a composição é administrada pelo menos duas vezes ao sujeito. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 90 ou pelo menos cerca de 120 dias se passam entre as administrações. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição é administrada a uma ou mais áreas afetadas e / ou não afetadas do sujeito. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a pele do é raspada antes da administração.
[0050] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína de colágeno humana, em que o ácido nucleico recombinante é um genoma de vírus herpes simplex recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do primeiro polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma HSV-1 recombinante, um genoma HSV-2 recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos.
[0051] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em um gene do vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o gene do vírus herpes simplex é
30 / 236 selecionado do grupo que consiste em Proteína Celular Infectada (ICP) 0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), Região Única Longa (UL) 41 e UL55. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do(s) gene(s).
[0052] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro do locus de gene viral ICP22. Em algumas modalidades que podem ser
31 / 236 combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro do locus de gene viral UL41. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o HSV tem citotoxicidade reduzida, em comparação com um vírus herpes simplex de tipo selvagem.
[0053] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9- 2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL2. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7, e COL17. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a sequência de ácido nucleico que codifica a primeira proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS : 1-14. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades
32 / 236 que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira proteína de colágeno humana não é COL7.
[0054] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o primeiro polipeptídeo compreende: (a) a primeira proteína de colágeno humana; (b) uma outra proteína de colágeno humana; e (c) um polipeptídeo ligante que liga (a) a (b). Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% , pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 28-31. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4- 1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9- 1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a outra proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
33 / 236 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[0055] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico que compreende: (a) uma primeira estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo; (b) uma segunda ORF que codifica uma proteína de colágeno humana adicional; e (c) um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) separando (a) e (b). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica IRES tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9- 3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6- 1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de colágeno humana adicional tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência
34 / 236 com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[0056] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o ácido nucleico recombinante compreende ainda um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9- 3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6- 1, COL7 e COL17. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a segunda proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana compreende
35 / 236 uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda proteínas de colágeno humana são diferentes.
[0057] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo em uma ou em ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral UL41.
[0058] Outros aspectos da presente divulgação se referem a uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é eucarionte. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula Vero. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira complementar.
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[0059] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de coleta de um vírus herpes simplex, o método compreendendo: (a) contatar uma célula hospedeira complementar com qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos; e (b) coletar o vírus herpes simplex gerado pela célula hospedeira complementar.
[0060] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de coleta de um vírus herpes simplex, o método compreendendo; (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos; e (b) coletar o vírus herpes simplex gerado pela célula hospedeira.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0061] O arquivo de pedido ou patente contém pelo menos uma figura executada em cor. Cópias dessa patente ou publicação de pedido de patente com figuras coloridas serão providas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0062] FIGS. 1A-N mostram esquemas de genomas de vírus herpes simplex de tipo selvagem e modificados. FIG. 1A mostra um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem. FIG. 1B mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4. FIG. 1C mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções da sequência de codificação de ICP4 (ambas as cópias), com um polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4. FIG. 1D mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um
37 / 236 polinucleotídeo contendo 1) a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um primeiro promotor heterólogo, e 2) a sequência de codificação de um segundo polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um segundo promotor heterólogo, integrado em cada um dos loci ICP4. Tanto o primeiro quanto o segundo polipeptídeos de colágeno humanos são codificados na mesma fita de DNA.
FIG. 1E mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções da sequência de codificação de ICP4 (ambas as cópias), com um polinucleotídeo contendo 1) a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um primeiro promotor heterólogo, e 2) a sequência de codificação de um segundo polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um segundo promotor heterólogo, integrado em cada um dos loci ICP4. Tanto o primeiro quanto o segundo polipeptídeos de colágeno humanos são codificados na mesma fita de DNA.
FIG. 1F mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um polinucleotídeo contendo 1) a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um primeiro promotor heterólogo, e 2) a sequência de codificação de um segundo polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um segundo promotor heterólogo, integrado em cada um dos loci ICP4. O primeiro e o segundo polipeptídeos de colágeno humano são codificados em fitas opostas de DNA.
FIG. 1G mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções da sequência de codificação de ICP4 (ambas as cópias), com um polinucleotídeo contendo 1) a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um primeiro promotor heterólogo, e 2) a sequência de codificação de um segundo polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um segundo
38 / 236 promotor heterólogo, integrado em cada um dos loci ICP4. O primeiro e o segundo polipeptídeos de colágeno humano são codificados em fitas opostas de DNA.
FIG. 1H mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um polinucleotídeo que codifica um mRNA policistrônico operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4. O mRNA policistrônico contém a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano e um segundo polipeptídeo de colágeno humano separado por um sítio de entrada ribossômico interno (IRES). FIG. 1I mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções da sequência de codificação de ICP4 (ambas as cópias), com um polinucleotídeo que codifica um mRNA policistrônico operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4. O mRNA policistrônico contém a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano e um segundo polipeptídeo de colágeno humano separado por um sítio de entrada ribossômico interno (IRES). FIG. 1J mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo quimérico operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4. O polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano e um segundo polipeptídeo de colágeno humano separados por um ligante clivável.
FIG. 1K mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções da sequência de codificação de ICP4 (ambas as cópias), com um polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo qimérico operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4. O polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um primeiro
39 / 236 polipeptídeo de colágeno humano e um segundo polipeptídeo de colágeno humano separados por um ligante clivável. FIG. 1L mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um primeiro polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4, e um segundo polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um segundo polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado no locus ICP22. FIG. 1M mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias), ICP22 e UL41, com um primeiro polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4 e um segundo polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um segundo polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado no locus UL41. FIG. 1N mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e UL41, com um primeiro polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um primeiro polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4, e um segundo polinucleotídeo contendo a sequência de codificação de um segundo polipeptídeo de colágeno humano operacionalmente ligado a um promotor heterólogo integrado no locus UL41.
[0063] FIGS. 2A-B mostram esquemas de vírus herpes simplex tipo 1 com defeito de replicação que transportam cassetes de expressão de colágeno humano 7 (COL7). FIG. 2A mostra um esquema do vírus “KCA211”. FIG. 2B mostra um esquema do vírus “SAR-COL7”.
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[0064] FIGS. 3A-B mostram a expressão de COL7 humano em células HaCaT infectadas com KCA211 ou SAR-COL7 nos MOIs indicados. FIG. 3A mostra a expressão de COL7 humano em células HaCaT infectadas com KCA211 ou SAR-COL7 nos MOIs indicados, conforme avaliado por qPCR. Os dados são apresentados como alteração de vezes em relação ao SAR-COL7, após a normalização para GAPDH. FIG. 3B mostra a expressão de COL7 humano em células HaCaT não infectadas ou células HaCaT infectadas com KCA211 ou SAR-COL7 nos MOIs indicados, conforme avaliado por análise de Western blot.
[0065] FIGS. 4A-B mostram imagens de imunofluorescência da expressão de COL7 humano em células humanas primárias falsamente infectadas isoladas de um paciente saudável (Normal) e células primárias humanas infectadas com SAR-COL7 ou falsas isoladas de um paciente que sofre de epidermólise bolhosa distrófica recessiva (RDEB). FIG. 4A mostra a expressão de COL7 humano em queratinócitos humanos primários RDEB e de tipo selvagem infectado simulado, ou em queratinócitos humanos primários RDEB infectados com SAR-COL7 na multiplicidade indicada de infecções (MOIs). FIG. 4B mostra a expressão de COL7 humano em fibroblastos humanos primários de tipo selvagem e RDEB com infecção simulada, ou em fibroblastos humanos primários com RDEB infectados com SAR-COL7 nos MOIs indicados.
[0066] FIGS. 5A-B mostram análise de PCR quantitativa da expressão de COL7 humano em células humanas primárias com infecção simulada isoladas de um paciente saudável e células humanas primárias com infecção simulada ou SAR-COL7 isoladas de um paciente que sofre de epidermólise bolhosa distrófica recessiva (EB). FIG. 5A mostra a expressão de COL7 humano em queratinócitos humanos primários com infecção simulada de tipo selvagem (N-HDK) e RDEB (EB-HDK), ou em queratinócitos humanos primários RDEB infectados com SAR-COL7 nos MOIs indicados. A expressão
41 / 236 de COL7 é mostrada como a mudança relativa em relação aos queratinócitos humanos primários de tipo selvagem de infecção simulada. FIG. 5B mostra a expressão de COL7 humano em fibroblastos humanos primários de infecção simulada (N-HDF) e RDEB (EB-HDF), ou em fibroblastos humanos primários RDEB infectados com SAR-COL7 nos MOIs indicados. A expressão de COL7 é mostrada como a mudança relativa em relação aos fibroblastos humanos primários de tipo selvagem infectados de forma simulada.
[0067] FIGS. 6A-B mostram a adesão celular de queratinócitos humanos primários RDEB não infectados (controle) ou infectados por SAR- COL7 a poços não tratados (plástico) ou tratados de uma placa de micropoços. FIG. 6A mostra adesão celular a poços não tratados (plástico), ou poços tratados com concentrações crescentes de Colágeno 1 de cauda de rato. FIG. 6B mostra adesão celular a poços não tratados (plástico), ou poços tratados com concentrações crescentes de fibronectina de plasma humano.
[0068] FIG. 7 mostram imagens de imunofluorescência representativas da expressão e deposição de COL7 humano na zona da membrana basal (BMZ) no dia 5 em culturas organotípicas construídas com queratinócitos e fibroblastos humanos primários RDEB infectados com SAR- COL7. Tanto os queratinócitos como os fibroblastos foram infectados in situ no MOI indicado após a construção da cultura.
[0069] FIGS. 8A-D mostram níveis de transcrito e genoma de COL7A1 humano observados na pele de camundongo não infectado (controle), ou na pele de camundongo após distribuição tópica ou intradérmica de SAR-COL7, conforme avaliado por qPCR. Barras de erro representam SEM. FIG. 8A mostra os níveis de transcritos de COL7A1 humanos / 100ng de RNA total na pele de camundongo no dia 3 após a infecção. FIG. 8B mostra o número de cópias de DNA COL7A1 humano / DNA total de 100 ng na pele de camundongo no dia 3 após a infecção. FIG. 8C mostra os níveis de transcritos de COL7A1 humanos / 100ng de RNA total na pele de camundongo no dia 6
42 / 236 após a infecção. FIG. 8D mostra o número de cópias de DNA COL7A1 humano / DNA total de 100 ng na pele de camundongo no dia 6 após a infecção.
[0070] FIGS. 9A-B mostram imagens de imunofluorescência representativas da expressão de COL7 humano na pele de camundongo após a distribuição de SAR-COL7. FIG. 9A mostra uma imagem imunofluorescente representativa da expressão de COL7 humano na pele de camundongo após a distribuição intradérmica de SAR-COL7. FIG. 9B mostra uma imagem imunofluorescente representativa da expressão de COL7 humano na pele de camundongo após a distribuição tópica de SAR-COL7.
[0071] FIGS. 10A-B mostram transcritos de COL7A1 humano e níveis de genoma observados na pele de camundongo BALB / c após distribuição intradérmica de veículo, SAR-COL7 ou KCA211, conforme avaliado por qPCR. FIG. 10A mostra os níveis de transcritos COL7A1 humanos / 100 ng de RNA total na pele de camundongo BALB / c. FIG. 10B mostra o número de cópias de DNA de COL7A1 humano / 100 ng de DNA total na pele de camundongo BALB / c.
[0072] FIGS. 11A-B mostram os níveis de transcrito e genoma de COL7A1 humano observados em cada local de injeção na pele de camundongo hipomorfo após distribuição intradérmica de alta dose de HSV-GFP (GFP ctrl) ou SAR-COL7, conforme avaliado por qPCR. Cada barra representa uma única amostra no ponto de tempo indicado. FIG. 11A mostra os níveis de transcritos COL7A1 humanos / 100 ng de RNA total na pele de camundongo hipomorfo. FIG. 11B mostra o número de cópias de DNA de COL7A1 humano / 100 ng de DNA total na pele de camundongo hipomorfo.
[0073] FIGS. 12A-B mostram imagens de imunofluorescência representativas da expressão de COL7 humano na pele de camundongo hipomorfo após distribuição intradérmica de alta dose de HSV-GFP (Controle de GFP) ou SAR-COL7. FIG. 12A mostra imageamento de imunofluorescência de controle (GFP) e SAR-COL7 de camundongo
43 / 236 hipomorfo 1 (colhido no dia 3) com ampliação de 10 e 20x. FIG. 12B mostra imageamento de imunofluorescência de SAR-COL7 de camundongo hipomorfo 2 e camundongo hipomorfo 3 (colhido no dia 7). A figura representa uma imagem lado a lado de 16 campos adquiridos com uma lente 10x, capturando toda a seção da pele.
[0074] FIG. 13 mostra amostras coradas com H&E de camundongo hipomorfo 1, 2 e 3 (colhido nos dias 3 e 3). As amostras foram retiradas de pele de camundongo hipomorfo não tratada e pele de camundongo hipomorfo após distribuição intradérmica de HSV-GFP ou SAR-COL7.
[0075] FIGS. 14A-B mostram imagens de micrografia eletrônica representativas da expressão de COL7 humano na pele de camundongo hipomorfo após a distribuição intradérmica de SAR-COL7. A lâmina densa é a faixa escura indicada no meio das imagens; os pontos pretos são os domínios NC corados de COL7l humano; as setas azuis indicam a formação de fibrilas de ancoragem. FIG. 14A mostra imagens de eletromicrografia de pele de camundongo hipomorfo infectado, corada com um anticorpo específico para o domínio NC2 de COL7 humano (LH24). FIG. 14B mostra imagens de eletromicrografia de pele de camundongo hipomorfo infectado corado com um anticorpo específico para o domínio NC1 de COL7 humano (NP185).
[0076] FIGS. 15A-B mostram os níveis de transcrito e genoma de COL7A1 humano observados em cada local de injeção na pele de camundongo hipomorfo após distribuição intradérmica de baixa dose de SAR-COL7, conforme avaliado por qPCR. Cada barra representa uma única amostra no ponto de tempo indicado. FIG. 15A mostra os níveis de transcritos COL7A1 humanos / 100 ng de RNA total na pele de camundongo hipomorfo. FIG. 15B mostra o número de cópias de DNA de COL7A1 humano / 100 ng de DNA total na pele de camundongo hipomorfo.
[0077] FIG. 16 mostra imagens de imunofluorescência representativas da expressão de COL7 humano em pele de camundongo hipomorfo (de
44 / 236 camundongo 1) após distribuição intradérmica de baixa dose de SAR-COL7.
[0078] FIGS. 17A-C mostram análises de ácidos nucleicos e proteínas COL1A1 e COL1A2 humanas em células Vero infectadas com os clones indicados de HSV que codificam COL1A1 sozinho (inserido nos loci ICP4) ou COL1A1 e COL1A2 (inserido nos loci ICP4 e ICP22, respectivamente). FIG. 17A mostra os níveis de transcritos COL1A1 humanos presentes em células Vero 5 dias após a infecção com os clones de HSV indicados, conforme determinado por análise de qRT-PCR. Os dados são apresentados para duas réplicas ± SEM. FIG. 17B mostra os níveis de transcritos COL1A2 humanos presentes em células Vero 5 dias após a infecção com os clones de HSV indicados, conforme determinado por análise de qRT-PCR. Os dados são apresentados para duas réplicas ± SEM. FIG. 17C mostra a análise de Western blot da expressão da proteína COL1A1 e COL1A2 humana em células Vero 5 dias após a infecção com os clones COL1A1 / COL1A2 positivos indicados, conforme determinado por qRT-PCR. Células Vero não infectadas (simuladas) foram usadas como controle negativo; GAPDH foi usado como um controle de carregamento.
[0079] FIG. 18 mostra a análise de Western blot da expressão da proteína COL1A1 e COL1A2 humana em células Vero 5 dias após a infecção com um isolado de HSV que codifica uma sequência de COL1A1-IRES- COL1A2 (IRES-Isolado 6) inserida nos loci ICP4. A infecção com um isolado que não contém o construto IRES (sem inserção) foi usada como controle negativo; GAPDH foi usado como um controle de carregamento.
[0080] FIGS. 19A-B mostram análises de proteína e ácido nucleico COL3 humano em queratinócitos humanos imortalizados (HaCaTs) infectados com C3vec01. FIG. 19A mostra os níveis de transcritos COL3A1 humanos presentes em queratinócitos humanos imortalizados (HKs) após infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não infectadas (simuladas) e infectadas com HSV-mCherry (mCherry) foram usadas como controles negativos. Os
45 / 236 dados são apresentados para duas réplicas ± SEM. FIG. 19B mostra imagens de imunofluorescência representativas da expressão da proteína COL3 humana em queratinócitos humanos imortalizados 48 horas após a infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não infectadas (simuladas) foram usadas como controles negativos.
[0081] FIGS. 20A-B mostram análises de proteína e ácido nucleico COL3 humano em fibroblastos dérmicos humanos imortalizados (HDFs) infectados com C3vec01. FIG. 20A mostra os níveis de transcritos COL3A1 humanos presentes em fibroblastos dérmicos humanos imortalizados (HDFs) após infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não infectadas (simuladas) e infectadas com HSV-mCherry (mCherry) foram usadas como controles negativos. Os dados são apresentados para duas réplicas ± SEM. FIG. 20B mostra imagens de imunofluorescência representativas da expressão da proteína COL3 humana em fibroblastos dérmicos humanos imortalizados 48 horas após a infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não infectadas (simuladas) foram usadas como controles negativos.
[0082] FIGS. 21A-D mostram análises de ácido nucleico e proteína COL3 humana em fibroblastos humanos primários (HDFs) envelhecidos, provenientes de dois fornecedores diferentes, infectados com C3vec01 nos MOIs indicados. FIG. 21A mostra os níveis de transcritos COL3A1 humanos presentes em HDFs primários colhidos de uma paciente do sexo feminino de 65 anos ou de um paciente do sexo masculino de 73 anos (fornecedor 1) após infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não transfectadas (simuladas) foram usadas como controle negativo. Os dados são apresentados para duas réplicas ± SEM. FIG. 21B mostra a análise de Western blot da expressão da proteína COL3A1 humana em HDFs primários colhidos de um paciente do sexo masculino de 73 anos (fornecedor 1) após infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não infectadas (simuladas) foram usadas como controle negativo; COL3A1 humano recombinante (rCOL3A1) foi usado
46 / 236 como um controle positivo; GAPDH foi usado como um controle de carregamento. FIG. 21C mostra os níveis de transcritos COL3A1 humanos presentes em HDFs primários colhidos de uma paciente do sexo feminino de 75 anos ou de um paciente do sexo masculino de 73 anos (fornecedor 2) após infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células de CHO não transfectadas (simuladas) foram usadas como controle negativo. Os dados são apresentados para duas réplicas ± SEM. FIG. 21D mostra a análise de Western blot da expressão da proteína COL3A1 humana em HDFs primários colhidos de um paciente do sexo feminino de 75 anos (fornecedor 2) após infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não infectadas (simuladas) foram usadas como controle negativo; COL3A1 humano recombinante (rCOL3A1) foi usado como um controle positivo; GAPDH foi usado como um controle de carregamento.
[0083] FIGS. 22A-B mostram análises de proteína e ácido nucleico COL3 humano em fibroblastos dérmicos humanos imortalizados (HDFs) após exposição a UV. FIG. 22A mostra a concentração de COL3 secretada no sobrenadante de HDFs cultivados 24 horas após a exposição a várias dosagens e tempos de luz UV, conforme avaliado por ELISA. O sobrenadante coletado de HDFs não expostos a UV (-UV) cultivados em paralelo foi usado como controle. FIG. 22B mostra os níveis de transcritos COL3A1 humanos presentes em fibroblastos dérmicos humanos imortalizados (HDFs) expostos a UV após infecção com C3vec01 nos MOIs indicados. Células não infectadas (simuladas) e infectadas com HSV-mCherry (mCherry) foram usadas como controles negativos. Os dados são apresentados para duas réplicas ± SEM.
[0084] FIGS. 23A-C mostram análises de ácido nucleico e proteína COL3 de biópsias de pele retiradas de camundongos C57BL / 6 jovens (6-8 semanas de idade) e velhos (~ 13 meses de idade) tratados com controle ou C3vec01 48 horas após a aplicação intradérmica. FIG. 23A mostra os níveis de DNA de COL3A1 humano presente em biópsias de pele retiradas de
47 / 236 camundongos jovens e velhos 48 horas após serem administrados por via intradérmica C3vec01 ou controle de veículo, conforme avaliado por análise qPCR. FIG. 23B mostra os níveis de transcritos COL3A1 humanos presentes em biópsias de pele retiradas de camundongos jovens e velhos 48 horas após serem administrados por via intradérmica C3vec01 ou controle de veículo, conforme avaliado por análise de qRT-PCR. Para cada condição na análise qPCR e qRT-PCR, os dados são apresentados como a média de quatro amostras de tecido (duas réplicas / amostra de tecido) ± SEM. FIG. 23C mostra imagens de imunofluorescência representativas da expressão de COL3 humano em biópsias de pele tiradas de camundongos jovens e velhos 48 horas após a administração intradérmica de C3vec01. Um jovem camundongo administrado por via intradérmica sozinho foi usado como controle negativo. A coloração DAPI foi usada para visualizar os núcleos.
[0085] FIGS. 24A-B mostram a expressão de LamB3 humano de tipo selvagem (WT) em células Vero infectadas com os isolados virais indicados. FIG. 24A mostra a expressão de LAMB3 humano de tipo selvagem em células Vero infectadas, conforme avaliado por análise de qPCR. FIG. 24B mostra a expressão da proteína LamB3 humana de tipo selvagem em células Vero infectadas, conforme avaliado por Western blot.
[0086] FIG. 25 mostra a expressão da proteína LamB3 humana de tipo selvagem (WT) ou otimizada para códons (CO) em células Vero infectadas com os isolados virais indicados, conforme avaliado por western blot. Células de Vero CHO não transfectadas foram usadas como controle negativo.
[0087] FIG. 26 mostra a expressão da proteína LamB3 humana de tipo selvagem (WT) ou otimizada para códons (CO) em queratinócitos humanos primários infectados com os isolados virais indicados, conforme avaliado por western blot. Queratinócitos primários não infectados foram usados como controle negativo.
[0088] FIGS. 27A-C mostram expressão de LamC2 humano de tipo
48 / 236 selvagem (WT) e otimizado por códon (CO) em células Vero infectadas com os isolados virais indicados. FIG. 27A mostra a expressão de LAMC2humano de tipo selvagem em células Vero infectadas, conforme avaliado por análise de qPCR. FIG. 27B mostra a expressão de LAMC2 humano otimizado por códon em células Vero infectadas, conforme avaliado por análise de qPCR. FIG. 27C mostra a expressão da proteína LamC2 humana de tipo selvagem e otimizada por códon em células Vero infectadas, conforme avaliado por western blot. O isolado viral em caixa "LGA" que expressa LamC2 otimizado por códon foi selecionado para experimentação adicional.
[0089] FIGS. 28A-C mostram LAMC2 humano expresso a partir de isolado viral "LGA" em queratinócitos humanos primários imortalizados infectados nas multiplicidades indicadas de infecção (MOIs). FIG. 28A mostra o número de cópias do genoma viral em queratinócitos humanos imortalizados primários após a infecção com o isolado viral "LGA" nos MOIs indicados. FIG. 28B mostra o nível de transcrito de LAMC2 otimizado por códon expresso em queratinócitos humanos imortalizados primários após infecção com isolado viral "LGA" nos MOIs indicados. FIG. 28C mostra a expressão da proteína LamC2 humana em queratinócitos humanos primários imortalizados após infecção com isolado viral "LGA" nos MOIs indicados, conforme avaliado por western blot.
[0090] FIGS. 29A-D mostram ácido nucleico LAMC2 e análise de proteína de biópsias de pele retiradas de controle (veículo) - ou camundongos tratados com "LGA" isolado de HSV 72 horas após a aplicação intradérmica. FIG. 29A mostra um esquema dos locais de injeção intradérmica nos animais tratados. FIG. 29B mostra os níveis de DNA de LAMC2 humano presente em biópsias de pele tiradas de camundongos 72 horas após serem administrados por via intradérmica ou isolado de HSV LGA ou controle de veículo, conforme avaliado por análise qPCR. FIG. 29C mostra os níveis de transcritos de LAMC2 humanos presentes em biópsias de pele tiradas de camundongos 72 horas após
49 / 236 serem administrados por via intradérmica ou isolado de HSV LGA ou controle de veículo, conforme avaliado por análise qRT-PCR. Para cada condição na análise qPCR e qRT-PCR, os dados são apresentados como a média de duas repetições ± SEM. FIG. 29D mostra imagens de imunofluorescência representativas da expressão de LAMC2 humano em biópsias de pele tiradas de camundongos 72 horas após a administração intradérmica de isolado de HSV LGA. Um local que foi administrado por via intradérmica sozinho foi usado como controle negativo. A coloração DAPI foi usada para visualizar os núcleos; a coloração com pKal foi usada para visualizar laminina-332 de camundongo.
DESCRIÇÃO DE TALHADA
[0091] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, genomas virais de herpes recombinantes) que codificam uma ou mais proteínas cosméticas e aos usos desses ácidos nucleicos recombinantes em vírus (por exemplo, em um vírus herpes), composições, formulações, medicamentos e / ou métodos para distribuir uma ou mais proteínas cosméticas na pele, como na, para dentro e / ou através da pele (por exemplo, para a ECM dérmica). Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, genomas virais de herpes recombinantes) que codificam uma ou mais proteínas cosméticas e aos usos desses ácidos nucleicos recombinantes em vírus (por exemplo, em um vírus herpes), composições, formulações, medicamentos e / ou métodos para aumentar, ampliar e / ou complementar uma ou mais proteínas ECM dérmicas (por exemplo, uma ou mais proteínas de colágeno). Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, genomas virais de herpes recombinantes) que codificam uma ou mais proteínas cosméticas e aos usos desses ácidos nucleicos recombinantes em vírus (por exemplo, em um vírus herpes), composições, formulações, medicamentos e / ou métodos no contexto
50 / 236 estético (por exemplo, para reduzir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento). Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a composições compreendendo um vetor viral de herpes recombinante e métodos que compreendem distribuir o vetor viral de herpes recombinante na, para e / ou através da pele de um mamífero, em que o vetor viral de herpes recombinante compreende um promotor operável em uma célula de mamífero e um ácido nucleico heterólogo que é expresso para alcançar um efeito cosmético na pele de mamífero.
O ácido nucleico heterólogo pode ser distribuído a uma célula de pele alvo de mamífero de um mamífero, compreendendo contatar a epiderme, derme ou tecido subcutâneo do mamífero com a composição que compreende o vetor viral de herpes recombinante, sob condições em que o vetor viral de herpes recombinante é transportado na, em e / ou através da epiderme, derme ou tecido subcutâneo e introduzido na célula alvo da pele, onde é expresso Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita- se que a administração de um ou mais dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus , e / ou as formulações aqui descritas para um indivíduo permitirão uma produção aumentada de proteínas ECM dérmicas funcionais (por exemplo, colágeno humano) no indivíduo.
Além disso, sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que aumentar, ampliar e / ou suplementar os níveis de proteínas cosméticas em um indivíduo pela administração de um ou mais dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou formulações aqui descritas irá levar a pelo menos um de: 1) a intensificação, ampliação e / ou suplementação de tecido mole; 2) a melhoria da qualidade, condição e / ou aparência da pele; 3) a redução de uma ou mais depressões superficiais na pele (por exemplo, rugas); 4) a melhora da textura, maciez, elasticidade e / ou tensão da pele; e / ou 5) a redução de um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento.
Em última análise, sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, composições e métodos aqui descritos fornecem uma nova estratégia para a distribuição de proteínas cosméticas
51 / 236 funcionais em configurações estéticas.
[0092] A descrição a seguir apresenta métodos, parâmetros e semelhantes exemplificativos. Deve ser reconhecido, no entanto, que tal descrição não se destina a ser uma limitação no escopo da presente divulgação, mas, em vez disso, é fornecida como uma descrição de modalidades exemplificativas. Técnicas Gerais
[0093] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui são geralmente bem entendidos e comumente empregados usando a metodologia convencional por aqueles versados na técnica, como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999). Definições
[0094] Antes de descrever a invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não está limitada às composições particulares ou sistemas biológicos que podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a
52 / 236 terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante.
[0095] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um/uma", "um/uma" e "o/a" incluem as formas do plural referentes, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma molécula" inclui opcionalmente uma combinação de duas ou mais dessas moléculas e semelhantes.
[0096] Conforme usado neste documento, o termo "e/ou" inclui quaisquer e todas as combinações de um ou mais dos itens listados associados. Por exemplo, o termo "a e / ou b" pode referir-se a "a sozinho", "b sozinho", "a ou b" ou "a e b"; o termo "a, b e / ou c" pode referir-se a "a sozinho", "b sozinho", "c sozinho", "a ou b", "a ou c", "b ou c", "a , b, ou c ”,“ a e b ”,“ a e c ”,“ b e c ”ou“ a, b e c ”; etc.
[0097] Como utilizado neste documento, o termo "cerca de" refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo versado neste campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro inclui aqui (e descreve) variações de que são dirigidas a esse valor ou parâmetro, por si só.
[0098] Entende-se que os aspectos e as modalidades da invenção descritos neste documento incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades.
[0099] Como usado aqui, os termos "polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico", "ácido nucleico" e variações dos mesmos, serão genéricos para polidesoxirribonucleotídeos (contendo 2-deoxi-D-ribose), para polirribonucleotídeos (contendo D-ribose), para qualquer outro tipo de polinucleotídeo que seja um N-glicosídeo de uma base de purina ou pirimidina, e para outros polímeros contendo espinhas dorsais não nucleotídicas, desde que os polímeros contenham nucleobases em uma configuração que permita emparelhamento e empilhamento de base, conforme encontrado em DNA e
53 / 236 RNA. Assim, estes termos incluem tipos conhecidos de modificações de sequência de ácido nucleico, por exemplo, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo e modificações internucleotídeos.
[00100] Como usado aqui, um ácido nucleico está “ligado de forma operacional” ou “operativamente ligado” quando ele é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou potencializador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operativamente" significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas.
[00101] Como utilizado neste documento, o termo "vetor" se refere a elementos distintos que são usados para introduzir ácidos nucleicos heterólogos em células para expressão ou replicação dos mesmos. Um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar ácidos nucleicos que estão operacionalmente ligados a sequências regulatórias, tais como regiões promotoras, que são capazes de efetuar a expressão de tais ácidos nucleicos. Assim, um vetor de expressão pode referir-se a um construto de DNA ou RNA, tal como um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, após introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão dos ácidos nucleicos. Os vetores de expressão apropriados são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e aqueles que permanecem epissômicos ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeira.
[00102] Como utilizado neste documento, uma "estrutura de leitura aberta" ou "ORF" refere-se a um trecho contínuo de ácidos nucleicos, DNA ou RNA, que codifica uma proteína ou polipeptídeo. Normalmente, os ácidos
54 / 236 nucleicos compreendem um sinal de início da tradução ou códon de iniciação, como ATG ou AUG, e um códon de terminação.
[00103] Como utilizado neste documento, uma "região não traduzida" ou "UTR" refere-se a ácidos nucleicos não traduzidos nas extremidades 5' e / ou 3' de uma estrutura de leitura aberta. A inclusão de uma ou mais UTRs em um polinucleotídeo pode afetar a regulação pós-transcricional, a estabilidade do mRNA e / ou a tradução do polinucleotídeo.
[00104] Como utilizado neste documento, o termo "transgene" refere-se a um polinucleotídeo que é capaz de ser transcrito em RNA e traduzido e / ou expresso em condições apropriadas, após ser introduzido em uma célula. Em alguns aspectos, ela confere uma propriedade desejada a uma célula na qual foi introduzida ou, de outra forma, leva a um resultado cosmético, terapêutico ou diagnóstico desejado.
[00105] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de modo intercambiável aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos.
[00106] Como utilizado neste documento, um "sujeito", "hospedeiro" ou um "indivíduo" refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e zoológico, esportes ou animais de estimação, como cães, cavalos gatos, vacas, bem como animais usados em pesquisas, como camundongos, ratos, hamsters, coelhos e primatas não humanos, etc. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano.
[00107] O termo "formulação farmacêutica" se refere a uma preparação em cuja forma permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nela seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos a um sujeito ao qual a formulação será administrada. Excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" (por exemplo, veículos, aditivos) são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um sujeito para fornecer uma dose eficaz do(s) ingrediente(s) ativo(s) empregado(s).
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[00108] Como utilizado neste documento, "administração cutânea" ou "administração por via cutânea" refere-se à distribuição de uma composição a um sujeito por contato, diretamente ou de outra forma, uma formulação compreendendo a composição para toda ("sistêmica") ou uma porção ("tópica") a pele de um sujeito. O termo abrange várias vias de administração, incluindo, mas não se limitando a, tópica e transdérmica. A administração tópica pode ser usada como um meio para distribuir uma composição à epiderme ou derme de um sujeito, ou a estratos específicos dos mesmos.
[00109] Conforme usado aqui, o termo "tratamento" refere-se à intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuir a taxa de progressão da doença, melhorar ou diminuir o estado da doença e remissão ou prognóstico aprimorado. Por exemplo, um indivíduo é “tratado” com sucesso se um ou mais sintomas associados ao envelhecimento dermatológico forem reduzidos, mitigados ou eliminados, incluindo a redução ou eliminação de rugas.
[00110] Como utilizado neste documento, o termo "retardar a progressão de" uma doença / distúrbio / defeito refere-se a adiar, impedir, desacelerar, retardar, estabilizar e / ou adiar o desenvolvimento da doença / distúrbio / defeito (por exemplo, rugas na pele). Esse atraso pode variar em diferentes períodos de tempo, dependendo do histórico da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Como é evidente para um versado na técnica, um retardo suficiente ou significativo pode, de fato, abranger a prevenção, na medida em que o indivíduo não desenvolve a doença. Ácidos Nucleicos Recombinantes
[00111] Certos aspectos da presente divulgação se referem a ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes isolados) compreendendo um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais ,
56 / 236 etc.) que codificam uma proteína cosmética. Qualquer proteína cosmética adequada aqui descrita ou conhecida na técnica pode ser codificada pelos polinucleotídeos da presente divulgação, incluindo, por exemplo, proteínas de colágeno, fibronectinas, elastinas, lumicanos, vitronectinas / receptores de vitronectina, lamininas, neuromoduladores, fibrilinas, proteínas ECM dérmicas adicionais, etc. Em algumas modalidades, a proteína cosmética é uma proteína estrutural da matriz extracelular (por exemplo, um colágeno, elastina, fibronectina, laminina, fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a proteína cosmética é um colágeno, elastina, fibronectina ou proteína laminina (por exemplo, um colágeno humano, elastina, fibronectina ou proteína laminina).
[00112] Em algumas modalidades, a presente divulgação se referem a ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes isolados) compreendendo um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais , etc.) que codificam uma proteína de colágeno. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno é uma proteína de colágeno humana. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam um colágeno homotrimérico (por exemplo, um colágeno humano homotrimérico, tal como Colágeno 3 humano (por exemplo, compreendendo três polipeptídeos COL3A1 (COL3)) ou Colágeno 7 humano (por exemplo, compreendendo três polipeptídeos COL7A1 (COL7)). Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam um colágeno heterotrimérico (por exemplo, um colágeno humano heterotrimérico, como o Colágeno 1 humano (por exemplo, compreendendo dois polipeptídeos COL1A1 (COL1-1) e um COL1A2 ( COL1-2) polipeptídeo) ou Colágeno 4 humano (por exemplo, compreendendo dois polipeptídeos COL4A1 (COL4-1) e um polipeptídeo COL4A2 (COL4-2)). Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere
57 / 236 a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam um colágeno homotrimérico e um colágeno heterotrimérico (por exemplo, um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam um Colágeno 1 humano e um Colágeno 3 humano). Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam o Colágeno 1 humano. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam o Colágeno 3 humano.
[00113] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína cosmética (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana). Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo consiste essencialmente em ou consiste na primeira proteína cosmética (por exemplo, consiste essencialmente em ou consiste em uma primeira proteína de colágeno humana). Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo: uma primeira proteína cosmética (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana), um polipeptídeo ligante e uma outra proteína cosmética (por exemplo, uma outra proteína de colágeno humana). Em algumas modalidades, a primeira e outras proteínas cosméticas (por exemplo, a primeira e outras proteínas de colágeno humanas) são as mesmas. Em algumas modalidades, a primeira e outras proteínas cosméticas (por exemplo, a primeira e outras proteínas de colágeno humanas) são diferentes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável.
[00114] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um primeiro polinucleotídeo
58 / 236 que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína cosmética (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana), em que o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico compreendendo: uma primeira estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo, um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) e uma segunda ORF que codifica uma proteína cosmética adicional (por exemplo, uma proteína de colágeno humana adicional). Em algumas modalidades, a primeira e as proteínas cosméticas adicionais (por exemplo, a primeira e as proteínas de colágeno humanas adicionais) são as mesmas. Em algumas modalidades, a primeira e as proteínas cosméticas adicionais (por exemplo, a primeira e as proteínas de colágeno humanas adicionais) são diferentes.
[00115] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína cosmética (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana) e um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína cosmética (por exemplo, uma segunda proteína de colágeno humana). Em algumas modalidades, a primeira e a segunda proteínas cosméticas (por exemplo, a primeira e a segunda proteínas de colágeno humanas) são as mesmas. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda proteínas cosméticas (por exemplo, a primeira e a segunda proteínas de colágeno humanas) são diferentes.
[00116] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor viral de herpes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon do vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon do vírus herpes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um genoma do vírus herpes simplex recombinante. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex
59 / 236 recombinante é um genoma do vírus herpes simplex tipo 1 recombinante (HSV- 1). Polinucleotídeos que codificam proteínas cosméticas Polinucleotídeos que codificam proteínas de colágeno
[00117] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene de colágeno. A sequência de codificação de qualquer gene de colágeno (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, genes de colágeno humano (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 1277, 1278, 1281, 1282, 1284, 1291, 1294, 1308, etc.), genes de colágeno de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 12842, 12843, 12825, 12826, 12827, 12833, 12836, 12821, etc.), genes de colágeno de chimpanzé (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 104001053, 455117, 459815, 452689, 452661, 450204, 101056895, 101058306, etc.), genes de colágeno de rato (ver por exemplo, NCBI Gene IDs: 29393, 84352, 84032, 290905, 306628, 294337, 301012, 294027, etc.), genes de colágeno de coelho (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 100347598, 100008997, 100009177, 100358256, 100358522, 100343947, 100356561, 100339335, etc.) etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos de genes de colágeno de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, o uso de um programa de alinhamento de sequência de ácido nucleico, como o BLAST® blastn suite. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência
60 / 236 com a sequência de qualquer um dos genes de colágeno (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00118] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon da sequência de codificação de qualquer um dos genes de colágeno aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o uso de uma variante otimizada por códon da sequência de codificação de um gene de colágeno aumenta a estabilidade e / ou o rendimento da expressão heteróloga (RNA e / ou proteína) da proteína de colágeno codificada em uma célula alvo (tal como uma célula da epiderme e / ou derme), em comparação com a estabilidade e / ou rendimento de expressão heteróloga de uma sequência de tipo selvagem correspondente, não otimizada por códon. Qualquer método adequado conhecido na técnica para realizar a otimização por códon de uma sequência para expressão em uma ou mais células alvo (por exemplo, uma ou mais células humanas) pode ser usado, incluindo, por exemplo, pelos métodos descritos por Fath et al. (PLoS One. 2011 Mar 3;6(3): e17596).
[00119] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (isto é, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de um gene de colágeno humano . Qualquer gene de colágeno humano adequado (incluindo qualquer isoforma do mesmo) conhecido na técnica pode ser codificado por um ácido nucleico da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um gene COL1A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1277; SEQ ID NO: 1), um gene COL1A2 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1278; SEQ ID NO: 3), um gene COL2A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1280), um gene COL3A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1281; SEQ ID NO: 5), um gene COL4A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1282; SEQ ID NO: 7), um gene COL4A2 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1284), um gene COL4A3 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1285), um gene COL4A4 (ver, por
61 / 236 exemplo, NCBI Gene ID: 1286), um gene COL4A5 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1287), um gene COL4A6 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1288), um gene COL5A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1289), um gene COL5A2 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1290), um gene COL5A3 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 50509), um gene COL6A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1291; SEQ ID NO: 9), um gene COL6A2 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1292), um gene COL6A3 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1293), um gene COL6A4 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 344875), um gene COL6A5 (ver, por exemplo NCBI Gene ID: 256076), um gene COL6A6 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 131873), um gene COL7A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1294; SEQ ID NO: 10), a COL8A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1295), um gene COL9A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1297), um gene COL9A2 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1298), um gene COL9A3 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1299), um geneCOL10A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1300), um gene COL11A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1301), um gne COL11A2 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1302), um gene COL12A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1303), um gene COL13A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1305), um gene COL14A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 7373), um geneCOL15A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1306), um gene COL16A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1307), um gene COL17A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1308; SEQ ID NO: 12), um gene COL18A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 80781), um gene COL19A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1310), um gene COL20A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 57642), um gene COL21A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 81578), um gene COL22A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 169044), um gene COL23A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 91522), um gene COL24A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 255631), um gene COL25A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 84570), um gene COL26A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 136227), um gene COL27A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 85301), um
62 / 236 gene COL28A1 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID:340267), etc. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo (ou seja um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98 %, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes de colágeno humano (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00120] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon de qualquer um dos genes de colágeno humano aqui descritos. Em algumas modalidades, o uso de uma variante otimizada por códon de um gene de colágeno humano aumenta a estabilidade e / ou o rendimento da expressão heteróloga (RNA e / ou proteína) do colágeno humano em uma célula alvo (como um queratinócito ou fibroblasto humano), em comparação com a estabilidade e / ou rendimento de expressão heteróloga de uma sequência de tipo selvagem não otimizada por códon correspondente.
[00121] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene COL1A1 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou
63 / 236 SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
[00122] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100 , pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, mas menos que 4395, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4392 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4392 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
[00123] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene COL1A2 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo
64 / 236 menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
[00124] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, mas menos que 4101, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4098 de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:
4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4098 de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
[00125] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene COL3A1 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades,
65 / 236 um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
[00126] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, mas menos que 4401, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4398 de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:
6. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4398 de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
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[00127] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene COL4A1 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
[00128] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, pelo menos 4500, pelo menos 5000, mas menos que 5010, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de
67 / 236 ácidos nucleicos 1-5007 de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-5007 de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
[00129] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene COL6A1 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10.
[00130] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, mas menos que 3087, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
68 / 236 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-3084 de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-3084 de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10.
[00131] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene COL7A1 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
[00132] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, pelo menos 4500, pelo menos 5000, pelo menos 5500, pelo menos 6000, pelo menos 6500, pelo menos 7000, pelo menos 7500, pelo menos 8000, pelo menos 8500, mas menos que 8835, nucleotídeos consecutivos de
69 / 236 SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-8832 de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-8832 de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
[00133] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene COL17A1 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.
[00134] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo
70 / 236 menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, mas menos que 4494, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4491 de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4491 de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.
[00135] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma ou mais proteínas de colágeno humanas (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana, uma proteína de colágeno humana adicional, uma proteína de colágeno humana adicional e / ou uma segunda proteína de colágeno humana) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma ou mais proteínas de colágeno humana (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana, uma outra proteína de colágeno humana, uma proteína de colágeno humana adicional e / ou uma segunda proteína de colágeno humana) compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 1-14. Polinucleotídeos que codificam proteínas de fibronectina
[00136] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um
71 / 236 ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene de fibronectina. A sequência de codificação de qualquer gene de fibronectina (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um gene de fibronectina humano (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 2335 ), um gene de fibronectina de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 14268), um gene de fibronectina de chimpanzé (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 459926), um gene de fibronectina de rato (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 25661), um gene de fibronectina de coelho (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 100328589), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos do gene da fibronectina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes de fibronectina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon de qualquer um dos genes de fibronectina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00137] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de um gene de fibronectina humano. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação
72 / 236 do gene FN1 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36.
[00138] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100 , pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, pelo menos cerca de 4500, pelo menos cerca de 5000, pelo menos cerca de 5500, pelo menos cerca de 6000, pelo menos cerca de 6500, pelo menos cerca de 7000, mas menos que 7434, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou
73 / 236 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-7431 de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-7431 de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Polinucleotídeos que codificam proteínas de elastina
[00139] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene de elastina. A sequência de codificação de qualquer gene de elastina (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um gene de elastina humana (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 2006 ), um gene de elastina de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 13717), um gene de elastina de chimpanzé (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 463943), um gene de elastina de rato (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 25043), um gene de elastina de coelho (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 100344271), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos do gene da elastina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes de elastina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon de qualquer um dos genes de elastina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na
74 / 236 técnica.
[00140] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de um gene de elastina humano. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene ELN humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38.
[00141] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300 ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250 , mas menos que 2361, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo
75 / 236 menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1- 2358 de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-2358 de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38. Polinucleotídeos que codificam proteínas de lumicano
[00142] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene de lumicanoo. A sequência de codificação de qualquer gene de lumicano (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um gene de lumicano humano (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 4060 ), um gene de lumicano de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 17022), um gene de lumicano de chimpanzé (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 452119), um gene de lumicano de rato (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 81682), um gene de lumicano de coelho (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 100008665), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos do gene de lumicano de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes de lumicano (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas
76 / 236 modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon de qualquer um dos genes de lumicano (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00143] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de um gene de lumicano humano. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene LUMhumano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40.
[00144] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300 ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, mas menos que 1017, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, um
77 / 236 polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-1014 de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-1014 de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40. Polinucleotídeos que codificam vitronectina e proteínas receptoras de vitronectina
[00145] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene receptor de vitronectina ou vitronectina. A sequência de codificação de qualquer vitronectina ou gene receptor de vitronectina (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, uma vitronectina ou gene receptor de vitronectina humano (ver, por exemplo , NCBI Gene IDs: 7448 e 3685), uma vitronectina ou gene receptor de vitronectina de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 22370 e 16410), uma vitronectina ou gene receptor de vitronectina de chimpanzé (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 738261 e 459807), uma vitronectina ou gene receptor de vitronectina de rato (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 29169 e 257645), uma vitronectina ou gene receptor de vitronectina de coelho (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 100009128 e 100008956), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos de vitronectina ou gene receptor de vitronectina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende
78 / 236 uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um de vitronectina ou gene receptor de vitronectina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon de qualquer um de vitronectina ou gene receptor de vitronectina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00146] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de uma vitronectina ou gene receptor de vitronectina humano. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene VTN humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42.
[00147] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42. Em algumas
79 / 236 modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300 ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos cerca de 1250, mas menos que 1437, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-1034 de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-1034 de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42. Polinucleotídeos que codificam proteínas laminina
[00148] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene de laminina. A sequência de codificação de qualquer gene de laminina (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, genes de laminina humanos (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 284217, 3908, 3909, 3910, 3911, 3912, 3913, 3914, 3915, 3918 e 10319), genes de laminina de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 16774, 16780 e 16782), genes de laminina de chimpanzé (ver, por exemplo, Gene NCBI IDs: 455339, 469668 e 457571), genes de laminina de rato (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 307582, 305078 e 192362), genes de laminina de coelho (ver por
80 / 236 exemplo, NCBI Gene IDs: 100346886 e 100342905), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos do gene de laminina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes de laminina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon de qualquer um dos genes de laminina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00149] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de um gene de laminina humano, como um gene LAMA1 humano (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 284217), um gene LAMA2 humano (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 3908), um gene LAMA3 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 3909), um gene humano LAMA4 (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 3910 ), um gene LAMA5 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 3911), um gene LAMB1 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 3912), um gene LAMB2 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 3913), um LAMB3 humano gene (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 3914), um gene LAMC1 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 3915), um gene LAMC2 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 3918) ou um gene LAMC3 humano (ver por exemplo , NCBI Gene ID: 10319).
[00150] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente
81 / 236 divulgação compreende a sequência de codificação do gene LAMA3 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.
[00151] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100 , pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, pelo menos cerca de 4500, pelo menos cerca de 5000, mas menos que 5175, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-5172 de SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID
82 / 236 NO: 44. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-5172 de SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.
[00152] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene LAMB3 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 46.
[00153] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência da SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 46 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, mas menos que 3519, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo
83 / 236 menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-3516 de SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-3516 de SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 46.
[00154] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene LAMC2 humano (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48.
[00155] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência da SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, mas menos que 3582, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente
84 / 236 divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-3579 de SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-3579 de SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48. Polinucleotídeos que codificam proteínas neuromoduladoras
[00156] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene neuromodulador. A sequência de codificação de qualquer gene neuromodulador (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um gene neuromodulador de Clostridium botulinum (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 5185061 e 39483740), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos do gene neuromodulador de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes neuromoduladores (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante
85 / 236 otimizada por códon de qualquer um dos genes neuromoduladores (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00157] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de um gene neuromodulador de Clostridium botulinum.
[00158] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene de clostridium botulinum botA gene (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50.
[00159] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência da SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos cerca de 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo
86 / 236 menos 3500, mas menos que 3891, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-3888 de SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-3888 de SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50.
[00160] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação do gene de clostridium botulinum botB gene (ou uma variante otimizada por códon do mesmo). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52.
[00161] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, o truncamento 5', o truncamento 3' ou o fragmento da sequência da SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125,
87 / 236 pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos cerca de 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, mas menos que 3876, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-3873 de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-3873 de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Polinucleotídeos que codificam proteínas de fibrilina
[00162] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene fribilina. A sequência de codificação de qualquer gene de fibrilina (incluindo qualquer isoforma do mesmo) de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, genes de fibrilina humana (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 2200, 2201 e 84467), genes de fibrilina de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 14118 e 14119), genes de fibrilina de chimpanzé (ver por exemplo, NCBI Gene IDs: 453411, 471621 e 455669), genes de fibrilina de rato (ver por exemplo, NCBI Gene IDs: 83727 e 689008), genes de fibrilina de coelho (ver, por exemplo, NCBI Gene IDs: 100350931, 100357126 e 100359336), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos do gene de fibrilina de espécies
88 / 236 adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes de fibrilina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códon de qualquer um dos genes de fibrilina (e / ou sequências de codificação dos mesmos) aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00163] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos (ou seja, um ou mais primeiros polinucleotídeos e / ou um ou mais segundos polinucleotídeos) compreendendo a sequência de codificação de um gene de fibrilina humana, como um gene FBN1 humano (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 2200), um gene FBN2 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 2201), ou um gene FBN3 humano (ver por exemplo, NCBI Gene ID: 84467). Polinucleotídeos exemplificativos
[00164] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma ou mais proteínas cosméticas (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14 ou 35-52. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente
89 / 236 divulgação que codifica uma ou mais proteínas cosméticas (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma outra proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOS : 1-14 ou 35-52.
[00165] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma ou mais proteínas cosméticas (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-14, 35-38, ou 43-48. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma ou mais proteínas cosméticas (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma outra proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOS : 1-14, 35-38, ou 43-
48.
[00166] Um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma proteína cosmética (por exemplo, uma proteína de colágeno humana) pode codificar ainda mais sequências de codificação e não codificação. Exemplos de sequências de codificação e não codificação adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, sequências que codificam etiquetas polipeptídicas adicionais (por exemplo, codificado em quadro com a proteína cosmética a fim de produzir uma proteína de fusão), íntrons (por exemplo, íntrons nativos, modificados ou heterólogos), UTRs 5' e/ou 3' (por exemplo, UTRs 5' e/ou 3' nativas, modificadas ou heterólogas) e semelhantes. Exemplos de etiquetas polipeptídicas adequadas podem incluir, mas não estão limitadas a qualquer combinação de etiquetas de purificação, tais como etiquetas his, etiquetas flag,
90 / 236 proteína de ligação de maltose e etiquetas de glutationa-S-transferase, etiquetas de detecção, tais como etiquetas que podem ser detectadas fotometricamente (por exemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, etc.) e etiquetas que têm uma atividade enzimática detectável (por exemplo, fosfatase alcalina etc.), etiquetas contendo sequências secretoras, sequências de sinal, sequências líderes e / ou sequências de estabilização, sítios de clivagem de protease (por exemplo, sítios de clivagem de furina, sítios de clivagem de TEV, locais de clivagem de trombina, etc.) e semelhantes. Em algumas modalidades, as UTR's 5' e/ou 3' aumentam a estabilidade, localização e / ou eficiência de tradução dos polinucleotídeos. Em algumas modalidades, as UTR's 5' e/ou 3' melhoram o nível e / ou a duração da expressão da proteína. Em algumas modalidades, as UTR's 5' e/ou 3' incluem elementos (por exemplo, um ou mais sítios de ligação de miRNA, etc.) que podem bloquear ou reduzir a expressão fora do alvo (por exemplo, inibir a expressão em tipos de células específicos (por exemplo, células neuronais), em momentos específicos do ciclo celular, em estágios de desenvolvimento específicos, etc.). Em algumas modalidades, as UTR's 5' e/ou 3' incluem elementos (por exemplo, um ou mais sítios de ligação de miRNA, etc.) que podem intensificar a expressão de proteínas cosméticas em tipos de células específicos (como queratinócitos humanos e / ou fibroblastos).
[00167] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma proteína cosmética (por exemplo, uma proteína de colágeno humana) está operacionalmente ligado a um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, etc.) sequências regulatórias. O termo "sequência regulatória" pode incluir intensificadores, isoladores, promotores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Qualquer intensificador(es) adequado(s) conhecido(s) na técnica pode(m) ser usado(s), incluindo, por exemplo, sequências intensificadoras de genes de mamíferos
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(tais como globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, insulina e semelhantes), sequências intensificadoras de um vírus de células eucarióticas (tal como intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o intensificador de promotor inicial de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, intensificadores de adenovírus e semelhantes) e quaisquer combinações dos mesmos.
Qualquer isolador(es) adequado(s) conhecido(s) na técnica pode(m) ser usado(s), incluindo, por exemplo, elementos de limite da cromatina de HSV (CTRL / ligação CTCF / isolador) CTRL1 e / ou CTRL2, isolador de sítio hipersensível 4 de frango (cHS4), HNRPA2B1 humano — CBX3 elemento de abertura de cromatina onipresente (UCOE), a região de fixação de andaime / matriz (S / MAR) do gene beta do interferon humano (IFNB1) e quaisquer combinações dos mesmos.
Qualquer promotor adequado (por exemplo, adequado para transcrição em células hospedeiras de mamíferos) conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, promotores obtidos a partir de genomas de vírus (tais como vírus polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tal como Adenovírus 2) , vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B, vírus símio 40 (SV40) e semelhantes), promotores de genes heterólogos de mamíferos (como o promotor da actina (por exemplo, o promotorde β-actina), um promotor de ubiquitina (por exemplo, um promotor de ubiquitina C (UbC)), um promotor de fosfoglicerato cinase (PGK), um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico e semelhantes), promotores de genes de mamíferos homólogos (por exemplo, promotores de colágeno nativo humano, fibronectina, elastina, lumicano, vitronectina, laminina e / ou fibrilina), promotores sintéticos (como o promotor CAGG) e quaisquer combinações dos mesmos, desde que tais promotores sejam compatíveis com as células hospedeiras.
As sequências regulatórias incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência nucleotídica, bem como as sequências
92 / 236 induzíveis e/ou regulatórias específicas de tecido.
[00168] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica a proteína cosmética (por exemplo, uma proteína de colágeno humana) está operacionalmente ligado a um ou mais promotores heterólogos. Em algumas modalidades, um ou mais promotores heterólogos são um ou mais dos promotores constitutivos, promotores específicos de tecido, promotores temporais, promotores espaciais, promotores indutíveis e promotores reprimíveis. Em algumas modalidades, um ou mais promotores heterólogos são um ou mais do promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (HCMV), o promotor do fator de alongamento humano-1 (EF1), o promotor de β-actina humana, o promotor de UbC humana, o promotor de PGF, o promotor de CAGG sintético e quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica uma proteína cosmética (por exemplo, uma proteína de colágeno humana) está operacionalmente ligado a um promotor de HCMV.
[00169] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação (por exemplo, uma codificação de transgene) de um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno (COL7). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação (por exemplo, uma codificação de transgene) de um polipeptídeo de Lisil hidroxilase 3 (LH3). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, uma codificação de transgene) um polipeptídeo citoesquelético 17 de queratina tipo I (KRT17). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação (por exemplo, um transgene que codifica) um polipeptídeo transglutaminase (TGM) (por exemplo, um polipeptídeo transglutaminase humano, como um polipeptídeo TGM1 humano). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente
93 / 236 divulgação não compreende a sequência de codificação (por exemplo, uma codificação do transgene) de um polipeptídeo de subunidade beta-3 da laminina (LAMB3). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, uma codificação de transgene) um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno, um polipeptídeo lisil hidroxilase 3, um polipeptídeo citoesquelético 17 de queratina tipo I e / ou quaisquer polipeptídeos quiméricos dos mesmos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, uma codificação de transgene) um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno, um polipeptídeo de lisil hidroxilase 3, um polipeptídeo citoesquelético 17 de queratina tipo I, um polipeptídeo de transglutaminase (TGM) (por exemplo, um polipeptídeo de transglutaminase humano, como um polipeptídeo TGM1 humano), um polipeptídeo de subunidade beta-3 (LAMB3) da laminina (por exemplo, um polipeptídeo LamB3 humano) e / ou qualquer polipeptídeo quimérico dos mesmos. Proteínas cosméticas Proteínas de colágeno
[00170] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de colágeno de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína de colágeno de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, proteínas de colágeno humana (ver, por exemplo, Números de acessão UniProt P02452, P08123, P02461, P02462, P08572, P12109, Q02388 , Q9UMD9 etc.), proteínas de colágeno de camundongo (ver, por exemplo, Números de acessão UniProt P11087, Q01149, P08121, P02463, P08122, Q04857, Q63870, Q07563, etc.), proteínas de colágeno de chimpanzé (ver, por exemplo, Números de acessão UniProt A0A2I3SM98, A0A2J8L483, H2QJ46,
94 / 236 K7C8P4, K7C8W0, A0A2J8M8U9, H2QMJ5, H2Q2J4, etc.), proteínas de colágeno de rato (ver, por exemplo, Números de acessão UniProt P02454, P02466, P13941, P02466, F1M6Q3, D3ZUL3, D3ZE04, D3ZE04, etc.), proteínas de colágeno de rato (ver, por exemplo, Números de acessão UniProt G1T4A5, Q28668, G1T8J0, G1U9R7, G1T548, G1T380, G1T548, etc.) etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos de proteína de colágeno de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, o uso de um programa de alinhamento de sequência de aminoácido, como o BLAST® blastn suíte ou OrthoDB. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de colágeno da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos polipeptídeos de colágeno aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[00171] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de colágeno humana. Qualquer proteína de colágeno humana adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um polipeptídeo de cadeia alfa-1(I) de colágeno (COL1-1) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P02452; SEQ ID NO: 15), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(I) de colágeno (COL1-2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P08123; SEQ ID NO: 16), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(II) de colágeno (COL2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P02458), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(III) de colágeno (COL3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P2461; SEQ ID NO: 17), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IV) de colágeno (COL4-1) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P02462; SEQ ID NO: 18), um polipeptídeo de
95 / 236 cadeia alfa-2(IV) de colágeno (COL4-2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P08572), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IV) de colágeno (COL4-3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q01955), um polipeptídeo de cadeia alfa-4(IV) de colágeno (COL4-4) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P53420), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(IV) de colágeno (COL4-5) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt 29400), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(IV) de colágeno (COL4-6) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q14031), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(V) de colágeno (COL5-1) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P20908), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(V) de colágeno (COL5-2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P05997), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(V) de colágeno (COL5-3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P25940), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VI) de colágeno (COL6-1) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P12109; SEQ ID NO: 19), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(VI) de colágeno (COL6-2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P12110), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(VI) de colágeno (COL6-3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P12111), a Collagen alpha-4(VI) chain polypeptide (COL6-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(VI) de colágeno (COL6-5) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt A8TX70), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(VI) de colágeno (COL6-6) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt A6NMZ7), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VII) de colágeno (COL7) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q02388; SEQ ID NO: 20), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VIII) de colágeno (COL8) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P27658), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IX) de colágeno (COL9-1) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P20849), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(IX) de colágeno (COL9-2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q14055), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IX) de colágeno (COL9-3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q14050), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(X) de colágeno (COL10) (ver, por exemplo,
96 / 236 número de acessão UniProt Q03692), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XI) de colágeno (COL11-1) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P12107), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(XI) de colágeno (COL11-2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P13942), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XII) de colágeno (COL12) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q99715), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIII) de colágeno (COL13) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q5TAT6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIV) de colágeno (COL14) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q05707), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XV) de colágeno (COL15) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P39059), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVI) de colágeno (COL16) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q07092), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVII) de colágeno (COL17) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q9UMD9; SEQ ID NO: 21), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVIII) de colágeno (COL18) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P39060), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIX) de colágeno (COL19) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q14993), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XX) de colágeno (COL20) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q9P218), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXI) de colágeno (COL21) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q96P44), aum polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXII) de colágeno (COL22) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q8NFW1), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIII) de colágeno (COL23) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q86Y22), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIV) de colágeno (COL24) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q17RW2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXV) de colágeno (COL25) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q9BXS0), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXVI) de colágeno (COL26) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q96A83), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXVII) de colágeno (COL27) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q8IZC6), um
97 / 236 polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXVIII) de colágeno (COL28) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q2UY09), etc. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência que codifica qualquer um dos polipeptídeos de colágeno humano aqui descritos ou conhecidos na técnica. Os métodos de identificação de colágeno humano adicional ou homólogos / ortólogos de polipeptídeo semelhante a colágeno são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, o uso de um programa de alinhamento de sequência de aminoácidos, como o BLAST® blastp suite ou OrthoDB.
[00172] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína COL1-1 humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL1-1 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL1-1 humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
[00173] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL1-1 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de
98 / 236 aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, mas menos que 1464, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 15.
[00174] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína COL1-2 humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL1-2 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL1-2 humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
[00175] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL1-2 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos
99 / 236 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, mas menos que 1366, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 16.
[00176] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína COL3 humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL3 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL3 humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[00177] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL3 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, mas menos que 1466, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 17.
[00178] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína COL4-1 humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL4-1 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos
100 / 236 com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL4-1 humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00179] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL4-1 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, pelo menos 1500, pelo menos 1600, mas menos que 1669, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 18.
[00180] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína COL6-1 humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL6-1 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 19. Em
101 / 236 algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL6-1 humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
[00181] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL6-1 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, mas menos que 1028, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 19.
[00182] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína COL7 humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL7 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL7 humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
[00183] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL7 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou
102 / 236 fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, pelo menos 1500, pelo menos 1600, pelo menos 1700, pelo menos 1800, pelo menos 1900, pelo menos 2000, pelo menos 2100, pelo menos 2200, pelo menos 2300, pelo menos 2400, pelo menos 2500, pelo menos 2600, pelo menos 2700, pelo menos 2800, pelo menos 2900, mas menos que 2944, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 20.
[00184] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína COL17 humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL17 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL17 humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[00185] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína COL17 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos
103 / 236 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, pelo menos menos que 1497 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 21.
[00186] Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de colágeno humana da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana, uma proteína de colágeno humana adicional, uma proteína de colágeno humana adicional e / ou uma segunda proteína de colágeno humana) compreendem uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15-
21. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de colágeno humana da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana, uma outra proteína de colágeno humana, uma proteína de colágeno humana adicional e / ou uma segunda proteína de colágeno humana) compreendem uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 15-21.
[00187] Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de colágeno humana da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana, uma proteína de colágeno humana adicional, uma proteína de colágeno humana adicional e / ou uma segunda proteína de colágeno humana) compreendem uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15-
17. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de colágeno humana da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana,
104 / 236 uma outra proteína de colágeno humana, uma proteína de colágeno humana adicional e / ou uma segunda proteína de colágeno humana) compreendem uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 15-17. Proteínas de fibronectina
[00188] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de fibronectina de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína de fibronectina de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, uma proteína de fibronectina humana (ver, por exemplo, Número de acessão UniProt P02751), uma proteína de fibronectina de camundongo (ver, por exemplo, Número de acessão UniProt P11276), uma proteína de fibronectina de chimpanzé (ver, por exemplo, Número de acessão UniProt P11276), uma proteína de fibronectina de rato (ver Número de acessão UniProt P04937), uma proteína de fibronectina de coelho (ver Número de acessão UniProt P04937), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos da proteína da fibronectina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína de fibronectina da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um das proteínas de fibronectina aqui descritas ou conhecidos na técnica.
[00189] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de fibronectina humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibronectina é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma
105 / 236 sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibronectina humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.
[00190] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibronectina é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, pelo menos 1500, pelo menos 1600, pelo menos 1700, pelo menos 1800, pelo menos 1900, pelo menos 2000, pelo menos 2100, pelo menos 2200, pelo menos 2300, pelo menos 2400, mas menos que 2477, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 53. Elastina e proteínas associadas
[00191] As fibras elásticas na matriz extracelular fornecem propriedades elásticas ao tecido. As fibras elásticas geralmente contêm dois componentes morfologicamente distintos - as fibras de elastina maduras e as microfibrilas que contêm principalmente fibrilina e estão associadas a outras proteínas, como as micro-fibrilas associadas a glicoproteínas (MAGPs), fibulinas e as proteínas localizadas na interface elastina-microfibrilas (EMILIN). A elastina e seu precursor solúvel, a tropoelastina, pertencem às principais proteínas estruturais
106 / 236 do corpo.
[00192] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma elastina ou proteína associada à elastina, incluindo uma tropoelastina, uma fibrilina, uma glicoproteína associada a micro-fibrilas, uma fibulina ou uma proteína localizada na interface elastina-microfibrilas. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de elastina de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína de elastina de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, uma proteína de elastina humana (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P15502), uma proteína de elastina de camundongo (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P15502), uma proteína de elastina de chimpanzé (ver, por exemplo, número de acessão UniProt H2QUQ6), uma proteína de elastina de rato (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q99372), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos da proteína da elastina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína de elastina da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um das proteínas de elastina aqui descritas ou conhecidos na técnica.
[00193] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de elastina humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de elastina humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma
107 / 236 sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de elastina humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.
[00194] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de elastina é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, mas menos que 786, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 54. Proteínas de lumicano
[00195] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de lumicano de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína de lumicano de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, uma proteína de lumicano humana (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P51884), uma proteína de lumicano de camundongo (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P51885), uma proteína de lumicano de chimpanzé (ver, por exemplo, número de acessão UniProt H2Q6L3), uma proteína de lumicano de rato (ver número de acessão UniProt H2Q6L3), uma proteína de lumicano de coelho (ver, por exemplo, número de acessão UniProt
108 / 236 O46379), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos da proteína de lumicano de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína de lumicano da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer uma das proteínas de lumicano aqui descritas ou conhecidos na técnica.
[00196] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de lumicano humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de lumicano humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de lumicano humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.
[00197] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de lumicano é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30,
109 / 236 pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, mas menos que 338, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 55. Proteínas de vitronectina e de receptor de vitronectina
[00198] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de vitronectina e de receptor de vitronectina de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína de vitronectina ou de receptor de vitronectina de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, uma proteína de vitronectina ou de receptor de vitronectina humana (ver, por exemplo, números de acessão UniProt P04004 e P06756), uma proteína de vitronectina ou de receptor de vitronectina de camundongo (ver, por exemplo, números de acessão UniProt P29788 e P43406), uma proteína de vitronectina ou de receptor de vitronectina de chimpanzé (ver, por exemplo, números de acessão UniProt H2QCH3 e H2R6C3), uma proteína de vitronectina ou de receptor de vitronectina de rato (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q7TQ11), uma proteína de vitronectina ou de receptor de vitronectina de coelho (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P22458), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos de vitronectina ou proteína de receptor de vitronectina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína de vitronectina e de receptor de vitronectina da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer uma das proteínas de vitronectina e de receptor de vitronectina aqui descritas
110 / 236 ou conhecidos na técnica.
[00199] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de vitronectina humana. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de vitronectina humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína vitronectina humana é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[00200] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de vitronectina é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N- terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56. Truncamentos N-terminais, truncamentos C- terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mas menos que 478, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 56. Proteínas de laminina
[00201] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de laminina de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína de laminina de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por
111 / 236 exemplo, uma proteína de laminina humana (ver, por exemplo, números de acessão UniProt P25391, P24043, Q16787, Q16363, O15230, P07942, P55268, Q13751, P11047, Q13753 e Q9Y6N6), uma proteína de laminina de camundongo (ver, por exemplo, números de acessão UniProt Q61789, Q61087 e Q61092), uma proteína de laminina de chimpanzé (ver, por exemplo, números de acessão UniProt H2QEC7, H2R041 e H2Q0R2), uma proteína de laminina de rato (ver, por exemplo, números de acessão UniProt D3ZN05, F1LPI5 e F1LRH4), uma proteína de laminina de coelho (ver, por exemplo, números de acessão UniProt G1SY40 e A0A0B5JSH0), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos da proteína de laminina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína de laminina da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer uma das proteínas de laminina aqui descritas ou conhecidos na técnica.
[00202] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de laminina humana, como um polipeptídeo de subunidade alfa-1 (LamA1) humana da laminina (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P25391), um polipeptídeo de subunidade alfa-2 (LamA2) humana da laminina (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P24043), um polipeptídeo de subunidade alfa-3 da laminina humana (LamA3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q16787), um polipeptídeo de subunidade alfa-4 da laminina humana (LamA4) (ver por exemplo, número de acessão UniProt Q16363 ), um polipeptídeo de subunidade alfa-5 da laminina humana (LamA5) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt O15230), um polipeptídeo de subunidade beta 1 da laminina humana (LamB1) (ver, por
112 / 236 exemplo, número de acessão UniProt P07942), um polipeptídeo de subunidade beta 2 da laminina humana (LamB2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P55268), um polipeptídeo de subunidade beta-3 da laminina humana (LamB3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q13751), um polipeptídeo de subunidade gama-1 da laminina humana (LamC1) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P11047), um polipeptídeo de subunidade gama-2 da laminina humana (LamC2) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q13753), um polipeptídeo de subunidade gama-3 da laminina humana (LamC3) (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q9Y6N6), etc.
[00203] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica um polipeptídeo LamA3 humano. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamA3 humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamA3 humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57.
[00204] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamA3 humano é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100,
113 / 236 pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250, pelo menos 2500, pelo menos 2750, pelo menos 3000, pelo menos 3250, mas menos do que 3333, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 57.
[00205] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica um polipeptídeo LamB3 humano. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamB3 humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamB3 humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
[00206] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamB3 humano é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, mas menos que 1172, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:
58.
114 / 236
[00207] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica um polipeptídeo LamC2 humano. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamC2 humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamC2 humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
[00208] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LamC2 humano é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, mas menos que 1193, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:
59. Proteínas neuromoduladoras
[00209] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína neuromoduladora de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína neuromoduladora de qualquer espécie adequada conhecida na técnica
115 / 236 pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, uma proteína de clostridium botulinum (ver, por exemplo, números de acessão UniProt P0DPI0, Q45894, P0DPI1, P10844 e B1INP5), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos da proteína neuromoduladora de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína neuromoduladora da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer uma das proteínas neuromoduladoras aqui descritas ou conhecidos na técnica.
[00210] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína neuromoduladora de Clostridium botulinum.
[00211] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de neurotoxina de clostridium botulinum tipo A. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de neurotoxina de clostridium botulinum tipo A é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de neurotoxina de clostridium botulinum tipo A é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, uma proteína de neurotoxina de clostridium
116 / 236 botulinum do tipo A da presente divulgação compreende uma mutação de alanina para valina em uma posição correspondente à posição 27 da SEQ ID NO: 60.
[00212] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína tipo A de neurotoxina de clostridium botulinum é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Truncamentos N- terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, mas menos que 1296, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 60.
[00213] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de neurotoxina de clostridium botulinum tipo B. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de neurotoxina de clostridium botulinum tipo B é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de neurotoxina de clostridium botulinum tipo B é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.
[00214] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína tipo B de neurotoxina de clostridium botulinum é um polinucleotídeo
117 / 236 que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61. Truncamentos N- terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, mas menos que 1291, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 61. Proteínas de fibrilina
[00215] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de fibrilina de comprimento total ou quaisquer isoformas ou porções das mesmas. Qualquer proteína de fibrilina de qualquer espécie adequada conhecida na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, uma proteína de fibrilina humana (ver, por exemplo, números de acessão UniProt P35555, P35556 e Q75N90), uma proteína de fibrilina de camundongo (ver, por exemplo, números de acessão UniProt Q61554 e Q61555), uma proteína de fibrilina de chimpanzé (ver, por exemplo, números de acessão UniProt A0A2I3RTE4 e K7CZX0), uma proteína de fibrilina de rato (ver, por exemplo, número de acessão UniProt G3V9M6 e F1M5Q4), uma proteína de fibrilina de coelho, (ver, por exemplo, número de acessão UniProt G1SKM2, G1SUS5 e G1T1H4), etc. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos da proteína de fibrilina de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína de fibrilina da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%,
118 / 236 pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer uma das proteínas de fibrilina aqui descritas ou conhecidos na técnica.
[00216] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de fribrilina humana.
[00217] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de fibrilina humana 1. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 1 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 1 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
[00218] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 1 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250, pelo menos 2500, pelo menos 2750, mas menos que 2871, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 62.
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[00219] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de fibrilina humana 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 2 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 2 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
[00220] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 2 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250, pelo menos 2500, pelo menos 2750, mas menos que 2912, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 63.
[00221] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação codifica uma proteína de fibrilina humana 3. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 3 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo
120 / 236 menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 3 é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.
[00222] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fibrilina humana 3 é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250, pelo menos 2500, pelo menos 2750, mas menos que 2809, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 64. Polipeptídeos cosméticos exemplificativos
[00223] Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas cosméticas da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma outra proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) compreendem uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15-21 ou 53-64. Em algumas modalidades, uma
121 / 236 ou mais proteínas cosméticas da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma outra proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 15- 21 ou 53-64.
[00224] Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas cosméticas da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma outra proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) compreendem uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 15-21, 53-54 ou 57-59. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas cosméticas da presente divulgação (por exemplo, uma primeira proteína cosmética, uma outra proteína cosmética, uma proteína cosmética adicional e / ou uma segunda proteína cosmética) compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 15-21, 53-54, ou 57-
59. Primeiros polinucleotídeos
[00225] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante que compreende um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo que compreende uma primeira proteína cosmética. A primeira proteína cosmética pode ser qualquer uma das proteínas cosméticas aqui descritas ou conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, uma proteína de colágeno, uma fibronectina, uma elastina, um lumicano, uma vitronectina/receptor de vitronectina, uma laminina, um neuromodulador, uma fibrilina etc. Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma proteína estrutural da matriz extracelular (por exemplo, um colágeno, elastina, fibronectina, laminina, fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a primeira
122 / 236 proteína cosmética é um colágeno, elastina, fibronectina ou proteína laminina (por exemplo, um colágeno humano, elastina, fibronectina ou proteína laminina).
[00226] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da presente divulgação compreende uma cópia do primeiro polinucleotídeo. Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da presente divulgação compreende duas ou mais (por exemplo, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, etc.) cópias do primeiro polinucleotídeo. Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da presente divulgação compreende duas cópias do primeiro polinucleotídeo.
[00227] Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma primeira proteína de colágeno humana. A primeira proteína de colágeno humana pode ser qualquer uma das proteínas de colágeno humana aqui descritas ou conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, ou COL28. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7, ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-2. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL3. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-1. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-2. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL6-1. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL7.
123 / 236 Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana não é COL7. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL17.
[00228] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo consiste essencialmente na primeira proteína cosmética. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo consiste na primeira proteína cosmética. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é a primeira proteína cosmética. Polipeptídeos quiméricos
[00229] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo quimérico que compreende a primeira proteína cosmética. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo quimérico que compreende a primeira proteína cosmética e uma outra proteína cosmética. Em algumas modalidades, o polipeptídeo quimérico compreende um polipeptídeo ligante que liga a primeira proteína cosmética e a outra proteína cosmética. Em algumas modalidades, o polipeptídeo quimérico compreende, do terminal n ao terminal c, a primeira proteína cosmética - o polipeptídeo ligante - a outra proteína cosmética. A primeira e/ou a outra proteína cosmética pode ser qualquer uma das proteínas cosméticas aqui descritas ou conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, uma proteína de colágeno, uma fibronectina, uma elastina, um lumicano, uma vitronectina/receptor de vitronectina, uma laminina, um neuromodulador, uma fibrilina etc. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a outra proteína cosmética é uma proteína estrutural da matriz extracelular (por exemplo, um colágeno, elastina, fibronectina, laminina, fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a primeira e/ou a outra proteína cosmética é um colágeno, elastina, fibronectina ou proteína laminina (por exemplo, um colágeno humano, elastina, fibronectina ou proteína laminina). Em algumas modalidades, a primeira e outras proteínas cosméticas são as mesmas. Em algumas modalidades, a primeira e a outra proteínas cosméticas são diferentes.
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[00230] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável. Qualquer polipeptídeo ligante clivável conhecido na técnica pode ser usado nos polipeptídeos quiméricos da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um ligante T2A, um ligante P2A, um ligante E2A e ligante F2A, etc. Em outras modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante T2A. Uma sequência de ácido nucleico exemplificativa que codifica um polipeptídeo ligante T2A é fornecida como SEQ ID NO: 24. Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de um polipeptídeo ligante T2A é fornecida como SEQ ID NO: 28. Em outras modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante P2A. Uma sequência de ácido nucleico exemplificativa que codifica um polipeptídeo ligante P2A é fornecida como SEQ ID NO: 25. Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de um polipeptídeo ligante P2A é fornecida como SEQ ID NO: 29. Em outras modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante E2A. Uma sequência de ácido nucleico exemplificativa que codifica um polipeptídeo ligante E2A é fornecida como SEQ ID NO: 26. Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de um polipeptídeo ligante E2A é fornecida como SEQ ID NO:
30. Em outras modalidades, o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante F2A. Uma sequência de ácido nucleico exemplificativa que codifica um polipeptídeo ligante F2A é fornecida como SEQ ID NO: 27. Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de um polipeptídeo ligante F2A é fornecida como SEQ ID NO: 31.
[00231] Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% , pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 28-31. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ligante compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 28-31.
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[00232] Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma primeira proteína de colágeno (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana) e a outra proteína cosmética é uma outra proteína de colágeno (por exemplo, uma outra proteína de colágeno humana). Uma sequência de ácido nucleico exemplificativa que codifica um polipeptídeo quimérico compreendendo uma primeira proteína de colágeno humana, um polipeptídeo ligante e uma outra proteína de colágeno humana é fornecida como SEQ ID NO: 32.
[00233] Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma primeira proteína de colágeno humana e a outra proteína cosmética é uma outra proteína de colágeno humana. A outra proteína de colágeno humana pode ser qualquer uma das proteínas de colágeno humana aqui descritas ou conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9- 3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, ou COL28. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4- 2, COL6-1, COL7, ou COL17. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é COL1-1. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é COL1-2. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é COL3. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é COL4-1. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é COL4-2. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é COL6-1. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana é COL7. Em algumas modalidades, a outra proteína de colágeno humana não é COL7. Em algumas modalidades, a outra proteína de
126 / 236 colágeno humana é COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são as mesmas. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[00234] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a outra proteína de colágeno humana é COL1-2. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a outra proteína de colágeno humana é COL3.
[00235] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-2 e a outra proteína de colágeno humana é COL1-1, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-2 e a outra proteína de colágeno humana é COL1-1.
[00236] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL3 e a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1- 1, COL1-2, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17.
[00237] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-1 e a outra proteína de colágeno humana é COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-1 e a outra proteína de colágeno humana é COL4-2.
[00238] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL6-1 e a outra proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL7 ou COL17.
[00239] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL7 e a outra proteína de colágeno humana é COL1-1, COL1-2,
127 / 236 COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 ou COL17.
[00240] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL17 e a outra proteína de colágeno humana é COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 ou COL7.
[00241] Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma primeira proteína de laminina (por exemplo, uma primeira proteína de laminina humana) e a outra proteína cosmética é uma proteína de laminina adicional (por exemplo, uma proteína de laminina humana adicional). Em algumas modalidades, a primeira proteína cosmética é uma primeira proteína de laminina humana e a outra proteína cosmética é uma proteína de laminina humana adicional. A outra proteína de laminina humana pode ser qualquer uma das proteínas de laminina humana aqui descritas ou conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamA3 humano e a outra proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamB3 humano. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamA3 humano e a outra proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamC2 humano. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamB3 humano e a outra proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamC2 humano.
[00242] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA monocistrônico. Em algumas modalidades, o mRNA monocistrônico compreende uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo.
[00243] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico. Em algumas modalidades, o mRNA policistrônico compreende uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo. mRNA policistrônico
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[00244] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico. Em algumas modalidades, o mRNA policistrônico compreende uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico compreendendo: 1) uma primeira fase de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo e 2) uma segunda fase de leitura aberta (ORF) que codifica uma proteína cosmética adicional. Em algumas modalidades, o mRNA policistrônico compreende ainda um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) que separa a primeira ORF e a segunda ORF. Em algumas modalidades, o mRNA policistrônico compreende, de 5' a 3', a primeira ORF que codifica o primeiro polipeptídeo - o IRES - a segunda ORF que codifica a proteína cosmética adicional. O primeiro polipeptídeo pode ser qualquer um dos primeiros polipeptídeos aqui descritos. A proteína cosmética adicional pode ser qualquer uma das proteínas cosméticas aqui descritas ou conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, uma proteína de colágeno, uma fibronectina, uma elastina, um lumicano, uma vitronectina/receptor de vitronectina, uma laminina, um neuromodulador, uma fibrilina etc. Em algumas modalidades, a proteína cosmética adicional é uma proteína estrutural da matriz extracelular (por exemplo, um colágeno, elastina, fibronectina, laminina, fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a proteína cosmética adicional é um colágeno, elastina, fibronectina ou proteína laminina (por exemplo, um colágeno humano, elastina, fibronectina ou proteína laminina).
[00245] Qualquer IRES adequado conhecido na técnica pode ser usado nos mRNAs policistrônicos da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um IRES derivado de vírus (por exemplo um IRES derivado de um poliovírus, rinovírus, vírus da encefalomiocardite (EMCV), vírus da febre aftosa, vírus da hepatite C, vírus da peste suína clássica, vírus do sarcoma de rous, vírus da imunodeficiência humana, vírus da paralisia do críquete, herpesvírus associado
129 / 236 ao sarcoma de Kaposi, etc.), um IRES derivado de mRNA celular (por exemplo um IRES derivado de mRNAs de fator de crescimento, tais como fator de crescimento de fibroblastos 2, fator de crescimento B derivado de plaquetas e fator de crescimento endotelial vascular; um IRES derivado de mRNAs do fator de transcrito, como antennapedia, ultrabithorax e fator de repressão NF-κB; um IRES derivado de mRNAs de oncogene, como c-myc, pim-1 e proteína cinase p58PITSLRE, etc.), um IRES sintético (por exemplo, um CP148 IRES), e outros (ver, por exemplo, Mokrejs et al. (2007) A Bioinformatical Approach to the Analysis of Viral and Cellular Internal Ribosome Entry Sites. Columbus F editors. New Messenger RNA Research Communications. Hauppauge, NY: Nova Science Publishers; pp. 133-166). Em algumas modalidades, o IRES é um IRES CP148. Uma sequência de ácido nucleico exemplificativa que codifica um IRES CP148 é fornecida como SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, o IRES é um EMCV IRES. Uma sequência de ácido nucleico exemplificativo que codifica um EMCV IRES é fornecida como SEQ ID NO:
23.
[00246] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o IRES compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO:
23. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o IRES compreende a sequência de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23.
[00247] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é uma primeira proteína de colágeno (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana) e a proteína cosmética adicional é uma proteína de colágeno adicional (por exemplo, uma proteína de colágeno humana adicional). Um exemplo de ácido nucleico que codifica um mRNA policistrônico compreendendo uma
130 / 236 primeira ORF, um IRES e uma segunda ORF é fornecido como SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34. A proteína de colágeno humana adicional pode ser qualquer uma das proteínas de colágeno humanas aqui descritas. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1- 1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, ou COL28. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6- 1, COL7, ou COL17. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL1-1. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL1-2. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL3. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL4-1. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL4-2. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL6-1. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL7. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional não é COL7. Em algumas modalidades, a proteína de colágeno humana adicional é COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são as mesmas. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[00248] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a proteína de colágeno humana adicional é COL1-2. Em algumas modalidades, a primeira
131 / 236 proteína de colágeno humana é COL1-1 e a proteína de colágeno humana adicional é COL3.
[00249] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-2 e a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-2 e a proteína de colágeno humana adicional é COL1-1.
[00250] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL3 e a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17.
[00251] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-1 e a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-1 e a proteína de colágeno humana adicional é COL4-2.
[00252] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL6-1 e a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL7 ou COL17.
[00253] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL7 e a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 ou COL17.
[00254] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL17 e a proteína de colágeno humana adicional é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 ou COL7.
[00255] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é uma primeira proteína de colágeno (por exemplo, uma primeira proteína de colágeno humana) e a proteína cosmética adicional é uma proteína de colágeno adicional (por exemplo, uma proteína de colágeno humana adicional).
[00256] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é uma
132 / 236 primeira proteína de laminina (por exemplo, uma primeira proteína de laminina humana), e a proteína cosmética adicional é uma proteína de laminina adicional (por exemplo, uma proteína de laminina humana adicional). Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é uma primeira proteína de laminina humana e a proteína cosmética adicional é uma proteína de laminina humana adicional. A proteína de laminina humana adicional pode ser qualquer uma das proteínas de laminina humana aqui descritas ou conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamA3 humano e a proteína de laminina humana adicional é um polipeptídeo LamB3 humano. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamA3 humano e a proteína de laminina humana adicional é um polipeptídeo LamC2 humano. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamB3 humano e a proteína de laminina humana adicional é um polipeptídeo LamC2 humano. Segundos polinucleotídeos
[00257] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante que compreende ainda um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína cosmética. A segunda proteína cosmética pode ser qualquer uma das proteínas cosméticas aqui descritas ou conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, uma proteína de colágeno, uma fibronectina, uma elastina, um lumicano, uma vitronectina/receptor de vitronectina, uma laminina, um neuromodulador, uma fibrilina etc. Em algumas modalidades, a segunda proteína cosmética é uma proteína estrutural da matriz extracelular (por exemplo, um colágeno, elastina, fibronectina, laminina, fibrilina, etc.). Em algumas modalidades, a segunda proteína cosmética é um colágeno, elastina, fibronectina ou proteína laminina (por exemplo, um colágeno humano, elastina, fibronectina ou proteína laminina). Em algumas modalidades, a primeira e a segunda proteínas
133 / 236 cosméticas são as mesmas. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda proteínas cosméticas são diferentes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende uma cópia do segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais (por exemplo, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, etc.) cópias do segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas cópias do segundo polinucleotídeo.
[00258] Em algumas modalidades, a segunda proteína cosmética é uma proteína de colágeno. Em algumas modalidades, a segunda proteína cosmética é uma segunda proteína de colágeno humana. A segunda proteína de colágeno humana pode ser qualquer uma das proteínas de colágeno humanas aqui descritas. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9- 3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, ou COL28. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6- 1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é COL1-1. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é COL1-2. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é COL3. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é COL4-1. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é COL4-2. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é COL6-1. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana é COL7. Em algumas modalidades, a segunda proteína de colágeno humana não é COL7. Em algumas modalidades, a segunda proteína de
134 / 236 colágeno humana é COL17.
[00259] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica uma primeira proteína de colágeno e o segundo polinucleotídeo codifica uma segunda proteína de colágeno. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica uma primeira proteína de colágeno humana e o segundo polinucleotídeo codifica uma segunda proteína de colágeno humana. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana (codificada pelo primeiro polinucleotídeo) e a segunda proteína de colágeno humana (codificada pelo segundo polinucleotídeo) são iguais. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana (codificada pelo primeiro polinucleotídeo) e a segunda proteína de colágeno humana (codificada pelo segundo polinucleotídeo) são diferentes.
[00260] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a segunda proteína de colágeno humana é COL1-2. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-1 e a segunda proteína de colágeno humana é COL3.
[00261] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-2 e a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL1-2 e a segunda proteína de colágeno humana é COL1-1.
[00262] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL3 e a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL4-1, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17.
[00263] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-1 e a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de
135 / 236 COL1-2, COL1-2, COL3, COL4-2, COL6-1, COL7 ou COL17. Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL4-1 e a segunda proteína de colágeno humana é COL4-2.
[00264] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL6-1 e a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL7 ou COL17.
[00265] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL7 e a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 ou COL17.
[00266] Em algumas modalidades, a primeira proteína de colágeno humana é COL17 e a segunda proteína de colágeno humana é selecionada de COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 ou COL7.
[00267] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica uma primeira proteína de laminina (por exemplo, uma primeira proteína de laminina humana) e o segundo polinucleotídeo codifica uma segunda proteína de laminina (por exemplo, uma segunda proteína de laminina humana). Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo codifica um primeiro polipeptídeo de laminina humana e o segundo polinucleotídeo codifica uma segunda proteína de laminina humana. A segunda proteína laminina humana pode ser qualquer uma das proteínas de laminina humana aqui descritas ou conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamA3 humano e a segunda proteína de laminina humana é um polipeptídeo de LamB3 humano. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamA3 humano e a segunda proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamC2 humano. Em algumas modalidades, a primeira proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamB3 humano e a segunda proteína de laminina humana é um polipeptídeo LamC2 humano Ácidos nucleicos recombinantes
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[00268] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo qualquer um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende uma cópia do primeiro polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas cópias do primeiro polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende uma cópia do primeiro polinucleotídeo e uma cópia do segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende uma cópia do primeiro polinucleotídeo e duas cópias do segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas cópias do primeiro polinucleotídeo e uma cópia do segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende duas cópias do primeiro polinucleotídeo e duas cópias do segundo polinucleotídeo.
[00269] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor (por exemplo, um vetor de expressão, um vetor de exibição, etc.). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de DNA ou um vetor de RNA. Geralmente, os vetores adequados para manter, propagar e / ou expressar polinucleotídeos para produzir um ou mais polipeptídeos em um sujeito podem ser usados. Exemplos de vetores adequados podem incluir, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, epissomas, transposons e vetores virais (por exemplo, vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados, vetores virais de vaccinia, vetores virais Sindbis, vetores de sarampo, vetores virais de herpes, vetores lentivirais, vetores retrovirais, etc.). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral do herpes. Em algumas modalidades, o vetor é capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o vetor é incapaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o vetor pode se integrar em um DNA hospedeiro. Em algumas modalidades, o vetor não pode se integrar em um DNA hospedeiro (por
137 / 236 exemplo, é epissômico). Métodos de produção de vetores contendo um ou mais polinucleotídeos de interesse são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, por síntese química, ou por manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos (por exemplo, por técnicas de engenharia genética).
[00270] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da presente divulgação é um amplicon do vírus herpes simplex (HSV). Os amplicons do vírus herpes, incluindo as características estruturais e métodos para produzir os mesmos, são geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, de Silva S. e Bowers W. “Vetores do Amplicon do vírus herpes”. Viruses 2009, 1, 594-629). Em algumas modalidades, o amplicon do vírus herpes simplex é um amplicon de HSV-1. Em algumas modalidades, o amplicon do vírus herpes simplex é um amplicon híbrido HSV-1. Exemplos de amplicons híbridos de HSV-1 podem incluir, mas não estão limitados a, amplicons híbridos HSV / AAV, amplicons híbridos HSV / EBV, amplicons híbridos HSV / EBV / RV e / ou amplicons híbridos HSV /Sleeping Beauty . Em algumas modalidades, o amplicon é um amplicon híbrido de HSV/AAV. Em algumas modalidades, o amplicon é um amplicon híbrido HSV/Sleeping Beauty .
[00271] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da presente divulgação é um genoma de vírus herpes recombinante. O genoma do vírus herpes recombinante pode ser um genoma recombinante de qualquer membro da família Herpesviridae de vírus de DNA conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, um genoma do vírus herpes simplex recombinante, um genoma do vírus da varicela zóster recombinante, um genoma do citomegalovírus humano recombinante, um genoma de herpesvírus 6A recombinante, um genoma de herpesvírus 6B recombinante, um genoma de herpesvírus 7 recombinante, um genoma de herpesvírus associado a sarcoma de Kaposi recombinante e quaisquer combinações ou quaisquer derivados dos
138 / 236 mesmos. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante compreende um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) mutações de inativação. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações de inativação estão em um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) genes do vírus herpes. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante é atenuado (por exemplo, em comparação com um genoma do vírus herpes de tipo selvagem correspondente). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante é competente para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante é defeituoso para replicação.
[00272] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um genoma do vírus herpes simplex (HSV) recombinante. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma do vírus herpes simplex do tipo 1 recombinante (HSV-1), um genoma do vírus herpes simplex do tipo 2 (HSV-2) recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma HSV-1 recombinante. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é competente para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante é defeituoso para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) mutações de inativação. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações de inativação estão em um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) genes do vírus herpes simplex. Como utilizado neste
139 / 236 documento, uma "mutação de inativação" pode referir-se a qualquer mutação que resulta em um gene ou produto regulon (RNA ou proteína) tendo quantidade e / ou função reduzida, indetectável ou eliminada (por exemplo, em comparação com uma sequência correspondente sem a mutação de inativação). Exemplos de mutações de inativação podem incluir, mas não estão limitados a, deleções, inserções, mutações pontuais e rearranjos em sequências de controle da transcrição (promotores, intensificadores, isoladores, etc.) e / ou sequências de codificação de um determinado gene ou regulon. Qualquer método adequado para medir a quantidade de um gene ou produto regulon conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, qPCR, Northern blots, RNAseq, western blots, ELISAs, etc.
[00273] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou todos os oito da proteína celular infectada (ou polipeptídeo celular infectado) (ICP) 0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), Long Unique Region (UL) 41 e / ou UL55 genes do vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação nos genes do vírus herpes simplex ICP34.5 e / ou ICP47 (por exemplo, para evitar a produção de um vírus estimulador da imunidade). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação no gene do vírus herpes simplex ICP34.5 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação no gene do vírus herpes simplex ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação nos genes do vírus herpes simplex ICP34.5 (uma ou ambas as cópias) e ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante não é oncolítico.
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[00274] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias) e compreende ainda uma mutação de iniciação no ICP4 (uma ou ambas as cópias) ICP22, ICP27, ICP47, UL41 e / ou genes UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), e uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP22 e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP22 e uma mutação de inativação no UL41 gene. Em
141 / 236 algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22 e / ou UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP27, ICP47 e / ou UL55.
[00275] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes complex recombinante compreende uma mutação de inativação no ICP4 (uma ou ambas as cópias e compreende ainda uma mutação de inativação no ICP0 (uma ou ambas as cópias) ICP22, ICP27, ICP47, UL41 e / ou genes UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias), e uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP22 e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22 e / ou UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0, ICP27, ICP47, e/ou UL55.
[00276] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22 e compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4
142 / 236 (uma ou ambas as cópias), ICP27, ICP47, UL41, e / ou UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22 e um gene UL41 de mutação de inativação. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP22 e / ou UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27, ICP47 e / ou UL55.
[00277] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27 e compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP47, UL41, e / ou UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene ICP27.
[00278] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP47 e compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, UL41, e / ou UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene ICP47.
[00279] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41 e compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4
143 / 236 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, e / ou UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene UL41.
[00280] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL55 e compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, e / ou UL41. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene UL55.
[00281] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação (por exemplo, uma deleção) da região de repetição interna (junta) que compreende as regiões de repetição interna longa (IRL) e de repetição interna curta (IRS). Em algumas modalidades, a inativação (por exemplo, deleção) da região comum elimina uma cópia de cada um dos genes ICP4 e ICP0. Em algumas modalidades, a inativação (por exemplo, deleção) da região de junta inativa ainda mais (por exemplo, deleta) o promotor para os genes ICP22 e ICP47. Se desejado, a expressão de um ou de ambos os genes pode ser restaurada pela inserção de um promotor precoce imediato no genoma do vírus herpes simplex recombinante (ver, por exemplo, Hill et al. (1995). Nature 375(6530): 411-415; Goldsmith et al. (1998). J Exp Med 187(3): 341-348). Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que a inativação (por exemplo, deleção) da região de junta pode contribuir para a estabilidade do genoma do vírus herpes simplex recombinante e / ou permitir que o genoma do vírus herpes simplex recombinante acomode mais transgenes e / ou transgenes maiores.
[00282] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP4 (uma ou
144 / 236 ambas as cópias), ICP22 e ICP27. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47 e UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação nos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e / ou UL55 é uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e / ou UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação nos genes ICP22 e ICP47 é uma deleção na região promotora dos genes ICP22 e ICP47 (por exemplo, as sequências de codificação ICP22 e ICP47 estão intactas, mas não são transcricionalmente ativas). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma deleção na sequência de codificação dos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e UL55 e uma deleção na região promotora dos genes ICP22 e ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 e / ou UL41.
[00283] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias) e ICP4 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias) e ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22 e ICP27. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4
145 / 236 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27 e UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27 e / ou UL55 compreende uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP0, ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27 e / ou UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP47 e / ou UL41.
[00284] Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais loci de genes virais. Exemplos de loci virais adequados podem incluir, sem limitação, os loci do gene viral herpes simplex. ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, tk, UL41 e UL55. Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro de um ou ambos os loci do gene ICP4 viral (por exemplo, um vírus recombinante transportando um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4; um vírus recombinante transportando um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4; etc.). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP22 viral (por exemplo, um vírus recombinante transportando um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana no locus ICP22; um vírus recombinante transportando um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana no locus ICP22; etc.). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene UL41 viral (por exemplo, um vírus
146 / 236 recombinante transportando um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana no locus UL41; um vírus recombinante transportando um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana no locus UL41; etc.). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um ou ambos os loci do gene ICP4 viral e um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus ICP22 viral (por exemplo, um vírus recombinante transportando um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4 e um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana no locus ICP22; um vírus recombinante transportando um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4 e um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana no locus ICP22; etc.). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um ou ambos os loci do gene ICP4 viral e um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus UL41 viral (por exemplo, um vírus recombinante transportando um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4 e um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana no locus UL41; um vírus recombinante transportando um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4 e um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana no locus UL41; etc.). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um ou ambos os loci do gene ICP4 viral e um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus ICP22 viral, e um ou mais polinucleotídeos da
147 / 236 presente divulgação dentro do locus UL41 viral (por exemplo, um vírus recombinante transportando um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4 e um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana nos loci ICP22 e UL41; um vírus recombinante que transporta um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana em um ou ambos os loci ICP4 e um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína de colágeno humana nos loci ICP22 e UL41; etc.).
[00285] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante (por exemplo, um genoma do vírus herpes simplex recombinante) foi engenheirado para diminuir ou eliminar a expressão de um ou mais genes do herpes simplex tóxico (como uma ou ambas as cópias do gene HSV ICP0, um ou ambos copiados do gene HSV ICP4, do gene ICP22 e / ou do gene UL41). Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante (por exemplo, um genoma do vírus herpes simplex recombinante) foi engenheirado para reduzir a citotoxicidade do genoma recombinante (por exemplo, quando introduzido em uma célula alvo) em comparação com um genoma do vírus herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem). Em algumas modalidades, a citotoxicidade (por exemplo, em queratinócitos humanos e / ou células de fibroblastos) do genoma do vírus recombinante (por exemplo, um genoma de vírus herpes simplex recombinante) é reduzida em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55% , pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%,
148 / 236 pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% em comparação com um genoma de vírus herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medição da citotoxicidade relativa de um genoma de vírus herpes simplex recombinante ΔICP4 (uma ou ambas as cópias) vs. um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos humanos ou fibroblastos (células primárias ou linhagens de células); medir a citotoxicidade relativa de um genoma de vírus herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) / ΔICP22 versus um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos ou fibroblastos humanos (células primárias ou linhagens de células); etc.). Em algumas modalidades, a citotoxicidade (por exemplo, em queratinócitos humanos e / ou células de fibroblastos) do genoma do vírus herpes recombinante (por exemplo, um genoma de vírus herpes simplex recombinante) é reduzido em pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes , pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 750 vezes, pelo menos cerca de 1000 vezes, ou mais em comparação com um genoma de vírus herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medir a citotoxicidade relativa de um genoma de vírus herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) versus um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos ou fibroblastos humanos (células primárias ou linhagens de células); medir a citotoxicidade relativa de um genoma de vírus herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) / ΔICP22 versus um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos ou fibroblastos humanos (células primárias ou linhagens de células); etc.). Os métodos de
149 / 236 medição da citotoxicidade são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, através do uso de corantes vitais (corantes formazano), biomarcadores de protease, um ensaio de MTT (ou um ensaio usando sais de tetrazólio relacionados, como XTT, MTS , sais de tetrazólio solúveis em água, etc.), medição do teor de ATP, etc.
[00286] Em algumas modalidades, o genoma do vírus herpes recombinante (por exemplo, um genoma do vírus herpes simplex recombinante) foi engenheirado para reduzir seu impacto na proliferação da célula hospedeira após a exposição da célula alvo ao genoma recombinante, em comparação com um genoma de vírus herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem). Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula da epiderme e / ou derme. Em algumas modalidades, a célula alvo é um queratinócito e / ou fibroblasto. Em algumas modalidades, a proliferação de células hospedeiras (por exemplo, queratinócitos humanos e / ou células de fibroblastos) após a exposição ao genoma recombinante é de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, em pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% mais rápida em comparação com a proliferação de células hospedeiras após a exposição a um genoma de vírus herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medir a proliferação celular relativa após a exposição a um genoma de vírus herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) versus proliferação celular após exposição a um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos ou fibroblastos
150 / 236 humanos (células primárias ou linhagens de células); medir a proliferação celular relativa após a exposição a um genoma de vírus herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) / ΔICP22 versus proliferação celular após exposição a um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos ou fibroblastos humanos (células primárias ou linhagens de células); etc.). Em algumas modalidades, a proliferação de células hospedeiras (por exemplo, queratinócitos humanos e / ou células de fibroblastos) após a exposição ao genoma recombinante é pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes , pelo menos cerca de 750 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes mais rápida em comparação com a proliferação da célula hospedeira após a exposição a um genoma de vírus herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medir a proliferação celular relativa após a exposição a um genoma de vírus herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) versus proliferação celular após exposição a um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos ou fibroblastos humanos (células primárias ou linhagens de células); medir a proliferação celular relativa após a exposição a um genoma de vírus herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) / ΔICP22 versus proliferação celular após exposição a um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em queratinócitos ou fibroblastos humanos (células primárias ou linhagens de células) ; etc.). Os métodos de medição da proliferação celular são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, através do uso de um ensaio de proliferação de células Ki67, um ensaio de proliferação de
151 / 236 células BrdU, etc.
[00287] Um vetor (por exemplo, vetor viral de herpes) pode incluir um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em uma forma adequada para a expressão do polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Os vetores podem incluir uma ou mais sequências regulatórias operacionalmente ligadas ao polinucleotídeo a ser expresso (por exemplo, como descrito acima).
[00288] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da presente divulgação (por exemplo, um genoma de vírus herpes simplex recombinante) compreende um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos inseridos em qualquer orientação no ácido nucleico recombinante. Se o ácido nucleico recombinante compreender dois ou mais polinucleotídeos aqui descritos (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, etc.), os polinucleotídeos podem ser inseridos na mesma orientação ou em orientações opostas um ao outro. Sem desejar estar limitado pela teoria, incorporar dois polinucleotídeos (por exemplo, dois transgenes) em um ácido nucleico recombinante (por exemplo, um vetor) em uma orientação antissentido pode ajudar a evitar a leitura e garantir a expressão adequada de cada polinucleotídeo. Vírus
[00289] Certos aspectos da presente divulgação se referem a vírus que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos e / ou ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o vírus é capaz de infectar uma ou mais células-alvo de um sujeito (por exemplo, um humano). Em algumas modalidades, o vírus é adequado para distribuir os polinucleotídeos e / ou ácidos nucleicos recombinantes em uma ou mais células-alvo de um sujeito (por exemplo, um sujeito humano). Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são uma ou mais células humanas. Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são uma ou mais células da pele (por exemplo, uma ou mais células da epiderme, derme e / ou subcutâneas). Em algumas modalidades, uma ou mais células são selecionadas de
152 / 236 queratinócitos, melanócitos, células de Langerhans, células de Merkel, mastócitos, fibroblastos e / ou adipócitos. Em algumas modalidades, uma ou mais células são queratinócitos. Em algumas modalidades, uma ou mais células residem no estrato córneo, estrato granuloso, estrato espinhoso, estrato basal e / ou membrana basal. Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são uma ou mais células epidérmicas.
[00290] Qualquer vírus adequado conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, adenovírus, vírus adenoassociado, retrovírus, lentivírus, vírus sendai, vírus herpes (por exemplo, um vírus herpes simplex), vírus vaccinia e / ou qualquer vírus híbrido dos mesmos. Em algumas modalidades, o vírus é atenuado. Em algumas modalidades, o vírus é defeituoso na replicação. Em alguns aspectos, o vírus é competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus foi modificado para alterar seu tropismo de tecido em relação ao tropismo de tecido de um vírus de tipo selvagem não modificado. Em algumas modalidades, o vírus reduziu a citotoxicidade em comparação com um vírus de tipo selvagem correspondente. Os métodos para a produção de um vírus compreendendo ácidos nucleicos recombinantes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00291] Em algumas modalidades, o vírus é um membro da família Herpesviridae de vírus de DNA, incluindo, por exemplo, um vírus herpes simplex, um vírus varicela zoster, um citomegalovírus humano, um herpesvírus 6A, um herpesvírus 6B, um herpesvírus 7 e um herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi, etc. Em algumas modalidades, o vírus herpes é atenuado. Em algumas modalidades, o vírus herpes é defeituoso na replicação. Em alguns aspectos, o vírus herpes é competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus herpes reduziu a citotoxicidade em comparação com um vírus herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o vírus herpes não é oncolítico.
[00292] Em algumas modalidades, o vírus é um vírus herpes simplex.
153 / 236 Os vírus herpes simplex compreendendo ácidos nucleicos recombinantes podem ser produzidos por um processo divulgado, por exemplo, em WO2015 / 009952 e / ou WO2017 / 176336. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex é atenuado. Em alguns aspectos, o vírus herpes simplex é competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex é defeituoso na replicação. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex é um vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), um vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) ou quaisquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex é um vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Em algumas modalidades, o HSV-1 é atenuado. Em algumas modalidades, o HSV-1 reduziu a citotoxicidade em comparação com um HSV-1 de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o HSV-1 não é oncolítico.
[00293] Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex foi modificado para alterar seu tropismo de tecido em relação ao tropismo de tecido de um vírus herpes simplex de tipo selvagem não modificado. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex compreende um envelope modificado. Em algumas modalidades, o envelope modificado compreende uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) glicoproteínas de vírus herpes simplex mutantes. Exemplos de glicoproteínas de vírus herpes simplex podem incluir, mas não estão limitados a, glicoproteínas gB, gC, gD, gH e gL. Em algumas modalidades, o envelope modificado altera o tropismo de tecido do vírus herpes simplex em relação a um vírus herpes simplex de tipo selvagem.
[00294] Em algumas modalidades, a eficiência de transdução (in vitro e / ou in vivo) de um vírus da presente divulgação (por exemplo, um vírus herpes) para uma ou mais células alvo (por exemplo, um ou mais queratinócitos e / ou fibroblastos humanos) é pelo menos cerca de 25%. Por exemplo, a eficiência de transdução do vírus para uma ou mais células alvo pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca
154 / 236 de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,5% ou mais. Em algumas modalidades, o vírus é um vírus herpes simplex e a eficiência de transdução do vírus para uma ou mais células alvo (por exemplo, um ou mais queratinócitos humanos e / ou fibroblastos) é de cerca de 85% a cerca de 100%. Em algumas modalidades, o vírus é um vírus herpes simplex e a eficiência de transdução do vírus para uma ou mais células alvo (por exemplo, um ou mais queratinócitos humanos e / ou fibroblastos) é de pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%. Métodos de medição da eficiência de transdução viral in vitro ou in vivo são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, análise qPCR, sequenciamento profundo, western blotting, análise fluorométrica (como hibridação fluorescente in situ (FISH), expressão do gene repórter fluorescente, imunofluorescência, FACS), etc. Composições e Formulações
[00295] Certos aspectos da presente divulgação se referem a composições e formulações (por exemplo, composições e formulações farmacêuticas) compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, um genoma de vírus herpes recombinante) e / ou vírus (por exemplo, um vírus herpes compreendendo um genoma recombinante descrito aqui (tal como um vírus herpes simplex compreendendo um genoma de vírus herpes simplex recombinante) e um excipiente ou transportador (por exemplo, um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável). Em
155 / 236 algumas modalidades, a composição ou formulação é uma composição ou formulação cosmética (por exemplo, um produto para o cuidado da pele).
[00296] Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende qualquer um ou mais dos vírus (por exemplo, vírus herpes) aqui descritos. Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende de cerca de 104 a cerca de 1012 unidades formadoras de placa (PFU) / mL do vírus. Por exemplo, a composição ou formulação pode compreender de cerca de 104 a cerca de 1012, cerca de 105 a cerca de 1012, cerca de 106 a cerca de 1012, cerca de 107 a cerca de 1012, cerca de 108 a cerca de 1012, cerca de 109 a cerca de 1012, cerca de 1010 a cerca de 1012, cerca de 1011 a cerca de 1012, cerca de 104 a cerca de 1011, cerca de 105 a cerca de 1011, cerca de 106 a cerca de 1011, cerca de 107 a cerca de 1011, cerca de 108 a cerca de 1011, cerca de 109 a cerca de 1011, cerca de 1010 a cerca de 1011, cerca de 104 a cerca de 1010, cerca de 105 a cerca de 1010, cerca de 106 a cerca de 1010, cerca de 107 a cerca de 1010, cerca de 108 a cerca de 1010, cerca de 109 a cerca de 1010, cerca de 104 a cerca de 109, cerca de 105 a cerca de 109, cerca de 106 a cerca de 109, cerca de 107 a cerca de 109, cerca de 108 a cerca de 109, cerca de 104 a cerca de 108, cerca de 105 a cerca de 108, cerca de 106 a cerca de 108, cerca de 107 a cerca de 108, cerca de 104 a cerca de 107, cerca de 105 a cerca de 107, cerca de 106 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 106, cerca de 105 a cerca de 106, ou cerca de 104 a cerca de 105 PFU/mL do vírus Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende cerca de 104, cerca de 105, cerca de 106, cerca de 107, cerca de 108, cerca e 109, about 1010, cerca de 1011, ou cerca de 1012 PFU/mL do vírus.
[00297] As composições e formulações (por exemplo, composições e formulações farmacêuticas), conforme descrito neste documento, podem ser preparadas pela mistura do(s) ingrediente(s) ativo(s) (como um ácido nucleico recombinante ou um vírus) com o grau de pureza desejado com um ou mais transportadores ou excipientes aceitáveis. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, transportadores ou excipientes farmaceuticamente
156 / 236 aceitáveis) são geralmente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas e podem incluir, mas não estão limitados a: tampões (tais como fosfato, citrato, acetato e outros ácidos orgânicos); antioxidantes (como ácido ascórbico e metionina); conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico ou benzílico, alquil parabenos, catecol, resorcinol, ciclo- hexanol, 3-pentanol e m-cresol); aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); polióis (como o glicerol, por exemplo, formulações incluindo glicerol a 10%); polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos (incluindo glicose, manose ou dextrinas); agentes quelantes (como EDTA); açúcares (tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol); contra-íons formadores de sal (tais como sódio); complexos de metal (tais como complexos de Zn-proteína); lipossomas (por exemplo, lipídeos catiônicos); transportadores de nanopartículas; e / ou tensoativos não iônicos (tais como polietileno glicol (PEG)). Uma discussão completa sobre os transportadores está disponível em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
[00298] Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende um ou mais transportadores lipídicos (por exemplo, lipídeo catiônico). Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende um ou mais transportadores de nanopartículas. As nanopartículas são veículos de distribuição de drogas de tamanho submicrônico (menos que cerca de 1000 nm) que podem transportar drogas encapsuladas (como pequenas moléculas sintéticas, proteínas, peptídeos, células, vírus e bioterapêuticos à base de ácido nucleico para liberação rápida ou controlada. Uma variedade de moléculas (por exemplo, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos recombinantes,
157 / 236 etc.) podem ser eficientemente encapsuladas em nanopartículas usando processos bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, uma molécula "encapsulada" em uma nanopartícula pode referir-se a uma molécula (como um vírus) que está contida dentro da nanopartícula ou ligada e / ou associada à superfície da nanopartícula, ou qualquer combinação das mesmas. Nanopartículas para uso nas composições ou formulações aqui descritas podem ser qualquer tipo de nanopartícula biocompatível conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, nanopartículas compreendendo poli(ácido lático), poli(ácido glicólico), PLGA, PLA, PGA e quaisquer combinações dos mesmos (ver, por exemplo, Vauthier et al. Adv Drug Del Rev. (2003) 55: 519-48; US2007/0148074; US2007/0092575; US2006/0246139; US5753234; US7081483; e WO2006/052285).
[00299] Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente (por exemplo, um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável) pode ser adaptado para ou adequado para qualquer via de administração conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, cutânea, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, oral, transdérmica, intradérmica, intraperitoneal, intraorbital, intravítrea, subrretinal, transmucosa, intra-articular, por injeção superficial, por implantação, por inalação, intratecal, intraventricular e / ou intranasal. Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente (por exemplo, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável) é adaptado ou adequado para administração tópica, transdérmica, subcutânea e / ou intradérmica. Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente é adaptado ou adequado para administração tópica, transdérmica e / ou intradérmica. Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente é adaptado ou adequado para injeção superficial.
[00300] Exemplos de transportadores ou excipientes adaptados ou adequados para uso em uma aplicação / administração tópica, transdérmica, subcutânea, superficial e / ou intradérmica podem incluir, mas não estão
158 / 236 limitados a, pomadas, óleos, pastas, cremes, aerossóis, suspensões, emulsões, pomadas gordurosas, géis, pós, líquidos, loções, soluções, sprays, adesivos (por exemplo, adesivos transdérmicos ou adesivos de microagulha), tiras adesivas, uma microagulha ou arranjos de microagulha e inalantes. Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente (por exemplo, o transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável) compreende um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, etc.) de uma pomada, óleo, pasta, creme, aerossol, suspensão, emulsão, pomada gordurosa, gel, pó, loção líquida, solução, spray, fita adesiva e um inalante. Em algumas modalidades, o transportador compreende um adesivo (por exemplo , um adesivo que adere à pele), como um adesivo transdérmico ou um adesivo de microagulha. Em algumas modalidades, o transportador compreende uma microagulha ou arranjo de microagulhas. Métodos para fazer e usar arranjos de microagulhas adequadas para distribuição de composição são geralmente conhecidos na técnica (Kim Y. et al. “Microneedles for drug and vaccine delivery”. Advanced Drug Delivery Reviews 2012, 64 (14): 1547-68).
[00301] Em algumas modalidades, a composição ou formulação (por exemplo, a composição ou formulação farmacêutica) é adaptada ou adequada para qualquer via de administração conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, cutânea, oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, intradérmica, intraperitoneal, intraorbital, intravítrea, subrretinal, transmucosa, intra- articular, por injeção superficial, por implantação, por inalação, intratecal, intraventricular e / ou intranasal. Em algumas modalidades, a composição ou formulação é adaptada para ou adequada para administração cutânea, tópica, transdérmica, subcutânea e / ou intradérmica. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica é adaptada ou adequada para administração tópica, transdérmica e / ou intradérmica. Em algumas modalidades, a composição ou formulação é adaptada ou adequada para
159 / 236 administração intradérmica. Em algumas modalidades, a composição da formulação é adaptada ou adequada para injeção superficial.
[00302] Em algumas modalidades, a composição ou formulação (por exemplo, composição ou formulação farmacêutica) compreende ainda um ou mais componentes adicionais. Exemplos de componentes adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose, etc.); enchimentos (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etil celulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, glicolato de amido sódico, etc.); agentes umectantes (por exemplo, laurilsulfato de sódio, etc.); soluções salinas; álcoois; polietilenoglicóis; gelatina; lactose; amilase; estearato de magnesio; talco; ácido silícico; parafina viscosa; hidroximetilcelulose; polivinilpirrolidona; adoçantes; aromatizantes; agentes perfumantes; corantes; hidratantes; protetores solares; agentes antibacterianos; agentes capazes de estabilizar polinucleotídeos ou prevenir sua degradação e semelhantes. Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende um gel de hidroxipropilmetilcelulose. Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende um tampão de fosfato. Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende glicerol (por exemplo, em cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, etc.).
[00303] As composições e formulações (por exemplo, composições e formulações farmacêuticas) a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, pela filtração através de membranas de filtração estéreis.
160 / 236
[00304] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados para distribuir um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de colágeno (por exemplo, uma proteína de colágeno humana, como Colágeno 3) em uma ou mais células de um sujeito (por exemplo, uma ou mais células deficientes de colágeno). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados em uma terapia. Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados no tratamento de uma condição cosmética ou estética que se beneficiaria da expressão de um polipeptídeo de colágeno (por exemplo, uma condição cosmética ou estética associada a uma deficiência de colágeno (como pele envelhecida e / ou danificada por UV)). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados no tratamento do envelhecimento dermatológico (por exemplo, conforme descrito abaixo).
[00305] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados na preparação ou fabricação de um medicamento. Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados na preparação ou fabricação de um medicamento útil para a distribuição de um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteína de colágeno (por exemplo, uma proteína de colágeno humana, como Colágeno 3) em uma ou mais células de um sujeito (por exemplo, uma ou mais células deficientes de colágeno). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados na preparação ou fabricação de um medicamento útil para o tratamento de uma
161 / 236 condição cosmética ou estética que se beneficiaria da expressão de um polipeptídeo de colágeno (por exemplo, uma condição cosmética ou estética associada a uma deficiência de colágeno (como pele envelhecida e / ou danificada por UV)). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e / ou composições ou formulações aqui descritas podem ser usados na preparação ou fabricação de um medicamento útil para o tratamento do envelhecimento dermatológico (por exemplo, conforme descrito abaixo). Métodos
[00306] Certos aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas da matriz extracelular dérmica em um sujeito (por exemplo, em uma ou mais células de um sujeito) compreendendo administrar ao sujeito a qualquer um dos ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
[00307] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao método para estabilizar ou melhorar a estrutura e / ou organização da matriz extracelular dérmica em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições aqui descritos. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
[00308] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas de colágeno humana em um sujeito (por exemplo, em uma ou mais células de um sujeito) compreendendo administrar ao sujeito a qualquer um dos ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
[00309] Em algumas modalidades, a administração do ácido nucleico,
162 / 236 vírus, medicamento e / ou composição recombinante ao sujeito aumenta o colágeno (por exemplo, COL1-1; COL1-2; COL3; COL1-1 e COL1-2; COL1- 1 e COL3 ; etc.) níveis (níveis de transcrito ou proteína) em uma ou mais células do sujeito em pelo menos cerca de 10%, em comparação com os níveis endógenos do(s) colágeno(s) em uma ou mais células não tratadas correspondentes (por exemplo, uma ou mais células antes do tratamento, uma ou mais células não infectadas durante o tratamento, etc.) do sujeito.
Por exemplo, a administração do ácido nucleico, vírus, medicamento e / ou composição recombinante pode aumentar os níveis de colágeno (níveis de transcrito ou proteína) em uma ou mais células do sujeito em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou mais, em comparação com os níveis endógenos do(s) colágeno(s) em uma ou mais células não tratadas correspondentes do sujeito.
Em algumas modalidades, a administração do ácido nucleico, vírus, medicamento e / ou composição recombinante ao sujeito aumenta os níveis de colágeno (níveis de transcrito ou proteína) em uma ou mais células do sujeito em pelo menos cerca de 2 vezes, em comparação com os níveis endógenos do(s) colágeno(s) em uma ou mais células não tratadas correspondentes (por exemplo, uma ou mais células antes do tratamento, uma ou mais células não infectadas durante o tratamento, etc.) do sujeito.
Por exemplo, a administração do ácido nucleico, vírus, medicamento e / ou composição recombinante pode aumentar os níveis de colágeno (níveis de transcrito ou proteína) em uma ou mais células do sujeito em pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes , pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca
163 / 236 de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, em pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 750 vezes, pelo menos cerca de 1000 vezes ou mais, em comparação com os níveis endógenos do(s) colágeno(s) em uma ou mais células não tratadas correspondentes do sujeito. Os métodos de medição dos níveis de transcrito ou proteína de uma amostra são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, por qPCR, RNAseq, ELISA, western blot, espectrometria de massa, etc.
[00310] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar o tecido mole de um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são injetados em um tecido mole do sujeito. Em algumas modalidades, a pele do sujeito está envelhecendo. Em algumas modalidades, a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta (por exemplo, do sol, de uma cama de bronzeamento artificial, etc.). Em algumas modalidades, a pele do sujeito está enrugada.
[00311] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes podem ser usados em um método para reparar e / ou aumentar o tecido mole de um sujeito. Em algumas modalidades, "reparo de tecido" se refere à restauração da arquitetura e / ou função do tecido e abrange a regeneração e substituição do tecido. Em algumas modalidades, o reparo ou aumento do tecido mole refere-se a procedimentos que são usados para restaurar a aparência jovem da pele (por exemplo, em comparação com a pele "envelhecida", cuja aparência é devido a defeitos resultantes do envelhecimento cronológico ou outros danos físicos, químicos,
164 / 236 ou danos por UV). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são úteis em aplicações cosméticas de tecidos moles, tais como para preencher rugas, linhas, dobras, cicatrizes e para intensificar o tecido dérmico (por exemplo, lábios finos roliços, preenchimento em olhos fundos e / ou bochechas superficiais, etc.).
[00312] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para melhorar a qualidade, condição, e / ou aparência da pele em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições aqui descritos. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, a condição da pele é um ou mais danos causados pelo sol, envelhecimento, exposição aos raios UV, textura áspera, flacidez da pele e / ou rugas. A melhoria da qualidade, condição e / ou aparência da pele (por exemplo, em comparação com antes do tratamento) pode ser avaliada usando qualquer método apropriado ou escala conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, FACE Q, GAIS, etc. Em algumas modalidades, a pele do sujeito está envelhecendo. Em algumas modalidades, a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta (por exemplo, do sol, de uma cama de bronzeamento artificial, etc.). Em algumas modalidades, a pele do sujeito está enrugada.
[00313] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele de um sujeito em necessidade, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições descritas aqui. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, administração do ácido nucleico recombinante, vírus, medicamentos e / ou composição reduz o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito por pelo menos cerca de três meses, pelo menos cerca de seis meses, pelo menos cerca de nove meses ou pelo menos
165 / 236 cerca de 12 meses. Em algumas modalidades, o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito é reduzido após a administração da composição, em comparação com o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito antes da administração da composição. Em algumas modalidades, uma ou mais depressões superficiais na pele são uma ou mais linhas finas e rugas (por exemplo, rugas na testa, "pés de galinha", rugas nas bordas dos olhos ou boca, etc.). Em algumas modalidades, o tratamento de uma ou mais depressões superficiais da pele é medido por uma melhoria na textura da pele ou na qualidade da pele, como suavidade, hidratação e elasticidade, em comparação com a pele não tratada. Em algumas modalidades, o tratamento de uma ou mais depressões superficiais da pele é medido por uma redução na gravidade (por exemplo, profundidade) das depressões superficiais e / ou uma redução no número de linhas finas ou rugas em uma determinada área da pele. Em algumas modalidades, a pele do sujeito está envelhecendo. Em algumas modalidades, a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta (por exemplo, do sol, de uma cama de bronzeamento artificial, etc.). Em algumas modalidades, a pele do sujeito está enrugada.
[00314] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para aumentar e / ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade e / ou tensão da pele de um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, a pele do sujeito mantém pelo menos um de uma textura, suavidade, elasticidade ou tensão aumentada e / ou melhorada por pelo menos cerca de três meses, pelo menos cerca de seis meses, pelo menos cerca de nove meses, ou pelo menos cerca de 12 meses após a administração da composição. Em algumas modalidades, pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele do sujeito é aumentada e / ou melhorada após a administração da composição, em comparação com a textura,
166 / 236 suavidade, elasticidade ou tensão da pele do sujeito antes da administração da composição. Os métodos de medição da textura, suavidade, elasticidade e / ou tensões da pele são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, a pele do sujeito está envelhecendo. Em algumas modalidades, a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta (por exemplo, do sol, de uma cama de bronzeamento artificial, etc.). Em algumas modalidades, a pele do sujeito está enrugada.
[00315] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, a diminuição de um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento inclui qualquer um ou mais dos seguintes: tratamento, redução e / ou prevenção de linhas finas e / ou rugas; redução do tamanho dos poros da pele; melhora na espessura da pele, maciez e / ou tensão; melhora na maciez, elasticidade e / ou suavidade da pele; melhora no tom, brilho e / ou clareza da pele; melhora na produção de procolágeno e / ou colágeno; melhora na textura da pele e ou promoção de retexturização; melhora na aparência dos contornos da pele; restauração do brilho e / ou da claridade da pele; melhora da aparência da pele diminuída pelo envelhecimento e / ou menopausa; melhora na hidratação da pele; aumento da elasticidade e / ou resiliência da pele; tratamento, redução e / ou prevenção ou flacidez da pele; melhora na firmeza da pele; redução de manchas de pigmento, manchas na pele e / ou cicatrizes (como cicatrizes de acne); e / ou melhoria das propriedades ópticas da pele por difração de luz ou reflexão. Em algumas modalidades, um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento no sujeito são reduzidos após a administração da composição, em comparação com um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento no sujeito antes da administração da
167 / 236 composição. Qualquer método adequado para medir um ou mais sinais de envelhecimento dermatológico conhecido na técnica pode ser usado.
[00316] Em algumas modalidades, uma ou mais porções da pele do sujeito são raspadas ou tornadas mais permeáveis antes do tratamento com uma quantidade eficaz de qualquer um dos ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes aqui descritos. Qualquer método adequado de abrasão da pele ou aumento da permeabilidade da pele conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, o uso de um rolo dérmico, o uso repetido de tiras adesivas para remover camadas de células da pele (remoção de fita), raspagem com um bisturi ou lâmina, uso de lixa, uso de intensificadores de permeação química ou energia elétrica, uso de energia sônica ou ultrassônica, uso de energia de luz (por exemplo, laser), uso de agulhas de tamanho mícron ou lâminas com um comprimento adequado para perfurar, mas não completamente passar pela epiderme, etc.
[00317] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação são para aplicações cosméticas, como para reduzir ou eliminar uma ou mais depressões superficiais na pele, para reduzir ou eliminar uma ou mais rugas e / ou para prevenir a ocorrência ou recorrência de uma ou mais rugas. Em algumas modalidades, uma ou mais depressões superficiais na pele ou rugas são selecionadas de dobras nasolabiais, pés de galinha, linhas de expressão, linhas de preocupação, cicatrizes, linhas glabelares, ptose de sobrancelha, cavidades lacrimais, linhas nasojugal, linhas de coelho, ptose da bochecha / rosto médio, linhas de marionete, ondulações de papoula, linhas de sorriso, linhas de gargalhada, vincos do queixo, linhas do pescoço, faixas de platisma e quaisquer combinações dos mesmos.
[00318] Em algumas modalidades, uma "quantidade eficaz" é pelo menos a quantidade mínima necessária para afetar uma melhoria mensurável ou prevenção de um ou mais sinais ou sintomas de uma condição particular (por exemplo, uma condição cosmética, como o envelhecimento da pele). Uma
168 / 236 “quantidade eficaz” pode variar de acordo com fatores como idade, sexo e peso do paciente. Uma quantidade eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do tratamento são superados pelos efeitos benéficos. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins da presente divulgação, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico, vírus, medicamento e / ou composição recombinante é uma quantidade suficiente para realizar uma melhoria mensurável direta ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico, vírus, medicamento e / ou composição recombinante pode ou não ser alcançada em conjunto com outra droga, composto ou composição. Assim, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes, e um único agente pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for alcançado.
[00319] Em algumas modalidades, o ácido nucleico, vírus, medicamento e / ou composição recombinante é administrado uma vez ao sujeito. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e / ou composição é administrado pelo menos duas vezes (por exemplo, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, etc.) para o sujeito. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 15 dias (por exemplo, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 40 dias, pelo menos cerca de 50 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 100 dias, pelo menos cerca de 120 dias, etc.) passam entre as administrações (por exemplo, entre a primeira e a segunda administrações, entre a segunda e a terceira administrações , etc.).
[00320] Os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações aqui descritos podem ser administrados por
169 / 236 qualquer método adequado ou via conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, por administração oral, administração sublingual, administração bucal, administração tópica, administração retal, via inalação, administração transdérmica, injeção subcutânea, injeção intradérmica, injeção superficial, injeção intravenosa (IV), injeção intra-arterial, injeção intramuscular, injeção intracardíaca, injeção intraóssea, injeção intraperitoneal, administração transmucosa, administração vaginal, administração intrauretral, administração intravítrea, administração intraorbital, administração subrretiniana, administração intra-articular, administração peri-articular, administração local, administração epicutânea ou quaisquer combinações das mesmas. A presente divulgação, portanto, abrange métodos de distribuição de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações aqui descritas a um indivíduo.
[00321] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações são administrados por via cutânea, tópica, transdérmica, subcutânea ou intradérmica ao sujeito. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações são administrados por via intradérmica e / ou subcutânea. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações são administrados via injeção superficial. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações são administrados por via tópica e/ou transdérmica. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações são administrados uma, duas, três, quatro, cinco ou mais vezes por dia. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações são administrados a uma ou mais áreas afetadas (por exemplo, enrugadas) de um indivíduo. Em algumas modalidades, a composição é administrada a uma ou mais áreas não afetadas
170 / 236 do indivíduo.
[00322] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são administrados em uma profundidade superficial na pele. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são introduzidos na pele a uma profundidade de cerca de 2.000 mícrons ou menos. Por exemplo, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes podem ser administrados na pele a uma profundidade de cerca de 2.000 mícrons ou menos, a cerca de 1750 mícrons ou menos, a cerca de 1500 mícrons ou menos, a cerca de 1250 mícrons ou menos, a cerca de 1000 mícrons ou menos, a cerca de 900 mícrons ou menos, a cerca de 800 mícrons ou menos, a cerca de 700 mícrons ou menos, a cerca de 600 mícrons ou menos, ou a cerca de 500 mícrons ou menos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são introduzidos em uma profundidade de injeção entre cerca de 0,5 mm e 5,0 mm. Por exemplo, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições podem ser introduzidos a uma profundidade de injeção entre cerca de 0,5 mm e 5,0 mm, cerca de 0,5 mm e 4,5 mm, cerca de 0,5 mm e 4,0 mm, cerca de 0,5 mm e 3,5 mm, cerca de 0,5 mm e 3,0 mm, cerca de 0,5 mm e 2,5 mm, cerca de 0,5 mm e 2,0 mm, cerca de 0,5 mm e 1,5 mm, cerca de 0,5 mm e 1,0 mm, 1,0 mm e 5,0 mm, cerca de 1,0 mm e 4,5 mm , cerca de 1,0 mm e 4,0 mm, cerca de 1,0 mm e 3,5 mm, cerca de 1,0 mm e 3,0 mm, cerca de 1,0 mm e 2,5 mm, cerca de 1,0 mm e 2,0 mm, cerca de 1,0 mm e 1,5 mm, 1,5 mm e 5,0 mm, cerca de 1,5 mm e 4,5 mm, cerca de 1,5 mm e 4,0 mm, cerca de 1,5 mm e 3,5 mm, cerca de 1,5 mm e 3,0 mm, cerca de 1,5 mm e 2,5 mm, cerca de 1,5 mm e 2,0 mm, etc.
[00323] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados por injeções espaçadas por uma distância de cerca de 1 mm a cerca de 30 mm. Por
171 / 236 exemplo, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições podem ser administrados por injeções espaçadas por uma distância entre cerca de 1 mm e 30 mm, 2 mm e 30 mm, 5 mm e 30 mm, 10 mm e 30 mm, 15 mm e 30 mm, 1 mm e 20 mm, 2 mm e 20 mm, 5 mm e 20 mm, 10 mm e 20 mm, 15 mm e 20 mm, 1 mm e 15 mm, 2 mm e 15 mm , 5 mm e 15 mm, 10 mm e 15 mm, 1 mm e 10 mm, 2 mm e 10 mm, 5 mm e 10 mm, 1 mm e 5 mm, 2 mm e 5 mm, etc. Em algumas modalidades, as injeções são espaçadas por uma distância de pelo menos cerca de 1 mm, pelo menos cerca de 2 mm, pelo menos cerca de 5 mm, pelo menos cerca de 10 mm, pelo menos cerca de 15 mm, pelo menos cerca de 20 mm, em pelo menos cerca de 30 mm ou mais.
[00324] Numerosas áreas do corpo podem ser tratadas com os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições aqui descritas, incluindo, por exemplo, o rosto, testa, lábios, couro cabeludo, pescoço, braços, mãos, pernas, joelhos, pés, tórax, costas, virilha, nádegas, coxas, etc. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados na face. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais dobras nasolabiais. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são administrados em torno de um ou ambos os olhos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a um ou mais pés de galinha. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais linhas de expressão. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são administrados a uma ou mais cicatrizes (por exemplo, cicatrizes de acne). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são
172 / 236 administrados a uma ou mais linhas glabelares. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais ptose de sobrancelha. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais depressões profundas Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais linhas nasojugais. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais linhas de coelho. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais ptose da bochecha / face média. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais linhas de marionete. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições são administrados a um ou locais de ondulação de papoula. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a um ou mais vincos do queixo. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais linhas de pescoço. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e / ou composições recombinantes são administrados a uma ou mais bandas de platisma.
[00325] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante expressa a(s) proteína(s) cosmética (por exemplo, colágenos humanos) quando o ácido nucleico recombinante é distribuído a uma ou mais células alvo de um sujeito. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) intensifica, aumenta, amplia e / ou suplementa os níveis de colágeno humano em uma ou mais células alvo. Em algumas modalidades, a expressão da (s) proteína (s) cosmética (por exemplo,
173 / 236 colágenos humanos) aumenta, aumenta, aumenta e / ou suplementa os níveis de colágeno humano secretado por uma ou mais células alvo. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) intensifica, aumenta, amplia e / ou suplementa os níveis de colágeno humano na matriz extracelular. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) intensifica, aumenta, amplia e / ou complementa a estabilidade da matriz extracelular no sujeito. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) intensifica, amplia e / complementa o tecido mole do sujeito. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) melhora a qualidade da pele, condição e / ou aparência do indivíduo. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) reduz uma ou mais depressões superficiais (por exemplo, rugas) na pele do sujeito. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) melhora a textura, suavidade, elasticidade e / ou tensão da pele do sujeito. Em algumas modalidades, a expressão da(s) proteína(s) cosmética(s) (por exemplo, colágenos humanos) reduz um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento no sujeito. Células Hospedeiras
[00326] Certos aspectos da presente divulgação se referem a uma ou mais células hospedeiras compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Qualquer célula hospedeira adequada (procariótica ou eucariótica) conhecida na técnica pode ser usada, incluindo, por exemplo: células procarióticas incluindo eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo Enterobacteriaceae, tais como Escherichia (por exemplo, E. coli), Enterobacter, Erminia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (por exemplo, S. typhimurium), Serratia (por exemplo, S.
174 / 236 marcescans), e Shigella, bem como Bacilli, comoB. subtilis e B. licheniformis; células fúngicas (por exemplo, S. cerevisiae); células de inseto (por exemplo, células S2, etc.); e células de mamífero, incluindo a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão), células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10), células de Sertoli de camundongo (TM4), células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70), células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75), células de fígado humano (Hep G2, HB 8065), tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, células FS4, linha de hepatoma humano (Hep G2), células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR" e linhagens de células de mieloma, como NS0 e Sp2 / 0. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula primata humana ou não humana. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula Vero. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira complementar. Em algumas modalidades, a célula hospedeira (por exemplo, a célula Vero) expressa um ou mais genes do vírus herpes simplex (por exemplo, um gene ICP4). Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células de uma linhagem celular. Exemplos de células hospedeiras ou linhagens celulares adequadas podem incluir, mas não estão limitados a, 293, HeLa, SH-Sy5y, Hep G2, CACO-2, A549, L929, 3T3, K562, CHO-K1, MDCK, HUVEC, Vero, Células N20, COS-7, PSN1, VCaP, CHO e semelhantes.
[00327] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor viral de herpes simplex. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon do vírus herpes simplex. Em algumas
175 / 236 modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon de HSV-1 ou amplicon de HSV-1 híbrido. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreendendo um vírus auxiliar é colocada em contato com um amplicon HSV-1 ou amplicon híbrido HSV-1 aqui descrito, resultando na produção de um vírus compreendendo um ou mais ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o vírus é coletado do sobrenadante da célula hospedeira contatada. Métodos de geração de vírus por contato de células hospedeiras compreendendo um vírus auxiliar com um amplicon de HSV-1 ou amplicon de HSV-1 / híbrido são conhecidos na técnica.
[00328] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira complementar. Em algumas modalidades, a célula hospedeira complementar expressa um ou mais genes que são inativados em qualquer um dos vetores virais aqui descritos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira complementar é contatada com um genoma de vírus herpes recombinante (por exemplo, um genoma de vírus herpes simplex recombinante) aqui descrito. Em algumas modalidades, o contato de uma célula hospedeira complementar com um genoma do vírus herpes recombinante resulta na produção de um vírus herpes compreendendo um ou mais ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o vírus é coletado do sobrenadante da célula hospedeira contatada. Os métodos de geração de vírus por contato de células hospedeiras complementares com um vírus herpes simplex recombinante são geralmente descritos em WO2015 / 009952 e / ou WO2017 / 176336. Artigos de fabricação ou Kits
[00329] Certos aspectos da presente divulgação se referem a um artigo de fabricação ou um kit compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações (por exemplo, composições ou formulações farmacêuticas) aqui descritos. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende uma bula
176 / 236 compreendendo instruções para administrar o ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e / ou composição ou formulação (por exemplo, para tratar uma deficiência de proteína de matriz extracelular dérmica (por exemplo, colágeno) e / ou para corrigir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento).
[00330] Recipientes adequados para os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e / ou composições ou formulações podem incluir, por exemplo, garrafas, frascos, sacos, tubos e seringas. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais, como vidro, plástico (como policloreto de vinil ou poliolefina) ou liga de metal (como aço inoxidável ou hastelloy). Em algumas modalidades, o recipiente compreende um rótulo no recipiente ou associado ao recipiente, em que o rótulo indica as instruções de uso. PodO artigo de fabricação ou kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, bulas e semelhantes. Modalidades enumeradas
[00331] Modalidade 1: uma composição que compreende: (a) um vírus herpes simplex (HSV) que compreende um ácido nucleico recombinante, em que o ácido nucleico recombinante compreende um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína de colágeno humana e (b) um excipiente.
[00332] Modalidade 2: a composição das modalidades 1, em que o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do primeiro polinucleotídeo.
[00333] Modalidade 3: a composição da modalidade 1 ou 2, em que o HSV é defeituoso para replicação.
[00334] Modalidade 4: a composição da modalidade 1 ou 2, em que o HSV é competente para replicação.
[00335] Modalidade 5: a composição de qualquer uma das modalidades
177 / 236 1-4, em que o HSV é um vírus herpes simplex tipo 1, um vírus herpes simplex tipo 2 ou quaisquer derivados dos mesmos.
[00336] Modalidade 6: a composição de qualquer uma das modalidades 1-5, em que o ácido nucleico recombinante é um amplicon do vírus herpes simplex.
[00337] Modalidade 7: a composição da modalidade 6, em que o amplicon do vírus herpes simplex é um amplicon HSV-1 ou um amplicon híbrido HSV-1.
[00338] Modalidade 8: a composição da modalidade 7, em que o amplicon híbrido HSV-1 é um amplicon híbrido HSV / AAV, um amplicon híbrido HSV / EBV e amplicon híbrido HSV / EBV / RV ou um amplicon híbrido HSV /Sleeping Beauty .
[00339] Modalidade 9: a composição de qualquer uma das modalidades 1-5, em que o ácido nucleico recombinante é um genoma de vírus herpes simplex recombinante.
[00340] Modalidade 10: a composição da modalidade 9, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma de HSV-1 recombinante, um genoma de HSV-2 recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos.
[00341] Modalidade 11: a composição da modalidade 9 ou 10, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em um gene do vírus herpes simplex.
[00342] Modalidade 12: a composição da modalidade 11, em que o gene do vírus herpes simplex é selecionado do grupo que consiste em Proteína Celular Infectada (ICP) 0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), Região Única Longa (UL) 41 e UL55.
[00343] Modalidade 13: a composição da modalidade 12, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP4.
178 / 236
[00344] Modalidade 14: a composição da modalidade 12 ou 13, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22.
[00345] Modalidade 15: a composição de qualquer uma das modalidades 12-14, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41.
[00346] Modalidade 16: a composição de qualquer uma das modalidades 12-15, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0.
[00347] Modalidade 17: a composição de qualquer uma das modalidades 12-16, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27.
[00348] Modalidade 18: a composição de qualquer uma das modalidades 11-17, em que a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do(s) gene(s).
[00349] Modalidade 19: a composição de qualquer uma das modalidades 9-18, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral.
[00350] Modalidade 20: A composição de qualquer uma das modalidades 9-19, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4.
[00351] Modalidade 21: a composição de qualquer uma das modalidades 9-20, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral ICP22.
[00352] Modalidade 22: a composição de qualquer uma das modalidades 9-21, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral UL41.
179 / 236
[00353] Modalidade 23: a composição de qualquer uma das modalidades 1-22, em que o HSV tem citotoxicidade reduzida em comparação com um vírus herpes simplex de tipo selvagem.
[00354] Modalidade 24: a composição de qualquer uma das modalidades 1-23, em que a primeira proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em polipeptídeo de cadeia alfa-1(I) de colágeno (COL1-1), polipeptídeo de cadeia alfa-2(I) de colágeno (COL1-2 ), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(II) de colágeno (COL2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(III) de colágeno (COL3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IV) de colágeno (COL4-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(IV) de colágeno (COL4- 2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IV) de colágeno (COL4-3), polipeptídeo de cadeia alfa-4(IV) de colágeno (COL4-4), um polipeptídeo de cadeia alfa- 5(IV) de colágeno (COL4-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(IV) de colágeno (COL4-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(V) de colágeno (COL5-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (V) de colágeno (COL5-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(V) de colágeno (COL5-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VI) de colágeno (COL6-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(VI) de colágeno (COL6-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(VI) de colágeno (COL6-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-4(VI) de colágeno (COL6-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(VI) de colágeno (COL6-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(VI) de colágeno (COL6-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VII) de colágeno (COL7) um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VIII) de colágeno (COL8), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IX) de colágeno (COL9-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (IX) de colágeno (COL9-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IX) de colágeno (COL9-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(X) de colágeno (COL10), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XI) de colágeno (COL11-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(XI) de colágeno (COL11-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XII) de colágeno (COL12), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XIII) de colágeno (COL13), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIV) de
180 / 236 colágeno (COL14), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XV) de colágeno (COL15), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVI) de colágeno (COL16), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVII) de colágeno (COL17), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVIII) de colágeno (COL18), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XIX) de colágeno (COL19), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XX) de colágeno (COL20), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXI) de colágeno (COL21), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXII) de colágeno (COL22), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIII) de colágeno (COL23), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIV) de colágeno (COL24), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XXV) de colágeno (COL25), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXVI) de colágeno (COL26), um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVII) de colágeno (COL27) e um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVIII) de colágeno (COL28).
[00355] Modalidade 25: a composição de qualquer uma das modalidades 1-24, em que a primeira proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
[00356] Modalidade 26: a composição de qualquer uma das modalidades 1-25, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a primeira proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00357] Modalidade 27: a composição de qualquer uma das modalidades 1-26, em que a primeira proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de
181 / 236 aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15- 21.
[00358] Modalidade 28: a composição de qualquer uma das modalidades 1-27, em que a primeira proteína de colágeno humana não é COL7.
[00359] Modalidade 29: a composição de qualquer uma das modalidades 1-28, em que o primeiro polipeptídeo compreende: (a) a primeira proteína de colágeno humana; (b) uma outra proteína de colágeno humana; e (c) um polipeptídeo ligante que liga (a) a (b).
[00360] Modalidade 30: a composição da modalidade 29, em que o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável.
[00361] Modalidade 31: a composição da modalidade 29 ou 30, em que a primeira proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% , pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 28-31.
[00362] Modalidade 32: a composição de qualquer uma das modalidades 29-31, em que a outra proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9- 2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28.
[00363] Modalidade 33: a composição de qualquer uma das modalidades 29-32, em que a outra proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
182 / 236
[00364] Modalidade 34: a composição de qualquer uma das modalidades 29-33, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a outra proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00365] Modalidade 35: a composição de qualquer uma das modalidades 29-34, em que a outra proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15- 21.
[00366] Modalidade 36: a composição de qualquer uma das modalidades 29-35, em que a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[00367] Modalidade 37: a composição de qualquer uma das modalidades 1-36, em que o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico que compreende: (a) uma primeira estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo; (b) uma segunda ORF que codifica uma proteína de colágeno humana adicional; e (c) um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) separando (a) e (b).
[00368] Modalidade 38: a composição da modalidade 37, em que a sequência de ácido nucleico que codifica IRES tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID
183 / 236 NO: 23.
[00369] Modalidade 39: a composição da modalidade 37 ou 38, em que a proteína de colágeno humana adicional é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28.
[00370] Modalidade 40: a composição de qualquer uma das modalidades 37-39, em que a proteína de colágeno humana adicional é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
[00371] Modalidade 41: a composição de qualquer uma das modalidades 37-40, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de colágeno humana adicional tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00372] Modalidade 42: a composição de qualquer uma das modalidades 37-41, em que a proteína de colágeno humana adicional compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15- 21.
[00373] Modalidade 43: a composição de qualquer uma das modalidades 37-42, em que a primeira proteína de colágeno humana e a
184 / 236 proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[00374] Modalidade 44: a composição de qualquer uma das modalidades 1-43, em que o ácido nucleico recombinante compreende ainda um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana.
[00375] Modalidade 45: a composição da modalidade 44, em que o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do segundo polinucleotídeo.
[00376] Modalidade 46, a composição da modalidade 44 ou 45, em que a segunda proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28.
[00377] Modalidade 47: a composição de qualquer uma das modalidades 44-46, em que a segunda proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
[00378] Modalidade 48: a composição de qualquer uma das modalidades 44-48, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a segunda proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00379] Modalidade 49: a composição de qualquer uma das modalidades 44-48, em que a segunda proteína de colágeno humana
185 / 236 compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15- 21.
[00380] Modalidade 50: a composição de qualquer uma das modalidades 44-49, em que a primeira e a segunda proteínas de colágeno humanas são diferentes.
[00381] Modalidade 51: a composição de qualquer uma das modalidades 44-50, em que o ácido nucleico recombinante é um genoma do vírus herpes simplex recombinante e em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral.
[00382] Modalidade 52: a composição da modalidade 51, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo em uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4.
[00383] Modalidade 53: a composição da modalidade 51 ou 52, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22.
[00384] Modalidade 54: a composição de qualquer uma das modalidades 51-53, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral UL41.
[00385] Modalidade 55: a composição de qualquer uma das modalidades 51-54, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22.
[00386] Modalidade 56: a composição de qualquer uma das modalidades 51-54, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante
186 / 236 compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene UL41 viral.
[00387] Modalidade 57: a composição de qualquer uma das modalidades 1-56, em que o excipiente é adaptado para administração cutânea (sistêmica ou tópica), transdérmica, subcutânea e / ou intradérmica.
[00388] Modalidade 58: a composição de qualquer uma das modalidades 1-57, em que o excipiente compreende um gel de hidroxipropil metilcelulose.
[00389] Modalidade 59: a composição de qualquer uma das modalidades 1-58, em que o excipiente é adaptado para administração intradérmica.
[00390] Modalidade 60: a composição de qualquer uma das modalidades 1-59, em que o excipiente compreende um tampão de fosfato.
[00391] Modalidade 61: a composição de qualquer uma das modalidades 1-60, em que o excipiente compreende glicerol.
[00392] Modalidade 62: a composição de qualquer uma das modalidades 1-61, em que o excipiente compreende um transportador lipídico.
[00393] Modalidade 63: a composição de qualquer uma das modalidades 1-62, em que o excipiente compreende um transportador de nanopartículas.
[00394] Modalidade 64: a composição de qualquer uma das modalidades 1-63, em que a composição é uma composição cosmética.
[00395] Modalidade 65: a composição da modalidade 64, em que a composição cosmética é um produto para o cuidado da pele.
[00396] Modalidade 66: um kit que compreende: (a) a composição de qualquer uma das modalidades 1-65; e (b) instruções para administrar a composição.
[00397] Modalidade 67: um método para intensificar, aumentar,
187 / 236 aumentar e / ou ampliar os níveis de uma ou mais proteínas de colágeno humanas em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das modalidades 1-65.
[00398] Modalidade 68: um método para intensificar, aumentar, ampliar e / ou suplementar o tecido mole de um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das modalidades 1-65.
[00399] Modalidade 69: o método da modalidade 68, em que a composição é injetada em um tecido mole do sujeito.
[00400] Modalidade 70: um método para melhorar a qualidade, condição e / ou aparência da pele em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das modalidades 1-65.
[00401] Modalidade 71: o método da modalidade 70, em que a condição é selecionada do grupo que consiste em danos causados pelo sol, envelhecimento, exposição aos raios ultravioleta, textura áspera, flacidez da pele, rugas e quaisquer combinações dos mesmos.
[00402] Modalidade 72: um método para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das modalidades 1-65.
[00403] Modalidade 73: o método da modalidade 72, em que a administração da composição reduz o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito por pelo menos cerca de três meses, pelo menos cerca de seis meses, pelo menos cerca de nove meses ou pelo menos cerca de 12 meses.
[00404] Modalidade 74: o método da modalidade 72 ou 73, em que o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito é reduzido após a administração da composição, em comparação com o
188 / 236 aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele do sujeito antes da administração da composição.
[00405] Modalidade 75: um método para aumentar e / ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição de qualquer um de modalidades 1-65.
[00406] Modalidade 76: o método da modalidade 75, em que o aparecimento de um ou mais a pele do sujeito mantém pelo menos um de uma textura, suavidade, elasticidade ou tensão aumentada e / ou melhorada por pelo menos cerca de três meses, pelo menos cerca de seis meses, pelo menos cerca de nove meses, ou pelo menos cerca de 12 meses após a administração da composição.
[00407] Modalidade 77: o método da modalidade 75 ou 76, em que pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele do sujeito é aumentada e / ou melhorada após a administração da composição, em comparação com a textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele do sujeito antes da administração da composição.
[00408] Modalidade 78: o método de qualquer uma das modalidades 70- 77, em que a pele do sujeito é uma pele envelhecida.
[00409] Modalidade 79: o método de qualquer uma das modalidades 70- 78, em que a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta.
[00410] Modalidade 80: o método de qualquer uma das modalidades 70- 79, em que a pele do sujeito está enrugada.
[00411] Modalidade 81: um método para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das modalidades 1-65.
[00412] Modalidade 82: o método da modalidade 81, em que a diminuição de um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento é
189 / 236 selecionada do grupo que consiste em: (a) tratamento, redução e / ou prevenção de linhas finas e / ou rugas; (b) redução do tamanho dos poros da pele; (c) melhora na espessura da pele, maciez e / ou esticamento; (d) melhora na maciez, elasticidade e / ou maciez da pele; (e) melhora no tom, brilho e / ou clareza da pele; (f) melhora na produção de procolágeno e / ou colágeno; (g) melhora da textura da pele e / ou promoção da retexturização; (h) melhora na aparência dos contornos da pele; (i) restauração do brilho e / ou da claridade da pele; (j) melhora da aparência da pele diminuída pelo envelhecimento e / ou menopausa; (k) melhora na hidratação da pele; (l) aumento da elasticidade e / ou resiliência da pele; (m) tratamento, redução e / ou prevenção ou flacidez da pele; (n) melhora da firmeza da pele; (o) redução de manchas pigmentares, manchas na pele e/ou cicatrizes de acne); (p) melhoria das propriedades ópticas da pele por difração de luz ou reflexão; e (q) quaisquer combinações dos mesmos.
[00413] Modalidade 83: o método da modalidade 81 ou 82, em que um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento no sujeito são diminuídos após a administração da composição, em comparação com um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento no sujeito antes da administração do composição.
[00414] Modalidade 84: o método de qualquer uma das modalidades 67- 83, em que o sujeito é um humano.
[00415] Modalidade 85: o método de qualquer uma das modalidades 67- 84, em que a composição é administrada por via cutânea (sistemicamente ou topicamente), transdermicamente, subcutaneamente ou intradermicamente ao sujeito.
[00416] Modalidade 86: o método de qualquer uma das modalidades 67- 85, em que a composição é administrada por injeção superficial.
[00417] Modalidade 87: O método de qualquer uma das modalidades 67-85, em que a composição é administrada por via intradérmica ao sujeito.
190 / 236
[00418] Modalidade 88: o método de qualquer uma das modalidades 67- 87, em que a composição é administrada uma vez ao sujeito.
[00419] Modalidade 89: o método de qualquer uma das modalidades 67- 87, em que a composição é administrada pelo menos duas vezes ao sujeito.
[00420] Modalidade 90: o método da modalidade 89, em que pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 90 ou pelo menos cerca de 120 dias se passam entre as administrações.
[00421] Modalidade 91: o método de qualquer uma das modalidades 67- 90, em que a composição é administrada a uma ou mais áreas afetadas e / ou não afetadas do sujeito.
[00422] Modalidade 92: o método de qualquer uma das modalidades 67- 91, em que a pele do sujeito é raspada antes da administração.
[00423] Modalidade 93: um ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína de colágeno humana, em que o ácido nucleico recombinante é um genoma de vírus herpes simplex recombinante.
[00424] Modalidade 94: o ácido nucleico recombinante da modalidade 93, em que o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do primeiro polinucleotídeo.
[00425] Modalidade 95: o ácido nucleico recombinante da modalidade 93 ou 94, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma de HSV-1 recombinante, um genoma de HSV-2 recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos.
[00426] Modalidade 96: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-95, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em um gene do vírus herpes simplex.
[00427] Modalidade 97: o ácido nucleico recombinante da modalidade
191 / 236 96, em que o gene do vírus herpes simplex é selecionado do grupo que consiste em ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, tk, UL41 e UL55.
[00428] Modalidade 98: o ácido nucleico recombinante da modalidade 97, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP4.
[00429] Modalidade 99: o ácido nucleico recombinante da modalidade 97 ou 98, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22.
[00430] Modalidade 100: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 97-99, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41.
[00431] Modalidade 101: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 97-100, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0.
[00432] Modalidade 102: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 97-101, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27.
[00433] Modalidade 103: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 96-102, em que a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do(s) gene(s).
[00434] Modalidade 104: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-103, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral.
[00435] Modalidade 105: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-104, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4.
[00436] Modalidade 106: o ácido nucleico recombinante de qualquer
192 / 236 uma das modalidades 93-105, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral ICP22.
[00437] Modalidade 107: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma de 93-106, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro do locus de gene viral UL41.
[00438] Modalidade 108: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-107, em que a primeira proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28.
[00439] Modalidade 109: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-108, em que a primeira proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
[00440] Modalidade 110: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-109, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a primeira proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00441] Modalidade 111: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-110, em que a primeira proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo
193 / 236 menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15- 21.
[00442] Modalidade 112: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-111, em que a primeira proteína de colágeno humana não é COL7.
[00443] Modalidade 113: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-112, em que o primeiro polipeptídeo compreende: (a) a primeira proteína de colágeno humana; (b) uma outra proteína de colágeno humana; e (c) um polipeptídeo ligante que liga (a) a (b).
[00444] Modalidade 114: O ácido nucleico recombinante da modalidade 113, em que o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável.
[00445] Modalidade 115: o ácido nucleico recombinante da modalidade 113 ou 114, em que o polipeptídeo ligante compreende uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 28-31.
[00446] Modalidade 116: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 113-115, em que a outra proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4- 1, COL4-2, COL4 -3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5- 3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6 , COL7, COL8, COL9-1, COL9-2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23 , COL24, COL25, COL26, COL27 e COL28.
[00447] Modalidade 117: o ácido nucleico recombinante de qualquer
194 / 236 uma das modalidades 113-116, em que a outra proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
[00448] Modalidade 118: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 113-117, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a outra proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00449] Modalidade 119: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 113-118, em que a outra proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15- 21.
[00450] Modalidade 120: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 113-119, em que a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[00451] Modalidade 121: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-120, em que o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico que compreende: (a) uma primeira estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo; (b) uma segunda ORF que codifica uma proteína de colágeno humana adicional; e (c) um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) separando (a) e (b).
[00452] Modalidade 122: o ácido nucleico recombinante da modalidade 121, em que a sequência de ácido nucleico que codifica IRES tem pelo menos
195 / 236 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23.
[00453] Modalidade 123: o ácido nucleico recombinante da modalidade 121 ou 122, em que a proteína de colágeno humana adicional é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9- 2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28.
[00454] Modalidade 124: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 121-123, em que a proteína de colágeno humana adicional é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
[00455] Modalidade 125: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 121-124, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de colágeno humana adicional tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00456] Modalidade 126: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 121-125, em que a proteína de colágeno humana adicional compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo
196 / 236 menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15-21.
[00457] Modalidade 127: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 121-126, em que a primeira proteína de colágeno humana e a proteína de colágeno humana adicional são diferentes.
[00458] Modalidade 128: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-127, em que o ácido nucleico recombinante compreende ainda um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína de colágeno humana.
[00459] Modalidade 129: o ácido nucleico recombinante da modalidade 128, em que o ácido nucleico recombinante compreende duas ou mais cópias do segundo polinucleotídeo.
[00460] Modalidade 130: o ácido nucleico recombinante da modalidade 128 ou 129, em que a segunda proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL4-3, COL4-4, COL4-5, COL4-6, COL5-1, COL5-2, COL5-3, COL6-1, COL6-2, COL6-3, COL6-4, COL6-5, COL6-6, COL7, COL8, COL9-1, COL9- 2, COL9-3, COL10, COL11-1, COL11-2, COL12, COL13, COL14, COL15, COL16, COL17, COL18, COL19, COL20, COL21, COL22, COL23, COL24, COL25, COL26, COL27, e COL28.
[00461] Modalidade 131: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 128-130, em que a segunda proteína de colágeno humana é selecionada do grupo que consiste em COL1-1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL6-1, COL7 e COL17.
[00462] Modalidade 132: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 128-131, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a segunda proteína de colágeno humana tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos
197 / 236 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-14.
[00463] Modalidade 133: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 128-132, em que a segunda proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15-21.
[00464] Modalidade 134: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 128-133, em que a primeira e a segunda proteínas de colágeno humanas são diferentes.
[00465] Modalidade 135: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 128-134, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro de um locus de gene viral.
[00466] Modalidade 136: o ácido nucleico recombinante da modalidade 135, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo em uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4.
[00467] Modalidade 137: o ácido nucleico recombinante da modalidade 135 ou 136, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22.
[00468] Modalidade 138: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 135-137, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o segundo polinucleotídeo dentro do locus de gene viral UL41.
198 / 236
[00469] Modalidade 139: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 135-138, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene viral ICP22.
[00470] Modalidade 140: o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 135-138, em que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de uma ou ambas as cópias dos loci do gene viral ICP4 e o segundo polinucleotídeo dentro do locus do gene UL41 viral.
[00471] Modalidade 141: uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-140.
[00472] Modalidade 142: a célula hospedeira da modalidade 141, em que a célula hospedeira é uma célula eucariótica.
[00473] Modalidade 143: a célula da hospedeira da modalidade 141 ou 142, em que a célula hospedeira é uma célula de mamífero.
[00474] Modalidade 144: a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades 141-143, em que a célula hospedeira é uma célula humana ou uma célula de primata não humana.
[00475] Modalidade 145: a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades 141-144, em que a célula hospedeira é uma célula Vero.
[00476] Modalidade 146: a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades 141-145, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira complementar.
[00477] Modalidade 147: um método para coletar um vírus herpes simplex, o método compreendendo: (a) contatar uma célula hospedeira complementar com o ácido nucleico recombinante de qualquer uma das modalidades 93-140; e (b) coletar o vírus herpes simplex gerado pela célula hospedeira complementar.
199 / 236
[00478] Modalidade 148: um método de coleta de um vírus herpes simplex, o método compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades 141-146; e (b) coletar o vírus herpes simplex gerado pela célula hospedeira.
[00479] A especificação é considerada como sendo suficiente para permitir que um especialista na técnica pratique a presente invenção. Várias modificações da presente divulgação além daquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e cairão no escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLOS
[00480] A invenção será mais completamente compreendida pela referências aos seguintes exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitativos do escopo da invenção. Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1: vetores de vírus herpes simplex modificados que codificam proteína(s) de colágeno humana(s)
[00481] Para fazer vetores do genoma do vírus herpes simplex modificados capazes de expressar proteína(s) de colágeno humano em uma célula de mamífero alvo (como um queratinócito ou fibroblasto humano), um genoma do vírus herpes simplex (FIG. 1A) é primeiro modificado para inativar um ou mais genes do vírus herpes simplex. Essas modificações podem diminuir a toxicidade do genoma em células de mamíferos. Em seguida, variantes desses construtos virais recombinantes modificadas / atenuadas são geradas de modo que transportem um ou mais polinucleotídeos que codificam proteína(s) de colágeno humana(s). Estas variantes incluem: 1) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de
200 / 236 expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada locus ICP4 (FIG. 1B); 2) agenoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada locus ICP4 (FIG. 1C); 3) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um primeiro promotor heterólogo e a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana sob o controle de um segundo promotor heterólogo na mesma fita de DNA integrada em cada locus ICP4 (FIG. 1D); 4) um genoma de HSV- 1 modificado com ΔICP4 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um primeiro promotor heterólogo e a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana sob o controle de um segundo promotor heterólogo no mesma fita de DNA integrada em cada locus ICP4 (FIG. 1E); 5) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um primeiro promotor heterólogo e a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana sob o controle de um segundo promotor heterólogo em fitas opostas de DNA integradas em cada locus ICP4 (FIG. 1F); 6) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um primeiro promotor heterólogo e a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana sob o controle de um segundo promotor heterólogo em fitas opostas de DNA integradas em cada locus ICP4 (FIG. 1G); 7) um genoma de
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HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de expressão que codificam um mRNA policistrônico sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4, onde o mRNA policistrônico contém a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana e a codificação sequência de uma segunda proteína de colágeno humana separada por um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) (FIG. 1H); 8) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 recombinante compreendendo cassetes de expressão que codificam um mRNA policistrônico sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4, onde o mRNA policistrônico contém a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana e a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana separada por um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) (FIG. 1I); 9) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma proteína quimérica sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4, onde a proteína quimérica contém a sequência de aminoácidos de uma primeira proteína de colágeno humana e a sequência de aminoácidos de uma segunda proteína de colágeno humana separada pela sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ligante (FIG. 1J); 10) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma proteína quimérica sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4, onde a proteína quimérica contém a sequência de aminoácidos de uma primeira proteína de colágeno humana e a sequência de aminoácidos de uma segunda proteína de colágeno humana separada pela sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ligante (FIG. 1K); 11) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de
202 / 236 um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4 e um cassete de expressão contendo a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana sob o controle de um promotor heterólogo integrado no locus ICP22 (FIG. 1L); 12) um genoma de HSV-1 modificado ΔICP4 / ΔICP22 / ΔUL41 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4 e um cassete de expressão contendo a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana sob o controle de um promotor heterólogo integrado no locus UL41 (FIG. 1M); e 13) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔUL41 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de uma primeira proteína de colágeno humana sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada um dos loci ICP4 e um cassete de expressão contendo a sequência de codificação de uma segunda proteína de colágeno humana sob o controle de um promotor heterólogo integrado no locus UL41 (FIG. 1N).
[00482] Esses vetores de genoma de vírus herpes simplex modificados são transfectados em células Vero engenheiradas que são modificadas para expressar um ou mais genes de vírus herpes. Estas células Vero engenheiradas secretam vírus herpes simplex com defeito de replicação com os genomas modificados empacotados no sobrenadante. O sobrenadante é então recolhido, concentrado e esterilizado por filtração através de um filtro de 5 µm. Exemplo 2: construção e análise in vitro de candidatos a HSV que codificam COL7 humano
[00483] A proteína da cadeia alfa-1(VII) de colágeno (COL7) funciona para fortalecer e estabilizar a pele. Resumidamente, os transcritos COL7A1 são traduzidos, os peptídeos COL7 resultantes são modificados pós-tradução por hidroxilação e glicosilação e os tri-peptídeos COL7 glicosilados formam uma hélice tripla conhecida como pró-colágeno, que é secretada pela célula. O pró-
203 / 236 colágeno se associa a estruturas de ordem superior na secreção, formando fibrilas de ancoragem, que ficam então disponíveis para ajudar a organizar, estabilizar e auxiliar na aderência da membrana basal epitelial. A membrana basal epitelial é responsável por ancorar o epitélio ao tecido conjuntivo frouxo subjacente e é essencial para a estabilidade dermoepidérmica (integridade da junção dermoepidérmica). A epidermólise bolhosa distrófica é uma condição genética hereditária causada por mutações no gene COL7A1 ; mutações nesse gene prejudicam a capacidade de COL7 de conectar adequadamente a epiderme à derme em pacientes com epidermólise bolhosa distrófica, resultando em pele frágil. Epidermólise bolhosa distrófica recessiva (RDEB), a forma mais grave de epidermólise bolhosa, é mais frequentemente caracterizada por extensas bolhas e cicatrizes na pele e nas membranas mucosas.
[00484] O exemplo a seguir descreve a construção de um vírus herpes simplex tipo 1 recombinante modificado para expressar o polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno humano (COL7) e fornece ainda experiências que mostram que o HSV recombinante era capaz de expressar colágeno humano funcional in vitro em queratinócitos humanos primários e fibroblastos de pacientes saudáveis e RDEB. Materiais e Métodos Construção de vírus
[00485] O vetor viral "KCA211" (FIG. 2A) foi gerado da seguinte forma: um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem foi modificado pela primeira vez pela exclusão da sequência de codificação de ambas as cópias do gene ICP4 viral (ΔICP4). O genoma viral modificado com ΔICP4 também foi engenheirado para conter um cassete de expressão de mCherry em cada um dos loci ICP4. O genoma viral foi então modificado para codificar COL7 humano de tipo selvagem. Resumidamente, um plasmídeo contendo a sequência de codificação para COL7 de tipo selvagem (sob o controle do promotor hCMV) flanqueado pelas regiões a montante (US) e a jusante (DS)
204 / 236 de ICP4 foi transfectado em células Vero modificadas para expressar o gene ICP4 do vírus herpes. Essas células transfectadas foram então infectadas com o vírus que expressa ΔICP4 mCherry modificado descrito acima. As regiões US e DS ICP4 que flanqueiam COL7 permitiram um duplo cruzamento e substituição de cada um dos loci mCherry. A triagem visual para a ausência de fluorescência mCherry foi então usada para identificar células contendo vírus recombinados.
[00486] O vetor viral "SAR-COL7" (FIG. 2B) foi gerado da seguinte forma: um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem foi modificado pela primeira vez pela exclusão da sequência de codificação de ambas as cópias do gene ICP4 viral, bem como do gene ICP22 de cópia única (ΔICP4 / ΔICP22). O genoma viral modificado com ΔICP4/ΔICP22 também foi engenheirado para conter um cassete de expressão de mCherry em cada um dos loci ICP4. O genoma viral foi então modificado para codificar COL7 humano de tipo selvagem. Resumidamente, um plasmídeo contendo a sequência de codificação para COL7 de tipo selvagem (sob o controle do promotor hCMV) flanqueado pelas regiões a montante (US) e a jusante (DS) de ICP4 foi transfectado em células Vero modificadas para expressar o gene ICP4 do vírus herpes. Essas células transfectadas foram então infectadas com o vírus que expressa ΔICP4/ΔICP22 mCherry modificado descrito acima. As regiões US e DS ICP4 que flanqueiam COL7 permitiram um duplo cruzamento e substituição de cada um dos loci mCherry. A triagem visual para a ausência de fluorescência mCherry foi então usada para identificar células contendo vírus recombinados. Cultura celular
[00487] As células foram previamente isoladas de biópsias de pele feitas como parte de procedimentos cirúrgicos ou diagnósticos de rotina. O consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente ou, no caso de crianças, dos pais ou responsável legal. Este estudo foi realizado de acordo com
205 / 236 a declaração de Helsinque. Todas as células foram cultivadas a 37ºC em 5% de CO2. Fibroblastos humanos foram cultivados em meio essencial modificado de Dulbecco suplementado com soro fetal bovino a 10% (soro PEAK®, cat. no. PS-FB1). RDEB e queratinócitos normais foram cultivados em meio DMEM / Ham's F12 (3:1) suplementado com FBS a 10%, fator de crescimento epidérmico 10ng / mL, toxina da cólera 10-10, hidrocortisona 0,4µg / mL, transferrina 5µg / mL, insulina 5µg / mL e liotironina 5 µg / mL. Todos os meios continham ácido ascórbico (150 µM). Os queratinócitos foram cultivados na presença de uma camada de alimentação mitoticamente ativada de células 3T3 e na presença de 10 µM do inibidor de Rho-cinase Y-27632. Infecções de vírus
[00488] As alíquotas virais foram armazenadas a -80ºC e deixadas para descongelar sob a capela de fluxo laminar de cultura de tecidos antes do uso. O número de células alvo foi determinado antes da infecção após a separação das células do plástico de cultura de tecidos e contagem em um hemocitômetro. A multiplicidade de infecção (MOI) foi calculada a partir do título do vírus e do número de células alvo, e o volume apropriado de estoque de vírus foi diluído em soro 10% contendo DMEM e incubado com as células alvo por 2 horas a 37ºC. O vírus foi então removido e meio fresco foi fornecido às células-alvo após lavagem duas vezes com meio pré-aquecido. Western Blots
[00489] Os queratinócitos foram semeados em um prato de 100 mm a 8x105 para atingir 70-80% de confluência no dia seguinte. 48 horas após a infecção, as células foram lisadas com tampão de ensaio de radioimunoprecipitação. O lisado foi colocado em uma centrífuga por 5 minutos a 4ºC, e o sobrenadante foi misturado com um tampão de carga Laemmli 6x. Antes de carregar em SDS-PAGE, as amostras foram fervidas por 5 minutos a 95ºC. Para a detecção de COL7, 5-30 µg de proteína foram carregados em um gel de acrilamida a 6%. O anticorpo primário usado para a
206 / 236 detecção de COL7 foi um anticorpo de coelho (Sigma, cat. no. HPA042420). As proteínas resolvidas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, bloqueadas em PBS-Tween 0,1% com 5% de leite ou 5% de BSA de acordo com os requisitos do anticorpo primário e incubadas durante a noite com o anticorpo primário. Após a incubação com anticorpo secundário conjugado com IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology), a membrana foi incubada com substrato de Western blotting (ThermoFisher Scientific, cat. no. 32106) e exposta ao filme (ThermoFisher Scientific, cat. no. 34090). qRT-PCR
[00490] O RNA foi isolado usando RNeasy® Mini Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. As extrações de RNA foram quantificadas usando um espectrofotômetro NanoDropTM (Fisher Scientific), e 1,5 µg de RNA foi usado para a síntese de cDNA usando um sistema SuperScript III First-Strand Synthesis (Invitrogen). Para qPCR, foi utilizado o mix SYBR Select Master (Life Technologies) e as amostras de cDNA foram diluídas 1:25 para servir de modelo. Todos os experimentos foram realizados pelo menos em triplicado. Ensaio de bloqueio de aderência
[00491] As placas de 96 poços foram deixadas sem revestimento ou revestidas com 10, 20 ou 50 µg / mL de colágeno de cauda de rato 1 (BD Biosciences) ou fibronectina humana (Millipore) em 100 µL de volume de reação a 4ºC durante a noite, depois lavadas com PBS e bloqueadas com PBS + BSA 0,1% por 1 hora a 37ºC. Queratinócitos RDEB infectados com Simulação (controle) ou SAR-COL7 (2,4x104 células em 100µL de DMEM / HamF12 + 0,1% BSA) foram adicionadas às placas e incubadas a 37ºC por 90 minutos. Os poços foram lavados três vezes com PBS para remover quaisquer células não ligadas e as células aderentes foram fixadas com PFE durante 20 minutos. As células fixadas foram então tratadas com etanol 70%, coradas com cristal violeta, resolvidas em etanol 100% e quantificadas por medição da
207 / 236 absorbância a 630nM com um leitor de placas Flex Station 3 (Molecular Devices). Equivalentes organotípicos de pele
[00492] Fibrinogênio bovino (90% coagulável, MP Biomedicals) foi dissolvido em 1,1% de NaCl a 37ºC por 4 horas e então filtrado com um filtro de membrana de náilon de 0,45 µm. Os fibroblastos foram coletados com o uso de tripsina e centrifugação e foram ressuspensos em meio a uma concentração final de 2x106 células/mL. 150 µL da suspensão de células foram misturados com 1mL de trombina (3 IU - Sigma Aldrich), e a mistura de células / trombina foi adicionada ao fibrinogênio em uma razão de 1:1. A mistura foi distribuída de forma rápida, mas suave, a 1mL / poço em uma placa de 12 poços e incubada a 37ºC. Após 20 minutos, foi adicionado meio suplementado com ácido ascórbico e aprotinina (Sigma) na concentração final de 10µg / mL. As matrizes foram deixadas para amadurecer por 5-7 dias enquanto o meio era trocado a cada dois dias. Os queratinócitos foram semeados no topo a 2x106 células / poço e, no dia seguinte, a cultura foi elevada até a interface ar-líquido em uma grade de metal e o tratamento com amlexanox foi iniciado. O meio foi trocado a cada dois dias com droga fresca, ácido ascórbico e aprotinina. As culturas foram coletadas em uma ou duas semanas de tratamento e congeladas com OCT em isopentano resfriado com nitrogênio líquido. Seções de 8 µm foram cortadas usando um criostato (Avantik QS11) e imunomarcadas com anticorpo policlonal anti-COL7 em uma diluição de 1:800. Os núcleos foram contrastados com DAPI (Invitrogen). Resultados
[00493] Em primeiro lugar, a expressão de COL7 de HSV modificado foi avaliada por qPCR e análises de western blot na linhagem de células de queratinócitos humanos HaCaT para determinar se os HSVs modificados eram capazes de expressar sua carga. As células HaCaT foram transduzidas com SAR-COL7 ou KCA211 em MOIs variando de 0,3-10. 48 horas após a
208 / 236 infecção, as células foram coletadas e processadas para análises de qPCR (FIG. 3A) ou Western blot (FIG. 3B). Os resultados demonstraram que COL7 de comprimento total foi expresso de uma maneira dependente da dose a partir de queratinócitos humanos infectados com o HSV modificado.
[00494] Em seguida, experimentos de imunofluorescência foram conduzidos para visualizar a expressão de COL7 em queratinócitos RDEB primários ou fibroblastos RDEB infectados por 24-48 horas com SAR-COL7 em vários MOIs (variando de 0,1 a 10). Um forte sinal COL7 foi observado em todas as doses de SAR-COL7 testadas para queratinócitos (FIG. 4A) e fibroblastos (FIG. 4B), em comparação com queratinócitos normais e RDEB e fibroblastos não infectados. As eficiências de infecção de SAR-COL7 em MOIs de 0,1-1 em fibroblastos variaram de 16-36%. As eficiências de infecção de SAR-COL7 em MOIs de 3,0 e acima em fibroblastos foram ≥ 90%.
[00495] Queratinócitos dérmicos humanos derivados de pacientes RDEB (HDKs) e fibroblastos (HDFs) foram infectados com SAR-COL7 em vários MOIs, a fim de avaliar a expressão de RNA COL7A1 . HDKs e HDFs normais, bem como HDKs e HDFs RDEB infectados com simulação, foram usados como controles negativos. Aumentos dependentes da dose em transcritos COL7A1 foram observados em HDKs (FIG. 5A) e HDFs (FIG. 5B) infectados com SAR-COL7. A mudança em vezes relativa na expressão do transcrito COL7A1 após infecção vs. HDKs saudáveis não infectados (Tabela 1A) ou HDFs saudáveis não infectados (Tabela 1B) também foi calculada. O uso de HSV que codifica COL7A1-foi capaz de aumentar a expressão de transcrito de COL7A1 em aproximadamente 26 vezes em RDEB HDFs e 60 vezes em RDEB HDFs em relação a níveis de transcrito de COL7A1 de tipo selvagem em HDKs saudáveis e HDFs em um MOI de 3. Tabela 1A: expressão de COL7A1 em HDKs Tipo de célula: MOI Mudança em vezes sobre N-HDK: HDKs normais (N-HDK) 0 1,00 RDEB HDKs (EB-HDK) 0 0,79 RDEB HDKs (EB-HDK) 0,3 7,00 RDEB HDKs (EB-HDK) 1,0 13,73 RDEB HDKs (EB-HDK) 3,0 26,25
209 / 236 Tabela 1B: Expressão de COL7A1 em HDFs Tipo de célula: MOI Mudança em vezes sobre N-HDF: HDFs normais (N-HDF) 0 1,000 HDFs RDEB (EB-HDF) 0 0,340 HDFs RDEB (EB-HDF) 0,1 1,805 HDFs RDEB (EB-HDF) 0,3 5,134 HDFs RDEB (EB-HDF) 1,0 30,788 HDFs RDEB (EB-HDF) 3,0 60,571
[00496] Em seguida, a funcionalidade de COL7 humano expresso a partir de SAR-COL7 foi testada por um ensaio de adesão celular. Foi estudada a capacidade de queratinócitos RDEB não infectados e queratinócitos RDEB infectados com SAR-COL7 em vários MOIs para aderir a poços tratados com Colágeno 1 ou fibronectina. Curiosamente, os queratinócitos RDEB infectados com SAR-COL7 mostraram aumento da adesão ao colágeno 1 (FIG. 6A) e fibronectina (FIG. 6B) de maneira dependente da dose usando um ensaio de adesão baseado em placa.
[00497] Finalmente, uma cultura organotípica de equivalente de pele (SE) composta por fibroblastos RDEB e queratinócitos foi usada para avaliar a expressão de COL7 a partir de SAR-COL7 na zona da membrana basal (BMZ). Culturas de órgãos foram construídas com RDEB ou fibroblastos normais e queratinócitos. As células RDEB foram infectadas com SAR-COL7 antes da construção da cultura de órgãos (dados não mostrados), ou SAR-COL7 foi adicionado gota a gota nas culturas antes de aumentar na interface ar-líquido (FIG. 7). Os equivalentes de pele resultantes (SEs) foram isolados, seccionados e corados para imunofluorescência para detectar a expressão da proteína COL7. COL7 foi detectado nessas culturas organotípicas de células infectadas com SAR-COL7, e o início da deposição da proteína COL7 no BMZ foi observado. Estes dados sugeriram que não apenas o SAR-COL7 poderia distribuir COL7A1 e expressar a proteína COL7 de forma eficiente, mas a proteína COL7 começou a se organizar em culturas organotípicas semelhantes ao padrão de organização esperado para a proteína COL7 in vivo.
[00498] Tomados em conjunto, os dados fornecidos neste documento indicaram que o HSV com defeito de replicação pode ser empregado como um
210 / 236 veículo para efetivamente distribuir e expressar altos níveis de colágeno humano funcional em células humanas primárias de tipo selvagem, bem como células humanas primárias isoladas de pacientes que sofrem de uma deficiência de colágeno, sem qualquer toxicidade óbvia em sistemas de cultura 2D ou 3D. Exemplo 3: análise in vivo de um candidato a HSV que codifica COL7 humano em animais de tipo selvagem
[00499] O seguinte exemplo descreve experiências que mostram que os vírus recombinantes construídos e validados in vitro em células humanas (ver Exemplo 2 acima) foram capazes de expressar o colágeno humano codificado in vivo em animais de tipo selvagem. O objetivo do estudo foi, em parte, avaliar a biodistribuição pela pele da expressão de colágeno mediada por HSV em animais imunocompetentes saudáveis. Materiais e Métodos Artigo de teste
[00500] O ingrediente ativo nas formulações administradas a camundongos foi o vírus herpes simplex modificado SAR-COL7 ou KCA211 (ver Exemplo 2 acima) a um título de 4,8x108 unidades formadoras de placas (PFU) / mL formulado em PBS + glicerol a 10%. O veículo utilizado para administração intradérmica foi solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) + glicerol a 10%. O veículo utilizado para administração tópica foi gel de hidroxipropil metilcelulose (HPMC) a 3% formulado em água destilada dupla estéril. Animais
[00501] Foram utilizados camundongos BALB / c machos saudáveis entre 6 e 10 semanas de idade. Todos os procedimentos usados no protocolo estavam em conformidade com as leis aplicáveis de bem-estar animal e foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) local. Injeções intradérmicas
[00502] Antes e durante a administração do artigo de teste, os
211 / 236 camundongos foram anestesiados com um coquetel de Dexdomitor (30µL ou 0,05mg / mL) e Telzol (50µL de 10mg / mL). O sedativo foi revertido com Antisedan (50µL de 0,5mg / mL). As áreas das costas e dos flancos foram raspadas com um cortador elétrico para animais de estimação, e a área foi limpa com álcool. As injeções intradérmicas foram realizadas pela técnica de Mantoux com uma seringa e agulha 27G (VWR, cat. No. BD305620), garantindo a criação de uma “bolha” superficial em cada local. O vírus foi mantido em gelo seco, descongelado à temperatura ambiente e administrado 30 minutos após o descongelamento. Duas injeções intradérmicas foram administradas nas costas de cada camundongo, e as bordas da "bolha" foram marcadas com um marcador permanente. Aplicações tópicas
[00503] A administração tópica foi realizada em feridas abertas ou em pele raspada ou escarificada. As regiões posterior e flanco foram raspadas com tesoura elétrica. A escarificação foi realizada raspando suavemente a pele com Dremel mecânico seguido de perfuração superficial com agulha 22G. Para a criação de uma ferida, uma biópsia de 5-6 mm de diâmetro da pele foi removida usando uma tesoura afiada. Para conter a formulação tópica no local raspado ou ferido, foi criado um poço a partir das pontas cortadas e autoclavadas de tubos de microcentrífuga de 1,5mL. As tampas foram retidas e o lado cortado coberto com curativo adesivo transparente. Os “poços” foram aderidos à região raspada / ferida com cola cirúrgica com a tampa voltada para baixo. 100µL de SAR-COL7 foram misturados com 20µL de veículo tópico e aplicados no local da ferida por injeção através do adesivo transparente, a fim de conter o gel tópico na ferida e prevenir vazamentos. Coleta de tecido
[00504] Nos pontos de tempo indicados após a administração de SAR- COL7, os camundongos foram sacrificados e o local da injeção foi removido usando uma punção de biópsia de 8 mm. Metade da biópsia foi congelada
212 / 236 rapidamente com nitrogênio líquido, enquanto a outra metade foi embebida em OCT e criopreservada para coloração por imunofluorescência. PCR quantitativa em tempo real
[00505] Metades de biópsia de congelamento rápido foram armazenadas a -80ºC até a análise. Para processamento e análise, as amostras foram ressuspensas em 350 µL de tampão RLT preparado com DTT fresco seguindo o protocolo do fabricante (Qiagen). A amostra foi sonicada 3 vezes em amplitude de 25% com incubação intermitente por 1 minuto em gelo, e extrações de DNA e RNA foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante (kit de extração de DNA e RNA Qiagen AllPrep). As amostras de RNA e DNA foram ressuspensas em água destilada e desionizada sem RNAse e quantificadas espectrofotometricamente em um leitor de microplaca Take3 (BioRad).
[00506] A quantificação absoluta de cópias de DNA COL7A1 e transcritos de RNA foi realizada por análise de Taqman Real Time PCR usando um ensaio de iniciador / sonda personalizado que abrangeu a extremidade 3' da estrutura de leitura aberta de COL7A1 humano e a UTR 3', detectando especificamente o transgene COL7A1. 100ng de DNA e RNA foram usados para os ensaios qPCR e qRT-PCR, respectivamente, e um plasmídeo padrão contendo a região a ser amplificada foi preparado em 100ng de camundongo genômico ou matriz de RNA. GAPDH foi utilizado como controle para ambas as análises. Coloração imunofluorescente
[00507] O tecido congelado de OCT foi seccionado a 5-8 µm e deixado secar ao ar por até 1 hora. As lâminas foram mergulhadas em metanol 100% por 10 minutos a -20ºC e deixadas para secar ao ar. As seções fixadas em metanol foram re-hidratadas através de 3 lavagens em PBS (5 minutos cada) em temperatura ambiente. Os cortes foram incubados com solução bloqueadora composta por 10% de soro (mistura de espécies) por 1 hora em temperatura
213 / 236 ambiente em câmara úmida. O excesso de solução de bloqueio foi removido e uma gota de anticorpo primário (colágeno anti-humano 7, Sigma, cat. no. HPA042420; anti-integrina alfa 6 (clone goH3), BD Biosciences, cat. no. 555734) solução, preparada em solução de bloqueio a 5%, foi aplicada em cada seção (30-50 µL / seção). As seções foram incubadas com o anticorpo primário por 16 horas a 4ºC, lavadas 3 vezes em PBS por 5 minutos cada em temperatura ambiente e anticorpo secundário (anticoelho AF 647, Invitrogen, cat. no. A21244; antirrato AF-594, Invitrogen, cat. no. A11007) foi aplicado a uma diluição de 1:400 em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente numa câmara úmida. A lavagem com PBS 3 vezes foi repetida, então as lâminas foram imersas em solução Hoechst (1:1000) por 5 minutos em temperatura ambiente. A lavagem com PBS 3 vezes foi repetida e as seções coradas foram montadas com meios de montagem (Fluorometer G, Southern Biotech, cat. No. 0100-01) e cobertas com uma lamela. As seções foram fotografadas após a desidratação (aproximadamente 24 horas) usando um Microscópio de Fluorescência de Campo Largo. Resultados
[00508] Um total de 30 camundongos BALB / c machos divididos em 6 grupos foram usados para este estudo. SAR-COL7 foi administrado por injeção intradérmica ou aplicação tópica no dia 1, e um subconjunto de camundongos foi colhido no dia 3 e os demais camundongos no dia 6. Os animais do grupo 2 receberam uma dose baixa de SAR-COL7 (4,8x106 pfu/sítio) no mesmo volume por injeção intradérmica, e o grupo 1 serviu como controle para as coortes intradérmicas. Nos grupos 4, 5 e 6, o veículo tópico (grupo 4) ou SAR-COL7 em gel tópico (grupos 5 e 6) foi aplicado a uma área ferida (grupos 4 e 6) ou raspada (grupo 5) em um volume total de 120µL. Os tecidos foram colhidos e processados para qPCR e análise de imunofluorescência conforme descrito acima.
[00509] A análise de qPCR pós-sacrifício foi realizada. Os transcritos
214 / 236 COL7A1 e os níveis de DNA foram detectados em todas as coortes que receberam SAR-COL7 por aplicação intradérmica ou tópica (FIGS. 8A-D) e uma resposta clara à dose foi observada. Os níveis de transcrito e DNA foram comparáveis entre coortes intradérmicas e tópicos (SAR-COL7 alta ID, ferida alta e alta abrasão), sugerindo que a aplicação tópica foi tão eficiente na distribuição de COL7A1 quanto a injeção intradérmica. No geral, os níveis de DNA e RNA foram mais baixos nas amostras do dia 6 (FIGS. 8C-D) do que nas amostras do dia 3 (FIGS. 8A-B), o que não era inesperado, uma vez que SAR-COL7 é um vetor não integrador que permanece epissômico (que se espera que desapareça com o tempo).
[00510] Em seguida, experimentos de imunofluorescência foram conduzidos para visualizar a expressão de COL7 após a infecção por SAR- COL7 in vivo. Conforme observado nas imagens representativas fornecidas nas FIGS. 9A-B, COL7 foi detectado na maioria das coortes de animais em ambos os pontos de tempo examinados. Muitas amostras mostraram localização correta de COL7 no BMZ e ao redor dos folículos capilares. Em alguns casos, especificamente com a aplicação intradérmica, uma forte expressão de COL7 foi observada em camadas mais profundas da pele, mais perto da fáscia subjacente, possivelmente devido à injeção ser subcutânea em vez de intradérmica. Da mesma forma, em muitas das amostras de pele raspada onde o BMZ foi provavelmente removido durante a abrasão (como sugerido pela falta de coloração goH3 representativa), a forte coloração COL7 foi limitada à superfície da pele. No geral, a presença de COL7 nas amostras de imunofluorescência apoiou fortemente a eficácia robusta do HSV SAR-COL7 modificado.
[00511] Além disso, a capacidade de KCA211 de expressar COL7 humano foi testada in vivo e comparada com a administração de SAR-COL7. Verificou-se que KCA211 também expressa o transgene COL7 in vivo em camundongos imunocompetentes (FIGS. 10A-B).
215 / 236
[00512] Tomados em conjunto, os dados indicaram que o HSV modificado era capaz de distribuir e expressar uma proteína de colágeno humana in vivo em animais saudáveis e imunocompetentes após administração tópica ou intradérmica e, além disso, que a expressão de colágeno do vírus administrado topicamente na pele comprometida ou feridas abertas era comparável à administração intradérmica na pele intacta. Exemplo 4: análise in vivo de doses baixas e altas de um candidato a HSV que codifica COL7 humano em animais hipomórficos
[00513] O exemplo a seguir descreve experiências que mostram que os vírus recombinantes construídos e validados in vitro em células humanas (ver Exemplo 2 acima) e in vivo em camundongos do tipo selvagem (ver Exemplo 3 acima) foram capazes de expressar colágeno humano funcional in vivo em camundongos hipomórficos COL7. O objetivo do estudo foi, em parte, avaliar a biodistribuição pela pele da expressão de colágeno mediada por HSV em animais imunocompetentes deficientes em COL7. Materiais e Métodos
[00514] Salvo indicação em contrário, as experiências foram realizadas conforme descrito no Exemplo 3 acima. Camundongos hipomórficos
[00515] O modelo de camundongo hipomórfico COL7 (Fritsch et al. J Clin Invest. 2008 May;118(5):1669-79) foi utilizado neste estudo. Este modelo de camundongo hipomórfico é um modelo animal imunocompetente para epidermólise bolhosa distrófica (DEB), no qual os camundongos expressam cerca de 10% dos níveis normais de COL7. Seu fenótipo se assemelha muito às características da DEB humana severa, incluindo bolhas mucocutâneas, distrofia ungueal e deformidades em luva das extremidades.
[00516] Os camundongos foram gerados por remoção mediada por flp / frt do éxon 2 de COL7A1de camundongo. Animais sem ambas as cópias funcionais de COL7A1 (Col7a1flNew / flNeo), referidos como “camundongos
216 / 236 hipomórficos” COL7, expressaram cerca de 10% dos níveis normais de COL7. De um total de 15 casais reprodutores, foram obtidos 58 filhotes, com ninhadas variando de 2 a 7 camundongos / ninhada. Destes 58 filhotes, 6 foram genotipados para serem hipomorfos. Os camundongos foram genotipados com DNA extraído de uma amostra de tecido de perfuração de orelha. A análise de PCR detectou a presença de um sítio loxP a montante do éxon 2 de COL7A1. Camundongos do tipo selvagem (WT) mostraram uma banda em 269 pares de bases (pb), camundongos hipomorfos mostraram uma banda em 435 pb e camundongos heterozigotos mostraram ambas as bandas. Todos os procedimentos estavam em conformidade com as leis aplicáveis de bem-estar animal e foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) local. Injeções intradérmicas
[00517] Antes e durante a administração do artigo de teste, os camundongos foram mantidos sob anestesia por inalação usando 2% de isoflurano. Uma pomada ocular (Puralube® Vet) foi aplicada nos olhos para prevenir o ressecamento. As injeções intradérmicas foram realizadas pela técnica de Mantoux com agulha 31G. Até quatro injeções intradérmicas foram administradas nas costas de cada camundongo nas doses especificadas. Coleta de tecido
[00518] Antes da coleta do tecido, os animais foram sacrificados por inalação de CO2 seguida de deslocamento cervical. Os locais de injeção foram biopsiados com tesouras afiadas. Coloração por Hematoxilina e Eosina (H&E)
[00519] Os tecidos criopreservados foram seccionados com uma espessura de 5-8 µm e deixados para secar ao ar por até uma hora. As lâminas foram mergulhadas em metanol 100% por dez minutos a -20ºC e deixadas para secar ao ar. Seções fixadas em metanol foram re-hidratadas em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente. As seções foram incubadas em hematoxilina
217 / 236 (hematoxilina modificada de Weigert) por 5-10 minutos em temperatura ambiente, seguido por uma lavagem em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. As seções foram então enxaguadas em Eosina (solução de Eosina Y, cat. no. HT110116) 3 vezes seguidas de um enxágue em água.
[00520] As seções foram gradualmente desidratadas com etanol por imersão em álcool etílico 70% 10 vezes, álcool etílico 95% dez vezes e álcool etílico 100% dez vezes. As seções foram configuradas para secar, montadas com meios de montagem (Fischer Scientific, cat. no. SPF15-100) e cobertas com uma lamela. As seções foram fotografadas após a desidratação (aproximadamente 24 horas) usando um microscópio de campo claro. Microscopia Eletrônica
[00521] A pele foi preparada para microscopia eletrônica por imersão em 1,5% glutaraldeído / 1,5% paraformaldeído em meio livre de soro de Dulbecco (SFM) contendo 0,05% de ácido tânico por um mínimo de uma hora, seguido por um enxágue extensivo em SFM, e uma etapa de pós-fixação em 1% de OsO4 por 60 minutos. As amostras foram lavadas em SFM, em seguida, desidratadas em uma série graduada de etanol a 100%, enxaguadas com óxido de propileno e infiltradas em epóxi Spurr durante um tempo total de duas horas, acelerado por energia de micro-ondas. As amostras foram polimerizadas a 70ºC durante 18 horas. Amostras adicionais foram preparadas por enxágue extensivo em SFM, em seguida, imersão em anticorpo IgM LH24 de camundongo ou anticorpo IgG NP185 de camundongo diluído 1:5 em SFM durante a noite a 4ºC. As amostras foram então enxaguadas extensivamente em SFM, expostas à solução de aumento de ouro (Nanossondas) por 15 minutos no gelo, então rapidamente aquecidas a 25ºC e incubadas por mais 5 minutos. As amostras foram enxaguadas com SFM gelado, fixadas e incorporadas. Resultados
[00522] Três camundongos hipomórficos foram usados para o estudo SAR-COL7 de alta dose. Todos os camundongos receberam uma dose de
218 / 236 4,6x107 PFU/50µL/local de injeção por injeção intradérmica no dia 1 (Tabela 2). Cada animal foi raspado e injetado em 4 locais nas costas, incluindo 1 injeção de controle e 3 injeções de SAR-COL7. Um animal (camundongo 3) recebeu uma segunda injeção nos mesmos 4 locais no dia 3. Um camundongo (camundongo 1) foi sacrificado no dia 3, enquanto o camundongo 2 e o camundongo 3 foram sacrificados no dia 7. Tabela 2: projeto do estudo para injeção intradérmica de SAR-COL7 em alta dose Amostra: Camundongo: Tratamento (Dia 1): Tratamento (Dia 3): Dia do sacrifício: 1 HSV-GFP PBS 2 SAR-COL7 - 1 Dia 3 3 SAR-COL7 - 4 SAR-COL7 - 5 PBS PBS 6 SAR-COL7 - 2 Dia 7 7 SAR-COL7 - 8 SAR-COL7 - 9 PBS PBS 10 SAR-COL7 SAR-COL7 3 Dia 7 11 SAR-COL7 SAR-COL7 12 SAR-COL7 SAR-COL7
[00523] A análise de qPCR pós-sacrifício foi realizada. Os transcritos deCOL7A1 (FIG. 11A) e níveis de DNA (FIG. 11B) foram detectados em cada local de injeção viral em todos os três camundongos. Os níveis de transcrito em todas as amostras de controle (PBS ou HSV-GFP) estavam no ou abaixo do nível de detecção no ensaio, então apenas 1 controle (dia 3, amostra 1, HSV-GFP) foi incluído para comparação nos gráficos. Foi observada alguma diminuição nos níveis de DNA e transcritos no dia 7 após a administração única de SAR-COL7 (camundongo 2); no entanto, os níveis de DNA e transcritos aumentaram após a readministração de SAR-COL7 (camundongo 3).
[00524] Em seguida, experimentos de imunofluorescência (IF) foram conduzidos para visualizar a expressão de COL7 em camundongos hipomórficos após infecção por SAR-COL7 in vivo (FIGS. 12A-B). Os experimentos IF demonstraram que a expressão da proteína COL7 robusta e disseminada foi observada no BMZ, bem como ao redor dos folículos capilares
219 / 236 (HF), tanto no dia 3 quanto no dia 7. Nenhum impacto negativo na morfologia da pele (mesmo após administração repetida) foi observado, uma vez que as amostras tratadas com SAR-COL7 mostraram uma morfologia de pele normal sem sinais óbvios de fibrose ou inflamação aguda (FIG. 13). No geral, a presença de COL7 nas amostras de imunofluorescência apoiou fortemente a eficácia robusta do SAR-COL7 em fornecer colágeno humano capaz de ser secretado e adequadamente organizado nas subestruturas subjacentes da pele.
[00525] As biópsias do dia 3 também foram avaliadas para a formação de fibrilas de ancoragem por microscopia eletrônica. Em fibrilas de ancoragem adequadamente estruturadas, o domínio NC1 de COL7 (que é corado com o anticorpo NP158) se alinha em direção à lâmina densa, enquanto o domínio NC2 de COL7 (que é corado com o anticorpo LH24) se alinha para longe da lâmina densa. Biópsias de camundongos injetados com SAR-COL7 mostraram coloração de COL7 com os anticorpos LH24 (FIG. 14A) e NP185 (FIG. 14B) e, mais importante, as imagens de microscopia eletrônica (EM) revelaram a formação de fibrilas de ancoragem. A lâmina densa foi observada como uma faixa escura no meio das imagens EM. Os domínios NC2 do COL7 humano exógeno foram posicionados longe da lâmina densa, enquanto os domínios NC1 do COL7 humano exógeno foram posicionados ao longo da lâmina densa, como seria de se esperar em fibrilas de ancoragem adequadamente formadas. Esses dados indicaram que o SAR-COL7 poderia não apenas expressar um COL7 humano codificado que era capaz de ser secretado e adequadamente organizado no BMZ, mas que o COL7 secretado era funcional e devidamente posicionado nas fibrilas de ancoragem resultantes, sustentando o tecido da pele dos camundongos hipomórficos.
[00526] Três camundongos hipomórficos adicionais foram usados para o estudo SAR-COL7 de dose baixa. Todos os camundongos receberam uma dose de 6,4x106 PFU/50µL/sítio de injeção de SAR-COL7 em 3 (camundongo 1) ou 2 (camundongo 2 e 3) locais por injeção intradérmica no dia 1 (Tabela
220 / 236 3). Tabela 3: projeto do estudo para injeção intradérmica de SAR-COL7 em dose baixa Camundongo: Dia do tratamento: Nº de sítios de injeção: Dia do término: 1 1 3 3 2 1 2 3 3 1 2 7
[00527] A análise de qPCR pós-sacrifício foi realizada. Os transcritos deCOL7A1 (FIG. 15A) e níveis de DNA (FIG. 15B) foram detectados em cada local de injeção viral em todos os três camundongos. Foi observada uma resposta à dose. Embora os níveis de DNA e de transcrito de COL7A1 fossem mais baixos nessas amostras de baixa dose em relação àquelas observadas no estudo de alta dose, a expressão de COL7A1 ainda era detectável. Apesar de uma redução aproximada de 2 log nos níveis de DNA ou RNA, a proteína COL7 ainda era detectável na pele de animais injetados com SAR-COL7 de baixa dose (FIG. 16). A proteína COL7 foi observada tanto no BMZ quanto ao redor dos folículos capilares. Os dados indicaram que mesmo em dosagens mais baixas, o HSV modificado ainda era eficaz na distribuição e na expressão da proteína de colágeno humana codificada, que foi então secretada e localizada na região apropriada da pele.
[00528] Tomados em conjunto, os dados fornecidos nos exemplos indicaram que os HSVs modificados aqui descritos foram capazes de: 1) transduzir células da pele para produzir colágeno humano funcional in vitro e em cultura organotípica (ver Exemplo 2); 2) transduzir a pele e distribuir colágeno humano in vivo em animais saudáveis e imunocompetentes após aplicações tópicas e intradérmicas (ver Exemplo 3); e 3) transduzir a pele, distribuir colágeno humano e iniciar a formação de fibrilas de ancoragem in vivo em animais com deficiência de colágeno (ver Exemplo 4). Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que os vetores recombinantes descritos neste documento fornecem uma estratégia desejável para distribuir colágeno humano funcional à pele, permitindo novas abordagens para suportar a derme
221 / 236 e / ou epiderme em configurações cosméticas. Exemplo 5: construção e validação de múltiplos HSVs engenheirados que codificam Colágeno 1 humano
[00529] O exemplo a seguir descreve duas abordagens diferentes para a engenharia de um HSV-1 recombinante para expressar com sucesso o colágeno 1 humano. Como o colágeno 1 humano é uma macromolécula heterotrimérica compreendendo duas cópias de um polipeptídeo COL1A1 e uma cópia de um polipeptídeo COL1A2, duas estratégias distintas foram realizadas para gerar um único genoma de HSV que codifica COL1A1 e COL1A2 humanos; essas duas abordagens são geralmente representadas nas FIGS. 1H-1I e 1L, e descritas em detalhes abaixo.
[00530] Como uma primeira abordagem, um HSV-1 recombinante foi inicialmente engenheirado para incorporar um cassete de expressão de COL1A1 humano, contendo um promotor heterólogo e uma sequência poliA, em cada um dos loci ICP4, conforme descrito no Exemplo 2 acima. Múltiplas placas de vírus contendo supostamente o cassete COL1A1 humano foram selecionadas e rastreadas por infecção em células Vero para testar a expressão de COL1A1 (dados não mostrados). Pelo menos três isolados (clones 1A1, 2A1 e 3A1) foram positivos para a expressão do transgene COL1A1 humano. Em seguida, os clones 1A1 e 2A1 positivos para COL1A1humano foram então projetados para incorporar um cassete de expressão de COL1A2 humano, contendo um promotor heterólogo diferente do cassete de COL1A1 e sua própria sequência poliA, inserida no locus ICP22. Sete isolados (clones 1A2- 1A1, 1B2-1A1, 1C1-1A1, 1B3-2A1, 3B1-1A1 e 3B1-2A1) foram então selecionados para identificar vírus HSV-1 atenuados capazes de expressar COL1A1 e COL1A2humanos, e, portanto, colágeno 1 humano de comprimento total.
[00531] As células Vero foram infectadas com um dos sete isolados putativos COL1A1-COL1A2-positivos ou um de três dos isolados de COL1A1
222 / 236 sozinho (como um controle negativo para a expressão de COL1A2) a fim de identificar clones de HSV-1 recombinantes capazes de expressar ambos os transgenes.
As infecções das células Vero puderam prosseguir durante cinco dias, as células foram colhidas por raspagem suave e os peletes celulares foram recolhidos por centrifugação a 6000xg durante cinco minutos.
Metade de cada pelete foi colhida para análise de qRT-PCR, enquanto a outra metade foi processada para Western Botting.
A quantificação absoluta de cópias de RNA de COL1A1 ou COL1A2 RNA foi realizada por análise de Taqman Real-Time PCR usando ensaios personalizados de iniciador/sonda que abrangem a extremidade 3' da estrutura de leitura aberta (ORF) de COL1A1 ou COL1A2 humano e a região 3' não traduzida (UTR), e são específicas para o transgene.
O RNA extraído de células infectadas com todos os três vírus COL1A1- isolados e células infectadas com 6/7 dos vírus COL1A1-COL1A2 foram positivos para a expressão do transgene COL1A1 humano (FIG. 17A). Curiosamente, apenas 3/7 dos vírus COL1A1-COL1A2 (clones 1B2-1A1, 1C1- 1A1 e 1B3-2A1) também expressaram níveis detectáveis de COL1A2 humano (FIG. 17B). O Western blotting da expressão das proteínas COL1A1 e COL1A2 em lisados celulares infectados com esses três isolados foi realizado para garantir que os transgenes fossem expressos em ambos os níveis de ácido nucleico e proteína.
Resumidamente, os peletes de células foram ressuspensos em tampão RIPA contendo coquetel de inibidor de protease Halt, incubados a 4°C por dez minutos e foram então tratados com benzonase por 10 minutos em temperatura ambiente.
As amostras foram então diluídas com tampão de amostra LDS 4x contendo 5% de 2-mercaptoetanol e resolvidas em géis de Tris-Glicina.
O lisado de células Vero infectado simulado foi carregado no gel como um controle negativo.
As proteínas foram transferidas para PVDF, bloqueadas e depois coradas durante a noite com o anticorpo primário (anti- COL1A1 humano, ThermoFisher cat. no.
PA5-29569; anti-COL1A2 humano, Abcam. cat. no. ab96723; ou anti-GAPDH, Abcam cat. no. ab9485). As
223 / 236 membranas coradas foram então lavadas, incubadas com anticorpo secundário e então desenvolvidas. De acordo com a análise de qRT-PCR, todos os três clones foram capazes de expressar as proteínas COL1A1 e COL1A2 humanas em níveis detectáveis (FIG. 17C).
[00532] Uma segunda abordagem foi buscada em paralelo para gerar vetores de HSV atenuados, recombinantes COL1A1-COL1A2-positivos. Aqui, foi gerado um construto polinucleotídico que codificou, de 5' a 3', uma ORF COL1A1 humana, uma IRES sintética e uma ORF COL1A2 humana. Este construto baseado em IRES (codificado em um cassete de expressão também contendo um promotor heterólogo e uma sequência poliA) foi então inserido em cada um dos loci ICP4, conforme descrito no Exemplo 2 acima. Múltiplas placas foram selecionadas e rastreadas para identificar vetores com construtos IRES inseridos corretamente. Resumidamente, as células Vero foram infectadas com isolados virais putativos do IRES, as infecções puderam prosseguir por cinco dias e as células foram colhidas e processadas para análise de qPCR e qRT-PCR. A quantificação absoluta de cópias de DNA e RNA de inserto foi realizada por análise de Taqman Real-Time PCR usando ensaios personalizados de iniciador / sonda que reconhecem o IRES sintético. 13 isolados virais foram selecionados por qPCR e qRT-PCR; apenas um desses isolados (isolado 6) deu positivo para os transcritos de DNA e RNA do IRES que compreendem a sequência do IRES (dados não mostrados). Para confirmar que este isolado era capaz de expressar COL1A1 e COL1A2 humanos ao nível da proteína, as células Vero infectadas foram processadas para Western blotting como descrito acima. Um isolado viral (isolado 1) que não apresentou incorporação de cassete de expressão por qPCR e expressão de transgene por qRT-PCR foi usado como controle negativo. Em paralelo com os dados de qPCR / qRT-PCR, o isolado viral 6 foi capaz de expressar as proteínas COL1A1 e COL1A2 humanas após a infecção (FIG. 18).
[00533] Tomados em conjunto, os dados apresentados nesta amostra
224 / 236 indicam que: (1) múltiplos vetores HSV-1 recombinantes foram construídos com sucesso e eram proficientes na expressão de COL1A1 e COL1A2 humanos após infectar células-alvo; (2) os vetores podem ser engenheirados para expressar proteínas de colágeno humanas heterotriméricas; e (3) múltiplas abordagens diferentes podem ser tomadas para expressar múltiplas proteínas de um único genoma recombinante. Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que a expressão bem-sucedida de Colágeno 1 humano a partir de um genoma de HSV-1 recombinante fornece suporte para o uso de HSV engenheirado para expressar qualquer proteína de colágeno heterotrimérica (por exemplo, Colágeno 4 humano). Exemplo 6: construção, validação e caracterização in vitro de um HSV engenheirado que codifica Colágeno 3 humano
[00534] O exemplo a seguir descreve a engenharia de um HSV-1 recombinante que expressou com sucesso o Colágeno 3 humano (denominado C3vec01). Além disso, o exemplo a seguir descreve experimentos in vitro que estabelecem vários sistemas de modelo de cultura de células 2D relevantes adequados para caracterizar a eficácia de C3vec01, incluindo o uso de queratinócitos humanos imortalizados e fibroblastos em estudos de variação de dose, o uso de fibroblastos dérmicos humanos primários biopsiados de múltiplos pacientes humanos idosos como um modelo de resgate de colágeno 3 mediado por C3vec01 em pacientes mais velhos e o uso de fibroblastos humanos imortalizados com radiação UV in vitro como um modelo para exposição ao sol / envelhecimento da pele.
[00535] A pele humana é amplamente composta por tecido conjuntivo rico em colágeno que é produzido, organizado e mantido por fibroblastos dérmicos. O colágeno dérmico representa > 90% (peso seco) da pele humana e é composto principalmente de fibrilas COL1 e COL3 em uma razão típica de cerca de 85:15. Essas fibrilas fornecem força à pele e são essenciais para a manutenção da arquitetura do tecido cutâneo.
225 / 236
[00536] As características do envelhecimento da pele são em grande parte devido à homeostase do colágeno aberrante, resultando em uma deficiência líquida de colágeno; a biossíntese do colágeno é reduzida, a fragmentação da fibrila do colágeno é aumentada e há uma perda progressiva do colágeno dérmico, todos contribuindo para o fenótipo envelhecido. O envelhecimento da pele é influenciado por uma combinação de fatores internos e externos: fatores intrínsecos - passagem do tempo, genética, metabolismo celular, hormônios, etc .; e extrínsecos - exposição crônica à luz, poluição, radiação ionizante, etc. Juntos, esses fatores levam a alterações estruturais e fisiológicas cumulativas na pele, levando ao aparecimento e agravamento das rugas cutâneas.
[00537] O rejuvenescimento da pele, o processo de reverter ou reparar irregularidades na pele (como rugas), é obtido, em parte, pela síntese de novo colágeno (neocolagênese). Na pele, a neocolagênese é afetada pela deposição e pelas complexas interações entre os colágenos 1 e 3. COL3 aparece no início durante a fibrilogênese de colágeno, e a substituição subsequente deste COL3 por COL1 é uma etapa crítica para a maturação da fibrila de colágeno e reorganização da matriz extracelular (Wang, et al., 2018, Journal of the Chinese Medical Association, 81(2), pp. 94-101). Além disso, COL3 regula as dimensões das fibras COL1 (Liu, et al., 1997, Proc Natl Acad Sci U S A, 94(5), pp. 1853-6) e intensifica a elasticidade de COL1 (Asgari, et al., 2017, Sci Rep, 7(1), p. 1392). Como tal, o surgimento da expressão inicial de COL3 e subsequente substituição por COL1 tem sido usado como um marcador de eficácia para preenchimentos faciais injetáveis em humanos (Yutskovskaya, et al., 2014, J Drugs Dermatol, 13(9), pp. 1047-52).
[00538] Todas as experiências foram realizadas conforme descrito acima, a menos que indicado de outra forma.
[00539] Para começar, um HSV-1 recombinante foi projetado para incorporar um cassete de expressão de COL3A1 humano, contendo um
226 / 236 promotor heterólogo e uma sequência poliA, em cada um dos loci ICP4. Múltiplas placas de vírus contendo supostamente o cassete COL3A1 humano foram selecionadas e rastreadas por infecção em células Vero para testar a expressão de COL3A1 (dados não mostrados). Um dos clones de alta expressão, denominado C3vec01, foi subsequentemente selecionado para análises adicionais in vitro (descrito abaixo) e in vivo (Exemplo 7).
[00540] Em primeiro lugar, um estudo de variação de dose foi conduzido para determinar a eficácia da distribuição mediada por C3vec01 de sua carga humana codificada em queratinócitos humanos imortalizados (FIG. 19) e fibroblastos dérmicos humanos imortalizados (FIG. 20). As células imortalizadas foram infectadas por 48 horas em várias multiplicidades de infecção (MOI) variando de 0,3 a 3, e a expressão do colágeno 3 humano foi medida quantitativa e qualitativamente por meio de múltiplos ensaios. Aumentos dependentes da dose foram observados tanto no DNA efetor por análise qPCR (dados não mostrados) quanto nos níveis de transcrito efetor por análise qRT-PCR nos HKs e HDFs imortalizados (FIGS. 19A e 20A, respectivamente). Células infectadas simuladas e células infectadas com um vírus contendo a mesma espinha dorsal HSV-1 que C3vec01, mas codificando um efetor mCherry, foram usadas como controles negativos. Paralelamente a estes resultados, um aumento dependente da dose na expressão da proteína COL3 após a infecção C3vec01 foi observado por imunofluorescência em HKs imortalizados (FIG. 19B) e HDFs (FIG. 20B). Enquanto os HDFs imortalizados expressaram COL3 humano endógeno antes da infecção (como esperado), um aumento significativo na expressão de COL3 foi observado após a infecção com C3vec01, mesmo em uma dose baixa (anticorpo anti-COL3 primário, Abcam cat. no. ab7778). Foi observado pouco ou nenhum COL3 endógeno detectável nos queratinócitos imortalizados não infectados. É importante ressaltar que nenhum efeito significativo na morfologia ou viabilidade celular foi observado em queratinócitos imortalizados ou
227 / 236 fibroblastos infectados com C3vec01, mesmo em altas doses.
[00541] Conforme a pele envelhece, os fibroblastos dérmicos residentes produzem menos Colágeno 3, e a razão de COL1:COL3 na pele se inclina em direção ao Colágeno 1. A fim de proporcionar o rejuvenescimento da pele por meio da síntese de novo Colágeno 3, era importante entender se C3vec01 seria capaz de infectar fibroblastos dérmicos envelhecidos de forma eficaz e expressar de forma robusta seu Colágeno 3 humano codificado. Como tal, a capacidade do C3vec01 de infectar fibroblastos dérmicos primários envelhecidos e expressar Colágeno 3 exógeno em vários MOIs foi testada em células provenientes de dois fornecedores diferentes. A Tabela 4 abaixo fornece informações do doador para as quatro amostras primárias de HDF usadas neste estudo. Tabela 4: doadores de fibroblastos dérmicos humanos primários Idade Sexo Raça Tecido Cat. Nº Lote Nº Empresa 73 M Caucasiana Pele / pálpebra C-12302 435Z009.2 PromoCell 65 F Caucasiana Pele / pálpebra C-12302 417Z010.2 PromoCell 73 M Caucasiana Parte inferior CC-2511 0000633428 Lonza esquerda das costas 75 F Caucasiana Voltar CC-2511 18TL057585 Lonza
[00542] Em comparação com os HDFs imortalizados, um aumento dependente da dose semelhante com níveis de transcrito de COL3 comparáveis ou superiores foi observado após a infecção por C3vec01 dos HDFs primários do fornecedor 1 (FIG. 21A) e do fornecedor 2 (FIG. 21C). Uma amostra de células primárias representativas de cada fornecedor também foi testada quanto à expressão de COL3 por análise de western blot (anticorpo primário anti- COL3, Abcam cat. no. ab7778). C3vec01 foi capaz de resgatar altos níveis de expressão de colágeno 3 humano em HDFs primários biopsiados de um paciente do sexo masculino de 73 anos (FIR. 21B) e uma paciente do sexo feminino com 75 anos de idade (FIG. 21D), mesmo com o menor MOI testado.
[00543] Finalmente, foi testada a capacidade do C3vec01 de induzir a expressão robusta do Colágeno 3 em fibroblastos humanos imortalizados expostos a UV. A exposição ao sol e o dano por UV correspondente são
228 / 236 conhecidos por serem os maiores contribuintes extrínsecos para o fenótipo de pele envelhecida, e vários grupos empregaram um sistema de exposição a UV de fibroblastos de pele in vitro para modelar certos aspectos do fotoenvelhecimento (ver, por exemplo, Qin et al. 2018, Cell Physiol Biochem 46(5):1849-1860). Para confirmar que a exposição aos raios ultravioleta fez com que fibroblastos dérmicos humanos secretassem menos Colágeno 3 (como seria de se esperar dado o fenótipo da pele fotoenvelhecida), a secreção de COL3 nos sobrenadantes de fibroblastos dérmicos humanos imortalizados em cultura foi medida por ELISA antes e depois de três níveis diferentes de exposição ao UV (FIG. 22A). Na verdade, a irradiação UV de fibroblastos cultivados reduziu significativamente a expressão de COL3 endógeno. A expressão de COL1 foi monitorada em paralelo neste experimento e não foi significativamente afetada pela irradiação UV, indicando que a exposição a UV induziu repressão específica de COL3, em oposição à supressão global da síntese de proteínas. Em seguida, a capacidade de C3vec01 para infectar HDFs imortalizados irradiados com UV e expressar COL3 exógeno foi testada. Aqui, HDFs imortalizados foram expostos à radiação ultravioleta e, em seguida, deixados em recuperação por 24 horas antes da infecção com C3vec01 em um MOI de 0,3 ou 1,48 horas após a infecção, COL3 humano exógeno foi avaliado por análise qRT-PCR. Expressão forte de COL3 foi detectada em HDFs infectados com C3vec01 e irradiados com UV em ambos os MOIs testados (FIG. 22B), indicando que C3vec01 transduziu células foto danificadas de forma eficiente e distribuiu sua carga codificada. Células infectadas simuladas e células infectadas com um vírus contendo a mesma espinha dorsal HSV-1 que C3vec01, mas codificando um efetor mCherry, foram usadas como controles negativos para garantir a especificidade da detecção do transgene.
[00544] Tomados em conjunto, os dados apresentados neste exemplo indicam que o vetor HSV-1 recombinante C3vec01 transduz de forma eficaz vários tipos de células da pele humana, é capaz de resgatar a expressão do
229 / 236 Colágeno 3 em fibroblastos primários envelhecidos colhidos de pacientes idosos e é capaz de salvar a expressão do Colágeno 3 de HDFs danificados por UV. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que os dados apoiam o uso de um HSV recombinante que codifica Colágeno 3 humano para corrigir os defeitos de colágeno da pele envelhecida. Exemplo 7: caracterização in vivo de C3vec01 administrado por via intradérmica
[00545] O exemplo a seguir descreveu experimentos in vivo que estabelecem métodos de administração intradérmica de C3vec01 em animais imunocompetentes jovens e idosos saudáveis.
[00546] Todas as experiências foram realizadas conforme descrito acima, a menos que indicado de outra forma.
[00547] Todos os procedimentos realizados neste exemplo estavam em conformidade com as leis aplicáveis de bem-estar animal e foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) local.
[00548] As costas dos camundongos foram raspadas antes de novas manipulações. C3vec01 (ou controle de veículo) foi então injetado intradermicamente em quatro locais nas costas dos camundongos. Após a infecção e o período de recuperação subsequente, os animais foram sacrificados e os locais de tratamento removidos por meio de uma biópsia por punção de 8 mm. Metade de cada biópsia foi congelada rapidamente em nitrogênio líquido para análise qPCR / qRT-PCR, enquanto a outra metade foi processada para análise de imunofluorescência.
[00549] As amostras de tecido foram processadas para análise de ácido nucleico e proteína conforme descrito acima. Para a coloração de imunofluorescência COL3, um anticorpo primário de coelho anticolágeno humano 3 (Abcam, cat. no. ab7778) e um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor® 488 foram utilizados. As amostras de tecido foram montadas em meio de montagem contendo DAPI para visualizar os núcleos.
230 / 236
[00550] Um estudo de farmacologia in vivo foi realizado em camundongos C57BL / 6 jovens (6-8 semanas de idade) e velhos (aproximadamente 13 meses de idade) para avaliar a expressão mediada por C3vec01 de COL3 humano em animais imunocompetentes após administração intradérmica do vetor. Um total de 10 animais foram usados para este estudo. As costas de cada camundongo foi primeiro raspada e depois injetada intradermicamente com 2x108 PFU/local de C3vec01 (ou controle de veículo) em 4 locais / animal. Os locais injetados foram biopsiados 48 horas ou 1 semana após a dosagem e foram avaliados quanto à expressão de COL3 humano por qPCR e imunofluorescência. A Tabela 5 abaixo fornece uma sinopse do projeto experimental. Tabela 5: projeto do estudo e administração do artigo de teste Volume Localização, Grupo Artigo de Via de Rescisão N Camundongo do artigo número de N°. teste Administração (dia) de teste locais 1 1 Veículo Jovem Intradérmico 100µL Costas, 4 2 2 2 C3vec01 Jovem Intradérmico 100µL Costas, 4 2 3 2 C3vec01 Jovem Intradérmico 100µL Costas, 4 7 4 1 Veículo Antigo Intradérmico 100µL Costas, 4 2 5 2 C3vec01 Antigo Intradérmico 100µL Costas, 4 2 6 2 C3vec01 Antigo Intradérmico 100µL Costas, 4 7
[00551] A distribuição intradérmica de C3vec01 levou a altos níveis de genomas de vetores transduzidos detectados em biópsias de pele colhidas 48 horas após a injeção (FIG. 23A), bem como produziu altos níveis de transcritos de Colágeno 3 humano em camundongos jovens e velhos (FIG. 23B). A detecção baseada em imunofluorescência também mostrou níveis visivelmente aumentados de COL3 humana em toda a derme na pele tratada com C3vec01 em relação à pele tratada com veículo (FIG. 23C), correlacionando-se com os níveis de transcrito.
[00552] Tomados em conjunto, os dados fornecidos neste exemplo indicam que pode transduzir de forma eficaz a pele e expressar o Colágeno 3 humano in vivo após a injeção intradérmica. Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que o estudo in vivo apresentado aqui empresta mais suporte para o uso de HSV-1 como uma nova terapia genética para distribuição de
231 / 236 Colágeno 3 humano no ambiente estético. Exemplo 8: geração e validação de vetores de vírus herpes simplex modificados que codificam lamininas humanas
[00553] Para começar, os vetores de vírus herpes recombinantes foram projetados para incorporar variantes de tipo selvagem ou otimizadas por códon de duas proteínas de laminina humana, LAMB3 ou LAMC2, como descrito no Exemplo 3 acima. Vários isolados foram selecionados para cada tipo de vírus. Para testar se certos isolados eram capazes de expressar a proteína LAMB3 humana codificada de tipo selvagem, células Vero que complementam ICP4 foram plaqueadas em placas de 6 poços e foram infectadas com 12 isolados virais não titulados de vírus que codificam LamB3 de tipo selvagem até a conclusão da infecção. Após a infecção, o RNA foi colhido, o cDNA foi gerado e a expressão de LamB3 de tipo selvagem de cada isolado foi determinada por qPCR (FIG. 24A). Todos os 12 isolados foram capazes de expressar LamB3 humano de tipo selvagem nas células Vero transduzidas em níveis variáveis. A capacidade de 10 desses isolados de expressar LamB3 humano também foi testada por western blot. As células Vero que complementam ICP4 foram semeadas em placas de 6 poços e foram infectadas com 10 isolados virais não titulados de vírus que expressam LamB3 de tipo selvagem até a conclusão da infecção. Um poço de células Vero foi transfectado com um plasmídeo de expressão LamB3 como um controle positivo. Após a infecção, as células foram coletadas por raspagem suave, centrifugadas para coletar os peletes celulares, o meio de cultura foi aspirado e os peletes celulares foram lavados uma vez com PBS. Após a lavagem, cada pelete celular foi ressuspenso em 200 µL de tampão RIPA contendo inibidores de protease, e as ressuspensões foram incubadas a 4ºC por 20 minutos com agitação gentílica a cada 5 minutos. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 17.000 x g por 5 minutos, o sobrenadante foi removido e 4x tampão de amostra de redução de LDS contendo 5% de 2-mercaptometanol foi adicionado a cada sobrenadante
232 / 236 clarificado. As amostras foram então fervidas por 10 minutos antes de serem carregadas em um gel de poliacrilamida Tris-Glicina 4-20%. Após a eletroforese, a proteína foi transferida para uma membrana de PVDF, e a membrana foi bloqueada por 30 minutos em leite a 5% / TBS. Anticorpo primário de coelho anti-LamB3 (Abcam, cat. No. ab128864) foi então adicionado à membrana de PVDF na diluição de 1:1000 em 5% de leite / TBS e incubado durante a noite a RTºC (~ 16 horas). Os blots foram então lavados 3x durante 5 minutos cada com TBS e, em seguida, corados com um anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugado com AP (Sigma, cat. No. A3687) em 5% de leite / TBS por 1 hora a RTºC. As membranas foram então lavadas 3x por 5 minutos cada com TBS, BCIP / NBT foi adicionado e os blots foram desenvolvidos por ~ 10 minutos a RTºC. De acordo com os dados de qPCR, todos os 10 isolados virais foram capazes de expressar o LamB3 humano de tipo selvagem codificado em níveis variáveis (FIG. 24B).
[00554] Os vírus que codificam variantes otimizadas por códon de LamB3 humano também foram testados quanto à sua capacidade de expressar sua carga em células Vero por análise de Western blot. Resumidamente, 10 isolados virais não titulados de vírus otimizados por códnon (CO) que codificam LamB3 foram usados para infectar células Vero, peletes celulares foram coletados, cada pelete foi ressuspenso em tampão RIPA contendo inibidores de protease, e western blots foram conduzidos usando esses lisados celulares, como descrito acima. Todos os 10 isolados virais foram capazes de expressar o LamB3 humano com otimizado por códon codificado em células Vero (FIG. 25).
[00555] Em seguida, quatro isolados virais que codificam LAMB3 de tipo selvagem ou otimizados por códon foram testados quanto à sua capacidade de transduzir células humanas primárias e expressar sua carga. Queratinócitos normais primários imortalizados foram infectados em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1,0 por 48 horas. Células de CHO não transfectadas foram
233 / 236 usadas como controle negativo. A expressão de LamB3 nos queratinócitos humanos infectados foi então examinada por Western blot. Os Western blots foram realizados conforme descrito acima usando um anticorpo primário de coelho anti-LamB3 (Abcam, cat. No. ab 128864). De acordo com os dados gerados usando células Vero, os isolados virais que expressam LamB3 de tipo selvagem e otimizados por códon foram confirmados para transduzir de forma eficaz queratinócitos humanos primários e expressar seu construto codificado em níveis adequados (FIG. 26).
[00556] Para testar se os isolados contendo LamC2 eram capazes de expressar o LAMC2 humano codificado de tipo selvagem ou otimizado por códon, células Vero complementando ICP4 foram plaqueadas em placas de 6 poços e foram infectadas com uma série de isolados virais de tipo selvagem não titulados ou otimizados por códon que expressam LamC2 até a conclusão da infecção. Após a infecção, o RNA foi colhido, o cDNA foi gerado e a expressão de LamC2 de tipo selvagem (FIG. 27A) ou LamC2 otimizado por códon (FIG. 27B) de cada isolado foi determinada por qPCR. 8/12 isolados foram capazes de expressar LamC2 humano de tipo selvagem nas células Vero transduzidas em níveis variáveis, enquanto 3/7 isolados foram capazes de expressar LamC2 humano otimizado por códon. A capacidade de certos isolados de tipo selvagem e otimizados por códon de expressar LamC2 humano foi testada em seguida por Western blot. As células Vero que complementam ICP4 foram semeadas em placas de 6 poços e foram infectadas com isolados virais não titulados até a conclusão da infecção. Um poço de células Vero não foi infectado como controle negativo. Após a infecção, as células foram coletadas por raspagem suave, centrifugadas para coletar os peletes celulares, o meio de cultura foi aspirado e os peletes celulares foram lavados uma vez com PBS. Após a lavagem, cada pelete celular foi ressuspenso em 200 µL de tampão RIPA contendo inibidores de protease, e as ressuspensões foram incubadas a 4ºC por 20 minutos com agitação gentílica a cada 5 minutos. Após a incubação, as
234 / 236 amostras foram centrifugadas a 17.000 x g por 5 minutos, o sobrenadante foi removido e 4x tampão de amostra de redução de LDS contendo 5% de 2- mercaptometanol foi adicionado a cada sobrenadante clarificado. As amostras foram então fervidas por 10 minutos antes de serem carregadas em um gel de poliacrilamida Tris-Glicina 4-20%. Após a eletroforese, a proteína foi transferida para uma membrana de PVDF, e a membrana foi bloqueada por 30 minutos em leite a 5% / TBS. Anticorpo primário de coelho anti-LamC2 (Abcam, cat. No. ab96327) foi então adicionado à membrana de PVDF na diluição de 1:1000 em 5% de leite / TBS e incubado durante a noite a RTºC (~ 16 horas). Os blots foram então lavados 3x durante 5 minutos cada com TBS e, em seguida, corados com um anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugado com AP (Sigma, cat. No. A3687) em 5% de leite / TBS por 1 hora a RTºC. As membranas foram então lavadas 3x por 5 minutos cada com TBS, BCIP / NBT foi adicionado e os blots foram desenvolvidos por ~ 10 minutos a RTºC. De acordo com os dados de qPCR, todos os 9 isolados virais testados também foram capazes de expressar o LamC2 humano codificado (FIG. 27C).
[00557] O isolado viral de expressão de LamC2 otimizado por códon "LGA" foi selecionado para testes adicionais em células humanas. Queratinócitos normais primários imortalizados foram infectados com o isolado de LGA em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 0,3, 1,0 ou 3,0 por 48 horas. Células não infectadas (controle) e células infectadas com vírus que expressam mCherry foram usadas como controle negativo. DNA e RNA foram extraídos dos queratinócitos imortalizados após 48 horas da infecção, e qPCR / qRT-PCR foi realizada (FIGS. 28A-B). Uma boa dose-resposta foi observada para o isolado LGA nos queratinócitos imortalizados, conforme avaliado por cópias do genoma viral detectado por 50 ng de DNA (FIG. 28A). Curiosamente, enquanto uma resposta à dose foi observada no nível de transcrito ao aumentar o MOI de 0,3 para 1,0, nenhum aumento adicional nos níveis de transcrito foi observado ao aumentar de um MOI de 1,0 para 3,0 (FIG.
235 / 236 28B). A expressão de LamC2 nos queratinócitos humanos infectados também foi examinada por Western blot. Os Western blots foram realizados conforme descrito acima (anticorpo primário de coelho anti-LamC2 (Abcam, cat. No. ab96327) foi utilizado). Em linha com a análise do transcrito, uma resposta à dose foi observada ao nível da proteína ao aumentar MOI de 0,3 para 1,0, mas não de 1,0 para 3,0 (FIG. 28C).
[00558] Finalmente, para testar se o isolado “LGA” foi capaz de expressar sua laminina humana quando distribuído in vivo, a expressão de LAMC2 humana foi avaliada por qPCR, qRT-PCR e imunofluorescência após injeção intradérmica em animais. 1x108 PFUs de LGA formulado em PBS + glicerol a 10% (veículo) foi injetado intradermicamente na pele dorsal e na planta da pata de dois camundongos. Um volume equivalente de veículo sozinho foi administrado por via intradérmica à pele dorsal de um camundongo para atuar como um controle negativo. Um esquema dos locais de injeção para os dois animais tratados neste estudo é fornecido na FIG. 29A.
[00559] 72 horas após a administração, uma biópsia de 8 mm de espessura total foi retirada de cada local de tratamento e dividida ao meio. Metade de cada seção foi congelada rapidamente em nitrogênio líquido e subsequentemente processada para análise qPCR e qRT-PCR, a fim de quantificar os números de cópias de DNA LAMC2 (FIG. 29B) e níveis de transcrito (FIG. 29C) na pele dorsal. A metade restante de cada biópsia foi incluída em OCT para imunofluorescência (IF). A expressão de LAMC2 em criosseções foi determinada por análise de imunofluorescência usando um anticorpo LAMC2 anti-humano (Abcam, cat. no. ab96327). Para confirmar que o LAMC2 humano expresso de LGA foi localizado corretamente na região da pele onde a laminina-332 nativa é encontrada, as amostras de pele dorsal também foram contrastadas para laminina-332 de camundongo (pKal). A administração intradérmica de LGA levou à transdução bem-sucedida da pele do camundongo, com expressão robusta do transgene humano codificado na
236 / 236 camada correta da epiderme.
A avaliação histológica não demonstrou infiltrado inflamatório no local tratado, demonstrando a segurança desta terapia.
Tomados em conjunto, os dados apresentados neste exemplo demonstram que (1) vetores de HSV podem ser projetados com sucesso para expressar de forma robusta proteínas de laminina humana (especificamente, a subunidade β ou γ da laminina-332 humana), (2) um vetor baseado em HSV ( LGA) poderia distribuir com sucesso uma subunidade laminina-332 humana in vivo, e (3) a subunidade laminina-332 humana recombinante foi expressa e localizada na região apropriada da epiderme dos animais tratados.

Claims (75)

1 / 13 REIVINDICAÇÕES
1. Genoma de herpes vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira proteína cosmética.
2. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes recombinante compreende duas ou mais cópias do primeiro polinucleotídeo.
3. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes recombinante é competente para replicação.
4. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes recombinante é defeituoso para replicação.
5. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes recombinante é selecionado do grupo que consiste em um genoma do vírus herpes simplex recombinante, um genoma do vírus da varicela zóster recombinante, um genoma do citomegalovírus humano recombinante, um genoma do herpesvírus 6A recombinante, um genoma do herpesvírus 6B recombinante, um genoma do herpesvírus 7 recombinante, um genoma do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi recombinante e quaisquer derivados dos mesmos.
6. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes recombinante é um genoma do vírus herpes simplex recombinante.
7. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma do vírus herpes simplex do tipo 1
2 / 13 recombinante (HSV-1), um genoma do vírus herpes simplex do tipo 2 recombinante (HSV-2) ou quaisquer derivados dos mesmos.
8. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante é um genoma do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) recombinante.
9. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação.
10. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mutação de inativação está em um gene do vírus herpes simplex.
11. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene do vírus herpes simplex.
12. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o gene do vírus herpes simplex é selecionado do grupo que consiste em Proteína Celular Infectada (ICP) 0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, timidina quinase (tk), Região Única Longa (UL) 41 e UL55.
13. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP4.
14. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22.
3 / 13
15. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41.
16. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP0.
17. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27.
18. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 17, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes simplex recombinante compreende o primeiro polinucleotídeo dentro de um ou ambos os loci do gene viral ICP4.
19. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína cosmética é selecionada do grupo que consiste em uma primeira proteína de colágeno, uma primeira proteína de fibronectina, uma primeira proteína de elastina, uma primeira proteína de lumicano, uma primeira proteína de vitronectina, uma primeira proteína de receptor de vitronectina, uma primeira proteína de laminina, uma primeira proteína neuromoduladora e uma primeira proteína de fibrilina.
20. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína cosmética compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos
4 / 13 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15- 21 e 53-64.
21. Genoma de herpes vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína cosmética é uma proteína de matriz extracelular estrutural.
22. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína de colágeno é uma proteína de colágeno humana.
23. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, em que a primeira proteína de colágeno é selecionada do grupo que consiste em polipeptídeo de cadeia alfa- 1(I) de colágeno (COL1-1), polipeptídeo de cadeia alfa-2(I) de colágeno (COL1-2 ), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(II) de colágeno (COL2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(III) de colágeno (COL3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IV) de colágeno (COL4-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(IV) de colágeno (COL4-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IV) de colágeno (COL4-3), polipeptídeo de cadeia alfa-4(IV) de colágeno (COL4-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(IV) de colágeno (COL4-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(IV) de colágeno (COL4-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(V) de colágeno (COL5-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (V) de colágeno (COL5-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(V) de colágeno (COL5-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VI) de colágeno (COL6-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2(VI) de colágeno (COL6-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(VI) de colágeno (COL6-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-4(VI) de colágeno (COL6-4), um polipeptídeo de cadeia alfa-5(VI) de colágeno (COL6-5), um polipeptídeo de cadeia alfa-6(VI) de colágeno (COL6-6), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(VIII) de colágeno (COL8), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(IX) de colágeno (COL9-1), um polipeptídeo de cadeia alfa-2 (IX) de colágeno
5 / 13 (COL9-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-3(IX) de colágeno (COL9-3), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(X) de colágeno (COL10), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XI) de colágeno (COL11-1), um polipeptídeo de cadeia alfa- 2(XI) de colágeno (COL11-2), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XII) de colágeno (COL12), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIII) de colágeno (COL13), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIV) de colágeno (COL14), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XV) de colágeno (COL15), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVI) de colágeno (COL16), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XVII) de colágeno (COL17), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XVIII) de colágeno (COL18), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XIX) de colágeno (COL19), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XX) de colágeno (COL20), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXI) de colágeno (COL21), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXII) de colágeno (COL22), um polipeptídeo de cadeia alfa- 1(XXIII) de colágeno (COL23), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXIV) de colágeno (COL24), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXV) de colágeno (COL25), um polipeptídeo de cadeia alfa-1(XXVI) de colágeno (COL26), um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVII) de colágeno (COL27) e um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (XXVIII) de colágeno (COL28).
24. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína de colágeno é selecionada do grupo que consiste em COL1- 1, COL1-2, COL3, COL4-1, COL4-2, COL6-1 e COL17.
25. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína de colágeno humana compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 17.
6 / 13
26. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína cosmética não é um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) do colágeno (COL7).
27. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo consiste essencialmente em ou consiste na primeira proteína cosmética.
28. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende: (a) a primeira proteína cosmética; (b) uma outra proteína cosmética; e (c) um polipeptídeo ligante que liga (a) a (b).
29. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ligante é um polipeptídeo ligante clivável.
30. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 28 ou reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ligante compreende uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 28-31.
31. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-30, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína cosmética e a outra proteína cosmética são diferentes.
32. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-31, caracterizado pelo fato de que o primeiro polinucleotídeo codifica um mRNA policistrônico compreendendo:
7 / 13 (a) uma primeira estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica o primeiro polipeptídeo; (b) uma segunda ORF que codifica uma proteína cosmética adicional; e (c) um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) separando (a) e (b).
33. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica IRES tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23.
34. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 32 ou reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a primeira proteína cosmética e a proteína cosmética adicional são diferentes.
35. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-34, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes recombinante compreende ainda um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína cosmética.
36. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda proteínas cosméticas são diferentes.
37. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-36, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus herpes recombinante tem citotoxicidade reduzida quando introduzido em uma célula alvo, em comparação com um genoma do vírus herpes de tipo selvagem correspondente.
38. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula da epiderme e/ou derme.
8 / 13
39. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 37 ou reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula humana.
40. Genoma do vírus herpes recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37-39, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é um fibroblasto.
41. Vírus herpes, caracterizado pelo fato de que compreende o genoma do vírus herpes recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40.
42. Vírus herpes, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes é competente para replicação.
43. Vírus herpes, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes é defeituoso para replicação.
44. Vírus herpes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes tem citotoxicidade reduzida em comparação com um vírus herpes de tipo selvagem correspondente.
45. Vírus herpes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes é selecionado do grupo que consiste em um vírus herpes simplex, um vírus varicela zoster, um citomegalovírus humano, um herpesvírus 6A, um herpesvírus 6B, um herpesvírus 7 e um vírus de Kaposi herpesvírus associado ao sarcoma.
46. Vírus herpes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes é um vírus herpes simplex.
47. Vírus herpes recombinante, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes simplex é um vírus herpes
9 / 13 simplex tipo 1 (HSV-1), um vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) ou quaisquer derivados dos mesmos.
48. Composição, caracterizada pelo fato de compreende: (a) o genoma do vírus herpes recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40 ou o vírus herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47; e (b) um excipiente.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a composição é estéril.
50. Composição, de acordo com a reivindicação 48 ou reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a composição é adequada para administração tópica, transdérmica, subcutânea, intradérmica, oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, retal, vaginal, uretral, inalada, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intraperitoneal, transmucosa, intravítrea, subrretiniana, intra-articular, peri-articular, local ou epicutânea.
51. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizada pelo fato de que a composição é adequada para administração intradérmica.
52. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 51, caracterizada pelo fato de que a composição é adequada para injeção superficial.
53. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição cosmética.
54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 53, caracterizada pelo fato de que a composição é um produto para o cuidado da pele.
55. Vírus herpes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou composição, de acordo com qualquer uma das
10 / 13 reivindicações 48 a 54 caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.
56. Vírus herpes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54 caracterizado pelo fato de que é para uso em uma terapia.
57. Uso do vírus herpes, como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 54 caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar um ou mais sinais ou sintomas de envelhecimento dermatológico.
58. Método para intensificar, aumentar, ampliar e/ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas da matriz extracelular dérmica em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus herpes, como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 54.
59. Método para intensificar, aumentar, ampliar e/ou suplementar os níveis de uma ou mais proteínas de colágeno em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 54.
60. Método para intensificar, aumentar, ampliar e/ou suplementar o tecido mole de um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus herpes, como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 54.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a composição é injetada no tecido mole do sujeito.
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62. Método para melhorar a condição, qualidade e/ou aparência da pele em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 54.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada a um ou mais locais de dano solar ou outra exposição aos raios ultravioleta, textura áspera, flacidez da pele, rugas ou qualquer combinação dos mesmos.
64. Método para reduzir o aparecimento de uma ou mais depressões superficiais na pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 54.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais depressões superficiais na pele são selecionadas do grupo que consiste em dobras nasolabiais, pés de galinha, linhas de expressão, linhas de preocupação, cicatrizes, linhas glabelares, ptose de sobrancelha, cavidades lacrimais, linhas nasojugal, linhas de coelho, ptose da bochecha / rosto médio, linhas de marionete, ondulações de papoula, linhas de sorriso, linhas de gargalhada, vincos do queixo, linhas do pescoço, faixas de platisma e quaisquer combinações dos mesmos.
66. Método para aumentar e/ou melhorar pelo menos um de textura, suavidade, elasticidade ou tensão da pele de um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 47 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 48-54.
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67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 66, caracterizado pelo fato de que a pele do sujeito é uma pele envelhecida.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 67, caracterizado pelo fato de que a pele do sujeito foi danificada devido à exposição à luz ultravioleta.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 68, caracterizado pelo fato de que a pele do sujeito é enrugada.
70. Método para diminuir um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 41-47 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 48-54.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a diminuição de um ou mais sinais dermatológicos de envelhecimento é selecionada do grupo que consiste em: (a) tratamento, redução e/ou prevenção de linhas finas e/ou rugas; (b) redução do tamanho dos poros da pele; (c) melhora na espessura da pele, maciez e/ou esticamento; (d) melhora na maciez, elasticidade e/ou maciez da pele; (e) melhora no tom, brilho e/ou clareza da pele; (f) melhora na produção de procolágeno e/ou colágeno; (g) melhora da textura da pele e/ou promoção da retexturização; (h) melhora na aparência dos contornos da pele; (i) restauração do brilho e/ou da claridade da pele; (j) melhora da aparência da pele diminuída pelo envelhecimento e/ou menopausa; (k) melhora na hidratação da pele; (l) aumento da elasticidade e/ou resiliência da pele; (m) tratamento, redução e/ou prevenção ou flacidez da pele; (n) melhora da firmeza da pele; (o) redução de manchas pigmentares, manchas na pele e/ou cicatrizes); (p) melhoria das propriedades ópticas da pele por difração de luz ou reflexão; ou (q) quaisquer combinações dos mesmos.
13 / 13
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 71, caracterizado pelo fato de que o sujeito é humano.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 72, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes ou composição é administradotopicamente, transdermicamente, subcutaneamente, epicutaneamente, intradermicamente, oralmente, sublingualmente, bucalmente, retalmente, vaginalmente, por via intra-uretral, intravenosamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, por via intraóssea, intracardialmente, intraperitonealmente, por via transmucosa, por via intravítrea, sub- retinianamente, intra-articularmente, peri-articularmente, localmente ou via inalação para o sujeito.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 73, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes ou composição é administrado intradermicamente ao sujeito.
75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 74, caracterizado pelo fato de que o vírus herpes ou composição é administrado por injeção superficial.
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