KR101208994B1

KR101208994B1 - 세포 투과성 ｒｐＳ3 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101208994B1
Application number: KR1020100101645A
Authority: KR
Inventors: 최수영; 박진서; 음원식; 김대원; 김준; 강태천; 한규형; 김덕수
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2012-12-06
Also published as: KR20120040308A

Abstract

본 발명은 rpS3와 단백질 수송도메인이 공유결합된 rpS3 융합 단백질을 형성함으로써 세포에 적용시킬 때 용이하게 세포 내로 투과 가능한 rpS3 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15～30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있으며, 대조군과 비교할 때 원활히 세포 내로 침투하여 염증 유발된 피부의 염증을 완화하고, 부종을 완화하는 효과를 거두었다.

Description

세포 투과성 ｒｐＳ3 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 조성물{A composition containing cell-transducing rpS3 fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders}

본 발명은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염의 발병은 국내의 경우 약 18?20%의 발생빈도를 보이며, 선진국에서도 전 인구의 약 20?40%의 환자 발생이 보고되었다. 선진국의 경우 치료비용이 년 약 1-2조원에 이르며 국내는 약 1000억 원 이상의 규모로서, 아토피 피부염 예방 및 치료에 막대한 경제적 손실이 발생하고 있다. 아토피 피부병은 발병 후 지속적인 장기간 동안의 치료가 요구되며, 또한 현재까지 증상과 병력에 의존하는 진단 외에 아토피 피부염의 병리유전학적(pathogenomic) 기준에 의존하는 진단법이 사실상 개발되어 있지 않다. 이런 점에 근거하여 새로운 진단법과 치료약제의 개발은 부가가치가 막대하다.

일부 아토피 피부염환자는 타인과 어울리기 싫어하는 대인 기피증이 있어 학교 및 사회생활에 크게 영향을 준다. 환자 자신의 소외감, 불안증, 수면장애뿐만 아니라 환자 부모들도 수면장애, 정서적인 장애, 피곤함 등으로 가족 및 사회생활에 있어 막대한 지장을 초래한다.

아토피 피부병의 치료로는 증세에 따라 다양한 기존의 치료 방법이 현재까지 사용되고 있으며 크게 국소요법, 전신투약요법, 자외선 등의 물리적 요법으로 대변된다. 그러나 치료에 있어서 사용되고 있는 국소 및 전신 약제의 장기 투여는 반대급부로 후유증 및 부작용을 동반해서 치료가 성공적일지라도 치료 중단 시 곧 병변이 재발되는 어려움이 있다. 또한 현재 선진국에서 개발되어 임상 시험 중인 여러 약재의 경우도 효과적이긴 하나 전신적 투여 시 의료비용의 부담이 크며, 장기간 사용 시 부수적으로 야기되는 전신면역 억제 현상으로 인해 또 다른 질환을 발생시킬 수 있는 단점이 있다.

효율적인 아토피 피부염 예방 및 치료를 위해서는 기존의 치료법과 상이한 특이적 치료법의 개발이 요구된다. 효과적인 치료방법의 확립은 환자 개인뿐 아니라 사회적인 비용을 획기적으로 줄일 수 있을 것으로 생각된다. 이와 아울러 기존의 치료제의 단점을 개선하고 약효가 뛰어난 약제의 개발은 치료 효과의 개선, 치료기간의 단축 및 비용의 절감을 통하여 많은 파급효과를 줄 것이다.

아토피성 피부면역 질환을 포함한 면역질환 진단시장의 세계규모는 1997년도 기준으로 약 13억불에 이르며 2005년에는 16억불에 이를 것으로 추정되고 있다.

국내는 피부과 내원 환자 중 아토피 피부염이 수위인 것을 감안할 때 약 1000억 원 이상의 규모이며 아토피 피부염 치료 및 예방을 위하여 의사 처방 없이 손쉽게 제재를 구입하는 비용이 약 100?200억 원이라고 보고되었다.

또한, 아토피 화장품 시장은 국내에서 2003년에 400억 원대로 확대되고 향후 3-5년 이내에 1천억 원대의 시장을 형성할 것으로 전망하고 있다.

rpS3(Ribosomal proteinS3)는 리보솜의 구성성분으로 40S 서브유닛의 외부 표면에 위치하며 개시인자(initiation factor) eIF2와 eIF3에 교차연결(cross-link)되어 있다. rpS3는 N-말단 부위에 핵 위치화 신호(nuclear localization signal)를 가지고 있는데, 이것은 rpS3의 세포질에서의 기능과 핵에서의 회복(repair) 기능을 가지고 있다는 것을 의미한다. 또한, 많은 리보솜 단백질들은 복제, 전사, RNA 프로세싱, DNA 회복(repair), 악성 형질전환(malignant transformation) 등의 두 번째 기능을 가지고 있다. 그러나, 지금까지 rpS3와 염증과의 연관관계에 대해서는 아직 확실하게 밝혀지지 않은 상태이다.

현재 질병 치료 분야에서 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료이다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 가지 문제점이 있다.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600 달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 PEP-1 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. PEP-1 펩타이드는 21개의 아미노산 (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV)으로 이루어졌고, 3개의 도메인 (hydrophobic, spacer, hydrophilic domain)을 갖고 있다. 지금까지, PEP-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 PEP-1 펩타이드와 외부 단백질을 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 치료 단백질을 비롯한 모든 종류의 단백질이 PEP-1에 의해 세포 내로 운반되는지는 아직까지 정확히 밝혀지지 않았다.

따라서, 본 발명은 상기 염증 질환의 효과적인 예방제, 치료제 또는 염증 개선용 화장료를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 자연상태의 단백질을 세포 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드를 사람 rpS3 단백질에 융합시켰고, 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제된 융합 단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 세포 내로 운반되는 것을 배양된 피부 세포 및 조직 실험을 통하여 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 피부 세포 내로 운반되며 생물학적인 활성 즉, 염증에 의하여 피부가 두꺼워지는 현상을 효과적으로 억제함을 밝혀냈다.

좀더 구체적으로 설명하면, 본 발명자들은 먼저 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 rpS3 융합 단백질 발현벡터를 제조하였다. 이 발현벡터는 인간 rpS3 cDNA, PEP-1 펩타이드 (21 아미노산) 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni² ⁺-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. 과대발현 및 정제된 rpS3 융합 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 정제된 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 배양된 피부 세포에 원활하게 운반되는 것을 형광염색으로 확인하였고, 세포 내로 투과된 rpS3 융합 단백질은 세포 내에서 최소 48시간 지속적으로 유지되는 것을 알 수 있었다. 또한 세포 내로 투과된 rpS3 융합 단백질은 피부 두께 및 중량을 효과적으로 감소시키고 있음을 알 수 있었다.

이러한 결과는 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 rpS3 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 세포 투과성rpS3 융합 단백질은 염증과 관련하여 피부 세포의 보호 등에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.

세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태, 경구투여, 도포제 형태 등으로 제형화할 수 있다. 예를 들면 액제, 시럽제, 캡슐제, 과립제, 분말, 연고, 에멀젼, 겔, 크림 등으로 제제화할 수 있으며, 이를 여러 경로로 투여할 수 있다. 여러 가지 제형 중 예컨대, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 피하 투여, 근육 투여 또는 경구투여, 정맥 투여, 피부 도포 등으로 투여할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명자들은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 피부 세포에 침투실험한 결과, 세포에 원활하게 침투하고, 염증을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 약제 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명은 rpS3 단백질을 피부 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 rpS3 단백질 분자의 세포내 전달은 rpS3에 15～30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 PEP-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 PEP-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, PEP-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15～30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일?유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증 질환 치료, 예방 목적의 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 비롯한 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 세포 투과성 rpS3 융합 단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화할 수 있다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

" 세포 투과성 rpS3 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 rpS3 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 rpS3를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "PEP-1-rpS3", "rpS3 융합 단백질" , "세포 투과성 rpS3 융합 단백질" 또는 "PEP-rpS3"와 혼용하였다. 또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다. 구체적으로 본 발명에서는 피부 세포를 의미한다.

본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 PEP-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.

본 명세서의 "목표 단백질"은 PEP-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미하며, 구체적으로는 rpS3를 의미한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 15～30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 rpS3 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) rpS3 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인이 rpS3 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 rpS3 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포 투과성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 융합 단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 PEP-1 단백질 수송 도메인과 융합한 rpS3 융합 단백질은 피부 세포 내로 원활히 운반되며, 세포 내에서 최소 48시간 이상 그 활성을 유지하며, 염증을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

도 1은 PEP-1-rpS3 융합 단백질 제조를 위한 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 발현된 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 정제 및 웨스턴 블랏팅한 결과이다. 세포에서 추출한 단백질 추출물 및 정제한 단백질을 12% SDS-PAGE로 전개하여 쿠마시 브릴리언트 블루로 단백질 염색하였고(A), 항-래빗 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏팅하였다(B). A와 B에서 각 레인은 다음과 같다. 레인 1: 유도되지 않은 pPEP-1-rpS3, 레인 2: 유도된 pPEP-1-rpS3, 레인 3: 정제된 pPEP-1-rpS3.
도 3은 TPA(Tetradecanoylphorbol Acetate)로 유도한 귀 염증에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 효과를 나타낸다. 마우스의 귀에 TPA(1㎍/한쪽 귀)를 하루 한 번씩 3일간 처리한 다음, 3일간 TPA 처리 한 시간 후 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 국소 도포하였다. 귀 두께(A)와 평균 중량(B)을 측정하였고, 귀 피부 절편을 제조하여 헤마토자일린 및 에오신 염색하였다(C). 각 도면에서 1 레인은 정상대조군, 2 레인은 대조군(염증 유발), 3 레인은 PEP-1-rpS3 융합 단백질 처리군, 4 레인은 rpS3 단백질 처리군이다.
도 4는 마우스 귀에서 TPA에 의해 유도된 싸이토카인 IL-6(A), TNF-α(B), IL-1β(C)에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 저해 효과를 나타낸다. 각 도면에서 1 레인은 정상대조군, 2 레인은 대조군(염증 유발), 3 레인은 PEP-1-rpS3 융합 단백질 처리군, 4 레인은 rpS3 단백질 처리군이다.
도 5는 마우스 귀에서 TPA-에 의해 유도된 싸이토카인 및 COX-2 발현에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 저해효과를 나타낸다. 마우스의 귀에 TPA(1㎍/한쪽 귀)를 하루 한 번씩 3일간 처리한 다음, 3일간 TPA 처리 한 시간 후 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 국소 도포하였다. 귀 생검으로부터 총 RNA를 추출하였다. IL-6, TNF-α, IL-1β 및 β-액틴 mRNA를 특이적 프라이머로 RT-PCR하여 분석하였다(A). 마우스 귀 추출물을 제조하여 COX-2 단백질 발현을 분석하였다(B). 1 레인은 정상대조군, 2 레인은 대조군(염증 유발), 3 레인은 PEP-1-rpS3 융합 단백질 처리군, 4 레인은 rpS3 단백질 처리군이다.
도 6은 마우스 귀에서 TPA로 유도되는 NF-κB 및 MAPK 활성화에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 저해효과를 나타낸다. 마우스의 귀에 TPA(1㎍/한쪽 귀)를 하루 한 번씩 3일간 처리한 다음, 3일간 TPA 처리 한 시간 후 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 국소 도포하였다. 1κBα 분해는 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다(A). 귀 생검 추출물을 제조하고 MAPK 활성화를 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다(B). 1 레인은 정상대조군, 2 레인은 대조군(염증 유발), 3 레인은 PEP-1-rpS3 융합 단백질 처리군, 4 레인은 rpS3 단백질 처리군이다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 세포 투과성 rpS3 융합 단백질로서 "PEP-1-rhEGF" 융합 단백질을 위주로 실시예 및 그 결과를 기재하였으나, rpS3 단백질의 C-말단에 PEP-1이 공유결합된 rpS3-PEP-1 융합 단백질(서열번호 9) 및 rpS3의 N-말단과 C-말단에 PEP-1이 공유결합된 PEP-1-rpS3-PEP-1 융합 단백질(서열번호 11)도 "rpS3 융합 단백질" 범주에 속하며, 각 실시예에서 "PEP-1-rpS3" 융합 단백질과 거의 유사한 정도(82~95%)의 결과를 나타내었다.

<재료>

제한 효소와 T4 DNA 연결효소(ligase)는 Promega (USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머레이즈는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로삼아세트산 세파로즈 슈퍼플로우(Ni-nitrilo- triactic acid sepharose superflow)는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 사람 rpS3(ribosomal protein S3) cDNA는 중합효소 연쇄반응 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

< 실시예 1: PEP -1- rpS3 융합 단백질 발현벡터 제조 및 형질변환>

세포 내로 목표 단백질인 인간 rpS3 단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였다.

먼저, PEP-1-rpS3 융합 단백질을 생산하기 위해 PEP-1 펩타이드 (KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV; 21 아미노산)가 포함된 pET-PEP 발현벡터를 제조하였다. PEP-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드 (위쪽 사슬, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'; 아래쪽 사슬, 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3')를 Nde-Xho 제한효소로 자른 pET-15b에 연결(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 rpS3 cDNA의 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 5'-CTCGAGATGGCAGTGCAAATATCCAAGAAG-3'로 Xho I 제한부위를 포함하고 있으며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 5'-GGATCCTTATGCTGTGGGGACTGGCTGGGG-3'로 BamHI 제한부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열 순환기(thermal cycler, Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 반응튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결한 다음, 세포(competent cell)를 형질변환시키고, 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법(alkaline lysis method)으로 분리하였다. 사람 rpS3 cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho과 BamH로 절단한 다음 PEP 발현 벡터에 삽입하였다. PEP-1-rpS3로 형질변환된 E. coli BL21 (DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎖ LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

"rpS3-PEP-1" 융합 단백질 및 "PEP-1-rpS3-PEP-1" 융합 단백질 제조를 위한 발현 벡터(서열번호 8 및 서열번호 10)도 위와 유사한 방법으로 제조하였다.

<실시예 2: PEP -1- rpS3 융합 단백질 발현 및 정제>

본 발명자들이 제조한 인간 rpS3 cDNA가 포함되어 있는 E. coli BL21 (DE3) 세포 (PEP-1-rpS3)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200 rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 0.5~1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5와 1 mM 되게 한 다음 30℃에서 12 시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5㎖ 결합 완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni² ⁺-니트릴로삼아세트산 세파로즈 슈퍼플로우 (Ni² ⁺-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. 정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.

< 실시예 3: TPA 에 의해 유도된 피부 염증 및 조직분석>

6~8주된 웅성 ICR 마우스를 한림대학교 실험동물센터에서 구입하였다. 동물은 일정 온도(23℃) 및 일정 상대 습도(60%)에서 12시간 빛: 12시간 어둠 조건으로 사육하였고, 먹이와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 이 실험에 사용된 모든 동물은 실험동물 관리준칙(Principles of Laboratory Animal Care)(NIH publication No. 86-23) 및 한림 의학 센터 연구 동물 관리 및 이용 위원회에 의해승인된 취급 및 실험 프로토콜에 따라 처리하였다.

피부 염증은 각 마우스(n=5)의 오른쪽 귀에 TPA를 국소 도포하여 유도하였다(Song et al.,2008). TPA(1.0 ㎍)를 20㎕ 아세톤에 용해시킨 다음 마우스 귀의 안쪽과 바깥쪽에 3일 동안 매 24시간 마다 도포하였다. PEP-1-rpS3 융합 단백질(3μM) 및 대조군 rpS3 단백질(3 μM)은 TPA 처리 후 1시간이 경과하면 마우스 귀에 국소 도포하였다. 최종 도포 후 디지털 두께 측정기(Mitutoyo, Tokyo, Japan)와 직경 5-mm 펀치를 이용하여 귀 두께와 중량을 측정하였다. 조직학적 분석을 위하여 귀 생검을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시키고, 파라핀에 깊숙히 박은 다음 5㎛ 두께로 절편을 제조하여 헤마토자일린과 에오신으로 염색하였다. 염색된 조직 절편은 AXIOIMAGER M1 장치를 갖춘 표준 밝은 시야 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 염증 세포의 침윤을 분석하였다.

< 실시예 4: 싸이토카인 측정>

귀 생검 시료는 프로테이즈 저해제 칵테일(Sigma-Aldrich)을 함유한 조직 단백질 추출제 완충용액에 넣고 과격하게 균질화한 다음 0.1% Triton X-100 존재 하에 15분간 차가운 상태에서 배양하였다. 각 균질액은 10,000×g로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액 중의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 (ELISA) 키트(R&D Systems, Minneapolis,MN,USA)를 이용하여 측정하였다.

< RT - PCR 분석>

트리졸(Trizol) 시약 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 귀 생검 시료의 총 RNA를 측정하였다. 역전사 중합효소(1000 U)와 0.5㎍/㎕의 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 총 RNA(2㎍)로부터 cDNA를 합성하였다. PCR에 의한 cDNA 합성에는 다음과 같은 특이한 프라이머들이 이용되었다. COX-2 안티센스 프라이머, 5'-TGGACGAGGTTTTTCCACCAG-3'; COX-2 센스 프라이머, 5'-CAAAGGCCTCCATTGACCAGA-3'; TNF-α 안티센스 프라이머, 5'-TGGCACCACTAGTTGGTTGTCTTT-3'; TNF-α 센스 프라이머, 5'-AAGTTCCCAAATGGCCTCCC-3'; IL-1β 안티센스 프라이머, 5'-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3'; IL-1β 센스 프라이머, 5'-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3'; IL-6 안티센스 프라이머, 5'-TGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3'; IL-6 센스 프라이머, 5'-CAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTT-3'; 및 베타-액틴 안티센스 프라이머, 5'-GGACAGTGAGGCCAGGATGG-3'; 베타-액틴 센스 프라이머, 5'-AGTGTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'. PCR을 수행한 후 PCR 산물은 1% 아가로즈 젤 상에서 분리한 후 에티듐 브로마이드 염색하고 자외선 하에서 관찰하였다.

<결과 1: PEP -1- rpS3 융합 단백질의 과대발현 및 정제>

PEP-1-rpS3 융합 단백질을 과대발현시키기 위해 사람 rpS3 cDNA, PEP 펩타이드 (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV; 21 아미노산) 및 6개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 PEP-1-rpS3 발현 벡터를 제조하였다(도 1).

IPTG로 융합 단백질의 과대발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2는 PEP-1-rpS3의 과대발현과 정제된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 단백질 밴드(도 2A)와 웨스턴 블랏으로 확인한 밴드(도 2B)이다. 도 2A의 레인 2는 0.5 mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합 단백질을 나타내고 있으며, 대조군인 레인 1 (pET-15b 벡터)과 비교하여 매우 높은 농도의 융합 단백질이 과대발현되었음을 잘 보여주고 있다.

PEP-1-rpS3 융합 단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피 (immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합 단백질을 자연상태로 순수하게 (순도 >95%) 정제할 수 있었다(도 2A). 레인 3은 정제된 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 확인한 결과이다.

과대발현 및 정제된 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한 번 확인하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 rpS3 또는 6x 히스티딘 항체에 반응하는 PEP-1-rpS3 밴드는 도 2A의 단백질 밴드와 동일한 위치에서 관찰되었다.

<결과 2: TPA 에 의해 유도된 마우스 귀 부종에 대한 PEP -1- rpS3 융합 단백질의 영향>

본 발명자들은 본 발명에 앞서 PEP-1-rpS3 융합 단백질이 피부 세포로 원활하게 전달되며, 자외선에 노출된 피부 세포의 DNA 손상을 현저히 감소시킨다는 것을 밝힌바 있다(Choi et al., 2006). 본 발명에서는 TPA에 의해 유도된 피부 염증에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 영향을 시험하였다.

마우스 귀에 3일간에 걸쳐 TPA를 세 번 도포하여 염증성 세포 침윤(inflammatory cell infiltration)을 유도하였고, 이에 따라 귀 피부의 두께 및 중량이 증가하였다(도 1). 마우스 귀에 3일간 하루 한 번씩 TPA를 도포한 다음 한 시간 후 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 국소 도포한 결과 TPA에 의해 유도된 귀 부종은 현저히 개선되었다. 대조군으로서 단백질 수송 도메인과 결합하지 않은 rpS3 단백질을 국소 도포한 결과, 귀 부종의 두께나 중량에 전혀 영향을 미치지 못하였다.

<결과 3: TPA 에 의해 유도된 싸이토카인에 대한 PEP -1- rpS3 융합 단백질의 영향>

TNF-α, IL-1β 및 IL-6과 같은 친염증성 싸이토카인(Pro-inflammatory cytokines)은 염증 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(De Vry et al.,2005; Ha et al., 2006; Murakawa et al.,2006). 본 발명자들은 TPA로 처리된 마우스 귀에서 친염증성 싸이토카인 생산에 미치는 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 영향을 시험하였다. TPA만을 단독 처리한 이후에는 싸이토카인 레벨이 증가하였다. 대조군으로서 rpS3 단백질을 처리한 경우에는 TPA 처리한 양성 대조군과 비교하여 싸이토카인 레벨에 아무런 변화가 나타나지 않았으나, PEP-1-rpS3 융합 단백질을 처리한 경우에는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 싸이토카인 레벨이 현저히 감소하였다(도 2). 친염증성 유전자 발현에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 영향을 시험하기 위하여 동일 조건에서 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 TPA에 의해 유도되는 상기 친염증성 싸이토카인 mRNA 발현을 현저히 억제하였다(도 3A).

<결과 4: TPA 에 의해 유도된 COX -2 발현에 대한 PEP -1- rpS3 융합 단백질의 영향>

PEP-1-rpS3 융합 단백질이 마우스에서 COX-2 발현을 억제할 수 있는지를 시험하기 위하여 TPA 처리된 마우스 귀에 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 국소 도포하고 귀 생검을 이용하여 COX-2 발현을 분석하였다. 웨스턴 블랏팅 결과 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 COX-2 단백질 발현 레벨을 현저히 억제하였다. 그러나, 대조군 rpS3 단백질은 아무런 영향을 미치지 않았다(도 3B). 이와 같은 결과는 PEP-1-rpS3 융합 단백질이 TPA에 의해 유도된 COX-2 및 싸이토카인 발현 수준을 억제함을 의미한다.

<결과 5: TPA 에 의하여 유도되는 NF - kB 및 MAPK 활성화에 대한 PEP -1-rpS3 융합 단백질의 영향>

NF-kB 및 MAPK의 활성화는 친염증성 싸이토카인 반응과 같은 많은 면역 반응에 있어서 중요하다(Gayathri et al.,2007; Kyriakis and Avruch, 2001). 그리하여, p65 이동(translocation)과 같이 TPA에 의해 유도되는 NF-kB 활성화 신호 연쇄반응에 미치는 PEP-1- rpS3 융합 단백질의 조절 효과를 시험하였다. 국소 적용된 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 TPA에 의해 유도되는 p65의 세포질로부터 핵으로의 이동을 저해하였다(도 4A). 그러나, 대조군 rpS3 단백질은 아무런 영향을 미치지 않았다.

또한, 본 발명자들은 p38 및 ERK 단백질 키나아제와 같은 MAPKs 활성에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 조절 효과를 시험하기 위하여 TPA로 처리된 마우스 귀에 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 국소 도포하고 귀 생검으로부터 추출한 세포 추출물을 웨스턴 블랏하여 MAPK 활성화를 분석하였다. 이때 항체는 MAPK에 대한 인산-특이적 항체(phosphor-specific antibodies)를 이용하였다. 도 4B와 같이 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 TPA에 의해 유도되는 ERK와 p38 MAPK의 인산화에 의한 활성화를 현저히 저해하였다. PEP-1-rpS3 융합 단백질은 JNK 활성화에는 아무런 영향을 미치지 않았다(데이터 미기재).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

PEP-1 단백질 수송 도메인이 rpS3 단백질의 N-말단 및 C-말단 중 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) rpS3 융합 단백질을 주요성분으로 함유하는 피부 염증질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 세포 투과성 rpS3 융합 단백질은 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
PEP-1 단백질 수송 도메인이 rpS3 단백질의 N-말단 및 C-말단 중 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) rpS3 융합 단백질을 주요성분으로 함유하는 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 세포 투과성 rpS3 융합 단백질은 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.