KR20140144829A - Ｆｋ506 결합 단백질 융합 단백질을 함유하는 다낭신 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상염색체 우성 다낭신 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 다낭신 세포 내로 투과가 가능한 FK506 결합단백질의 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 다낭신 예방 또는 질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

ＦＫ506 결합 단백질 융합 단백질을 함유하는 다낭신 예방 및 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for autosomal dominant polycystic kidney disease containing FK506 binding protein fusion protein}

본 발명은 다낭신 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 조직 및 세포내 투과가 가능한 FK506 결합단백질의 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 다낭신 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상염색체 우성 다낭신 (Autosomal dominant polycystic kidney disease : ADPKD)은 500~1,000명당 최소 1명의 발병률을 나타내는 가장 흔한 유전병이다. 상염색체 우성 다낭신은 건강한 사람과 비교할 때 양쪽 신장에 액체가 찬 낭포가 많이 형성되고 신장이 4~8배 커지는 것으로 특징지을 수 있다. 현재까지는 다낭신에 효과적인 임상 치료방법이 없어 대부분의 다낭신은 말기 신장질환으로 진행된다 (Gabow, 1993; Grantham, 1996). 인간 다낭신에서 낭포 형성은 낭포 표피세포의 세포증식 증가 및 자기세포사멸을 수반한다.

지금까지 많은 다낭신 치료약제들이 개발되고 있지만, 부정적인 피드백 저해로 인해 실망스러운 임상결과들이 보고되었다.

WT 9-7 세포는 기본적으로 mTOR 신호가 활성화되어 있는 다낭신 세포이다. 그래서 치료제을 사용할 경우 WT 9-7 세포는 사멸해야 한다. 현재 다낭신 치료제로 가장 많이 알려져 있는 치료제는 라파마이신 (Rapamycin)이다. 라파마이신은 WT 9-7 세포에 활성화되어 있는 mTOR의 아래 신호인 S6을 p-S6로 바꾸어 다낭신 치료제로 많이 알려져 있지만, 대조적으로 염증 인자인 Erk 신호를 활성화시키는 부작용을 나타낸다.

FK506 결합 단백질(FK506 binding protein; "FK506BP")은 사이클로필린 A와 같이 이뮤노필린 패밀리 중 하나로, 펩티딜-프롤릴-아이소머라제(peptidyl-prolyl-isomerase) 활성을 가진 풍부한 세포질 수용체 단백질(cytosolic receptor protein)이다. FK506BP는 세포막에서 면역억제제(immunosuppressive drug)인 FK506, 라파마이신(rapamycin)과 결합하여 복합체(complex)를 형성하고, 이 복합체는 T 세포 활성화를 위한 신호체계에 관여하여 사이토카인의 발현을 조절한다. 또한 FK506BP는 Ca²⁺ 신호전달(signaling)에도 관여하는 것으로 보고되고 있다.

생체 내 고분자를 치료목적으로 이용하려는 관심이 매우 높아지고 있다. 현재 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료이다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 가지 문제점을 가진다.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어서 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 PEP-1 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형 단백질을 세포 내로 운반할 수 있음이 밝혀졌다. PEP-1 펩타이드는 21개의 아미노산(KETWWETWWTEW SQP KKKRKV)으로 이루어졌고, 세 개의 도메인(소수성 도메인, 스페이서, 친수성 도메인)을 갖고 있다. 지금까지, PEP-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 PEP-1 펩타이드와 외부 단백질을 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것만 밝혀졌다. 또한, PEP 펩타이드는 Tat 단백질에 비해 단백질 치료제로서의 여러 가지 장점 즉, 매우 효율적으로 단백질을 세포 내로 투과시키고, 생리학적인 완충액에서의 안정성, 혈청에 대한 민감성의 결여 등을 나타낸다. 그러나, PEP 펩타이드는 외부 단백질 즉, 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP), 베타갈락토시데이즈(β-galactosidase, β-Gal) 등과 일정한 비율로 맞추어 투여해야만 세포 내에 효과적으로 단백질이 운반되는 것으로 확인되었다. 그러나, 치료 단백질을 비롯한 모든 단백질이 PEP-1에 의해 세포 내로 운반 가능한지는 아직까지 명확히 밝혀지지 않았다.

본 발명은 다낭신 치료의 타겟이 되는 mTOR를 억제하는 단백질들을 선택하여 단백질 침투기술을 이용하여 다낭신에 대한 기전 규명 및 보호효과를 확인하여 좀더 효과적인 단백질 치료제를 제공하는 것을 목표로 한다.

본 발명자들은 mTOR 신호의 아래 신호인 S6을 p-S6로 바꾸어주면서 Erk 신호를 활성화시키지 않는 다낭신 단백질 치료제를 찾는 것이 목표이다. FK506BP는 라파마이신과 복합체를 이루어 mTOR를 직접적으로 억제하여 아래 신호를 저해한다고 많이 알려져 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 면역반응 억제 약물인 단백질제를 침투 능력을 높이는 제형으로 개발하고자 연구하였고, 단백질 제제의 침투효과, 다낭신 세포주에 FK506BP 융합단백질을 처리하였을 때 mTOR의 활성과 Erk 신호 발현이 감소됨을 확인하여 FK506BP 융합단백질의 다낭신 치료 효과를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 자연상태의 단백질을 세포 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드 및 HIV-1 Tat 펩타이드 중 1종을 외부 단백질인 사람 FK506BP(이하 "FK506 결합 단백질"과 혼용함)의 N- 및/또는 C- 말단에 융합시켰고, 이 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다. 또한, 정제된 융합 단백질이 효과적으로 다낭신 신장세포주에 침투하여 mTOR 신호 및 Erk 신호를 감소시킴을 실험을 통하여 확인하였다. 본 발명은 FK506BP 융합 단백질이 상염색체 우성 다낭신에 대한 단백질 치료제로서의 응용 가능성을 제기하였다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 FK506 결합단백질의 N-말단 및 C-말단 중 한 군데 이상에 PEP-1, Tat과 같은 단백질 수송 도메인이 공유결합되어 있는 FK506 결합단백질의 융합 단백질(이하 "FK506BP 융합 단백질"과 혼용함)을 함유하는 상염색체 우성 다낭신 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 FK506 결합단백질의 융합 단백질에 대하여 시간 및 투여량에 따른 다낭신 신장세포주 내로의 침투성을 확인하였고, 세포 침투 후 FK506BP 융합 단백질의 안정성을 확인하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 FK506BP 융합 단백질은 다낭신 세포에 시간 의존적 및 농도 의존적으로 효과적으로 침투하였으며, 침투 후 최소 60시간 동안 안정적이었다. 뿐만 아니라, 다낭신 세포주에 FK506BP 융합 단백질을 처리하면 mTOR 신호와 Erk 신호가 감소하였다.

본 발명은 FK506 결합단백질의 N-말단 및 C-말단 중 한 군데 이상에 단백질 수송 도메인이 공유결합된 융합 단백질을 함유하는 상염색체 우성 다낭신 예방 및 치료용 약학 조성물에 대한 것이다.

본 발명은 상기 단백질 수송 도메인이

a) 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인,

b) 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 단백질 수송 도메인,

c) 6 내지 12개의 라이신으로 구성되는 올리고라이신 단백질 수송 도메인,

d) 6 내지 12개의 아르기닌으로 구성되는 올리고아르기닌 단백질 수송 도메인 및

e) 6 내지 12개의 라이신 또는 아르기닌으로 구성되는 올리고(라이신,아르기닌) 단백질 수송 도메인 및 상기 a) 내지 e)의 유도체(derivatives) 들 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질이 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 및 서열번호 14 중 선택된 1종인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 FK506BP 융합단백질 외에도 부가적으로 라파마이신을 포함함을 특징으로 한다.

PEP-1-FK506BP 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태 또는 도포제로 제형화할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 PEP-1-FK506BP 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

본 발명에 따른 FK506BP 단백질 분자의 세포 내 전달은 FK506BP에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된, Pep-1을 비롯한 세포투과성 수송도메인 또는 HIV Tat 세포투과성 도메인이 목표 단백질인 FK506BP의 N-말단 및/또는 C-말단과 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고 서열번호 1과 같은 아미노산 서열로 이루어진 PEP-1 펩타이드, 서열번호 2와 같은 아미노산 서열로 이루어진 HIV Tat 49~57 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 1의 PEP-1 펩타이드, 서열번호 2의 HIV Tat 49~57 잔기 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, PEP-1 또는 HIV Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드 또는 HIV Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인, 또는 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인, 6 내지 12개의 라이신으로 구성되는 올리고라이신 수송 도메인, 6 내지 12개의 아르기닌으로 구성되는 올리고아르기닌 수송 도메인 또는 6 내지 12개의 라이신 또는 아르기닌으로 구성되는 올리고(라이신,아르기닌) 수송 도메인도 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 상기와 같은 단백질 수송 도메인과 공유결합된 FK506BP 융합 단백질을 포함하는 상염색체 우성 다낭신 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"FK506BP 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 FK506BP를 포함하며, 단백질 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 FK506BP를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서와 도면에서는 "FK506 결합단백질 융합 단백질"과 혼용하였고, 구체적인 일 실시예로서 "PEP-1-FK506BP"는 FK506BP 융합 단백질 중 FK506BP의 N-말단에 PEP-1 단백질 수송 도메인이 결합된 것을 말한다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다. 구체적으로 본 명세서에서 표적 세포는 다낭신 신장 세포 등을 의미한다.

본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 화물 분자(목표 단백질) 펩타이드 또는 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 PEP-1 펩타이드(서열번호 1)를 말한다.

본 명세서의 "목표 단백질"은 PEP-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미한다. "화물 분자"와 동일한 의미이다.

또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명에서 단백질 수송 도메인으로는 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인, 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인, 6 내지 12개의 라이신으로 구성되는 올리고라이신 수송 도메인, 6 내지 12개의 아르기닌으로 구성되는 올리고아르기닌 수송 도메인 또는 6 내지 12개의 라이신 또는 아르기닌으로 구성되는 올리고(라이신,아르기닌) 수송 도메인을 들 수 있다. 또한, 목표 단백질(화물 분자)는 FK506BP이다. 상기 단백질 수송 도메인 및 목표 단백질은 silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내에서 동일·유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 세포 도입성 FK506BP 융합 단백질이 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인(protein transducing domain; "PTD")이 FK506BP 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 도입성(cell-transducing) FK506BP 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 세포 도입성 FK506BP 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 FK506BP 융합 단백질은 시간 의존적 및 투여량 의존적으로 다낭신 세포 내로 침투하였다.

또한, 본 발명에 따른 FK506BP 융합 단백질은 세포 내로 침투하여 최소 60시간 이상 안정적으로 유지되었다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 FK506BP 융합 단백질은 다낭신 세포 내에서 mTOR 신호 및 Erk 신호를 저하시켰다.

따라서, 본 발명에 따른 FK506BP 융합 단백질은 상염색체 우성 다낭신의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 유용할 것으로 예상된다.

도 1은 WT 9-7 세포에 5 μM의 FK506BP 융합 단백질을 처리하는 시간을 달리 하여 0 ~ 120분간 처리한 후 웨스턴 블랏팅한 사진이다. 대조군으로서 단백질 수송도메인이 결합되지 않은 FK506BP를 사용하였다. "C"는 FK506BP 융합 단백질 또는 FK506BP 단백질을 처리하지 않은 군을 말한다.
도 2는 WT 9-7 세포에 FK506BP 융합 단백질을 처리하는 농도를 달리 하여 두 시간 동안 0.5 ~ 5 μM 처리한 후 웨스턴 블랏팅한 사진이다. 대조군으로서 단백질 수송도메인이 결합되지 않은 FK506BP를 사용하였다. "C"는 FK506BP 융합 단백질 또는 FK506BP 단백질을 처리하지 않은 군을 말한다.
도 3은 WT 9-7 세포에 5 μM의 FK506BP 융합 단백질을 두 시간 처리한 후 시간 경과에 따라 웨스턴 블랏팅한 사진이다. 60시간까지는 융합 단백질이 안정적으로 유지되었다.
도 4는 WT 9-7 세포에 5 μM의 FK506BP 융합 단백질을 두 시간 처리한 후 공촛점 현미경으로 촬영한 사진이다. "Control"은 무처리군이다.
도 5는 WT 9-7 세포에 FK506BP 융합단백질, 라파마이신 등을 넣어 세포생존율을 MTT 분석법으로 분석한 결과이다.
도 6은 WT 9-7 세포에 FK506BP 융합단백질, 라파마이신 등을 넣어 mTOR 신호억제효과를 본 것이다.
도 7은 WT 9-7 세포에 FK506BP 융합단백질, 라파마이신 등을 넣어 Erk 신호억제효과를 본 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예의 기재 범위 내로 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 각 실험예의 결과로서 구체적인 실시예에서 제조한 여러 가지 융합 단백질 중 PEP-1-FK506BP 융합 단백질을 시료로 한 데이터를 기재하였으나, 그 외의 융합 단백질들 또한 PEP-1-FK506BP 융합 단백질을 시료로 한 결과와 유사한 정도의 결과를 나타내었음을 밝힌다.

<재료>

제한 효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머라아제는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로-트리아세틱 애시드 세파로즈 슈퍼플로우는 Qiagen(Germany)에서 구입하였다. 사람 FK506 결합 단백질(FK506BP) cDNA는 PCR 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

<실시예 1: PEP-1-FK506BP 융합 단백질의 발현벡터 제조 및 형질변환>

기능을 가진 단백질을 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표 단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였고, PEP-1 펩타이드가 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 사람 FK506BP를 선택하였다.

먼저, PEP-1-FK506BP 융합 단백질을 생산하기 위해 PEP-1 펩타이드(KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV)(서열번호 1)가 포함된 pET-PEP 발현벡터를 제조하였다. PEP-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(윗 사슬, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'(서열번호 15); 아랫 사슬, 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3'(서열번호 16))를 NdeⅠ-XhoⅠ 제한효소로 자른 pET-15b에 연결(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 FK506BP의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머는 5’-CTCGAGATGGGAGTGC AGGTGGAAACCATC-3'(서열번호 17)로 XhoⅠ 제한 부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머는 5'-GGATCCTCATTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC-3'(서열번호 18)로 BamHⅠ 제한 부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열 순환반응기(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결(ligation)한 다음, 클로닝이 용이한 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법(alkaline lysis method)으로 분리하였다. 사람 FK506BP cDNA가 포함된 TA 벡터를 XhoⅠ과 BamHⅠ로 절단한 다음 PEP 발현 벡터에 삽입하였다. PEP-1-FK506BP로 형질변환된 E. coli BL21(DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100ml LB 배지에 접종하고 IPTG(0.5mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 PEP-1-FK506BP 융합 단백질의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 PEP-1-FK506BP 융합 단백질은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

상기 방법을 변형하여 FK506BP-PEP-1 융합 단백질 및 PEP-1-FK506BP-PEP-1 융합 단백질을 제조하였다.

<실시예 2: PEP-1-FK506BP 융합단백질의 발현 및 정제>

상기 실시예 1과 같이 제조한 인간 FK506BP cDNA가 PEP-1-FK506BP 형태로 포함되어 있는 E. coli BL21(DE3)세포를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 0.5～1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5와 1mM 되게 한 다음 30℃에서 12시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5ml 결합완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni²⁺-니트릴로 트리아세틱 애시드 세파로즈 슈퍼 플로우(Ni²⁺-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.

정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.

상기 방법과 동일한 방법으로 FK506BP-PEP-1 융합 단백질 및 PEP-1-FK506BP-PEP-1 융합 단백질을 과대발현 및 정제하였다.

<실시예 3: Tat-FK506BP 융합 단백질 발현벡터의 제조 및 형질변환>

Tat-FK506BP 융합 단백질을 과다 발현시키기 위하여 FK506BP, HIV-1 Tat의 형질 도입부위(Tat49-57) 및 6개의 히스티딘에 대한 cDNA가 연속적으로 포함되어 있는 pET-Tat-FK506BP 발현 벡터를 제조하였다. 먼저, HIV-1 Tat의 기본 도메인(basic domain, 즉 아미노산 49-57)이 포함된 pET-Tat 발현벡터를 만들었다. Tat 기본 도메인에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(상위 쇄(top strand), 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'(서열번호 19); 하위 쇄(bottom strand), 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3'(서열번호 20))를 NdeI-XhoI 제한효소로 자른 pET15b에 결찰(ligation)하여 삽입하였다. 이어 인간 FK506BP의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 2종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 위 실시예 1의 서열번호 17로 Xho I 제한부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머(reverse primer)는 위 실시예 1의 서열번호 18로 BamH I제한부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 thermal cycler(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였으며, 반응 혼합액을 50 ㎕ 실리콘 튜브(siliconized reaction tube)에 넣고 94℃에서 5 분간 가열하였다. PCR 반응은 94℃에서 40초간 30회의 연장(extension), 54℃에서 1분간 변성(denaturation), 70℃에서 3분간 어닐링(annealing), 그리고 72℃에서 10분, 20℃에서 5분간 최종 연장(final extension)을 유도하였다. PCR 수행후 아가로즈 젤 전기이동(agarose gel electrophoresis)으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 결찰하였다. 이어 이 벡터를 형질변환용 세포(competent cell)에 형질변환(transformation)시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균 방법(alkaline lysis method)으로 분리하였다[Sambrook, J., Fritsch, F.E. and Maniatis, T(1989) Molecular cloning, Cold spring harbor laboratory press, Cold spring harbor]. 인간 FK506BP cDNA가 포함된 TA 벡터를Xho I과BamH I로 절단한 다음 pET-15b 및 pET-15b-Tat 발현 벡터에 삽입하였다. 벡터의 발현은 T7 프로모터와 lacO-오퍼레이터의 조절 하에 있다.

pET-Tat-FK506BP로 형질변환된 E. coli BL21(DE3)를 선택한 다음, 콜로니(colony)를 100ml LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 과다 발현을 유도하였다. IPTG로 융합단백질의 과다 발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파처리(sonication)로 파쇄한 다음, 원심분리하여 상청액의 단백질을 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기이동방법으로 분리하였다. 과다 발현된 SOD와 Tat-SOD는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기이동과 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

상기 방법을 변형하여 FK506BP-Tat 융합 단백질 및 Tat-FK506BP-Tat 융합 단백질을 제조하였다.

<실시예 4: Tat-FK506BP 융합 단백질 과다 발현 및 정제>

형질전환된 E. coli BL21을 앰피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D 600 = 0.5∼1.0를 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM가 되게 한 다음 3시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5ml 결합 완충용액(binding buffer; 5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)을 넣고 초음파처리(sonication)하였다.

원심분리하여 상청액을 즉시 2.5 ml Ni 2+ -니트릴로트리아세틱 애시드 세파로즈 컬럼(nitrilotriacetic acid sepharose column)에 부하하고 10배 부피의 결합 완충용액과 6배 부피의 세척 완충액(washing buffer; 60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(elution buffer; 1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합단백질을 용출하였다. 이어 융합단백질이 포함된 분획들을 모아 세파덱스 G-15 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. 융합단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합단백질을 거의 순수하게(순도 > 90%) 정제하였다. 분획의 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다[Bradford, M.A. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254].

상기 방법과 동일한 방법으로 FK506BP-Tat 융합 단백질 및 Tat-FK506BP-Tat 융합 단백질을 과대발현 및 정제하였다.

<실시예 5: 시료 제조>

상기 실시예 2 및 4에서 정제된 각종 FK506BP 융합 단백질을 생리식염수에 5㎍/5㎕로 용해하여 이후 실험에 시료로 사용하였다.

실험예 1: 시간 및 투여량에 따른 FK506BP 융합 단백질의 세포내 침투효율

1-1. 세포주 및 약물 처리

상염색체 우성 다낭신 근위 피질 세뇨관 (proximal cortical tubule) 세포 WT9-7는 10% (v/v) 우태혈청 및 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12 (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. 이 세포들은 37 ℃에서 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 조건에서 배양하였다. 이 세포들은 2~4 μM의 5-aza-dC (5-aza-2'-deoxycytidine, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 또는 100 μM 제뷸라린 (zebularine; Calbiochem, San Diego, California, USA)으로 14일간 처리하였다. 배지는 하루 또는 이틀마다 갈아주었고, 새로운 5-aza-dC 또는 제뷸라린을 가해주었다.

1-2. 처리 시간에 따른 세포침투효율

60mm 배양접시에 5 x 10⁵개의 세포를 분주한 뒤, 각각 5 μM FK506BP 융합 단백질을 WT9-7 세포에 각각 10, 30, 60, 120분간 처리한 다음 다음 인산완충식염수로 2번 씻어준 후 트립신을 1분간 처리하여 세포를 배양접시에서 떨어뜨리고, 원심분리(1300rpm, 5분)를 하여 세포만 얻어내었다. 이렇게 얻어낸 세포는 세포 용해 용액인 리파 완충액으로 용해시킨 후, 항 히스티틴 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 세포내 침투효율을 확인하였다.

결과는 도 1과 같이, FK506BP 융합 단백질이 시간 의존적으로 WT9-7 세포 내로 침투함을 확인하였다. 이와 대조적으로 수송도메인이 결합되지 않은 FK506BP 단백질은 세포 내로 침투되지 않았다.

1-3. 처리 농도에 따른 세포침투효율

60mm 배양접시에 5 x 10⁵개의 세포를 분주한 뒤, FK506BP 융합 단백질을 WT9-7 세포에 각각 0.5, 1, 3 및 5 μM 농도로 두 시간 처리한 다음 다음 인산완충식염수로 2번 씻어준 후 트립신을 1분간 처리하여 세포를 배양접시에서 떨어뜨린 다음 원심분리(1300rpm, 5분)를 하여 세포만 얻어내었다. 이렇게 얻어낸 세포는 세포 용해 용액인 리파완충액으로 용해 시킨 후, 항 히스티틴 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 세포내 침투 효율을 확인하였다.

결과는 도 2와 같이, FK506BP 융합 단백질이 농도(투여량) 의존적으로 WT9-7 세포 내로 침투함을 확인하였다. 이와 대조적으로 수송도메인이 결합되지 않은 FK506BP 단백질은 세포 내로 침투되지 않았다.

실험예 2: 세포 내로 침투한 FK506BP 융합 단백질의 안정성

커버글라스의 1 x 10⁴개의 WT9-7 세포에 5 μM FK506BP 융합 단백질을 두 시간 동안 처리하였다. 인산완충액식염수로 2번 씻어 준 후, 파라포름알데하이드를 처리해 세포를 고정시켰다. 인산완충액식염수에 3% 우혈청알부민과 0.1% 트윈20을 포함시킨 용액을 이용하여, 세포를 투과성의 성질을 가지게 한 뒤 3시간 동안 1차 항체인 항히스타민을 처리하였다. 그리고 2차 형광항체인 알렉사488을 처리한 뒤, 세포의 핵만을 특이적으로 염색할 수 있는 파란색 형광을 띠는 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)를 처리하였다. 이를 공촛점 현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 4에 나타내었다. 그 결과, WT9-7 세포에 FK506BP 융합 단백질이 성공적으로 침투함을 확인할 수 있었다. 반면, FK506BP 단백질은 세포 내로 침투되지 않았다.

또한, 침투한 FK506BP 융합 단백질을 시간 별로 각각 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60 시간 경과 후 인산완충식염수로 2번 씻어 준 후 트립신을 1분간 처리하여 세포를 배양접시에서 떨어뜨린 후 원심분리(1300rpm, 5분)를 하여 세포만 얻어내었다. 이렇게 얻어낸 세포는 세포 용해 용액인 리파완충액으로 용해시킨 후, 항 히스티틴 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행하여 안정성을 확인하였다. 그 결과, 도 3과 같이, 60시간 이상 융합 단백질이 안정적으로 유지되었다.

실험예 3: WT 9-7 세포에 FK506BP 융합단백질의 MTT 분석

mTOR 신호가 활성화되어 있는 WT 9-7 세포에 다낭신 치료제로 많이 알려진 라파마이신을 처리한 결과, WT 9-7 세포 사멸을 확인할 수 있었다. 96 well 세포배양용 접시에 각각 1 x 10⁴개의 세포를 배양하였다. 12시간 후에 소혈청이 없는 배지에 각각 5uM FK506BP 융합단백질, 100nM 라파마이신을 3시간 동안 처리하였다. 그리고 다시 소혈청이 없는 배지로 갈아주어 12시간동안 배양하였다. 살아있는 세포의 미토콘드리아를 570nm에서 측정할 수 있도록 염색해주는 MTT 미디아로 2시간 염색하였다. 그리고 아이소프로판올로 세포를 용해시켜 570nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 5와 같이, FK506BP 융합단백질을 처리한 경우에도 세포사멸을 확인할 수 있었으며, FK506BP 융합단백질과 라파마이신을 동시에 처리하였을 경우 세포사멸이 현저히 활발하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다 (1: 대조군, 2: FK506BP, 3: FK506BP+라파마이신, 4: PEP-1-FK506BP 융합단백질, 5: 라파마이신, 6 : PEP-1-FK506BP 융합단백질+라파마이신). 3번 레인을 보면 FK506BP와 라파미이신을 함께 처리할 경우 초기 복합체를 이루어 그 기능을 하지 못하는 것으로 보이며, 6번 레인을 보면 PEP-1-FK506BP 융합단백질과 라파마이신을 함께 처리할 경우 세포 내로 침투하여 그 효과가 탁월한 것을 볼 수 있었다.

실험예 4: WT 9-7 세포에 PEP-FK506BP 융합단백질의 ADPKD 시그널 연구

WT 9-7 세포는 mTOR 신호와 발현이 활성화되어 있는 세포이다. FK506BP 융합단백질이나 라파마이신은 mTOR 발현 양에는 변화를 주지 않으며, 바로 다음 아래 신호인 S6 신호로부터 mTOR 신호에 대한 그 기능을 확인하였다. 60mm 배양접시에 5 x 10⁵개의 세포를 분주한 뒤, 각각 5uM FK506BP 융합단백, 100nM 라파마이신을 2시간동안 처리하였다. 다음 인산완충식염수로 2번 씻어 준 후 트립신을 1분간 처리하여 세포를 배양접시에서 떨어뜨린 후 원심분리(1300rpm, 5분)를 하여 세포만 얻어내었다. 이렇게 얻어낸 세포는 세포 용해 용액인 리파완충액으로 용해시킨 후, 각각의 항 mTOR, 항 S6, 항 p-S6의 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 그 신호들을 확인하였다. mTOR 신호에 대해서는 모두 아무런 기능이 없는 것을 확인할 수 있으며, S6 신호에 대해서도 아무 변화가 없는 것을 확인할 수 있다 (도 6). 그러나, p-S6의 경우에는 발현량의 차이가 확연히 보인다. 그림에서 보는 것처럼 PEP-1-FK506BP 융합단백질과 라파마이신은 거의 동등한 효과를 나타내고 있으며, PEP-1-FK506BP 융합단백질과 라파마이신을 함께 처리한 경우 그 기능은 매우 시너직한 것으로 확인되고 있다 (1: 대조군, 2: FK506BP, 3: FK506BP+라파마이신, 4: PEP-1-FK506BP 융합단백질, 5: 라파마이신, 6 : PEP-1-FK506BP 융합단백질+라파마이신).

실험예 5: WT 9-7 세포에 PEP-FK506BP 융합단백질의 Erk 시그널 연구

라파마이신의 경우 mTOR의 아래 신호인 S6를 저해하는 기능은 굉장히 좋으나, 염증 신호인 Erk 신호를 증가시켜 치료제로서 부작용을 보이고 있다. 60mm 배양접시에 5 x 10⁵개의 세포를 분주한 뒤, 각각 5uM FK506BP 융합단백, 100nM 라파마이신을 2시간동안 처리하였다. 다음 인산완충식염수로 2번 씻어 준 후 트립신을 1분간 처리하여 세포를 배양접시에서 떨어뜨린 후 원심분리(1300rpm, 5분)를 하여 세포만 얻어내었다. 이렇게 얻어낸 세포는 세포 용해 용액인 리파완충액으로 용해시킨 후, 각각의 항 Erk, 항 p-Erk의 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 그 신호들을 확인하였다. PEP-1-FK506BP 융합단백질은 Erk 신호를 저해하며, WT 9-7 세포에서도 역시 Erk 신호를 억제함을 확인할 수 있었다. 라파마이신의 경우 Erk를 활성화시키는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, PEP-1-FK506BP 융합단백질+라파마이신을 함께 처리하는 경우 Erk를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (1: 대조군, 2: FK506BP, 3: FK506BP+라파마이신, 4: PEP-1-FK506BP 융합단백질, 5: 라파마이신, 6 : PEP-1-FK506BP 융합단백질+라파마이신).

이상과 같은 실험예의 결과들로부터, FK506BP 융합 단백질을 다낭신 세포에 처리하는 경우 FK506BP 단백질이 세포 내로 원활히 침투하고 최소 60시간의 안정성을 나타내며, S6 신호를 저해하며 Erk 신호를 감소시키므로, FK506BP 융합 단백질은 다낭신 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition for arthritis containing fk506 binding protein fusion protein <130> sychoi-fk506bp-arthritis <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein transducing domain called PEP-1 <400> 1 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding PEP-1-FK506BP fusion protein <400> 3 taaaagaaac ctggtgggaa acctggtgga ccgaatggtc tcagccgaaa aaaaaacgta 60 aagtgctcga gatgggagtg caggtggaaa ccatctcccc aggagacggg cgcaccttcc 120 ccaagcgcgg ccagacctgc gtggtgcact acaccgggat gcttgaagat ggaaagaaat 180 ttgattcctc ccgggacaga aacaagccct ttaagtttat gctaggcaag caggaggtga 240 tccgaggctg ggaagaaggg gttgcccaga tgagtgtggg 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Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser 20 25 30 Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val 35 40 45 His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg 50 55 60 Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile 65 70 75 80 Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala 85 90 95 Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro 100 105 110 Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu 115 120 125 Lys Leu Glu Gly Ser Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu 130 135 140 Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 145 150 <210> 9 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding Tat-FK506BP fusion protein <400> 9 aggaagaagc ggagacagcg acgaagactc gagatgggag tgcaggtgga aaccatctcc 60 ccaggagacg ggcgcacctt ccccaagcgc ggccagacct gcgtggtgca ctacaccggg 120 atgcttgaag atggaaagaa atttgattcc tcccgggaca gaaacaagcc ctttaagttt 180 atgctaggca agcaggaggt gatccgaggc tgggaagaag gggttgccca gatgagtgtg 240 ggtcagagag ccaaactgac tatatctcca gattatgcct atggtgccac tgggcaccca 300 ggcatcatcc caccacatgc cactctcgtc ttcgatgtgg agcttctaaa actggaatga 360 ggatcc 366 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-FK506BP fusion protein <400> 10 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Gly Val Gln Val 1 5 10 15 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln 20 25 30 Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe 35 40 45 Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val 65 70 75 80 Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala 85 90 95 Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp 100 105 110 Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 115 <210> 11 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding FK506BP-Tat fusion protein <400> 11 atgggagtgc aggtggaaac catctcccca ggagacgggc gcaccttccc caagcgcggc 60 cagacctgcg tggtgcacta caccgggatg cttgaagatg gaaagaaatt tgattcctcc 120 cgggacagaa acaagccctt taagtttatg ctaggcaagc aggaggtgat ccgaggctgg 180 gaagaagggg ttgcccagat gagtgtgggt cagagagcca aactgactat atctccagat 240 tatgcctatg gtgccactgg gcacccaggc atcatcccac cacatgccac tctcgtcttc 300 gatgtggagc ttctaaaact ggaaggatcc taggaagaag cggagacagc gacgaagata 360 g 361 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FK506BP-Tat fusion protein <400> 12 Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu 20 25 30 Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys 35 40 45 Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val 50 55 60 Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala 85 90 95 Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Arg Lys Lys Arg 100 105 110 Arg Gln Arg Arg Arg 115 <210> 13 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding Tat-FK506BP-Tat fusion protein <400> 13 taggaagaag cggagacagc gacgaagact cgagatggga gtgcaggtgg aaaccatctc 60 cccaggagac gggcgcacct tccccaagcg cggccagacc tgcgtggtgc actacaccgg 120 gatgcttgaa gatggaaaga aatttgattc ctcccgggac agaaacaagc cctttaagtt 180 tatgctaggc aagcaggagg tgatccgagg ctgggaagaa ggggttgccc agatgagtgt 240 gggtcagaga gccaaactga ctatatctcc agattatgcc tatggtgcca ctgggcaccc 300 aggcatcatc ccaccacatg ccactctcgt cttcgatgtg gagcttctaa aactggaagg 360 atcctaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gatag 395 <210> 14 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-FK506BP-Tat fusion protein <400> 14 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Gly Val Gln Val 1 5 10 15 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln 20 25 30 Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe 35 40 45 Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val 65 70 75 80 Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala 85 90 95 Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp 100 105 110 Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 115 120 125 <210> 15 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding sequence for PEP-1 <400> 15 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anticoding sequence for PEP-1 <400> 16 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctcgagatgg gagtgcaggt ggaaaccatc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggatcctcat tccagtttta gaagctccac 30 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand for Tat peptide <400> 19 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand for Tat peptide <400> 20 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31

Claims (4)

1. FK506 결합단백질의 N-말단 및 C-말단 중 한 군데 이상에 단백질 수송 도메인이 공유결합된 융합 단백질을 함유하는 상염색체 우성 다낭신 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 단백질 수송 도메인은
   a) 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인,
   b) 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 단백질 수송 도메인,
   c) 6 내지 12개의 라이신으로 구성되는 올리고라이신 단백질 수송 도메인,
   d) 6 내지 12개의 아르기닌으로 구성되는 올리고아르기닌 단백질 수송 도메인 및
   e) 6 내지 12개의 라이신 또는 아르기닌으로 구성되는 올리고(라이신,아르기닌) 단백질 수송 도메인 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 융합 단백질은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 및 서열번호 14 중 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물에는 라파마이신이 부가됨을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   

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