CZ293439B6

CZ293439B6 - Farmaceutické kompozice indukující odpověď cytotoxických T-lymfocytů

Info

Publication number: CZ293439B6
Application number: CZ19971741A
Authority: CZ
Inventors: Syamal Raychaudhuri; William Rastetter
Original assignee: Idec Pharmaceuticals Corporation
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 2004-04-14
Also published as: EP0801656A1; RU2201253C2; IS4479A; EP0801656A4; MD970199A; EE9700100A; RO120065B1; SK71397A3; WO1996017863A1; BR9509872A; NO972521L; GEP20012556B; AP661A; FI972431A0; UA49814C2; CN1175260A; CA2204738A1; LV11866B; TW487575B; US5709860A

Abstract

Popisují se kompozice vhodné pro indukci odpovědi cytotoxických T-lymfocytů (CTL) u člověka, domácího nebo zemědělského zvířete. Kompozice podle předmětného řešení obsahují antigen, proti němuž má být namířena odpověď cytotoxických T-lymfocytů, a antigenní přípravek, který obsahuje, sestává nebo podstatnou měrou sestává ze dvou nebo více složek. Těmito složkami jsou stabilizující detergent, činidlo podporující tvorbu micel a olej. Ve výhodném provedení neobsahuje tento antigenní přípravek imunostimulující peptid nebo obsahuje dostatečně malé množství takového peptidu tak, aby intenzita požadované odpovědi CTL nebyla zmenšována.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutických kompozic použitelných k indukci cytotoxických odpovědí zprostředkovaných T-lymfocyty u lidí a domestikovaných nebo hospodářských zvířat.

Dosavadní stav techniky

Předpokládá se, že cytotoxické T-lymfocyty (CTL) jsou hlavním obranným mechanizmem hostitele při odpovědi na nejrůznější virové infekce a neoplastický nebo rakovinný růst buněk. Tyto cytotoxické T-lymfocyty ničí infikované nebo pozměněné buňky. Infikované nebo pozměněné buňky na svém povrchu „vystavují“ v komplexech s různými molekulami (nazývanými MHC molekuly I. třídy) množství fragmentů nejrůznějších antigenů, podle nichž jsou tyto buňky rozpoznávány příslušnými CTL. Experimentálně mohou být CTL indukovány prostřednictvím specifických buněk, do jejichž cytoplazmy jsou dodány určité rozpustné antigeny. Imunizace samotným rozpustným antigenem obvykle nedostačuje ke specifické indukci cytotoxických T-lymfocytů.

Jedním ze způsobů, které mohou být použity pro indukci odpovědi CTL, je využití technik genového inženýrství, při kterých jsou do genomu neškodného infekčního agens inkorporovány části příslušného antigenů. Cílem takové strategie je generovat antigen-specifickou odpověď cytotoxických T-lymfocytů proti požadovanému epitopu tím, že vystavíme hostitele nepřenosné infekci s mírným průběhem. Byly popsány chimérické vektory, které jako neškodné infekční agens využívající viry vakcinia, polioviry, adenoviry a retroviry a rovněž bakterie jako například bakteria rodu Listeria nebo BCG. Například Takahashi a další, 85 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 3105, 1988 popisuje použití rekombinantního viru vakcinia exprimujícího gen gpl60 viru HIV, který slouží jako potenciální nástroj k indukci cytotoxických T-lymfocytů.

Při jiném způsobu, který může být použit k indukci buněčně zprostředkované imunitní odpovědi, se využívá určitých adjuvans. Zatímco současná odborná literatura se ve velké míře věnuje diskuzím týkajícím se využívání adjuvans, není vůbec zřejmé, zda-li používání adjuvans může indukovat buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď a jestliže ano, pak jestli taková buněčně zprostředkovaná imunitní odpověď v sobě zahrnuje cytotoxickou odpověď T-lymfocytů. V následujícím textu jsou nicméně uvedeny příklady nejrůznějších publikací z této oblasti.

Stover a další, 351 Nátuře 456, 1991 popisuje odpověď CTL na přítomnost β-galaktosidázy za použití rekombinantních bakterií BCG nesoucích gen pro β-galaktosidázu. Při použití β-galaktosidázy spolu s neúplným Freundovým adjuvans nebyla taková odpověď CTL vůbec detekována.

Mitchell a další, 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nejnovější poznatky související s patentem) popisuje léčbu pacientů trpících metastázujícím melanomem za použití adjuvans nazývaného „DETOX“ a allogenních lyzátů melanomu, které byly pacientům podávány celkem pětkrát v průběhu šesti týdnů. U malé části ze skupiny pacientů bylo pozorováno zvýšení cytolytické aktivity T-buněk. Autoři popisují nezbytnost zvýšit množství nově vytvořených cytotoxických T-lymfocytů a navrhují kombinovanou terapii, která využívá adjuvans spolu s interleukinem-2, a součástí které je rovněž předběžné působení cyklofosfamidem, účelem kterého je snížit množství supresorových T-buněk (které snad existují) specifických pro daný nádor. DETOX se skládá z detoxifikovaného endotoxinu (monofosfát lipidu A) z bakterií Salmonella minnesota, buněčných stěn bakterií Mycobacterium phlei, skvalenového oleje a emulzifikátoru.

Allison a Gregoriadis, 11 Immunology Today 427, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nejnovější poznatky související s patentem) poznamenává, že jediným adjuvans „schváleným pro použití“ při vakcinaci lidí jsou soli obsahující hliník (hlinité soli - Alum), které zaručeně nevyvolávají buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď. Allison a Gregoriadis tvrdí že ,je tudíž nezbytné vyvinout adjuvans, která mají stejnou účinnost jako kompletní Freundovo adjuvans, ale která nemají nežádoucí vedlejší účinky kompletního Freundova adjuvans, jakými je například tvorba granulomů“. Dále pak pokračují tvrzením, že existují tři využitelné strategie, například: použití lipozomů; použití adjuvans nazývaných imunostimulační komplexy (ISCOM - immunostimulating complexes, která obsahují saponin nebo Quil A [triterpen se třemi sacharidovými řetězci], cholesterol a fosfatidyl cholin), která jsou schválena pro použití při vakcinaci proti chřipce koní (Morein a další, Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenům Press, 153); a použití emulzí (SAF) skvalenu nebo skvalenu (s nebo bez kopolymeru pluronic) a muramyl dipeptidu (MDP - muramyl dipeptide). Tvrdí se, že SAF vyvolává u myší buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď, ačkoliv „dlouhou dobu se předpokládalo, že podjednotkové antigeny nemohou indukovat odpověď cytotoxických T-buněk“.

Takahashi a další, 344 Nátuře 873, 1990 popisuje indukci pomocných T-lymfocytů, které rozpoznávají antigen v kontextu MHC glykoproteinů II. třídy, a cytotoxických T-lymfocytů prostřednictvím ISCOM. Této indukce je u myší dosaženo jedinou subkutánní imunizací. Takahashi a další, 344 Nátuře 873, 1990 dále tvrdí, že použití Freundova adjuvans, nekompletního Freundova adjuvans a fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrem nevede k indukci cytotoxické aktivity T-lymfocytů proti cílovým buňkám, proti nimž měla být tato cytotoxická aktivita namířena. Dále tvrdí, že, narozdíl od výsledků experimentů, při kterých byly použity exogenní rozpustné proteinové antigeny v jiné formě, jejich skupina prokázala, že je možné použít exogenní intaktní protein v kombinaci s ISCOM k imunizaci vedoucí k primární aktivaci CD8+ CD4- cytotoxických T-lymfocytů, které rozpoznávají antigen v kontextu s MHC glykoproteiny I. třídy. Tato skupina rovněž tvrdí, že popsané experimenty naznačují, že je možné za použití ISCOM obsahujících proteiny viru HTV, vyvolat u lidí odpověď CTL, a že použitím vakcín na bázi ISCOM může být dosaženo dlouho hledaného cíle, kterým je současná indukce odpovědi CTL a indukce tvorby protilátek při použití purifikovaného proteinu.

Byars a Allison, 5 Vaccines 223, 1987 popisují použití SAF-1, které obsahuje Tween 80, PLURONIC L121 a skvalem nebo Skvalan, v kombinaci snebo bez muramyl dipeptidu. Jejich data naznačují, že přípravek obsahující muramyl dipeptid budou vhodné k přípravě vakcín použitelných kočkování lidí nebo kpřípravě vakcín použitelných ve veterinářství. Při druhé imunizaci (upomínací dávka) bylo použito adjuvans bez muramyl dipeptidu. Zdá se, že použití muramyl dipeptidu podstatně zvyšuje produkci protilátek ve srovnání s použitím adjuvans bez muramyl dipeptidu. Buněčně zprostředkovaná imunita byla měřena kožními testy jako přecitlivělost oddáleného typu; cílem tohoto měření bylo stanovit, jestli došlo k aktivaci pomocných Tbuněk. Jestliže byl jako součást adjuvans přítomen muramyl dipeptid, pak byla tato přecitlivělost oddáleného typu silnější a déletrvající. Podobná adjuvans jsou popsána v Allison a další, Patent Spojených států amerických US 4 770 874 (popisuje vyvolání silné buněčné zprostředkované a humorální odpovědi proti vaječnému albuminu pomocí směsi muramyl dipeptidu a polyolu PLURONIC); v Allison a další, Patent Spojených států amerických US 4 772 466; v MurphyCorb a další, 246 Science 1293, 1989 (popisuje použití kombinovaných adjuvans s muramyl dipeptidem, které může zesílit indukci, jak humorální imunitní odpovědi, tak buněčně zprostředkované imunitní odpovědi); v Allison a Byars, 87 Vaccines 56,1987 (buněčně zprostředkovanou imunita je indukována při použití SAF (s muramyl dipeptidem), což bylo prokázáno existencí přecitlivělosti oddáleného typu, zvýšenou proliferací T-buněk za přítomnosti antigenu, produkcí interleukinu-2 a specifickou lýzou cílových buněk, které nesly antigen použitý k imunizaci); v Allison a Byars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-specifíc Resistance, strany 191 až 201,1987; v Morgan a další, 28 J. Medical Virology 74, 1989; vKenney a další, 121 J. Immunological Methods 157, 1989; v Allison a Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (kde bylo prokázáno, že hlinité soli a emulze minerálních olejů zvyšují produkci protilátek, ale neovlivňují buněčně zprostředkovanou imunitu;

-2CZ 293439 B6 a bylo prokázáno, že přípravky obsahující muramyl dipeptid vyvolávají buněčně zprostředkovanou imunitu); v Byars a další, 8 Vaccine 49, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nejnovější poznatky související s patentem; kde je řečeno, že jimi použité adjuvans podstatně zvyšuje humorální imunitní odpověď a menší měrou zvyšuje buněčně zprostředkované reakce proti hemaglutininovému antigenu viru chřipky); v Allison a Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (tato publikace nemusí obsahovat nejnovější poznatky související s patentem; kde je řečeno, že úkolem muramyl dipeptidu je indukovat expresi cytokinů a zvýšit expresi genů kódujících velké histokompatibilní komplexy (MHC); a že s tímto adjuvans byly získány lepší humorální a buněčně zprostředkované odpovědi, než tomu bylo při použití jiných adjuvans, a že se, doufejme, zjistí, jsou-li podobné strategie účinné i u lidí); v Allison a Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (kde je popsána indukce buněčně zprostředkované imunity za použití SAF); v Epstein a další, 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (tato publikace poskytuje přehled nejrůznějších adjuvans používaných při přípravě vakcín); v Allison a Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (kde je řečeno, že přidání muramyl dipeptidu k adjuvans má za následek značné zesílení buněčně zprostředkovaných odpovědí na přítomnost nejrůznějších antigenů, včetně monoklonálních imunoglobulínů a virálních antigenů); a v Morgan a další, 29 J. Medical Virology 74, 1989 (kde je popsáno použití SAF-1 k přípravě vakcíny proti viru Epstein-Barrové).

Kwak a další, Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, strana 163, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nejnovější poznatky související s patentem) popisuje použití SAF bez muramyl dipeptidu jako adjuvans pro idiotyp lymfomu B-buněk u lidí. Přesněji řečeno, spolu s příslušným idiotypem byla administrována emulze obsahující polymer Pluronic L121, Skvalan a 0,4% Tween-80 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem. V této publikaci se tvrdí, že „přídavek nějakého adjuvans může dále zesílit... humorální odpovědi a může rovněž usnadnit indukci buněčně zprostředkovaných odpovědí“.

Mezi jiné imunologické přípravky patří lipozoiny (Allison a další, Patenty Spojených států amerických US 4 053 585 a US 4 117 113); cyklické peptidy (Dreesman a další, Patent Spojených států amerických US 478 784); Freundovo kompletní adjuvans (Asherson a další, 22 Immunology 465, 1972; Berman a další, 2 Intemational J. Cancer 539, 1967; Allison 18 Immunopotentiation 73, 1973; a Allison, Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOM (Letvin a další, 87 Vaccines 209, 1987); adjuvans tvořené minerálním olejem, povrchově aktivním činidlem a Tweenem 80, obsahující neiontové blokové polymery (Hunter a Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; a Hunter a další, 127 J. Immunology 1244, 1981); adjuvans tvořené minerálním olejem a emulzifikujícím činidlem v kombinaci s nebo bez mrtvých mykobaktérií (Sanchez-Pescador a další, 141 J. Immunology 1720, 1988); a jiná adjuvans jako například lipofílní deriváty muramyl tripeptidu a muramyl dipeptid kovalentně spojený s rekombinantním proteinem.

Podstata vynálezu

Přihlašovatel vynalezl bezpečný a výhodný způsob a bezpečné a výhodné kompozice, s jejichž využitím mohou být u lidí a domestikovaných nebo hospodářských zvířat indukovány imunitní odpovědi CTL. Tento způsob zahrnuje použití antigenního přípravku, který je pro živočichy velmi málo nebo dokonce není vůbec toxický a který neobsahuje žádný imunostimulační peptid (například muramyl dipeptid), jehož přítomnost by snížila intenzitu požadované buněčně zprostředkované odpovědi. Použití této metodologie je velmi jednoduché a není při ní třeba provádět rozsáhlé činnosti in vivo, při kterých jsou pomocí rekombinantních DNA technik pozměňovány buňky za účelem zvýšení jejich antigenicity. Tento objev je velmi překvapivý, protože se nepředpokládalo, že použití těchto antigenních přípravků neobsahujících imunostimulační peptidy nebo jejich ekvivalenty, by mohlo indukovat odpověď CTL. Tato zjištění uskutečněná podavatelem patentu umožňují použití těchto antigenních přípravků u širokého spektra nemocí nebo použití těchto antigenních přípravků jako činidel použitelných pro prevenci.

-3CZ 293439 B6

Takové antigenní přípravky mohou být například použity k léčbě virových onemocnění, při kterých je důležitá odpověď CTL. Mezi taková virová onemocnění patří například infekce virem HIV nebo chřipka; použití těchto antigenních přípravků může být rozšířeno i na použití při léčbě bakteriálních infekcí, rakoviny, infekcí způsobených parazity a podobných onemocnění. Jako činidlo použitelné pro prevenci může být antigenní přípravek spolu s vhodným antigenem použito při prevenci virových infekcí zmíněných výše, zvláště pak při prevenci infekce způsobené virem HTV. Jinou možností je použití antigenního přípravku spolu s vhodným antigenem při prevenci u pacientů vystavených zvýšenému riziku vzniku rakoviny, například u pacientů po resekci primárního nádoru.

Vynález popisuje způsob sloužící k indukci odpovědi CTL u lidí nebo domestikovaných zvířat (například koček nebo psů) nebo hospodářských zvířat (například koní, skotu nebo vepřů). Tato odpověď je namířena proti nějakému antigenu mimo antigenu lymfomu B-buněk a vaječnému albuminu. Tento způsob se skládá z kroků, při kterých je získán antigen, proti kterému chceme vyvolat odpověď CTL, a dále tento způsob poskytuje návod pro přípravu antigenního přípravku, který obsahuje. Tento antigenní přípravek obsahuje, skládá se nebo skládá se téměř výhradně ze stabilizujícího detergentu, činidla podporujícího tvorbu micel a biodegradovatelného a biokompatibilního oleje. Ve výhodném provedení vynálezu neobsahuje tento antigenní přípravek složku tvořenou imunostimulačním peptidem nebo obsahuje malé množství této složky dostačující ktomu, aby nedošlo ke snížení požadované odpovědi CTL. Ve výhodném provedení vynálezu je tento přípravek připraven ve formě stabilní emulze oleje ve vodě. To znamená, že každá z použitých složek je vybrána tak, aby se daná emulze udržela v emulzifíkovaném stavu po dobu nejméně jednoho měsíce a ve výhodném provedení vynálezu pak po dobu delší než jeden rok, aniž by došlo k oddělení fází. Při tomto způsobu jsou antigen a antigenní přípravek smíchány dohromady a výsledkem je vytvoření směsi (ve výhodném provedení vynálezu mikrofluidizace), která je administrována do organizmu živočicha v množství dostačujícím k indukci odpovědi CTL. Tuto administraci stačí provést pouze jednou.

Termínem „stabilizující detergent“ rozumíme detergent, který umožňuje jednotlivým složkám emulze zůstat ve formě stabilní emulze. Mezi takové detergenty patří polysorbát 80 (Tween) (Sorbitan-mono-9-oktadekanoátpoly(oxy-l,2-ethandiyl; produkt ICI Americans, Wilmington, DE), Tween 20, Tween 60, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7 a SPÁN 85. Tyto detergenty jsou obvykle používány v množstvích přibližně 0,05 až 0,5 %, ve výhodném provedení vynálezu pak v množstvích přibližně 0,2 %.

Termínem „činidlo podporující tvorbu micel“ rozumíme činidlo, které je schopno stabilizovat emulzi tvořenou jinými složkami takovým způsobem, že dojde k vytvoření struktury podobné micelám. Taková činidla způsobují ve výhodném provedení vynálezu podráždění v místě, do něhož jsou injikovány. Toto podráždění má za následek infiltraci makrofágů do místa injekce a tím zesílení buněčně zprostředkované odpovědi. Příkladem takovýchto činidel jsou polymemí povrchově aktivní látky PLURONIC L62LF, L101 a L64, PEG1000 a TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301 a 130R1, popsané v publikacích BASF Wyandotte, například Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977; a Hunter a další, 129 J. Immunol. 1244, 1981. Chemické struktury těchto činidel jsou v současnosti dobře známé. Ve výhodném provedení vynálezu je toto činidlo vybráno tak, aby se jeho rovnováha na rozhraní hydrofilní látka-lipofílní látka (HLB - hydrophile-lipophile balance), jak je definována v článku Hunter a Bennett, 133 Joumal of Immunology 3167, 1984, pohybovala v intervalu 0 až 2. Ve výhodném provedení vynálezu je toto činidlo používáno v množstvím 0,5 až 10 %, výhodněji pak v množstvích mezi 1,25 až 5 %.

Olej je vybrán za účelem podpory při udržení příslušného antigenu v emulzi oleje ve vodě. To znamená, že olej vlastně slouží jako nosič příslušného antigenu. Ve výhodném provedení vynálezu má tento olej teplotu tání nižší než 65 °C, takže emulze je vytvořena buď při pokojové teplotě (přibližně 20 °C až 25 °C), nebo ve chvíli, kdy je teplota emulze snížena na hodnotu pokojové teploty. Příkladem takových olejů jsou skvalen, Skvalan, EICOSANE, tetratetrakontan, glycerol a olej z burských oříšků nebo jiné rostlinné oleje. Ve výhodném provedení vynálezu je

-4CZ 293439 B6 tento olej používán v množstvích 1 až 10 %, výhodněji pak v množstvích mezi 2,5 až 5 %. Je důležité, aby byl zmíněný olej biodegradovatelný a biokompatibilní, což znamená, že za určitý časový interval je organizmus schopen tento olej degradovat, a že při použití nemá tento olej v organizmu žádné nežádoucí účinky, jakými je například tvorba granulomů.

U výše zmíněných přípravků je důležité, aby tyto přípravky neobsahovaly peptidovou složku, zvláště pak, aby neobsahovaly muramyl dipeptid (MDP). Jestliže bude takový peptid administrován v přípravku do organizmu člověka v množství větším než 20 mikrogramů na jednu dávku, bude tento peptid interferovat s indukcí odpovědi CTL. Ve výhodném provedení vynálezu by io takové peptidy neměly být vůbec přítomny v antigenních přípravcích, i když je zjevný jejich pozitivní vliv na stimulaci humorální složky imunitního systému. To znamená, že podavatel patentu zjistil, že ačkoliv mohou tyto peptidy zesilovat humorální odpověď, je jejich použití nevýhodné v případech, kdy je požadována indukce odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.

Vynález dále popisuje kompozice, ve kterých je antigenní přípravek tvořen jenom dvěma ze tří výše zmíněných složek a tento přípravek je použit spolu příslušným antigenem (tímto termínem označujeme proteiny, polypeptidy a jejich fragmenty, které jsou imunogenní), kromě vaječného albuminu (nebo jiných albuminů, například HSA-lidského sérového albuminu, BSA-hovězího sérového albuminu a ovalbuminu), k indukci odpovědi CTL u výše zmíněných zvířat nebo lidí.

Předpokládá se, že při použití u lidí jsou výše zmíněné přípravky daleko výhodnější než přípravky v současnosti používané (včetně ISCOM, DETOX a SAF). Na rozdíl od těchto přípravků známých ze stavu techniky je společným rysem přípravků podle vynálezu skutečnost, že obsahují činidlo podporující tvorbu micel a zároveň neobsahují žádné peptidy, části 25 cytoskeletu nebo části bakteriálních buněk. Přípravky podle vynálezu rovněž indukují takovou odpověď CTL, ke které buď nedochází při použití přípravků známých ze stavu techniky, anebo je tato odpověď CTL při použití přípravků podle vynálezu značně silnější, než je tomu při použití přípravků známých ze stavu techniky.

Termínem „netoxický“ se rozumí skutečnost, že při použití antigenního přípravku nejsou u léčených živočichů ani u lidí pozorovány žádné nebo jen nepatrné vedlejší účinky. Odborníci v lékařství nebo ve veterinářství pochopí, že termín „netoxický“ má velmi široký význam. Například u v podstatě zdravých živočichů nebo lidí může být tolerována jen nízká toxicita, zatímco u lidí trpících nemocí ohrožujících jejich život, lze připustit i silnější toxicitu podávaného antigen35 ního přípravku.

Ve výhodných provedeních vynálezu se antigenního přípravku podle vynálezu v podstatě skládá ze dvou nebo ze tří následujících složek: z detergentu, činidla a oleje; způsob podle vynálezu v podstatě zahrnuje pouze jedinou administraci směsi (antigenu v kombinaci s antigenním 40 přípravkem) do organizmu živočicha nebo člověka; tento člověk nebo živočich je infikován nějakým virem a vykazuje jeden nebo více příznaků (tak, jak jsou obecně definovány odborníky v dané oblasti) typických pro danou virovou infekci; a daný antigenní přípravek je pro člověka nebo živočicha netoxický.

V jiných výhodných provedeních vynálezu je příslušný antigen vybrán z antigenních oblastí příslušejících antigenům viru HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev; z antigenních oblastí příslušejících antigenům malárie: proteinu CS a povrchovému proteinu 2 sporozoitu; z antigenních oblastí příslušejících povrchovým antigenům viru Hepatitidy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a HBe Ag; z antigenních oblastí příslušejících antigenům viru chřipky: HA, NP a NA; z antigenních 50 oblastí příslušejících povrchovým antigenům viru Hepatitidy A: z antigenních oblastí příslušejících antigenům Herpes viru: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, časný proteinový produkt HSV, z antigenních oblastí příslušejících antigenům lidského papilomaviru (například antigenů HPV jako například antigenů LI, E4, E6 a E7, zvláště pak antigenů E6 a E7 z HPV16 a HPV18 (tyto typy virů jsou nejobvykleji se vyskytující formy virů spojené s karcino55 mem děložního hrdla), antigenů E4 a LI odvozených od HPV6 a HPV11 (tyto typy virů jsou

-5CZ 293439 B6 nejobvykleji se vyskytující formy asociovaných se špičatým kondylomem - condyloma acuminatum); z antigenních oblastí příslušejících antigenu prostaty (PSA- prostatě specific antigen), cytomegaloviru gB, cytomegaloviru gH a proteinu gP72 IE; z antigenních oblastí příslušejících antigenům syncyciálního viru napadajícího respirační systém: proteinu F, proteinu G a proteinu N; a z antigenních oblastí příslušejících antigenům spojených s nádory: produkt CEA karcinomu, mucin spojený s karcinomy, produkt P21 karcinomu, produkt P53 karcinomu, produkt MPG melanomu, produkt p97 melanomu a produkt onkogenu Neu karcinomu, produkt genu p53 karcinomu, antigen melanomu nazývaný MÁGE a mutovaný protein p21 ras přítomný u velkého množství maligních nádorů.

Podobně vynález popisuje kompozice, které obsahují, skládají se nebo skládají se téměř výhradně z nějakého antigenu smíchaného s antigenním přípravkem popsaným výše, přičemž příslušný antigen je vybrán z antigenních oblastí vyjmenovaných v předešlém textu.

Jinou podobnou stránkou vynálezu je popis způsobů sloužících k léčbě pacientů infikovaných virem HTV, trpících malárií, trpících chřipkou, trpících hepatitidou, trpících rakovinným bujením, infikovaných Herpes virem, trpících karcinomem děložního hrdla, trpících špičatým kondylomem (condyloma acuminata - genitální bradavice) nebo infikovaných syncyciálním virem napadajícím respirační systém. Tato léčba je prováděna pomocí podání kompozice, která obsahuje příslušný antigen (například antigen vybraný ze skupiny antigenů vyjmenovaných v předešlém textu) smíšený s jedním z výše zmíněných antigenních přípravků. Zmíněné antigeny a způsoby léčby jsou jenom příkladem antigenů, které mohou být použity v kombinaci s antigenními přípravky.

Jiné stránky a výhody vynálezu budou zřejmé z následujících příkladů provedení vynálezu a z patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

Nejprve budou stručně popsány jednotlivé obrázky.

Popis obrázků

Obrázky 1A až 1C a 4A až 4C jsou grafickým znázorněním dat srovnávajících indukci CTL dosaženou použitím různých přípravků s ovalbuminem; poměr E:T označuje na všech obrázcích poměr efektorových buněk k cílovým buňkám a je vyznačen na vodorovné ose (obrázky 1 až 11). Na svislé ose je vyznačeno procento specifické cytotoxicity, rovněž popis svislé osy platí pro všechny obrázky 1 až 9.

Obrázek 1A popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu v HBSS, data pro buňky EL4 a EG7-ova jsou shodná.

Obrázek 1B popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu obsaženého vcytoplazmě. Odpověď měřená na buňkách EL4 je znázorněna prázdnými čtverečky, odpověď na EG-7 ova plnými.

Obrázek 1C popisuje indukci CTL po imunizaci ovalbuminem v antigenním přípravku. Odpověď měřená na buňkách EL4 je znázorněna prázdnými čtverečky, odpověď na EG-7 ova plnými.

Obrázky 2A a 2B jsou grafickým znázorněním dat srovnávajících indukci CTL dosaženou použitím β-galaktosidázy v HBSS (2a) a β-galaktosidázy s antigenním přípravkem (2b). Prázdné čtverečky platí pro buňky C3-4, plné pro buňky P815 (na obrázku 2a jsou tyto body shodné s vodorovnou osou).

-6CZ 293439 B6

Obrázek 3 je grafickým znázorněním dat srovnávajících indukci CTL dosaženou použitím ovalbuminu v lipozomech (čtverečky) a použitím ovalbuminu v kombinaci s antigenním přípravkem (plná kolečka).

Obrázek 4A popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu v HBSS.

Obrázek 4B popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu obsaženého v cytoplazmě.

Obrázek 4C popisuje indukci CTL po imunizaci ovalbuminem v antigenním přípravku.

Obrázek 5 je grafickým znázorněním dat ukazujících, jaký vliv má na indukci CTL selektivní odstranění buď CD4 buněk (plná kolečka), nebo CD8 buněk (plné čtverečky), kontrola bez odstraněných lymfocytů je značena prázdnými čtverečky.

Obrázek 6 popisuje účinek selektivního odstranění těchto subpopulací T-lymfocytů: primárně aktivovaných CD4 (A), primárně aktivovaných cd8 (B), CD8n a CD4p (C), CD4n a CD8p (D) a CD4p a CD8p (E).

Obrázek 7 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci CTL pomocí gp!20 v HBSS 20 (prázdné čtverečky) a v Idoxu (plná kolečka).

Obrázek 8 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci CTL pomocí směsi kopolymeru Pluronic a Tweenu spolu s antigenem. Účinek na buňky EL4 je vyjádřen prázdnými čtverečky, na buňky EG7 plnými kolečky.

Obrázek 9 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci CTL pomocí směsi skvalanu a Tweenu v kombinaci s antigenem. Účinek na buňky EL4 je vyjádřen prázdnými čtverečky, na buňky EG7 plnými kolečky.

Obrázek 10 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci CTL pomocí směsi skvalanu a kopolymeru Pluronic v kombinaci s antigenem. Účinek na buňky EL4 je vyjádřen prázdnými čtverečky, na buňky EG7 plnými kolečky.

Obrázek 11 je grafickým znázorněním účinků ova v kombinaci s těmito dvoj či trojsložkovými antigenními přípravky na odpověď CTL: antigenní přípravek S-T-P (A), antigenní přípravek S-T (B), antigenní přípravek P-T (C), antigenní přípravek S-P (D), HBSS (E) a antigenní přípravek SAF-M (F).

Obrázek 12 je grafickým znázorněním indukce protilátek proti gp 120111b u opic, které je dosaženo použitím různých antigenních přípravků. Na svislé ose je vyznačena hodnota absorbance při 405 nm, na vodorovné je ředění séra. Jednotlivé experimenty jsou označeny těmito symboly: 854/SPT/2d (A), 220/SPT/2d (B), 207/ST/2d (C), 222/ST/2d (d), 720/SAFm/2d (E), 722/SAFm/2d (F), 225/HBSS/2d (g), 208/HBSS/2d (H).

Obrázek 13 znázorňuje protinádorovou aktivitu buněk HOPE2, kterou vykazovaly deset dnů po jediné imunizaci rozpustným proteinem E7 v kombinaci s adjuvans. Na svislé ose je vyznačena velikost tumorů v mm³, na vodorovné dny po implantaci. Symboly odpovídají: 30/antigenní přípravek/Ix (A), 90/antigenní přípravek/lx (B), 90/Alum/lx (C) a kontrola (D).

Obrázek 14 znázorňuje protinádorovou aktivitu buněk HOPE2, kterou měly v časech 10 a 19 dnů po dvou imunizacích rozpustným proteinem E7 v kombinaci s adjuvans. Na svislé ose je vyznačena velikost tumorů v mm³, na vodorovné dny po implantaci. Symboly odpovídají: 30/antigenní přípravek/2x (A), 90/antigenní přípravek/2x (B), 90/Alum/2x (C) a kontrola (D).

Antigenní přípravky

Antigenní přípravky vhodné pro použití ve vynálezu jsou obecně popsány v předchozím textu. Odborníci zjistí, že mohou být poměrně snadno připraveny ekvivalentní přípravky, a že od těchto přípravků můžeme očekávat ekvivalentní vlastnosti ve vztahu k indukci odpovědi CTL. Vlastnosti takových přípravků mohou být poměrně snadno testovány za použití technik podobných níže popsaným technikám.

Následují příklady použití vynálezu, ve kterých je použit antigenní přípravek (AF-antigen formulation) tvořený přibližně 2,5 % skvalanu, 5 % pluronové ky seliny a Tweenem 80 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem. Emulze AF přesněji obsahuje: 15 mg skvalanu, 37,5 mg poloxameru 401 (PLURONIC L121), 6 mg polysorbátu 80 (Tween 80), 0,184 mg chloridu draselného, 0,552 mg dihydrogenfosforečnanu draselného, 7,36 mg chloridu sodného, 3,3 mg hydrogenfosforečnanu sodného (bezvodého) v 1 ml vody; výsledné pH = 7,4. Tato emulze byla mikrofluidizována prostřednictvím standardních technik (Microfluidics, model Mil OF) za použití modulu o zpětném tlaku 75,9 MPa až 96,5 MPa (11 000 až 14 000 psi) s postupným návratem tlaku na hodnotu atmosférického tlaku a chlazením pomocí ledu.

V jiných příkladech byl antigen smíchán s mikrofluidizovanou směsí skvalanu (S), kopolymeru Pluronic (P) a Tweenu 80 (T), v níž bylo dosaženo finální koncentrace jednotlivých složek: 0,2% Tweenu 80, 1,25% kopolymeru pluronic a 5% skvalanu. Za účelem stanovení, které z těchto složek jsou nezbytné k indukci antigen-specifícké imunitní odpovědi, byly v koncentracích odpovídajících třísložkové směsi připraveny dvojsložkové směsi Skvalan-Tween 80, Pluronic-Tween 80 a Skvalan-Pluronic. Pluronic, Svalan a Tween 80 byly rovněž použity individuálně za účelem stanovení vlivu těchto jednotlivých složek na indukci CTL. Za účelem stanovení účinků různých derivátů Tweenu na indukci CTL byly v ova systému namísto Tweenu 80 použity Tween 20, Tween 40 nebo Zwittergent. Ve třísložkových přípravcích byl Skvalan nahrazen Eikosonem nebo Triakontonem a namísto kopolymeru Pluronic byly ve stejných třísložkových přípravcích použity PEG1000, Pluronic L62LF a Tetronic 1501 a Tetronic 150R1. Co se týká dvoj složkových přípravků, za účelem testování indukce CTL specificky namířené proti antigenu ova, byly použity směsi nejrůznějších analog zmíněných složek v různých kombinacích. Patří sem například směsi cholesterol - Tween 80, Skvalan - Tween 20, Přistaň Tween 80 nebo olivový olej - Tween 80. Při studii zaměřené na stanovení stability, byla mikrofluidizovaná směs Skvalan-Tween 80 smíchána s dextrózou tak, aby bylo dosaženo finální koncentrace dextrózy 5 %. Ve všech případech byly kombinace jednotlivých aditiv smíchány v mikrofluidizéru za účelem vytvoření stabilní emulze. V některých experimentech byl, za účelem indukce odpovědi CTL a indukce humorální odpovědi, do dvoj složkových přípravků přidán muramyl dipeptid v různých koncentracích. V Tabulce 1 je znázorněn úplný seznam nejrůznějších přípravků použitých v této studii.

-8CZ 293439 B6

Tabulka 1: Účinky různých substitucí provedených ve dvoj složkových nebo třísložkových systémech

Substituce provedená ve třísložkových formulacích	počet usmrcených buněk (v % při poměru E:T-100:l
STP	84,0
TWEEN 40 (T)	66,0
TWEEN 20	48,0
T1501(P)48	0,0
T150R1 (P)	0,0
Pluronic L62LF (P)	47,0
Eikosan (S)	*
PEG1000 (P)	♦
Triakontan (S)	*
Zwittergent (T)	*
Substituce provedená ve dvoj složkových formulacích
ST	76,0
PT	45,0
SP	26,0
Cholesterol (S) + TWEEN 80	0,0
Skvalan + TWEEN 29 (T)	65,0
Přistaň (S) + TWEEN 80	42,0
Olivový olej (S) + TWEEN 80	69,0
Jednosložková formulace
PluronicL121	0,0
Skvalan	0,0
TWEEN 80	0,0
Skvalan + TWEEN 80 + 5% dextróza	86,0

stanovení cytotoxické aktivity CTL je prováděno znovu

Jako kontrolní adjuvans byl použit přípravek Syntex adjuvans (mikrofluidizovaný; SAFm - Syntex adjuvants formulation). Tento přípravek se skládá ze dvou částí. Část I se skládá z fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrem obsahujícího finální koncentrace jednotlivých složek: Skvalan - 5%, kopolymer Pluronic - 1,25% a Tween 80 - 0,2% (tato část se nazývá nosič nebo I-SAF). Část II se skládá zN-acetylmuramyl-L-threonyl-D-izoglutaminu (Thr-MDP), který je vlastně derivátem složky buněčné stěny mikroorganizmu rodu Mykobakterium. Za účelem imunizace byl antigen smíchán s mikrofluidizovaným nosičem (část I) a výsledkem byl vznik homogenní emulze. K. takto vytvořenému SAFm byl přidán MDP a celá směs byla krátce vortexována. Ve směsi bylo použito několik různých koncentrací MDP, aby bylo možné zjistit optimální koncentraci MDP pro indukci CTL. Myši byly rovněž imunizovány rozpustnými antigeny smíchanými podle návodu poskytovaného výrobcem (Pierce Chemical, Rockford, IL) s alum nebo smíchanými s Freundovým kompletním adjuvans (CFA).

Antigenní přípravek podle vynálezu je použit k indukci odpovědí cytotoxických T-lymfocytů u myší. Odborníkům je zřejmé, že takový myší model naznačuje, že stejné experimenty nebo stejná léčba budou vést k indukci odpovědí cytotoxických T-lymfocytů u lidí, domestikovaných nebo hospodářských zvířat. Množství antigenního přípravku a antigenu použitelné k vyvolání požadované buněčně zprostředkované odpovědi může být stanoveno empiricky pomocí standardních způsobů odborníkům dobře známým a není přitom třeba provádět přílišné množství

-9CZ 293439 B6 experimentů. Jestliže je tedy žádoucí minimalizovat vedlejší účinky těchto směsí při léčbě, jejíž cílem je vyvolat odpověď CTL a tudíž indukovat imunitu proti požadovanému antigenu, mohou odborníci určit minimální množství takové směsi určené k administraci do organizmu člověka, domestikovaného nebo hospodářsky významného živočicha. Při normálním použití bude taková směs do organizmu injikována jedním ze standardních způsobů, nicméně jako nejvýhodnější se jeví intramuskulámí injekce do místa, kde bude umožněno, aby emulze zůstala ve své stabilní formě po dobu několika dnů nebo týdnů.

Způsoby

Není-li řečeno jinak, byly v níže uvedených příkladech použity následující materiály a způsoby:

Myši Samice myší C57BL/6 (H-2b) a BALB/c (H-2d) byly zakoupeny od firmy Harlen Sprague (San Diego, Califomia).

Antigeny

Ovalbumin (ova, třída VII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) byl použit v nativním stavu. β-galaktosidáza (β-gal, třída VIII; BRL) byla použita jednak v nativním stavu a jednak po alkalické lýze prováděné v 1 M NaOH po dobu 2 minut při 100 °C. Rekombinantní protein gpl20 byl zakoupen od firmy Američan Biotechnology.

Nádorové buňky a transfikované buňky

Jako nádorové buňky byly použity Ia- linie buněk EL4 (thymom C57BL/6, H-2b) a buněk P815 (mastocytom DBA/2, H-2d). Příprava buněk EG7-ova, které jsou odvozeny od transfikované buněčné linie EL4 produkující ova, byla již dříve popsána v článku Moore a další, 54 Cell 777, 1988. Transfikované buňky PÍ3.1, které produkují β-gal byly odvozeny elektroporací z buněčné linie P815 o celkovém počtu buněk přibližně 10⁷. Elektroporace byla provedena v 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrem (PBS) a bylo kní použito 10 mg plazmidu pCHHO (Pharmacia LKB Biotechnology lne., Piscatawy, NJ) linearizovaného restrikční endonukleázou Pst I a 1 mg plazmidu pSV2 neo (Southem a další, 1 J. Mol. Appl. Genet. 327, 1982) linearizovaného restrikční endonukleázou Pvu I. Po této elektroporací následovala selekce v médiu obsahujícím 400 pg/ml antibiotika G418. Transfikovaná buněčná linie C3-4 byla odvozena od linie hybridomů BALB/c Igm 662 prostřednictvím transfekce těchto hybridomů plazmidem kódujícím gen pro β-gal; tento gen byl připojen ke třetímu a čtvrtému exonu kódujícímu těžký řetězec IgM (Rammensee a další, 30 Immunogenetics 296, 1989). Fibroblasty 3T3 exprimující gplóOIIIb (linie 15-12) byly poskytnuty Dr. Germainem zNIH (Bethesda, MD). Buněčnou linii L buněk transfikovanou genem Kb nám poskytl Dr. Carbone, Monash University, Australia. Buněčné linie L buněk transfikované geny Dl a Ld nám poskytl Dr. Ted Hensen, Washington University, St. Louis.

Imunizace

Myši byly imunizovány intravenózně 200 μΐ suspenze obsahující splenocyty (které byly předem nasyceny příslušným antigenem) v množství 25 x 10⁶, jak je popsáno v článcích Moore a další, 54 Cell 777, 1988 a Carbone a další, J. Exp. Med. 169:603, 1989. Při imunizacích směsmi ova-antigenní přípravek nebo β-gal-antigenní přípravek bylo na imunizaci jedné myši použito 30 pg jednotlivých proteinových antigenů. Myši byly imunizovány subkutánně (do podkožní vrstvy) u kořene ocasu nebo na polštářku chodidla. Každá injekce obsahovala 67 μΐ mikrofluidizovaného antigenního přípravku (připraveného pomocí standardních způsobů) a 30 pg proteinového antigenu v celkovém objemu 200 pl. Celkového objemu 200 μΐ bylo dosaženo přidáním HBSS, viz. Wittaker manual (Welkersville, MD). MDP bylo připraveno v množstvích 0 až

-10CZ 293439 B6

300 pg. Tam kde je řečeno, byly myši imunizovány rozpustnými antigeny v kombinaci s CFA nebo s alum o celkovém objemu 200 μΐ.

In vitro stimulace populace efektorových buněk

Slezinné buňky (30 x 10⁶) získané z „normálních“ nebo imunizovaných myší (tyto myši byly imunizovány nejméně o 14 dní dříve) byly, za účelem měření odpovědi na přítomnost ova, inkubovány s 1,5 x 10⁶ buněk EG7-ova (ozářených 20 000 rad) na 24 jamkových plotnách při 37 °C v atmosféře obsahující 7% CO2. Za účelem měření odpovědi na přítomnost β-gal byly slezinné buňky (30 x 10⁶) získané z „normálních“ nebo imunizovaných myší (tyto myši byly imunizovány nejméně o 14 dní dříve) inkubovány s 1,5 x 10⁶ buněk C3-4 (ozářených 20 000 rad) na 24 jamkových plotnách při 37 °C v atmosféře obsahující 7% CO2. Všechny experimenty na tkáňových kulturách byly prováděny v kompletním médiu, které je tvořeno IMDM médiem, viz. Wittaker manual (Welkersville, MD) doplněným 10% fetálního telecího séra (FCS), 2 mM glutaminem, gentamycinem a 2 x 10'⁵ M 2-merkaptoethanolem. Při in vitro experimentech, při nichž je ze směsi buněk selektivně odstraněn určitý typ buněk, byly in vivo primárně aktivované nebo in vitro stimulované buňky vystaveny působení monoklonálních protilátek (mAbs) RL.172 (anti-CD4) nebo monoklonálních protilátek 3.168 (anti-CD8). Toto působení monoklonálními protilátkami slouží k odstranění CD4+ nebo CD8+ T-buněk (Sarmiento a další, 125 J. Immunol. 2665, 1980 a Ceredig a další, 314 Nátuře 98, 1985). Monoklonální protilátky RL.172 a 3.168 byly získány od Dr. Johathana Sprenta ze Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

Slezinné buňky (30 x 10⁶) získané z „normálních“ nebo imunizovaných myší (tyto myši byly imunizovány nejméně o 21 dní dříve) byly inkubovány s 1,5 x 10⁶ buněk 15-12 (na které bylo předběžně, po dobu 45, minut působeno mitomycinem C v množství 200 pg/10⁸ buněk), nebo byly tyto slezinné buňky inkubovány v kompletním IMDM médiu (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) obsahujícím 10% předem otestovaného PCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, lne., Costa Mesa, CA), 2 mM glutamin, gentamycin a 2 x 10“⁵ M 2-merkaptoethanol, v němž je rovněž přítomno 500 pg peptidu 18111b obsahujícího epitop dominantní pro CTL myší Balb/c. Při in vitro stimulaci prostřednictvím peptidů byly slezinné buňky kultivovány v kompletním IMDM médiu obsahujícím 5% supematantu ConA.

Při experimentech, při nichž je ze směsi buněk selektivně odstraněn určitý typ buněk, byly invivo primárně aktivované nebo in vitro stimulované buňky podrobeny působení monoklonálními protilátkami (mAbs) RL.172 (anti-CD4) nebo monoklonálními protilátkami 3.1168 (anti-CD8) za přítomnosti králičího komplementu o nízké toxicitě (Cederlane Laboratories, Ltd., Homby Ontario, Canada). Toto působení monoklonálními protilátkami slouží k odstranění CD4+ nebo CD8+ T-buněk (22, 23). Monoklonální protilátky RL.172 a 3.168 byly získány od Dr. Johathana Sprenta ze Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

Stanovení cytotoxicity

Cílové buňky (1 x 10⁶) byly značeny po dobu 60 minut [⁵¹Cr] chromanem sodným o aktivitě 100 pCi. K cílovým buňkám, která byly za účelem experimentu povlečeny peptidovými fragmenty, bylo v průběhu jejich značení izotopem ⁵¹Cr přidáno 50 μΙ roztoku 1 mg/ml peptidu v HBSS. Po promytí bylo 10⁴ značených cílových buněk inkubováno po dobu 4 hodin při 37 °C s postupně zřeďovanými efektorovými buňkami v 200 μΐ RP10. Po skončení inkubace bylo odebráno 100 μΐ supematantu a specifická lýza byla stanovena jako: Specifická lýza (v procentech) = lOOx {(aktivita uvolněná působením CTL - spontánně uvolněná aktivita) / (maximální uvolněná aktivita - spontánně uvolněná aktivita)}. Spontánně uvolněná aktivita za nepřítomnosti cytotoxických T-lymfocytů (CTL) byla ve všech experimentech menší než 25 % maximálně uvolněné aktivity dosažené působením detergentu.

-11 CZ 293439 B6

Stanovení proti látkových odpovědí u myší a opic

Každá z jamek na 96-ti jamkových plotnách, s průřezem jamek ve tvaru U (Costar, Cambridge, MA), byla povlečena 150 ng ova nebo gpl20 rozpuštěnými v 50 μΐ HBSS a inkubována přes noc při 4 °C. Při stanovení proti látkových odpovědí proti ova a proti gpl20 u myší, byly plotny blokovány po dobu 1 hodiny roztokem 1% BSA. Do každé jamky byla přidána postupně ředěná séra v objemech 25 μΐ/jamka a inkubována po dobu 2 hodin. Plotny byly promyty a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ kozího IgG proti myším protilátkám ve zředění 1:1000 konjugovaného s křenovou peroxidázou (HRPO- horše radish peroxidase, SBT, Alabama) v roztoku obsahujícím 1% BSA. Po jedné hodině inkubace byly plotny promyty a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ substrátu. Po 10 až 15 minutách byla odečítaná OD405. Při stanovení protilátkových odpovědí proti gpl20 u opic byly všechny kroky totožné s výše zmíněnými kroky s výjimkou faktu, že jak blokování ploten, tak zřeďovací sér bylo prováděno v 5% kozím séru v Hankově rovnovážném roztoku.

Syntéza peptidů

Syntetické peptidy odpovídající aminokyselinové sekvenci ovalbuminu (ova 253 až 276) tvořené aminokyselinami 253 až 276 (Sekvence číslo 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; kde je použit standardní jednopísmenný kód aminokyselin), aminokyselinové sekvenci myelinového bazického proteinu (MBP 84 až 102) tvořené aminokyselinami 84 až 102 (Sekvence číslo 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP) a syntetické peptidy odpovídající aminokyselinové sekvenci gp 120111b tvořené aminokyselinami 308 až 322 (sekvence 18111b) byly syntetizovány peptidovou syntézou na pevné fázi za použití syntetizéru Applied Biosystems 430A. Aminokyseliny byly kondenzačně připojovány ve formě symetrických anhydridů s výjimkou asparaginu, glutaminu aargininu, které byly připojovány ve formě esterů hydroxybenzotriazolu. Účinnost tvorby peptidových vazeb byla sledována pomocí ninhydrinové reakce způsobem popsaným v článku Kaiser a další, 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Peptidy byly z matrice uvolněny působením HF za využití „high-low“ způsobu popsaného v článku Tam a další, 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983. Peptidy byly následně od matrice odděleny extrakcí 10% kyselinou octovou. Po lyofilizaci byly peptidy odsoleny na koloně Sephadex G-25 a jednotlivé peptidy byly poté purifikovány HPLC chromatografií na reverzní fázi na preparativní koloně C-18 Vydac. Purifikované peptidy (98%) byly solubilizovány v HBSS do finální koncentrace 10 mg/ml a následně zředěny v kompletním médiu na požadovanou koncentraci.

Štěpení pomocí CNBr

Vzorky proteinů (například β-galaktosidáza) byly vystaveny působení 100 násobného molámího nadbytku bromkyanu v roztoku 100 mM kyseliny trifluoroctové. Reakce probíhala 18 hodin při teplotě místnosti (okolo 20 °C) za stálého promíchávání. Po uplynutí reakčního času byly peptidové štěpy separovány od reaktantů pomocí zařízení SEP-PAK C-18 (Waters), eluovány 95% acetonitrilem a lyofilizovány.

Alkalické štěpení

Vzorky proteinů (například β-galaktosidáza) byly vystaveny působení 1 N NaOH a povařeny po dobu dvou minut. Získané peptidové fragmenty byly separovány od reaktantů pomocí zařízení SEP-PAK C-18 (Waters), eluovány 95% acetonitrilem a lyofilizovány.

-12CZ 293439 B6

Příklad 1: Primární aktivace CTL namířených proti buňkám exprimujícím antigen v komplexu s MHC glykoproteiny I. Třídy

Moore a další, 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 a Carbone a Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377, 1990 ukázali, že u myší imunizovaných slezinnými buňkami, jejichž cytoplazma byla nasycena rozpustným ova, došlo k indukci odpovědi CTL, která byla specificky namířená proti ova prezentovanému v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy. Buněčná linie EG7-ova, což jsou vlastně transfikované buňky EL7 exprimující ova, byla použita k in vitro stimulaci primárně aktivovaných (in vivo) lymfocytů přítomných ve slezině a buňky EG7-ova byly rovněž využity jako cílové buňky, které jsou „zabíjeny“ činností CTL, specificky namířených proti ova. Tato studie rovněž prokázala, že CD8+ efektorové buňky indukované prostřednictvím transfikovaných buněk EG7-ova nebo prostřednictvím slezinných buněk s cytoplazmou nasycenou antigenem ova rozpoznávající část ova tvořenou aminokyselinami 258 až 276 v komplexu sH-2Kb, lyžují buňky EG7-ova a rovněž ničí buňky EL4 pokryté částí ova tvořenou aminokyselinami 258 až 276. Za účelem stanovení, jestli může být, za použití rozpustného antigenu, indukována dráha zprostředkovaná endogenními CD8+ T-buňkami namířenými proti buňkám nesoucím antigen v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy, byl tudíž použit výše zmíněný systém, který umožňuje určit, jestli nějaký antigenní přípravek může být použit, spolu s rozpustným antigenem, k indukci odpovědi CTL namířené proti buňkám nesoucím antigen v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy.

a) ova

Myši C57BL/6 byly jednou imunizovány různými množstvími ova (30 pg až 1 mg ova na jednoho jedince) v kombinaci s nebo bez antigenním přípravkem. Myši byly injikovány subkutánně a do kořene ocasu. Nejdříve dva týdny po imunizaci byly z imunizovaných myší odebrány slezinné buňky a tyto buňky byly in vitro stimulovány prostřednictvím transfikovaných buněk EG7-ova. Použití antigenu ova v množství kolem 30 pg bylo stejně účinné jako dávka obsahující 1 mg ova. Studie CTL byly tudíž rutinně prováděny se slezinnými buňkami získanými z myší imunizovaných 30 pg ova. Po pěti dnech kultivace slezinných buněk s EG7-ova byla existence primární aktivace stanovena na základě přítomnosti efektorových buněk specificky namířených proti ova, které jsou schopny lyžovat buňky EG7-ova.

Myši injikované ova rozpuštěným v HBSS, kde množství ova použité na jednu imunizaci dosahovalo až 1 mg, nevykazovala žádné stopy indukce CTL (Obrázek IA). Nicméně myši imunizované 30 pg ova v kombinaci s antigenním přípravkem popsaným výše vykazovaly výraznou odpověď CTL namířenou proti buňkám transfikovaným příslušným antigenem (obrázek 1C). Navíc množství buněk EG7-ova usmrcených prostřednictvím slezinných buněk získaných z myší imunizovaných pomocí ova-AF bylo srovnatelné s množstvím buněk EG7-ova usmrcených prostřednictvím slezinných buněk získaných z myší imunizovaných pomocí slezinných buněk nasycených antigenem ova (obrázek 1B).

Skutečnost, že in vivo primární aktivace CTL byla antigen specifická, byla prokázána tak, že slezinné buňky získané z myší imunizovaných β-galaktosidázou nevykazovaly in vitro sekundární odpověď CTL, jestliže byly stimulovány buňkami EG7-ova. Nebyla pozorována žádná indukce CTL namířená proti ova.

b) β-galaktosidáza

Obdobné výsledky byly získány při použití jiného rozpustného proteinového antigenu, kterým byla β-gal. Za účelem stanovení odpovědi CTL specificky namířené proti β-gal byly jako cílové buňky použity buňky C3-4 exprimující β-gal, odvozené transfekcí od buněčné linie získané z myší BALB/c. Při imunizaci myší BALB/c rozpustnou β-gal bylo zjištěno určité „pozadí“ u odpovědi CTL. Za účelem stanovení specifické odpovědi CTL byla tedy izolace slezinných

-13CZ 293439 B6 lymfocytů odložena přinejmenším o osm týdnů a tyto lymfocyty byly následně kultivovány po dobu pěti dnů za přítomnosti ozářených transfikovaných buněk C3-4.

Obrázek 2B ukazuje, že 30 pg β-galaktosidázy v AF indukovalo silnou odpověď CTL specificky namířenou proti transfikovaným buňkám C3-4. Při poměrech efektorová buňka ku cílové buňce (E:T) 3 ku 1, byly buňky izolované z myší imunizovaných β-galaktosidázou použitou v kombinaci s AF schopny specificky usmrtit přibližně 80 % buněk C3-4. Nicméně při použití efektorových buněk izolovaných z myší imunizovaných β-gal v HBSS bylo při stejném poměru E:T dosaženo usmrcení pouze 20 % cílových buněk (obrázek 2A). Jelikož ani buňky EL4 ani buňky P815 neexprimují na svém povrchu MHC glykoproteiny II. třídy a lýza buněk je syngenně omezená, jsou efektorové buňky specificky namířené proti ova a β-gal ve svém působení omezené na cílové buňky exprimující MHC glykoproteiny I. třídy.

Aby byla prokázána efektivita antigenního přípravku, byly myši imunizovány rozpustným ova zapouzdřeným do dvou typů lipozomů, z nichž jedním typem byly lipozomy citlivé na změny v pH. Po jednom týdnu byly slezinné buňky in vitro stimulovány způsobem popsaným výše a bylo testováno jejich působení proti buňkám EG7-ova nebo EL4 značených izotopem 51Cr. Na Obrázku 3 jsou znázorněny reprezentativní výsledky ze kterých vyplývá, že antigen ova v lipozomech není u myší schopen vyvolat indukci CTL. Podobné výsledky byly získány v experimentech, kdy byly myši imunizovány antigenem ova v alum.

Příklad 2: Rozpoznání epitopu prostřednictvím CTL

Carbone a Bevan, viz výše, prokázali, že CTL indukované v myších C57BL/6 pomocí transfikovaných buněk EG7-ova anebo pomocí splenocytů, jejichž cytoplazma je nasycena ova, rozpoznávají buňky EL4, na jejich povrchu je přítomen peptid tvořený aminokyselinami 258 až 276 z ova. Za účelem stanovení, jestli rozpustný ovalbumin v kombinaci s AF indukuje podobné odpovědi CTL, byly z imunizovaných myší izolovány slezinné buňky a tyto buňky byly následně in vitro stimulovány s využitím EG7-ova. U efektorových buněk bylo testováno jejich působení proti buňkám EL4, na jejichž povrchu je přítomen peptid tvořený aminokyselinami 258 až 276 z ova, nebo proti buňkám EL4, na jejichž povrchu je přítomen peptid odvozený zmyelinového bazického proteinu (MBP 84-102). Získané výsledky ukazují, že CTL primárně aktivované pomocí ova-AF mají podobnou specifitu jako CTL primárně aktivované pomocí transfikovaných buněk nebo pomocí buněk, jejichž cytoplazma je nasycena ova (Obrázky ΙΑ, 1B a 1C). Efektorové buňky primárně aktivované pomocí ova-AF účinně lyžovaly buňky EG7-ova a netransfíkované buňky, jejichž povrch byl pokryt peptidem ova v množství 50 pg/10⁸ buněk, ale tyto efektorové buňky nelyžovaly buňky EL4, jejichž povrch byl pokryt peptidem MBP v množství 50 pg/10⁸ buněk.

Článek Carbone a Bevan, viz. výše, naznačuje, že v systému s β-galaktosidázou, v němž byly CTL indukované prostřednictvím transfikovaných buněk exprimujících β-gal nebo v němž byly CTL indukovány prostřednictvím splenocytů cytoplazmaticky nasycených rozpustnou β-galaktosidázou, lyžovaly tyto CTL indukované prostřednictvím splenocytů cytoplazmaticky nasycených rozpustnou β-galaktosidázou, lyžovaly netransfíkované buňky P815, jejichž povrch byl pokryt fragmenty získanými alkalickou lýzou β-galaktosidázy. Jestliže byly myši imunizované rozpustnou β-galaktosidázou v kombinaci s AF, došlo k indukci CTL, a takto indukované buňky měly podobnou specifitu jako buňky indukované způsobem zmíněným výše (Obrázek 2).

Příklad 3: Efektorové buňky CTL jsou CD8+ T-buňky

Skutečnost, že rozpustné proteinové antigeny v kombinaci sAF indukují CD8+ efektorové T-buňky, byla prokázána následovně. Splenocyty získané z imunizovaných myší byly in vitro

-14CZ 293439 B6 kultivovány spolu s ozářenými transfikovanými buňkami po dobu pěti dní. Následně byly buňky posbírány a ze směsi buněk byly za použití monoklonálních protilátek proti CD4 a proti CD8 spolu s komplementem selektivně odstraněny CD4+ a CD8+ T-buňky. Takto upravené buněčné populace byly poté testovány proti buňkám EG7-ova značeným izotopem 51Cr (v ova systému) nebo proti buňkám PÍ3.1 značeným izotopem 51Cr (v β-gal systému). Data znázorněná na obrázku 4. naznačují, že v ova systému byla při použití populace buněk, z níž byly selektivně odstraněny CD8+ T-buňky, úplně zrušena cytolytická aktivita celé této populace efektorových buněk. Nicméně selektivní odstranění populace CD4+ T-buněk nemělo žádný vliv na lýzu buněk EG7-ova.

Podobně v β-gal systému vedlo selektivní odstranění CD8+ T-buněk ke zrušení cytolytické aktivity slezinných buněk získaných z myší imunizovaných antigenním přípravkem v kombinaci s antigenem β-gal.

Příklad 4: Rozpustný ova v kombinaci s AF primárně aktivuje CD8+ T-buňky

Za účelem prokázat, že směs ova-AF in vivo primárně aktivuje populace CD8+ T-buněk, a že tato primární aktivace je nezbytná k vyvolání sekundární odpovědi in vitro, byly ze slezinných buněk získaných z myší imunizovaných směsí ova-AF a z neimunizovaných myší selektivně odstraněny populace CD4+ buněk a CD8+ buněk. Takto zpracované populace byly následně in vitro stimulovány za použití samotných buněk EG7-ova nebo buněk EG7-ova spolu s CD4+ aCD8+ T-buňkami získanými z myší imunizovaných směsí ova-AF, nebo za použití buněk EG7-ova použitých v různých kombinacích s CD4+ buňkami nebo CD8+ buňkami získanými z myší imunizovaných směsí ova-AF spolu s CD4+ buňkami nebo CD8+ buňkami získanými z neimunizovaných myší. Obrázek 5 ukazuje, že primárně aktivované CD8+ buňky jsou nezbytné k manifestaci sekundární odpovědi CTL in vitro. Tato data rovněž naznačují, že k účinné sekundární odpovědi CTL in vitro jsou zapotřebí CD4+ T-buňky. CD4+ buňky nejsou potřebné k primární aktivaci. Obdobně, CD8+ T-buňky jsou nezbytné k in vitro manifestaci sekundární odpovědi CTL specificky namířené proti β-gal.

Výše zmíněné příklady ukazují účinky zmiňovaného antigenního přípravku na indukci odpovědí CTL namířených proti rozpustným proteinovým antigenům, přičemž tyto antigeny jsou rozpoznávány v kontextu MHC glykoproteinů I. třídy. Antigenní přípravek zprostředkoval primární aktivaci CTL rozpustnými antigeny a takto indukované CTL mají podobnou aktivitu jako CTL indukované prostřednictvím transfikovaných buněk a splenocytů cytoplazmaticky nasycených rozpustným ova nebo β-gal. V systému s ovalbuminem buňky EG7-ova, splenocyty cytoplazmaticky nasycené ova a směs ova-AF indukují: (a) CD8+ CTL, které rozpoznávají antigen v kontextu MHC glykoproteinů I. třídy; (b) CTL, které rozpoznávají cílové buňky senzitizované syntetickým peptidem o aminokyselinové sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci ova 253 až 276; a (c) dlouhožijící CTL po jediné imunizaci. V β-galaktosidázovém systému indukuje směs β-gal-AF CTL, které rozpoznávají transfikované buňky C3-4 exprimující β-gal, a rovněž rozpoznávají netransfikovaná buňky P815 senzitizované peptidovými fragmenty získanými alkalickou lýzou β-gal. Tato skutečnost je analogická dějům pozorovaným při indukci CTL prostřednictvím imunizace pomocí slezinných buněk cytoplazmaticky nasycených β-galaktosidázou. Indukce CTL, specificky namířených proti ova, prostřednictvím antigenního přípravku je unikátní, protože ani ova zapouzdřený v lipozomech reagujících na změnu pH, ani ova ve směsi s alum nejsou schopny in vivo primárně aktivovat CTL.

Zmíněné příklady naznačují, že antigenní přípravek použitý výše a jeho ekvivalenty, jsou využitelné k léčbě lidí a k vývoji vakcín sloužících k indukci CTL při různých rakovinných bujeních a virových onemocněních.

-15CZ 293439 B6

Příklad 5:

Tento specifický příklad ukazuje použití výše zmíněné AF za účelem primární aktivace CTL rozpoznávajících antigen v kontextu MHC glykoproteinů I. třídy prostřednictvím rozpustného gpl20 viru HIV.

Buněčná linie exprimující gpl60 IIIB (15-12) byla vytvořena z buněčné linie 3T3 odvozené od linie fíbroblastů získaných z myší Balb/c. Tato linie byla získána od Dr. Rona Germaina a Dr. Jaye Berzofskeho z National Institute of Health, Bethesda, M. D. Buněčná linie exprimující gpl60 byla využita k in vitro stimulaci in vivo primárně aktivovaných slezinných lymfocytů a rovněž byla použita jako cílové linie pro měření indukce CTL specificky namířených proti gpl60. Myši Balb/c byly jednou imunizovány 10 pg gpl60 v kombinaci s nebo bez AF. Imunizace byla provedena subkutánní injekcí do polštářku na chodidle nebo do kořene ocasu. Dva týdny po imunizaci byly z imunizovaných myší izolovány slezinné buňky a tyto buňky byly in vitro stimulovány prostřednictvím ozářených buněk transfíkovaných gpl60. Po pětidenní kultivaci in vitro byla účinnost primární aktivace stanovována měřením přítomnosti efektorových buněk schopných specificky lyžovat buňky transfíkované gpl60 a nelyžovat netransfikované buněčné linie. Získané výsledky jsou zobrazeny na obrázku 7, na němž vidíme, že odpověď CTL je mnohonásobně zesílena přítomností AF a gpl20.

Následující příklad demonstruje použití antigenních přípravků podle vynálezu s využitím pouze jedné nebo dvou složek. Tyto příklady ukazují, že odpovědi CTL mohou být indukovány za použití pouze dvou z výše zmíněných tří složek.

Příklad 6: Stanovení složek nepostradatelných k indukci CTL

Za účelem zjištění, zda-li jsou všechny zvýše zmíněných komponent nezbytné kantigenspecifické indukci CTL, byly myši imunizovány ovalbuminem v kombinaci s mikrofluidizovanou přípravkem tvořeným různými kombinacemi dvou nebo tří komponent přítomných ve výše zmíněné AF. Byly použity následující dvojsložkové přípravky; Skvalan/Tween v PBS, Skvalan/Pluronic v PBS nebo Pluronic/Tween v PBS. Jiné sady přípravků byly použity v experimentech, ve kterých byly myši imunizovány pomocí ova v kombinaci s jednosložkovým systémem, například v kombinaci se Skvalanem v PBS, kopolymerem Pluronic v PBS nebo Tweenem v PBS. Výše zmíněný třísložkový antigenní přípravek byl modifikován tak, že byly postupně vyčleňovány jednotlivé složky a tyto složky byly nahrazeny PBS.

Výše zmíněné antigenní přípravky obsahují: 0,300 g Tweenu 80 (Aldrich, WI), 1,875 g Pluronic LI21 (BASF, NJ) a 7,5 g Skvalanu (Aldrich, WI) doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Použité dvojsložkové přípravky:

Skvalan/Tween: 0,300 g Tweenu 80 a 7,5 g Skvalanu doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Pluronic/Tween: 1,875 g Pluronic L121 a 0,300 g Tweenu 80 doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Pluronic/Skvalan: 1,875 g Pluronic L121 a 7,5 g Skvalanu doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Vzorky byly zpracovány v mikrofluidizéru, typ 110T, Microfluidics corp, uzavřeny do lahví a skladovány při 4 °C až do doby použití.

-16CZ 293439 B6

Ovalbumin (Sigma, MO) byl zvážen a rozpuštěn v HBSS (Whittaker, viz výše) na výslednou koncentraci 0,3 mg/ml. Tento zásobní roztok ovalbuminu o koncentraci 0,3 mg/ml byl smíchán v následujících poměrech s dvojsložkovým přípravkem: 5 dílů roztoku ovalbuminu o koncentraci 0,3 mg/ml, 3,3 dílu dvoj složkového přípravku a 1,7 dílu HBSS.

Připravený přípravek byl vortexován a uchováván na ledu až do doby, kdy by injikován. Všechny roztoky byly smíchány těsně před injikováním.

Každá myši obdržela prostřednictvím injekce do obou polštářků na chodidlech 200 μΐ některého z přípravků obsahující 30 pg ova a zbylý roztok byl injikován subkutánně do kořene ocasu. Vlastní odebrání sleziny bylo provedeno dva až čtyři týdny po imunizaci.

Dva týdny po imunizaci byly z myší izolovány slezinné buňky a tyto buňky byly in vitro stimulovány prostřednictvím ozářených buněk EG7-ova. Po pěti dnech kultivace byla přítomnost CTL specificky namířených proti ova měřena pomocí testů prováděných při 4 °C na buňkách EG7-ova značených izotopem 51Cr nebo na buňkách EL4 značených izotopem 51Cr, při kterých bylo měřeno uvolňování izotopu 51Cr. Data znázorněná na obrázcích 8 až 10 ukazují, že ovalbumin vpravený do mikrofluidizovaného dvojsložkového přípravku může in vivo specificky (proti ova) primárně aktivovat CTL.

Dále jsme hodnotili relativní příspěvky jednotlivých složek vzhledem kjejich schopnosti indukovat, jsou-li přítomny v kombinaci s proteinovými antigeny, CTL. Za účelem imunizace byl rozpustný antigen smíchán s mikrofluidizovanými excipienty a výsledkem byl vznik stabilní homogenní emulze tvořené částicemi o velikosti 250 až 300 nm. Za účelem určení, které ze složek přípravku tvořené Skvalanem-Tweenem 80-Pluronic (STP) jsou zodpovědné za indukci CTL, jsme imunizovali myši antigenem ova v kombinaci se směsí Skvalan-Tween 80 (ST), se směsí Pluronic-Tween 80 (PT) nebo se směsí Skvalan-Pluronic (SP) a jako kontrola byl použit antigen ova v kombinaci se Skvalanem (S), Tweenem 80 (T) nebo kopolymerem Pluronic (P). Myši byly rovněž imunizovány pomocí ova-SAF (obsahujícího 70 pg MDP) nebo pomocí ova-alum, které sloužily jako kontrolní adjuvans. Jako pozitivní kontrola byly použity myši imunizované slezinnými buňkami cytoplazmaticky nasycenými rozpustným ova. Byly rovněž použity další kombinace složek a také přípravky, ve kterých byla některá ze složek nahrazena nějakým substituentem. Získané výsledky jsou znázorněny v Tabulce 1.

Při experimentech sloužících k detekci primární aktivace CTL byly myši imunizovány pouze jednou. Dva týdny po imunizaci byly slezinné buňky smíchány s ozářenými buňkami EG7-ova (buňkami EL4 exprimujícími ova) a po pěti dnech kultivace bylo testováno jejich působení proti buňkám EG7-ova značených izotopem 51Cr nebo proti buňkám EL4 značených izotopem 51Cr. Získané výsledky (Obrázek 11) ukazují, že 30 pg ova v kombinaci sSTP nebo ST primárně aktivuje u myší odpověď CTL, které rozpoznávají antigen v kontextu MHC glykoproteinů

I. třídy. Primární aktivace CTL specificky namířených proti ova byla při použití ova v kombinaci s STP nebo s ST lepší, než tomu bylo u primární aktivace CTL pomocí slezinných buněk cytoplazmaticky nasycených rozpustným ova. Ova v kombinaci s PT nebo s SP mohl sice u myší indukovat specifické odpovědi CTL, ale jen velmi slabě a nedůsledně. Přidání MDP do přípravku obsahující ST neblokovalo, na rozdíl od účinků na přípravek SAFm, u myší indukci CTL specificky namířených proti ova (Tabulka 2). Jestliže byly myši imunizovány pomocí ova smíchaného s jednotlivými složkami - S, P nebo T - nebo jestliže byly myši imunizovány pomocí ova-SAF nebo ova-alum, nedošlo k žádné indukci CTL specificky namířených proti ova. U myší imunizovaných ova v množství až 1 mg v (a) kombinaci s HBSS, (b) v kombinaci s SAF nebo (c) absorbovaným valum nedošlo k primární aktivaci CTL specificky namířených proti ova.

-17CZ 293439 B6

Tabulka 2: Indukce odpovědi CTL specificky namířené proti ova není blokována prostřednictvím ST + MDP

Stimulant	Cílové buňky **	E:T	cytotoxicita (v %)	u myší imunizovaných pomocí
-ova-ST	ova-ST	ova-ST-MDP 300 pg/myš	ova-ST-MDP 72 pg/myš
EG7-ova	EG7-ova	100:1	0	100	82	76
		33:1	0	86	67	62
		11:1	0	33	39	25
		3:1	0	6	13	3
		1:1	0	0	0	0
		1:3	0	0	0	0

* myši byly imunizovány 30 pg ova v kombinaci s různými formulacemi ** cytotoxicita (v procentech) byla vypočítána tak, že od procentuálního množství usmrcených buněk daného typu bylo odečteno procento usmrcených buněk u linií, které neexprimují antigen

Příklad 7: Složky nezbytné k produkci protilátek specificky namířených proti ova

Myši byly celkem třikrát ve dvoutýdenních intervalech imunizovány pomocí 30 pg ova v kombinaci s HBSS, STP, ST, PT nebo SP. Jako pozitivní kontrola byly použity myši imunizované pomocí ova-SAF, protože je známo, že SAF indukuje silnou protilátkovou odpověď. Sedm dní po druhé a po třetí imunizaci byla myším odebrána krev a séra byla testována na přítomnost protilátek specificky namířených proti ova. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 3. Tyto výsledky naznačují, že myši imunizované pomocí ova v kombinaci s STP, ST nebo SAF vykazují po dvou imunizacích podobné humorální odpovědi specificky namířené proti ova.

Tabulka 3: Indukce protilátkové odpovědi namířené proti ova

30 pg ova/zvíře	počet myší, u kteiých nastala reakce/počet myší injikovaných	1/zředění titr séra
HBSS	0/3	<1/20, <1/20, <1/20
STP	3/3	<1/4860, >1/4860, <1/4860
ST	3/3	>1/4860, >1/4860, >1/4860
PT	NA	NA, NA, NA
SP	NA	NA, NA, NA
SAF-M	3/3	1/4860, 1/4860, 1/4860

* NA; není k dispozici

Příklad 8: Indukce CTL specificky namířená proti gpl20 viru HIV

Za účelem měření indukce CTL byl jako druhý antigenní systém použit gpl20 IIIB viru HIV v kombinaci sSTP, ST nebo MP-T. Myši byly imunizovány lpg gp210 Illb v kombinaci s HBSS, STP, PT nebo ST. Jako kontrola byly použity myši imunizované 1 pg gpl20 Illb v kombinaci s SAF nebo CFA (kompletní Freundovo adjuvans) nebo v systému RIBI, který obsahuje MPL (monofosfátu lipidu A) a TDM (Trehalose dimycolite - dimykolit trehalózy). Tři týdny po imunizaci byly získány slezinné buňky a tyto buňky byly in vitro stimulovány transfikovanými

-18CZ 293439 B6 buňkami 15-12 vystavenými působení mitomycinu nebo byly stimulovány peptidem 18111b. Po pěti dnech kultivace byly vzniklé efektorové buňky testovány v působení proti buňkám P815 infikovaným virem vaccinia:gpl60 nebo rodičovským virem vakcinia.

Získané výsledky ukazují, že přípravek gpl20-Skvalan-Tween 80 indukoval u myší odpověď CTL specificky namířenou proti gpl20, ale ktéto indukci nedošlo při použití přípravku gpl20-Skvalan-Tween 80-Pluronic nebo gpl20-HBSS (Tabulka 4).

Tabulka 4: Indukce odpovědi CTL specificky namířené proti gpl20 u myší

Stimulant	Cílové buňky**	E:T	cytotoxicita (v %) u myší imunizovaných pomocí*
gpl20-HBSS	gpl20-ST	gpl20-STP
18IIIb/IL2	vakc:gpl20	100:1	23	42	na***
		33:1	23	38	NA
		11:1	0	0	NA
		3:1	0	35	NA
18IIIb/IL2	15-12	100:1	0	50	0
		33:1	0	35	0
		11:1	0	27	0
		3:1	0	18	0
18IIIb/IL2	3T3 + 18111b	100:1	0	59	13
		33:1	0	59	2
		11:1	0	57	0
		3:1	0	29	0
15-12	vakc:gpl20	100:1	35	84	NA
		33:1	19	65	NA
		11:1	12	37	NA
		3:1	0	22	NA
		1:1	0	0	NA

* myši byly imunizovány 1 pg gpl 20III v kombinaci s různými formulacemi ** cytotoxicita (v procentech) byla vypočítána tak, že od procentuálního množství usmrcených buněk daného typu bylo odečteno procento usmrcených buněk u linií, které neexprimují antigen *** NA; není k dispozici

Příklad 9: Indukce humorální odpovědi u myší specificky namířené proti gpl20

Za účelem indukce humorální odpovědi specificky namířené proti gpl20 byly myši imunizovány 1 pg gp 120111b celkem třikrát ve dvoutýdenních intervalech. Těmto zvířatům byla odebrána krev a získané sérum bylo metodou ELISA na pevné fázi testováno na přítomnost protilátek typu IgG gpl20-ST je více imunogenní než gpl20-HBSS, gpl20-SAF nebo gpl20-STP (Tabulka 5).

-19CZ 293439 B6

Tabulka 5: Indukce protilátkové odpovědi namířené proti gpl20

1 gg gpl20/zvíře formulace	počet myší, u kterých nastala reakce/počet myší injikovaných	1/zředění titr séra
HBSS	0/3	<1/20, <1/20, <1/20
STP	1/3	<1/20, >1/4860, <1/20
ST	3/3	>1/4860, >1/4860 >1/4860
PT	3/3	>1/4860, >1/4860, >1/4860
SP	2/3	<1/20, 1/540, 1/540
SAF-M	2/3	1/180, >1/4860, 1/540

Příklad 10: Protilátkové odpovědi specificky namířené proti gpl20 u opic

Opice (dvě ve skupině) byly imunizovány pomocí gpl20-SAFm, gpl20-SPT, gpl20-ST nebo gpl20-HBSS. Jako kontrola byla použita skupina opic, kde byla zvířata imunizována rekombinantním virem vakcinia nesoucím gpl60 Illb. Opice byly imunizovány ve dvoutýdenních intervalech a krev jim byla odebrána tři týdny po druhé imunizaci. Séra získaná z každé opice před imunizací a po imunizaci byla postupně zřeďována a metodou ELISA, tak, jak je popsáno v oddíle Materiál a metody, byla v sérech stanovována protilátková aktivita proti gpl20. Data (obrázek 12) naznačují, že u opic imunizovaných gpl20-STP nebo gpl20-SAFm jsou indukovány podobně silné humorální odpovědi. U jedné opice imunizované pomocí gpl20-ST byla indukována odpověď proti gpl20 podobná odpovědím u opic imunizovaných pomocí gpl20-SAFm nebo gpl20-SPT. U jedné opice imunizované pomocí gpl20-ST nedošlo ani po dvou imunizacích k indukci silné odpovědi proti gpl20.

Příklad 11: In vivo aktivita AF použité v kombinaci s HPV 16 E7

1. Tvorba rekombinantního proteinu HPV 16 E7 použitého k imunizaci

a) PCR a klonování genu E7

Gen HPV 16 E7 byl klonován zplazmidu získaného od Dr. Karen Vousdenové (Ludwig Institute) kódujícího gen E7 odvozený z buněčné linie karcinomu CaSki. Kódující oblasti byly amplifikovány pomocí PCR za použití příměrů, které jsou komplementární k 5' a 3' koncům kódující sekvence genu a navíc obsahují klonovací místa pro restrikční enzymy BamHI a Sal I. PCR produkt E7 byl zaligován do expresívního vektoru pGEX - 4T-1 (Pharmacia Biotech) a výsledkem této ligace byl expresívní plazmid pGEX.E7. Tímto expresívním plazmidem pGEX.E7 byly transfikovány baktérie E. coli kmene XL1 - blue (Stratagene). Sekvence genu E7 získaná zplazmidů izolovaných z vyrostlých kolonií byla stejná jako sekvence genu E7 získaného z buněk CaSki.

b) Produkce a purifikace proteinu E7 produkovaného bakteriemi

Bakteriální expresívní plazmid pGEX.E7 kóduje fuzní protein glutathion-S-transferázy (GST), který se skládá z GST na NH2 konci následované štěpným místem rozpoznávaným proteázou thrombin a karboxy-konec je tvořen proteinem E7. Protein E7 byl produkován a purifíkován způsobem popsaným v katalogu získaném od výrobce vektoru pGEX-4T-l (Pharmacia Biotech). Stručně řečeno, u bakterií obsahujících expresívní plazmid pGEX.E7 byla exprese tohoto fuzního proteinu indukovaná přidáním izopropyl-p-D-thiogalaktosidázy do kultivačního média. Buňky byly sklizeny a lyžovány mírnou sonikací. Buněčný lyzát byl vpraven do roztoku Glutathion

-20CZ 293439 B6

Sepharozy 4B (Pharmacia Biotech). Poté co se fúzní protein naváže na matrix, je tato matrix promyta za účelem odstranění nespecificky navázaných proteinů. Navázaný fúzní protein byl rozštěpen thrombinem. Při tomto štěpení byl protein E7 odštěpen od GST na fúzním proteinu.

Takto připravený protein E7 byl analyzován prostřednictvím SDS elektroforézy na polyakrylamidovém gelu a koncentrace proteinu byla stanovena metodou podle Bradfordové (BioRad). Z jednoho litru bakteriální kultury bylo získáno 9 mg rozpustného proteinu E7.

2. Vytvoření transfektantů X21 transfikovaných genem kódujícím protein E7

Kódující sekvence proteinu E7 viru HPV16 (viz výše) byly vloženy do eukaryotického expresívního plazmidu INPEP4 (chráněná známka firmy IDEC). V tomto vektoru je exprese genu E7 řízena transkripčními prvky, promotorem/zesilovačem transkripce, Cytomegaloviru. Navíc, první tři nukleotidy kódující sekvence genu E7 byly odstraněny a nahrazeny vedoucí sekvencí imunoglobulinového lehkého řetězce, která byla umístěna do místa ležícího proti směru transkripce hned vedle kódující oblasti genu E7 a nacházejícího se ve stejném čtecím rámci jako kódující oblast genu E7. Po transfekci myší buněčné linie X21 tímto konstruktem byla u jednotlivých klonů buněk rezistentních vůči antibiotiku G418 zjišťována, pomocí analýzy metodou Nothem blot, produkce messengerové RNA kódující protein E7. Každý klon vykazoval detekovatelné množství messengerové RNA kódující protein E7. U buněčných lyzátů dvou klonů 4E7 a 1C7 (nazývané též HOPE1 a HOPE2) byla provedena analýza metodou Western blot a tato analýza prokázala produkci proteinu E7 v těchto klonech.

3. In vivo účinnost imunizace pomocí rozpustného antigenu E7/AF

K těmto studiím byly použity samice myší C3H (FLŽ¹^, Harlan Sprague Dawley). Se zvířaty byly zacházeno v souladu s „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ (DHHS Publication NO. NIH 86 až 123, Bethesda, MD:NIH, 1985), byl jim poskytován dostatek potravy a vody. Při těchto studiích byla použita buněčná linie buněk HOPE2 142¹^ transfikovaná genem E7. Linie nádorových buněk byla in vitro udržována opakovaným pasážováním.

U této buněčné linie bylo prokázáno, že je i po opakovaném pasážování in vitro schopna cytoplazmatické exprese antigenu E7. Tato skutečnost byla prokázána Western blotovou analýzou. Růst nádorů byl u syngenních myší C3H iniciován prostřednictvím subkutánní injikace buněk pasážovaných in vitro v množství 150000 buněk.

Velikost nádorů byla měřena ve dvou na sebe kolmých směrech v intervalech dvou týdnů. Objem jednotlivých nádorů (V) byl spočítán podle následujícího vzorce:

V (mm³) = (LxW²) /2 kde:

L = nej delší naměřená osa v mm

W = osa kolmá k L (mm)

Data v Tabulce 6 jsou prezentována jako Počet myší s nádorem (počet zvířat majících nádor vzhledem k celkovému počtu injikovaných zvířat). Data na obrázcích 13 a 14 jsou prezentovány jako medián velikosti nádorů (mm³) u každé léčené skupiny a u kontrolní skupiny. Každá léčená skupina byla srovnávána s kontrolní skupinou, která nepodstupovala terapii. Terapie byla zahájena 10 dní po inokulaci zvířat buňkami HOPE2, když byla většina nádorů už hmatatelná (přibližně 50 až 75 mm³). Terapie byla zahájena imunizací myší rozpustným proteinem E7 v kombinaci s AF nebo s adjuvans Alum (subkutánně, celkový objem 0,2 ml). Těsně před imunizací byla AF míchána po dobu 30 sekund s proteinem E7 v Hankově rovnovážném roztoku

-21 CZ 293439 B6 solí (HBSS) tím způsobem, aby každá myš obdržela buď 30 pg, nebo 90 pg proteinu E7 v 0,2 ml roztoku. Alum (Pierce Chemical Co.) bylo smícháno s proteinem E7 podle instrukcí výrobce, tak, aby každá myš obdržela 90 pg proteinu E7 v 0,2 ml roztoku. Zvířata ve druhé léčené skupině byla imunizována o 9 dni později (19 dní po inokulaci nádorových buněk). Složky použité pro 5 druhou imunizaci (upomínací dávka) byly připraveny těsně před inokulaci způsobem popsaným výše.

V tomto příkladu (tabulka 6: experiment #223), 41 dní po inokulaci nádorových buněk, jenom 4/8 a 5/8 z myší imunizovaných jednou injekcí rozpustného E7 v kombinaci s AF (30 pg ío v prvním případě nebo 90 pg ve druhém případě) mělo měřitelné nádory. Naopak všechny myši imunizované proteinem E7 v kombinaci s Alum (8/8) měly aktivně rostoucí nádory. Navíc, jak je zobrazeno na obrázku 13, jenom u léčených skupin imunizovaných proteinem E7 v kombinaci s AF byla pozorována významná inhibice růstu nádorů, jak je patrné ze srovnání těchto skupin s kontrolní skupinou (neléčenou) nebo s léčenými skupinami imunizovanými proteinem E7 15 v kombinaci s Alum. U myší imunizovaných jednou injekcí proteinu E7 v Alum nebyla pozorována inhibice růstu nádorů (obrázek 13) nebo zvýšená rychlost regrese nádorů (tabulka 6).

Podobné výsledky byly rovněž pozorovány u léčených skupin, které byly imunizovány celkem dvakrát, 10 a 19 dní po inokulaci nádorovými buňkami (tabulka 6 a obrázek 14), ačkoliv částečné 20 zpomalení růstu nádorů bylo pozorováno i u myší imunizovaných dvěma injekcemi proteinu E7 v kombinaci s Alum.

Získané výsledky naznačují, že významná protinádorová aktivita, která byla měřena prostřednictvím snížení počtu myší nesoucích nádory a inhibici růstu nádorů, byla pozorována 25 následně po imunizaci rozpustným E7 v kombinaci s AF. Naopak u všech zvířat imunizovaných buď jedinou, nebo dvěma injekcemi rozpustného proteinu E7 v kombinaci s Alum, byly přítomny rostoucí nádory. Celkově lze tedy shrnout, že imunizace pomocí rozpustného proteinu E7 v kombinaci s AF měla za následek významnou inhibici růstu nádorových buněk, která nebyla pozorována při imunizaci pomocí rozpustného proteinu E7 v kombinaci s Alum.

Tabulka 6: Protinádorová aktivita při imunizaci pomocí rozpustného proteinu E7 v kombinaci s adjuvans

Experiment č.	Léčba	Dávka (pg/myš)	Počet zvířat s nádory^a 41. den
223	kontrola		7/8
223	E7 v kombinaci s AF	30pgxl^b	4/8
223	E7 v kombinaci s AF	90 pg x 1	5/8
223	E7 v kombinaci s Alum	90 pg x 1	8/8
223	E7 v kombinaci s AF	30pgx2^c	3/8
223	E7 v kombinaci s AF	90 pg x 2	1/4
223	E7 v kombinaci s Alum	90 pg x 2	8/8

a. Počet myší majících nádoiy/celkový počet myší, které byly inokulovány

b. Všechny imunizace začaly 10. den po implantaci

c. Druhá imunizace (x2) byla provedena 19. den po implantaci

Další provedení vynálezu jsou popsána v následujících patentových nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje antigen papilomaviru smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem obsahujícím:

a) stabilizující detergent,

b) činidlo podporující tvorbu micel, a

c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej, přičemž antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, v podstatě neobsahuje žádné imunostimulující peptidy a kompozice po podání zvířeti vybranému ze skupiny tvořené člověkem, domácími zvířaty a zemědělskými zvířaty, je schopna indukovat specifickou odpověď cytotoxických T-lymfocytů proti antigenu papilomaviru, který je v kompozici obsažen.
2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že antigen papilomaviru je vybrán ze skupiny tvořené antigenem HPV16 E6, antigenem HPV16 E7, antigenem HPV18 E6, antigenem HPV18 E7, antigenem HPV6 E4, antigenem HPV6L1, antigenem HPV11 E4 a antigenem HPVI1 LI.
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 2 pro použití při léčení cervikálního nádoru.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 2 pro použití při léčení špičatého kondylomu.
5. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tí m , že stabilizující detergent je vybrán ze skupiny neiontových detergentů, olej je vybrán ze skupiny zahrnující skvalen, eikosan a přistaň, a činidlo podporující tvorbu micel je vybráno ze skupiny zahrnující neiontový blokový polymer a polyoxamer.
6. Farmaceutická kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že detergentem je polysorbát 80 a činidlem podporujícím tvorbu micel je polyoxamer.
7. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m , že detergent je vybrán ze skupiny zahrnující polysorbát 80, polysorbát 20, polysorbát 40, polysorbát 60 a detergent zwitteriontové povahy.
8. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že velikost micel v kompozici je 250 až 300 nm.

12 výkresů