SI9520148A - Indukcija citotoksičnih T-limfocitnih odzivov - Google Patents

Indukcija citotoksičnih T-limfocitnih odzivov Download PDF

Info

Publication number
SI9520148A
SI9520148A SI9520148A SI9520148A SI9520148A SI 9520148 A SI9520148 A SI 9520148A SI 9520148 A SI9520148 A SI 9520148A SI 9520148 A SI9520148 A SI 9520148A SI 9520148 A SI9520148 A SI 9520148A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
antigen
mice
ctl
polyoxyethylene
formulation
Prior art date
Application number
SI9520148A
Other languages
English (en)
Inventor
Syamal Raychaudhuri
William H. Rastetter
Original Assignee
Idec Pharmaceuticals Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idec Pharmaceuticals Corporation filed Critical Idec Pharmaceuticals Corporation
Publication of SI9520148A publication Critical patent/SI9520148A/sl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/892—Reproductive system [uterus, ovaries, cervix, testes]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

Opisane so metode in sestavki, uporabni za induciranje citotoksičnega T-limfocitnega odziva (CTL) pri človeku ali domači ali kmetijsko važni živali. Metoda vključuje stopnje zagotovitve antigena, proti kateremu je zaželen CTL odziv, in zagotovitve antigenske formulacije, ki obsega, obstoji ali obstoji v bistvu iz dveh ali več izmed stabilizirnega detergenta, sredstva za tvorbo micela in olja. Ta antigenska formulacija prednostno nima imunostimulirne peptidne komponente ali ima zadosti nizke nivoje take komponente, da se želeni CTL odziv ne zmanjša. Formulacijo zagotovimo kot stabilno emulzijo olje-v-vodi.ŕ

Description

Idec Pharmaceuticals Corporation
Indukcija citotoksičnih T-limfocitnih odzivov
Ozadje izuma
Patentna prijava ZDA št. 08/919,787, vložena 24. julija 1992, in patentna prijava ZDA št. 07/735,069, vložena 25. julija 1991, ki sta istočasno v postopku in imata obe naziv Indukcija citotoksičnih T-limfocitnih odzivov, avtorja Syamal Raychaudhuri in William H. Rastetter (sedaj opuščeno), sta v celoti vključeni kot referenca v predloženi prijavi. Predloženi izum se nanaša na metode in sestavke, koristne za indukcijo citotoksičnih odzivov, ki jih posredujejo T-celice, pri ljudeh, pri domačih ali kmetijskih živalih.
Smatra se, da so citotoksični T-limfociti (CTLs) glavni gostiteljski obrambni mehanizem pri odzivu na številne virusne infekcije ter neoplastično ali kancerozno rast. Te celice eliminirajo inficirane ali transformirane celice s prepoznavanjem antigenskih fragmentov v povezavi z različnimi molekulami (ki jih imenujemo razred I MHC molekule) na inficiranih ali transformiranih celicah. CTLs lahko induciramo eksperimentalno s citoplazmičnim nalaganjem določenih topnih antigenov v specifičnih celicah. Imunizacija s samim topnim antigenom je na splošno nezadostna za specifično citotoksično T-limfocitno indukcijo.
Ena metoda, s katero lahko induciramo CTL odziv, zajema uporabo tehnik rekombinantnega inženiringa za vdelavo kritičnih komponent zadevnega antigena v genom benignega infekcijskega sredstva. Cilj take strategije je ustvariti antigensko specifične citotoksične T-limfocitne odzive na želeni epitop s tem, da gostitelja podvržemo mili samoomejevalni infekciji. Opisali so himerne vektorje ob uporabi vaccinia virusov, polio virusov, adeno virusov in retro virusov kot tudi bakterije, kot Listeria in BCG. Npr. v Trakahashi et al. 85 Proč. Natl. Acad. Sci., USA 3105. 1988 je opisana uporaba rekombinantnega vaccinia virusa, ki eksprimira HIV gpl60 ovojni gen, kot potencialno orodje za indukcijo citotoksičnih T-limfocitov.
Druga metoda, s katero lahko induciramo celično posredovan odziv, zajema uporabo adjuvansov. Medtem ko je videti, da je stroka prenesičena z diskusijo o uporabi adjuvansov, je v taki stroki nejasno, če je bila inducirana celično posredovana imunost in če je taka celično posredovana imunost vključevala citotoksičen T-limfocitni odziv. V nadaljevanju pa so reprezentativne izmed različnih publikacij na tem področju.
Stover et al., 351 Nature 456, 1991 (se ne upošteva kot stanje tehnike za predloženo prijavo) opisuje CTL odziv na /3-galaktozidazo ob uporabi rekombinantnega BCG, ki vsebuje /3-galaktozidazni gen. Nobenega takega odziva niso ugotovili ob uporabi nepopolnega Freundovega adjuvansa in /3-galaktozidaze.
Mitchell et al., 8 J. Clinical Oncologv 856, 1990 (ki se ne upošteva kot stanje tehnike za predloženi izum) opisuje zdravljenje pacientov z metastatskim melanomom z adjuvansom z imenom DETOX in alogenskimi melanomskimi lizati, ki so jih dajali petkrat v času šest tednov. Pri majhnem delu pacientov so opazili povečanje citolitskih T-celic. Avtorji opisujejo potrebo, da bi povečali nivo proizvodnje citotoksičnih T-limfocitov, in predlagajo kombinirano terapijo adjuvansa z interlevkinom-2 kot tudi predhodno zdravljenje s ciklofosfamidom, da se zmanjša nivo tumorsko specifičnih T-supresorskih celic, ki utegnejo obstajati. DETOX vključuje detoksificiran endotoksin (monofosforil lipid A) iz Salmonella minnesota, skelete celičnih sten Mycobacterium phlei, skvalensko olje in emulgator.
Allison in Gregoriadis, 11 Immunology Today 427, 1990 (ki se ne upošteva kot stanje tehnike za predloženi izum) omenjata, da je edini adjuvans, avtoriziran za uporabo v humanih cepivih aluminijeva sol (galun), ki ne izvabi dosledno celično posredovane imunosti. Allison in Gregoriadis navajata zato je potreba, da bi razvili adjuvanse z učinkovitostjo Freundovega popolnega adjuvansa, vendar brez njegovih različnih stranskih učinkov, kot so granulomi. Nadaljujeta z navajanjem, da obstajajo tri možne strategije, npr. uporaba liposomov; uporaba adjuvansov, ki jih imenujemo imunostimulacijski kompleksi (ISCOMs, ki vključujejo saponin ali Quil A (triterpenoid z dvema ogljikovodičnima verigama), holesterol in fosfatidil holin), ki so odobreni za uporabo v cepivu za influenco za konje (Morein et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); in uporaba emulzije (SAF) skvalena ali Squalana (z ali brez pluroničnega sredstva) in muramil dipeptida (MDP). Za SAF pravijo, da izvabi celično posredovano imunost pri miših, čeprav se je dolgo časa mislilo, da podenotski antigeni ne morejo izvabiti citotoksičnih T-celičnih (CTL) odzivov.
Takahashi et al., 344 Nature 873, 1990 opisuje indukcijo na razred II restringiranega pomočnika in citotoksično T-limfocitno indukcijo z uporabo ISCOMs z eno samo subkutano imunizacijo miši. Navaja, da Freundov adjuvans, nepopolni Freundov adjuvans in s fosfatom zapufrana fiziološka raztopina kuhinjske soli niso inducirali citotoksične T-limfocitne aktivnosti proti tarčam, za katere so se zanimali. Navaja, da v nasprotju z rezultati z drugimi oblikami eksogenega topnega proteinskega antigena niso pokazali, da je mogoče iniciirati antigensko specifičen MHC razred I restringiran CD8+ CD4' CTL z imunizacijo z eksogenim intaktnim proteinom ob uporabi ISCOMs. Navaja tudi, da opisani poskusi sugerirajo, da je lahko mogoče izvabiti humani CTL ob uporabi ISCOMs, ki vsebuje HIV proteine, in da s cepivi na osnovi ISCOM lahko dosežejo že dolgo želeni cilj indukcije tako CTL kot tudi protiteles z očiščenim proteinom.
Byars in Allison, 5 Vaccines 223, 1987, opisujeta uporabo SAF-1, ki vključuje TWEEN 80, PLURONIC L121 in skvalen ali Squalane z ali brez muramil dipeptida, in sugerirata, da njuni podatki kažejo, da bo formulacija z muramil dipeptidom koristna za humana in veterinarska cepiva. Zagotovili so spodbujevalne injekcije adjuvansa brez muramil dipeptida. Za muramil dipeptid pravijo, da znatno poveča proizvodnjo protiteles v primerjavi z uporabo adjuvansa brez muramil dipeptida. Celično posredovano imunost so merili kot hipersenzibilnost odloženega tipa s kožnimi testi za določitev T-pomočniške celične indukcije. Taka hipersenzibilnost je bila močnejša in bolj zadrževana, kadar je bil v adjuvansu muramil dipeptid. Podobni adjuvansi so opisani v Allison et al., US patent 4,770,874 (kjer je navedeno, da je kombinacija muramil dipeptida in pluroničnega poliola bistvena, da se izvabi močan celično posredovan in humoralen odziv proti jajčnemu albuminu); v Allison et al., US patent 4,772,466; Murphy-Corb et al., 246 Science 1293, 1989 (kjer je navedeno, da lahko uporaba kombiniranih adjuvansov z muramil dipeptidom poveča indukcijo tako humoralnih kot celularnih krakov imunskega odziva); v Allison in Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (kjer je navedeno, da celično posredovano imunost izvabi SAF (z muramil dipeptidom). kot se pokaže s hipersenzibilnostjo odloženega tipa, s proliferativnimi odzivi T-celic na antigen, s proizvodnjo interlevkina-2 in s specifično genetsko restringirano lizo tarčnih celic, ki nosijo imunizirni antigen); v Allison in Byars, Immunopharmaeology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191-201, 1987; v Morgan et al., 29 J. Medical
Virology 74, 1989; v Kenney et al., 121 J. Immunological Methods 157, 1989; v Allison in Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (kjer se je pokazalo, da aluminijeve soli in emulzije mineralnih olj povečajo tvorbo protiteles, vendar ne celično posredovane imunosti; in se je pokazalo, da muramil dipeptidne formulacije izvabijo celično posredovano imunost); v Byars et al., 8 Vaccine 49, 1990 (ki se ne upošteva kot stanje tehnike za predloženo prijavo, kjer je navedeno, da njihova formulacija adjuvansa znatno poveča humoralne odzive in do manjšega obsega poveča celično posredovane reakcije na influenčni hemaglutininski antigen); v Allison in Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (se ne upošteva kot stanje tehnike za predloženo prijavo; ki navaja, da je funkcija muramil dipeptida induciranje ekspresije citoksinov in povečanje ekspresije glavnih histokompatibilnostnih (MHC) genov; in da dobijo boljše protitelesne in celularne odzive kot z drugimi adjuvansi in da upajo, da bodo potrdili, če so podobne strategije učinkovite pri ljudeh); v Allison in Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (ki opisuje celično posredovano imunost ob uporabi SAF); v Epstein et al., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (ki daje pregled različnih adjuvansov uporabljenih pri pripravi cepiv); v Allison in Byars, 95 J. Immunological Methods 157,1986 (ki navaja, da dodatek muramil dipeptida adjuvansu znatno povečuje celično posredovane odzive na množico antigenov, vključno na monoklonske imunoglobuline in virusne antigene); in v Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1989 (ki opisuje uporabo SAF-1 za pripravo cepiva za Epstein-Barr virus).
Kwak et al., Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, str. 163,1990 (ki se ne upošteva kot stanje tehnike za predloženo prijavo) opisuje uporabo SAF brez muramil dipeptida kot adjuvansa za B-celični limfomski idiotip pri človeku. Specifično so dajali emulzijo Pluronic L121, Squalana in 0,4 % TWEENa-80 v fiziološki raztopini kuhinjske soli, zapufrani s fosfatom, z idiotipom. Navaja, da naj bi dodatek adjuvansa nadalje povečal... humoralne odzive in lahko prav tako olajša idukcijo celularnih odzivov.
Drugi imunološki pripravki vključujejo liposome (Allison et al., US patenta 4,053,585 in 4,117,113); ciklične peptide (Dreesman et al., US patent 4,778,784); Freundov popolni adjuvans (Asherson et al., 22 Immunology 465, 1972; Berman et al., 2 International J. Cancer 539, 1967; Allison, 18 Immunopotentiation 73, 1973; in Allison, Non-Specific Factors Intluencing Host Resistance 247; 1973); ISCOMs (Letvin et al., 87 Vaccines 209, 1987); adjuvanse, ki vsebujejo neionska blok-polimerna sredstva, tvorjena z mineralnim oljem, površinsko aktivnim sredstvom in TWEEN 80 (Hunter in Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; ter Hunter et al., 127 J. Immunology 1244, 1981); adjuvanse, sestavljene iz mineralnega olja in emulgatorja z ali brez usmrčenih mikobakterij (Sanchez-Pescador et al., 141 J. Immunology 1720, 1988); in druge adjuvanse, kot lipofilen derivat muramil tripeptida, in muramil dipeptid, kovalentno konjugiran na rekombinantni protein (id.).
Povzetek izuma
Prijavitelj je odkril varno in prednostno metodo ter sestavke, s čimer lahko induciramo CTL odzive pri človeku ter domačih ali kmetijsko važnih živalih. Metoda zajema uporabo antigenskega pripravka, ki je le malo ali sploh ni toksičen za živali, in nima imunostimulacijskega peptida (npr. muramil dipeptida), katerega prisotnost bi zmanjšala želeni celularni odziv. Poleg tega je metodologija enostavna za uporabo in ne zahteva ekstenzivnega dela in vivo za spreminjanje obstoječih celic z rekombinantnimi DNA tehnikami, da bi jih naredili bolj antigenske. Ta ugotovitev je presenetljiva, ker je bilo nepričakovano, da bi lahko tak CTL odziv inducirali z uporabo takega antigenskega pripravka, ki nima imunostimulacijskih peptidov ali njihovega ekvivalenta. Ugotovitve prijavitelja dopuščajo uporabo takih antigenskih formulacij, pri širokem spektru bolezenskih stanj ali kot profilaktično sredstvo. Npr. dajanje take antigenske formulacije lahko uporabimo za zdravljenje virusnih bolezni, pri katerih je CTL odziv važen, npr. pri zdravljenju HIV infekcije ali influence; uporabo lahko tudi razširimo na zdravljenje bakterijskih infekcij, raka, parazitskih infekcij ipd. Kot profilaktično sredstvo je antigenska formulacija, kombinirana s primernim antigenom, koristna pri preprečevanju infekcije z virusi, ki so odgovorni za prej omenjene virusne bolezni, zlasti za profilakso HIV infekcije, in tudi za profilakso pacientov z rizikom raka, npr. po izrezanju primarnega tumorja.
Tako gre pri prvem vidiku izuma za metodo za induciranje CTL odziva pri človeku ali domačih živalih (npr. mačkah ali psih) ali kmetijsko pomembnih živalih (npr. konjih, kravah ali svinjah) na antigen, ki je različen od B-celičnega limfomskega antigena ali jajčnega albumina. Metoda vključuje stopnji zagotovitve antigena, na katerega želimo CTL odziv, in zagotovitve netoksične antigenske formulacije, ki obsega, ki obstoji ali ki v bistvu obstoji iz stabilizirnega detergenta, sredstva za tvorbo micela ter biorazgradljivega in biokompatibilnega olja. Ta antigenska formulacija prednostno nima nobene imunostimulacijske peptidne komponente ali ima zadosti nizke nivoje take komponente, da se želeni celularni odziv ne zmanjša. To formulacijo prednostno zagotovimo kot stabilno emulzijo olje-v-vodi. T.j. vsako od različnih komponent izberemo tako, da bo emulzija ostala v stanju emulzije vsaj en mesec, prednostno več kot eno leto, brez ločenja faz. Pri metodi antigen in antigensko formulacijo pomešamo skupaj, da dobimo zmes (prednostno z mikrofluidiziranjem), in to zmes dajemo živalim v količini, ki je zadostna, da inducira CTL odziv pri živalih. Tako dajanje je potrebno le enkrat.
S stabilizirnim detergentom je mišljen detergent, ki omogoča, da komponente emulzije ostanejo kot stabilna emulzija. Taki detergenti so polisorbat, 80 (TWEEN) (sorbitan-mono-9-oktadecenoat-poli(oksi-1,2-etandiil; proizvaja ICI Americas, Wilmington, DE), TWEEN 40, TWEEN 20, TWEEN 60, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7, in ŠPAN 85. Ti detergenti so običajno v količini približno 0,05 do 0,5 %, prednostno pri okoli 0,2 %.
S sredstvom za tvorbo micela je mišljeno sredstvo, ki je sposobno stabilizirati emulzijo, nastalo z drugimi komponentami tako, da nastane micelu podobna struktura. Taka sredstva prednostno povzročajo nekaj draženja na mestu injekcije, da rekrutirajo makrofage za povečanje celularnega odziva. Primeri takih sredstev so polimerna površinsko aktivna sredstva, opisana v BASF Wyandotte publikacijah, npr. Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110,1977, in Hunter et al., 129 J. Immunol 1244, 1981, ki sta oba vključena tukaj kot referenca, PLURONIC L62LF, L101 in L64, PEG1000 in TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901,1301 in 130R1. Kemične strukture takih sredstev so dobro znane v stroki. Prednostno izberemo sredstvo, ki ima hidrofilno-lipofilno ravnotežje (HLB) med 0 in 2, kot je definirano v Hunter in Bennett, 133 Journal of Immunology 3167, 1984. Sredstvo je prednostno v količini med 0,5 in 10 %, najbolj prednostno v količini med 1,25 in 5 %.
Olje izberemo za pospešitev retencije antigena v emulziji olje-v-vodi, t.j. da zagotovimo vehikel za želeni antigen, in ima prednostno tališče manj kot 65 °C, tako da se emulzija tvori bodisi pri sobni temperaturi (okoli 20°C do 25 °C) ali ko temperaturo emulzije spravimo na sobno temperaturo. Primeri takih olj so skvalen, Squalane, EICOSANE, tetratetrakontan, glicerol in arašidovo olje ali druga rastlinska olja. Olje je prednostno v količini med 1 in 10 %, najbolj prednostno med 2,5 in 5 %. Važno je, daje olje biorazgradljivo in biokompatibilno tako, da lahko telo razgradi olje v teku časa, in tako, da po uporabi olja niso očitni, škodljivi učinki, kot granulomi.
V gornjem pripravku je važno, da ni peptidne komponente, zlasti ne muramil dipeptida (MDP). Tak peptid bo motil indukcijo CTL odziva, če je v količini, ki je večja kot okoli 20 gg v normalnem humanem formulacijskem dajanju. Prednostno je, da so taki peptidi popolnoma odsotni za antigenske formulacije kljub njihovi očitni stimulaciji humoralnega predelka imunskega sistema. T.j. prijavitelj je ugotovil, da so taki peptidi neugodni, kadar je zaželen citotoksičen T-limfocitni odziv, čeprav lahko povečajo humoralni odziv.
Pri drugih sorodnih vidikih tvorimo antigensko formulacijo iz le dveh od gornjih treh komponent in uporabimo s katerimkoli želenim antigenom (ta izraz vključuje proteine, polipeptide in njihove fragmente, ki so imunogeni) razen jajčnim albuminom (ali drugimi albumini, npr. HSA, BSA in ovalbuminom), da induciramo CTL odziv pri zgoraj navedenih živalih ali človeku.
Prijavitelj smatra, da so gornje formulacije znatno bolj prednostne kot znane formulacije (vključno ISCOMs, DETOX in SAF) za uporabo pri človeku. Za razliko od takih formulacij predložena formulacija vključuje hkrati sredstvo, ki tvori micel, in nima peptidov, celičnih stenskih skeletov ali bakterijskih celičnih komponent. Predložena formulacija tudi inducira CTL odziv, ki se bodisi ne pojavi z znanimi formulacijami ali pa je znatno povečan v primerjavi s temi formulacijami.
Z netoksičen je mišljeno, da pri tretirani živali ali človeku opazimo le majhen ali pa sploh nobenega stranskega učinka antigenske formulacije. Običajni strokovnjaki v medicini ali veterini bodo priznali, da ima ta izraz širok pomen. Npr. pri v bistvu zdravi živali ali človeku lahko toleriramo le rahlo toksičnost, medtem ko pri človeku, ki trpi zaradi grozeče bolezni, lahko toleriramo bistveno več toksičnosti.
Pri prednostnih izvedbah obstoji antigenska formulacija v bistvu iz dveh ali treh sestavin, kot so detergent, sredstvo in olje; postopek obstoji v bistvu iz enega samega dajanja zmesi (antigen + antigenska formulacija) človeku ali živali; človek ali žival je inficirana z virusom in ima enega ali več simptomov (kot na splošno definirajo zdravniki na zadevnem področju) virusne infekcije; in antigenska formulacija je netoksična za človeka ali žival.
Pri drugih prednostnih izvedbah antigen izberemo izmed antigenskih deležev HIV antigenov: gpl60, gag, pol, Nef, Tat in Rev; malarijskih antigenov: CS protein in sporozoitni površinski protein 2; površinskih antigenov hepatitisa B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag in HBe Ag; antigenov influence: HA, NP in NA; površinskih antigenov hepatitisa A; antigenov herpes virusa: EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV zgodnji proteinski produkt, humani papillomavirus antigeni (npr. HPV antigeni, kot LI, E4, E6, E7 antigeni, zlasti E6 in E7 antigeni iz HPV 16 in 18, obeh najbolj običajnih HPV tipov, povezanih s cervikalnim karcinomom, E4 in LI, izvedeni iz HPV6 in HPV11, obeh najbolj običajnih HPV tipov, povezanih s condyloma acuminata; prostatni specifični antigen (PSA), citomegalovirus gB, citomegalovirus gH in IE protein gP72; respiratornih sincitialnih virusnih antigenov: F protein, G protein, in N protein; in tumorskih antigenov: karcinom CEA, s karcinomom povezan mucin, karcinom P21, karcinom P53, melanom MPG, melanom p97 in karcinom Neu onkogenski produkt, karcinom p53 genski produkt, melanomski antigen, imenovan MAGE, in mutiran p21 ras protein, predstavljen v številnih malignih tumorjih.
Pri sorodnem vidiku gre pri izumu za sestavek, ki obsega, obstoji ali v bistvu obstoji iz antigena, pomešanega z zgoraj opisano antigensko formulacijo, in antigen izberemo iz tistih antigenskih deležev, kot so navedeni zgoraj.
Pri drugih sorodnih vidikih gre pri izumu za postopke za zdravljenje pacienta, inficiranega s HIV virusom, ki ima malarijo, ki ima influenco, ki ima hepatitis, ki ima raka, ki je inficiran s herpes virusom, ki ima cervikalni karcinom, ki ima condyloma acuminata (genitalne bradavice) ali je inficiran z respiratornim sincitialnim virusom, z dajanjem sestavka, ki vključuje primeren antigen (npr. izbran izmed tistih, ki so navedeni zgoraj) pomešan z eno od gornjih antigenskih formulacij. Ti antigeni in obdelave so podane le kot zgled antigenov, ki jih lahko uporabimo v predmetnih antigenskih formulacijah.
Druge značilnosti in prednosti izuma bodo očitne iz sledečega opisa njegovih prednostnih izvedb in iz zahtevkov.
Opis prednostnih izvedb
Risbe bomo najprej na kratko opisali.
Risbe
Sl. IA - 1C in 4A - 4C so grafične predstavitve podatkov, ki primerjajo CTL indukcijo z različnimi ovalbuminskimi formulacijami; E:T predstavlja razmerje efektor/tarča na vseh slikah.
Sl. 2A in 2B sta grafični predstavitvi podatkov, ki primerjajo CTL indukcijo z različnimi /3-galaktozidaznimi formulacijami;
Sl. 3 je grafična predstavitev podatkov, ki primerjajo CTL indukcijo z ovalbuminom v liposomu in v antigenski formulaciji;
Sl. 5 in 6 sta grafični predstavitvi podatkov, ki kažejo učinek CD4 in CD8 celične deplecije na CTL indukcijo;
Sl. 7 je grafična predstavitev podatkov, ki kažejo CTL indukcijo z gpl20;
Sl. 8 je grafična predstavitev podatkov, ki kažejo CTL indukcijo z zmesjo pluronica in TWEEN-a in antigena;
Sl. 9 je grafična predstavitev podatkov, ki kažejo CTL indukcijo z zmesjo skvalana in TWEENA in antigena;
Sl. 10 je grafična predstavitev podatkov, ki kažejo CTL indukcijo z zmesjo skvalana in pluronica in antigena;
Sl. 11 je grafična predstavitev učinkov OVA z različnimi antigenskimi formulacijami na CTL odziv;
Sl. 12 je grafična predstavitev indukcije anti-gpl20IIIb protiteles pri opicah z različnimi antigenskimi formulacijami;
Sl. 13 prikazuje antitumorsko aktivnost HOPE2 celic deset dni po eni sami imunizaciji topnega E7 proteina v adjuvansu; in
Sl. 14 prikazuje antitumorsko aktivnost HOPE2 celic pri dneh 10, 19 po dveh imunizacijah s topnim E7 proteinom v adjuvansu.
Antigenska formulacija
Antigenske formulacije, uporabne pri predloženem izumu, so na splošno opisane zgoraj. Povprečni strokovnjaki na tem področju bodo uvideli, da se ekvivalentne formulacije zlahka pripravijo in se lahko pričakuje , da imajo ekvivalentne lastnosti pri indukciji CTL odziva. Take formulacije se zlahka testirajo glede na svoje lastnosti ob uporabi tehnik, ki so ekvivalentne tistim, opisanim v spodnjih primerih.
Sledijo primeri v smislu izuma z uporabo antigenske formulacije (AF), sestavljene iz okoli 2,5 % skvalana, 5 % pluronske kisline in TWEEN-a 80 v fiziološki raztopini kuhinjske soli, zapufrani s fosfatom. Specifično vključuje emulzija AF: 15 mg skvalana, 37,5 mg poloksamera 401 (PLURONIC L121), 6 mg polisorbata 80 (TWEEN 80), 0,184 mg kalijevega klorida, 0,552 mg monobazičnega kalijevega fosfata, 7,36 mg natrijevega klorida, 3,3 mg dibazičnega natrijevega fosfata (brezvodnega) na 1 ml vode, pH 7,4. To emulzijo mikrofluidiziramo ob uporabi standardne tehnike (Microfluidics Model M110F) s protitlačnim modulom pri 770-980 bar s postopnim vračanjem do atmosferskega tlaka, hlajenjem in pakiranjem v mokrem ledu.
V drugih primerih antigen pomešamo z zmesjo mikrofluidiziranega skvalana (S), pluronica (P) in TWEEN-a 80 (T), da dosežemo končno koncentracijo 0,2 % TWEEN-a 80, 1,25 % pluronica oz. 5 % skvalana. Za določitev pod-komponent, potrebnih za indukcijo antigensko specifičnega imunskega odziva, pripravimo Squalane-TWEEN 80, pluronic-TWEEN 80 ali Squalane-pluronic z isto koncentracijo kot za trikomponentno zmes. Pluronic, Squalane ali TWEEN 80 pripravimo tudi posamezno, da določimo učinek posamezne komponente na CTL indukcijo. TWEEN 80 tudi nadomestimo s TWEEN 20, TWEEN 40 ali Zwittergentom, da določimo učinek različnih derivatov TWEEN-a na CTL indukcijo v ova sistemu. Squalane v trikomponentni formulaciji nadomestimo z Eicosone ali Triacontone in kopolimerni pluronic v isti trikomponentni formulaciji nadomestimo s PEG 1000, Pleuronic L62LF ter Tetronics 1501 in 150R1. Kot dvokomponentne formulacije pomešamo različne analoge v različnih kombinacijah in testiramo na ova specifično CTL indukcijo. To so zmes holesterola - TWEEN-a 80, Squalane TWEEN-a 20, Pristane - TWEEN-a 80 ali olivnega olja - TWEEN-a 80. Za stabilizacijsko študijo pomešamo mikrofluidizirano zmes Squalane-TWEEN-a 80 z dekstrozo do končne koncentracije 5 %. V vseh primerih kombinacije nosilcev pomešamo v mikrofluidizatorju, da naredimo stabilno emulzijo. Pri nekaterih poskusih dvokomponentne formulacije pomešamo z različnimi koncentracijami MDP za indukcijo CTL odziva in indukcijo humoralnega odziva. Tabela 1 opisuje obsežen seznam različnih formulacij, uporabljenih v teh študijah.
TABELA 1
Učinek različnih nadomestitev v tri- ali dvokomponentnem sistemu
Nadomestitev v trikomponentnih formulacijah odstotek smrtnosti pri E:T 100:1
STP 84
Tween 40(T) 66
Tween 20(T) 48
T1501(P) 0
T150R1(P) 0
Pluronic L62LF(P) 47
Eicosane(S) *
PEGIOOO(P)) *
Triacontane(S) *
Zwittergent(T) *
Nadomestitev v dvokomponentnih formulacijah
ST 76
PT 45
SP 26
Holesterol(S) + Tween 80 0
Squalane + Tween 29(T) 65
Pristane(S) + Tween 80 42
olivno olje(S) + Tween 80 69
Enokomponentna formulacija
Pluronic L121 0
Squalane 0
Tween 80 0
Squalane + Tween 80 + 5% dekstroze 86
* CTL test je v ponavljanju
Razlaga trgovskih imen:
Trgovsko ime Tween 20 Tween 40 Tween 60 Kemično ime Polioksietilen(20)sorbitan monolavrat Polioksietilen(20)sorbitanmonopalmitat Polioksietilen(20)sorbitanmonostearat
Tween 80 Polisorbat 80 Polioksietilen(20)sorbitan monooleat
Zwittergent 3 N,N-dimetil-3-amonijo-2- propansulfonat
Teepol HB7 alkil natrijev sulfat
Špan 85 Sorbitan trioleat
PEG 1000 Polietilen glikol
Pluronic L62LF
Poloxamer 401 (Pluronic L121)
Pluronic L101 Pluronic L64 Tetronic 1501 Tetronic 701 Tetronic 901 Tetronic 1301 Blok kopolimeri propilen oksida in etilen oksida z različnimi molekulskimi masami
Tetronic 150R1 Tetronic 130 Rl Blok kopolimeri etilen oksida in propilen oksida
Formulacijo Syntexovega adjuvansa (mikrofluidizirana; SAFm) uporabimo kot kontrolo z adjuvansom in obstoji iz dveh delov. Del I obstoji iz fiziološke raztopine kuhinjske soli, zapufrane s fosfatom, ki vsebuje končno koncentracijo 5 % Squalane, 1,25 % pluronica in 0,2 % TWEEN-a 80 (vehikel ali I-SAF). Del II obstoji iz N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamina (Thr-MDP), derivata komponente mikobakterijske celične stene. Za imunizacijo antigen pomešamo z mikrofluidiziranim vehiklom (del I), da dobimo homogeno emulzijo. Dodamo MDP, da naredimo SAFm, in na kratko pomešamo z Vortex-om. Koncentracijo MDP v zmesi variiramo, da določimo, če je optimalna koncentracija za CTL indukcijo. Kot kontrolo z adjuvansom miši tudi imuniziramo s topnimi antigeni, pomešanimi z galumom v skladu s priročnikom proizvajalca (Pierce Chemical, Rockford, IL) ali s popolnim Freundovim adjuvansom (CFA).
To antigensko formulacijo uporabimo za indukcijo citotoksičnih T-limfocitnih odzivov pri miših. Povprečni strokovnjaki na tem področju bodo uvideli, da tak model miši kaže na to, da bodo ekvivalentni poskusi ali tretmaji podobno inducirali citotoksične T-limfocitne odzive pri človeku, domačih ali kmetijskih živalih. Količino antigenske formulacije in antigena, uporabnega za to, da proizvede želeni celularni odziv, lahko določimo empirično s standardnimi postopki, ki so dobro znani povprečnim strokovnjakom, brez pretiranega eksperimentiranja. Tako lahko, če želimo minimizirati stranske učinke tretmaja s tako zmesjo, povprečni strokovnjaki na tem področju določijo minimalni nivo take zmesi za dajanje človeku, domačim ali kmetijskim živalim, da se sproži CTL odziv, in se s tem inducira imunost za želeni antigen. Pri normalni uporabi bomo tako zmes injicirali na katerikoli način izmed številnih standardnih postopkov, posebno prednostna pa je intramuskularna injekcija pri lokaciji, ki bo omogočila, da bo emulzija ostala v stabilni obliki v času več dni ali več tednov.
Metode
V spodnjih primerih uporabimo naslednje materiale in metode, če ni drugače navedeno:
Miši
Samice C57BL/6 (H-2b) in BALB/c (H-2d) miši smo nabavili pri Harlen Sprague (San Diego, Kalifornija).
Antigeni
Ovalbumin (ova, Grade VII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) uporabimo v nativni obliki. 0-galaktozidazo, (jS-gal, Grade VIII; BRL) uporabimo v nativni obliki in po kuhanju v 1 M NaOH 2 minuti, da dobimo alkalijski prebavek. Rekombinantni gpl20 smo nabavili pri American Biotechnology.
Tumorske celice in transfektanti
Uporabne tumorske celice so la linije EL4 (C57BL/6, H-2b timoma) in P815 (DBA/2, H-2d mastocitoma). Derivatizacijo ovu-producirnega EL4 transfektanta, EGl-ova, je predhodno opisal Moore et al., 54 Celi 777, 1988. /?-gal-producirni transfektant, P13.1, derivatiziramo z elektroporacijo ΙΟ7 P815 celic v 1 ml fiziološke raztopine kuhinjske soli, zapufrane s fosfatom (PBS) z 10 mg Pstl lineariziranega pCHllO (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) in 1 mg Pvul lineariziranega pSV2 neo (Southern et al., 1 J. Mol. App'1. Genet. 327,1982), čemur sledi selekcija v 400 /ig/ml antibiotika G418. C3-4 transfektant derivatiziramo iz BALB/c hibridoma Igm 662 s transfekcijo s plazmidom, ki kodira /3-gal gen, zlit na tretji in četrti ekson IgM težke verige (Rammensee et al., 30 Immunogenetics 296, 1989). gpl60IIIb eksprimirni 3T3 fibroblast, 15-12, smo dobili od Dr. Germaina z NIH (Bethesda, MD). Kb transficirano L celično linijo smo dobili od Dr. Carbona, Monash University, Avstralija. D4 in Ld transficirane L celične linije smo dobili od Dr. Teda Hensena, Washington University, St. Louis.
Imunizacija
Miši imuniziramo intravensko z 200 μΐ suspenzije 25 χ 106 splenocitov po citoplazmičnem nalaganju, kot je opisano v Moore et. al. supra, in Carbone et al., J. Exp. Med. 169:603, 1989). Za imunizacijo z ovu-antigensko formulacijo ali /3-gal15 antigensko formulacijo injiciramo 30 /Ag vsakega proteinskega antigena subkutano na miš v nožno blazinico in koren repa. Vsaka injekcija obstoji iz 67 gl mikrofluidizirane antigenske formulacije (narejene po standardnih postopkih) in 30 gg proteinskega antigena v končnemu volumnu 200 μ\. Končni volumen dopolnimo s HBSS, glej priročnik Whittaker (Welkersville, MD). MDP zagotovimo v koncentracijah med 0 in 300 gg. Kjer je navedeno, miši imuniziramo s topnimi antigeni v CFA ali v galunu v celotnem volumnu 200 gl.
In vitro stimulacija efektorskih populacij
Vranične celice (30 χ 106) normalnih ali imuniziranih miši, ki smo jih iniicirali vsaj 14 dni prej, inkubiramo z 1,5 χ 106 EG7-ova (obsevanimi z 20000 rad) za ova odzive ali 1,5 χ 106 C3-4 celicami (obsevanimi z 20000 rad) za jS-gal odziv na ploščah s 24 vdolbinami pri 37 °C v 7 % CO2/zraku. Vse tkivne kulture izvedemo v kompletnem mediju, ki obstoji iz IMDM medija, glej priročnik Whittaker (Welkersville, MD) dopolnjenega z 10 % fetalnega telečjega seruma (FCS), 2mM glutamina, gentamicinom in 2 χ 10'5 M 2-merkaptoetanola. Za poskuse deplecije in vitro obdelamo in vivo iniciirane ali in vitro stimulirane vranične celice z monoklonskimi protitelesi (mAbs) RL.172 (anti-CD4) ali mAbs 3,168 (anti-CD8) za odstranitev CD4+ ali CD8+ T celic (Sarmiento et al., 125 J. Immunol. 2665,1980, in Ceredig et al., 314 Nature 98, 1985). mAb RL.172 in mAb 3,168 smo dobili od Dr. Jonathana Sprenta pri Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.
Vranične celice (30 χ 106) normalnih ali imuniziranih miši, ki smo jih iniciirali vsaj 21 dni prej, inkubiramo z 1,5 χ 106 15-12 celic (obdelanih z 200 /Ag mitomicina C 45 minut na 108 celic) ali s 500 gg 18IIIb peptida, ki vsebuje dominantni CTL epitop pri miših Balb/c, v kompletnih IMDM medijih (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), ki vsebujejo 10 % pred-skriniranega FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 mM glutamina, gentamicin in 2 x 10’5 M 2-merkaptoetanola. Za in vitro stimulacijo s peptidi vranične celice gojimo v kompletnem IMDM, ki vsebuje 5 % ConA supematanta.
Za deplecijske poskuse obdelamo in vivo iniciirane ali in vitro stimulirane vranične celice z mAbs RL.172 (anti-CD4) ali mAbs 3,168 (anti-CD8) v prisotnosti nizkotoksičnega kunčjega komplementa (Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Kanada) za odstranitev CD4+ ali CD8+ T celic (22, 23). mAb RL.172 in mAb
3,168 sta darilo od Dr. Jonathana Sprenta pri Scripps Clinic and Research Fonda16 tion, La Jolla, CA.
Poskus citotoksičnosti
Tarčne celice (1 χ 106) markiramo s 3,7.106 s'1 [51Cr] natrijevega kromata 60 minut. Za peptidno pulzirane tarče dodajamo 50 μί 1 mg/ml peptidne raztopine v HBSS med markiranjem tarč z 51Cr. Po izpiranju inkubiramo 104 markirane tarče in serijska razredčenja efektorskih celic v 200 pl RP10 4 ure pri 37 °C. Zberemo 100 pl supernatanta in specifično lizo določimo kot: odstotna specifična liza = 100 x {(sproščanje s CTL - spontano sproščanje)/(maksimalno sproščanje - spontano sproščanje)}. Spontano sproščanje v odsotnosti citotoksičnega T-limfocita (CTL) je bilo <25 % maksimalnega sproščanja z detergentom v vseh poskusih.
Določitev protitelesnih odzivov pri miših in opicah
Vsako vdolbino plošč z U dnom s 96 vdolbinami (Costar, Cambridge, MA) preslojimo s 150 mg ova ali gpl20 v 50 pl HBSS in inkubiramo preko noči pri 4 °C. Za določitev anti-gpl20 in anti-ονα protitelesnih odzivov pri miših plošče blokiramo 1 uro z 1 % BSA. Dodamo serijsko razredčene serume v 25 pl volumna na vdolbino in inkubiramo 2 uri. Plošče izperemo in na vdolbino dodamo 50 pl 1:1000 razredčenja kozjega proti-miš IgG, konjugiranega na HRPO (SBT, Alabama) v 1 % BSA. Po 1 uri inkubacije plošče izperemo in na vdolbino dodamo 100 pl substrata. Po 10 do 15 minutah posnamemo OD405. Za določitev opičjega anti-gpl20 protitelesnega odziva so vse stopnje enake, razen da tako blokiranje plošč kot tudi razredčenje serumov izvedemo v 5 % normalnem kozjem serumu v Hankovi uravnoteženi solni raztopini.
Peptidna sinteza
Sintetske peptide, ki ustrezajo aminokislinskim sekvencam 253-276 (seznam sekvenc št. 1:
EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; kjer uporabljamo standardno kodo z eno črko za predstavljanje vsake amino kisline) ovalbumina (ova 253-276), aminokislinskim sekvencam 84-102 mielinskega bazičnega proteina (MBP 84-102) (seznam sekvenc št. 2:
DENPVVHFFKNIVTPRTPP), in sintetske peptide, ki ustrezajo aminokislinskim sekvencam 308-322 (18IIIb sekvenca) gpl20IIIb, sestavimo s peptidno sintezo v trdni fazi ob uporabi sintetizatorja Applied Biosystems 430A. Amino kisline pripajamo preko predhodno tvorjenih simetričnih anhidridov z izjemo asparagina, glutamina in arginina, ki jih pripajamo kot hidroksibenzotriazolne estre. Pripajalno učinkovitost kontroliramo z ninhidrinsko reakcijo po metodi Kaiser et al. 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Peptide sprostimo s podlage s HF po proceduri low-high (nizko-visoko), opisani v Tam, et al. 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983, in peptide ekstrahiramo s smole s 10 % ocetno kislino. Po liofilizaciji peptide razsolimo na koloni Sephadex-a G-25 in vzorce peptidov nato čistimo s HPLC s kromatografijo z reverzno fazo na Vydac preparativni C-18 koloni. Očiščene peptide (98 %) solubiliziramo v HBSS pri končni koncentraciji 10 mg/ml in razredčimo na želeno koncentracijo v popolnih medijih.
CNBr prebavek
Vzorce proteina (npr. /3-galaktozidaze) obdelamo s 100-kratnim molskim prebitkom cianobromida v raztopini 100 mM trifluorocetne kisline. Pustimo, da reakcija poteka 18 ur pri sobni temperaturi (okoli 20 °C) z rotacijo. Po predpisanem reakcijskem času peptidne fragmente ločimo od reaktanta ob uporabi aparata SEP-PAK C-18 (Waters), eluiramo s 95 % acetonitrilom in liofiliziramo.
Alkalni prebavek
Proteinske vzorce (npr. jS-galaktozidaze) obdelamo z 1 N NaOH in kuhamo 2 minuti, dobljene peptidne fragmente ločimo od reaktantov ob uporabi aparata C-18 SEPPAK (Waters), eluiramo s 95 % acetonitrilom in liofiliziramo.
PRIMER 1:
Razred I restringirana CTL iniciaciia
V Moore et al., 113 UCLA Svmp. Mol. Celi. Biol. 1989, in Carbone in Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377,1990, je prikazano, da so miši, imunizirane z vraničnimi celicami, naloženimi citoplazmično s topnim ova, iniciirali za ova specifičen, razred I restringiran CTL odziv, ova-eksprimirni EL4 transfektant EG7-ova uporabimo za in vitro stimulacijo ali in vivo iniciirane vranične limfocite in tudi uporabimo kot tarčo za ova specifično CTL posredovano usmrtitev. V tej študiji je tudi prikazano, da CD8+ efektorji, inducirani z EGI-ovci transfektantom ali z vraničnimi celicami, citoplazmično naloženimi z ova, prepoznajo determinanto, mapirano s peptidom ova 258-276 v povezavi z H-2Kb, lizirajo EGI-ova, in tudi usmrtijo EL4 celice, preslojene z ova 258-216. Tako za ocenitev, če lahko topni antigen inducira endogeno razred I restringirano CG8+ T celično stezo, uporabimo gornji sistem za določitev, če lahko določene antigenske formulacije uporabimo, da vodimo topni antigen v razred I restringirano stezo.
a) ova
C57BL/6 miši enkrat imuniziramo z različnimi količinami ova (30 μg -1 mg na miš) z ali brez antigenske formulacije. Mišim damo injekcijo subkutano in v koren repa. Vranične celice odvzamemo imuniziranim mišim vsaj 2 tedna po imunizacijah in stimuliramo in vitro z EGI-ova transfentanti. Celo tako nizka koncentracija ova kot 30 je bila učinkovita kot 1 mg doza. Zato CTL študije rutinsko izvedemo z vraničnimi celicami miši, iniciiranimi s 30 pg ova. Po 5 dneh gojenja in vitro z EG7ova ocenimo iniciacijo s prisotnostjo ova specifičnih efektorjev, ki so sposobni lizirati EGI-ova.
Miši, ki smo jim inicirali ova v HBSS celo tako visoko kot 1 mg, ne kažejo dokaza CTL iniciacije (sl. 1 A). Vendar pa miši, imunizirane s 30 /xg ova v zgoraj opisani antigenski formulaciji (prikazana kot AF na slikah) kažejo znaten transfektantski specifični CTL odziv (sl. 1C). Nadalje je obseg EGI-ova usmrtitve z ονα-AF imuniziranimi vraničnimi celicami primerljiv tistemu pri miših, imuniziranih z ovanaloženimi vraničnimi celicami (sl. IB).
Da je specifičnost CTL imiciacije in vivo antigensko specifična, je prikazano s tem, da vranične celice miši, imuniziranih z /3-galaktozidazo, ne kažejo sekundarnega CTL odziva in vitro, če so stimulirane z EG7-ovfl. Nismo opazili ova specifične CTL indukcije.
b) /3-galaktozidaza
Podobne rezultate dobimo ob uporabi drugega topnega proteinskega antigena, /3-gal.
Za testiranje j8-gal-specifičnega CTL odziva je bila uporabljena tarča BALB/c derivatiziran /3-gal-eksprimirni C3-4 transfektant. Imunizacija BALB/c miši s topno /3-gal da CTL odziv v ozadju. Zato za določitev specifičnega CTL odziva žetev odložimo za vsaj 8 tednov pred žetvijo vraničnih limfocitov in gojimo 5 dni v prisotnosti obsevanih C3-4 transfektantov.
Sl. 2B kaže, da 30 μ-g /3-galaktozidaze v AF inducira močan specifičen CTL odziv proti transfektantu. Pri razmerju efektor: tarča (E:T) 3:1 so z /3-gal-AF imunizirane miši pokazale okoli 80 % specifičnega C3-4 uničenja. Vendar le 20 % uničenja iste tarče dosežemo z efektorji, izoliranimi iz miši, imuniziranih z /S-gal v HBSS pri istem razmerju E:T (sl. 2A). Ker niti EL-4 niti P815 ne eksprimira razred II MHC genskih produktov in liza kaže singensko restrikcijo, so ti ova in /3-gal specifični efektorji razred I MHC restringirani.
Za prikaz uporabnosti antigenskega pripravka imuniziramo miši s topnim ova, zakapsuliranim v dva tipa liposomov, od katerih je eden na pH občutljiv liposom. En teden kasneje vranične celice stimuliramo in vitro, kot je opisano zgoraj, in testiramo proti 51Cr-markiranemu EG7-ova ali EL4. Sl. 3 prikazuje reprezentativen rezultat, ki kaže, da ova v liposomu ni mogel iniciirati miši za znatno CTL indukcijo. Podobne rezultate opazimo, kadar ova imuniziramo v galunu.
PRIMER 2:
Prepoznava epitopa s CTL
Carbone in Bevan, zgoraj, sta pokazala, da CTL, inducirani pri C57BL/6 miših z EGl-ova transfektantom in s citoplazmično ονα-naloženimi splenociti, prepoznajo EL4 celice, preslojene s peptidom ova 258-276. Za določitev, če topni ovalbumin v AF inducira podobne CTL odzive, pripravimo vranične celice iz imuniziranih miši in stimuliramo in vitro z EG7-ova. Efektorje testiramo proti EL4 celicam, preslojenim s peptidom ova 253-276 ali s kontrolnim peptidom, derivatiziranim iz mielinskega bazičnega proteina (MBP 84-102). Rezultati kažejo, da ονα-AF iniciira CTL s podobno specifičnostjo, kot jo imajo tisti, iniciirani s transfektanti ali s citoplazmično naloženim ova (sl. ΙΑ, IB in IC). ova-AF iniciirane efektorske celice učinkovito lizirajo EG7-ovo in netransficirane EL4 celice, preslojene s 50 /Ag/lO8 celic ova peptida, vendar ne lizirajo EL4 celic, preslojenih s 50^g/10® celic MBP peptida.
V /3-galaktozidaznem sistemu sta Carbone in Bevan, zgoraj, navedla, da /3-gal eksprimirni transfektant in splenociti, citoplazmično naloženi s topno jS-galaktozidazo, inducirajo CTL, ki lizirajo jS-gal eksprimirne transfektantske in netransfektantske P815 celice, preslojene z /3-galaktozidazo, digerirano z alkalijo. Topna /3-galaktozidaza inducira CTL s podobno specifičnostjo, kadar imuniziramo v AF (sl. 2).
PRIMER 3:
CTL efektorii so CD8hT celice
Da topni proteinski antigeni v AF inducirajo CD8+ efektorske T celice, je bilo prikazano, kot sledi. Splenocite iz imuniziranih miši gojimo 5 dni z obsevanimi transfektanti in vitro. Nato celice požanjemo in depletiramo CD4+ ali CD8+ T celice z uporabo monoklonskih anti-CD4 ali anti-CD8 protiteles plus komplementa. Depletirane populacije nato testiramo proti 51Cr-EG7<w v ova sistemu ali 51CrP13.1 v jS-gal sistemu. Podatki, prikazani na sl. 4, kažejo, da je v ova sistemu deplecija CD8+ T celic odpravila citolitično aktivnost, ki jo je podelila celotna efektorska celična populacija. Vendar deplecija CD4+ T celične populacije ni imela nobenega učinka na lizo EG7-ovn.
Podobno je v /3-gal sistemu deplecija CD8+ T celic odpravila citolitično aktivnost vraničnih celic, imuniziranih z /3-gal-antigensko formulacijo.
PRIMER 4:
Topni ova v AF iniciira CD8±T celice
Za prikaz, da ora-AF iniciira CD8+ T celične populacije in vivo in je kritičen za in vitro sekundaren odziv, CD4+ ali CD8+ populacije depletiramo od vranic miši, imuniziranih z ovo-AF, in od naivnih miši. Te obdelane populacije nato stimuliramo in vitro s samim EG7-ovn ali v kombinaciji CD4+ in CD8+ T celic miši, imuniziranih z ova-AF, ali v različni kombinaciji CD4+ ali CD8+ T celic miši, imuniziranih z ova-AF, s CD4+ ali CD8+ celicami od naivnih miši. Sl. 5 kaže, da so iniciirane CD8+ celice bistvene za manifestacijo sekundarnega CTL odziva in vitro. Ti podatki tudi kažejo, da so za učinkovit sekundarni CTL odziv in vitro potrebne CD4+ T celice. CD4+ T celice niso potrebne za iniciiranje. Podobno so CD8+ T celice potrebne za manifes21 tacijo jS-gal specifičnega sekundarnega CTL odziva in vitro.
Gornji primeri prikazujejo učinek antigenske formulacije na indukcijo razred I restringiranih CTL odzivov proti topnim proteinskim antigenom. Z antigensko formulacijo posredovan topen antigen inducira CTL iniciiacijo in je po aktivnosti podoben tistemu, ki ga inducirajo transfektanti in splenociti, citoplazmično naloženi s topnim ova ali /3-gal. V ovalbuminskem sistemu EG7-ova, splenociti, citoplazmično naloženi z ova, in ova-AF inducirajo: (a) razred I restringirane CD8+ CTL; (b) CTL, ki prepoznajo tarčo, senzibilizirano z ova 253-276 sintetskim peptidom; in (c) CTL z dolgo življensko dobo le po eni imunizaciji. V jS-galaktozidaznem sistemu inducira /3-gal AF CTL, ki prepoznajo /3-gal eksprimime transfektantske C3-4 in tudi netransficirane P815 celice, senzibilizirane z /3-gal, digerirano z alkalijo. To je analogno temu, kar opazimo pri CTL, induciranih z imunizacijo z vraničnimi celicami, citoplazmično naloženimi z /3-galaktozidazo. Indukcija ova-speifičnih CTL z antigensko formulacijo je enkratna, ker niti ova, zakapsuliran v liposomu, občutljivem na pH, niti v galunu ni mogel inducirati CTL iniciiranje in vivo.
Ti primeri kažejo, da so antigenska formulacija, uporabljena zgoraj, in njeni ekvivalenti uporabni v humani terapiji in v razvoju cepiv za indukcijo CTL pri raznih karcinomih in virusnih boleznih.
PRIMER 5:
To je specifičen primer, da prikažemo uporabo gornjih AF pri ustvarjanju razred I restringirane CTL iniciacije s topnim gpl20 iz HIV.
gpl60 HIB eksprimirno celično linijo (15-12) proizvedemo v Balb/c fibroblastderivatizirani 3T3 celični liniji. Dobili smo jo od Dr. Rona Germaina in Dr. Jaya Berzofsky-ja, National Institute of Health, Bethesda, M.D. gpl60 eksprimirno celično linijo uporabimo za in vitro stimulacijo in vivo iniciiranih vraničnih limfocitov in tudi uporabimo kot tarčo za gpl60 specifično CTL indukcijo. Balb/c miši imuniziramo enkrat z 10 /xg gpl60 na miš z ali brez AF. Mišim damo subkutano injekcijo pri nožnih blazinicah in korenu repa. Vranične celice odvzamemo imuniziranim mišim 2 tedna po imunizacijah ter in vitro stimuliramo z obsevanimi gpl60 transfektanti. Po 5 dneh gojenja in vitro ocenimo iniciacijo s prisotnostjo specifičnih efektorjev, ki so sposobni lizirati gpl60 transfektante, ne pa ne-transficiranih celičnih linij. Rezultati so prikazani na sl. 7, kjer je CTL odziv ojačen z AF in gp!20.
Naslednji primer prikazuje uporabo antigenskih formulacij v smislu predloženega izuma ob uporabi le ene ali dveh komponent. Ti primeri kažejo, da lahko CTLodzive induciramo le z dvema od gornjih treh komponent.
PRIMER 6:
Določitev kritičnih komponent, potrebnih za CTL indukcijo
Za določitev, če so vse zgoraj omenjene komponente potrebne za antigensko specifično CTL indukcijo, imuniziramo miši z ovalbuminom v mikrofluidizirani formulaciji različnih kombinacij dveh od vseh treh komponent, predstavljenih v AF zgoraj. Uporabljene dvokomponentne kombinacije so bile naslednje:
Squalane/TWEEN v PBS, Squalane/Pluronic v PBS ali Pluronic/TWEEN v PBS. Vključili smo drugo serijo skupin, kjer miši imuniziramo z ova, formuliranim v enokomponentnem sistemu, t.j. le v Squalane v PBS, Pluronic v PBS ali TWEEN v PBS. Gornjo trikomponentno antigensko formulacijo smo modificirali tako, da smo naenkrat izključili eno komponento, na njeno mesto pa smo namestili PBS.
Gornje antigenske formulacije obstoje iz 0,300 g TWEEN 80 (Aldrich, WI), 1,875 g Pluronic L121 (BASF, NJ) in 7,5 g Squalane (Aldrich, WI), ki smo jih spravili na 50 ml s PBS.
Dvokomponentne formulacije so: Squalane/TWEEN: 0,300 g TWEEN 80 in 7,5 g Squalane, ki smo jo spravili na 50 ml s PBS.
Pluronic/TWEEN: 1,875 g Pluronic L121 in 0,300 g TWEEN 80, ki smo jo spravili na 50 ml s PBS.
Pluronic/Squalane: 1,875 g Pluronic L121 in 7,5 g Squalane, ki smo jo spravili na 50 ml s PBS.
Vzorce nato predelamo skozi mikrofluidizator, model 110T, Microfluidics corp, ustekleničimo in hranimo pri 4 °C do uporabe.
Ovalbumin (Sigma, MO) stehtamo in spravimo v 0,3 mg/ml raztopino v HBSS (Whittaker, zgoraj). Osnovno 0,3 mg/ml raztopino kombiniramo z dvokomponentno formulacijo v naslednjih količinah: 5 delov ovalbuminske 0,3 mg/ml raztopine, 3,3 deli dvokomponentne formulacije in 1,7 delov HBSS.
Formulacijo mešamo v Vortex-u in vzdržujemo na ledu do injiciranja. Vse raztopine kombiniramo tik pred injekcijo.
Vsaka miš dobi 200 μ\ ene formulacije, ki vsebuje 30 jul OVA, z injekcijo v obe zadnji nožni blazinici in morebitno preostalo raztopino injiciramo subkutano pri korenu repa. Miši pustimo počivati 2 do 4 tedne pred vranično žetvijo.
Dva tedna po imunizacijah pripravimo vranične celice in stimuliramo in vitro z obsevanim EG7-OVA. Po 5 dneh gojenja merimo prisotnost OVA specifičnih CTL s testiranjem proti 51Cr-EG7-OVA ali 51Cr-EL4 v 4-urnem 51Cr sproščevalnem testu. Podatki, prikazani na sl. 8-10 kažejo, da lahko ovalbumin, formuliran v mikrofluidiziranem dvokomponentnem sistemu, iniciira OVA specifične CTL in vivo.
Nadalje smo ocenili relativen prispevek posameznih komponent glede na njihovo sposobnost induciranja CTL, če jih kombiniramo s proteinskimi antigeni. Za imunizacijske namene topen antigen pomešamo z mikrofluidiziranimi nosilci, da dobimo stabilno homogeno emulzijo z velikostjo delcev od 250 do 300 nm. Za nadaljnjo definicijo komponent formulacije squalane-Tween 80-pluronic (STP), odgovorne za CTL indukcijo, imuniziramo miši z ova v squalane-Tween 80 (ST) zmesi, pluronic-Tween 80 (PT) zmesi ali squalane-pluronic (SP) zmesi in kot kontrolo v squalane (S), Tween 80 (T) ali pluronic (P). Miši tudi imuniziramo z ovaSAFm (ki vsebuje 70 jug MDP) ali z ova-galunom kot kontrolami z adjuvansi. Za pozitivno kontrolo miši imuniziramo z vraničnimi celicami, citoplazmično naloženimi s topnim ova. Uporabimo tudi druge kombinacije in nadomestke, rezultati pa so predstavljeni v tabeli 1.
Za detekcijo CTL iniciirnih študij miši imuniziramo enkrat. Dva tedna po imunizaciji vranične celice mešamo z obsevanim EG7-ova (ova eksprimirne EL4 celice) pet dni in testiramo proti 51Cr-EG7-ova ali 51Cr-EL4 celicam. Rezultati (sl. 11) kažejo, da 30 jug ova v kombinaciji s STP ali ST iniciira razred I restringiran CTL odziv pri miših. Zdi se, da je iniciiranje ova specifičnih CTL z ova v STP ali z ova v ST boljše kot tisto, ki ga inducirajo vranične celice, citoplazmično naložene s topnim ova. Ova v PT ali SP lahko inducira ova specifične CTL odzive pri miših, vendar nedosledno in šibko. Z razliko od SAFm dodatek MDP k ST formulaciji ni ogrožal ova specifične CTL in24 ducije pri miših (tabela 2). Ni se pojavila ova specifična CTL indukcija, kadar smo miši imunizirali z ova, pomešanim z individualnimi komponentami, S, P ali T, niti kadar smo miši imunizirali z ova-SAFm ali ova-galunom. Miši, imunizirane celo z 1 mg ova v (a) HBSS, v (b) SAFm ali (c) absorbiranega na galun, niso iniciirale ova specifičnih CTL.
TABELA 2
Indukcija ova specifičnega CTL odziva ni blokirana s ST + MDP % citotoksičnosti pri miših, imuniziranih z* ova-ST-MDP ova-ST-MDP
Stimu- Tarča** E-T ova-ST ova-ST 300 gg mi
lator
EG7 EG7-ova 100:1 0 100 82 76
-ova 33:1 0 86 67 62
11:1 0 33 39 25
3:1 0 6 13 3
1:1 0 0 0 0
3:1 0 0 0 0
* miši so bile imunizirane s 30 μς ova v različnih formulacijah ** % citotoksiCnosti smo izračunali z odštetjem odstotnega uničenja proti antigen ne-eksprimirnim celičnim linijam
PRIMER 7:
Komponente, potrebne za ova specifično proizvodnjo protiteles
Miši imuniziramo trikrat v dvotedenskih intervalih s 30 jug ova v HBSS, STP, ST, PT ali SP. Kot pozitivna kontrola miši tudi imuniziramo z ova-SAFm, ker je znano, da SAFm inducira močan protitelesni odziv. Sedem dni po drugi in tretji imunizaciji miši pustimo izkrvaveti in serume testiramo na ova specifičen protitelesni odziv. Rezultati so prikazani na tabeli 3. Kažejo, da imajo miši, imunizirane z ova v STP, ST ali v SAFm, podobne anti-ονα odzive po dveh imunizacijah.
TABELA 3
Indukcija anti-ova protitelesnega odziva
formulacija 30 pg št. miši z ; odzivom/ 1/razredčenje
ova/2ival št. miši, injekcijo ki so dobile titra serumov
HBSS 0,3 <1/20, <1/20, <1/20,
STP 3/3 <1/4860, >1/4860, <1/4860,
ST 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860,
PT NA NA, NA, NA
SP NA NA, NA, NA
SAF-M 3/3 1/4860, 1/4860, 1/4860,
* N/A: ni na razpolago (not available)
PRIMER 8:
HIV gp!20 specifična CTL indukcija
HIV gpl20 HIB uporabimo kot drugi antigenski sistem za določitev CTL indukcije v STP, ST ali v MP-T. Miši imuniziramo z 1 μ% gpl20 IHb v HBSS, STP, PT ali v ST. Kot kontrolo imuniziramo miši z 1 gg gpl20IIIb v SAFm ali CFA (popolen Freundov adjuvans) ali v RIBI adjuvantskem sistemu, ki vsebuje MPL (monofosforil lipid A) in TDM (trehaloza dimikolit). Tri tedne po imunizaciji vranične celice pripravimo in stimuliramo in vitro z mitomicinsko obdelanimi transfektantskimi celicami 15-12 ali z 18IIIb peptidom. Po petih dneh gojenja dobljene efektorske celice testiramo proti vaccinia:gpl60 HIB ali starševskim vaccinia-iniciiranim P815 celicam kot tarčam. Rezultati kažejo, da je gpl20-Squalane-TWEEN 80 formulacija in ne gpl20Squalane-TWEEN 80 pluronic formulacija ali gpl20-HBSS inducirala gpl20 specifičen CTL odziv pri miših (Tabela 4).
TABELA 4
Indukcija gp 120 specifičnega CTL odziva pri miših % citotoksičnosti pri miših, imuniziranih z*
Stimulator Tarča** E-T gp 120-HBSS gp 120-ST gp 120 STP
18IIIb/II2 vac:gpl20 100:1 23 42 NA***
33:1 23 38 NA
11:1 0 0 NA
3:1 0 35 NA
18IIIb/II2 15-12 100:1 0 50 0
33:1 0 35 0
11:1 0 27 0
3:1 0 18 0
18IIIb/II2 3T3+18IIIb 100:1 0 59 13
33:1 0 59 2
11:1 0 57 0
3:1 0 29 0
15/12 vac:gpl20 100:1 35 84 NA
33:1 19 65 NA
11:1 12 37 NA
3:1 0 22 NA
1:1 0 0 NA
* miši smo imunizirali z 1 gg gp 120III v različnih formulacijah
** % citotoksičnosti smo izračunali z odštetjem odstotnega
proti antigen ne-eksprimirnim celičnim linijam
*** NA; ni na razpolago (not , available)
PRIMER 9:
Indukcija gp!20 specifičnega humoralnega odziva pri miših
Za indukcijo gpl20 specifičnih humoralnih odzivov miši imuniziramo z 1 jug gpl20IIIb trikrat v dvotedenskih intervalih. Živali pustimo izkrvaveti in testiramo na prisotnost IgG protiteles, ki ugotovijo gpl20IIIb v ELISA testu v trdni fazi. Rezultati kažejo, daje gpl20-ST boljši imunogen kot gpl20-HBSS, gpl20SAFm (Tabela 5) ali gpl20-STP.
TABELA 5
Indukcija anti-gpl20 protitelesnega odziva
formulacija 1 gg gpl20/2ival St. miši z odzivom/ St. miši, ki so dobile injekcijo 1/razredčenje titra serumov
HBSS 0/3 <1/20, <1/20, <1/20,
STP 1/3 <1/20, >1/4860, <1/20,
ST 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860,
PT 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860,
SP 2/3 <1/20, 1/540, 1/540
SAF-M 2/3 1/180, >1/4860, 1/540
PRIMER 10:
gp!20 specifični protitelesni odzivi pri opicah
Opice (dve na skupino) imuniziramo z gpl20-SAFm, gpl20-SPT, gpl20-ST ali gpl20-HBSS. Kot kontrolo imuniziramo skupino opic z rekombinantnim vaccinia vsebujočim gpl60IIIb. Opice imuniziramo v dvotedenskih intervalih ter pustimo izkrvaveti dva tedna in tri tedne po drugi imunizaciji. Pred- in imunske serume vsake opice serijsko razredčimo in testiramo na anti-gpl20 aktivnost v ELISA, kot je opisano v materialih in metodah. Podatki (sl. 12) kažejo, da so opice, imunizirane z gpl20-STP ali gpl20-SAFm inducirale podobne odzive v opicah. Ena opica, imunizirana z gpl20-ST, je inducirala anti-gpl20 odziv, podoben kot v skupini, imunizirani z gpl20-SAFm ali gpl20-SPT. Ena opica, imunizirana z gpl20-ST, ni inducirala močnega anti-gpl20 odziva po dveh imunizacijah.
PRIMERU:
In vivo aktivnost AF v kombinaciji s HPV 16 E7
1. Generiranje rekombinatnega HPV 16 E7 proteina za imunizacijo
a) PCR in kloniranje E7 gena
HPV 16 E7 gen kloniramo iz plazmida, ki smo ga dobili od Dr. Karen Vousden (Ludwig Institute), ki kodira E7 gen, derivatiziran iz karcinomske celične linije CaSki. Kodirne regije ojačamo s PCR ob uporabi primerjev, ki kodirajo 5’ in 3’ konce genov, ki leže bočno ob Bam HI in Sal I klonirnih mestih. E7 PCR produkt Iigiramo v pGEX - 4T-1 ekspresijski vektor (Pharmacia Biotech), rezultat pa je pGEX.E7 ekspresijski plazmid. Soj E.coli XL1 - moder (stratagene) transficiramo s pGEX.E7 ekspresijskim plazmidom. Sekvenco E7 dobimo iz plazmidov dobljenih kolonij in je identična E7 sekvenci, dobljeni iz CaSki celic.
b) Proizvodnja čiščenja bakterijsko eksprimiranega E7 pGEX.E7 bakterijski ekspresijski plazmid kodira glutation-S-transferazni (GST) fuzijski protein, ki obstoji iz GST pri amino-terminusu, trombinskega proteaznega mesta cepljenja in E7 proteina pri karboksi-terminusu. E7 protein proizvedemo in čistimo, kot je opisano v informacijski literaturi za produkt proizvajalca pGEX.4T-l vektorja (Pharmacia Biotech). Na kratko, povzročimo, da bakterije, ki vsebujejo pGEX.E7 ekspresijski plazmid, eksprimirajo fuzijski protein z dodatkom izopril b-D-tiogalaktozidaze v medij kulture. Celice požanjemo in liziramo z rahlim sonificiranjem. Lizat nanesemo na Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Ko se je fuzijski protein vezal na matrico, smolo speremo, da odstranimo nespecifično vezane proteine. Vezani fuzijski protein digeriramo s trombinom, da sprostimo E7 protein iz GST fuzijskega partnerja.
E7 proteinski preparat analiziramo s SDS-PAGE in koncentracijo E7 proteina določimo z Bradfordovo analizo (BioRad). Dobimo 9 mg topnega E7 proteina na liter bakterijske kulture.
2. Generiranje Χ21 E7 transfektanta
Kodirne sekvence za HPV16 E7 protein (glej zgoraj) smo vstavili v evkariontski ekspresijski plazmid INPEP4, ki je last IDEC-a. Znotraj tega vektorja kontroliramo E7 ekspresijo s citomegalovirusnimi promotor/vzpodbujevalec transkripcijskimi elementi. Poleg tega smo prve tri nukleotide E7 kodirne sekvence odstranili in nadomestili z imunoglobulinsko lahkoverižno voditeljsko sekvenco, nameščeno takoj zgoraj in v okviru E7 kodirne regije. Po transfekciji v mišjo celično linijo Χ21 preiščemo posamezne G418 rezistentne klone z northern blot analizami za proizvodnjo E7 informacije. Vsak klon je pokazal ugotovljivo E7 informacijo. Nato smo izvedli Western blot analizo celičnih lizatov iz dveh od teh klonov, 4E7 oz. 1C7, (HOPE1 oz. HOPE2) in prikazali proizvodnjo E7 proteina.
3. In vivo aktivnost E7/AF topne antigenske imunizacije
V teh študijah uporabimo samice miši C3H izvora (442^, Harlan Sprague Dawley). Živali vzdržujemo v skladu z Guide for the Čare and Use of Laboratory Animals (DHHS Publication No. NIH 86-23, Bethesda, MD:NIH, 1985) in dobivajo hrano in vodo ad libitum. V teh študijah uporabimo E7 transfektantsko celično linijo HOPE2 H2k/k). Tumorsko celično linijo vzdržujemo s serijsko pasažo in vitro.
Pokazalo se je, da ta celična linija vzdržuje E7 citoplazmično antigensko ekspresijo, kot je bilo ugotovljeno z vvestern blot analizo po ponovljenih in vitro pasažah. Tumorje smo iniciirali v singenskih C3H miših s subkutano injekcijo 150000 in vitro celic, pri katerih smo izvedli pasaže.
Tumorje merimo v 2 pravokotnih smereh v dvotedenskih intervalih. Volumen tumorja (V) izračunamo po naslednji formuli:
V (mm3)=(LxW2) deljeno z 2 kjer je:
L = najdaljša osna meritev v mm W = pravokotna os (mm)
Podatki v tabeli 6 so predstavljeni kot tumorske miši (število živali s tumorji v primerjavi s celotnim številom živali, ki smo jim dali injekcije). Podatki na sl. 13 in 14 so predstavljeni kot srednja tumorska velikost (mm3) vsake obdelane ali kontrolne skupine. Vsako obdelano skupino primerjamo s kontrolno skupino, ki ni prejela terapije. Terapija se začne 10 dni po inokulaciji HOPE2 celic, ko je večina tumorjev otipljivih (približno 50-75 mm3). Terapijo iniciiramo z imunizacijo miši s topnim E7 proteinom v AF ali galunskih adjuvansih (subkutano v celotnem volumnu 0,2 ml). Tik pred imunizacijo AF mešamo 60 sekund z E7 proteinom v Hankovi uravnoteženi solni raztopini (HBSS) tako, da vsaka miš prejme bodisi 30 jug ali 90 jug E7 proteina 0,2 ml. Galun (Pierce Chemical Co.) pomešamo z E7 proteinom po navodilih proizvajalca tako, da vsaka žival prejme 90 pg E7 proteina v 0,2 ml na miš. Živali v drugi obdelani skupini dobijo drugo imunizacijo 9 dni kasneje (19 dni po inokulaciji tumorskih celic). Spodbujevalno imunizacijo pripravimo takoj pred inokuliranjem, kot je opisano zgoraj.
V tem primeru (tabela 6: Xp # 233) je 41 dni po inokulaciji tumorskih celic le 4/8 in 5/8 miši, ki so prejele eno samo injekcijo topnega E7 v aF (30 μ oz. 90 gg), imelo merljive tumorje. V nasprotju s tem so imele vse miši, imunizirane z E7 proteinom v galunu (8/8) aktivno rastoče tumorje. Poleg tega, kot je prikazano na sl. 13, opazimo znatno inhibicijo tumorske rasti le v obdelanih skupinah, imuniziranih z E7 proteinom v aF, v primerjavi s kontrolnimi (neobdelanimi) skupinami ali skupinami, obdelanimi z galunom. Ne opazimo inhibicije tumorske rasti (sl. 13) ali povečanih tumorskih regresijskih stopenj (tabela 6) pri miših, ki so prejele eno samo injekcijo E7 v galunu.
Podobne rezultate tudi opazimo ob uporabi obdelanih skupin, ki so prejele dve imunizaciji na dan 10 in 19 po tumorskem izzivu (tabela 6 in sl. 14), čeprav smo opazili nekaj retardacije tumorske rasti pri miših, ki so prejele dve injekciji E7 v galunu.
Rezultati kažejo, da opazimo znatno antitumorsko aktivnost, kot jo merimo z zmanjšanim številom miši s tumorji in inhibicijo tumorske rasti, po imunizaciji topnega E7 v AF. V nasprotju s tem so imele vse živali, imunizirane bodisi z enojno, bodisi dvojno injekcijo topnega E7 proteina v galunu, rastoče tumorje. Če povzamemo, je rezultat imunizacije s topnim E7 proteinom v AF znatna inhibicija tumorske celične rasti, ki je nismo opazili ob uporabi imunizacije s topnim E7 v galunu.
TABELA 6: Antitumorska aktivnost imunizacije s topnim E7 v adjuvansu
Eks. # Obdelava Doza (/xg/miš) Tumorske živali dan 41
223 kontrola • 7/8
223 E7vAF 30ggx lb 4/8
223 E7vAF 90 gg χ 1 5/8
223 E7 v galunu 90 gg χ 1 8/8
223 E7vAF 30 gg x 2C 3/8
223 E7vAF 90 gg x 2 1/4
223 E7 v galunu 90 gg x 2 8/8
a. Število miši s tumorji/celotno število inokuliranih miši
b. Vse imunizacije se začnejo na dan 10 po implataciji
c. Druga imunizacija (x2) na dan 19 po implantaciji
Druge izvedbe so v okviru sledečih zahtevkov.

Claims (9)

1. Sestavek, označen s tem, da obsega papillomavirusni antigen pomešan z mikrofluidizirano antigensko formulacijo, ki obsega (a) stabilizirni detergent, (b) sredstvo za tvorbo micela in (c) biorazgradljivo in biokompatibilno olje, pri čemer antigensko formulacijo formuliramo kot stabilno emulzijo olje-v-vodi, je v bistvu brez imunostimulirnih peptidov in je sestavek po dajanju živali, izbrani iz skupine, v kateri so človek, domače živali in kmetijske živali, sposoben inducirati specifičen citotoksičen T-limfocitni odziv proti papillomavirusnemu antigenu, ki ga vsebuje.
2. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da papillomavirusni antigen izberemo iz skupine, v kateri so HPV16 E6 antigen, HPV16 E7 antigen, HPV18 E6 antigen, HPV18 E7 antigen, HPV6 E4 antigen, HPV6 LI antigen, HPV11 E4 antigen in HPV11 LI antigen.
3. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da detergent izberemo iz skupine, v kateri so polioksietilen(20)sorbitan monolavrat, polioksietilen(20)sorbitan monopalmitat in polioksietilen(20)sorbitan monooleat; olje izberemo iz skupine, v kateri so skvalan, eikozan in pristan, in sredstvo za tvorbo micela izberemo iz skupine, v kateri so blok kopolimeri propilenoksida in etilen oksida.
4. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, daje detergent polioksietilen(20)sorbitan monooleat in sredstvo za tvorbo micela blok kopolimer propilenoksida in etilenoksida.
5. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da detergent izberemo iz skupine, v kateri so polioksietilen(20)sorbitan monooleat, polioksietilen(20)sorbitan monolavrat, polioksietilen(20)sorbitan monopalmitat, polioksietilen(20)sorbitan monostearat, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonijo-2-propansulfonat, alkil natrijev sulfat in sorbitan trioleat.
6. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da sredstvo za tvorbo micela izberemo iz skupine, v kateri so blok kopolimeri propilenoksida in etilenoksida z različnimi molekulskimi masami, etilenglikol 1000 in blok kopolimeri etilenoksida in
7. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da je velikost delcev v sestavku v območju od okoli 250 do 300 nm.
propilenoksida.
8. Uporaba sestavka po zahtevku 1 za pripravo zdravila za zdravljenje cervikalnega karcinoma.
9. Uporaba sestavka po zahtevku 1 za pripravo zdravila za zdravljenje condyloma acuminata.
SI9520148A 1994-12-07 1995-11-29 Indukcija citotoksičnih T-limfocitnih odzivov SI9520148A (sl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/351,001 US5709860A (en) 1991-07-25 1994-12-07 Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
PCT/US1995/015433 WO1996017863A1 (en) 1994-12-07 1995-11-29 Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9520148A true SI9520148A (sl) 1998-06-30

Family

ID=23379172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9520148A SI9520148A (sl) 1994-12-07 1995-11-29 Indukcija citotoksičnih T-limfocitnih odzivov

Country Status (33)

Country Link
US (2) US5709860A (sl)
EP (1) EP0801656A4 (sl)
JP (1) JPH10510264A (sl)
CN (2) CN1109046C (sl)
AP (1) AP661A (sl)
AR (1) AR002255A1 (sl)
AU (1) AU699044B2 (sl)
BG (1) BG63262B1 (sl)
BR (1) BR9509872A (sl)
CA (1) CA2204738A1 (sl)
CZ (1) CZ293439B6 (sl)
EE (1) EE03569B1 (sl)
FI (1) FI972431A (sl)
GE (1) GEP20012556B (sl)
HK (1) HK1008226A1 (sl)
HU (1) HUP9800946A2 (sl)
IS (1) IS4479A (sl)
LT (1) LT4308B (sl)
LV (1) LV11866B (sl)
MD (1) MD1586G2 (sl)
MX (1) MX9704097A (sl)
NO (1) NO972521L (sl)
NZ (1) NZ298582A (sl)
OA (1) OA10736A (sl)
PL (1) PL183954B1 (sl)
RO (1) RO120065B1 (sl)
RU (1) RU2201253C2 (sl)
SI (1) SI9520148A (sl)
SK (1) SK71397A3 (sl)
TJ (1) TJ384B (sl)
TW (1) TW487575B (sl)
UA (1) UA49814C2 (sl)
WO (1) WO1996017863A1 (sl)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197311B1 (en) * 1991-07-25 2001-03-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
EP0671926B1 (en) * 1992-08-11 2002-11-13 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory peptides
MY131805A (en) * 1997-09-18 2007-09-28 Biogen Idec Inc Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis.
US6013258A (en) * 1997-10-09 2000-01-11 Zycos Inc. Immunogenic peptides from the HPV E7 protein
US6183746B1 (en) 1997-10-09 2001-02-06 Zycos Inc. Immunogenic peptides from the HPV E7 protein
FR2771640B1 (fr) * 1997-12-03 2000-02-11 Inst Nat Sante Rech Med Micelles mixtes de lipopeptides pour l'induction d'une reponse immunitaire et leurs utilisations a des fins therapeutiques
AU3344299A (en) * 1998-04-20 1999-11-08 Shionogi & Co., Ltd. Th2-migration promoters containing w/o emulsions
US20010033839A1 (en) * 1999-10-04 2001-10-25 Emilio Barbera-Guillem Vaccine and immunotherapy for solid nonlymphoid tumor and related immune dysregulation
WO2000049655A1 (en) * 1999-02-18 2000-08-24 Seiko Epson Corporation Semiconductor device, circuit board, method of manufacturing circuit board, and electronic device
CA2366908A1 (en) * 1999-03-24 2000-09-28 The Secretary Of State For Defence Vaccine composition
US20050100928A1 (en) * 1999-09-16 2005-05-12 Zycos Inc., A Delaware Corporation Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
FR2805163A1 (fr) * 2000-02-21 2001-08-24 Pf Medicament Utilisation d'un detergent de type zwittergent pour la preparation d'une composition pharmaceutique destinee a etre administree par voie nasale
US7767197B2 (en) * 2000-06-22 2010-08-03 Endo Pharmaceuticals Colorado LLC Delivery vehicle composition and methods for delivering antigens and other drugs
FR2814957B1 (fr) * 2000-10-06 2002-12-20 Aventis Pasteur Composition vaccinale et procede de stabilisation
WO2003104429A2 (en) * 2002-06-10 2003-12-18 Idec Pharmaceuticals Corporation Genes overexpressed by ovarian cancer and their use in developing novel therapeutics
AU2003254792A1 (en) * 2002-08-02 2004-02-23 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Bacterial cell wall skeleton component preparaion
BR0314629A (pt) 2002-09-19 2005-08-02 Us Gov Health & Human Serv Polipeptìdeos de p. ariasi polipeptìdeos de p. perniciosus e métodos e uso
AU2003284239B2 (en) * 2002-10-21 2008-08-21 Eisai Inc. Compositions and methods for treating human papillomavirus-mediated disease
US7485306B2 (en) 2002-10-29 2009-02-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Lutzomyia longipalpis polypeptides and methods of use
US20080032384A1 (en) * 2004-04-22 2008-02-07 Takehiko Nomura Pharmaceutical Preparation Containing Bacterial Cell Wall Skeleton
WO2008039171A2 (en) 2005-08-08 2008-04-03 Oregon Health & Science University Inactivating pathogens with hydrogen peroxide for vaccine production
US20100130425A1 (en) 2005-09-09 2010-05-27 Oregon Health & Science University Use of toll-like receptor ligands in treating excitotoxic injury, ischemia and/or hypoxia
US7732166B2 (en) * 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
CN101438166A (zh) 2006-03-14 2009-05-20 俄勒冈健康科学大学 产生针对结核病的免疫应答的方法
JP2009536818A (ja) 2006-04-20 2009-10-22 ザ ヘンリー エム． ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドヴァンスメント オブ ミリタリー メディシン インコーポレイテッド 志賀毒性１型タンパク質に基づく方法および組成物
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
US8968995B2 (en) * 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
DK2918598T3 (en) 2007-02-28 2019-04-29 The Govt Of U S A As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health And Human Services Brachyury polypeptides and methods of use
WO2010017209A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Membrane proximal region of hiv gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine
US8664183B2 (en) 2009-02-27 2014-03-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services SPANX-B polypeptides and their use
JP2012526286A (ja) 2009-05-07 2012-10-25 オンコヘルス コーポレーション ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）およびｈｐｖ関連癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニング、および診断のための高度または≧ｃｉｎ２の同定
ES2594485T3 (es) 2009-10-07 2016-12-20 Uvic Industry Partnerships Inc. Vacunas que comprenden transgenes sensibles al calor
WO2011047340A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine
US9173930B2 (en) 2009-11-20 2015-11-03 Oregon Health & Science University Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection
WO2011084598A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Oncohealth Corporation High throughput cell-based hpv immunoassays for diagnosis and screening of hpv-associated cancers
WO2011112599A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary. Department Of Health & Human Services Immunogenic pote peptides and methods of use
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CN102125698A (zh) * 2010-11-29 2011-07-20 昆明理工大学 具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型的建立方法
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
ES2855110T3 (es) 2011-07-18 2021-09-23 The Us Secretary Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Métodos y composiciones para la inhibición de una patología asociada a poliomavirus
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
WO2013152352A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Live, attenuated rubella vector to express vaccine antigens
PL2850431T3 (pl) 2012-05-16 2018-09-28 Immune Design Corp. Szczepionki przeciwko HSV-2
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
EP2895191B1 (en) 2012-09-14 2019-06-05 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Brachyury protein, adenoviral vectors encoding brachyury protein, and their use
WO2014062778A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bavarian Nordic, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
WO2015089469A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Multi-epitope tarp peptide vaccine and uses thereof
US9931393B2 (en) 2013-12-20 2018-04-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunogenic JC polyomavirus compositions and methods of use
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
WO2017024000A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Brachyury deletion mutants, non-yeast vectors encoding brachyury deletion mutants, and their use
CN109196094A (zh) * 2016-03-17 2019-01-11 伯克利之光生命科技公司 微流体装置中t淋巴细胞的选择和克隆
AU2017261705B2 (en) 2016-05-10 2024-04-18 Najit Technologies, Inc. Inorganic polyatomic oxyanions for protecting against antigenic damage during pathogen inactivation for vaccine production
US11235046B2 (en) 2017-11-04 2022-02-01 Nevada Research & Innovation Corporation Immunogenic conjugates and methods of use thereof
CA3120324A1 (en) 2018-12-04 2020-06-11 The Rockefeller University Hiv vaccine immunogens
TW202214294A (zh) 2020-09-30 2022-04-16 美商碩騰服務公司 具有ｈｙａＣ及ｎａｎＰ缺失之新穎多殺性巴斯德氏菌株及疫苗

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4117113A (en) * 1974-06-25 1978-09-26 National Research Development Corporation Immunological preparations
GB1502774A (en) * 1974-06-25 1978-03-01 Nat Res Dev Immunological preparations
US4772466A (en) * 1983-08-22 1988-09-20 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccines comprising polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
US4770874A (en) * 1983-08-22 1988-09-13 Syntex (U.S.A.) Inc. Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
JPS6147500A (ja) * 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
US5114708A (en) * 1985-06-18 1992-05-19 Emory University Method for stimulating growth in animals
US5234683A (en) * 1985-06-18 1993-08-10 Emory University Method of stimulating the immune system
US4877611A (en) * 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
CA1337395C (en) * 1986-10-20 1995-10-24 Rae Lyn Burke Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine
US4778784A (en) * 1987-01-07 1988-10-18 Baylor College Of Medicine Cyclic peptide and method of use for inducing an immunological response to hepatitis B virus
US4963354A (en) * 1987-01-21 1990-10-16 Genentech, Inc. Use of tumor necrosis factor (TNF) as an adjuvant
ATE149091T1 (de) * 1987-11-03 1997-03-15 Syntex Inc Einen tetra-polyol enthaltendes impfstoff- adjuvans
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
HU212924B (en) * 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
DE4018442A1 (de) * 1990-06-08 1991-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante dna und verfahren zur herstellung chimaerer antikoerper
AU1025692A (en) * 1991-02-06 1992-08-13 Ciba-Geigy Ag Novel chimeric antiidiotypic monoclonal antibodies
HU220295B (hu) * 1991-07-25 2001-11-28 Idec Pharmaceuticals Corp. Antigénkészítmények és ezek alkalmazása citotoxikus T-limfocita reakciók indukálására
DE4443414A1 (de) * 1994-12-07 1996-06-13 Basf Ag Benzopyranfarbstoffe und deren Zwischenprodukte
US7735069B2 (en) 2006-02-09 2010-06-08 International Business Machines Corporation Creating software debug breakpoints activated by specific call patterns
US8919787B1 (en) 2010-10-08 2014-12-30 James Timothy Wilcher Reciprocating tool attachment assembly and methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP0801656A1 (en) 1997-10-22
RU2201253C2 (ru) 2003-03-27
IS4479A (is) 1997-05-07
EP0801656A4 (en) 2004-06-30
MD970199A (en) 1999-02-28
EE9700100A (et) 1997-10-15
RO120065B1 (ro) 2005-08-30
SK71397A3 (en) 1997-11-05
WO1996017863A1 (en) 1996-06-13
BR9509872A (pt) 1997-11-25
NO972521L (no) 1997-08-06
GEP20012556B (en) 2001-10-25
AP661A (en) 1998-08-19
FI972431A0 (fi) 1997-06-06
UA49814C2 (uk) 2002-10-15
CN1175260A (zh) 1998-03-04
CA2204738A1 (en) 1996-06-13
LV11866B (en) 1998-01-20
TW487575B (en) 2002-05-21
US5709860A (en) 1998-01-20
JPH10510264A (ja) 1998-10-06
CN1109046C (zh) 2003-05-21
HK1008226A1 (en) 1999-05-07
AR002255A1 (es) 1998-03-11
US5695770A (en) 1997-12-09
CZ174197A3 (en) 1997-10-15
LT4308B (lt) 1998-03-25
FI972431A (fi) 1997-06-06
OA10736A (en) 2002-12-11
LV11866A (lv) 1997-10-20
BG63262B1 (bg) 2001-07-31
TJ384B (en) 2004-07-08
MD1586G2 (ro) 2001-10-31
BG101656A (en) 1998-02-27
LT97115A (en) 1997-11-25
MX9704097A (es) 1998-07-31
CZ293439B6 (cs) 2004-04-14
NO972521D0 (no) 1997-06-03
PL183954B1 (pl) 2002-08-30
HUP9800946A2 (hu) 1998-07-28
AP9701056A0 (en) 1997-10-31
AU4410496A (en) 1996-06-26
PL320612A1 (en) 1997-10-13
CN1515319A (zh) 2004-07-28
MD1586F2 (en) 2001-01-31
EE03569B1 (et) 2001-12-17
NZ298582A (en) 1999-10-28
AU699044B2 (en) 1998-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AP661A (en) Induction of cytotoxic T- lymphocite responses.
EP0596032B1 (en) Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses
US20060057162A1 (en) Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
KR100478617B1 (ko) 세포독성t-림프구반응을유도하는방법