PL183954B1 - Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi - Google Patents
Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowiInfo
- Publication number
- PL183954B1 PL183954B1 PL95320612A PL32061295A PL183954B1 PL 183954 B1 PL183954 B1 PL 183954B1 PL 95320612 A PL95320612 A PL 95320612A PL 32061295 A PL32061295 A PL 32061295A PL 183954 B1 PL183954 B1 PL 183954B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antigens
- antigen
- composition
- ova
- polyoxyethylene sorbitan
- Prior art date
Links
- 230000004044 response Effects 0.000 title abstract description 44
- 230000006698 induction Effects 0.000 title description 38
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 title 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 title 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 143
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 137
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 134
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 112
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims abstract description 79
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 38
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 claims description 28
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 claims description 27
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 26
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 26
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims description 23
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 23
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 claims description 18
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 16
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 16
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 16
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 8
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920002359 Tetronic® Polymers 0.000 claims description 8
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 235000010483 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000249 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Substances 0.000 claims description 6
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 5
- 229920002046 Pluronic® L 62 LF Polymers 0.000 claims description 5
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 5
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 5
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims description 4
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 244000144972 livestock Species 0.000 claims description 4
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 claims description 4
- KMXFZRSJMDYPPG-UHFFFAOYSA-N tetratetracontane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC KMXFZRSJMDYPPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010069621 Epstein-Barr virus EBV-associated membrane antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 108010083021 Epstein-Barr virus glycoprotein 85 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 2
- -1 eicosan Chemical compound 0.000 claims description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims description 2
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 claims 2
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 claims 2
- BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N Triolein Natural products O([C@H](OCC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)C(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N 0.000 claims 1
- PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N Trioleoylglycerol Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 claims 1
- 229940117972 triolein Drugs 0.000 claims 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 39
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 36
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 35
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 24
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 16
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 14
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 14
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 14
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 13
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 12
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 12
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 9
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 8
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 8
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 8
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N icosane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 2
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 101000957351 Homo sapiens Myc-associated zinc finger protein Proteins 0.000 description 2
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 102100038750 Myc-associated zinc finger protein Human genes 0.000 description 2
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 2
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 2
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 2
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N (4as,6as,6br,8ar,9r,10s,12ar,12br,14bs)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,12a-hexamethyl-9-[(sulfooxy)methyl]-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-4a-carboxylic acid Chemical compound C1C[C@H](O)[C@@](C)(COS(O)(=O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N 0.000 description 1
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical class OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101000693916 Gallus gallus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100156155 Human papillomavirus type 16 E7 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 1
- 241000187481 Mycobacterium phlei Species 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000004147 Sorbitan trioleate Substances 0.000 description 1
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 1
- 108700027479 Syntex adjuvant formulation Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940055036 mycobacterium phlei Drugs 0.000 description 1
- YDLYQMBWCWFRAI-UHFFFAOYSA-N n-Hexatriacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC YDLYQMBWCWFRAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000019337 sorbitan trioleate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000391 sorbitan trioleate Drugs 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940038774 squalene oil Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- OLTHARGIAFTREU-UHFFFAOYSA-N triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(C)CCCCCCCC OLTHARGIAFTREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/892—Reproductive system [uterus, ovaries, cervix, testes]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
1 . Kompozycja do wywolywania swoistej reakcji odpornosciowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzeciu wybranemu z grupy obejmujacej czlowieka, zwierzeta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, ze obejmuje antygen wybrany z grupy obejmujacej antyge- ny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowana formulacja dla antygenu obejmujaca: a) detergent stabilizujacy; b) czynnik tworzacy micelle; i c) ulegajacy rozkladowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest za- sadniczo wolna od jakiegokolwiek immunostymulujacego czynnika peptydowego. 2. Kompozycja do wywolywania swoistej reakcji odpornosciowej limfocytów T cytotoksycz- nych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzeciu wybranemu z grupy obejmujacej czlowieka, zwie- rzeta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, ze obejmuje antygen wybrany z grupy obejmujacej antygeny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowana formula- cja dla antygenu obejmujaca: a) detergent stabilizujacy; b) czynnik tworzacy micelle; i c) ulegajacy rozkladowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest po- zbawiona jakiegokolwiek immunostymulujacego czynnika peptydowego. PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi u ludzi oraz zwierząt domowych i gospodarczych.
Uważa się, że limfocyty T cytotoksyczne (CTL) są głównym mechanizmem obronnym w odpowiedzi na różne zakażenia bakteryjne oraz wzrost nowotworu albo raka. Komórki te eliminują komórki zakażone albo transformowane przez rozpoznawanie fragmentów antygenowych w połączeniu z różnymi cząsteczkami (określanymi jako cząsteczki MHC klasy I) na komórkach zakażonych albo transformowanych. CTL mogą być indukowane doświadczalnie przez wprowadzanie do cytoplazmy pewnych rozpuszczalnych antygenów do określonych komórek. Immunizacja samymi antygenami rozpuszczalnymi jest zasadniczo niewystarczająca do indukowania swoistych limfocytów T.
Jedna z metod, którą można indukować odpowiedź CTL obejmuje zastosowanie technik inżynierii rekombinacyjnej do wprowadzania kluczowych składników interesującego antygenu do genomu łagodnych czynników zakaźnych. Celem takiej strategii jest wywołanie swoistej antygenowo odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych na pożądany epitop, przez poddanie gospodarza łagodnej, samoograniczającej się infekcji. Opisano wektory chimeryczne wykorzystujące wirusy krowianki, polio, adeno- i retrowirusy, jak również bakterie takie jak Listeria i BCG. Przykładowo, Takahashi i in., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 3105, 1988, opisuje zastosowanie rekombinowanego wirusa krowianki ekspresjonującego gen otoczkowy gp160 HIV jako potencjalne narzędzie do wywołania odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T.
Druga metoda, dzięki której można indukować odpowiedź komórkową obejmuje zastosowanie adiuwantów. Aczkolwiek stan techniki obfituje w dyskusje na temat zastosowania adiuwantów, nie jest jasne czy została wywołana odpowiedź komórkowa oraz czy odpowiedź
183 954 taka obejmuje odpowiedź limfocytów T cytotoksycznych. Poniżej przedstawione są najbardziej reprezentatywne różne publikacje w tej dziedzinie.
Stover i in., 351 Nature 456, 1991 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) opisuje odpowiedź CTL na β-galaktozydazę przy użyciu rekombinowanych BCG niosących gen β-galaktozydazy. Nie stwierdzono takiej odpowiedzi stosując niekompletny adiuwant Freunda i β-galaktozydazę.
Mitchell i in., 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) opisuje leczenie pacjentów z przerzutami czerniaka adiuwantem określanym jak DETOX i lizatami allogenicznego czerniaka podawanymi pięciokrotnie w ciągu sześciu tygodni. U niewielkiej części pacjentów obserwowano podwyższenie liczby limfocytów T cytotoksycznych. Autorzy opisują potrzebę zwiększenia poziomu wytwarzania limfocytów T cytotoksycznych i sugerują skojarzone leczenie adiuwantem z IL-2, jak również wstępne leczenie cyklofosfamidem w celu zmniejszenia poziomu swoistych wobec nowotworu limfocytów T supresorowych, które mogą występować. DETOX zawiera detoksykowaną endotoksynę (monofosforylo-lipid A) z Salmonella minnesota, szkielety ściany komórkowej Mycobacterium phlei, olej Squalene i emulgator.
Allison i Gregoriadis, 11 Immunology Today 427, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) zauważyli, że jedynym adiuwantem dopuszczonym do stosowania w szczepionkach dla ludzi są sole glinu (alum), które nie wywołują w sposób powtarzalny odporności komórkowej Allison i Gregoriadis stwierdzają: istnieje potrzeba opracowania adiuwantów o skuteczności kompletnego adiuwantu Freunda, ale bez jego licznych efektów ubocznych takich jak ziarniniaki. Twierdzą oni, że istnieją trzy możliwe strategie: przykładowo, zastosowanie liposomów; zastosowanie adiuwantów określanych jako kompleksy immunostymulujące (ISCOM, które zawierają saponinę albo Quil A (triterpenoid z dwoma łańcuchami węglowodanowymi), cholesterol i fosfatydylocholinę) zatwierdzonych do stosowania w końskich szczepionkach przeciwko grypie (Morein i in., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); oraz zastosowanie emulsji (SAF) Squalene albo Squalane (z lub bez czynników typu Pluronic) i muramylodipeptydu (MDP). Uważa się, że SAF wywołuje odporność komórkową u myszy, jakkolwiek długo uważano, że podjednostki antygenu nie mogą wywołać odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych (CTL).
Takahashi i in., 344 Nature 873, 1990, opisują wywołanie limfocytów T rozpoznających w kontekście klasy II, pomocniczych i cytotoksycznych, przez zastosowanie ISCOM-ów w pojedynczej immunizacji podskórnej u myszy. Twierdzą oni, że adiuwant Freunda, niekompletny adiuwant Freunda i roztwór soli buforowany fosforanem nie wywołuje aktywności cytotoksycznych limfocytów T przeciwko celom stanowiącym ich przedmiot zainteresowania. Twierdzą oni, że w przeciwieństwie do wyników z innymi postaciami egzogennych rozpuszczalnych antygenów białkowych, wykazali, że jest możliwe uczulenie rozpoznających w kontekście klasy II CTL CD8+ CD4- swoistych wobec antygenu, przez immunizację egzogennym kompletnym białkiem przez wykorzystanie ISCOM. Twierdzą również, że opisane doświadczenia wskazują na możliwość wywołania ludzkich CTL przez zastosowanie ISCOM zawierających białka HIV, oraz, że szczepionki oparte na ISCOM mogą osiągnąć długo poszukiwany cel wywołania zarówno CTL jak i przeciwciał przez oczyszczone białko.
Byars i Allison, 5 Vaccines 223, 1987, opisują zastosowanie SAF-1, zawierającego monooleinian polioksyetylenosorbitanu, PLURONIC L121 i squalene albo Squalane, z lub bez zastosowania dipeptydu muramylowego, i sugerują, że ich dane wskazują, że kompozycja z dipeptydem muramylowym powinna być przydatna do stosowania w szczepionkach ludzkich i weterynaryjnych. Dawki przypominające adiuwantu były podawane bez dipeptydu muramylowego. Opisuje się, że dipeptyd muramylowy zwiększa znacząco wytwarzanie przeciwciał w stosunku do zastosowania adiuwantu bez niego. Odporność komórkowa była mierzona jako testy skórne nadwrażliwości typu późnego, w celu określenia indukcji limfocytów T pomocniczych. Nadwrażliwość taka była silniejsza i bardziej trwała gdy w adiuwancie znajdował się dipeptyd muramylowy. Podobne adiuwanty opisał Allison i in., w patencie USA 4,770,874 (gdzie stwierdzono, że połączenie dipeptydu muramylowego i poliolu Pluronic stanowi istotę wywołania silnej komórkowej i humoralnej odpowiedzi na kurzą albuminę);
183 954
Allison i in., patent USA 4,772,466; Murphy-Corb i in., 246 Science 1293, 1989 (gdzie stwierdzono, że zastosowanie skojarzonych adiuwantów z dipeptydem muramylowym może wzmocnić indukcję ' gałęzi humoralnej jak i komórkowej odpowiedzi odpornościowej); Allison i Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (gdzie stwierdzono, że odporność komórkowa wywoływana jest przez SAF (z dipeptydem muramylowym) co wykazano nadwrażliwością typu późnego, odpowiedzią proliferacyjną limfocytów T na antygen, wytwarzaniem interleukiny-2 oraz swoistą genetycznie rozpoznawaną lizą komórek docelowych niosących immunizujący antygen); Allison i Bryars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators ot Non-Specific Resistance 191-201, 1987; Morgan i in., 29 J. Medical Virology 74, 1989; Kenney i in., 121 J. Immunological; Methods 157, 1989; Allison i Bryars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (gdzie wykazano, że sole glinu i emulsje olejów mineralnych zwiększają wytwarzanie przeciwciał ale nie odporność komórkową; oraz wykazano, że preparaty dipeptydu muramylowego wywołują odporność komórkową); Byars i in., 8 Vaccine 49, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku, gdzie stwierdzono, że kompozycje adiuwantów znacząco zwiększają odpowiedź humorałną oraz w mniejszym stopniu reakcję komórkową na antygen hemaglutyniny wirusa grypy); Allison i Bryars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku; gdzie stwierdzono, że funkcją dipeptydu muramylowego jest wywołanie ekspresji cytokin i zwiększenie ekspresji genów głównego układu zgodności tkankowej (MHC); oraz, że uzyskano lepszą odpowiedź przeciwciał i komórkową niż w przypadku innych adiuwantów, oraz wyrażono nadzieję, że podobna strategia będzie skuteczna u ludzi); Allison i Byars, Techno-logy Advances in Vaccine Development 401, 1988 (gdzie opisano odporność komórkową po zastosowaniu SAF); Epstein i in., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (gdzie zamieszczono przegląd różnych adiuwantów stosowanych w preparatach szczepionek); Allison i Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (gdzie stwierdzono, że dodanie dipeptydu muramylowego do adiuwantu znacząco wzmaga odpowiedź komórkową na różne antygeny, w tym na przeciwciała monoklonalne i antygeny wirusowe); i Morgan i in., 29 J. Medical Virology 74, 1989 (gdzie opisano zastosowanie SAF-1 do wytwarzania szczepionki przeciwko wirusowi Epsteina-Barr).
Kwak i in., Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, str. 163, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) opisuje zastosowanie SAF bez dipeptydu muramylowego jako adiuwantu wobec idiotypowi chłoniaka z limfocytów B u ludzi. Konkretnie, emulsję Pluronic LI21, Squalane i 0,4% monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, w roztworze soli buforowanym fosforanem podawano wraz z idiotypem. Stwierdzili oni, że „dodanie adiuwantu powinno dalej wspomóc ... odpowiedź humoralną, oraz również może poprawić indukcję odpowiedzi komórkowej.
Inne preparaty immunologiczne zawierają liposomy (Allison i in., patent USA 4,053,585 oraz 4,117,113); peptydy cykliczne (Dreesman i in., patent USA 4,778,784); kompletny adiuwant Freunda (Asherson i in., 22 Immunology 465, 1972; Berman i in., 2 International J. Cancer 539, 1967; Allison, 18 Immunopotentiation 73, 1973; oraz Allison, NonSpecific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOM (Letvin i in., 87 Vaccines 209, 1987); adiuwanty zawierające niejonowe polimery blokowe, wytworzone z olejem mineralnym, czynnkiem aktywnym powierzchniowo i monooleinianem polioksyetyleno-sorbitanu, (Hunter i Bennett, 133 J. Immunqlogy 3167, 1984; oraz Hunter i in., 127 J. Immunology 1244, 1981); adiuwanty składające się z oleju mineralnego i czynnika emulgującego z lub bez zabitych mykobakterii (Sanches-Pescador i in., 141 J. Immunology 1720, 1988); oraz inne adiuwanty takie jak lipofilowe pochodne dipeptydu muramylowego, oraz dipeptyd muramylowy sprzęgnięty kowalencyjnie z białkiem rekombinowanym (id.).
Streszczenie wynalazku
Zgłaszający opracowali bezpieczne i korzystne kompozycje, dzięki którym można wywołać odpowiedź CTL u ludzi oraz zwierząt domowych i hodowlanych. Kompozycja zawiera antygen o małej lub żadnej toksyczności dla zwierząt, oraz pozbawiona jest peptydu immunostymulującego (np. dipeptydu muramylowego) którego obecność mogłaby zmniejszyć pożądaną odpowiedź komórkową. Oprócz tego, technologia wytwarzania kompozycji, jest prosta
183 954 do zastosowania i nie wymaga intensywnej pracy in vivo w celu zmiany istniejących komórek techniką rekombinacji DNA i uczynienia ich bardziej antygenowymi. Stwierdzenie to jest zaskakujące, ponieważ nie oczekiwano, że taka odpowiedź CTL może być wywołana przez zastosowanie takiej formulacji dla antygenu, pozbawionej peptydów immunostymulujących albo ich równoważników. Odkrycie Zgłaszających umożliwia zastosowanie takich formulacji dla antygenu w szeregu chorób albo jako czynników profilaktycznych. Przykładowo, podanie takiej kompozycji antygenu może być zastosowane w leczeniu chorób wirusowych w których istotna jest odpowiedź CTL, przykładowo, w leczeniu zakażenia HIV albo grypą; może również być rozciągnięte na zastosowanie w leczeniu zakażeń bakteryjnych, nowotworów, inwazji robaków itp. Jako czynnik profilaktyczny, kompozycja antygenu skojarzona z odpowiednim antygenem jest przydatna w zapobieganiu zakażeniom wirusami odpowiedzialnymi za wymienione wyżej choroby wirusowe, szczególnie profilaktyce zakażeń HIV jak również do profilaktyki u pacjentów narażonych na choroby nowotworowe, przykładowo po wycięciu guza pierwotnego.
Tak więc, w pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy dostarczenia kompozycji antygenu, na który pożądana jest odpowiedź CTL, i dostarczenie jej w nie toksycznej kompozycji antygenu obejmującej, składającej się z, i zasadniczo składającej się z detergentu stabilizującego, czynnika tworzącego micele i ulegającego rozkładowi biologicznemu i biokompatybilnego oleju. Ta formulacja dla antygenu korzystnie pozbawiona jest jakiegokolwiek immunostymulującego składnika peptydowego albo zawiera wystarczająco niski poziom takiego składnika, tak że odpowiedź odpornościowa nie jest zmniejszona. Formulacja ta korzystnie jest dostarczona jako stabilna emulsja olej w wodzie. To znaczy, każdy z różnych składników wybrany jest tak, że emulsja pozostaje w postaci emulsji przez okres co najmniej miesiąca, zaś korzystnie przez ponad rok, bez rozdzielenia się faz. Według wynalazku, antygen i formulacja dla antygenu są mieszane ze sobą tworząc mieszaninę (korzystnie przez mikrofluidyzację), a mieszanina podawana jest zwierzęciu w ilości odpowiedniej do wywołania odpowiedzi CTL u zwierzęcia. Podawanie takie jest konieczne tylko raz.
Przez określenie „stabilizujący detergent rozumie się detergent, który umożliwia składnikom emulsji pozostawanie w stanie stabilnej emulsji. Detergenty takie obejmują monoolo-inian polioksyetyleno-sorbitanu (Sorbitano-mono-9-oktadecenian-poli(oksy 1,2-etanodiyl; wytwarzany przez ICI Americas, Wilmington, DE), monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu, mono-stearynian polioksyetyleno-sorbitanu, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7 i trioleinian sorbitanu. Detergenty te zwykle stosuje się w ilości około 0,05 do 0,5%, korzystnie około 0,2%.
Przez określenie „czynnik tworzący micele rozumie się czynnik: który jest zdolny do stabilizacji emulsji utworzonej przez inne składniki tak, że tworzone są struktury micelarne. Czynniki takie korzystnie powodują pewne podrażnienie w miejscu wstrzyknięcia co powoduje rekrutację makrofagów i zwiększenie odpowiedzi odpornościowej. Przykłady takich czynników obejmują surfaktanty polimerowe opisane w publikacjach BASF Wyandotte, np. Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977, i Hunter i in., 129 J. Immunol. 1244, 1981, załączone tu jako odnośniki, PLURONIC L62LF, L101 i L64, PEG1000 i TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301 i 130R1. Budowa chemiczna takich środków jest dobrze znana. Korzystnie, wybiera się czynnik posiadający równowagę hydrofilowo-hydrofobową (HLB) od 0 do 2, jak to zdefiniowano w Hunter i Bennett, 133 J. Immunol. 3167, 1984. Środek korzystnie stosuje się w ilości od 0,5 do 10%, korzystniej w ilości pomiędzy 1,25 do 5%.
Olej dobiera się tak aby ułatwiał retencję antygenu w emulsji olej w wodzie, tj. aby stanowił nośnik dla pożądanego antygenu i korzystnie miał temperaturę topnienia poniżej 65°C, tak że emulsja tworzy się w temperaturze pokojowej (około 20-25°C) albo temperatura emulsji spadnie do temperatury pokojowej. Przykłady takich olejów obejmują Squalane, Squalene, EICOSANE, tetratetrakontan, glicerynę i olej arachidowy albo inne oleje roślinne. Olej korzystnie stosuje się w ilości pomiędzy 1 i 10%, najkorzystniej pomiędzy 2,5 i 5%. Istotne jest, aby olej ulegał degradacji biologicznej albo był biokompatybilny, tak by organizm mógł rozłożyć olej po pewnym czasie, oraz by nie powodował on niekorzystnych efektów takich jak ziarniniaki.
183 954
Istotne jest, aby w powyższej formulacji nie znajdował się składnik peptydowy, a zwłaszcza dipeptyd muramylowy (MDP). Peptyd taki będzie przeszkadzał w indukcji odpowiedzi CTL, jeżeli będzie dostarczony w ilości większej niż około 20 pg w normalnej ludzkiej dawce kompozycji. Korzystne jest, aby peptydy nie występowały zupełnie w formulacji dla antygenu, mimo ich wyraźnego pobudzania przedziału humoralnego układu odpornościowego. Zgłaszający stwierdzili, że jakkolwiek peptydy takie mogą pobudzać odpowiedź humoralną, są one niekorzystne gdy pożądana jest odpowiedź limfocytów T cytotoksycznych.
W innym pokrewnym aspekcie, formulacja dla antygenu wytworzona jest tylko z dwóch spośród powyższych trzech składników i zastosowana z dowolnym pożądanym antygenem (które to określenie obejmuje białka, polipeptydy i ich fragmenty, które są immunogenne), z wyjątkiem albuminy jaja (albo innych albumin, np. HSA, BSA albo owalbuminy) w celu wywołania odpowiedzi CTL u powyższych zwierząt albo ludzi.
Zgłaszający uważają, że powyższe formulacje są wyraźnie korzystniejsze w porównaniu z poprzednimi formulacjami (w tym ISCOM, DETOX i SAF) w zastosowaniu u ludzi. W przeciwieństwie do powyższych formulacji, niniejsze formulacje zarówno obejmują czynnik tworzący micele, jak i pozbawione są peptydów, szkieletów ścian komórkowych albo składników komórek bakteryjnych. Niniejsze formulacje wywołują również odpowiedź CTL, która nie występowała w przypadku poprzednich formulacji albo jest ona znacząco zwiększona w porównaniu z innymi formulacjami.
Przez „nietoksyczne rozumie się, że nie występują albo występują niewielkie objawy uboczne formulacji dla antygenu u leczonych zwierząt albo ludzi. Specjaliści w dziedzinie medycyny albo weterynarii zauważą, że określenie to ma szerokie znaczenie. Przykładowo, u zasadniczo zdrowego zwierzęcia albo człowieka tolerowana jest wyłącznie niewielka toksyczność, podczas gdy u człowieka cierpiącego na niebezpieczną chorobę dopuszczalna jest zasadniczo większa toksyczność.
W najkorzystniejszym wykonaniu, formulacja dla antygenu składa się zasadniczo z dwóch albo trzech spośród detergentu, czynnika i oleju; sposób zasadniczo obejmuje pojedyncze podanie mieszaniny (antygen z formulacją dla antygenu) człowiekowi albo zwierzęciu; człowiek albo zwierzę jest zakażone wirusem i cierpi na jeden lub wiele objawów (jak to jest ogólnie definiowane przez specjalistów z danej dziedziny medycyny) zakażenia przez wirusa; zaś formulacja dla antygenu nie jest toksyczna dla człowieka albo zwierzęcia.
W najkorzystniejszym wykonaniu, antygen wybrany jest spośród części antygenowych antygenów HIV: gp160, gag, pol, Nef, Tat i Rev; antygenów malarii: białka CS i białka 2 powierzchni sporozoitów; antygenów powierzchniowych wirusa zapalenia wątroby typu B: PreS1, Pre-32, Hbc Ag i HBe Ag; antygenów wirusa grypy: HA, NP i NA; antygenów powierzchniowych wirusa zapalenia wątroby typu A; antygenów wirusa Herpes: EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, wczesnego produktu białkowego HSV, antygenów ludzkiego wirusa brodawczaków (np. antygenów HPV takich jak antygeny L1, E4, E6, E7, w szczególności antygenów E6 i E7 HPVl6 i 18, dwóch najbardziej powszechnych typów związanych z rakiem szyjki macicy, E4 i L1 pochodzącymi z HPV6 i HPV11, dwóch najbardziej powszechnych typów związanych z kłykcinami kończystymi; antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (PSA), gB wirusa cytomegalii, gH wirusa cytomegalii i białka IE gP72; antygenów wirusa oddechowego: białka F, G i N; oraz antygenów raka CEA, mucyny związane z rakiem, antygenów rakowych P21, P53, antygenów czerniaka MPG, p97 i produktu onkogenu nowotworowego Neu, rakowego produktu genu p53, antygenu czerniaka MAGE, i zmutowanego białka ras p21 obecnego na różnych nowotworach złośliwych.
W pokrewnym aspekcie, wynalazek dotyczy kompozycji obejmującej, składającej się albo składającej się zasadniczo z antygenu zmieszanego z formulacją dla antygenu opisaną powyżej, przy czym antygen wybrany jest spośród części antygenowych wymienionych wyżej.
W innym pokrewnym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobów leczenia pacjenta zarażonego wirusem HlV, cierpiącego na malarię, cierpiącego na grypę, cierpiącego na zapalenie wątroby, cierpiącego na raka, zarażonego wirusem herpes, cierpiącego na raka szyjki macicy, cierpiącego na kłykciny kończyste (kłykciny genitalne) albo zakażonego wirusem oddechowym, przez podanie kompozycji obejmującej odpowiedni antygen (np. wybrany spośród wy8
183 954 mienionych wyżej) zmieszany z odpowiednią formulacją dla antygenu wymienioną wyżej. Antygeny te i leczenie są jedynie przykładami antygenów, które można zastosować w niniejszych formulacjach antygenów.
Inne cechy i zalety wynalazku staną się jasne w oparciu o poniższy opis najkorzystniejszych wykonań oraz zastrzeżerua.
Opis najkorzystniejszych wykonań
Poniżej podano krótki opis rysunków
Rysunki
Figury od 1A do 1C i od 4A do 4C są graficzną prezentacją danych porównujących indukcję CTL przez różne kompozycje owalbuminy; na wszystkich Figurach E:T przedstawia stosunek efektorów do celów.
Figury 2A i 2B są graficzną prezentacją danych porównujących indukcję CTL przez różne formulacje β-galiddOzydazy;
Figura 3 jest graficzną prezentacją danych porównujących indukcję CTL przez owalbuminę w liposomach i w formulacji dla antygenu;
Figury 4 i 6 są graficzną prezentacją danych pokazujących wpływ usunięcia limfocytów CD4 i CD8 na indukcję CTL;
Figura 7 jest graficzną prezentacją danych przedstawiających indukcję CTL przez gp120;
Figura 8 jest graficzną prezentacją danych pokazujących indukcję CTL przez mieszaninę Pluronic i detergentu (TWEEN) oraz antygenu;
Figura 9 jest graficzną prezentacją danych pokazujących indukcję CTL mieszaniną Squalene, Pluronic i antygenu;
Figura 10 jest graficzną prezentacją danych pokazujących indukcję CTL przez mieszaninę Squalene, Pluronic i antygenu;
Figura 11 jest graficzną prezentacją wpływu OVA w różnych formulacjach dla antygenu na odpowiedź CTL;
Figura 12 jest graficzną prezentacją indukcji przeciwciał przeciwko gp120IIIb u małp, przez różne formulacje dla antygenu;
Figura 13 przedstawia aktywność przeciwnowotworową komórek HOPE2 dziesięć dni po pojedynczej immunizacji rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie; i
Figura 14 przedstawia aktywność przeciwnowotworową komórek HOPE2 w 10, 19 dni po dwukrotnej immunizacji rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie.
Formulacja dla antygenu
Formulacje dla antygenu przydatne w niniejszym wynalazku są ogólnie opisane powyżej. Specjaliści w tej dziedzinie wiedzy zauważą, że można łatwo wytworzyć równoważniki formulacji i należy oczekiwać podobnych właściwości indukcji odpowiedzi CTL. Formulacje takie można łatwo testować pod kątem ich właściwości stosując techniki równoważne do opisanych niżej w przykładach.
Poniżej przedstawiono przykłady wynalazku z zastosowaniem formulacji dla antygenu (AF) składającej się z około 2,5% Squalrnr, 5% kwasu Pluronic i monooleinianu polioksyety-lrnosorbitanu, w roztworze soli buforowanym fosforanem. Konkretnie, emulsja AF obejmowała: 15 mg Squalene, 37,5 mg poloksameru 401 (PLURONIC L121), 6 mg monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, 0,184 mg chlorku potasu, 0,552 monozasadowego fosforanu sodu, 7,36 mg chlorku sodu, 3,3 mg dizasadowego fosforanu sodu (bezwodnego) na 1 ml wody, pH 7,4. Emulsję tą mikrofluidyzowano stosując standardową technikę (Microfluidics Model M110F) z modułem ciśnienia zwrotnego przy 11-14000 psi ze stopniowym powrotem do ciśnienia atmosferycznego, chłodzono i pakowano w lodzie.
W innych przykładach, antygen zmieszano z mikrofluidyzowaną mieszaniną Squalene (S), Pluronic (P) i monooleinianu polioksyrtyleno-sorbitanu (T) zachowując stężenia końcowe 0,2% monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, 1,25% Pluronic i 5% Squalene. W celu określenia składników niezbędnych do indukcji swoistej antygenowe odpowiedzi odpornościowej wytworzono mieszaniny Squalane-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, Pluronic-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu i Squalrne-Pluronic w tych samych stężeniach co w mieszaninie trzech
183 954 składników. Pluronic, Squalane albo monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu były również preparowane osobno w celu określenia wpływu pojedynczych składników na indukcję CTL. Wykonano również zastąpienia monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu przez monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu i Zwittergent w celu określenia wpływu różnych pochodnych TWEEN na indukcję CTL w układzie ova. Zastąpienie Squalene w formulacji trójskładnikowej wykonano przez zastosowanie Eicosone albo Triacontone zaś kopolimer Pluronic zastąpiono w tych samych trzech formulacjach PEG 1000, Pluronic L62LF i Tetronic 1501 i 150R1. W formulacjach dwuskładnikowych mieszano różne analogi w różnych kombinacjach i badano pod kątem indukcji CTL swoistej wobec ova. Były to mieszaniny cholesterolmonooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, Squalene-monolaurynianu polioksyetyleno-sorbitanu, Pristane-mono-oleinianu polioksyetyleno-sorbitanu albo olej z oliwek-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu. W badaniach nad stabilizacją mikrofluidyzowaną mieszaninę Squalenemonooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu mieszano z dekstrozą do stężenia końcowego 5%. We wszystkich przypadkach, kombinację wypełniacza mieszano w urządzeniu do mikrofluidyzacji tworząc stabilną emulsję. W niektórych doświadczeniach formulacje dwuskładnikowe mieszano z różnymi stężeniami MDP w celu indukcji odpowiedzi CTL i humoralnej. W tabeli 1 przedstawiono skróconą listę różnych formulacji stosowanych w tym badaniu.
Tabela 1
Wpływ różnych zastąpień w układach dwu- i trójskładnikowych
Zastąpienia w formulacji trój składnikowej
STP monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu (T) monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu (T) T1501(P)
T150R1(P)
Pluronic L62LF(P)
Eicosane (S)
PEG 1000(P)
Triacontane (S)
Zwittergent (T)
Zastąpienia w formulacji dwuskładnikowej
ST
PT
SP
Cholesterol (S ) + monooleinian polioksy-etyleno-sorbitanu
Skwalen + monolaurynian polioksyetylenosorbitanu (T)
Pristane(S) + monooleinian polioksyetylenosorbitanu
Olej z oliwek (S) + monooleinian polioksy-etyleno-sorbitanu F ormulacj a j ednoskładnikowa Pluronic L121 Skwalen monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu Skwalen + monooleinian polioksyetylenosorbitanu+ 5% dekstrozą * test CTL jest powtarzany
Procent niszczenia przy E:T równym 100:1 84
183 954
Formulację adiuwantu Syntex (mikrofluidyzowana; SAFm) zastosowano jako kontrolę adiuwantu i składała się ona z dwóch części. Część I składała się z roztworu soli buforowanego fosforanem zawierającego 5% Squalene, 1,,25% Pluronic i 0,2% monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu (nośnik albo I-SAF). Część II składała się z N-acetylomuramylo-Ltreonylo-D-izoglutaminy (Thr-MDP), pochodnej składnika ściany komórkowej mykobakterii. W celu immunizacji, antygen miesza się z mikrofluidyzowanym nośnikiem (część I) w celu otrzymania homogennej emulsji. Do wytworzonego SAFm dodaje się MDP i krótko miesza. Stężenie MDP w mieszaninie było zmieniane w celu określenia, czy było ono optymalne dla indukcji CTL. Jako kontrola adiuwantu, myszy immunizowano również rozpuszczalnymi antygenami zmieszanymi z alumem według instrukcji producenta (Pierce Chemical, Rockford, IL) albo z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA).
Tę formulację dla antygenu stosowano do indukowania odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych u myszy. Specjaliści w tej dziedzinie wiedzy zauważą, że taki model mysi świadczy, że jest możliwe równoważne doświadczenie albo leczenie powinno podobnie wywołać odpowiedź limfocytów T cytotoksycznych u ludzi, zwierząt domowych albo hodowlanych. Ilość formulacji dla antygenu i antygenu przydatna w wywołaniu pożądanej odpowiedzi komórkowej może być określona doświadczalnie według standardowych procedur, dobrze znanych specjalistom, bez dodatkowych doświadczeń. Tak więc, jeżeli pożądane jest zmniejszenie efektów ubocznych leczenia taką mieszaniną, specjalista może określić minimalny poziom takiej mieszaniny do podawania człowiekowi, zwierzęciu domowemu albo hodowlanemu, w celu wywołania odpowiedzi CTL i w ten sposób wywołania odporności na pożądany antygen. W normalnym stosowaniu, mieszanina taka może być wstrzykiwana dowolną spośród licznych procedur, ale szczególnie korzystne jest wstrzyknięcie domięśniowe w miejsce umożliwiające emulsji pozostanie w postaci stabilnej przez okres kilku dni albo tygodni.
Metody
Poniższe materiały i metody zastosowano w Przykładach podanych niżej jeżeli nie zaznaczono inaczej:
Myszy
Samice myszy C57BL/6 (H-2b) i BALB/c (H-2d) zakupiono z Harlen Spraque (San Diego, Kalifornia).
Antygeny
Owalbuminę (ova, czystość VII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zastosowano w postaci natywnej. β-galaktozydazę (β-gal, czystość VIII; BRL) zastosowano w postaci natywnej i po gotowaniu z 1 M NaOH przez 2 min. co dało produkt trawienia alkalicznego. Rekombinowanągp120 zakupiono z American Biotechnology.
Komórki nowotworowe i transfektanty
Zastosowano komórki nowotworowe linii Ia- EL4 (C57BL/6, grasiczak H-2b) i P815 (DBA/2, mastocytoma H-2d). Otrzymanie transfektantów EL4 wytwarzających ova, EG7-ova, opisano uprzednio przez Moore i in., 54 Cell 777, 1988. Transfektant wytwarzający β-gal, P13.1, uzyskano przez elektroporację 107komórek P815 w 1 ml roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) z 10 mg pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) linearyzowanego Psit I, i 1 mg pSV2 neo (Southern i in., 1 J. Mol. Appl. Gen. 327, 1982) linearyzowanego PvuI, a następnie selekcję w 400 pg/ml antybiotyku G418. Transfektant C3-4 uzyskano z hybrydomy BALB/c Igm 662 przez transfekcję plazmidem kodującym gen β-gal poddany fuzji z trzecim i czwartym egzonem łańcucha ciężkiego IgM (Rammensee i in., 30 Immunogenetics 296, 1989). Fibroblasty 3T3 ekspresjonujące gp160IIIb, 15-12, uzyskano od Dr Germain z NIH (Bethesda, MD). Linię komórek L transfekowanych Kb uzyskano od Dr Carbone, Monash University, Australia. Linie komórek L transfekowanych Dd i Ld uzyskano od Dr Teda Hansena, Washington University, St. Louis.
Immunizacja
Myszy immunizowano dożylnie stosując 200 pi zawiesiny 25x106 splenocytów, po upakowywaniu cytoplazmy jak to opisano w Moore i in., wyżej, i Carbone i in., J. Exp. Med. 169:603, 1989. Do immiunizacji formulacją dla antygenu ova albo formulacją β-gal 30 pg każdego z antygenów białkowych na mysz wstrzyknięto w poduszkę łapy i podskórnie u na183 954 sady ogona. Każde ze wstrzyknięć zawierało 67 pl mikrofluidyzowanej formulacji dla antygenu (wytworzonej procedurą standardową) i 30 pg antygenu białkowego w objętości końcowej 200 pl. Objętość końcową dopełniono HBSS, patrz, podręcznik Whittakera (Walkersville, MD). MDP dostarczono w stężeniach pomiędzy 0 i 300 pg. Gdzie to zaznaczono, myszy immunizowano rozpuszczalnym antygenem w CFA, albo w alumie w objętości końcowej 200 pl.
Pobudzanie populacji efektorów in vitro
Splenocyty (30x106) pochodzące z myszy normalnych albo immunizowanych, uczulonych przynajmniej 14 dni wcześniej, inkubowano z 1,5x106 EG7-ova (napromieniowanych dawką 20000 radów) dla odpowiedzi na ova i 1,5x106 komórek C3-4 (napromieniowanych dawką 20000 radów) dla odpowiedzi na β-gal w 24-studzienkowych płytkach w 37°C w 7% CO2/powietrze. Wszystkie hodowle komórkowe wykonano w kompletnej pożywce zawierającej pożywkę IMDM, patrz, podręcznik Whittakera (Walkersville, MD) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (FCS), 2 mM glutaminy, gentamycyny i 2x10'5 2-merkaptoetanolu. Do doświadczeń z deplecją in vitro, splenocyty uczulane in vivo albo pobudzane in vitro traktowano przeciwciałami monoklonalnymi (mAbs) RL.172 (przeciwko CD4) albo mAbs 3.168 (przeciwko CD8) w celu usunięcia limfocytów CD4+ albo CD8+ (Sarimento i in., 125 J. Immunol. 2665, 1980; i Ceredig i in., 314 Nature 98, 1985). mAb RL.172 i mAb 3.168 uzyskano od Dr Jonathana Sprenta z Scripps Clinic and Research Fundation, La Jolla CA.
Splenocyty (30x106) od normalnych albo immunizowanych myszy, uczulonych przynajmniej 21 dni wcześniej inkubowano z 1,5x106 komórek 15-12 (traktowanych 200 pg mitomycyny C na 108 komórek przez 45 minut) albo 500 pg peptydu 18IIIb zawierającego dominujący epitop CTL myszy BALB/c w kompletnej pożywce IMDM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) zawierającej 10% uprzednio zbadanej FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 mM glutaminę, gentamycynę i 2x10'5 2-merkaptoetanolu. Do stymulacji in vitro peptydami, splenocyty hodowano w kompletnej IMDM zawierającej 5% nadsącz ConA.
Do doświadczeń z deplecją, uczulane in vivo albo pobudzane in vitro splenocyty traktowano mAbs RL.172 (przeciwko CD4) albo mAbs 3.168 (przeciwko CD8) w obecności króliczego dopełniacza o niskiej toksyczności (Cederlane Laboratories, Ltd., Homby, Ontario, Kanada) w celu usunięcia limfocytów CD4+ albo CD8+ (22, 23). mAb RL.172 i mAb 3.168 były ofiarowane przez Dr Jonathana Sprenta z Scripps Clinic and Research Fundation, La Jolla, CA.
Test cytotoksyczności
Komórki docelowe (1x106) znakowano 100 pCi [5'Cr] chromianu sodu przez 60 minut. W celu uzyskania celów pulsowanych peptydem, 50 pl roztworu peptydu 1 mg/ml w HBSS dodano podczas znakowania celów 5'Cr. Po płukaniu, 104 znakowanych celów i seryjne rozcieńczenia komórek efektorowych inkubowano w 200 pl RP10 przez 4 godziny w 37°C. Zebrano 100 pl nadsączu i określano lizę swoistą w następujący sposób:
% lizy swoistej=100 x {(uwalnianie w CTL - uwalnianie spontaniczne)/(uwalnianie maksymalne - uwalnianie spontaniczne)}.
Uwalnianie spontaniczne pod nieobecność limfocytów T cytotoksycznych (CTL) wynosiło <25% uwalniania maksymalnego pod wpływem detergentu we wszystkich doświadczeniach.
Określenie odpowiedzi przeciwciał u myszy i małp
Każdą ze studzienek płytki 96-studzienkowej o ukształtnych denkach (Costar, Cambridge, MA) opłaszczono 150 ng ova albo gp120 w 50 pl HBSS i inkubowano przez w 4°C. W celu określenia odpowiedzi przeciwciał przeciwko antygenom gp120 albo ova u myszy, płytki blokowano 1% BSA przez 1 godzinę. Seryjnie rozcieńczone surowice dodano w ilości 25 pl na studzienkę i inkubowano przez 2 godziny. Płytki płukano i dodawano po 50 pl rozcieńczenia 1:1000 kozich koniugatów z HRPO przeciwko mysim IgG (SBT, Alabama) w 1% BSA. Po 1 godzinie inkubacji, płytki płukano i dodawano po 100 pl substratu na studzienkę. OD405 mierzono po 10 do 15 minutach. W celu określenia odpowiedzi przeciwciał przeciwko gp120 u małp, wszystkie etapy były takie same z wyjątkiem tego, że blokowanie płytek i rozcieńczenia surowic wykonano w 5% normalnej surowicy koziej w HBSS.
183 954
Synteza peptydów
Syntetyczne peptydy odpowiadające sekwencji aminokwasowej 253-276 (Identyfikator Sekw. Nr 1:
EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; gdzie w celu przedstawienia aminokwasów zastosowano standardowy kod jednoliterowy) owalbuminy [ova 253-276), sekwencji amino-kwasowej 84-102 zasadowego białka mieliny (MBP 84-102) (Identyfikator Sekw. Nr 2:
DENPVVHFFKNIVTPRTPP) i syntetyczne peptydy odpowiadające sekwencji amino kwasowej 308-322 (sekwencja 18IIIb) gp120IIIb, wytworzono stosując syntezę peptydów na podłożu stałym z użyciem syntezatora Applied Biosystems 430A. Aminokwasy sprzęgano przez uprzednio wytworzone bezwodniki symetryczne z wyjątkiem asparaginy, glutaminy i argininy które wiązano jako estry hydroksybenzotriazolu. Efektywność sprzęgania monitorowano reakcją ninhydrynową w oparciu o metodę Kaisera i in., 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Peptydy uwalniano z podłoża przy użyciu HF, w oparciu o procedurę określaną jako „low-high opisaną przez Tam i in., 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983 zaś peptydy ekstrahowano z żywicy 10% kwasem octowym. Po liofilizacji, peptydy wysalano na kolumnie Sephadex G-25, zaś próbki peptydów oczyszczano przez HpLc, metodą chromatografii z odwróconymi fazami na kolumnie preparatywnej Vydac C-18. Oczyszczone peptydy (98%) solubilizowano w HBSS w stężeniu końcowym 10 mg/ml i rozcieńczano do pożądanego stężenia w kompletnej pożywce.
Trawienie CNBr
Próbki białka (np. β-galaktozydazy) traktowano 100-krotnym nadmiarem molarnym bromku cyjanu w roztworze 100 mM kwasu trifluorooctowego. Reakcję prowadzono przez 18 godzin w temperaturze pokojowej (około 20°C) przy wirowaniu. Po przepisanym czasie, fragmenty peptydowe oddzielono od składników reakcji stosując aparat SEP-PAK C-18 (Waters), eluowano 95% acetonitrylem i liofilizowano.
Trawienie alkaliczne
Próbki białka (np. β-galaktozydazy) traktowano 1 N NaOH i gotowano przez 2 minuty, zaś powstałe fragmenty peptydowe oddzielono od składników reakcji stosując aparat SEPPAK C-18 (Waters), eluowano 95% acetonitrylem i liofilizowano.
Przykład 1: Wyzwalanie CTL w kontekście klasy I
Moore i in., 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 i Carbone i Bevan, 171 J. Exp. Med. 377, 1990, wykazali, że myszy immunizowane splenocytami o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną ova, były uczulone swoiście wobec ova odpowiedzią CTL w kontekście klasy I. Do pobudzania in vitro uczulonych in vivo limfocytów śledzionowych jak również jako cele do swoistego wobec ova niszczenia przez CTL zastosowano transfektanty EG7-ova, ekspresjonujące ova EL4. Badanie to pokazało również, że efektory CD8+ indukowane przez transfektanty ova albo splenocyty z cytoplazmą upakowaną ova, rozpoznaj ą determinantę mapowaną przez peptyd ova 258-276 w kontekście H-2Kb, niszczą EG7-ova jak również niszczą komórki EL4 opłaszczone przez ova 258-276. Tak więc, w celu określenia czy endogenny szlak limfocytów T CD8+ rozpoznających w kontekście klasy I może być indukowany antygenem rozpuszczalnym, powyższy układ zastosowano do określenia, czy pewne formulacje dla antygenu mogą być zastosowane do skierowania rozpuszczalnego antygenu na szlak rozpoznawania w kontekście klasy I.
a) ova
Myszy C57BL/6 immunizowano jeden raz różnymi ilościami ova (30 pg - 1 mg na mysz) z lub bez formulacji dla antygenu. Myszy nastrzykiwano podskórnie oraz u podstawy ogona. Splenocyty pobrano od immunizowanych myszy przynajmniej dwa tygodnie po immunizacji i pobudzano in vitro transfektantami EG7-ova. Stężenie ova równe 30 pg było równie skuteczne jak dawka 1 mg. Stąd, badania CTL były rutynowo wykonywane ze splenocytami od myszy uczulanych dawką 30 pg ova. Po pięciu dniach hodowli in vitro z EG7-ova, badano uczulenie przez obecność swoistych dla ova efektorów zdolnych do niszczenia EG7-ova.
Myszy nastrzyknięte rozpuszczalną ova w HBSS w dawce 1 mg nie wykazywały śladów uczulenia CTL (fig. 1A). Jednakże, myszy immunizowane 30 pg ova w formulacji dla
183 954 antygenu opisanej powyżej (pokazane na figurach jako AF) wykazywały znaczną odpowiedź CTL swoistą wobec transfektantów (fig. 1C). Ponadto, wielkość niszczenia EG7-ova przez swoiście immunizowane splenocyty była porównywalna z obecną u myszy immunizowanych splenocytami wypełnionymi ova (fig. 1B).
Swoistość antygenową uczulenia CTL in vivo wykazano przez brak u myszy immunizowanych β-galaktozydazą splenocytów wykazujących wtórną odpowiedź CTL in vitro podczas pobudzania EG7-ova. Nie obserwowano indukcji CTL swoistych wobec ova.
b) (egalaatooydaaa
Podobne wyniki uzyskano przy zastosowaniu innego rozpuszczalnego antygenu białkowego, β-gal. W celu zbadania odpowiedzi CTL swoistej wobec β-gal, zastosowano jako cel transfektanty C3-4 ekspresjonujące β-gal, uzyskane od BALB/c. Immunizacja myszy BALB/c rozpuszczalną β-gal dawała odpowiedź CtL na poziomie tła. Stąd, w celu oznaczenia swoistej odpowiedzi CTL zbieranie limfocytów śledzionowych odłożono o przynajmniej osiem tygodni po czym hodowano je przez 5 dni w obecności napromieniowanych transfektantów C3-4.
Figura 2B pokazuje, że 30 pg β-galaktozydazy w AF indukuje silną odpowiedź CTL swoistą wobec transfektantów. Przy stosunku efektorów do celów (E:T) równym 3:1, myszy immunizowane β-gal-AF wykazywały około 80% niszczenia swoistego wobec C3-4. Jednakże, tylko 20% niszczenia swoistego wobec tych samych celów uzyskano stosując komórki efektorowe izolowane od myszy immunizowanych β-gal w HBSS przy tym samym stosunku E:T (fig. 2A). Ponieważ ani EL4, ani P815 nie ekspresjonują produktu genu MHC klasy II zaś liza wykazuje restrykcję syngeniczną, te swoiste wobec ova i β-gal komórki efektorowe rozpoznają w kontekście MHC klasy I.
W celu wykazania przydatności formulacji dla antygenu, myszy immunizowano rozpuszczalną ova zamkniętą w dwóch rodzajach liposomów, z których jeden typ był wrażliwy na pH. Tydzień później, splenocyty pobudzano in vitro, jak to opisano wyżej, i badano wobec EG7-ova albo EL4 znakowanym 5lCr. Figura 3 pokazuje reprezentatywne wyniki pokazujące, że ova w liposomach może nie uczulać myszy w kierunku wyraźnej odpowiedzi CTL. Podobne wyniki obserwowano gdy immunizowano myszy ova w alumie.
Przykład 2: Rozpoznawanie epitopu przez CTL
Carbone i Bevan, wyżej, wykazali, że CTL indukowane u myszy C57BL/6 przez transfektanty EG7-ova oraz przez splenocyty o cytoplazmach wypełnionych ova, rozpoznają komórki EL4 opłaszczone peptydem ova 258-276. W celu stwierdzenia, czy rozpuszczalna owalbumina w AF wywołuje podobną odpowiedź CTL, od immunizowanych myszy pobrano splenocyty i pobudzano in vivo EG7-ova. Efektory badano wobec komórek EL4 opłaszczonych peptydem ova 258-276 albo peptydem kontrolnym uzyskanym z zasadowego białka mieliny (MBP 84-102). Wyniki pokazują, że ova-AF uczulała CTL z podobną swoistością co wywołana przez transfektanty, albo komórki o cytoplazmie wypełnionej ova (fig. 1A, 1B i 1C). Komórki efektorowe uczulane ova-AF skutecznie niszczyły EG7-ova oraz nie transfekowane komórki EL4 opłaszczone ova w ilości 50 pg/108 komórek, ale nie niszczyły komórek EL4 opłaszczonych peptydem MBP w ilości 50 gg/106 komórek.
W układzie β-galaktozydazy, Carbone i Bevan, wyżej, wykazali, że transfektant ekspresjonujący β-gal i spenocyty wypełnione rozpuszczalną β-gal indukują CTL, które niszczą transfektanty ekspresjonujące β-gal i nietransfekowane komórki P815 opłaszczone produktem alkalicznego trawienia β-galaktozydazy. Rozpuszczalna β-galaktozydaza wywoływała CTL o podobnej swoistości gdy immunizowano niż w AF (fig. 2).
Przykład 3: efektory CTL są limfocytami T CD8+
Indukcję efektorowych limfocytów T CD8+ przez rozpuszczalny antygen w AF wykazano w poniższy sposób. Splenocyty od immunizowanych myszy hodowano in vitro przez 5 dni wraz z napromieniowanymi transfektantami. Następnie, komórki zebrano i pozbawiono limfocytów CD4+ albo CD8+ stosując odpowiednio, przeciwciała monoklonalne przeciwko CD4 albo przeciwko CD8 z dodatkiem dopełniacza. Populacje tak traktowane badano następnie w układzie ova wobec 5ICr-EGY-ova albo układzie β-gal wobec 5lCr-P13.1. Dane pokazane na fig. 4 wskazują, że w układzie ova usunięcie limfocytów T CD8+ usuwa aktywność
183 954 cytolityczną wykazywaną przez pełną populację efektorową. Jednakże, usunięcie populacji limfocytów T CD4+ nie wykazuje wpływu na niszczenie EG7-ova.
Podobnie, w układzie β-gal, usunięcie limfocytów T CD8+ zniosło aktywność cytolityczną splenocytów immunizowanych formulacjjądla antygenu z β-gal.
Przykład 4: Rozpuszczalna ova w AF uczula limfocyty T CD8+
W celu wykazania, że ova-AF uczula populacje limfocytów T CD8+ in vivo, i jest kluczowa dla wtórnej odpowiedzi in vitro, populacje CD4+ albo CD8+ usunięto ze śledzion myszy immunizowanych ova-AF oraz myszy naiwnych. Tak traktowane populacje były następnie pobudzane in vitro samą ova-AF, albo w kombinacji z limfocytami T CD4+ i CD8+ od myszy immunizowanych ova-AF, albo w różnych kombinacjach limfocytów CD4+ albo CD8+ od myszy immunizowanych ora-AF z limfocytami T CD4+ albo CD8+ od myszy naiwnych. figura 5 pokazuje, że uczulone limfocyty CD8+ są kluczowe dla wywołania wtórnej odpowiedzi CTL in vitro. Dane te wskazują również, że dla skutecznej wtórnej odpowiedzi CTL in vitro nie są konieczne limfocyty T CD4+. Limfocyty CD4+ nie są konieczne do uczulenia. Podobnie, limfocyty T CD8+ były konieczne do wywołania wtórnej odpowiedzi CTL in vitro swoistej wobec β-gal.
Powyższy przykład pokazuje wpływ formulacji dla antygenu na indukcję odpowiedzi CTL w kontekście klasy I przeciwko rozpuszczalnemu antygenowi białkowemu. Formulacja dla antygenu indukowała uczulenie CTL rozpuszczalnym antygenem o podobnej aktywności co indukowana przez transfektanty albo splenocyty o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną ova albo β-gal. W układzie owalbuminy, EG7-ova, splenocyty wypełnione ova i ovaAF indukowały: (a) CD8+ CTL w kontekście klasy I; (b) CTL rozpoznające cele uwrażliwione syntetycznym peptydem ova 253-276; i (c) długotrwałe CTL po tylko jednej immunizacji. W układzie β-galaktozydazy, β-gal-AF indukowała CTL, które rozpoznawały transfektant C3-4 ekspresjonujący β-gal, jak również nietransfekowane komórki P815 uwrażliwione produktem trawienia alkalicznego β-gal. Jest to analogiczne do tego, co było obserwowane z CTL indukowanymi przez immunizację splenocytami o cytoplazmach wypełnionych β-galaktozydazą. Indukcja CTL swoistych wobec ova przez formulację dla antygenu jest unikalna, ponieważ ani ova zamknięta w liposomach wrażliwych na pH, ani w alumie nie potrafiła indukować uczulenia CTL in vivo.
Przykłady te wskazują że zastosowana wyżej formulacja dla antygenu i jej równoważniki są przydatne w terapii człowieka oraz w opracowywaniu szczepionek do wywoływania CTL przeciwko różnym chorobom wirusowym i nowotworowym.
Przykład 5:
Jest to konkretny przykład mający na celu pokazanie zastosowania powyższej AF do wywołania uczulenia CTL w kontekście klasy I przez rozpuszczalną gp120 HIV.
Linię komórkową ekspresjonującą gp160 IIIB (15-12) uzyskano w oparciu o linię komórek 3T3 uzyskaną z fibroblastów Balb/c. Otrzymano ją od Dr Rona Germaina i Jay'a Berzofsky'ego, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Linię komórkową ekspresjonującą gp160 zastosowano do pobudzania in vitro uczulonych in vivo limfocytów śledzionowych, jak również zastosowano ją jako cel do indukcji CTL swoistych wobec gp160. Myszy Balb/c immunizowano jednokrotnie stosując 10 pg gp160 na mysz, z albo bez Af. Myszy nastrzykiwano w poduszeczkę łapy i podskórnie w nasadę ogona. Splenocyty pobrano od immunizowanych myszy po dwóch tygodniach po i pobudzano in vitro napromieniowanymi transfektantami gp160. Po 5 dniach hodowli in vitro uczulenie oceniano przez wykazanie obecności efektorów zdolnych do niszczenia transfektantów gp160, a nie nietransfekowanych kontroli. Wyniki pokazano na fig. 7, gdzie odpowiedź CTL jest wzmożona przez AF z gp120.
Poniższy przykład pokazuje zastosowanie formulacji dla antygenu według wynalazku przy zastosowaniu tylko jednego albo dwóch składników. Przykłady te pokazj że odpowiedź CTL może być indukowana przy użyciu tylko dwóch spośród trzech składników.
Przykład 6: Oznaczanie składników kluczowych, niezbędnych do indukcji CTL
W celu określenia czy wszystkie spośród zaznaczonych powyżej składników są niezbędne do indukcji CTL swoistych wobec antygenu, myszy immunizowano owalbuminą
183 954 w mikrofluidyzowanej formulacji różnych kombinacji dwóch albo trzech składników przedstawionych w powyższej AF. Zastosowano poniższe kombinacje dwuskładnikowe; Skwalan/TWEEN w PBS, Skwalan/Pluronic w PBS albo Pluronic/TWEEN w PBS. Włączono dodatkowy zestaw grup w których myszy immunizowano ova w postaci układu jednoskładnikowego, tj. Skwalanu w PBS, Pluronic w PBS albo TWEEN w PBS. Powyższe trójskładnikowe formulacje dla antygenu zostały zmodyfikowane w taki sposób, że jednocześnie były wyłączane pojedyncze składniki, z wprowadzeniem na ich miejsce PBS.
Powyższe formulacje dla antygenu składały się z: 0,300 g monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu (Aldrich, WI), 1,875 g Pluronic L121 (BASF, NJ) i 7,5 g Squalane (Aldrich, WI) w PBS do objętości 50 ml.
Dwuskładnikowe formulacje składały się z: Squalane/TWEEN: 0,300 g monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, 7,5 g Squalane, w PBS do objętości 50 ml.
Pluronic/TWEEN: 1,875 g Pluronic L121, 0,300 g monooleinianu polioksyetylenosorbitanu, w PBS do objętości 50 ml.
Pluronic/Squalane: 1,875 g Pluronic L121, 7,5 g Squalane, w PBS do objętości 50 ml.
Próbki poddano obróbce w urządzeniu do mikrofluidyzacji, model 110T, Microfluidics Corp., butelkowano i przechowywano w 4°C do momentu zastosowania.
Owalbuminę (Sigma, MO) ważono i doprowadzono do stężenia 0,3 mg/ml w HBSS (Whittaker, wyżej). Roztwór wyjściowy 0,3 mg/ml połączono z dwuskładnikową formulacją w następujących ilościach: 5 części roztworu owalbuminy 0,3 mg/ml, 3,3 części formulacji dwuskładnikowej i 1,7 części HBSS.
Formulację zmieszano i trzymano na lodzie do momentu wstrzyknięcia. Wszystkie roztwory połączono tuż przed wstrzyknięciem.
Każda mysz otrzymała 200 μΐ jednej z formulacji zawierającej 30 μΐ OVA, we wstrzyknięciu w poduszeczki obu tylnych łap zaś resztę roztworu wstrzyknięto podskórnie w nasadę ogona. Myszy przed pobraniem śledzion pozostawiono na dwa do czterech tygodni.
Dwa tygodnie po immunizacji, wypreparowano splenocyty i pobudzano in vitro napromieniowanymi EG7-OVA. Po pięciu dniach hodowli obecność CTL swoistych wobec OVA mierzono wobec 51Cr-EGY-OVA albo 5ICr-EL4 w 4-godzinnym teście uwalniania 51Cr. Dane pokazane na Fig. 8-10 pokazują, że owalbumina w postaci mikrofluidyzowanego układu dwuskładnikowego może uczulać CTL swoiste wobec OVA in vivo.
Badano dalej względny wpływ pojedynczych składników na ich zdolność do pobudzania CTL, w połączeniu z antygenami białkowymi. Dla celów immunizacji, rozpuszczalny antygen mieszano z mikrofluidyzowanym wypełniaczem w celu uzyskania stabilnej homogennej emulsji o wielkości cząsteczek zawierającej się od 250 do 300 nm. W celu dalszego określenia składników formulacji Squalane-monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu -Pluronic (STP) odpowiedzialnych za indukcję CTL, immunizowano myszy ova w mieszaninie Squalan-monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu (ST), Pluronic-monooleinian polioksyetylenosorbitanu (T) albo Squalane-Pluronic (SP) i jako kontrola w Squalane (S), monooleinianie polioksyetyleno-sorbitanu (T) albo w Pluronic (P). Myszy immunizowano również ovaSAFm (zawierającą 70 μg MDP) albo ova-alum jako kontrola adiuwantu. Jako kontrolę pozytywną myszy immunizowano splenocytami o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną ova. Zastosowano również inne kombinacje i zastąpienia, zaś wyniki przedstawiono w tabeli 1.
W badaniach uczulania CTL myszy immunizowano jednokrotnie. Dwa tygodnie po immunizacji splenocyty zmieszano z napromieniowanymi EG7-ova (komórkami EL4 ekspresjonującymi ova) na pięć dni i badano wobec komórek 5lCr-EG7-ova albo 51Cr-EL4. Wyniki (fig. 11) pokazują że 30 μg ova w połączeniu z STP albo ST, uczula odpowiedź CTL w kontekście klasy I u myszy. Uczulenie CTL swoistych wobec ova przez ova w STP albo w ST wydaje się być lepsze niż wywołane przez splenocyty o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną. ova. Ova w PT albo w SP może wywołać odpowiedź CTL swoistą wobec ova u myszy, ale słabo i nie w powtarzalny sposób. W przeciwieństwie do SAFm, dodanie MDP do formulacji ST nie zakłóca odpowiedzi CTL swoistej wobec ova u myszy (tabela 2). Nie stwierdzono indukcji CTL swoistych wobec ova gdy myszy immunizowano ova zmieszaną z pojedynczymi składnikami S, T albo P, ani u myszy immunizowanych ova-SAFm albo ova16
183 954 alum. Myszy immunizowane 1 mg ova w (a) HBSS, (b) w SAFm albo (c) adsorbowane na alumie nie wywoływały CTL swoistych wobec ova.
Tabela 2
Indukcja odpowiedzi CTL swoistej wobec ova nie jest blokowana przez ST+MDP
% cytotoksyczności u myszy immunizowanych | ||||||
Stymulator | Cel | E:T | Ova-ST | Ova-ST | ova-ST- -MDP-300 pg/mysz | ova-ST- -MDP-72 pg/mysz |
EG7-ova | EG7-ova | 100:1 | 0 | 100 | 82 | 76 |
33:1 | 0 | 86 | 67 | 62 | ||
11:1 | 0 | 33 | 39 | 25 | ||
3:1 | 0 | 6 | 13 | 3 | ||
1:1 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
3:1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
* myszy immunizowano 30 pg ova w różnych formulacjach % cytotoksyczności obliczono przez odjęcie procentu niszczenia wobec linii komórkowych nie ekspresjonujących antygenu.
Przykład 7: Składniki niezbędne do wytwarzania przeciwciał swoistych wobec ova Myszy immunizowano trzykrotnie w odstępach 2-tygodniowych 30 pg ova w HBSS,
STP, ST, PT albo SP. Jako kontrolę pozytywną myszy immunizowano również ova-SAFm, ponieważ wiadomo, że SAFm wywołuje silną odpowiedź przeciwciał. Siedem dni po drugiej i trzeciej immunizacji, myszom pobierano krew i badano surowice pod kątem odpowiedzi przeciwciał swoistej wobec ova. Wyniki pokazano na tabeli 3. Wskazują one, że myszy immunizowane ova w STP, ST albo w SAFm wykazują podobne odpowiedzi przeciwko ova po dwóch immunizacjach.
Tabela 3.
Indukcja odpowiedzi przeciwciał przeciwko ova
30 pg formulacji ova/zwierzę | Liczba myszy odpowiadających/liczba myszy nastrzykniętych | ł/rozcieńczenie miano surowic |
HBSS | 0/3 | < 1/20, < 1/20, < 1/20 |
STP | 3/3 | <1/4860, >1/4860,<1/4860 |
ST | 3/3 | >1/4860, >1/4860,>1/4860 |
PT | NA | NA, NA, NA |
SP | NA | NA, NA, NA |
SAFm | 3/3 | 1/4860,1/4860,1/4860 |
* NA; dane nie dostępne
Przykład 8: Indukcja CTL swoistych wobec gp120 HIV gp120 IIIb HIV zastosowano jako drugi układ antygenowy w celu określenia indukcji CTL w STP, ST albo MP-T. Myszy immunizowano 1 pg gp120 IIIb w HBSS, STP, PT albo w ST. Jako kontrolę, myszy immunizowano 1 pg gp120 IIIb w SAFm albo cFa (kompletny adiuwant Freunda) albo w układzie adiuwantu RIBI zawierającym MPL (monofosforylo-lipid A) i TDM (dimykolan trehalozy). Trzy tygodnie po immunizacji, splenocyty wypreparowano i pobudzano in vitro traktowanymi mitomycyną transfektantami 15-12 albo peptydem 18IIIb. Po pięciu dniach hodowli, powstałe komórki efektorowe badano wobec komórek P815 zakażonych wirusem krowianki: gp160IIIb albo rodzicielskich komórek zakażonych wirusem krowianki, służących jako cel. Wyniki wskazują, że formulacja gp120-Squalanemonooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, nie zaś formulacja gp120-Squalane-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu albo gp120-HBSS wywołuje odpowiedź CTL swoistą wobec gp120 u myszy (tabela 4).
183 954
Tabela 4
% cytotoksyczności u myszy immunizowanych* | |||||
Stymulator | Cel | E:T | gp120-HBSS | gp120-ST | gp120-STP |
18IIIb/IL2 | vac:gp120 | 100:1 | 23 | 42 | NA*** |
33:1 | 23 | 38 | NA | ||
11:1 | 0 | 0 | NA | ||
3:1 | 0 | 35 | NA | ||
18IIIb/IL2 | 15-12 | 100:1 | 0 | 50 | 0 |
33:1 | 0 | 35 | 0 | ||
11:1 | 0 | 27 | 0 | ||
3:1 | 0 | 18 | 0 | ||
18IIIb/IL2 | 3T3+18IIIb | 100:1 | 0 | 59 | 13 |
33:1 | 0 | 59 | 2 | ||
11:1 | 0 | 57 | 0 | ||
3:1 | 0 | 29 | 0 | ||
15-12 | vc:gp120 | 100:1 | 35 | 84 | NA |
33:1 | 19 | 65 | NA | ||
11:1 | 12 | 37 | NA | ||
3:1 | 0 | 22 | NA | ||
1:1 | 0 | 0 | NA |
* myszy immunizowano 1 ąg gp120III w różnych formulacjach ** % cytotoksyczności obliczono przez odjęcie procentu niszczenia linii komórkowych nie ekspresjonujących antygenu *** NA; dane nie dostępne
Przykład 9: Indukcja odpowiedzi humoralnej swoistej wobec gp120 u myszy W celu indukcji odpowiedzi humoralnej swoistej wobec gp120 myszy immunizowano pg gp120IIIb trzykrotnie w odstępach dwutygodniowych. Zwierzętom pobierano krew i badano na obecność przeciwciał IgG wykrywających gp120IIIb w teście ELISA na podłożu stałym. Wyniki pokazują, że gp120-ST jest lepszym immunogenem niż gp120-HBSS, gp120SAFm (tabela 5) albo gp120-STP.
Tabela 5
Indukcja odpowiedzi przeciwciał przeciwko gp120
1 ąg formulacji gp120/zwierzę | Liczba myszy odpowiadających/liczba nastrzykniętych | 1/rozcieńczenie miano surowic |
HBSS | 0/3 | <1/20, <1/20, <1/20 |
STP | 1/3 | <1/20,>1/4860,<1/20 |
ST | 3/3 | > 1/4860,> 1/4860,>1/4860 |
PT | 3/3 | >1/4860,>1/4860,>1/4860 |
SP | 2/3 | <1/20, 1/540, 1/540 |
SAFm | 2/3 | 1/180,>1/4860, 1/540 |
Przykład 10: Odpowiedź przeciwciał swoista wobec gp120 u małp
Małpy (po dwie na grupę) immunizowano gp120-SAFm, gp120-SPT, gp120-ST albo gp120-HBSS. Jako kontrola, grupę małp immunizowano rekombinowanym wirusem krowianki zawierającym gp160IIIb. Małpy immunizowano w odstępach dwutygodniowych i pobierano im krew w dwa i trzy tygodnie po drugiej immunizacji. Surowice z przed immunizacji i po immunizacji od każdej z małp rozcieńczano seryjnie i badano pod kątem aktywności wobec gp120 w teście ELISA jak to opisano w Materiałach i Metodach. Dane (fig. 12) pokazują, że małpy immunizowane gp120-STP albo gp120-SAFm odpowiadały podobnie na immuniza18
183 954 cje. Jedna z małp immunizowana gp120-ST, odpowiedziała przeciwko gp120 podobnie jak grupa immunizowana gp120-SAFm albo gp120-SPT. Jedna z małp immunizowana gp120-ST nie odpowiedziała silnie na gp120 po dwóch immunizacjach.
Przykład 11: Aktywność in vivo AF w kombinacji z HPV 16 E7
1. Wytworzenie rekombinowanego białka HPV16 E7 do immunizacji
a) PCR i klonowanie genu E7
Gen HPV16 E7 klonowano z plazmidu uzyskanego od Dr Karen Vousden (Ludwig Institute) kodującego gen E7 uzyskany z linii komórkowej nowotworu CaSki. Region kodujący amplifikowano przez PCR stosując startery kodujące końce 5' i 3' genu flankowane przez miejsca klonowania BamHI i SalI. Produkt PCR E7 ligowano do wektora ekspresyjnego pGEX-4T-1 (Pharmacia Biotech) otrzymując plazmid ekspresyjny pGEX.E7. Szczep E. coli XL1-blue (Stratagene) transfekowano plazmidem ekspresyjnym pGEX.E7. Uzyskano sekwencję E7 z plazmidu z powstałych kolonii i była ona identyczna z sekwencją E7 uzyskaną z komórek CaSki.
b) Wytwarzanie i oczyszczanie E7 ekspresjonowanego w bakteriach
Plazmid ekspresyjny pGEX.E7 kodował białko fuzyjne transferazy S glutationu (GST) zbudowane z GST na końcu aminowym, miejsca cięcia trombiny i białka E7 na końcu karboksylowym. Białko E7 było wytwarzane i oczyszczane jak to opisano w literaturze dołączone przez producenta wektora pGEX-ET-1 (Pharmacia Biotech). Pokrótce, bakterie zawierające plazmid ekspresyjny pGEX.E7 indukowano do ekspresji białka fuzyjnego przez dodanie izopropylo-D-tiogalaktozydazy do pożywki hodowlanej. Komórki zebrano i poddano lizie przez delikatną sonikację. Lizat wprowadzono do kolumny Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Po związaniu się białka z matrycą, żywicę płukano w celu usunięcia białka związanego nieswoiści. Związane białko trawiono trombiną w celu uwolnienia białka E7 z fuzji z GST.
Preparat białka E7 analizowano przez SDS-PAGE i oznaczano jego stężenie analizą Bradforda (BioRad). Z litra hodowli bakterii uzyskano 9 mg rozpuszczalnego białka E7.
2. Tworzenie transfektanta E7 X21
Sekwencję kodującą białko HPV16 E7 (patrz wyżej) wprowadzono do eukariotycznego plazmidu ekspresyjnego INPEP4, stanowiącego własność IDEC. W tym wektorze, ekspresja E7 kontrolowana jest przez element transkrypcyjny promotora/wzmacniacza wirusa cytomegalii. Oprócz tego, pierwsze trzy nukleotydy sekwencji kodującej E7 usunięto i zastąpiono sekwencją liderową łańcucha lekkiego immunoglobuliny, położona bezpośrednio powyżej i w jednej ramce z regionem kodującym E7. Po transfekcji do mysiej linii komórkowej X21 badano pojedyncze klony oporne na G418 analizą metodą northern blot, w kierunku obecności sygnału E7. Każdy z klonów wykazywał wykrywalny sygnał E7. Przeprowadzono analizę metodą western blot lizatów komórkowych z dwóch spośród tych klonów, 4E7 i 1C7 (odpowiednio, HOPE1 i HOPE2) i stwierdzono produkcję białka E7.
3. Aktywność in vivo immunizacji rozpuszczalnym antygenem E7/AF
Do doświadczeń użyto samic myszy podłoża C3H (H2k/f, Harlan Spraque Dawley). Zwierzęta trzymano według wytycznych „Guide fot the Care and Use of Laboratory Animals (publikacja DHHS nr NIH 86-23, Bethesda, MD:NIH, 1985) z pełnym dostępem do wody i pożywienia. Nowotworową linię komórkową utrzymywano w kolejnych pasażach in vitro.
Linia komórkowa utrzymywała ekspresję cytoplazmatyczną antygenu E7, co wykryto analizą western blot, po kolejnych pasażach in vitro. Wzrost nowotworu u syngenicznych myszy C3H zapoczątkowano przez wstrzyknięcie podskórne 150000 komórek pasażowanych in vitro.
Guzy mierzono w 2 kierunkach w odstępach dwutygodniowych. Objętość guzów (V) obliczano w oparciu o poniższy wzór:
V (mmj=(LxW) podzielone przez 2 gdzie:
L= najdłuższy wymiar podłużny w mm
W= wymiar w osi poprzecznej w mm
183 954
Dane na tabeli 6 przedstawiono jako liczba myszy z guzem (liczba zwierząt z guzem w stosunku do zwierząt nastrzykniętych). Dane na fig. 13 i 14 są przedstawione jako mediana wielkości guza (mm3) każdej z grup leczonych albo kontrolnych. Każdą z grup leczonych porównywano z kontrolą nie otrzymującą żadnego leczenia. Leczenie rozpoczęto 10 dni powszczepieniu komórek HOPE2, kiedy większość z guzów była wyczuwalna palpacyjnie (około 50-75 mm3). Leczenie zapoczątkowano przez immunizację myszy rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie AF albo alumie (podskórnie w objętości całkowitej 0,2 ml). Bezpośrednio przed immunizacją AF zmieszano przez 60 sekund z białkiem E7 w buforowanym roztworze soli Hank'a (HBSS) tak, że każda z myszy otrzymała 30 pg albo 90 pg białka E7 w 0,2 ml. Alum (Pierce Chemical Co.) zmieszano z białkiem E7, według instrukcji producenta, tak, że każde ze zwierząt otrzymało 90 pg białka E7 w 0,2 ml na mysz. Zwierzęta w drugiej grupie leczonej otrzymały drugą immunizację 9 dni później (19 dni po wszczepieniu komórek nowotworowych). Immunizację przypominającą przygotowano bezpośrednio przed szczepieniem, jak to opisano wyżej.
W tym przykładzie (tabela 6: Xp #233), 41 dni po wszczepieniu komórek nowotworowych tylko 4/8 i 5/8 myszy otrzymujących pojedyncze wstrzyknięcie rozpuszczalnego E7 w AF (odpowiednio, 30 pg albo 90 pg) wykazywało mierzalny guz. W przeciwieństwie, wszystkie spośród myszy immunizowanych białkiem E7 w alumie (8/8) miało aktywnie rosnące nowotwory. Oprócz tego, jak to pokazano na fig. 13, znaczące zahamowanie wzrostu guza obserwowano wyłącznie w grupach leczonych immunizowanych białkiem E7 w AF w porównaniu z kontrolą (nie leczoną) albo grupami otrzymującymi leczenie w alumie. Zahamowanie wzrostu guza (fig. 13) albo zwiększone tempo regresji (tabela 6) nie były obserwowane u myszy, otrzymały pojedyncze wstrzyknięcie E7 w alumie.
Podobne wyniki obserwowano w grupach otrzymujących dwie immunizację w dniach 10 i 19 po podaniu nowotworu (tabela 6 i fig. 14), jakkolwiek pewne opóźnienie wzrostu guza obserwowano u myszy otrzymujących dwa wstrzyknięcia AF w alumie.
Wyniki wskazują, że znaczną aktywność przeciwnowotworową, mierzoną zmniejszoną liczbą myszy z guzem oraz zahamowaniem wzrostu nowotworu, obserwowano po immunizacji rozpuszczalnym E7 w AF. W przeciwieństwie, wszystkie zwierzęta immunizowane pojedynczą albo podwójną immunizacją rozpuszczalnego białka E7 w alumie miały rosnący nowotwór. Podsumowując, immunizacja rozpuszczalnym białkiem E7 w AF powodowała znaczące zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych czego nie obserwowano stosując immunizację rozpuszczalnym E7 w alumie.
Tabela 6.
Aktywność przeciwnowotworowa immunizacji rozpuszczalnym E7 w adiuwancie
Dośw. Nr | Leczenie | Dawka (pg/mysz) | Zwierzęta z guzem*. Dzień 41 |
223 | Kontrola | - | 7/8 |
223 | E7 w AF | 30 pg x1 | 4/8 |
223 | E7 w AF | 90 pg x1 | 5/8 |
223 | E7w AF | 90 pg x1 | 8/8 |
223 | E7 w AF | 30 pg x2c | 3/8 |
223 | E7 w AF | 90 pg x2 | 1/4 |
223 | E7 w alumie | 90 pg x2 | 8/8 |
a. Liczba myszy z guzem/całkowita liczba nastrzykniętych
b. Wszystkie immunizacje rozpoczęto dnia 10 po wszczepieniu
Inne wykonania ujęto w poniższych zastrzeżeniach.
183 954 % Cytotoxicity % Cytotoksyczności
fig. 2g
183 954
FIG. 4α
Ονα in HBSS Immunized a _ tmniunizowane ova w HBSS % Cytotoxicity % Cytotoksyczności
100
33:! 11:1 3:1 1:1
FIG. 4c
FIG. 4b
o
1:1
183 954
Limfocyty T CD8+ są komórkami efektorowymi
CD8 + T cells ore the Effector cells
Effector to target ratio _ Stosunek efektorów do celów fig. 6
183 954
Idox nasila indukcję CTL wywołaną gp12O Idox potentiates gp120 induced CTL induction
Effector ; Target EfektorzCel
183 954
Wpływ skwalanu/TUEEN na uczulanie CTL Effect of Squalone/Tween on CTL Priming % Cytotoxicity * Cytotoksyczności
Wpływ skwalanu/pluronic na uczulanie CTL
Effector : Target Efektor:Cel
183 954
Porównanie 30 ug ova w znanych adiuwantach 2- albo 3-składnikowych
Comparison of 30 ug 0VA in Custom 3 or 2 Component Adjuvants
FIG.
Efektor:Cel
Indukcja przeciwciał przeciwko gp12CIIIb u małp
Induction of anti-gp120IUb antibodies in monkeys
1/sera dilution
1/rozcieńczenie surowicy
FIG. 12
-B—· 854/SPT/2d 220/SPT/2d <— 207/ST/2d Θ— 222/ST/2d A— 720/SAFm/2d A— 722/SAFm/2d -X—- 225/HBSS/2d H- 208/HBSS/2d
183 954
Aktywność przeciwnowotworowa komórek H0PE2 popojedyncjej immunizacji (Dzień 10) rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie
Antitumor activity of H0PE2 Cells after a Single Immunization (Day 10) of Soluble E7 Protein in Adjuvont
Tumor Size (mm3) Wielkość guza
3000 —i-j- | |||
- 30/ΑΡ/1Χ | |||
— | - 90/AF/1X | ||
—B— | - 9O/ALUM/1X | ||
Δ | Control | ||
2000 - | Kontrola J | ||
1000 - | |||
o - | —i— | ι»ηΑί8ι |
15
FIG. I3
25 30 35 40
Days Post Implant
Dni dc wszczepieniu
183 954
Aktywność przeciwnowotworowa komórek H0PE2 po dwukrotnej immunizacji (Dzień 10, 1S) rozpuszczalnym białkiem E7 w adiu νθηο iθ
Antitumor Actiwity of H0PE2 Cells ofter o Two Immunizotions (Day 10, 19) of Soluble E7 Protein in Adjuvant
Tumor Size (mm3) Wielkość guza
Doys Post Implant
Dni po wszczepieniu fig. 14
183 954 fig. ia % Cytotoxicity % cytotoksyczności
100
33:1 11:1 3:1 1:1 % Cytotoxicity % Cytotoksyczności
10080fig. ib fig. ic
Ονα in HBSS immunized Immunizowane ova w HBSS
EL4 and EG7—Ονα
0va cytoplasmically loaded wypełnione cytoplazmatycznie ova
EG7-0va
ET
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (20)
- Zastrzeżenia patentowe1. Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzęciu wybranemu z grupy obejmującej człowieka, zwierzęta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, że obejmuje antygen wybrany z grupy obejmującej antygeny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowaną formulacją dla antygenu obejmującą:a) detergent stabilizujący;b) czynnik tworzący micelle; ic) ulegający rozkładowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest zasadniczo wolna od jakiegokolwiek immunostymulującego czynnika peptydowego.
- 2. Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzęciu wybranemu z grupy obejmującej człowieka, zwierzęta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, że obejmuje antygen wybrany z grupy obejmującej antygeny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowaną formulacją dla antygenu obejmującą:a) detergent stabilizujący;b) czynnik tworzący micelle; ic) ulegający rozkładowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest pozbawiona jakiegokolwiek immunostymulującego czynnika peptydowego.
- 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że antygen jest z grupy obejmującej antygeny HIV: gp160, gag, pol, Nef, Tat i Rev; antygeny malarii: białka CS i białka 2 powierzchni sporozoitów; antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B: Pre-S1, Pre-S2, HbcAg i HbeAg; antygeny wirusa grypy: HA, NP i NA; antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu A; antygeny wirusów herpes: EBV gp340, EBV gp85, HSV gD, HSV gH, wczesnego produktu białkowego HSV, gB wirusa cytomegalii, gH wirusa cytomegalii i białka IE gp72; antygeny wirusa oddechowego: białka F, G i N oraz antygeny nowotworowe: CEA, mucyny związanej z rakiem, antygeny P21, P53, antygeny czerniaka MPG, p97 i produktu onkogenu nowotworowego Neu, rakowego produktu genu p53 i zmutowanego białka Ras p21.
- 4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że formulacja dla antygenu jest nietoksyczna dla ludzi i zwierząt domowych albo hodowlanych.
- 5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że detergent stabilizujący wybrany jest z grupy obejmującej monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu, monostearynian polioksyetyleno-sorbitanu, Zwittergent 3-12, Teepol HB7 i trioleinian sorbitanu.
- 6. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera detergent w ilości w zakresie od ok. 0,05% do 0,5%.
- 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że ilość detergentu wynosi ok. 0,2%.
- 8. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera czynnik tworzący micelle charakteryzujący się równowagą hydrofilowo-lipofilową w zakresie od 0 do 2.
- 9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że czynnik tworzący micelle wybrany jest z grupy obejmującej polioksamer 401, Pluronic L62LF, Pluronic L101, Pluronic183 954L64, PEG 1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic 701, Tetronic 901, Tetronic 1301 i Tetronic 130R1.
- 10. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera czynnik tworzący micelle w ilości od ok. 0,5% do ok. 10%.
- 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że ilość czynnika tworzącego micelle wynosi od ok. 1,:25% do ok. 5%.
- 12. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że olej wykazuje temperaturę topnienia niższą niż 60°C.
- 13. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że olej jest wybrany z grupy obejmującej skwalen, skwalan, eikozan, tetratetrakontan, pristan, glicerynę i oleje roślinne.
- 14. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera olej w ilości od ok. 1%dook. 10%.
- 15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że ilość oleju wynosi od ok. 1,5% do ok. 5%.
- 16. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera mniej niż 20 pg dipeptydu muramylowego na dawkę.
- 17. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że nie zawiera w ogóle dipeptydu muramylowego.
- 18. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jako detergent zawiera monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, zaś czynnikiem tworzącym micelle jest Polioksamer 401.
- 19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że jako olej zawiera skwalan.
- 20. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że detergent wybrany jest z grupy obejmującej monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu, monostearynian polioksyetyleno-sorbitanu; olej wybrany jest z grupy obejmującej skwalan, eikozan i pristan, zaś czynnik tworzący micelle wybrany jest z grupy obejmującej Pluronic L62LF i Polioksamer 401.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/351,001 US5709860A (en) | 1991-07-25 | 1994-12-07 | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses |
PCT/US1995/015433 WO1996017863A1 (en) | 1994-12-07 | 1995-11-29 | Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL320612A1 PL320612A1 (en) | 1997-10-13 |
PL183954B1 true PL183954B1 (pl) | 2002-08-30 |
Family
ID=23379172
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL95320612A PL183954B1 (pl) | 1994-12-07 | 1995-11-29 | Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5709860A (pl) |
EP (1) | EP0801656A4 (pl) |
JP (1) | JPH10510264A (pl) |
CN (2) | CN1109046C (pl) |
AP (1) | AP661A (pl) |
AR (1) | AR002255A1 (pl) |
AU (1) | AU699044B2 (pl) |
BG (1) | BG63262B1 (pl) |
BR (1) | BR9509872A (pl) |
CA (1) | CA2204738A1 (pl) |
CZ (1) | CZ293439B6 (pl) |
EE (1) | EE03569B1 (pl) |
FI (1) | FI972431A0 (pl) |
GE (1) | GEP20012556B (pl) |
HK (1) | HK1008226A1 (pl) |
HU (1) | HUP9800946A2 (pl) |
IS (1) | IS4479A (pl) |
LT (1) | LT4308B (pl) |
LV (1) | LV11866B (pl) |
MD (1) | MD1586G2 (pl) |
MX (1) | MX9704097A (pl) |
NO (1) | NO972521L (pl) |
NZ (1) | NZ298582A (pl) |
OA (1) | OA10736A (pl) |
PL (1) | PL183954B1 (pl) |
RO (1) | RO120065B1 (pl) |
RU (1) | RU2201253C2 (pl) |
SI (1) | SI9520148A (pl) |
SK (1) | SK71397A3 (pl) |
TJ (1) | TJ384B (pl) |
TW (1) | TW487575B (pl) |
UA (1) | UA49814C2 (pl) |
WO (1) | WO1996017863A1 (pl) |
Families Citing this family (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6197311B1 (en) * | 1991-07-25 | 2001-03-06 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses |
EP0671926B1 (en) * | 1992-08-11 | 2002-11-13 | President And Fellows Of Harvard College | Immunomodulatory peptides |
ZA988461B (en) * | 1997-09-18 | 1999-03-30 | Idec Pharma Corp | Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis |
US6013258A (en) * | 1997-10-09 | 2000-01-11 | Zycos Inc. | Immunogenic peptides from the HPV E7 protein |
US6183746B1 (en) * | 1997-10-09 | 2001-02-06 | Zycos Inc. | Immunogenic peptides from the HPV E7 protein |
FR2771640B1 (fr) * | 1997-12-03 | 2000-02-11 | Inst Nat Sante Rech Med | Micelles mixtes de lipopeptides pour l'induction d'une reponse immunitaire et leurs utilisations a des fins therapeutiques |
WO1999053947A1 (fr) * | 1998-04-20 | 1999-10-28 | Shionogi & Co., Ltd. | PROMOTEURS DE LA MIGRATION DE Th2 CONTENANT DES EMULSIONS EAU-DANS-HUILE |
US20010033839A1 (en) * | 1999-10-04 | 2001-10-25 | Emilio Barbera-Guillem | Vaccine and immunotherapy for solid nonlymphoid tumor and related immune dysregulation |
WO2000049655A1 (en) | 1999-02-18 | 2000-08-24 | Seiko Epson Corporation | Semiconductor device, circuit board, method of manufacturing circuit board, and electronic device |
ES2311451T3 (es) * | 1999-03-24 | 2009-02-16 | The Secretary Of State For Defence | Carbohidratos policationicos como immuestimulantes en vacunas. |
US20050100928A1 (en) * | 1999-09-16 | 2005-05-12 | Zycos Inc., A Delaware Corporation | Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides |
FR2805163A1 (fr) * | 2000-02-21 | 2001-08-24 | Pf Medicament | Utilisation d'un detergent de type zwittergent pour la preparation d'une composition pharmaceutique destinee a etre administree par voie nasale |
EP1315672A4 (en) * | 2000-06-22 | 2006-04-26 | Rxkinetix Inc | ADMINISTRATIVE COMPOSITION COMPOSITION AND METHOD FOR THE ADMINISTRATION OF ANTIGENES AND OTHER ACTIVE SUBSTANCES |
FR2814957B1 (fr) * | 2000-10-06 | 2002-12-20 | Aventis Pasteur | Composition vaccinale et procede de stabilisation |
WO2003104429A2 (en) * | 2002-06-10 | 2003-12-18 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Genes overexpressed by ovarian cancer and their use in developing novel therapeutics |
AU2003254792A1 (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-23 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Bacterial cell wall skeleton component preparaion |
US7741437B2 (en) | 2002-09-19 | 2010-06-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | P. ariasi polypeptides, p. perniciosus polypeptides and methods of use |
JP2006503914A (ja) * | 2002-10-21 | 2006-02-02 | エムジーアイ ファーマ バイオロジックス インコーポレイテッド | ヒトパピローマウイルス媒介性疾患を治療するための組成物および方法 |
AU2003287267A1 (en) | 2002-10-29 | 2004-05-25 | Centro De Pesquisas Goncalo Moniz | Lutzomyia longipalpis polypeptides and methods of use |
EP1741438A4 (en) * | 2004-04-22 | 2009-08-26 | Dainippon Sumitomo Pharma Co | PHARMACEUTICAL PREPARATION CONTAINING SKELETAL COMPONENT OF BACTERIAL CELL WALL |
PL1942932T3 (pl) | 2005-08-08 | 2013-11-29 | Univ Oregon Health & Science | Inaktywacja patogenów nadtlenkiem wodoru do wytwarzania szczepionek |
US20100130425A1 (en) | 2005-09-09 | 2010-05-27 | Oregon Health & Science University | Use of toll-like receptor ligands in treating excitotoxic injury, ischemia and/or hypoxia |
US7732166B2 (en) * | 2005-11-15 | 2010-06-08 | Oncohealth Corporation | Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer |
US7842299B2 (en) | 2006-03-14 | 2010-11-30 | Oregon Health & Science University | Methods for producing an immune response to tuberculosis |
MX2008013363A (es) | 2006-04-20 | 2009-03-26 | Jackson H M Found Military Med | Metodos y composiciones basados en la proteina tipo 1 de la toxina shiga. |
US8278056B2 (en) * | 2008-06-13 | 2012-10-02 | Oncohealth Corp. | Detection of early stages and late stages HPV infection |
US8968995B2 (en) * | 2008-11-12 | 2015-03-03 | Oncohealth Corp. | Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers |
AU2008221383B2 (en) | 2007-02-28 | 2012-09-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Brachyury polypeptides and methods for use |
WO2010017209A2 (en) | 2008-08-04 | 2010-02-11 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Membrane proximal region of hiv gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine |
US8664183B2 (en) | 2009-02-27 | 2014-03-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | SPANX-B polypeptides and their use |
EP2427763A4 (en) | 2009-05-07 | 2013-08-21 | Oncohealth Corp | IDENTIFICATION OF HIGH GRADE OR CIN2 FOR DETECTION, MONITORING AND DIAGNOSIS, AT EARLY STAGES AND ADVANCED STAGES, OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) AND HPV ASSOCIATED CANCERS |
CN102782138A (zh) | 2009-10-07 | 2012-11-14 | Uvic工业合伙公司 | 包含热敏性转基因的疫苗 |
US9181306B2 (en) | 2009-10-16 | 2015-11-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine |
WO2011063263A2 (en) | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Oregon Health & Science University | Methods for producing an immune response to tuberculosis |
WO2011084598A1 (en) | 2010-01-08 | 2011-07-14 | Oncohealth Corporation | High throughput cell-based hpv immunoassays for diagnosis and screening of hpv-associated cancers |
WO2011112599A2 (en) | 2010-03-12 | 2011-09-15 | The United States Of America, As Represented By The Secretary. Department Of Health & Human Services | Immunogenic pote peptides and methods of use |
CA2793959C (en) | 2010-03-25 | 2019-06-04 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
CN102125698A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-07-20 | 昆明理工大学 | 具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型的建立方法 |
CA2832109C (en) | 2011-06-10 | 2021-07-06 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
AU2012284122B2 (en) | 2011-07-18 | 2017-06-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for inhibiting polyomavirus-associated pathology |
AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
EP2586461A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Viral particles derived from an enveloped virus |
WO2013152352A1 (en) | 2012-04-06 | 2013-10-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Live, attenuated rubella vector to express vaccine antigens |
PT2850431T (pt) | 2012-05-16 | 2018-07-23 | Immune Design Corp | Vacinas para hsv-2 |
EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
EP2895191B1 (en) | 2012-09-14 | 2019-06-05 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Brachyury protein, adenoviral vectors encoding brachyury protein, and their use |
AU2013331328B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-05-31 | Bavarian Nordic A/S | Methods and compositions for the treatment of cancer |
US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
EP2873423B1 (en) | 2013-10-07 | 2017-05-31 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
AU2014361788B2 (en) | 2013-12-13 | 2019-10-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Multi-epitope TARP peptide vaccine and uses thereof |
US9931393B2 (en) | 2013-12-20 | 2018-04-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Immunogenic JC polyomavirus compositions and methods of use |
US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
US9931394B2 (en) | 2015-03-23 | 2018-04-03 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
JP7048482B2 (ja) | 2015-08-03 | 2022-04-05 | アメリカ合衆国 | Brachyury欠失変異体、Brachyury欠失変異体をコードする非酵母ベクター、及びそれらの使用 |
EP3922716A1 (en) * | 2016-03-17 | 2021-12-15 | Berkeley Lights, Inc. | Selection and cloning of t lymphocytes in a microfluidic device |
CA3022603A1 (en) | 2016-05-10 | 2017-11-16 | Najit Technologies, Inc. | Inactivating pathogens and producing highly immunogenic inactivated vaccines using a dual oxidation process |
EP3703745B1 (en) | 2017-11-04 | 2024-04-10 | Nevada Research & Innovation Corporation | Immunogenic conjugates and methods of use thereof |
US20220031830A1 (en) | 2018-12-04 | 2022-02-03 | The Rockefeller University | Hiv vaccine immunogens |
TW202214294A (zh) | 2020-09-30 | 2022-04-16 | 美商碩騰服務公司 | 具有hyaC及nanP缺失之新穎多殺性巴斯德氏菌株及疫苗 |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4117113A (en) * | 1974-06-25 | 1978-09-26 | National Research Development Corporation | Immunological preparations |
GB1502774A (en) * | 1974-06-25 | 1978-03-01 | Nat Res Dev | Immunological preparations |
US4772466A (en) * | 1983-08-22 | 1988-09-20 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Vaccines comprising polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants |
US4770874A (en) * | 1983-08-22 | 1988-09-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants |
JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
US5114708A (en) * | 1985-06-18 | 1992-05-19 | Emory University | Method for stimulating growth in animals |
US5234683A (en) * | 1985-06-18 | 1993-08-10 | Emory University | Method of stimulating the immune system |
US4877611A (en) * | 1986-04-15 | 1989-10-31 | Ribi Immunochem Research Inc. | Vaccine containing tumor antigens and adjuvants |
DE3751772T2 (de) * | 1986-10-20 | 1996-12-05 | Chiron Corp | Impfstoff zur behandlung von hsv |
US4778784A (en) * | 1987-01-07 | 1988-10-18 | Baylor College Of Medicine | Cyclic peptide and method of use for inducing an immunological response to hepatitis B virus |
US4963354A (en) * | 1987-01-21 | 1990-10-16 | Genentech, Inc. | Use of tumor necrosis factor (TNF) as an adjuvant |
AU626271B2 (en) * | 1987-11-03 | 1992-07-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Vaccine adjuvant |
IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
JPH0832638B2 (ja) * | 1989-05-25 | 1996-03-29 | カイロン コーポレイション | サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤 |
DE4018442A1 (de) * | 1990-06-08 | 1991-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante dna und verfahren zur herstellung chimaerer antikoerper |
AU1025692A (en) * | 1991-02-06 | 1992-08-13 | Ciba-Geigy Ag | Novel chimeric antiidiotypic monoclonal antibodies |
US5585103A (en) * | 1991-07-25 | 1996-12-17 | Idec Pharmaceutical Corporation | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses |
DE4443414A1 (de) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Basf Ag | Benzopyranfarbstoffe und deren Zwischenprodukte |
US7735069B2 (en) | 2006-02-09 | 2010-06-08 | International Business Machines Corporation | Creating software debug breakpoints activated by specific call patterns |
US8919787B1 (en) | 2010-10-08 | 2014-12-30 | James Timothy Wilcher | Reciprocating tool attachment assembly and methods |
-
1994
- 1994-12-07 US US08/351,001 patent/US5709860A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/472,311 patent/US5695770A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-29 NZ NZ298582A patent/NZ298582A/en unknown
- 1995-11-29 CN CN95197570A patent/CN1109046C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-29 CA CA 2204738 patent/CA2204738A1/en not_active Abandoned
- 1995-11-29 GE GEAP19953809A patent/GEP20012556B/en unknown
- 1995-11-29 PL PL95320612A patent/PL183954B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-11-29 EP EP95942921A patent/EP0801656A4/en not_active Withdrawn
- 1995-11-29 CN CNA031088449A patent/CN1515319A/zh active Pending
- 1995-11-29 HU HU9800946A patent/HUP9800946A2/hu unknown
- 1995-11-29 RO RO97-01046A patent/RO120065B1/ro unknown
- 1995-11-29 AP APAP/P/1997/001056A patent/AP661A/en active
- 1995-11-29 TJ TJ97000475A patent/TJ384B/xx unknown
- 1995-11-29 AU AU44104/96A patent/AU699044B2/en not_active Ceased
- 1995-11-29 BR BR9509872A patent/BR9509872A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-11-29 WO PCT/US1995/015433 patent/WO1996017863A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-11-29 RU RU97111160A patent/RU2201253C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-11-29 JP JP51764196A patent/JPH10510264A/ja not_active Ceased
- 1995-11-29 EE EE9700100A patent/EE03569B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-11-29 CZ CZ19971741A patent/CZ293439B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-11-29 MD MD97-0199A patent/MD1586G2/ro not_active IP Right Cessation
- 1995-11-29 SI SI9520148A patent/SI9520148A/sl unknown
- 1995-11-29 SK SK713-97A patent/SK71397A3/sk unknown
- 1995-11-29 UA UA97063426A patent/UA49814C2/uk unknown
- 1995-12-06 AR AR10045895A patent/AR002255A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-07 TW TW84113021A patent/TW487575B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-07 IS IS4479A patent/IS4479A/is unknown
- 1997-06-03 NO NO972521A patent/NO972521L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-06-03 MX MX9704097A patent/MX9704097A/es not_active IP Right Cessation
- 1997-06-06 FI FI972431A patent/FI972431A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-06-08 OA OA70021A patent/OA10736A/en unknown
- 1997-06-23 BG BG101656A patent/BG63262B1/bg unknown
- 1997-07-04 LT LT97-115A patent/LT4308B/lt not_active IP Right Cessation
- 1997-07-07 LV LVP-97-132A patent/LV11866B/en unknown
-
1998
- 1998-07-17 HK HK98109248A patent/HK1008226A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL183954B1 (pl) | Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi | |
EP0596032B1 (en) | Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses | |
US20060057162A1 (en) | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses | |
KR100478617B1 (ko) | 세포독성t-림프구반응을유도하는방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20081129 |