RO120065B1

RO120065B1 - Compoziţie cu antigen de papilloma şi utilizarea acesteia

Info

Publication number: RO120065B1
Application number: RO97-01046A
Authority: RO
Inventors: Syamal Raychaudhuri; William H. Rastetter
Original assignee: Idec Pharmaceuticals Corporation
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 2005-08-30
Also published as: WO1996017863A1; EE03569B1; AU699044B2; CA2204738A1; EE9700100A; BR9509872A; LV11866B; CN1175260A; LV11866A; AP9701056A0; JPH10510264A; CN1109046C; LT97115A; OA10736A; LT4308B; BG101656A; MD1586F2; NZ298582A; AU4410496A; PL320612A1

Abstract

Invenţia se referă la o compoziţie pentru inducerea unui răspuns citotoxic, care cuprinde un antigen de papillomavirus, în amestec cu o formulare microfluidizantă de antigen, care cuprinde un detergent de stabilizare, un agent de formare a miceliilor şi un ulei biodegradabil şi biocompatibil, compoziţie utilizată în tratamentul cancerului cervical.ŕ

Description

Prezenta invenție se referă la o compoziție de antigen de Papillomavirus, pentru inducerea unui răspuns citotoxic mediat de celula T, și la utilizarea acestei compoziții pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul tumorilor la oameni și animale domestice.

Este cunoscut faptul că limfocitele T citotoxice (CTL) sunt considerate a fi cei mai importanți agenți ai mecanismului de apărare ca răspuns la o diversitate de infecții virale și creșteri neoplazice sau canceroase. Aceste celule elimină celule infectate sau transformate prin recunoașterea fragmentelor antigen în asociere cu diverse molecule (denumite molecule MHC de clasa I), din celule infectate sau transformate. Se pot induce experimental CTL prin încărcarea citoplasmică în celule specifice, a anumitor antigene solubile. în general, imunizarea numai cu antigen solubil este insuficientă pentru inducerea limfocitului T citotoxic.

O metodă prin care poate fi indus un răspuns CTL implică folosirea tehnicilor de inginerie recombinantă pentru încorporarea componentelor critice ale respectivului antigen în genomul unui agent infecțios benign. Scopul unei astfel de strategii este să se genereze răspunsuri citotoxice T-limfocitare, antigen specific la epitopul dorit prin supunerea gazdei la o infecție slabă, care se poate autolimita. Au fost descriși vectori himerici care folosesc virusuri Vaccinia, polio, adeno- și retrovirusuri, precum și bacterii ca Listeria și BCG. De exemplu, Takahashi și colab. 85 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 3105, 1988 descrie utilizarea unui virus recombinant Vaccinia care exprimă gena de înveliș gpl60 din HIV ca un intermediar puternic pentru inducerea limfocitelor T citotoxice.

O a doua metodă, prin care poate fi indus răspuns mediat de celulă, implică folosirea de adjuvanți. Cu toate că domeniul pare a fi saturat de discuții privind utilizarea adjuvanților, este neclar dacă imunitatea este mediată de celulă și dacă asemenea imunitate mediată de celulă a inclus un răspuns citotoxic T-limfocitar. Totuși, cele care urmează sunt reprezentative pentru diverse publicații din această zonă.

Stover și colab., 351 Nature 456,1991 (neadmis ca fiind stadiul anterior al tehnicii pentru prezenta cerere) descrie un răspuns CTL la β-galactozidază, folosind BCG recombinant care conține o genă β-galactozidază. Nu s-a detectat nici un astfel de răspuns folosind adjuvantul Freund incomplet și β-galactozidază.

Mitchell și colab., 8 J. Clinical Oncology, 856,1990 (care nu este considerat ca stadiul anterioral tehnicii, pentru prezenta invenție) descrie tratamentul paciențilorcare prezintă melanom metastatic cu un adjuvant denumit DETOX și cu lizate melanomice alogeneice administrate de 5 ori, pe durata unei perioade de 6 săptămâni. La o mică parte din pacienți, s-a observat o creștere în celule T citolitice. Autorii descriu necesitatea de a spori nivelul producției de limfocite T citotoxice și sugerează o terapie combinată de adjuvant cu interleukină2, precum și un pretratament cu ciclofosfamidă, pentru reducerea nivelului de celule supresoare T specifice tumorii, care pot exista. DETOX include endotoxina detoxifiată (lipida A monofosforil) de la Salmonella minnesota, structuri de perete celular de la Mycobacterium phlei, ulei de squlenă și emulgator.

Allison și Gregoriadis, 111mmunology Today, 427,1990 (care nu este admis ca fiind stadiul anterioral tehnicii pentru prezenta cerere) precizează că, doaradjuvantul autorizat pentru utilizare'¹ în vaccinuri umane, reprezentat de sărurile de aluminiu (alum), nu provoacă imunitate consistentă mediată celular. Allison și Gregoriadis afirmă că există, prin urmare, o nevoie de a dezvolta adjuvanți cu eficiența adjuvantului complet Freund, dar fără efectele sale secundare cum ar fi granuloamele”. Ei continuă prin a afirma că există trei strategii posibile, de exemplu, utilizarea lipozomilor; utilizarea adjuvanților, denumite complexe imunostimulatoare (ISCOM, care includ saponina sau Quil A (un triterpenoid cu două catene carbohidrat, colesterol și fosfatidil colină), care sunt autorizate pentru utilizare într-un vaccin gripal

RO 120065 Β1 pentru cai (Morein și colab., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); 1 și utilizarea unei emulsii (SAF) de Squalen sau Squalan (cu sau fără un agent pluronic) și muramil dipeptidă (MDP). SAF este numit a produce o imunitate mediată celular la șoarece, 3 deși s-a crezut mult timp că subunitatea antigenelor nu poate provoca răspunsuri citotoxice celulă T (CTL). 5

Takahashi și colab., 344, Nature, 873,1990, descriu inducerea celulelor II de helper restricționat și limfocite T citotoxice, prin folosirea de ISCOM cu o singură imunizare subcuta- 7 nată la șoareci. Ei afirmă că adjuvantul Freund, adjuvantul incomplet Freund și fosfatul tamponat salin nu induc activitate citotoxică T-limfocitară împotriva țintelor de interes pentru ei. 9 Ei afirmă că spre deosebire de rezultatele cu alte forme de antigen de proteină solubilă exogenă, ei au dovedit că este posibil să se inițieze CTL restricționate CD⁺ CD4, antigene spe- 11 cifice din clasa I MHC, prin imunizare cu proteină exogenă intactă, folosind ISCOM. De asemenea, ei afirmă că experimentele descrise sugerează că poate fi posibil să se provoace 13 CTL umane, prin folosirea de ISCOM-uri care conțin proteine HIV și că vaccinuri bazate pe ISCOM pot atinge un scop dorit de mult, și anume, de inducere atât a CTL, cât și a anticor- 15 pilor printr-o proteină purificată.

Byars și Allison, 5 Vaccines, 223, 1987 descriu utilizarea de SAF-1, care include 17 TWEEN 80, PLURONIC L121 și Squalen sau Squalan, cu sau fără muramil dipeptidă și sugerează că datele lor arată că formularea cu muramil dipeptidă va fi utilă pentru vaccinuri 19 umane și veterinare. Rapelurile de adjuvant s-au furnizat fără muramil dipeptidă. Muramil dipeptidă este responsabilă de creșterea semnificativă a producerii de anticorpi față de utili- 21 zarea adjuvantului fără muramil dipeptidă. Imunitatea mediată celular s-a măsurat ca hipersensibilitate de tip întârziat, prin teste ale pielii, pentru a determina inducerea celulei T hei- 23 per. O astfel de sensibilitate a fost mai puternică și mai susținută când s-a furnizat muramil dipeptidă în adjuvant. Adjuvanți similari sunt descriși de către Allison și colab., US 4770874 25 (unde se afirmă că o combinație de muramil dipeptidă și poliol pluronic este esențială pentru a provoca un răspuns puternic tumoral și mediat celular împotriva albuminei de ou); Allison 27 și colab., US 4772466; Murphy-Corb și colab., 246, Science, 1293, 1989 (unde s-a afirmat că utilizarea adjuvanților combinați cu muramil dipeptidă poate spori inducerea ambelor 29 ramuri, tumorală și celulară, ale răspunsului imun); Allison și Byars, 89, Vaccines, 56,1987 (unde se afirmă că imunitatea mediată celular este provocată de către SAF (cu muramil 31 dipeptidă), așa cum s-a dovedit prin hipersensibilitatea de tip întârziat, prin răspunsuri proliferative ale celulelor T la antigen, prin producerea de interleukină-2 și prin liza specifică restric- 33 ționată genetic a celulelor țintă care poartă antigenul de imunizare); Allison și Byars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non- 35 Specific Resistance, 191...201, 1987; Morgan și colab., 29, J.Medical Virology, 74, 1989; Kenney și colab., 121, J. Immunological Methods, 157, 1989; Allison și Byars, 95, J. 37 Immunological Methods, 157, 1986 (unde sărurile de aluminiu și emulsiile de ulei mineral s-au dovedit a spori formarea de anticorp, dar nu și imunitatea mediată celular; și formulările 39 muramil dipeptidă s-au dovedit a provoca imunitate mediată celular); Byars și colab., 8, Vaccine, 49,1990 (neadmisă ca stadiu anterior al tehnicii, pentru prezenta cerere, unde se 41 afirmă că formularea lor de adjuvant crește marcant răspunsurile tumorale și la un nivel mai mic sporesc reacțiile mediate celular pentru antigen hemaglutinină de virus gripal); Allison 43 și Byars, 28, Molecular Immunology, 279, 1991 (neadmis a fi stadiul tehnicii anterioare, pentru prezenta cerere; care afirmă că funcția muramil dipeptidei este de a induce expresia 45 citokinelor și de a crește expresia genelor de histocompatibilitate principală (MHC); și că un anticorp mai bun și răspunsuri celulare s-au obținut cu alți adjuvanți și că se speră să se 47

RO 120065 Β1 lămurească dacă strategii similare sunt eficace la oameni); Allison și Byars, Technoiogy Advancesin Vaccine Development, 401,1988 (care descrie imunitatea mediată celular folosind SAF); Epstein și colab., 4, Advance Drug Delivery Reviews, 223,1990 (care asigură o vedere de ansamblu a diverșilor adjuvanți folosiți în prepararea vaccinurilor); Allison și Byars, 95, J. Immunological Methods, 157,1986 (care afirmă că adăugarea de muramil dipeptidă, la adjuvant, mărește marcant răspunsurile mediate celular, la o diversitate de antigene, inclusiv imunoglobuline monoclonale și antigene virale); și Morgan și colab. 29, J. Medical Virology, 74,1989 (care descrie utilizarea de SAF-1, pentru prepararea unui vaccin pentru virusul Epstein-Barr).

Kwak și colab., Idiotype Networs in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, p. 163,1990 (neadmisă ca stadiul anterior al tehnicii, pentru prezenta cerere) descrie utilizarea de SAF fără muramil dipeptidă ca un adjuvant pentru un idiotip limfom celulă-B, la un om. Mai precis, s-a administrat cu idiotipul o emulsie de Pluronic L121, Squalan și 0,4% TWEEN-80 în fosfat tamponat. Ei afirmă că adăugarea unui adjuvant ar putea mări în mod suplimentar, răspunsurile tumorale și la fel de bine poate facilita inducerea răspunsurilor celulare.

Alte preparate imunologice includ lipozomi (Allison și colab., US 4053585 și 4117113); peptide ciclice (Dreesman și colab., US 4778784); adjuvant Freunds complet (Asherson șicolab., 22, Immunology,465,1972; Berman și colab., 2 Internațional J. Cancer, 539, 1967; Allison, 18, Immunopotentiation, 73, 1973; și Allison, Non-Specific Factors Influencing HostResistance, 247,1973); ISCOM (Letvin și colab., 87, Vaccines, 209,1987); adjuvanți care conțin agenți bloc polimeri neionici, formați cu ulei mineral, o suprafață agent activ și TWEEN-80 (Hunter și Bennett, 133, J. Immunology, 3167, 1984; și Hunter și colab., 127, J. Immunology, 1244,1981); adjuvanți compuși din ulei mineral și agent emulgator, cu sau fără micobacterii omorâte (Sanchez-Pescador și colab., 141, J. Immunology, 1720, 1988); și alți adjuvanți, cum ar fi un derivat lipofilic al muramil tripeptidei și o muramil dipeptidă conjugată covalent la proteină recombinantă.

Problema, pe care o prezintă invenția, este o compoziție de antigen de Papillomavirus și utilizarea acesteia, în fabricarea unui medicament pentru tratamentul tumorilor.

Compoziția conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta cuprinde un antigen de Papillomavirusîn amestec cu o formulare microfluidizată de antigen, care include:

(a) un detergent de stabilizare;

(b) un agent de formare a micelelor, și (c) un ulei biodegradabil și biocompatibil.

Numita formulare de antigen fiind formulată ca o emulsie stabilă ulei-în-apă, numita formulare de antigen fiind substanțial fără peptide imunostimulatoare și în care numita compoziție, prin administrare la un animal, ales din grupul format din oameni, animale domestice și animale de tracțiune, este aptă de a induce un răspuns citotoxic T-limfocitar specific față de antigenul de Papillomavirus conținut în compoziție.

Utilizarea compoziției conform invenției, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul cancerului cervical și Condyloma acuminata.

Solicitantul a găsit o metodă sigură și avantajoasă, și compoziții prin care poate induce răspunsuri CTL, la oameni și animale domestice sau la animale importante din punct de vedere agricol. Metoda implică utilizarea unei formulări de antigen, care are toxicitate redusă sau absentă, la animale, și căreia îi lipsește o peptidă imunostimulatoare (de exemplu, muramil dipeptidă), a cărei prezență ar descrește răspunsul celular dorit.

RO 120065 Β1

Suplimentar, metodologia este simplu de folosit și nu necesită o muncă excesivă in vivo, 1 pentru modificarea celulelor existente prin tehnici de ADN recombinant, pentru a le face mai antigenice. Această descoperire este surprinzătoare, deoarece este neașteptat, ca un astfel 3 de răspuns CTL să poată fi indus prin utilizarea unei astfel de formulări de antigen căreia îi lipsesc peptidele imunostimulatoare sau echivalentul lor. Descoperirile solicitantului permit 5 folosirea, de asemenea, a formulării de antigen într-un spectru larg de stări de boală sau ca un agent profilactic. De exemplu, administrarea formulării de antigen se poate folosi pentru 7 tratamentul bolilor virale în care un răspuns CTL este important, de exemplu, în tratamentul infecției HIV sau gripă; de asemenea, el poate fi extins pentru folosire în tratamentul 9 infecțiilor bacteriene, cancer, infecții parazitare și altele. Ca agent profilactic, formularea antigen combinată cu un antigen corespunzător este utilă în prevenirea infecțiilor prin virusuri 11 responsabile de bolile virale menționate anterior, în special, profilaxia infecției HIV și, de asemenea, pentru profilaxia pacienților cu risc de cancer, de exemplu, după rezecția unei 13 tumori primare.

Astfel, într-un prim aspect, invenția caracterizează o metodă pentru inducerea unui 15 răspuns CTL, la un om sau animal domestic (de exemplu, pisică sau câine), sau animal important agricol (de exemplu, cal, vacă sau porc), la un antigen, altul decât antigenul limfom 17 celulă-B sau albumină de ou. Metoda include etapele furnizării antigenului la care se dorește răspunsul CTL și furnizarea unei formulări antigen netoxice, care cuprinde, constă sau 19 constă esențial dintr-un detergent stabilizator, un agent care formează micele și un ulei biodegradabil și biocompatibil. Acestei formulări antigen, de preferință, îi lipsește orice compo- 21 nent peptidic imunostimulatorsau are niveluri suficient de scăzute ale unui asemenea component, încât răspunsul celular dorit nu este diminuat. Această formulare este asigurată, de 23 preferință, ca o emulsie stabilă ulei-în-apă. Fiecare dintre diversele componente sunt alese, astfel încât emulsia va rămâne într-o stare de emulsie pentru o perioadă de cel puțin o lună 25 și, de preferință, mai mult decât un an, fără separarea fazei. în metodă, antigenul și formularea de antigen sunt amestecate pentru a forma un amestec (de preferință, prin microfluidi- 27 zare) și acel amestec administrat la un animal într-o cantitate suficientă pentru a induce răspuns CTL în animal. O astfel de administrare este necesară numai o dată. 29

Prin detergent stabilizator, se înțelege un detergent care permite componentelor emulsiei să rămână ca o emulsie stabilă. Astfel de detergenți includ polisorbat 80 (TWEEN) 31 (sorbitan-mono-9-octadecenoat-poli(oxi-1,2-etandiil; fabricat de către ICI Americas, Wilmington, DE), TWEEN 40, TWEEN 20, TWEEN 60, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7 și SPÂN 85. 33

Acești detergenți sunt asigurați de obicei într-o cantitate de aproximativ 0,05 până la 0,5%, de preferință, la circa 0,2%. 35

Prin agent de formare micele, se înțelege un agent care este capabil să stabilizeze emulsia formată cu alte componente, astfel că se formează o structură asemenea micelelor. 37 Astfel de agenți produc, de preferință, o oarecare iritare la locul injectării, în scopul recrutării macrofagelorcare să sporească răspunsul celular. Exemple de astfel de agenți includ agenți 39 tensioactivi polimerici, descriși de publicațiile BASF Wyandotte, de exemplu, Schmolka, 54, J. Am. Oii. Chem. Soc., 110,1977 și Hunter și colab., 129 , J. Immunol, 1244,1981, ambele 41 încorporate aici prin referire, PLURONIC L62LF, L101 și L64, PEGIOOOșiTETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301 și 130R1. Structurile chimice ale unor asemenea agenți sunt bine- 43 cunoscute în domeniu. De preferință, agentul este ales pentru a avea o balanță hidrofilă-lipofilă (HLB) între 0 și 2, așa cum s-a definit de către Hunter și Bennett, 133, Journal of 45 Immunology, 3167, 1984. Agentul este asigurat, de preferință, într-o cantitate între 0,5 și 10%, cel mai preferat, într-o cantitate între 1,25 și 5%. 47

Uleiul este ales pentru a promova reținerea antigenului în emulsia ulei-în-apă, adică, de a furniza un vehicul pentru antigenul dorit și, de preferință, are o temperatură de topire 49

RO 120065 Β1 mai mică decât 65°C, astfel încât emulsia se formează fie la temperatura camerei (circa 20 până la 25’C), fie o dată ce temperatura emulsiei este adusă la temperatura camerei. Exemple de astfel de uleiuri includ Squalen, Squalan, EICOSANE, tetratetracontan, glicerol și ulei de arahide sau alte uleiuri vegetale. De preferință, uleiul este asigurat într-o cantitate între 1 și 10%, cel mai preferat, între 2,5 și 5%. Este important că uleiul este biodegradabil și biocompatibil, astfel că organismul poate degrada în timp uleiul, astfel încât nu se observă efecte adverse, cum ar fi granuloame, la utilizarea uleiului.

Este important ca din formularea de mai sus să lipsească un component peptidic, în special, o muramil dipeptidă (MDP). O asemenea peptidă va interfera cu inducerea unui răspuns CTL dacă este furnizată într-o cantitate mai mare decât circa 20 pg per administrare formulare om normal. Este de preferat ca astfel de peptide să fie absente complet din formularea antigenului, în ciuda stimulării aparente de către acestea a compartimentului tumoral al sistemului imun. Astfel, solicitantul a găsit că, deși asemenea peptide pot să sporească răspunsul tumoral, ele sunt dezavantajoase când se dorește un răspuns citotoxic T-limfocitar.

în alte aspecte apropiate, formularea de antigen se formează numai din două dintre cele trei componente de mai sus și se folosește cu orice antigen dorit (termen care include proteine, polipeptide și fragmente ale lor care sunt imunogenice), cu excepția albuminei de ou (sau alte albumine, de exemplu, HSA, BSA și ovalbumină), pentru a induce un răspuns CTL, în animalele de mai sus sau oameni.

Solicitantul crede că formulările de mai sus sunt semnificativ mai avantajoase față de formulările anterioare (incluzând ISCOM, DETOXșiSAF) pentru utilizare la oameni. Spre deosebire de astfel de formulări, prezenta formulare include ambele, un agent de formare micele și nu are peptide structurale ale pereților celulari sau componente celulare bacteriene. De asemenea, prezenta formulare induce un răspuns CTL, care fie nu se întâlnește cu formulările anterioare, fie este semnificativ sporit comparativ cu acele formulări.

Prin netoxic, se înțelege că se observă un efect secundar mic sau nu se observă efecte secundare ale formulării antigen la animalul sau omul tratat. Cei cu pregătire în domeniile medical sau veterinar vor recunoaște că acest termen are un înțeles larg. De exemplu, la un animal sau om sănătos, poate fi tolerată numai o ușoară toxicitate, în timp ce la un om care suferă de o boală iminentă, poate fi tolerată substanțial mai multă toxicitate, în realizări preferate, formularea de antigen constă în esență din două sau trei componente alese dintre detergent, agent și ulei; metoda constă în esență dintr-o singură administrare a amestecului (antigen plus formulare antigen), la om sau animal, omul sau animalul se infectează cu un virus și prezintă unul sau mai multe simptome (așa cum este în general definit de către doctori în medicină, în domeniul relevant) ale infecției cu virus; și formularea antigenului este netoxică pentru om sau animal.

în alte realizări preferate, antigenul este ales din porțiuni antigenice ale antigenelor HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat și Rev; antigenele malariei: proteina CS și proteina 2 a suprafeței sporozoitului; antigenele de suprafață ale hepatitei B: Pre-SI, Pre-S2, HBc Ag, și HBe Ag; antigenele gripale: HA, NP, și NA; antigenele de suprafață ale hepatitei A; antigenele virusului Herpes: EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, produsul proteinei timpurii HSV, antigen Papillomavirus uman (de exemplu, antigenele HPV, cum ar fi antigenele L1, E4, E6 și E7, în special, antigenele E6 și E7 de la HPV16 și 18, cele două tipuri HPV asociate cel mai adesea cu carcinom cervical, E4 și L1 derivate de la HPV6 și HPV11, cel mai adesea HPV asociate cu Condyloma acuminata, antigenul specific prostatei (PSA), Citomegalovirus gB, Citomegalovirus gH și proteină IE gP72; antigenele virusului sincițial respirator; proteină F, proteină G și proteină N; și antigenele tumorii carcinomice CEA, carcinom

RO 120065 Β1 asociat mucinei, carcinom P21, carcinom P53, melanom MPG, melanom p27 și carcinomul 1 produsului oncogen Neu, carcinom produsul genei p53, antigenul melanomului numit MAGE și proteina mutată p21 ras prezentă într-o diversitate de tumori maligne. 3 într-un aspect apropiat, invenția caracterizează o compoziție, care cuprinde, constă sau care constă, în esență, dintr-un antigen amestecat cu o formulare antigen descrisă mai 5 sus și antigenul este ales de la acele porțiuni antigenice listate mai sus.

în alte aspecte apropiate, invenția caracterizează metode de tratament al unui pacient 7 infectat cu virus HIV, care suferă de malarie, care suferă de gripă, care suferă de hepatită, care suferă de un cancer, infectat cu un virus herpes, care suferă de cancer cervical, care 9 suferă de Condyloma acuminata (verucozități genitale), sau infectat cu virus sincițial respirator, prin administrarea unei compoziții incluzând un antigen corespunzător (de exemplu, 11 selectat dintre cei listați mai sus), amestecat cu una dintre formulările antigen de mai sus. Aceste antigene și tratamentele sunt doar exemplificări ale antigenelor care pot fi folosite în 13 formulările antigenice respective. Alte trăsături și avantaje ale invenției vor fi evidente din descrierea care urmează, a realizărilor preferate ale acesteia și din revendicări. 15

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- obținerea unei formulări în formă de emulsie stabilă, ulei-în-apă, cel puțin 1 an; 17

- absența componentului peptidic, deși poate să sporească răspunsul tumoral, determină un răspuns citotoxic T-limfocitic. 19 în continuare, vor fi descrise pe scurt desenele care însoțesc invenția.

- fig. IA-IC și 4A-4C sunt prezentări grafice ale datelor, care compară inducerea CTL 21 prin diverse formulări ovalbumină; E:T reprezintă raportul efector la țintă în toate figurile;

- fig. 2A și 2B sunt prezentări grafice ale datelor, care compară inducerea CTL prin 23 diverse formulări β-galactozidază;

- fig. 3 este o prezentare grafică a datelor, care compară inducerea CTL prin ovalbu- 25 mină într-un lipozom și într-o formulare antigen;

- fig. 5 și 6 sunt prezentări grafice ale datelor, care arată efectul epuizării celulelor 27 CD4 și CD8 asupra inducerii CTL;

- fig. 7 este o reprezentare grafică a datelor, care arată inducerea CTL prin gp120;29

- fig. 8 este o reprezentare grafică a datelor, care arată inducerea CTL printr-un amestec de pluronic și TWEEN și un antigen;31

- fig. 9 este o reprezentare grafică a datelor, care arată inducerea CTL cu un amestec de squalan și pluronic și un antigen;33

- fig. 10 este o reprezentare grafică a datelor, care arată inducerea CTL printr-un amestec de squalan și pluronic și un antigen;35

- fig. 11 este o reprezentare grafică a efectului OVA, cu diverse formulări antigen asupra răspunsului CTL;37

-fig. 12 este o reprezentare grafică a inducerii anticorpilor anti-gp120lllb, la maimuțe, cu diverse formulări de antigen;39

- fig. 13 ilustrează activitatea antitumorală a celulelor HOPE2, la 10 zile, după o singură imunizare de proteină E7 solubilă în adjuvant; și41

- fig. 14 ilustrează activitatea antitumorală a celulelor HOPE2, la 10 și 19 zile, după două imunizări cu proteină E7 solubilă în adjuvant.43

Formulare antigen

Formulări antigen utile în această invenție sunt descrise, în general, mai sus. Cei cu 45 pregătire obișnuită, în acest domeniu, vor recunoaște că formulări echivalente sunt preparate cu ușurință și poate fi de așteptat să aibă proprietăți echivalente în inducerea unui răs- 47 puns CTL. Asemenea formulări sunt testate cu ușurință, pentru proprietățile lor, folosind tehnici echivalente celor descrise în exemplele de mai jos. 49

RO 120065 Β1 în continuare, sunt prezentate exemple ale invenției, prin utilizarea unei formulări antigen (AF), compusă din circa 2,5% squalan, 5% acid pluronic și TWEEN 80, într-un fosfat tamponat salin. în mod specific, o emulsie de AF a inclus: 15 mg squalan, 37,5 mg poloxamer401 (PLURONIC L121), 6 mg polisorbat 80 (TWEEN 80), 0,184 mg clorură de potasiu, 0,552 mg fosfat monobazic de potasiu, 7,36 mg clorură de sodiu, 3,3 mg fosfat dibazic de sodiu (anhidru), per 1 ml apă, pH=7,4. Această emulsie s-a microfluidizat, folosind tehnica standard (Microfluidics Model MIIOF) cu un modul de contrapresiune la 11...14000 psi, cu reîntoarcere gradată la presiunea atmosferică, răcind și împachetând în gheață umedă.

în alte exemple, antigenul s-a amestecat cu squalanul microfluidizat (S), pluronic (P) și TWEEN 80 (T), pentru a atinge o concentrație finală de 0,2% TWEEN 80,1,25% pluronic și, respectiv, 5% squalan. Pentru a determina subcomponentele necesare pentru inducerea unui răspuns imun specific antigen, Squalan-TWEEN 80, pluronic-TWEEN 80 sau SqualanPluronic s-au preparat la aceeași concentrație ca pentru cele trei componente ale amestecului. Pluronic, Squalan sau TWEEN 80 s-au preparat, de asemenea, individual, pentru determinarea efectului componentului individual asupra inducerii CTL. De asemenea, s-au făcut substituții ale TWEEN 20, TWEEN 40 sau Zwittergent pentru TWEEN 80 pentru determinarea efectelor diverșilor derivați TWEEN asupra inducerii CTL în sistemul ova. Substituții ale Squalanului în cele trei formulări componente au fost făcute cu Eicosone sau Triacontone și substituții pentru copolimerul pluronic în formularea acelorași trei componente s-au făcut prin PEG 1000, Pluronic L62LF și Tetronic 1501 și 150R1. Ca și cele două formulări componente, s-au amestecat divești analogi în diverse combinații și s-au testat pentru inducere CTL specifică ova. Ele sunt un amestec de colesterol - TWEEN 80, Squalan - TWEEN 20, Pristan - TWEEN 80, sau ulei de măsline - TWEEN 80. Pentru un studiu de stabilizare, amestecul microfluidizat de Squalan - TWEEN 80 s-a amestecat cu dextroză la o concentrație finală de 5%. în toate cazurile, combinațiile de excipienți s-au amestecat într-un aport de microfluidizare, pentru a obține o emulsie stabilă. în unele experimente, formulări de 2 componente s-au amestecat cu diferite concentrații de MDP, pentru a induce CTL și răspunsul tumoral. Tabelul 1 descrie o listă cuprinzătoare a diferitelor formulări folosite în acest studiu.

Efectul diferitelor substituția în sisteme de trei sau două componente

Tabelul 1

Substituție în formulări de trei	Omorâre % la E:T
componente	100:1
STP	84
Tween 40(T)	66
Tween 20 (T)	48
T1501 (P)	0
T150R1 (P)	0
Pluronic L62LF (P)	47
Eicosan (S)	*
PEG1000 (P)	★
Triacontan (S)	★
Zeittergent (T)	*

RO 120065 Β1

Tabelul 1 (continuare)

Substituție în formulări de două componente ST PT SP Colesterol (S) + Tween 80 Squalan + Tween 29 (T) Pristan (S) + Tween 80 Ulei de măsline (S) + Tween 80	76 45 26 0 65 42 69
Formulare 1 component Pluronic L121 Squalan Tween 80 Squalan + Tween 80 + dextroză 5%	0 0 0 86

‘Analiza CTL este repetată

S-a folosit formularea adjuvant Syntex (microfluidizat; SAFm) ca un adjuvant de con- 19 trol și constă din două părți. Partea I constă din fosfat tamponat salin, care conține o concentrație finală de 5% Squalan, 1,25% Pluronic și 0,2% TWEEN 80 (vehicul sau l-SAF). Partea 21 a ll-a constă din N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamină (Thr-MDP), un derivat al componentului peretelui celular de microbacterium. Pentru scopurile imunizării, antigenul este 23 amestecat cu vehicul microfluidizat (partea I), pentru a obține o emulsie omogenă. Se adaugă MDP pentru a obține SAFm și se centrifughează ușor. Concentrația MDP din ames- 25 tec a variat pentru a determina dacă a fost o concentrație optimă pentru o inducere CTL. Ca un adjuvant de control, șoarecii s-au imunizat cu antigene solubile amestecate cu alum, con- 27 form manualului producătorului (Pierce Chemical, Rockford, IL) sau cu adjuvant Freund complet (CFA). 29

Această formulare de antigen se folosește pentru inducerea răspunsurilor citotoxice T-limfocitare la șoareci. Cei cu pregătire obișnuită în domeniu vor recunoaște că un astfel 31 de model șoarece este indicator că experimentele sau tratamentele echivalente vor induce în mod similar răspunsuri citotoxiceT-limfocitare, la oameni, animale domestice sau animale 33 din agricultură. Cantitatea formulării de antigen și antigen utilă, pentru a produce răspunsul celular dorit, poate fi determinată empiric prin proceduri standard bine cunoscute celor cu 35 pregătire obișnuită în domeniu, fără a mai proceda la experimentare. Astfel, dacă se dorește să se reducă efectele secundare ale tratamentului cu un astfel de amestec, cei cu pregătire 37 obișnuită în domeniu pot determina un nivel minim al unui astfel de amestec, pentru administrare la un om, un animal domestic sau agricol, în scopul de a provoca un răspuns CTL, și 39 prin aceasta, să inducă imunitate la un antigen dorit. în cazul utilizării în mod curent, un asemenea amestec va fi injectat prin oricare dintre numeroasele proceduri standard, dar se pre- 41 feră în mod deosebit, o injecție intramusculară cu o localizare care va permite emulsiei să rămână într-o formă stabilă pentru o perioadă de câteva zile sau câteva săptămâni. 43

Metode în exemplele date mai jos s-au folosit, cu excepția cazului unde s-a remarcat altfel, 45 următoarele materiale și metode:

RO 120065 Β1

Șoareci

S-au procurat femele C57BL/6 (H-2^b) și BALB/c (H-2^d) de la Harlen Sprague (San Diego, California).

Antigene

S-a folosit ovalbumină (ova, Grade VII; Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO) în formă nativă. S-a folosit β-galactozidază (β-gal, Grade VIII; BRL) în formă nativă și după fierbere în NaOH, timp de 2 min, pentru a da un digest alcalin. S-a procurat gp120 recombinant de la American Biotechnology.

Celule tumorale și transfectanți

S-au folosit celule tumorale la liniile EL4 (C57BL/6, H-2^btimom) și P815 (DBA/2, H-2^dmastocitom). Derivarea transfectantului EL4 care produce ova, EGI-ova, este descrisă anterior de către Moore și colab., 54, Cell, 777,1988. Transfectantul P13.1, care produce β-gal, s-a derivat prin electroporarea a 10⁷ celule P815 în 1 ml de fosfat tamponat salin (PBS) cu 10 mg de Pstl liniarizat pCHUO (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) și 1 mg de Pvul liniarizat pSV2 neo (Southern și colab., 1, J. Mol. Appl. Genet., 327,1982) urmat de selecție în 400 pg/ml antibiotic G418. Transfectantul C3-4 s-a derivat de la hibridomul Igm 662 BALB/c prin transfectare cu o plasmidă care codifică gena /5-gal fuzionată la al treilea și al patrulea exon al lanțului greu IgM (Rammensee și colab., 30, Immunogenetics, 296, 1989). S-a furnizat gp160lllb care exprimă fibroblast 3T3,15-12 de către dr. Germain de la NIH (Bethesda, MD). Linia celulară L transfectată K^b a fost asigurată de către dr. Carbone, Monash University, Australia. Liniile celulare L transfectate D^d și L^d au fost furnizate de către dr. Ted Hensen, Washington University, St. Louis.

Imunizare

S-au imunizat intravenos șoareci, cu 200 pl dintr-o suspensie 25 x 10⁶ splenocite, după o încărcare citoplasmică cum s-a descris de Moore și colab., prezentată mai sus și Carbone și colab., J. Exp. Med. 169:603,1989). Pentru formularea de imunizare antigen ova sau formulările de imunizare antigen β-gal, s-au injectat subcutanat 30 pg per șoarece din fiecare proteină antigen, în talpă și baza cozii. Fiecare injectare constă din 67 pl formulare antigen microfluidizată (obținută urmând proceduri standard) și 30 pg de proteină antigen într-un volum final de 200 μΙ. Volumul final s-a obținut cu HBSS, vezi, Whittaker Manual (Welkersville, MD). S-a asigurat MDP în concentrații între 0 și 300 pg, unde s-a afirmat că șoarecii s-au imunizat cu antigene solubile în CFA sau în Alum, într-un volum total de 200 μΙ.

Stimularea in vitro a populațiilor efectoare

Celule splenice (30 x 10⁶) de la șoareci normali sau imunizați, care au fost inițiați cu cel puțin 14 zile mai devreme, s-au incubat cu 1,5 x 10® EGI-ova (iradiate cu 20000 rad) pentru răspunsuri ova sau 1,5 x 10® celule C3-4 (iradiate cu 20 000 rad) pentru răspuns β-gal în plăci 24 godeuri la 37°C în 7% CO₂/aer. Toate culturile de țesut au fost realizate într-un mediu complet, constând din mediu IMDM, vezi, WhittakerManual (Welkersville, MD) suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (FCS), 2 mM glutamină, gentamicină și 2 x 10⁵ M 2-mercaptoetanol. Pentru experimentele epuizării in vitro, celule splenice inițiate in vivo au fost stimulate in vitro, au fost tratate cu anticorpi monoclonali (mAbs) RL.172 (anti-CD4) sau mAbs 3.168 (anti-CD8) pentru îndepărtarea celulelorT CD4⁺ sau CD8⁺ (Sarmiento și colab., 125,

J. Immunol., 2665, 1980, și Ceredig și colab., 314, Nature, 98, 1985). Au fost obținuți mAb RL.172 și mAb 3.168 de la dr. Jonathan Sprent de la Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

Celule splenice (30 x 10^e) de la șoareci normali sau imunizați, care au fost inițiate cel puțin 21 zile mai devreme, au fost incubate cu 1,5 x 10® celule 15...12 (tratate cu 200 pg de

RO 120065 Β1 mitomicină C, timp de 45 min, pe 10⁸ celule) sau cu 500 pg peptidă 18111b care conține epi- 1 topul CTL dominant în șoareci Balb/c în mediu IMDM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) care conțin 10% FCS pre-sortat (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 mM gluta- 3 mină, gentamicină și 2 x 10‘⁵ M2-mercaptoetanol. Pentru stimulare in vitro cu peptide, celule splenice s-au cultivat în IMDM complet, conținând 5% supernatant ConA. 5

Pentru experimente de epuizare, celule splenice inițiate in vivo sau stimulate in vitro s-au tratat cu mAbs RL.172 (anti-CD4) sau mAbs 3.168 (anti-CD8), în prezență de comple- 7 mentde iepure de toxicitate scăzută (Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Canada) pentru îndepărtarea celulelor T CD4⁺ sau CD8⁺ (22,23). Anticorpii mAb RL.172 și mAb 3.168 9 au fost donate de dr. Jonathan Sprent de la Scripps Clinic and Research Foundation, La, Jolla, CA.11

Analiza citotoxicității

Celule țintă (1 x 10⁶) au fost marcate cu 100 pCi [⁵¹Cr] cromat de sodiu, timp de 6013 min. Pentru țintele peptidice pulsare în timpul marcării cu ⁵¹Cr, s-au adăugat 50 pl dintr-o soluție 1 mg/ml peptidă în HBSS. După spălare, 10⁴ celule marcate și diluții în serii de celule15 efectoare s-au incubat în 200 μΙ de RP10, timp de 4 h, la 37°C. S-au colectat 100 μΙ de supernatant și s-a determinat liza specifică ca: procent liză specifică = 100 x {(eliberare prin 17 CTL - eliberare spontană)/(eliberare maximă - eliberare spontană)}. Eliberarea spontană în absența răspunsului citotoxic T-limfocitar (CTL) a fost < 25% din eliberarea maximă de deter- 19 gent în toate experimentele.

Determinarea răspunsurilor anticorp în șoareci și maimuțe21

Fiecare godeu al unei plăci cu 96 godeuri cu fundul în formă de U (Costar, Cambridge, MA) s-a acoperit cu 150 ng de ova sau gpl20 în 50 μΙ de HBSS și au fost incubate23 peste noapte la 4°C. Pentru determinarea răspunsurilor anticorp anti-gp120 și anti-ova, la șoareci, plăcile au fost blocate cu 1% BSA, timp de 1 h. S-au adăugat seruri diluate în serii25 de 25 μΙ volum per godeu și au fost incubate, timp de 2 h. Plăcile au fost spălate și s-a adăugat, per godeu, 50 μΙ dintr-o diluție 1:1000 de IgG capră antișoarece conjugat cu HRPO 27 (SBT, Alabama) în 1% BSA. După o oră de incubare, plăcile au fost spălate și s-au adăugat 100 μΙ substrat pergodeu. S-a luat OD₄₀₅după 10... 15 min. Pentru determinarea răspunsului 29 anticorp al maimuței anti-gp120, toate etapele au fost la fel, cu excepția că atât blocarea plăcilor, cât și diluția serurilor s-au făcut în 5% ser normal de capră în soluție salină echilibrată 31 Hank.

Sinteza peptidei 33

Peptide sintetice corespunzătoare la secvențele aminoacide 253-276 (Lista de secvențe nr. 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; unde se folosește codul standard de o literă, 35 pentru a reprezenta fiecare aminoacid) ale albuminei (ova 253-276), secvențele aminoacide 84-102 ale proteinei mielină bazică (MBP 84-102) (Lista de secvențe nr. 2: DENPWHFFK 37 NIVTPRTPP) și peptide sintetice care corespund secvențelor aminoacide 308-322 (secvență 18111b) a gp120lllb, au fost asamblate prin sinteză peptidică în fază solidă, folosind un 39 sintetizator Applied Biosystems 430A. Aminoacizii au fost cuplați prin intermediul anhidridelor simetrice preformate, cu excepția asparaginei, glutaminei și argininei care au fost cuplate ca 41 esteri hidroxibenzotriazol. Eficiența cuplării s-a monitorizat prin reacția ninhidrină, urmând metoda lui Kaiser și colab., 34, Anal. Biochem,. 595,1970. Peptidele au fost eliberate de pe 43 suport cu HF, urmând procedura low-high descrisă de Tam, și colab., 21, J. Am. Chem. Soc., 6442,1983, și peptidele au fost extrase de pe o rășină cu acid acetic 10%. După liofi- 45 lizare, peptidele au fost desalinizate pe o coloană Sephadex G-25 și probe de peptide au fost purificate apoi prin cromatografie HPLC în fază inversă, pe o coloană preparativă Vydac C- 47 18. Peptide purificate (98%) au fost solubilizate în HBSS, la o concentrație finală de 10 mg/ml și au fost diluate până la concentrația dorită în medii complete. 49

RO 120065 Β1

Digest CNBr

Probe de proteină (de exemplu, β-galactozidază) s-au tratat cu exces molar de 100 de ori de bromură de cianogen într-o soluție de acid trifluoracetic 10 mM. Reacția a fost lăsată să se desfășoare timp de 18 h, la temperatura camerei (circa 20°C) cu centrifugare. După timpul de reacție prescris, fragmentele peptidice s-au separat de reactant, folosind un aparat SEP-PAK C-18 (Waters), au fost eluate cu 95% acetonitril și au fost liofilizate.

Digest alcalin

Probe de proteină (de exemplu, β-galactozidază) au fost tratate cu NaOH 1N și au fost fierte 2 min, iar fragmentele peptidice rezultate s-au separat de reactanți, folosind un aparat C-18 SEP-PAK (Waters) și s-au eluat cu 95% acetonitril și s-au liofilizat.

Exemplul 1. Inițiere CTL restricționate, Clasa I.

Moore și colab., 113, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., 1989, și Carbone și Bevan, 171,

J. Exp. Medicine, 377,1990, demonstrează că șoareci imunizați cu celule splenice încărcate citoplasmic cu ova au fost inițiate pentru răspuns CTL restricționat Clasa I specific ova. S-a folosit transfectant EG7-ova EL4, care exprimă ova pentru stimularea in vitro a limfocitelor splenice inițiate in vivo și, de asemenea, s-au folosit ca țintă pentru omorârea mediată CTL specific ova. De asemenea, acest studiu a demonstrat că efectori CD8⁺ induși prin transfectant EG-7 ova sau prin celule splenice încărcate citoplasmic cu ova, recunosc un determinant configurat prin peptida ova 258-276 în contextul lui H-2K^b, lizează EG7-ova și, de asemenea, omoară celule EL4 acoperite cu ova 258-276. Astfel, în scopul de a cerceta dacă o cale metabolică a celulei T CD8⁺ restricționat Clasa I poate fi indusă printr-un antigen solubil, sistemul de mai sus s-a folosit pentru a determina dacă anumite formulări antigen se pot folosi pentru a conduce antigenul solubil, o cale restricționată Clasa I.

a) ova

S-au inițiat o dată șoareci C57BL/6 cu diverse cantități de ova (30 pg...1 mg per șoarece), cu sau fără o formulare antigen. Șoarecii au fost injectați subcutanat și la baza cozii. S-au luat celule splenice de la șoareci imunizați, la cel puțin 2 săptămâni după imunizare și au fost stimulați in vitro cu transfectanți EG7-ova. O concentrație ova de ordinul a 30 pg a fost la fel de eficientă ca o doză de 1 mg. Prin urmare, s-au realizat studii CTL de rutină cu celule splenice de la șoareci inițiați 30 pg ova. După 5 zile de cultură in vitro cu EG7-ova s-a analizat inițierea prin prezența efectorilor specifici ova capabili să lizeze EG7-ova.

Șoareci injectați cu ova solubil în HBSS, la concentrație de 1 mg, nu au prezentat dovada inițierii CTL (Fig. 1 A). Totuși, șoarecii imunizați cu 30 pg ova în formularea antigen descrisă mai sus (prezentată în figuri ca AF) au prezentat un răspuns CTL specific transfectantului semnificativ (Fig. IC). Mai mult, extinderea uciderii EG7-ova de către celule splenice imunizate ova-AF a fost comparabilă celor ale șoarecilor imunizați cu celule splenice încărcate ova (fig. 1B).

Acea specificitate a inițierii CTL in vivo a fost antigen specific și s-a arătat prin lipsa celulelor splenice de la șoareci imunizați β-galactozidază de a manifesta răspuns CTL secundar in vitro când s-au stimulat cu EGI-ova. Nu s-a observat nici o inducere CTL specifică ova.

b) β-qalactozidază

Rezultate similare au fost obținute folosind o altă proteină antigen solubilă β-gal. Pentru analizarea răspunsului CTL specific β-gal, celula țintă folosită a fost derivat β-gal de BALB/c care exprimă transfectant C3-4. Imunizarea șoarecilor BALB/c cu β-gal a dat răspuns CTLde bază. Prin urmare, pentru determinarea răspunsului CTL specific, recoltarea a fost amânată pentru cel puțin 8 săptămâni, înainte să fie recoltate limfocite splenice și au fost cultivați 5 zile în prezența transfectanților C3-4 iradiați.

RO 120065 Β1

Fig. 2B demonstrează că 30 pg de β-galactozidază în AF au indus un răspuns CTL 1 specific puternic împotriva transfectantului. La un raport efector la țintă (E:T) de 3:1, șoareci imunizați /7gal-AF au prezentat circa 80% moarte specifică C3-4. Cu toate acestea, s-a atins 3 numai 20% moarte a aceleiași celule țintă cu efectori izolați de la șoareci imunizați β-gal în HBSS la același raport E:T (fig. 2A). Deoarece nici EL4 și nici P815 nu exprimă produsele 5 genei MHC clasa II și liza prezintă restricție singeneică, acești efectori specifici ova și /7gal sunt restrcționați MHC clasa I. 7

Pentru demonstrarea utilității formulării antigen, s-au imunizat șoareci cu ova încapsulată în două tipuri de lipozomi, din care unul a fost lipozom sensibil la pH. O săptămână 9 mai târziu, celulele splenice au stimulat in vitro, așa cum s-a descris mai sus, și s-au testat împotriva EG7-ova marcat ⁵¹Cr sau EL4. Fig. 3 arată un rezultat reprezentativ, care demon- 11 strează că ova în lipozom s-ar putea să nu inițieze șoareci pentru inducere CTL substanțială. Rezultate similare s-au observat când ova s-a imunizat în alum. 13

Exemplul 2. Recunoașterea epitopului de către CTL.

Carbone și Bevan, în materialul prezentat mai sus, au demonstrat că CTL induse în 15 șoareci C57BL/6 prin transfectant EG7-ova și prin splenocite încărcate citoplasmic ova recunosc celule EL4 acoperite cu peptida ova 258-27 6. Pentru a determina dacă ovalbumina 17 solubilă în AF induce răspunsuri CTL similare, s-au preparat celule splenice de la șoareci imunizați și stimulați in vitrocu EG7-ova. Efectorii au fosttestați împotriva celulelor EL-4 aco- 19 perite cu peptida ova 253-276 sau cu o peptidă de control derivată de la proteina bazică mielină (MBP 84-102). Rezultatele demonstrează că ova-AF au inițiat CTL cu o specificitate 21 similară celor inițiate prin transfectanți sau prin ova încărcată citoplasmic (fig. IA, 1B și IC). Celulele efectoare inițiate ova-AF au lizat efectiv EG7-ova și celule EL4 netransfectate aco- 23 perite cu 50 pg/10⁸ celule de peptidă ova, dar nu lizează celule EL4 acoperite cu 50 pg/10⁸peptidă MBP. în sistemul jff-galactozidază, Carbone și Bevan, în materialul prezentat mai 25 sus, au arătat că transfectantul care exprimă β-gal și splenocite încărcate citoplasmic cu 3-galactozidază solubilă au inclus CTL care au lizat transfectant care exprimă Z?-gal și celule 27

P815 netransfectante acoperite cu ^-galactozidază digerată alcalin, β-galactozidaza solubilă induce CTL care au specificitate similară au fost imunizate în AF (fig. 2). 29

Exemplul 3. Efectori CTL sunt celule T CD8L

Antigene proteice solubile în AF induc celule T efector CD8⁺, așa cum s-a dovedit din 31 cele care urmează. S-au cultivat splenocite de la șoareci imunizați timp de 5 zile cu transfectanți iradiați in vitro. De aici, celulele au fost recoltate și au fost epuizate de celule T CD4⁺ 33 sau CD8⁺, folosind anticorpi monoclonali anti-CD4 sau anti-CD8 plus complement. Apoi, populațiile epuizate au fost testate împotriva ⁵¹Cr-EG7-ova în sistemul ova sau ⁵¹Cr-P13.1 35 în sistemul /3-ga\. Datele prezentate în fig. 4 arată că, în sistemul ova, epuizarea de celule T CD8⁺ a desființat activitatea citolitică conferită de către întreaga populație de celule efec- 37 toare. Totuși, epuizarea populației de celule T CD4⁺ nu are nici un efect asupra lizei EG7ova. 39 în mod similar, în sistemul β-gal, epuizarea celulelor T CD8⁺ a desființat activitatea citolitică a celulelor splenice imunizate, formulare β-gal-antigen. 41

Exemplul 4. Ova solubilă în AF inițiază celule T CD8⁺.

Pentru a demonstra că ova-AF inițiază populații de celule T CD8⁺ in vivo și este cri- 43 tică pentru răspunsul secundar in vitro, s-au epuizat splinele șoarecilor imunizați ova-AF și de la șoareci neinițiați de populații CD4⁺ sau CD8⁺. Apoi, aceste populații tratate au fost sti- 45 mulate in vitro numai cu EG7-ova sau într-o combinație de celule T CD4⁺ CD8⁺, de la șoareci imunizați ova-AF cu celulele CD4⁺sau CD8⁺, de la șoareci neinițiați. Fig. 5 arată că celule 47 CD8⁺ sunt esențiale pentru manifestarea unui răspuns CTL in vitro. Aceste date indică, de

RO 120065 Β1 asemenea, că pentru un răspuns CTL secundar eficient in vitro, sunt necesare celule T CD4*. Celule CD4⁺ nu sunt necesare pentru inițiere. în mod similar, celule T CD8⁺ au fost necesare pentru manifestarea răspunsului CTL secundar specific /2-gal in vitro.

Exemplele de mai sus demonstrează efectul formulării antigen asupra inducerii răspunsurilor CTL restricționate Clasa I împotriva antigenelor proteine solubile. Formularea antigen a mediat inițierea CTL, indus de antigenul solubil și este similară ca activitate celui indus prin transfectanți și prin splenocite încărcate citoplasmatic cu ova sau Z?-gal solubile. în sistemul ovalbumină, EGI-ova, splenocite încărcate citoplasmatic ova și ova-AFau indus: (a) CTL CD8⁺restricționate Clasa I; (b) CTL care recunosc țintă sensibilizată cu peptidă sintetică ova 253-276; și (c) CTL de lungă durată doar după o imunizare, în sistemul /J-galactozidază, βgal-AF au indus CTL care recunosc transfectantul C3-4 care exprimă β-gal și de asemenea, celule P815 netransfectate sensibilizate cu β-gal digerată alcalin. Aceasta este similară la ceea ce s-a observat cu CTL induse prin imunizare cu celule splenice încărcate citoplasmic cu /î-galactozidază. Inducerea CTL specific ova, prin formulare de antigen este unică, deoarece nici ova încapsulată într-un lipozom sensibil la pH, nici în alum, nu a putut să inducă inițierea CTL in vivo.

Aceste exemple arată că formularea antigen folosită mai sus și echivalentele sale sunt utile în terapia umană și în dezvoltarea de CTL, în diverse cancere și boli virale.

Exemplul 5. Acesta este un exemplu specific pentru a arăta folosirea AF de mai sus pentru inițierea CTL restricționate, clasa I, prin gp120 solubilă de la HIV.

Linia celulară, care exprimă gp160IIIB (15-12), s-a produs în linia de celule 3T3 derivată de fibroblaste Balb/c. Aceastaa a fost obținută de la dr. Ron Germain și dr. Jay Berzofsky, Național Institute of Health, Bethesda, M.D. S-a folosit linia de celule care exprimă gp160 pentru stimularea in vitro a limfocitelor splenice inițiate in vivo și s-a folosit de asemenea țintă pentru inducerea CTL specific gp160. S-au imunizat o dată șoareci Balb/c cu 10 pg de gp160 per șoarece cu sau fără AF. Șoarecii au fost injectați în talpă sau la baza cozii, subcutanat. Celulele splenice s-au luat de la șoareci imunizați după 2 săptămâni de imunizare și s-au stimulat in vitro cu transfectanți gp160 iradiați. După 5 zile de cultură in vitro, inițierea a fost cercetată prin prezența efectorilor specifici capabili să lizeze transfectanți gpl60, dar nu și linii de celule netransfectate. Rezultatele sunt prezentate în fig. 7, unde răspunsul CTL este mărit cu AF și gp120.

Exemplul care urmează, demonstrează utilizarea formulărilor antigen cu utilizarea a numai două componente. Aceste exemple demonstrează că răspunsuri CTL pot fi induse cu numai două din cele trei componente de mai sus.

Exemplul 6. Determinarea componentelor critice necesare pentru inducerea CTL.

Pentru a determina dacă toate componentele notate mai sus, sunt necesare pentru inducere de CTL specifice antigen, au fost imunizați șoareci cu ovalbumină într-o formulare microfluidizată de diverse combinații de două din cele trei componente prezentate în AF de mai sus. Combinațiile de două componente folosite au fost, după cum urmează: Squalan/ TWEEN în PBS, Squalan/Pluronic în PBS sau Pluronic/TWEEN în PBS. Alt set de grupuri au inclus șoareci imunizați cu ova formulată într-un sistem un component, adică numai Squalan în PBS, Pluronic în PBS sau TWEEN în PBS. Formularea de antigen din cele trei componente de mai sus a fost modificată, pentru a exclude, la un moment, un component, punând în locul său PBS.

Formulările de antigen de mai sus au constat din: 0,300 g TWEEN 80 (Aldrich, Wl), 1,875 g Pluronic L121 (BASF, NJ) și 7,5 g Squalan (Aldrich, Wl) aduse la 50 ml cu PBS.

Formulările de două componente au fost:

Squalan/TWEEN: 0,300 g TWEEN 80 și 7,5 g Squalan adus la 50 ml cu PBS. Pluronic/TWEEN: 1,875 g Pluronic L121 și 0,300 g TWEEN 80 adus la 50 ml cu PBS.

RO 120065 Β1

Pluronic/Squalan: 1,875 g Pluronic L121 și 7,5 g Squalan adus la 50 ml cu PBS. 1

Probele au fost prelucrate apoi printr-un aparat de microfluidizare, model 110 T, Microfluidics corp, închise în sticle și depozitate la 4°C, până la folosire. 3

S-a cântărit ovalbumină (Sigma, MO) și s-a adus la o soluție 0,3 mg/ml în HBSS (Wittaker, de mai sus). Soluția stoc 0,3 mg/ml a fost combinată cu formularea de două corn- 5 ponente, în următoarele cantități: 5 părți soluție 0,3 mg/ml ovalbumină, 3,3 părți formularea din două componente și 1,7 părți HBSS. 7

Formularea a fost agitată și a fost păstrată pe gheață până când s-a injectat. Toate soluțiile au fost combinate chiar înainte de injectare. 9

Fiecare șoarece a primit 200 μΙ, dintr-o formulare care conține 30 μΙ de ova, prin injectare în ambele tălpi din spate, și orice soluție, care a rămas, a fost injectată subcutanat, 11 la baza cozii. Șoarecii au fost lăsați în repaus, timp de 2 până la 4 sătămâni, înainte de prelevarea splinei. 13

La două săptămâni după imunizări au fost preparate celule splenice și au fost stimulate in vitro cu EG7-OVA iradiată. După 5 zile de cultură în prezența de CTL specific, 15 ova s-a măsurat prin testare față de ⁵¹Cr-EG7-ova sau ⁵¹Cr-EL4. într-un test de eliberare de ⁵¹Cr,timp de 4 h. Datele prezentate în fig. 8...10 demonstrează că Ovalbumină formulată în 17 sistemul de două componente microfluidizate, poate iniția in vivo CTL specific ova.

în continuare, a fost evaluată contribuția relativă a componentelor individuale, pentru 19 capacitatea lor de a induce CTL când au fost combinate cu antigene proteină. în scopurile imunizării, antigenul solubil a fost amestecat cu excipienți microfluidizați, pentru a obține o 21 emulsie omogenă stabilă, cu particule de mărimea în domeniul de la 250...300 nm. Pentru a defini suplimentarcomponentele formulării Squalan-Tween 80-Pluronic (STP) responsabilă 23 pentru inducere CTL, au fost imunizați șoareci cu ova în amestec Squalan-Tween 80 (ST), amestec Pluronic-Tween 80 (PT) sau amestec Squalan-Pluronic (SP) și drept control în 25 Squalan (S), Tween 80 (T) sau Pluronic (P). De asemenea, șoarecii au fost imunizați cu ovaSAFm (care conține 70 pg de MDP) sau ova-alum ca adjuvanți de control. Pentru un control 27 pozitiv, șoarecii au fost imunizați cu celule splenice încărcate citoplasmic cu ova solubilă. S-au folosit, de asemenea, alte combinații și substituții și rezultatele sunt prezentate în 29 tabelul 1.

Pentru detectarea studiilor de inițiere CTL, șoarecii au fost imunizați o dată. Două 31 săptămâni după imunizare, celulele splenice au fost amestecate cu EG7-ova (celule EL4 care exprimă ova), timp de 5 zile și au fost testate față de ⁵¹Cr-EG7-ova sau celule ⁵¹Cr-EL4. 33

Rezultatele (fig. 11) demonstrează că 30 pg de ova în combinație cu STP sau ST inițiază la șoareci răspuns CTL restricționat clasa I. Inițierea CTL specifice ova prin ova în STP sau prin 35 ova în ST apare a fi mai bună decât cea indusă prin celule splenice încărcate citoplasmic cu ova solubilă. Ova în PT sau SP a putut să inducă răspunsuri CTL specifice ova la șoareci, 37 dar inconsistente și slabe. Spre deosebire de SAFm, adăugarea de MDP, la formularea ST, nu cuprinde inducerea de CTL specific ova la șoareci (tabelul 2). Nu s-a întâlnit nici o 39 inducere CTL specifică ova când șoarecii au fost imunizați cu ova amestecată cu componentele individuale S, P sau T, nici când șoarecii au fost imunizați cu ova-SAFm sau ova-alum. 41 Șoarecii imunizați cu mai mult de 1 mg ova în HBSS, în (b) SAFm sau (c) absorbit la Alum, nu inițiază CTL specific ova. 43

RO 120065 Β1

Inducerea răspunsului CTL specific ova nu este blocat prin ST+MDP

Tabelul 2

	Citotoxicitate % la șoareci imunizați cu*
					Ova-ST-	Ova-ST-
Stimulator	Țintă**	E-T	Ova-	Ova-ST	MDP	MDP
EG7-ova	EG7-ova	100:1	ST	100	300 pg	12 pg
		33:1	0	86	șoarece	șoarece
		11:1	0	33	82	76
		3:1	0	6	67	62
		1:1	0	0	39	25
		3:1	0	0	13	3
			0		0	0
					0	0

* șoarecii au fost imunizați cu 30 pg ova în diverse formulări.

** % citotoxicitatea a fost calculată prin scăderea procentului de moarte față de linii de celule care nu exprimă antigen.

Exemplul 7. Componente necesare pentru producerea anticorpului specific ova.

Au fost imunizați șoareci de trei ori, la intervale de 2 săptămâni, cu 30 pg de ova în HBSS, STP, ST, PT sau SP. Drept control pozitiv, șoarecii au fost imunizați, de asemenea, cu ova-SAFm, deoarece SAFm este cunoscut că induce un răspuns anticorp puternic. Șapte zile, după a doua și a treia imunizare, s-a prelevat sânge de la șoareci și serurile au fost testate pentru răspuns anticorp specific ova. Rezultatele sunt arătate în tabelul 3. Ele arată că șoarecii imunizați cu anti-ova în STP, ST sau SAFm prezintă răspunsuri anti-ova după 2 imunizări.

Inducerea răspunsului anticorp anti-ova

Tabelul 3

Formulare 30 ug ova/animal	# șoareci care răspund/ # șoareci injectați	1/diluție titru seruri
HBSS	0β	<1/20, <1/20, <1/20
STP	3β	<1/4860, >1/4860,
ST	3β	>1/4860, >1/4860,
PT	NA*	NA, NA, NA
SP	NA	NA, NA, NA
SAF-M	3β	1/4860, 1/4860, 1/4860

* NA neaccesibil

Exemplul 8. Inducerea CTL specifice gp120 HIV.

S-a folosit gp120 IIIB HIV ca un al doilea sistem antigen pentru inducerea CTL în STP, ST sau MP-T. Șoarecii au fost imunizați cu 1 pg de gp120 lllb în HBSS, STP, PT sau în ST. Drept control, șoarecii au fost imunizați cu 1 pg gp120lllb în SAFm sau CFA(adjuvant Freund complet), sau în sistem de adjuvant RIBI care conține MPL (lipida A monofosforil) și TDM (dimicolit de trehaloză). Trei săptămâni după imunizare, au fost preparate celule splenice și au fost stimulate in vitro, cu celule 15...12 transfectante tratate cu mitomicină sau cu peptidă 18111b. După cinci zile de cultură, celulele efectoare rezultante au fost testate față de Vacc/n/a^pIGOIIIb sau celule țintă celule P815 infectate cu Vaccinia parentală. Rezultatele demonstrează că formularea gp120-Squalane-TWEEN 80 și nu formularea gp120Squalane-TWEEN 80 Pluronic sau gpl20-HBSS a indus răspuns CTL specific la șoareci (tabelul 4).

Tabelul 4

RO 120065 Β1

Inducerea răspunsului CTL specific gp!20, la șoareci

	Citotoxicitate% la șoareci imunizați cu*
Stimulator	Țintă**	E-T	gpl20-HBS	qpl20-ST	gpl20-STP
18lllb/IL2	vac:120	100:1	23	42	NA***
		33:1	23	38	NA
		11:1	0	0	NA
		3:1	0	35	NA
18lllb/IL2	15-20	100:1	0	50	0
		33:1	0	35	0
		11:3	0	27	0
		3:1	0	18	0
18lllb/IL2	3T3+18lllb	100:1	0	59	13
		33:1	0	59	2
		11:1	0	57	0
		3:1	0	29	0
15-12	VACOG120	100:1	35	84	NA
		33:1	19	65	NA
		11:1	12	37	NA
		3:1	0	22	NA
		1:1	0	0	NA

*șoarecii au fost imunizați cu 1 pg de gp120III în diverse formulări **% citotoxicitatea s-a calculat prin scăderea procentului de deces față de linile de celule care nu exprimă antigen ***NA neaccesibil

Exemplul 9. Inducerea de răspuns tumoral specific gp120 la șoareci.

Pentru inducerea răspunsurilor tumorale specifice gp120, s-au imunizat șoareci cu 1 pg de gp120llb de trei ori, la intervale de 2 săptămâni. De la animale, s-a prelevat sânge și s-a testat pentru prezența anticorpilor IgG care detectează gp120IIIb, într-un test ELISA, în fază solidă. Rezultatele demonstrează că gp120-ST este un imunogen mai bun decât gp120-HBSS, gp120SAFm (tabelul 5) sau gp120-STP.

Inducerea răspunsurilor anticorp anti-gpl20

Tabelul 5

Formulare 1 ug gpl20/animal	# șoareci care răspund/ # șoareci injectați	1/diluție titru ser
HBSS	0β	<l/20, <l/20, <1/20
STP	1β	<1/20, >1/4860, <1/20
ST	3β	>1/4860, >1/4860, >1/4860
PT	3β	>1/4860, >1/4860, >1/4860
SP	2β	<1/20, 1/540, 1/540
SAF-M	2β	1/180, >1/4860, 1/540

Exemplul 10. Răspunsuri anticorp specifice gp120, la maimuțe.

S-au imunizat maimuțe (2 per grup) cu gp120-SAFm, gp120-SPT, gp120-ST sau gp120-HBSS. Drept control, s-a imunizat un grup de maimuțe cu Vaccinia recombinantă

RO 120065 Β1 care conține gp160 lllb. Maimuțele au fost imunizate la intervale de 2 săptămâni și li s-a prelevat sânge la două săptămâni și trei săptămâni, după a doua imunizare. Seruri pre- și imune de maimuță s-au diluat steril și s-a cercetat activitatea anti-gp120, într-un test ELISA, așa cum s-a descris în materiale și metode. Datele (fig. 12) arată că maimuțele imunizate cu gp120-STP sau gp120-SAFm au indus răspunsuri similare la maimuțe. O maimuță imunizată cu gp120-ST a indus răspuns anti-gp 120 similar grupului imunizat gp 120-SAFm sau gp120SPT. O maimuță imunizată cu gp 120-SPT nu a indus un răspuns puternic anti-gp120 după două imunizări.

Exemplul 11. Activitatea in vivo a AF în combinație cu HPV 16 E7.

1. Generarea proteinei HPV 16 E7 recombinante pentru imunizare.

a) PCR și donarea genei E7.

Gena HPV 16 E7 s-a donat de la o plasmidă donată de la dr. Karen Voudsen (Ludwig Institute), care codifică gena E7 derivată de la linia de celule carcinomice CaSKi. Regiunile codificatoare s-au amplificat prin PCR, folosind primeri care codifică capetele 5' și 3' ale genelor flancate prin situsurile de donare Bam HI și Sal I. Produsul PCR E7 s-a ligat în vectorul de expresie pGEX-4T-l (Pharmacia Biotech), rezultând plasmida de expresie pGEX.E7. S-a transfectat E. coli, tulpină XLI-blue (Stratagene) cu plasmida de expresie pGEX.E7. Secvența E7 s-a obținut de la plasmidele din coloniile rezultate și a fost identică secvenței obținute din celule CaSKi.

b) Producerea și purificarea E7 exprimată bacterian.

Plasmida de expresie bacteriană pGEX. E7 codifică o proteină de fuziune glutation-Stransferază (GST) care constă din GST la capătul aminoterminal, un situs de clivare a trombin proteazei și proteina E7, la capătul carboxil. Proteina E7 a fost produsă și purificată, așa cum a fost descrisă in literatura de informare de la producătorul vectorului pGEX-4T-l (Pharmacia Biotech). Pe scurt, bacteriilor care conțin plasmida de expresie pGEX.E7, le-a fost indusă capacitatea de a exprima proteina de fuziune, prin adăugare de izopropil /?-D-tiogalactozidază, în mediul de cultură. Celulele au fost recoltate și Uzate prin sonicare blândă a Uzatului aflat, aplicat la Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). După legarea proteinei de fuziune la matrice, rășina a fost spălată pentru îndepărtarea proteinelor legate nespecific. Proteina de fuziune legată a fost digerată cu trombină, pentru eliberarea proteinei E7 din partenerul de fuziune GST.

Preparatul de proteină E7 a fost analizat prin SDS-PAGE și concentrația proteinei E7 a fost determinată prin analiză Bradford (BioRad). S-au obținut 9 mg de proteină E7 solubilă pe litru de cultură bacteriană.

2. Generarea transfectantului X21 E7.

Secvențele codificatoare pentru proteina HPV16 E7 (vezi mai sus) au fost inserate în plasmida de expresie eucariotă INPEP4, proprietatea IDEC. în acest vector, expresia E7 este controlată de elemente transcripționale promotor/intensificator Cytomegalovirus. Suplimentar, primele trei nucleotide ale secvenței de codificare E7 au fost îndepărtate și înlocuite cu o secvență lider de lanț ușor de imunoglobulină, plasat imediat în amonte și în cadru cu regiunea de codificare E7. După transfecție, în linia de celule de șoarece X21, au fost examinate clone individuale rezistente G418 prin analize Northem bloot pentru mesajul de producere E7. Fiecare clonă a prezentat mesaj E7 detectabil. Apoi s-a realizat analiza Western bloot a lizatelor celulare, de la două din aceste clone, 4E7 și 1C7 (HOPE1 și respectiv HOPE2) și s-a demonstrat producerea proteinei E7.

3. Activitatea in vivo a imunizării antigen solubil E7/AF.

în aceste studii, s-au folosit șoareci femelă de fundal C3H (H2^Wk, Harlan Sprague

RO 120065 Β1

Dawley). Animalele au fost menținute conform Guide for the Care and Use of Laboratory 1 Animals (DHHS Publication No. NIH 86-23, Bethesda, MD:NIH, 1985) și au primit hrană și apă la discreție. în aceste studii, s-a folosit linia de celule transfectante E7 HOPE2 H2^k/k. 3 Linia de celule tumorale s-a menținut prin pasaj serial in vitro.

Această linie de celule s-a dovedit a menține expresia antigenului citoplastic E7, așa 5 cum s-a detectat prin analiză Western bloot, care s-a repetat în pasajele in vitro. S-au inițiat tumori în șoareci C3H singeneici, prin injectarea subcutanată a 150 000 celule trecute in 7 vitro.

Tumorile s-au măsurat în 2 direcții perpendiculare, la intervale bisăptămânale. 9 Volumul tumorii (V) s-a calculat conform formulei următoare:

V(mm³) = (L x W²) împărțit la 2, unde: 11

L = cea mai lungă axă măsurată în mm;

W = axa perpendiculară (mm). 13 în tabelul 6 sunt prezentate date, ca tumoare de la șoareci (numărul de animale care poartă tumori față de numărul total al animalelor injectate). în fig. 13 și 14, sunt prezentate 15 date, ca mărimea medie a tumorii (mm³), ale fiecărui tratament sau grup de control. Fiecare grup de tratament s-a comparat cu un grup de control care nu a primit tratament. Terapia a 17 început la 10 zile după incubarea celulelor HOPE2, când majoritatea tumorilor au fost palpabile (aproximativ 50...75 mm³). Terapia s-a inițiat prin imunizarea șoarecilor cu proteină E7 19 solubilă în AF sau adjuvanți Alum (subcutanat într-un volum total de 0,2 ml). Direct, înaintea imunizării, AF s-a amestecat 60 s, cu proteină E7, în soluție de săruri echilibrate Hanks 21 (HBSS), astfel încât fiecare șoarece a primit fie 30 pg, fie 90 pg în 0,2 ml proteină E7. Alum (Pierce Chemical Co.) s-a amestecat cu proteina E7 conform instrucțiunilor de fabricare, ast- 23 fel încât fiecare animal a primit în 0,2 ml 90 pg proteină E7 per șoarece. Animalele din al doilea grup de tratament au primit o a doua imunizare, 9 zile mai târziu (19 zile după inocularea 25 celulei tumorale). S-au preparat, imediat înaintea inoculării, imunizări rapel, așa cum s-a descris mai sus. 27 în acest exemplu (tabelul 6, Xp # 233), la 41 zile după inocularea celulei tumorale, numai 4/8 și 5/8 dintre șoareci, care au primit o singură injecție de E7 solubilă în AF (30 pg 29 sau, respectiv, 90 pg), au avut tumori măsurabile. Din contră, toți șoarecii imunizați cu proteină E7 în Alum (8/8) au avut tumori în creștere activă. Suplimentar, așa cum s-a arătat în 31 fig. 13, s-a observat inhibarea semnificativă a creșterii tumorii numai în grupurile de tratament imunizate cu proteină E7 în AF comparativ cu controlul (netratat) sau grupurile de trata- 33 ment cu alum. Inhibarea creșterii tumorii (fig. 13) sau viteze crescute de regresie a tumorii (tabelul 6) nu s-au observat la șoarecii care au primit o singură injecție de E7 în Alum. 35

Rezultate similare au fost observate, de asemenea, folosind grupuri de tratament care au primit 2 imunizări la zilele 10 și 19, după provocarea tumorii (tabelul 6 și fig. 16), deși 37 s-a observat ceva întârziere a creșterii tumorii la șoarecii care au primit 2 injecții de E7 în Alum. 39

Rezultatele arată că activitatea antitumorală semnificativă, așa cum s-a măsurat printr-o descreștere a numărului de tumori, pe care le au șoarecii și inhibarea creșterii tumo- 41 rii, s-au observat după imunizare de E7 solubilă în AF. Din contră, toate animalele imunizate fie cu o injecție unică, fie cu o injecție dublă de proteină E7 solubilă în Alum au avut tumori 43 în creștere. în concluzie, imunizarea cu proteină E7 solubilă în AF a avut ca rezultat o inhibare semnificativă a creșterii celulei tumorale, care nu s-a observat folosind imunizarea E7 45 solubilă în Alum.

RO 120065 Β1

Activitate antitumorală a imunizării E7 solubilă în adjuvant

Tabelul 6

Exp. #	Tratament	Doză (ug/șoarece)	Animale³ cu tumoare ziua 41
223	Control	-	7/8
223	E7 în AF	30 ug x l^b	4/8
223	E7 în AF	90 ug x 1	5/8
223	E7 în Alum	90 ug x 1	8/8
223	E7 în AF	30 ug x 2^C	3/8
223	E7 în AF	90 pg x 2	1/4
223	E7 în Alum	90 ug x 2	8/8

a Numărul de șoareci purtători de tumori/număr total inoculați b Toate imunizările au început în ziua 10 după implant c A doua imunizare (x 2) în ziua 19 după implant

Claims

Revendicări

1. Compoziție care cuprinde un antigen de Papillomavirusvn amestec cu o formulare microfluidizată de antigen, care include:

(a) un detergent de stabilizare, (b) un agent de formare a micelelor, și (c) un ulei biodegradabil și biocompatibil, numita formulare de antigen fiind formulată ca o emulsie stabilă ulei-în-apă, numita formulare de antigen fiind substanțial fără peptide imunostimulatoare și în care numita compoziție, prin administrare la un animal ales din grupul format din oameni, animale domestice și animale de tracțiune, este aptă de a induce un răspuns citotoxic T-limfocitar specific față de antigenul de Papillomavirus conținut în compoziție.
2. Compoziție conform revendicării 1, în care antigenul de Papillomavirus este un antigen de Papillomavirus uman.
3. Compoziție conform revendicării 2, în care antigenul de Papillomavirus este ales din grupul format din antigenele L1, E4, E6 și E7.
4. Compoziție conform revendicării 3, în care antigenul Papillomavirus este ales din grupul format din antigenul HPV16 E6,1 antigenul HPV16 E7, antigenul HPV18 E6, antigenul HPV18 E7, antigenul HPV6 E4, antigenul HPV6 L1, antigenul HPV11 E4 și antigenul HPV11 L1.
5. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care detergentul este ales din grupul format din Tween (polisorbat) 80, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Zwittergent 3-12, Teepol HB7 și Spân 85.
6. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care cantitatea de detergent în formularea microfluidizată de antigen este în intervalul de la 0,05 până la 0,5%.
7. Compoziție conform revendicării 6, în care cantitatea de detergent în formularea microfluidizată de antigen este de aproximativ 0,2%.

RO 120065 Β1
8. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care agentul de 1 formare a micelelor este ales din grupul format din Pluronic L121 (poloxamer401), Pluronic L62LF, Pluronic L101, Pluronic L64, PEG1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic 701, 3

Tetronic 901, Tetronic 1301 și Tetronic 130R1.
9. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care agentul de 5 formare a micelelor are un raport hidrofil/lipofiI între 0 și 2.
10. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care cantitatea 7 agentului de formare a micelelor în formularea microfluidizată de antigen este în intervalul de la 0,5 la 10%. 9
11. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care uleiul este ales din grupul format din Squalen, Squalan, Eicosan, Tetratetracontan pristan, glicerina și 11 uleiuri vegetale.
12. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care uleiul are 13 o temperatură de topire mai mică de 65°C.
13. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care cantitatea 15 de ulei, în formularea microfluidizată de antigen, este în intervalul de la 1 la 10%.
14. Compoziție conform revendicării 13, în care cantitatea de ulei, în formularea 17 microfluidizată de antigen, este în intervalul de la 2,5 la 5%.
15. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care detergentul19 este ales din grupul format din Tween 80, Tween 20 și Tween 40; uleiul este ales din grupul format din scualan, eicosan și pristan și agentul de formare a micelelor este ales din grupul21 format din Pluronic L121 și Pluronic L62LF.
16. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care formularea23 microfluidizată de antigen constă, în principal, din numitul detergent, agent de formare a micelelor și ulei.25
17. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, în care detergentul este Tween 80 și agentul de formare a micelelor este Pluronic L121.27
18. Compoziție conform revendicării 17, în care uleiul este scualan.
19. Compoziție conform cu oricare dintre revendicările anterioare, care nu conține o 29 peptidă imunostimulatoare.
20. Utilizare a compoziției, conform cu oricare dintre revendicările 2...4, pentru fabri- 31 carea unui medicament pentru tratamentul cancerului cervical.
21. Utilizare a compoziției conform cu oricare dintre revendicările 2...4, pentru fabri- 33 carea unui medicament pentru tratamentul Condyloma acuminata.