SK71397A3 - Pharmaceutical compositions inducting cytotoxic t-lymphocyte response - Google Patents

Pharmaceutical compositions inducting cytotoxic t-lymphocyte response Download PDF

Info

Publication number
SK71397A3
SK71397A3 SK713-97A SK71397A SK71397A3 SK 71397 A3 SK71397 A3 SK 71397A3 SK 71397 A SK71397 A SK 71397A SK 71397 A3 SK71397 A3 SK 71397A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
composition
antigen
protein
antigenic
oil
Prior art date
Application number
SK713-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Syamal Raychaudhuri
William H Rastetter
Original Assignee
Idec Pharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idec Pharma Corp filed Critical Idec Pharma Corp
Publication of SK71397A3 publication Critical patent/SK71397A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/892—Reproductive system [uterus, ovaries, cervix, testes]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobov a kompozícii použiteľných na indukciu odpovedí sprostredkovaných cytotoxickými T-lymfocytmi u ľudí a domácich alebo hospodárskych zvierat.
Doterajší stav techniky
Predpokladá sa, že cytotoxické T-lymfocyty (CTL) sú hlavným obranným mechanizmom hostiteľa pri odpovedi na najrôznejšie vírusové infekcie a neoplastický alebo rakovinový rast buniek. Tieto cytotoxické T-lymfocyty ničia infikované alebo pozmenené bunky. Infikované alebo pozmenené bunky na svojom povrchu vystavujú v komplexoch s rôznymi molekulami (nazývanými MHC molekuly I.triedy) množstvo fragmentov najrôznejších antigénov, podľa ktorých sú tieto bunky rozpoznávané príslušnými CTL. Experimentálne môžu byť CTL indukované prostredníctvom špecifických buniek, do ktorých cytoplazmy sú dodané určité rozpustné antigény. Imunizácia samotným rozpustným antigénom obvykle nedostačuje ku špecifickej indukcii cytotoxických T-lymfocytov.
Jedným zo spôsobov, ktoré môžu byť použité na indukciu odpovedi CTL, je využitie techník génového inžinierstva, Pri ktorých sú do genómu neškodného infekčného agens inkorporované časti príslušného antigénu. Cieľom takejto stratégie je generovať antigén-špecifickú odpoveď cytotoxických T-lymfocytov proti požadovanému epitopu tým, že vystavíme hostiteľa neprenosnej infekcii s miernym priebehom. Boli opísané chimérické vektory, ktoré ako neškodné infekčné agens využívajú vírusy vakcínia, poliovírusy, adenovírusy a retrovírusy a tiež baktérie ako napríklad baktéria rodu
Listeria alebo BCG. Napríklad Takahashi- a ďalší, 85 Proc.
Natl. Acad. SSci. USA 3105, 1988 opisuje použitie rekombinantného vírusu vakcinia exprimujúceho gén gpl60 vírusu
HIV, ktorý slúži ako potenciálny nástroj na indukciu cytotoxických T-lymfocytov.
Pri inom spôsobe, ktorý sa môže použiť na indukciu bunkovo sprostredkovanej imunitnej odpovede, sa využíva určitých adjuvans. Zatiaľ čo súčasná odborná literatúra sa vo veľkej miere venuje diskusiám týkajúcim sa využívania adjuvans, nie vôbec zrejmé, či používanie adjuvans môže indukovať bunkovo sprostredkovanú imunitnú odpoveď a ak áno, potom či takáto bunkovo sprostredkovaná imunitná odpoveď v sebe zahŕňa cytotoxickú odpoveď T-lymfocytov. V nasledujúcom texte sú viacmenej uvedené príklady najrôznejších publikácií z tejto oblasti.
Stover a ďalší, 351 Náture 456, 1991 opisuje odpoveď CTL na prítomnosť β-galaktozidázy na použitie rekombinantných baktérií BCG nesúcich gén pre β-galaktozidázu. Pri použití β-galaktozidázy spolu s neúplným Freundovým adjuvans nebola taká odpoveď CTL vôbec detekovaná.
Mitchell a ďalší, 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 (táto publikácia nemusí obsahovať najnovšie poznatky súvisejúce s patentom) opisuje liečbu pacientov trpiacich metastázujúcim melanómom s použitím adjuvans nazývaným DETOX a allogénnych lyzátov melanómu, ktoré boli pacientom podávané celkom päťkrát v priebehu šiestich týždňov. Pri malej časti zo skupiny pacientov bolo pozorované zvýšenie cytolytickej aktivity T-buniek. Autori opisujú nevyhnutnosť zvýšiť množstvo kombinovanou terapiou, ktorá využíva adjuvans spolu s interleukínom-2, a súčasťou ktorej je tiež predbežné pôsobenie cyklofosfamidom, účelom ktorého je znížiť množstvo supresorových T-buniek (ktoré možno existujú) špecifických pre daný nádor. DETOX sa skladá z detoxifikovaného endotoxínu (monofosfát lipidu A) z baktérií Salmonella minnesota, bunkových stien baktérií Mycobacterium phlei, skvalénového oleja a emulzifikátora.
Allison a Gregoriadis, 11 Immunology Today 427, 1990 (táto publikácia nemusí obsahovať najnovšie poznatky súvisejúce s patentom) poznamenáva, že jediným adjuvans schváleným na použitie pri vakcinácii ľudí sú soli obsahujúce hliník (hlinité soli - Alim), ktoré zaručene nevyvolávajú bunkovo sprostredkovanú imunitnú ' odpoveď. Allison a Gregoriadis tvrdí že je teda nevyhnutné vyvinúť adjuvans, ktoré majú rovnakú účinnosť ako kompletné účinky kompletného Freundovho adjuvans, akými je napríklad tvorba granulómov. Ďalej potom pokračujú tvrdením, že existujú tri využiteľné stratégie, napríklad: použitie lipozómov; použitie adjuvans nazývaných imunostimulačné komplexy (ISCOM immunostimulating complexes, ktoré obsahujú saponín alebo
Quil A [triterpén s tromi sacharidovými reťazcami], cholesterol a fosfatidylcholín) ,· ktoré sú schválené na použitie pri vakcinácii proti chrípke koní (Morein a ďalší, Immunological Adjuvants and Vaccines, Plénum Press, 153); a použitie emulzií (SAF) skvalénu alebo skvalánu (s alebo bez kopolyméru pluronic) a muramyl dipeptidu (MDP - muramyl dipeptide) . Tvrdí sa, že SAF vyvoláva u myší bunkovo sprostredkovanú imunitnú odpoveď, aj keď sa dlhú dobu predpokladalo, že podjednotkové antigény nemôžu indukovať odpoveď cytotoxických T-buniek.
Takahashi a ďalší, 344 Náture 873, 1990 opisuje indukciu pomocných T-lymfocytov, ktoré rozpoznávajú antigén v kontexte MHC glykoproteínov II. triedy, a cytotoxických T-lymfocytov prostredníctvom ISCOM. Túto indukciu možno u myší dosiahnuť jedinou subkutánnou imunizáciou. Takahashi a ďalší, 344, Náture 873, 1990 ďalej tvrdí, že použitie
Freundovho adjuvans, nekompletného Freundovho adjuvans a fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrom nevedie k indukcii cytotoxickej aktivity T-lymfocytov proti cieľovým bunkám, proti ktorým mala byť táto cytotoxická aktivita namierená. Ďalej tvrdí, že na rozdiel od výsledkov, experimentov, pri ktorých sa použili exogénne rozpustné proteínové antigény v inej forme, ich skupina dokázala, že sa môže použiť exogénny intaktný protein v kombinácii s ISCOM na imunizáciu vedúcu k primárnej aktivácii CD8+ CD4cytotoxických T-lymfocytov, ktoré rozpoznávajú antigén v kontexte s MHC giykoproteínmi I. triedy. Táto skupina tiež tvrdí, že je možné s použitím ISCOM obsahujúcich proteiny vírusu HIV, vyvolať u ľudí odpoveď CTL, a že použitím vakcín na báze ISCOM sa môže dosiahnuť dlho hľadaný cieľ, ktorým je súčasná indukcia odpovede CTL a indukcia tvorby protilátok s použitím purifikovaného proteínu.
Byars a Allison, 5 Vaccines 223, 1987 opisujú použitie SAF-1, ktoré obsahuje Tween 80, PLURONIC L121 a skvalén alebo Skvalán, v kombinácii s alebo bez muramyl dipeptidu. Ich dáta naznačujú, že prípravok obsahujúci muramyl dipeptid bude vhodný na prípravu vakcín použiteľných vo veterinárstve. Pri druhej imunizácii (pripomínacia dávka) sa použilo adjuvans bez muramyl dipeptidu. Zdá sa, že použitie muramyl dipeptidu podstatne zvyšuje produkciu protilátok v porovnaní s použitím adjuvans bez muramyl dipeptidu. Bunkovo sprostredkovaná imunita bola meraná kožnými testami ako precitlivenosť oneskoreného typu; cieľom tohoto merania bolo stanoviť, či došlo k aktivácii pomocných T-buniek. Ak bol ako súčasť adjuvans prítomný muramyl dipeptid, potom bola táto precitlivenosť oneskoreného typu silnejšia a dlhšie trvajúca. Podobné adjuvans sú opísané v Allison a ďalší, Patent Spojených Štátov Amerických 4770874 (opisuje vyvolanie silnej bunkovo sprostredkovanej a humorálnej odpovede proti vaječnému albumínu pomocou zmesi muramyl dipeptidu a polyolu PLURONIC); v Allison a ďalší, Patent Spojených Štátov Amerických 4772466; v Murphy-Corb a ďalší, 246 Science 1393, 1989 (opisuje použitie kombinovaných adjuvans s muramyl dipeptidom, ktoré môže zosilniť indukciu ako humorálnej imunitnej odpovede tak aj bunkovo sprostredkovanej imunitnej odpovede); v Allison a Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (bunkovo sprostredkovaná imunita je indukovaná pri použití SAF (s muramyl ^dipeptidom), čo bolo dokázané existenciou precitlivenosti oneskoreného typu, zvýšenou proliferáciou T-buniek za prítomnosti antigénu, produkciou interleukínu-2 a špecifickou lýzou cieľových buniek, ktoré niesli antigén použitý na imunizáciu); v Allison a Byars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Caccine Adjuvants and Modulators of Non-specific Resistance, strany 191 až 201, 1987; v Morgan a ďalší, 29 J. Medical Virology 74, 1989; v Kenney a ďalší, 121 J. Immunological Methods 157, 1989; v Allison a Byars, 954 J. Immunological Methods 157, 1986 (kde sa dokázalo, že hlinité soli a emulzie minerálnych olejov zvyšujú produkciu protilátok, ale neovplyvňujú bunkovo sprostredkovanú imunitu); v Byars a ďalší, 8 Vaccine 49, 1990 (táto publikácia nemusí obsahovať najnovšie poznatky súvisejúce s patentom; kde je povedané, že nimi použité adjuvans podstatne zvyšuje humorálnu imunitnú odpoveď a menšou mierou zvyšuje bunkovo sprostredkované reakcie proti hemaglutinínovému antigénu vírusu chrípky); v Allison a Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (táto publikácia nemusí obsahovať najnovšie poznatky súvisejúce s patentom; kde je povedané, že úlohou muramyl dipeptidu je indukovať expresiu cytokínov a zvýšiť expresiu génov kódujúcich veľké histokompatibilné komplexy (MHC); a že s týmto adjuvans sa získali lepšie humorálne a bunkovo sprostredkované odpovede, ako tomu bolo pri použití iných adjuvans, a že sa, dúfajme, zistí, či sú podobné stratégie účinné aj u ľudí); v Allison a Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (kde je opísaná indukcia bunkovo sprostredkovanej imunity s použitím SAF) ; v Epstein a ďalší, 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (táto publikácia poskytuje prehľad najrôznejších adjuvans používaných pri príprave vakcín); v Allison a Byars, 95, J. Immunological Methods 157, 1986 (kde je povedané, že pridanie muramyl dipeptidu k adjuvans spôsobuje značné zosilnenie bunkovo sprostredkovaných odpovedí na prítomnosť najrôznejších antigénov, vrátané monoklonálnych imunoglobulínov a virálnych antigénov); a v Morgan a ďalší, 29 J, Medical Virology 74, 1989 (kde je opísané použitie SAF-1 na prípravu vakcíny proti Epstein-Barrovej vírusu).
Kwak a ďalší, Idiotype Networks in Biology and Medicíne, Elsevier Science Publishers, strana 163, 1990 (táto publikácia nemusí obsahovať najnovšie poznatky súvisejúce s patentom) opisuje použitie SAF bez muramyl dipeptidu ako adjuvans na idiotyyp lymfómu B-buniek u ľudí. Presnejšie povedané, spolu s príslušným idiotypom bola administrovaná emulzia obsahujúca polymér Pluronic L121, Skvalán a 0,4% Tween-80 vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom. V tejto publikácii sa tvrdí, že ”prídavok nejakého adjuvans môže ďalej zosilniť . . . humorálne odpovede a môže tiež uľahčiť indukciu bunkovo sprostredkovaných odpovedí”.
Medzi iné imunologické prípravky patria lipozómy (Allison a ďalší, patenty US 4053585 a 41171113); cyklické peptidy Dreesman a ďalší, patent US 478784); Freundovo kompletné adjuvans (Asherson a Ďalší, 22 Immunology 465, 1972; Berman a Ďalší, 2 International J. Cancer 539, 1967;
--Allison 18 Immunopotentiation 73, 1973; a Allison,
Non-Specefic Factors Influencing Host Resistance 247, 1973);
adjuvans tvorené minerálnym olejom, povrchovo aktívnym činidlom a Tweenom 80, obsahujúce neiónové blokové polyméry (Hunter a Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; a Hunter a ďalší, 127 J. Immunology 1244, 1981); adjuvans tvorené minerálnym olejom a emulzifikujúcim činidlom v kombinácii s alebo bez mŕtvych mykobaktérií (Sanchez-Pescador a ďalší, 141 J.Immunology 1720, 1988)+, a iné adjuvans ako napríklad lipofilné deriváty muramyl tripeptidu a muramyl dipeptid kovalentne spojený s rekombinantným proteinom.
I
Podstata vynálezu
Prihlasovateľ vynašiel bezpečný ä výhodný spôsob a bezpečné a výhodné kompozície, s ktorých využitím môžu byť u ľudí a domestikovaných alebo hospodárskych zvierat indukované imunitné odpovede STL. Tento spôsob zahŕňa ' použitie antigénneho prípravku, ktorý je pre živočíchy veľmi málo alebo dokonca nie je vôbec toxický, a ktorý neobsahuje žiadny imunostimulačný prítomnosť by sprostredkovanej veľmi jednoduché rozsiahle činnosti peptid (napríklad muramyl dipeptid) , ktorého znížila odpovede.
nie je vykonávať intenzitu požadovanej bunkovo Použitie tejto metodológie je pri nej potrebné in vivo, pri ktorých sú technik pozmeňované bunky zvýšenia ich antigenicity. Tento objav je veľmi pretože sa nepredpokladalo, že použitie týchto rekombinantnžch DNA pomocou s účelom prekvapivý, antigénnych prípravkov neobsahujúcich imunostimulačné peptidy alebo ich ekvivalenty, by mohlo indukovať odpoveď CTL. Tieto zistenia uskutočnené podávateľom patentu umožňujú použitie týchto antigénnych prípravkov ako činidiel použiteľných na prevenciu. Takéto antigénne prípravky môžu byť napríklad použité na liečbu vírusových ochorení, pri ktorých je ..dôležitá odpoveď CTL. Medzi takéto vírusové ochorenia patria napríklad infekcie vírusom HIV alebo chrípka; použitie týchto antigénnych prípravkov môže byť rozšírené aj na použitie pri liečbe bakteriálnych infekcií, rakoviny, infekcií spôsobených parazitmi prevenciu antigénom zmienených spôsobenej antigénneho a podobných ochorení. Ako činidlo použiteľné na antigénny prípravok spolu s pri prevencii obzvlášť môže byť použité vyššie, vírusom
HIV.
prípravku spolu š vírusových potom pri prevencii
Inou možnosťou je vhodným antigénom pri vhodným infekcií infekcie použitie prevencii u pacientov vystavených zvýšenému riziku vzniku rakoviny, napríklad u pacientov po resekcii primárneho nádoru.
Vynález opisuje spôsob slúžiaci na indukciu odpovede CTL u ludi alebo domestikovaných (napríklad mačiek alebo psov) alebo hospodárskych zvierat (napríklad . koní, hovädzieho dobytku alebo ošípaných). Táto odpoveď je namierená proti nejakému antigénu mimo antigénu lymfómu B-buniek a vaječnému albumínu. Tento spôsob sa skladá z krokov, pri ktorých je získaný antigén, proti ktorému chceme vyvolať odpoveď CTL, a ďalej tento spôsob poskytuje návod na prípravu antigénneho prípravku, ktorý obsahuje. Tento antigénny prípravok obsahuje, skladá sa alebo skladá sa takmer výhradne zo stabilizujúceho detergentu, činidla podporujúceho tvorbu miciel a biodegradovatelného a biokompatibilného oleja. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu neobsahuje tento antigénny prípravok zložku tvorenú imunostimulačným peptidom alebo obsahuje malé množstvo tejto zložky postačujúcej na to, aby nedošlo ku zníženiu požadovanej odpovede CTL. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je tento prípravok pripravený vo forme stabilnej emulzie oleja vo vode. To znamená, že každá z použitých zložiek je vybratá tak, aby sa daná emulzia udržala v emulzifikovanom stave počas najmenej jedného mesiaca a vo výhodnom uskutočnení vynálezu potom počas doby dlhšej než jeden rok, bez toho, aby došlo k oddeleniu fáz, Pri tomto .spôsobe sú antigén a antigénny prípravok zmiešané dohromady a výsledkom je vytvorenie zmesi (vo výhodnom uskutočnení vynálezu mikrofluidizáciou), ktorá je administrovaná do organizmu živočícha v množstve postačujúcom na indukciu odpovede CTL. Túto administráciu stačí uskutočniť iba raz.
Termínom stabilizujúci detergent rozumieme detergent, ktorý umožňuje jednotlivým zložkám emulzie zostať vo forme stabilnej emulzie. Medzi takéto detergenty patrí polysorbát 80 (Tween) (Sorbitan-mono-9-oktadekanoát-poly(oxy-1,2-etán diyl; produkt ICI Americas, Wilmington, DE), Tween 40, Tween 20, Tween 60, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7 a SPAN 85. Tieto detergenty sú obvykle používané v množstvách približne 0,05 až 0,5 %, vo výhodnom uskutočnení vynálezu potom v množstvách približne 0,2%.
Termínom činidlo podporujúce tvorbu miciél rozumieme činidlo, ktoré je schopné stabilizovať emulziu tvorenú inými zložkami takým spôsobom, že dôjde k vytvoreniu štruktúry podobnej micelám.
Takéto činidlá spôsobujú vo výhodnom uskutočnení vynálezu podráždenie v mieste, do ktorého sú injikované. Toto podráždenie spôsobuje infiltráciu makrofágov do miesta injekcie a tým zosilnenie bunkovo sprostredkovanej odpovede. Príkladom takýchto činidiel sú polymérne povrchovo aktívne látky PLURONIC L62LF, L101 a L64m PEG1000 a TETRONIC
1501, 150R1, 701, 901, 1301 s 130R1, opísané v publikáciách
BASD Wyandotte, napríklad Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977; a Hunter a ďalší, 129 J. Immunol. 1244, 1981.
Chemické štruktúry týchto činidiel sú v súčasnosti dobre známe. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je toto činidlo vybraté tak, aby sa jeho rovnováha na rozhraní hydrofilná látka-lipofilná látka (HLB-hydrophile-lipophile balance), ako je definovaná v článku Hunter a Bennett, 133 Journal of Immunology 3167, 1984, pohybovala v intervale 0 až 2. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je toto činidlo používané v --množstvách 0,5 až 10 %, výhodnejšie potom v množstvách medzi
1,25 až 5%.
Olej je vybratý za účelom podpory pri udržaní príslušného antigénu v emulzii oleja vo vode. To znamená, že olej vlastne slúži ako nosič príslušného antigénu. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu má tento olej teplotu topenia nižšiu ako 65 °C, takže emulzia je vytvorená buď pri izbovej teplote (približne 20 °C až 25 °C) alebo vo chvíli, keď je teplota emulzie znížená na hodnotu izbovej teploty. Príkladom takýchto olejov sú skvalén, skvalán, eikozán, tetra tetrakontán, glycerol a olej z búrskych orieškov alebo iné rastlinné oleje. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je tento olej používaný v nmožstvách 1 až 10 %, výhodnejšie potom v množstvách medzi 2,5 až 5 %. Je dôležité, aby bol zmienený olej biodégradovateľný a biokompatibilný, čo znamená, že za určitý časový interval je organizmus schopný tento olej degradovať, a žč pri použití nemá tento olej v organizme žiadne nežiadúce účinky, akými je napríklad tvorba granulómov.
U vyššie zmienených prípravkov je dôležité, aby tieto prípravky neobsahovali peptidovú zložku, obzvlášť potom, aby neobsahovali muramyl dipeptid (MDP). Ak bude takýto peptid administrovaný v prípravku do organizmu človeka v množstve väčšom ako 20 mikrogramov na jednu dávku, bude tento peptid interferovať s indukciou odpovede CTL. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu by takéto peptidy nemali byť vôbec prítomné v antigénnych prípravkoch, aj keď je zjavný ich pozitívny vplyv na stimuláciu humorálnej zložky imunitného systému. To znamená, že podávateľ patentu zistil, že napriek tomu, že tieto peptidy môžu zosilňovať humorálnu odpoveď, je ich použitie nevýhodné v ,prípadoch, keď je požadovaná indukcia odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
Vynález ďalej opisuje kompozície, v ktorých je antigénny prípravok tvorený len dvomi z troch vyššie zmienených zložiek .a tento prípravok je použitý spolu s . príslušným antigénom (týmto termínom označujeme proteíny, polypeptidy a ich fragmenty, ktoré sú imunogénne) , okrem vaječného albumínu (alebo iných albumínov, napríklad HSA-ľudského sérového albumínu, BSA-hovädzieho sérového albumínu a ovalbumínu), na indukciu odpovede CTL u vyššie zmienených zvierat alebo ľudí.
Prihlasovateľ verí, že pri použití u ľudí sú vyššie zmienené prípravky ďaleko výhodnejšie ako v súčasnosti používané prípravky (vrátane ISCOM, DETOX a SAF). Na rozdiel od týchto prípravkov známych zo stavu techniky je spoločným rysom prípravkov podľa vynálezu skutočnosť, že obsahujú činidlo podporujúce tvorbu miciel a zároveň neobsahujú žiadne peptidy, časti cytoskeletu alebo časti bakteriálnych buniek. Prípravky podľa vynálezu tiež indukujú takú odpoveď CTL, ku ktorej buď nedochádza pri použití prípravkov známych zo stavu techniky alebo je táto odpoveď CTL pri použití prípravkov podlá vynálezu značne silnejšia, ako je pri použití prípravkov známych zo stavu techniky.
Termínom netoxický rozumieme skutočnosť, že pri použití antigénneho prípravku nie sú u liečených živočíchov ani u ľudí pozorované žiadne alebo len nepatrné vedľajšie účinky. Odborníci v lekárstve alebo vo veterinárstve pochopia, že termín netoxický má veľmi široký význam. Napríklad u v podstate zdravých živočíchov alebo ľudí môže byť tolerovaná len nízka toxicita, no u ľudí trpiacich ochorením ohrozujúcim ich život, môžeme pripustiť aj silnejšiu toxicitu podávaného antigénneho prípravku.
Vo výhodných uskutočneniach vynálezu sa antigénneho prípravku podľa vynálezu v podstate skladá z dvoch alebo z troch nasledujúcich zložiek: z detergentu, činidla a oleja; spôsob podľa vynálezu v podstate zahŕňa iba jedinú administráciu zmesi (antigénu v kombinácii s antigénnym prípravkom) do organizmu živočícha alebo človeka; tento človek alebo živočích je infikovaný nejakým vírusom a -vykazuje jeden alebo. viac príznakov (tak, ako sú všeobecne definované odborníkmi v danej oblasti) typických pre danú vírusovú infekciu; a daný antigénny prípravok je pre človek alebo živočícha netoxický.
V iných výhodných uskutočneniach vynálezu je príslušný antigén vybratý z antigénnych oblastí prislúchajúcich antigénom vírusu HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev; z antigénnych oblastí prislúchajúcich antigénom malárie: proteínu CS a povrchovému proteínu 2 sporozoitu; z antigénnych oblastí prislúchajúcich povrchovým antigénom vírusu Hepatitídy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a Hbe Ag; z antigénnych oblasti prislúchajúcich antigénom vírusu chrípky: HA, NP a NA; z antigénnych oblastí prislúchajúcim povrchovým antigénom vírusu Hepatitídy A: z antigénnych oblastí prislúchajúcim antigénom Herpes víru: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, skorý proteínový produkt HSV, z antigénnych oblastí prislúchajúcich antigénom ľudského papilomavírusu napríklad antigénu HPV ako napríklad antigénom Ll,' E4, E6 a E7, obzvlášť potom antigénom E6 a E7 z HPV16 a HPV18 (tieto typy vírusov sú najobvyklejšie sa vyskytujúce formy vírusov spojené s karcinómom krčku maternice) , antigénov E4 a Ll odvodeným od HPV6 a HPV11 (tieto typy vírusov sú najobvyklejšie sa vyskytujúcimi formami asociovaných so špicatým kondylómom - condyloma acuminatum); z antigénnych oblastí prislúchajúcich antigénu prostaty (PSA - prostate specific antigén), cytomegalovírusu gB, cytomegalovírusu gH a proteínu gP72 IE; z antigénnych oblasti prislúchajúcich antigénom syncyciálneho vírusu napadajúceho respiračný systém: proteínu F, proteínu G a proteínu N; a z antigénnych oblastí prislúchajúcich antigénom spojených s nádormi: produkt CEA karcinómu, mucín spojený s karcinómami, produkt P21 karcinómu, produkt P53 karcinómu, produkt MPG melanómu, produkt p97 melanómu a produkt onkogénu Neu karcinómu, produkt génu p53 karcinómu, antigén melanómu nazývaný MAGE a mutovaný proteín p21 ras prítomný u veľkého množstva malígnych nádorov.
Podobne vynález opisuje kompozície, ktoré obsahujú, skladajú sa alebo skladajú sa takmer výhradne z nejakého antigénu zmiešaného s antigénnym prípravkom opísaným vyššie, pričom príslušný antigén je vybratý z antigénnych oblastí vymenovaných v predošlom texte.
Inou podobnou stránkou vynálezu je opis spôsobov slúžiacich na liečbu pacientov infikovaných vírusom HIV, trpiacich maláriou, trpiacich chrípkou, trpiacich hepatitídou, trpiacich rakovinovým bujnením, infikovaných Herpes vírusom, trpiacich karcinómom krčku maternice, trpiacich špicatým kondylómom (condyloma acuminata genitálne bradavice) alebo infikovaných syncyciálnym vírusom napadajúcim respiračný systém. Táto liečba je uskutočňovaná pomocou podania kompozície, ktorá obsahuje príslušný antigén (napríklad antigén vybratý zo skupiny antigénov vymenovaných v predchádzajúcom texte) zmiešaný s jedným 'z vyššie zmienených antigénnych prípravkov. Zmienené antigény a spôsoby liečby sú len príkladom antigénov, ktoré sa môžu použiť v kombinácii s antigénnymi prípravkami.
Iné stránky a výhody vynálezu budú zrejmé z nasledujúcich príkladov uskutočnenia vynálezu a z patentových nárokov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Najskôr budú stručne opísané jednotlivé obrázky.
Opis obrázkov
Obrázky IA až IC a 4A až 4C sú grafickým znázornením dát porovnávajúcich indukciu CTL dosiahnutú použitím rôznych prípravkov s ovalbumínom; pomer E : T označuje na všetkých obrázkoch pomer efektorových buniek k cieľovým bunkám a je vyznačený na vodorovnej, osi (obrázky 1 až 11) . Na zvislej osi je vyznačené percento špecifickej cytotoxicity, opis zvislej osi platí tiež pre všetky obrázky 1 až 9.
Obrázok IA opisuje indukciu CTL po podaní ovalbumínu v HBSS, dáta pre bunky EL4 a EG-7 ova sú zhodné.
Obrázok IB opisuje indukciu CTL po podaní ovalbumínu obsiahnutého v cytoplazme. Odpoveď meraná na bunkách EL4 je znázornená prázdnymi štvorčekmi, odpoveď na EG-7 ova plnými.
Obrázok 1C opisuje indukciu CTL po imunizácii ovalbumínom v antigénnom prípravku. Odpoveď meraná na bunkách EL4 je znázornená prázdnymi štvorčekmi, odpoveď na EG-7 ova plnými.
Obrázky 2A a 2B sú grafickým znázornením dát porovnávajúcich indukciu CTL dosiahnutú použitím β-galaktozidázy s antigénnym prípravkom (2b). Prázdne štvorčeky platia pre bunky tieto body
Obrázok 3 je indukciu lipozómoch kombinácii
C3-4, plné pre bunky P815 (na zhodné s vodorovnou osou ). grafickým znázornením dát CTL dosiahnutú použitím (štvorčeky) a použitím antigénnym prípravkom (plné indukciu CTL po podaní ovalbuminu v HBSS.
obrázku 2a sú porovnávajúcim ovalbuminu ovalbuminu kolieska).
Obrázok 4A opisuje
Obrázok 4B opisuje indukciu CTL po podaní ovalbuminu obsiahnutého v cytoplazme.
Obrázok 4C opisuje indukciu CTL po imunizácii ovalbumínom v antigénnom prípravku.
Obrázok 5 je grafickým znázornením dát ukazujúcich, aký vplyv má na indukciu CTL selektívne odstránenie buď CD4 buniek (plné kolieska) alebo CD8 buniek (plné štvorčeky), kontrola bez odstránených lymfocytov je označená prázdnymi štvorčekmi.
Obrázok 6 opisuje účinok selektívneho odstránenia týchto - . subpopulácií T-lymfocytov: primárne aktivovaných CD4 (A) , primárne aktivovaných cd8 (B) , CD8n a CD4p (C) , CD4n a CD8p (D) a CD4p a CD8p(E).
Obrázok 7 je grafickým znázornením dát ukazujúcich indukciu CTL pomocou gpl20 v HBSS (prázdne štvorčeky) a v Idoxe (plné kolieska).
Obrázok 8 je grafickým znázornením dát ukazujúcich indukciu CTL pomocou zmesi kopolyméru Pluronic a Tweenu spolu s antigénom. Účinok na bunky EL4 je vyjadrený prázdnymi štvorčekmi, na bunky EG7 plnými kolieskami.
Obrázok 9 je grafickým znázornením dát ukazujúcich indukciu CTL pomocou zmesi skvalánu a Tweenu v kombinácii s antigénom. Účinok na bunky EL4 je vyjadrený prázdnymi štvorčekmi, na bunky EG7 plnými kolieskami.
Obrázok 10 je grafickým znázornením dát ukazujúcich indukciu CTL pomocou zmesi skvalánu a kopolyméru Pluronic v kombinácii s antigénom. Účinok na bunky EL4 je vyjadrený prázdnymi štvorčekmi, na bunky EG7 plnými kolieskami.
Obrázok 11 je grafickým znázornením účinkov ova v kombinácii s týmito dvoj či trojzložkovými antigénnymi prípravkami na odpoveď CTL: antigénny prípravok S-T-P (A), antigénny prípravok S-T (B), antigénny prípravok p-t (c), antigénny prípravok S-P (D), HBSS (E) a antigénny prípravok SAF-M (F) .
Obrázok 12 je grafickým znázornením indukcie protilátok proti gpl20HIb u opíc, ktoré je dosiahnuté použitím rôznych antigénnych prípravkov. Na zvislej osi je vyznačená hodnota absorbancie pri 405 nm, na vodorovnej je riedenie séra. Jednotlivé experimenty sú označené týmito symbolmi: 854/SPT/2d (A), 220/SPT/2d (B),
207/ST/2d (C), 222/ST/2d (D), 720/SAFm/2d (E),
722/SAFm/2d (F), 225/HBSS/2d (G), 208/HBSS/2d (H).
Obrázok 13 znázorňuje protinádorovú aktivitu buniek HOPE2, ktorú vykazovali desať dní po jedinej imunizácii rozpustným proteínom E7 v kombinácii s adjuvanš. Na zvislej osi je vyznačená velkosť tumorov v mm3, na vodorovnej dni po implantácii. Symboly odpovedajú: 30/antigénny prípravok /Ix (A), 90/antigénny prípravok/lx (B), 90/Alum/lx (C) a kontrola (D).
Obrázok 14 znázorňuje protinádorovú aktivitu buniek HOPE2, ktorú mali v časoch 10 a 19 dní po dvoch imunizáciach rozpustným proteínom E7 v kombinácii s adjuvanš. Na zvislej osi je vyznačená veľkosť tumorov v mm3, na vodorovnej dni po implantácii. Symboly odpovedajúce: 30/antigénny prípravok/2x (A), 90/antigénny prípravok/2x (B), 90/Alum/2x (C) a kontrola (D).
Antigénne prípravky
Antigénne prípravky vhodné na použitie vo vynáleze sú všeobecne opísané v predchádzajúcom texte. Odborníci zistia, že môžu byť pomerne ľahko pripravené ekvivalentné prípravky, a že od týchto prípravkov môžeme očakávať ékvivalentné vlastnosti vo vzťahu k indukcii odpovede CTL. Vlastnosti takýchto prípravkov môžu byť pomerne ľahko testované s použitím techník podobných nižšie opísaným technikám.
Nasledujú príklady použitia vynálezu, v ktorých je použitý antigénny prípravok (AF-antigén formulation) tvorený približne 2,5% skvalánu, 5% plurónovej kyseliny a Tweenom 80 vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom. Emulzia AF presnejšie obsahuje: 15 mg skvalánu, 37,5 mg poloxaméru 401 (PLURONIC L121), 6 mg polysorbátu 80 (Tween 80), 0,184 mg chloridu draselného, 0,552 mg dihydrogénfosforečnanu draselného, 7,36 mg chloridu sodného,
3,3 mg hydrogénfosforečnanu sodného (bezvodého) v 1 ml vody; výsledné pH = 7,4. Táto emulzia bola mikrofluidizovaná prostredníctvom štandardných techník (Microfluidics, model M110F) s použitím modulu so spätným tlakom 11000 až 14000 psí (75,9 MPa až 96,5 MPa) s postupným návratom tlaku na hodnotu atmosférického tlaku a chladením pomocou ľadu.
V iných príkladoch bol antigén zmiešaný s mikrofluidizovanou zmesou skvalánu (S), kopolyméru Pluronic (P) a Tweenu 80 (T) , v ktorej bola dosiahnutá finálna koncentrácia jednotlivých zložiek: 0,2% Tweenu 80. 1,25% kopolyméru Pluronic a 5% skvalánu. Za účelom stanovenia, ktoré z týchto zložiek sú nevyhnutné na indukciu antigén-špecifickej imunitnej odpovede, boli v koncentráciách odpovedajúcich trojzložkovej zmesi pripravené dvojzložkové zmesi
Skvalán-Tween 80, Pluronic-Tween 80 a Skvalán-Pluronic. Pluronic, Skvalán a Tween 80 sa tiež použili individuálne s účelom stanovenia vplyvu týchto jednotivých zložiek na indukciu CTL. Za účelom stanovenia účinkov rôznych derivátov Tweenu na indukciu CTL sa v ova systému namiesto Tweenu 80 použili Tween 20, Tween 40 alebo Zwittergent. V trojzložkových prípravkoch bol Skvalán nahradený Eikozánom alebo Triakontánom a namiesto kopolyméru Pluronic sa v rovnakých trojzložkových prípravkoch ’ použili PEG1000, Pleuronic L62LF a Tetronic 1501 a Tetronic 150R1. Čo sa týka dvojzložkových prípravkov, za účelom testovania indukcie CTL špecificky namierenej proti antigénu ova, sa použili zmesi najrôznejších analógov zmienených zložiek v rôznych kombináciách. Patria sem napríklad zmesi cholesterol - Tween 80, Skvalán - Tveen 20, Pristán - Tween 80 alebo olivový olej - Tween 80. Pri štúdiu zameranom na stanovenie stability, bola mikrofluidizovaná zmes Skvalán-Tween 80 zmiešaná s dextrózou tak, aby bola dosiahnutá finálna koncentrácia dextrózy 5%. Vo všetkých prípadoch boli kombinácie jednotlivých aditív zmiešané v mikrofluidizére za účelom vytvorenia stabilnej emulzie. V niektorých experimentoch bol, za účelom indukcie odpovede CTL a indukcie humorálnej odpovede, do dvojzložkových prípravkov pridaný muramyl dipeptid v rôznych koncentráciách. V Tabuľke 1 je znázornený úplný zoznam najrôznejších prípravkov použitých v tejto štúdii.
Tabuľka 1: Účinky rôznych substitúcii uskutočnených v dvojzložkových alebo trojzložkových systémoch
Substitúcia uskutočnená v troj zložkových formuláciách počet usmrtených buniek (v : pri pomere E:T-100:l
STP 84,0
TWEEN 40 (T) 66,0
TWEEN 20 48,0
T1501 (P)48 0,0
T150R1 (P) 0,0
Pluronic L62LF (P) 47,0
Eikozán (S) *
PEG1000 (P) *
Triakontán (S) *
Zwittergent (T) *
Substitúcia uskutočnená v dvojzložkových formuláciách
ST 76,0
PT 45,0
SP 26,0
Cholesterol (S) + TWEEN 80 0,0
Skvalán + TWEEN 29 (T) 65,0
Pristán (S) + TWEEN 80 42,0
Olivový olej (S) + TWEEN 80 69,0
Jednozložková formulácia
PluronicL121
Skvalán
TWEEN 80
Skvalán + TWEEN 80 + 5% dextróza
0,0
0,0
0,0
86,0 f
♦stanovenie cytotoxickej aktivity CTL je uskutočnené znovu
Ako kontrolné adjuvans sa použil prípravok Syntex adjuvans (mikrofluidizovaný; SAFm - Syntex adjuvants formulation). Tento prípravok sa skladá z dvoch častí. Časť I sa skladá z fyziplogického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrom obsahujúcim finálnu koncentráciu jednotlivých zložiek: Skvalán - 5% kopolymér Pluronic - 1,25% a Tween 80 - 0,2% (táto časť sa nazýva nosič alebo I-SAF). Časť II sá skladá z N-acetylmuramyl -L-treonyl-D-izoglutamínu (Thr-MDP), ktorý je vlastne derivátom zložky bunkovej steny mikroorganizmu rodu Mykobakterium. Za účelom imunizácie bo antigén zmiešaný s mikrofluidizovaným nosičom (časť I) a výsledkom bol vznik homogénnej emulzie. K takto vytvorenému SAFm bol pridaný MDP a celá zmes sa krátko vortexovala. V zmesi sa použilo niekoľko rôznych koncentrácií MDP, aby bolo možné zistiť optimálnu koncentráciu MDP na indukciu CTL. Myši sa tiež imunizovali rozpustnými antigénmi zmiešanými podlá návodu poskytovaného výrobcom (Pierce Chemical, Rockford, IL) s alum alebo zmiešanými s Freundovým kompletným adjuvans (CFA).
Antigénny prípravok podlá vynálezu je použitý na indukciu odpovedí cytotoxických T-lymfocytov u myši. Odborníkom je zrejmé, že takýto myší model naznačuje, že rovnaké experimenty alebo rovnaká liečba budú viesť k indukcii odpovedi cytotoxických T-lymfocytov u ľudí,
...domestikovaných alebo hospodárskych zvierat. Množstvo antigénneho prípravku a antigénu použiteľné na vyvolanie požadovanej bunkovo sprostredkovanej odpovede sa môže stanoviť empiricky pomocou štandardných spôsobov odborníkom dobre známym a nie je pritom potrebné uskutočňovať príliš vela experimentov. Ak je teda žiadúce minimalizovať vedľajšie účinky týchto zmesí pri liečbe, ktorej cieľom je vyvolať odpoveď CTL a teda indukovať imunitu proti požadovanému antigénu, môžu odborníci určiť minimálne množstvo takej zmesi určenej k administrácii do organizmu človeka, domestikovaného alebo hospodársky významného živočícha. Pri normálnom použití bude takáto zmes do organizmu injikovaná jedným zo štandardných spôsobov, viacmenej sa ako najvýhodnejšia javí intramuskulárna injekcia do miesta, kde bude umožnené, aby emulzia zostala vo svojej stabilnej forme počas niekoľkých dní alebo týždňov.
Spôsoby
Ak nie jé povedané inak, použili sa v nižšie uvedených príkladoch nasledujúce materiály a spôsoby:
Myši
Samice myší C57BL/6 (H-2b) a BALB/c (H-2d) boli zakúpené od firmy Harlen Sprague (San Diego, California).
Antigény
Ovalbumín (ova, trieda VII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) sa použil v natívnom stave. β-galaktozidáza (β-gal, trieda VIII; BRL) sa použila jednak v natívnom stave a jednak po alkalickej lýze uskutočnenej v 1 M NaOH počas 2 minút pri 100 °C. Rekombinantný proteín gpl20 bol zakúpený od firmy Američan Biotechnology.
Nádorové bunky a transfekované bunky
- Ako nádorové bunky sa použili la- línie buniek EL4 (thymon C57BL/6, H-2b) a bunky P815 (mastocytóm DBA/2, H-2d). Príprava buniek EG7-ova, ktoré sú odvodené od transfekovanej bunkovej línie EL4 produkujúcek ova, boli už skôr opísané v článku Moore a ďalší, 54 Celí 777, 1988. Tranfekované bunky
P13.1, ktoré produkujú β-gal sa odvodili elektroporáciou z bunkovej línie P815 s celkovým počtom buniek približne 107. Elektroporácia sa uskutočnila v 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrom (PBS) a použilo sa na ňu 10 mg plazmidu pCHUO (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.,
Piscataway, NJ) linearizovaného reštrikčnou endonukleázou Pst I a 1 mg plazmidu pSV2 neo (Southern a ďalší, 1 J. Mol. Appl. Genet. 327, 1982) linearizovaného reštrikčnou endonukleázou Pvu I. Po tejto elektroporácii nasledovala selekcia v médiu obsahujúcom.400 gh/ml antibiotika G418. Transfekovaná bunková línia C3-4 sa odvodila od línie hybridómu BALB/c Igm 662 prostredníctvom transfekcie týchto hybridómov plazmidom kódujúcim gén pre β-gal; tento gén sa pripojil ku tretiemu a štvrtému exónu kódujúcemu ťažký reťazec IgM (Rammensee a ďalší, 30 Immunogenetics 296, 1989). Fibroblasty 3T3 exprimujúce gpl60IIIb (línia 15-12) poskytol Dr. Germain z NIH (Bethesda, MD). Bunkovú líniu L buniek transfekovanú génom Kb nám poskytol Dr. Carbone, Monash University, Austrália. Bunkové línie L buniek transfekované fénmi Dl a Ld nám poskytol Dr. Ted Hensen, Washington University, St. Louis.
Imunizácia
Myši boli imunizované intravenózne 200 μΐ suspenzie obsahujúcej splenocyty (ktoré boli dopredu nasýtené príslušným antigénom) v množstve 25 x 106. Ako je opísané v článkoch Moore a ďalší, 54 Celí 777, 1988 a Carbone a ďalší, J. Exp. Med. 169:603,1989. Pri imunizáciach zmesami ova-antigénny prípravok alebo β-gal-antigénny prípravok sa na ímuňizáciu jednej myši použili 30 gg jednotlivých proteínových antigénov. Myši boli imunizované subkutánne (do podkožnej vrstvy) pri koreni chvosta alebo na vanúšiku chodidla. Každá injekcia obsahovala 67 μΐ mikrofluidizovaného antigénneho prípravku (pripraveného pomocou štandardných spôsobov) a 30 gg proteínového antigénu v celkovom objeme 200 gl, celkový objem 200 gl sa dosiaho pridaním HBSS, viď Wittaker manual (Welkersvelle, MD) . MDP sa pripravilo v množstvách 0 až 300 gg. Tam kde je povedané, boli myši imunizované rozpustnými antigénmi v kombinácii s CFA alebo s alum s celkovým objemom 200 μΐ.
In vitro stimulácia populácie efektorových buniek
Bunky sleziny (30 x 106) získané z normálnych alebo imunizovaných myší (tieto myši boli imunizované najmenej o 14 dní skôr) boli, za účelom merania odpovede na prítomnosť ova, inkubované s 1,5 x 106 buniek EG7-ova (ožiarených 2’0000 rad) na 24 jamkových platniach pri 37 °C v atmosfére obsahujúcej 7% C02. Za účelom merania odpovede na prítomnosť β-gal boli bunky sleziny (30 x 106) získané z normálnych alebo imunizovaných myší(tieto myši boli imunizované najmenej o 14 dní skôr) inkubované s 1,5 x 106 buniek C3-4 (ožiarených 20000 rad) na 24 jamkových platniach pri 37 °C v atmosfére obsahujúcej 7% CO2. Všetky experimenty na tkanivových kultúrach sa uskutočnili v kompletnom médiu, ktoré je tvorené IMDM médiom, viď Wittaker manual (Welkersville, MD) doplneným 10% fetálneho teľacieho séra (FCS), 2 mM glutaminom, gentamycínom a 2 x 10~5 M 2-merkaptoetanolom. Pri in vitro experimentoch, pri ktorých je zo zmesi buniek selektívne odstránený určitý typ buniek, boli in vivo primárne aktivované alebo in vitro stimulované bunky vystavené pôsobeniu monoklonálnych protilátok (mAbs) RL.172 (anti-CD4) alebo monoklonálnych protilátok 3.168 (anti-CD8). Toto pôsobenie monoklonálnymi protilátkami slúži na odstránenie CD4+ alebo CD8+ T-buniek (Sarmiento a ďalší, 125 J. Immunol. 2665, 1980 a Ceredig a ďalší, 314 Náture 98, 1985) . Monokonálne protilátky RL.172 a 3.168 sa získali od Dr. Johathana Sprenta zo Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.
Bunky sleziny (30 x 106) získané z normálnych alebo imunizovaných myší(tieto myši boli imunizované najmenej o 21 dní skôr) inkubované s 1,5 x 106 buniek 15-12 (na ktoré sa predbežne, počas 45 minút pôsobilo mitomycínom C v množstve
200μς/108 buniek), alebo boli tieto bunky sleziny inkubované v kompletnom IMDM médiu (Irvine Scientific, Šanta Ana, CA) obsahujúcom 10%-ný dopredu otestovaný FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA) , 2 mM glutamin, gentamycín a 2 x; 105 M 2-merkaptoetanólu, v ktorom je tiež prítomných 500 gg peptidu 18111b obsahujúceho epitop dominantný pre CTL myší Balb/c. Pri in vitro stimulácii prostredníctvom peptidov boli bunky sleziny kultivované v kompletnom IMDM médiu obsahujúcom 5% supernatantu ConA.
Pri experimentoch, pri ktorých je zo zmesi buniek selektívne odstránený určitý typ buniek, boli in vivo primárne aktivované alebo in vitro stimulované bunky podrobené pôsobeniu monoklonálnymi protilátkami (mAbs) RL.172 (anti-CD4) alebo monoklonálnymi protilátkami 3.168 (anti-CD8) za prítomnosti králičieho komplementu s nízkou toxicitou (Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Canada). Toto pôsobenie monoklonálnymi protilátkami slúži na odstránenie CD4+ alebo CD8+ T-buniek (22, 23). Monoklonálne protilátky RL.172 a 3.168 sa získali od Dr. Johathana Sprenta zo Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.
Stanovenie cytotoxicity
Cieľové bunky (1 x 106) boli značené počas 60 minút [51Cr] chrómanom sodným s aktivitou 100 μCi. K cieľovým bunkám, ktoré boli za účelom experimentu povlečené peptidóvými fragmentárni, sa v priebehu ich značenia izotopom 51Cr pridalo 50 μΐ roztoku 1 mg/ml peptidu v HBSS. Po premytí sa 104 značených cieľových buniek inkubovalo počas 4 hodín pri 37 °C s postupne zried’ovanými efektorovými bunkami v 200 μΐ RP10. Po skončení inkubácie sa odobralo 100 μΐ supernatantu a špecifická lýza sa stanovila ako: Špecifická lýza (v percentách) = 100 x { (aktivita uvoľnená pôsobením CTL spontánne uvoľnená aktivita) / (maximálna uvoľnená aktivita spontánne uvoľnená aktivita)L Spontánne uvoľnená aktivita za neprítomnosti cytotoxických T-lymfocytov (CTL) bola vo všetkých experimentoch menšia ako 25 % maximálnej uvoľnenej aktivity dosiahnutej pôsobením detergentu.
Stanovenie protilátkových odpovedí u myší a opíc
Každá z jamiek na 96-tich jamkových platniach, s prierezom jamiek v tvare U (Costar, Cambridge, MA) , bola povlečená 150 ng ova alebo gpl20 rozpustenými v 50 μΐ HBSS a inkubovaná cez noc pri 4 °C. Pri stanovení protilátkových odpovedí proti ova a proti gpl20 u myší, boli platne blokované počas 1 hodiny roztokom 1%-ho BSA. Do každej jamky sa pridali postupne riedené séra v objemoch 25 μΐ/jamka a inkubované počas 2 hodín. Platne boli premyté a do každej jamky sa pridalo 50 μΐ kozieho IgG proti myším protilátkam v zriedení 1:1000 konjugovaného s chrenovou peroxidázou (HRPOhorsé radish peroxidase, SBT, Alabama) v roztoku obsahujúcom 1%-ný BSA. Po jednej hodine inkubácie boli platne premyté a do každej jamky sa pridalo 100 μΐ substrátu. Po 10 až 15 minútach sa odčítala OD405. Pri stanovení protilátkových odpovedí proti gpl20 u opíc boli všetky kroky totožné s vyššie zmienenými krokmi s výnimkou faktu, že ako blokovanie platní, tak zrieďovanie sér sa uskutočnilo v 5%-nom kozom sére v Hankovom rovnovážnom roztoku.
Sntéza peptidov
Syntetické peptidy odpovedajúce aminokyselinovej sekvencií ovalbumínu (ova 253 až 276) tvorené aminokyselinami 253 až 256 (Sekvencia číslo 1: EQLWSIINDWKLREWRSSSNVMEER; kde je použitý štandardný jednopísmenový kód aminokyselín), aminokyselinovej sekvencií myelínového bázického proteínu (MBP 84 až 102) tvorenej aminokyselinami 84 až 102 (Sekvencia číslo 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP) a syntetické peptidy zodpovedajúce aminokyselinovej sekvencií gp 120111b tvorenej aminokyselinami 308 až 322 (sekvencia 18111b) boli syntetizované peptidovou syntézou na pevnej fáze s použitím syntetizéru Applied Biosystems 430A. Aminokyseliny boli kondentačne pripojované vo forme symetrických anhydridov s výnimkou .asparaginu, glutamínu a arginínu, ktoré . boli pripojované vo forme esterov hydroxybenzotriazolu. Účinnosť tvorby peptidových väzieb sa sledovala pomocou ninhydrínovej reakcie spôsobom opísaným v článku Kaiser a ďalší,' 34 Anál. Biochem. 595, 1970. Peptidy boli z matrice uvoľnené pôsobením HF s využitím high-low spôsobu opísaného v článku Tam a ďalší, 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983. Peptidy boli následne od matrice oddelené extrakciou 10% kyselinou octovou. Po lyofilizácii boli peptidy odsolené na kolóne Sephadex G-25 a jednotlivé peptidy boli potom purifikované HPLC chromatografiou na reverznej fáze na preparatívnej kolóne C-18 Vydac. Purifikované peptidy (98%) boli solubilizované v HBSS do finálnej koncentrácie 10 mg/ml a následne zriedené v kompletnom médiu na požadovanú koncentráciu.
Štiepenie pomocou CNBr
Vzorky proteínov (napríklad β-galaktozidáza) boli vystavené pôsobeniu 100 násobného molárneho nadbytku brómkyánu v roztoku lOOmM kyseliny trifluóroctovej. Reakcia prebiehala 18 hodín pri izbovej teplote (okolo 20 °C) za stáleho premiešavania. Po uplynutí reakčného času boli peptidové štepy separované od reaktantov pomocou zariadenia SEP-PAK C-18 (Waters), eluované 95%-ným acetonitrilom a lyofilizované.
Alkalické štiepenie
Vzorky proteínov (napríklad β-galaktozidáza) bolu vystavené pôsobeniu 1 N NaOH a povarené počas 2 minút. Získané peptidové fragmenty boli separované od reaktantov pomocou zariadenia SEP-PAK C-18 (Waters), eluované 95%-ným acetonitrilom a lyofilizované.
Príklad 1: Primárna aktivácia CTL namierených proti bunkám exprimujúcim antigén v komplexe s MHC glykoproteínmi I. triedy
Moore a ďalší, 113 UCLA Symp. Mol. Celí. Biol. 1989 a Carbone a Bevan, 171 J. Exp. Medicíne 377, 1990 ukázali, že u myší imunizovaných bunkami sleziny, ktorých cytoplazma bola nasýtená rozpustným ova, došlo k indukcii odpovede CTL, ktorá bola špecificky namierená proti ova prezentovanému v komplexe s MHC glykoproteínmi I: triedy. Bunková línia EG7-ova, čo sú vlastne transfekované bunky EL7 exprimujúce ova, sa použila k in vitro stimulácii primárne aktivovaných (in vivo) lymfocytov prítomných v slezine a bunky EG7-ova sa tiež využili ako cieľové bunky, ktoré sú zabíjané činnosťou CTL, špecificky namierených proti ova. Táto štúdia tiež dokázala, že CD8+ efektorové bunky indukované prostredníctvom buniek sleziny s cytoplazmou nasýtenou antigénom ova rozpoznávajú časť ova tvorenú aminokyselinami 258 až 27 6 v komplexe s H-2Kb, lyžujú bunky EG7-ova a tiež ničia bunky EL4 pokrytej časti ova tvorenou aminokyselinami 258 až 27 6. Za účelom stanovenia, či môže byť, s použitím rozpustného antigénu, indukovaná dráha sprostredkovaná endogénnymi CD8+ T-bunkami namierenými proti bunkám nesúcim antigén v komplexe s MHC glykoproteínmi I. Triedy, sa teda použil vyššie zmienený systém, ktorý umožňuje určiť, či sa nejaký antigénny prípravok môže použiť, spolu s rozpustným antigénom, k indukcii odpovede CTL namierenej proti bunkám nesúcim antigén v komplexe s MHC glykoproteínmi I. triedy.
a) ova
Myši C57BL/6 boli raz imunizované rôznymi množstvami ova (30 pg áž 1 mg ova na jedného jedinca) v kombinácii s alebo bez antigénnym prípravkom. Myši sa injikovali subkutánne a do koreňa chvosta. Najskôr dva týždne po imunizácii boli z imunizovaných myší odobrané bunky sleziny a tieto bunky boli in vitro stimulované prostredníctvom transfekovaných buniek EG7-ova. Použitie antigénu ova v množstve okolo 30 ^g bolo rovnako účinné ako dávka obsahujúca 1 mg ova. Štúcie CTL sa teda rutinne uskutočňovali s bunkami sleziny získanými z myší imunizovaných 30 pg ova. Po piatich dňoch kultiváci'e buniek sleziny s EG7-ova sa stanovila existencia primárnej aktivácie na základe prítomnosti efektorových buniek špecificky namierených proti ova, ktoré sú schopné lyžovať bunky EG7-ova.
Myši injikované ova rozpusteným v HBSS, kde množstvo ova použité na jednu imunizáciu dosahovalo až 1 mg, nevykazovala žiadne stopy indukcie CTL (Obrázok 1A). Viacmenej myši imunizované 30 gg ova v kombinácii s antigénnym prípravkom opísaným vyššie vykazovali výraznú odpoveď CTL namierenú proti bunkám transfekovaným príslušným antigénom (obrázok IC) . Naviac množstvo buniek EG7-ova usmrtených prostredníctvom buniek sleziny získaných z myší imunizovaných pomocou ova-AF bolo porovnateľné s množstvom buniek EG7-ova usmrtených prostredníctvom buniek sleziny získaných z myší imunizovaných pomocou buniek sleziny nasýtených antigénom ova (obrátok IB).
-Skutočnosť, že in vivo primárna aktivácia CTL bola antigén špecifická, bola dokázaná tak, že bunky sleziny získané z myší imunizovaných β-galaktozidázou nevykazovali in vitro sekundárnu odpoveď CTL, ak boli stimulované bunkami EG7-ova. Nebola pozorovaná žiadna indukcia CTL namierená proti ova.
b) β-galaktozidáza
Podobné výsledky sa získali pri použití iného rozpustného proteínového antigénu, ktorým bola β-gal. Za účelom stanovenia odpovede CTL špecificky namierenej proti β-gal sa ako cieľové bunky použili bunky C3-4 exprimujúcej β-gal, odvodenej transfekciou od bunkovej línie získanej z myší BALB/c. Pri imunizácii myší BALB/c rozpustnou β-gal sa zistilo určité pozadie u odpovede CTL. Za účelom stanovenia špecifickej odpovede CTL bola teda izolácia slezinných lymfocytov odložená prinajmenšom o osem týždňov a tieto lymfocyty sa následne kultivovali počas piatich dní za prítomnosti ožiarených transfekovaných buniek C3-4.
Obrázok 2B ukazuje, že 30 μς β-galaktozidázy v AF indukovalo silnú odpoveď CTL špecificky namierenú proti transfekovaným bunkám C3-4. Pri pomeroch efektorová bunka ku cieľovej bunke (E:T) 3 ku 1, boli bunky izolované z myší imunizovaných β-galaktozidázou použitou v kombinácii s AF schopné špecificky usmrtiť približne 80% buniek C3-4. Ničmenej pri použití efektorových buniek izolovaných z myší imunizovaných β-gal v HBSS bolo pri rovnakom pomere E:T dosiahnuté usrmtenie iba 20% cieľových buniek (obrázok 2A) . Keďže ani bunky EL4 ani bunky P815 neexprimujú na svojom povrchu MHC glykoproteíny II. Triedy a lýza buniek je syngénne obmedzená, sú efektorové bunky špecificky namierené proti ova a β-gal vo svojom pôsobení obmedzené na cieľové bunky exprimujúce MHC glykoproteíny I. triedy.
Aby bola dokázaná efektivita antigénneho prípravku, boli myši imunizované rozpustným ova zapuzdreným do dvoch typov lipozómov, z ktorých jedným typom boli lipozómy citlivé na zmeny v pH. Po jednom týždni boli bunky sleziny in vitro stimulované spôsobom opísaným vyššie a testovalo sa ich pôsobenie proti bunkám EG7-ova alebo EL4 značených izotopom 51Cr. Na Obrázku 3 sú znázornené reprezentatívne výsledky z ktorých vyplýva, že antigén ova v lipozómoch nie je u myší schopný vyvolať indukciu CTL. Podobné výsledky sa získali v experimentoch, kde boli myši imunizované antigénom ova v alum.
Príklad 2: Rozpoznanie epitopu prostredníctvom. CTL
Carbone a Bevan, viď vyššie, dokázali, že CTL indukované v myšiach C57BL/6 pomocou transfekovaných buniek EG7-ova alebo pomocou splenocytov, ktorých cytoplazma je- nasýtená ova, rozpoznávajú bunky'EL4, na ktorých povrchu je prítomný peptid tvorený aminokyselinami 258 až 276 z ova. Za účelom stanovenia, či rozpustný ovalbumín v kombinácii s AF indukuje podobné odpovede CTL, boli z imunizovaných myší izolované bunky sleziny a tieto bunky boli následne in vitro stimulované s využitím EG7-ova. U efektorových buniek sa testovalo ich pôsobenie proti bunkám EL4, na ktorých povrchu je prítomný peptid tvorený aminokyselinami 258 až 276 z ova, alebo proti bunkám E.L4, na ktorých povrchu je prítomný peptid odvodený z myelínového bázického proteínu (MBP 84-102). Získané výsledky ukazujú, že CTL primárne aktivované pomocou ova-AF majú podobnú špecifitu ako CTL primárne aktivované pomocou transfekovaných buniek alebo pomocou buniek ktorých cytoplazma je nasýtená ova /Obrázky ΙΑ, 1B a 1C). Efektorové bunky primárne aktivované pomocou ova-AF účinne lyžovali bunky EG7-ova a netransfekované bunky, ktorých povrch bol pokrytý peptidom ova v množstve 50 μg/108 buniek, ale tieto efektorové bunky nelyzovali bunky EL4, ktorých povrch bol pokrytý peptidom MBP v množstve 50 μg/108 buniek.
Článok Carbone a Bevan, viď vyššie, naznačuje, že v systéme s β-galaktozidázou, v ktorom boli CTL indukované prostredníctvom transfekovaných alebo v ktorom boli CTL splenocytov cytoplazmaticky β-galaktozidázou, lyžovali prostredníctvom splenocytov buniek exprimujúcich β-gal indukované prostredníctvom nasýtených rozpustnou tieto
CTL indukované cyt op1azrnat i cky nasýtených rozpustnou β-galaktozidázou, lyžovali netransfekované bunky P815, ktorých povrch bol pokrytý fragmentárni získanými alkalickou lýzou β-galaktozidázy. AK boli myši imunizované rozpustnou β-galaktozidázou v kombinácii s AF, došlo k indukcii CTL, a takto indukované bunky mali podobnú špecifitu ako bunky indukované spôsobom zmieneným vyššie (Obrázok 2).
Príklad 3: Efektorové bunky CTL sú CD8+ T-bunky
Skutočnosť, že rozpustné proteínové antigény v kombinácii s AF indukujú CD8+ efektorové T-bunky, bola dokázaná nasledovne. Splenocyty získané z imunizovaných myší boli in vitro kultivované spolu s ožiarenými transfekovanými bunkami počas piatich dní. Následne boli bunky pozbierané a zo zmesi buniek boli s použitím monoklonálnych protilátok proti CD4 a proti CD8 spolu s komplementom selektívne odstránené CD4+ a CD8+ T-bunky. Takto upravené bunkové populácie boli potom testované proti bunkám EG7-ova značeným izotopom 51Cr (v ova systéme) alebo proti bunkám P13.1 značeným izotopom 51Cr (v β-gal systome). Dáta znázornené na obrázku 4. Naznačujú, že v ova systéme bola pri použití populácia buniek, z ktorej boli selektívne odstránené CD8+ T-bunky, úplne zrušená cytolytická aktivita celej tejto populácie efektorových buniek. Ničmenej selektívne odstránenie populácie CD4+ T-buniek nemalo žiadny vplyv na lýzu' buniek EG7-ova.
Podobne v β-gal systéme viedlo selektívne odstránenie CD8+ T-buniek ku zrušeniu cytolytickej aktivity buniek sleziny získaných z myší imunizovaných antigénnym prípravkom v kombinácii s antigénom β-gal.
Príklad 4: Rozpustný ova v kombinácii s AF primárne aktivuje CD8+ T-bunky
Za účelom dokázať, že zmes ova-AF in vivo primárne aktivuje populácie CD8+ T-buniek, a že táto primárna aktivácia je nevyhnutná na vyvolanie sekundárnej odpovede in vitro, boli z buniek sleziny získaných z myší imunizovaných zmesou ova-AF a z neimunizovaných myší selektívne odstránené populácie CD4+ buniek a CD8+ buniek. Takto spracované populácie boli následne in vitro stimulované s použitím samotných buniek EG7-ova alebo buniek EG7-ova spolu s CD4+ a CD8+ T-bunkami získanými z myší imunizovaných zmesou ova-AF, alebo s použitím buniek EG7-ova použitých v rôznych kombináciách s CD4+ bunkami alebo CD8+ bunkami získanými z myší imunizovaných zmesou ova -AF spolu s CD4+ bunkami alebo CD8+ bunkami získanými z neimunizovaných myší. Obrázok 5 ukazuje, že primárne aktivované CD8+ bunky sú nevyhnutné na manifestáciu sekundárnej odpovede CTL in vitro. Tieto dáta tiež naznačujú, že k účinnej sekundárnej odpovede CTL in vitro sú potrebné CD4+ T-bunky. CD4+ bunky nie sú potrebné na primárnu aktiváciu. Podobne, CD8+ T-bunky sú nevyhnutné na in vitro manifestáciu sekundárnej odpovede. CTL špecificky namierené proti β-gal.
Vyššie zmienené príklady ukazujú účinky zmieňovaného antigénneho prípravku na indukciu odpovedí CTL namierených proti rozpustným proteínovým antigénom, pričom tieto antigény sú rozpoznávané v kontexte MHC glykoproteínov I. triedy. Antigénny prípravok sprostredkoval primárnu aktiváciu CTL rozpustnými antigénmi a takto indukované CTL majú podobnú -aktivitu ako CTL indukované prostredníctvom transfekovaných buniek a splenocytov cytoplazmaticky nasýtených rozpustným ova alebo β-gal. V systéme s ovalbumínom bunky EG7-ova, splenocyty cytoplazmaticky nasýtené ova a zmes ova-AF indukujú: (a) CD8+ CTL, ktoré rozpoznávajú antigén v kontexte MHC glykoproteínov I. triedy; (b) CTL, ktoré rozpoznávajú cieľové bunky senzitizované syntetickým peptidom s aminokyselinovou sekvenciou zodpovedajúcou aminokyselinovéj sekvencii ova 253 až 276; a (c) dlhožijúce CTL po jedinej imunizácii. V β-galaktozidázovom systéme indukuje zmes β-gal-AF CTL, ktoré ’ rozpoznávajú transfekované bunky C3-4 exprimujúce β-gal, a tiež rozpoznávajú netransfekované bunky P815 senzitizované peptidovými fragmentárni získanými alkalickou lýzou β-gal. Táto skutočnosť je analogická dejom pozorovaným pri indukcii CTL prostredníctvom imunizácie pomocou buniek sleziny cytoplazmaticky nasýtených β-galaktozidázou. Indukcia CTL, špecificky namierených proti ova, prostredníctvom antigénneho prípravku je unikátna, pretože ani ova zapuzdrený v lipozómoch reagujúcich na zmenu pH, ani ova v zmesi s alum nie sú schopné in vivo primárne aktivovať CTL.
Spomínané príklady naznačujú, že antigénny prípravok použitý vyššie a jeho ekvivalenty, sú využiteľné na liečbu ľudí a na vývoj vakcín slúžiacich na indukciu CTL pri rôznych rakovinových bujneniach a vírusových ochoreniach.
Príklad 5:
Tento špecifický príklad ukazuje použitie vyššie zmienenej AF za účelom primárnej aktivácie CTL rozpoznávajúcich antigén v kontexte MHC glykoproteínov I. triedy prostredníctvom rozpustného gpl20 vírusu HIV.
Bunková línia exprimujúca gpl60 IIIB (15-12) bola vytvorená z bunkovej línie 3T3 odvodenej od línie fibroblastov získaných z myší Balb/c. Táto línia bola získaná od Ďr. Rona Germaina a Dr. Jaye Berzofskeho z National Inštitúte of Healtf, Bethesda, M. D. Bunková línia exprimujúca gpl60 bola využitá na in vitro stimuláciu in vivo primárne aktivovaných slezinných lymfocytov a tiež sa použila ako cieľová línia na meranie indukcie CTL špecificky namierených proti gpl60. Myši Balb/c boli raz imunizované 10 μς gpl60 v kombinácii s alebo bez AF. Imunizácia sa uskutočnila subkutánnou injekciou do vankúšika na chodidle alebo do koreňa chvosta. Dva týždne po imunizácii boli z imunizovaných myší izolované bunky sleziny a tieto bunky boli in vitro stimulované prostredníctvom ožiarených buniek transfekovaných fpl60. Po päťdennej kultivácii in vitro bola účinnosť primárnej aktivácie stanovovaná meraním prítomnosti efektorových buniek schopných špecificky lyžovať bunky transfekované fpl60 a nelyzovať natransfekované bunkové línie. Získané výsledky sú zobrazené ná obrázku 7, na ktorom vidíme, že odpoveď CTL je mnohonásobne zosilnená prítomnosťou AF a gpl20.
Nasledujúci príklad demonštruje použitie antigénnych prípravkov podľa vynálezu s vyžitím iba jednej aleob dvoch zložiek. Tieto príklady ukazujú, že odpovede XTL môžu byť indukované s použitím iba dvoch z vyššie zmienených troch zložiek.
Príklad 6: Stanovenie zložiek nepostrádateľných na indukciu
CTL
Za účelom zistenia, či sú všetky z vyššie zmienených komponentov nevyhnutné na antigén-špecifickú indukciu CTL, boli myši imunizované ovalbumínom mikrofluidizovaným dvoch alebo troch v kombinácii s
AF. Použili sa prípravkom tvoreným komponetov prítomných nasleduj úce
PBS, Skvalán/Pluronic v rôznymi kombináciami vo vyššie zmienenej dvoj zložkové prípravky;
Skvalán/Tween
PBS alebo
Pluronic/Tween v PBS. Iné sady prípravkov sa použili v v ktorých boli myši imunizované pomocou ova v
..experimentoch, kombinácii s jednozlôžkovým systémom, napríklad v kombinácii so Skvalánom v PBS, kopolymérom Pluronic v PBS alebo Tweenom v PBS. Vyššie zmienený trojzložkový antigénny prípravok bol modifikovaný tak, že sa postupne vyčleňovali jednotlivé zložky a tieto zložky sa nahradili PBS.
Vyššie zmienené antígénne prípravky obsahujú: 0,300 g Tweenu 80 (Aldrich, WI) , 1,875 g Pluronic L121 (BASF, NJ) a
7,5 g Skvalánu (Aldrich, WI) doplnené do celkového objemu 50 ml PBS.
Použité dvojzložkové prípravky:
Skvalán/Tween: 0,300 g Tweenu 80 a 7,5 g Skvalánu doplnené do celkového objemu 50 ml PBS.
Pluronic/Tween: 1,875 g Pluronic L121 a 0,300 g Tweenu 80 doplnené do celkového objemu 50 ml PBS.
Pluronic/Skvalán: 1,875 g Pluronic L121 a 7,5 g Skvalánu doplnené do celkového objemu 50 ml PBS.
Vzorky sa spracovali v mikrof luidizéri, typ HOT,
Microfluidics corp, zatvorili do flaší a skladovali pri 4 °C až do doby použitia.
Ovalbumín (Sigma, MO) sa zvážil a rozpustil v HBSS (Whittaker, viď vyššie) na výslednú koncentráciu 0,3 mg/ml. Tento zásobný roztok ovalbumínu s koncentráciou 0,3 mg/ml sa zmiešal v nasledujúcich pomeroch s dvojzložkovým prípravkom: 5 dielov roztoku ovalbumínu s koncentráciou 0,3 mg/ml, 3,3 dielu dvojzložkového prípravku a 1,7 dielu HBSS.
Pripravený prípravok bol vortexovaný a uchovávaný na ľade až do doby, keď bol injikovaný. Všetky roztoky boli pred injikovaním.
dostala prostredníctvom injekcie zmiešané tesne
Každá myš do obidvoch vankúšikov na chodidlách 200 μΐ niektorého z prípravkov obsahujúceho 30 pg ova a zvyšný roztok bol subkutánne do koreňa chvosta.
Vlastné odobratie inj ikovaný sleziny sa uskutočnilo dva až štyri týždne
Dva týždne po imunizácii boli sleziny a tieto bunky prostredníctvom ožiarených kultivácie bola prítomnosť po imunizácii.
boli z myší izolované bunky in bitro stimulované buniek EG7-ova. Po piatich dňoch
CTL špecificky namierených proti ova meraná pomocou testov uskutočnených pri 4 °C na bunkách EG7-ova značených izotopom 51 Cr alebo na bunkách EL4 značených izotopom 51Cr, pri ktorých sa meralo uvoľňovanie izotopu 51Cr. Dáta znátornené na obrázkoch 8 až 10 ukazujú, že ovalbumín vpravený do mikrofluidizovaného dvojzložkového prípravku môže in vivo špecificky (proti ova) primárne aktivovať CTL.
Ďalej sme hodnotili telatívne príspevky jednotlivých zložiek vzhľadom k ich schopnosti indukovať, či sú prítomné v kombinácii, s proteínovými antigénmi,. CTL. Za účelom imunizácie bol rozpustný antigén zmiešaný s mikro-fluidizovanými excipientami a výsledkom bol vznik stabilnej homogénnej emulzie tvorenej časticami s veľkosťou 250 až 300 nm. Za účelom určenia, ktoré zo zložiek prípravku tvorené Skvalánom-Tweenom 80-Pluronic (STP) sú zodpovedné za indukciu CTL, sme imunizovali myši antigénom ova v kombinácii so zmesou Skvalán-Tween 80 (ST), so zmesou Pluronic-Tween 80 (PT) alebo so zmesou Sdvalán-Pluronic (SP) a ako kontrola sa použil antigén ova v kombinácii so Skvalánom (S) , Tweenom 80 (T) alebo kopolymérom Pluronic (P) . Myši boli tiež imunizované pomocou ova-SAF (obsahujúceho 70 pg MDP) alebo pomocou ova-alum, ktoré slúžili ako kontrolné adjuvans. Ako pozitívna kontrola sa použili myši imunizované bunkami sleziny cytoplazmaticky nasýtenými rozpustným ova. Použili sa tiež ďalšie kombinácie zložiek a také prípravky, v ktorých bola niektorá zo zložiek nahradená nejakým substituentom. Získané výsledky sú znázornené v Tabuľke 1.
Pri experimentoch slúžiacich na detekciu primárnej aktivácie CTL boli myši imunizované iba raz. Dva týždne po --imunizácii boli bunky sleziny zmiešané s ožiarenými bunkymi EG7-ova (bunkami EL4 exprimujúcimi ova) a po piatich dňoch kultivácie sa testovalo ich pôsobenie proti bunkám EG7-ova značených izotopom 51Cr alebo proti bunkám EL4 značených izotopom 51Cr. Získané výsledky (Obrázok 11 ukazujú, že 30 μς ova v kombinácii s STP alebo ST primárne aktivuje u myší odpoveď CTL, ktoré rozpoznávanú antigén v konteste MHC glykoproteínov I. triedy. Primárna aktivácia CTL špecificky namierených proti ova bola pri použití ova v kombinácii s STP alebo s ST lepšia, ako tomu bolo u primárnej aktivácie CTL pomocou buniek sleziny cytoplazmaticky nasýtených rozpustným ova. Ova v kombinácii s PT alebo s SP mohol síce u myší indukovať špecifické odpovede CTL, ale len veľmi slabo a nedôsledne. Pridanie MDP do prípravku obsahujúci ST neblokovalo, na rozdiel od účinkov na prípravok SAFm, u myší indukciu CTL špecificky namierených proti ova zmiešaného s jednotlivými zložkami - S, P alebo T - alebo ak boli myši imunizované pomocou ova-SAF alebo ova -alum, nedošlo ku žiadnej indukcii CTL špecificky namierených proti ova.Umyší imunizovaných ova v množstve až 1 mg v (A) kombinácii s HBSS, (b) v kombinácii s SAF alebo (c) absorbovaným v alum nedošlo k primárnej aktivácii CTL špecificky namierených proti ova.
Tabuľka 2: Indukcia odpovede CTL špecifecky namierenej proti ova nie je blokovaná prostredníctvom ST + MDP
Stimulant Cielové E:T cytotoxicita (v%) u myší bunky ** imunizovaných pomocou
-ova-ST ova-ST ova-ST-MDP ova-ST-MDP
300 gg/myš 72 gg/myš
EG7-ova EG7-ova 100:1 0 100 82 76
33:1 0 86 67 62
11:1 0 33 39 25
3:1 0 6 13 3
1:1 0 0 0 0
1:3 0 0 0 0
* myši boli imunizované 30 μg ova v kombinácii s rôznymi formuláciami ** cytotoxicita (v percentách) bola vypočítaná tak, že od percentálneho množstva usmrtených buniek daného typu bolo odčítané percento usmrtených buniek u línií, ktoré neexprimujú antigén
Príklad 7: Zložky nevyhnutné na produkciu protilátok špecificky namierených proti ova
Myši boli celkom trikrát v dvojtýždenných intervaloch imunizované pomocou 30 gg ova v kombinácii s HBSS, STP, ST, PT alebo SP; Ako pozitívna kontrola sa použili myši imunizované pomocou ova-SAF, pretože je známe, že SAF indukuje silnú protilátkovú odpoveď. Sedem dní podruhej a tretej imunizácii bol amyšiam odobratá krv a séra sa testovali naprítomnosť protilátok špecificky namierených proti ova. Získané vyýsledky sú uvedené v tabuľke 3. Tieto výsledky naznačujú, že myši imunizované pomocou ova v kombinácii s STP, ST alebo SAF vykazujú po dvoch imunizáciach podobné humorálne odpovede špecificky namierené proti ova.
Tabuľka 3: Indukcia protilátkovej odpovede namierenej proti ova
30 μg ova/zviera prípravok počet myší, u ktorých 1/zriedenie nastala reakcia/počet titer séra
myší injikovaných
HBSS 0/3 <1/20, <1/20, <1/20
STP 373 <1/4860, >1/4860,
<1/4860
ST 3/3 >1/4860, >1/4860,
>1/4860
PT NA NA, NA, NA
SP NA NA, NA, NA
SAF-M 3/3 1/4860, 1/4860,
1/4860
* NA; nie je k dispozícii
Príklad 8: Indukcia CTL špecificky namierená proti gpl20 vírusu HIV za účelom merania indukcie CTL bol ako druhý antigénny systém použitý gpl20 IIIB vírusu HIV v kombinácii s STP, ST alebo MP-T. Myši boli imunizované 1 gg gpl20 Illb v kombinácii s HBSS, STP, PT alebo ST. Ako kontrola sa použili myši imunizované 1 gg gpl20 Illb v kombinácii s SAF alebo SFA (kompletné Freundovo adjuvans) alebo v systéme RIBI, ktorý obsahuje MPL (monofosfátu lipidu A) a TDM (Trehalose dimycolite - dimykolit trehalózy). Tri týždne po imunizácii boli získané bunky sleziny a tieto bunky boli in vitro stimulované transfekovanými bunkami 15-12 vystavenými pôsobeniu mitomycínu alebo boli stimulované peptidom 18111b. Po piatich dňoch kultivácie boli vzniknuté efektorové bunky testované v pôsobení proti bunkám P815 infikovaným vírusom vaccinia:gpl60 alebo rodičovským vírusom vakcínia.
Získané výsledky ukazujú, že prípravok gpl20-SkvalánTween 80 indukoval u myší odpoveď CTL špecificky namierenú proti gpl20, ale k tejto indukcii nedošlo pri použití prípravku gpl20-Skvalán-Tween 80-Pluronic alebo gpl20-HBSS (Tabuľka 4).
Tabuľka 4: Indukcia odpovede CTL špecficky namierenej proti
gpl20 u myší
Stimulant delové bunky** E:T cytotoxicita imuni zovaných gpl20-HBSS' (v%) u pomocou ♦ gpl20-ST myší gpl20-STP
18IIIb/IL2 vakc:gpl20 100:1 23 42 NA *♦*
33:1 23 38 NA
11:1 0 0 NA
3:1 0 35 NA
18IIIb/IL2 15-12 100:1 0 50 0
33:1 0 35 0
11:1 0 27 0
3:1 0 18 0
Pokračovanie tabuľky 4
18IIIb/IL2 3T3 + 100:1 0 59 13
18111b
33:1 0 59 2
.11:1 0 ' 57 0
3:1 0 29 0
15-12 vakc:gpl20 100:1 35 84 NA
33:1 19 65 NA-
11:1 12 37 NA
3:1 0 22 NA
1:1 0 0 NA
♦myši boli imunizované 1 μς gpl20III v kombinácii s rôznymi formuláciami ** cytotoxicita (v percentách) bola vypočítaná tak, že od percentuálneho množstva usmrtených buniek daného typu bolo odpočítané percento usmrtených buniek u línií, ktoré neexprimujú antigén *** NA; nie je k dispozícii
Príklad 9: Indukcia humorálnej odpovede u myší špecificky namierenej proti gpl20
Za účelom indukcie humorálnej odpovede špecificky namierenej proti gpl20 boli myši imunizované 1 μς gpl20HIb celkom trikrát v dvojtýždenných intervaloch. Týmto zvieratám bola odobratá krv a získané sérum bolo metódou ELISA na pevnej fáte testované na prítomnosť protilátok typu IgG namierených proti gpl20IIIb. Získané výsledky ukazujú, že gpl20-ST je viac imunogénny ako gpl20-HBSS, gpl20-SAF alebo gpl20-STP (Tabuľka 5).
Tabuľka 5: Indukcia protilátkovej odpovede namierenej proti gp!20
1 μς gpl20/zviera formulácia počet myši, u ktorých nastala reakcia/počet myší injikovaných 1/zriedenie titer séra
HBSS 0/3 . <1/20, <1/20, <1/20
STP 1/3 <1/20, >174860, <1/20
ST 3/3 >1/4860, >1/4860,
>1/4860
PT 3/3 >1/4860, >1/4860,
>1/4860
SP 2/3 <1/20, 1/540, 1/540
SAF-M 2/3 1/180, >1/4860, 1/540
Príklad 10:
Opice gpl20-SAFm,
Protilátkové odpovede špecificky namierené proti gpl20 u opíc (dve v skupine) boli imunizované pomocou gpl20-SPT, gpl20-ST alebo gpl20-HBSS. Ako kontrola sa imunizované gpl60lIIb.
intervaloch použila skupina opíc, rekombinantným vírusom
Opice boli imunizované kde boli vakcínia zvieratá nesúcim imunizácii.
v dvojtýždenných týždne po druhej Séra získané z každej opice pred imunizáciou a po imunizácii boli postupne zrieďované a metódou ELISA, tak ako a krv im bola odobratá tri —je 7opísané v oddiele Materiál a metódy, bola . v sérach stanovovaná protilátková aktivita proti gpl20. Dáta (obrázok
12) naznačujú, že u opíc imunizovaných gpl20-STP alebo gpl20-SAFm sú indukované podobne silné humorálne odpovede. U jednej opice imunizovanéj pomocou gpl20-ST bola indukovaná odpoveď' proti gpl20 podobná odpovediam u opíc imunizovaných pomocou gpl20-SAFm alebo gpl20-SPT. U jednej opice imunizovanej pomocou gpl20-ST nedošlo ani po dvoch imunizáciách k indukcii silnej odpovede proti gpl20.
Príklad 11: In vivo aktivita AF použitej v kombinácii s HPV
E7
1. Tvorba rekombinantného proteínu HPV 16 E7 použitého na imunizáciu
a) PCR a klonovanie génu E7
Gén HPV 16 E7 bol klonovaný z plazmidu získaného od Dr. Karen Vousdenovej (Ludwig Inštitúte) kódujúceho gén E7 odvedený z bunkovej línie karcinómu CaSki. Kódujúce oblasti boli amplifikované pomocou PCR s použitím primérov, ktoré sú komplementárne k 5'a 3' koncom kódujúcej sekvencie génu a naviac obsahujú klonovacie miest pre reštrikčné enzýmy BamHI a Sal I. PCR produkt E7 bol zaligovaný do expresívneho vektoru pGEX - 4T-1 (Pharmacia Biotech) a výsledkom tejto ligácie bol expresívny plazmid pGEX.E7. Týmto expresívnym plazmidom pGEX.E7 boli transfekované baktérie E. coli kmene XL1 - blue (Stratagene). Sekvencia génu E7 získaná z plazmidov izolovaných z vyrastených kolónií bola rovnkaá ako sekvencia génu E7 získaného z buniek CaSki.
b) Produkcia a purifikácia proteínu E7 produkovaného baktériami
Bakteriálny expresívny plazmid pGEX.E7 kóduje fúzny proteín glutatión-S-transferázy (GST), ktorý sa skladá z GST na NH2 konci nasledované štiepnym miestom rozpoznávaným proteázou trombín a karboxy-koniec je tvorený proteínom E7. ‘Proteín E7 bol produkovaný a purifikovaný spôsobom opísaným v katalógu získanom od výrobxu vektoru pGEX-4T-l (Pharmacia Biotech). Stručne povedané, u baktérií obsahujúcich expresívny plazmid pGEX.E7 bola expresia tohoto fúznaho proteínu indukovaná pridaním izopropyl-p-D-tiogalaktozidázy do kultivačného média. Bunky boli usporiadané a lyzované miernou sonikáciou. Bunkový lyzát bol vpravený do roztoku Glutathion Sepharozy 4B (Pharmacia Biotech). Potom čo sa fúzny proteín navieže na matrix, je táto matrix premytá za účelom odstránenia nešpecifický naviazaných proteínov.
Naviazaný fúzny protein bol rozštiepený trombínom. Pri tomto· štiepení bol protein E7 odštiepený od GST na fúznom proteíne.
Takto pripravený protein E7 bol analyzovaný prostredníctvom SDS elektroforézy na polyakrylamidovom géle a koncentrácia . proteínu bola stanovená metódou podľa Bradfordovej (BioRad). Z jedného litra bakteriálnej kultúry bolo získané 9 mg rozpustného proteínu E7.
2. Vytvorenie transfektantov X21 transfekovaných génom kódujúcim protein E7
Kódujúce sekvencie proteínu E7 vírusu HPV16 (viď vyššie) boli vložené do eukaryotického expresívneho plazmidu INPEP4 (chránená známka firmy IDEC). V tomto vedtore je expresia génu E7 riadená transkripčnými prvkami, promótorom/zosilňovačom transkripcie, Cytomegalovírusu. Naviac, prvé tri nukleotidy kódujúcej sekvencie génu E7 boli odstránené a nahradené vedúcou sekvenciou imunoglobulínového ľahkého reťazca, ktorá bola umiestnená do miesta ležiaceho proti smeru transkripcie hneď vedľa kódujúcej oblasti génu E7 a nachádzajúceho sa v rovnakom čítacom rámci ako kódujúca oblasť génu E7. Po transfekcii myšej bunkové línie X21 týmto konštruktom bola u jednotlivých klonov buniek rezistentných voči antibiotiku G418 zisťovaná, pomocou analýzy metódou Northern blot, produkcia messengerovej RNA kódujúcej protein E7. Každý kloň vykazoval detekovateľné množstvo messengerovej RNA kódujúcej protein E7. U bunkových lyzátov dvoch klonov 4E7 a 1C7 (nazývané tiet HOPE1 a HOPE2) bola uskutočnená analýza metódou Western blot a táto ananlýza dokázala produkciu proteínu E7 v týchto klonoch.
3. In vivo účinnosť imunizácie pomocou rozpustného antigénu E7/AF
‘r: '...;
K týmto štúdiám sa použili samice myši C3H (H2k/k, Harlan Sprague Dawley). Zo zvieratami sa zachádzalo v súlade s Guide f or the Čare and Use of Laboratory Animals (DHHS Publication No. NIH 86 až 123, Bethesda, MD:NIH, 1985), bol im poskytovaný dostatok potravy a vody. Pri týchto štúdiách sa použila bunková línia buniek HOPE2 H2k/k transfekovaná génom E7. Línia nádorových buniek bola in vitro udržovaná opakovaným pasážovaním.
U tejto bunkovej línie bolo dokázané, že je aj po opakovanom pasážovaní in vitro schopná cytoplazmatickej expresie antigénu E7. Táto skutočnosť bola dokázaná Western blotovou analýzou. Rast nádorov bol u syngénnych myší C3H iniciovaný prostredníctvom subkutánnej injikácie buniek pasážovaných in vitro v množstve 150000 buniek.
Veľkosť nádorov bola meraná v dvoch na seba kolmých smeroch v intervaloch dvoch týždňov. Objem jednotlivých nádorov (V) bol Vypočítaný podľa nasledujúceho vzorca:
v (mm3) = (LxW2) /2 kde:
L = najdlhšia nameraná os v mm w = os kolmá na L (mm)
Dáta v Tabuľke 6 sú prezentované ako Počet myší s nádorom (počet zvierat majúcich nádor vzhľadom k celkovému počtu injikovaných zvierat) . Dáta na obrázkoch 13 a 14 sú prezentované ako medián veľkosti nádorov (mm3) u každej liečenej skupiny a u kontrolnej skupiny. Každá liečená skupina bola porovnávaná s kontrolnou skupinou, ktorá nepodstupovala terapiu. Terapia bola zahájená 10 dní po inokulácii zvierat bunkami HOPE2, keď bola väčšina nádorov už hmatateľná (približne 50 až 75 mm3) . Terapia bola zahájená imunizáciou myší rozpustným proteínom E7 v kombinácii s AF alebo s adjuvans Alum (subkutánne, celkový objem 0,2 ml).
Tesne pred imunizáciou bola AF miešaná počas 30 sekúnd s proteinom E7 v Hnakovom rovnovážnom roztoku soli (HBSS) tým spôsobom, aby každá myš dostala buď 30 μς alebo 90 μς proteinu E7 v 0,2 ml roztoku. Alum (Pierce Chemical Co.) bolo zmiešané s proteinom E7 podlá inštrukcií výrobcu, tak aby každá myš dostala 90 μς proteinu E7 v 0,2 ml roztoku. Zvieratá v druhej liečenej skupine boli imunizované o 9 dní neskôr (19 dni po inokulácii nádorových buniek). Zložky použité na druhú imunizáciu (pripomínacia dávka) boli pripravené tesne pred inokuláciou spôsobom opísaným vyššie.
V tomto príklade (tabuľka 6: experiment #223), 41 dní po inokulácii nádorových buniek, len 4/8 a 5/8 z myší imunizovaných raz injekciou rozpustného E7 v kombinácii s AF (30 μς v prvom prípade alebo 90 μς v druhom prípade) malo merateľné nádory. Naopak všetky myši imunizované proteinom E7 v kombinácii s Alum (8/8) mali aktívne rastúce nádory. Naviac, ako je zobrazené na obrázku 13, len u liečených skupín imunizovaných proteinom E7 v kombinácii s AF bola pozorovaná významná inhibícia rastu nádorov, ako je patrné z porovnania týchto skupín s kontrolnou skupinou (neliečenou) alebo s liečenými skupinami imunizovanými proteinom E7 v kombinácii s Alum. U myší imunizovaných raz injekciou proteinu E7 v Alum nebola pozorovaná inhibícia rastu nádorov (obrázok 13) alebo zvýšená rýchlosť ΓβςΓθείβ nádorov.(tabuľka 6) .
Podobné výsledky boli tiež pozorované u liečených skupín, ktoré boli imunizované celkom dvakrát, 10 a 19 dní po inokulácii nádorovými bunkami (tabuľka 6 a obrázok 14), aj keď čiastočné spomalenie rastu nádorov bolo pozorované aj u myší imunizovaných dvoma injekciami proteinu E7 v kombinácii s Alum.
Získané výsledky naznačujú, že významná protinádorová aktivita, ktorá bola meraná prostredníctvom zníženia počtu myší nesúcich nádory a inhibíciou rastu nádorov, bola pozorovaná následne po imunizáčii rozpustným E7 v kombinácii s AF. Naopak u všetkých zvierat imunizovaných buď jedinou alebo dvomi injekciami rozpustného proteinu E7 v kombinácii s AF mala za následok významnú inhibiciu rastu nádorových buniek, ktorá nebol spozorovaná .pri imunizáčii pomocou rozpustného proteinu E7 v kombinácii s Alum.
Tabuľka 6:
Protinádorová aktivita pri imunizáčii pomocou rozpustného proteinu E7 v kombinácii s adjuvans
Experiment Liečba
Dávka
Počet zvierat (μς/πιγζ) s nádormi3
41. deň
223 kontrola
223 E7 v kombinácii
223 E7 v kombinácii
223 E7 v kombinácii
223 E7 v kombinácii
223 E7 v kombinácii
E7 v kombinácii
7/8 s AF 30 μς x lb 4/8 s AF 90 μς x 1 5/8 s Alum 90 μς x 1 8/8 s AF 30 μς x 2C 3/8 s AF 90 μς x 2 1/4 s Alum 90 μς x 2 8/8
a. Počet myší majúcich nádory/celkový počet myší, ktoré boli inokulované
b. Všetky imunizácie začali 10. Deň po implantácii
c. Druhá imunizácia (x21) bola uskutočnená 19. Deň po implantácii
Ďalšie uskutočnenia vynálezu sú opísané v nasledujúcich patentových nárokoch.

Claims (4)

1. Kompozícia, vyznačujúca sa, tým, že obsahuje antigén zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom obsahujúcim:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovateľný a biokompatibilný olej pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, v podstate neobsahuje žiadne imunostimulujúce peptidy a po administrácii do živočícha vybratého zo skupiny tvorenej človekom, domácimi zvieratami a hospodárskymi zvieratami, je schopný indukovať špecifickú odpoveď cytotoxických T-lymfocytov proti antigénu, ktorý je v tejto kompozícii obsiahnutý.
2. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že antigén je vybratý zo skupiny tvorenej antigénnymi oblasťami antigénov vírusu HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev; z antigénnych oblastí antigénov malárie: proteínu CS a povrchovému proteínu 2 sporozoitu; z antigénnych oblastí povrchových antigénov vírusu hepatitídy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a Hbe Ag; z antigénnych oblastí antigénov vírusu chrípky: HA, NP a NA; z antigénnych oblastí povrchových antigénov vírusu hepatitídy A: z antigénnych oblastí antigénov herpetického vírusu: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, skorého proteínového produktu HSV, cytomegalovírusu gB, cytomegalovírusu gH a proteínu gP72 IE; z antigénnych oblastí antigénov syncyciálneho vírusu napadajúceho respiračný systém: proteínu F, proteínu G a proteínu N; a z antigénnych oblastí antigénov spojených s rakovinou: produktu CEA karcinómu, mucínu asociovaného s karci- nómami, produktu P21 karcinómu, produktu P53 karcinómu, produktu MPG melanómu, produktu p97 melanómu a produktu onkogénu Neu karcinómu, produktu génu p53 karcinómu a mutovaného proteinu p21 ras.
3. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje antigén zmiešaný s mikrof.luidizovaným antigénnym prípravkom obsahujúcim:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelný a biokompatibilný olej pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, neobsahuje žiadne imunostimulujúce peptidy a po administrácii do živočícha vybratého zo skupiny tvorenej človekom, domácimi zvieratami a hospodárskymi zvieratami, je schopný indukovať špecifickú odpoveď cytotoxických T-lymfocytov proti antigénu, ktorý je v tejto kompozícii obsiahnutý.
4 . Kompozícia podlá nároku 3, vyznačujúca sa tým, že antigénny prípravok pozostáva v podstate z uvedeného detergentu, činidla a oleja. 5. Kompozícia podlá nároku 3, vyznačujúca sa tým, že antigénny prípravok je netoxický pre človeka alebo pre domáce či hospodárske zviera. 6. Kompozícia podlá nároku 3, vyznačujúca sa tým, že
antigén je vybratý zo skupiny tvorenej antigénnymi oblasťami antigénov vírusu HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev; antigénmi malárie: proteínom CS a povrchovým proteínom 2 sporozoitu; povrchovými antigénmi vírusu hepatitídy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a Hbe Ag; antigénmi vírusu chrípky: HA, NP a NA; povrchovými antigénmi vírusu hepatitídy A: z antigénnych oblastí antigénov herpetického vírusu: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, skorým proteínovým produktom HSV, cytomegalovirusom gB, cytomegalovirusom gH a proteínom gP72 IE; antigénmi syncyciálneho vírusu napadajúceho respiračný systém: proteínom F, proteínom G a proteínom N; a antigénmi spojenými s rakovinou: produktom CEA karcinómu, mucínom asociovaným s karcinómami, produktom P21 karcinómu, produktom P53 karcinómu, produktom MPG melanómu, produktom p97 melanómu a produktom onkogénu Neu karcinómu, produktom génu p53 karcinómu, a mutovaným proteínom p21 ras.
7. Spôsob indukcie odpovede cytotoxických T-lymfocytov vo živočíchovi vybratom zo skupiny tvorenej človekom, domácimi a hospodárskymi zvieratami, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie takej prímesi uvedenému živočíchovi, ktorá obsahuje antigén a mikrofluidizovaný antígénny prípravok pozostávajúci z
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel
c) biologicky degradovateľného a biokompatibilného oleja pričom tento antígénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi peptidmi a je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto primes tomuto živočíchovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov proti antigénu, ktorý je v tejto prímesi obsiahnutý.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že antígénny prípravok pozostáva v podstate z uvedeného detergentu, činidla a oleja.
9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že pozostáva v podstate z jediného podania uvedenej zmesi človeku alebo uvedenému zvieraťu.
10. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že človek alebo uvedené zviera je nakazené vírusom alebo vykazuje jeden alebo viac príznakov vírusovej infekcie.
11. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že antigénny prípravok je netoxický pre človeka alebo pre domáce či hospodárske zviera.
12. Spôsob podľa nároku je vybratý gpl60, gag, ternom CS povrchovými Pre-S2,
NP a NA; herpetického gD, gB, syncyciálneho proteínom spojenými spojeným produktom produktom karcinómu, proteínom p21 ras.
13. Spôsob liečby pacienta vyznačujúci sa tým,
7, vyznačujúci sa tým, že antigén zo skupiny tvorenej antigénmi vírusu HIV: pol, Nef, Tat a Rev; antigénmi malárie: proa povrchovým proteínom 2 sporozoitu; antigénmi vírusu hepatitídy B: Pre-Sl,
HBc Ag a Hbe Ag; antigénmi vírusu chrípky: HA, antigénmi vírusu hepatitídy A: z antigénmi vírusu: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV skorým proteínovým produktom HSV, cytomegalovírusom cytomegalovírusom gH a proteínom gP72 IE; antigénmi vírusu napadajúceho respiračný systém:
F, proteínom G á proteínom N; a antigénmi s rakovinou: produktom CEA karcinómu, mucínom s karcinómami,
P53 karcinómu, p 97 melanómu produktom génu produktom P21 karcinómu, produktom MPG melanómu, a produktom onkogénu Neu p53 karcinómu, a mutovaným infikovaného vírusom HIV, že zahŕňa podanie kompozície obsa50 hujúcej antigén vírusu HIV zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom, ktorý obsahuje:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degŕadovatéľný a' biokompátibilný olej pričom tento antigénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi peptidmi a je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto prímes pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
14. Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že antigén vírusu HIV je vybratý zo skupiny tvorenej antigénmi gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev.
15. Spôsob liečby pacienta trpiaceho maláriou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie mikrofluidizovanej kompozície obsahujúcej antigén spojený s maláriou zmiešaný s antigénnym prípravkom, ktorý obsahuje:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovateľný a biokompátibilný olej pričom tento antigénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi peptidmi a je tvorený
‘.stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto prímes pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým , že antigén spojený s maláriou je vybratý zo skupiny tvorenej proteínom CS a povrchovým proteínom 2 sporozoitu.
17. Spôsob liečby pacienta trpiaceho chrípkou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie kompozície obsahujúcej anti- gén spojený s chrípkou zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom, ktorý obsahuje:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovatéľný a. biokompatibilný olej pričom tento antigénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi peptidmi a je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto prímes pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
18. Spôsob podlá nároku 17, vyznačujúci sa tým, že antigén spojený s chrípkou je vybratý zo skupiny tvorenej proteínmi HA, NP a NA.
19. Spôsob liečby pacienta trpiaceho hepatitídou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie kompozície obsahujúcej antigén spojený s hepatitídou zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom, ktorý obsahuje:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovateľný a biokompatibilný olej pričom tento antigénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi. peptidmi a je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto prímes pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že antigén spojený s hepatitídou je vybratý zo skupiny tvorenej povrchovým antigénom hepatitídy A, Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a antigénom Hbe.
21. Spôsob liečby pacienta trpiaceho rakovinou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie kompozície obsahujúcej antigén spojený s rakovinou zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom, ktorý obsahuje: .a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelný a biokompatibilný olej pričom tento antigénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi peptidmi a je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto prímes pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že antigén spojený s rakovinou je vybratý zo skupiny tvorenej produktom CEA karcinómu, mucínom spojeným s karcinómami, produktom P21 karcinómu, produktom P53 karcinómu, produktom MPG melanómu, produktom p97 melanómu a produktom onkogénu Neu karcinómu, produktom génu p53 karcinómu, a mutovaným proteínom p21 ras.
23. Spôsob liečby pacienta infikovaného herpetickým vírusom, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie kompozície obsahujúcej antigén herpes vírusu zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom, ktorý obsahuje:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelný a biokompatibilný olej pričom tento antigénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi peptidmi a je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto prímes pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým , že antigén herpetického vírusu je vybratý zo skupiny tvorenej antigénmi EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, HSV gH, skorým proteínovým produktom HSV, cytomegalovirusom gB, cytomégalovirusom gH a proteinom gP72.
25. Spôsob liečby pacienta infikovaného syncyciálnym vírusom, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie kompozície obsahujúcej antigén syncyciálneho vírusu napadajúceho respiračný systém zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom, ktorý obsahuje:
a) stabilizujúci detergent
b) činidlo podporujúce tvorbu miciel
c) biologicky degradovateľný a biokompatibilný olej pričom tento antigénny prípravok neobsahuje žiadnu zložku tvorenú imunostimulujúcimi peptidmi a je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, pričom je táto prímes pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že antigén syncyciálného vírusu napadajúceho respiračný systém je vybratý zo. skupiny tvorenej proteinom F, G a N.
'27. Spôsob indukcie odpovede cytotoxických T-lymfocytov v človeku alebo v domácom či hospodárskom zvierati, vyznačujúci sa tým , že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje antigén a mikrofluidizovaný antigénny prípravok pozostávajúci v podstate z dvoch z nasledujúcich zložiek:
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto zmes živočíchovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolaniu špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že človek alebo domáce či hospodárske zviera je infikované vírusom a trpí jedným alebo viacerými príznakmi infekcie týmto vírusom.
29. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že antigénny prípravok nie je pre človeka alebo domáce či hospodárske zviera toxický.
30. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že antigén je vybratý zo skupiny tvorenej antigénnymi oblasťami antigénov vírusu HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat, a Rev; antigénmi malárie : proteínom CS a povrchovým proteínom 2 sporozoitu; antigénnymi . oblasťami povrchových antigénov vírusu hepatitídy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a HBe Ag; antigénmi vírusu chrípky: HA, NP a NA; antigénmi vírusu hepatitídy A; antigénmi herpetického vírusu: EBV gp340,
EBV gp85, HSV gp, HSV gD, skorým proteínovým produktom HSV cytomegalovírusom gB, cytomegalovírusom gH a proteínom gP72 IE; antigénmi syncycialného vírusu napádajúceho respiračný systém: proteínom F, proteínom G, a proteínom N; a antigénmi spojenými s rakovinou:
produktom CEA karcinómu, mucínom spojeným s karcinómom, produktom P21 karcinómu, produktom P53 karcinómu, produktom MPG melanómu, produktom p97 melanómu a produktom onkogénu Neu karcinómu, produktom génu p53 karcinómu a mutovaným proteínom p 21 ras.
31. Spôsob liečby pacienta infikovaného vírusom HIV, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje antigén vírusu HIV zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom pozostávajúcim v podstate z dvoch z následujúcich zložiek:
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel . c) biologicky degradovateľného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto kompozícia pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolaniu špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
32. Spôsob podlá nároku 31, vyznačujúci sa tým, že antigén vírusu HIV je vybratý z antigénov gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rv.
33. Spôsob liečby pacienta trpiaceho maláriou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje antigén spojený s maláriou zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom pozostávajúcim v podstate z dvoch z nasledujúcich zložiek:
gg) stabilizujúceho detergentu hh) činidla podporujúceho tvorbu miciel ii) biologicky degradovateľného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto kompozícia pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že antigén spojený s maláriou je vybratý z proteínu CS a povrchového proteínu 2 sporozoitu.
35. Spôsob liečby pacienta trpiaceho chrípkou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje antigén spojený s chrípkou zmiešaný s mikrofluidizovaným anti génnym prípravkom, pozostávajúcim v podstate z dvoch z nasledujúcich zložiek:
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel
c) biologicky degradovateľného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto kompozícia pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že antigén spojený s vírusom chrípky je vybratý z antigénov HA, NP a NA.
37. Spôsob liečby pacienta trpiaceho hepatitídou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje antigén spojený s hepatitídou zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom pozostávajúcim v podstate z dvoch z nasledujúcich zložiek:
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto kompozícia -pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že antigén spojený s vírusom hepatitídy je vybratý z povrchových antigénov vírusu hepatitídy A, Pre. SI, Pre-S2, HBc-Ag a HBe Ag.
39. Spôsob liečby pacienta trpiaceho rakovinou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje anti gén spojený s rakovinou zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom pozostávajúcim v podstate z dvoch z nasledujúcich zložiek:
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto kompozícia pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
40. Spôsob podlá nároku 39, vyznačujúci sa tým, že s rakovinou spojený antigén je vybratý zo skupiny tvorenej produktom CEA karcinómu, mucínom spojeným s karcinómami, produktom P21 karcinómu, produktom P53 karcinómu, produktom MPG melanómu, produktom p97 melanómu a produktom onkogénu Neu karcinómu, produktom génu p53 karcinómu a mutovaným proteínom p21 ras.
41. Spôsob liečby pacienta trpiaceho herpetickým vírusom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje antigén herpetického vírusu zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom pozostávajúcim v podstate z dvoch z následujúcich zložiek:
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto kompozícia pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
42. Spôsob podlá nároku 41, vyznačujúci sa tým, že antigén herpetického vírusu je antigénny EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gd, skorým proteínovým produktom HSV, proteínom gB cytomegalovírusu, proteínom gH cytomegalovírusu a proteínom gP72 IE.
43. Spôsob liečby pacienta, trpiaceho syncyciálným vírusom napádajúcim respiračný systém, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie zmesi, ktorá obsahuje antigén syncyciálneho vírusu napádajúceho respiračný systém zmiešaný s mikrofluidizovaným antigénnym prípravkom pozostávajúcim v podstate z dvoch z následujúcich zložiek:
a) stabilizujúceho detergentu
b) činidla podporujúceho tvorbu miciel
c) biologicky degradovatelného a biokompatibilného oleja pričom tento antigénny prípravok je tvorený stabilnou emulziou olej vo vode, a pričom je táto kompozícia pacientovi podaná v množstve dostatočnom na vyvolanie špecifickej odpovede cytotoxických T-lymfocytov.
44. Spôsob podľa nároku 43, vyznačujúci sa tým, že antigén syncyciálneho vírusu napádajúcého respiračný systém je vybratý zo skupiny tvorenej proteínom F, proteínom G a proteínom N.
45. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 25 až 44, vyzna’čujúci sa tým, že antigénny prípravok sa takmer výhradne skladá z uvedeného detergentu a z uvedeného činidla podporujúceho tvorbu miciel.
46. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 25 až 44, vyznačujúci sa tým, že antigénny prípravok sa takmer výhradne skladá z uvedeného detergentu a z uvedeného oleja.
47. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 25 až 44, vyznačujúci sa tým, že antigénny prípravok sa takmer výhradne
5Š skladá z uvedeného oleja a z uvedeného činidla podporujúceho tvorbu miciel.
48. Kompozícia podlá nároku 6, vyznačujúca sa tým, že antigén papilomavírusu je vybratý zo skupiny tvorenej antigénmi HPV16 E6, HPV16 E7, HPV18 E6, HPV18 E7, HPV6 E4, HPV6 Ll, HPV11 E4. a HPV11 Ll.
49. Spôsob liečby cervikálného nádoru, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podanie účinného množstva antigénného prípravku z ľudského papilomavírusu podľa nároku 48.
50. Spôsob liečby špicatého kondylómu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podanie účinného množstva antigénného prípravku z ľudského papilomavírusu podľa nároku 48.
51. Spôsob liečby rakoviny, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podanie kompozície podľa nároku 6, pričom antigénom je špecifický antigén prostaty.
52. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že stabilizujúci detergent je vybratý zo skupiny polysorbát 80, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Zwittergent 3-12, Teepol HB7 a Span 85.
53. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že detergent je prítomný v množstve od približne 0,05 do 0,5%.
54. Kompozícia podľa nároku 53, vyznačujúca sa tým, že množstvo detergentu je približne 0,2 %.
55. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje činidlo podporujúce tvorbu miciel, ktorého rovnováha na rozhraní hydrofilno-lipofilnej látky sa pohybuje v rozmedzí 0 až 2.
56. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že činidlo podporujúce, tvorbu miciel je vybraté z týchto činidiel: poloxamer, Pluronic L62LF, Pluronic L101, Pluronic L64, PEG1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic 701, Tetronic 901, Tetronic 1301 a Tetronic 130R1.
57. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že činidlo podporujúce tvorbu miciel prítomné v množstve od 0,5 do 10 %.
58. Kompozícia podlá nároku 57, vyznačujúca sa tým, že činidlo podporujúce tvorbu miciel je prítomné v množstve od 1,25 do 5 %.
59. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že teplota topenia oleja je nižšia ako 60 °C.
60. Kompozícia podlá nároku 59, vyznačujúci sa tým, že olej je vybratý zo skupiny tvorenej skvalénom, skvalánom, eikozánom, tetratetrakontánom, pristánom, glycerolom, a
rastlinným olejom. 61. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že množ- stvo oleja je v rozsahu 1 až 10 %. 62. Kompozícia podlá nároku 61, vyznačujúca sa tým, že množ- stvo oleja je v rozsahu 2,5 až 5 %. 63. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsa- huj e menej ako 20 gg muramyl dipeptidu.
64. Kompozícia podľa nároku 63, vyznačujúca satým, že neobsahuje muramyl dipeptid.
65. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že detergent je polysorbáť 80 a činidlo podporujúce tvorbu miciel je poloxamér 401.
66. Kompozícia podľa nároku 65, vyznačujúca sa tým, že olejom je skvalán.
67. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že detergent je vybratý z detergentov Tween 20, Tween 40 a Tween 80, olej je vybratý zo skupiny tvorenej skvalánom, eikozánom a pristánom a činidlo podporujúce tvorbu miciel je vybraté zo skupiny tvorenej Pluronicom L62LF a poloxamérom 401.
68. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že detergent je vybratý z detergentov: polysorbát 80, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Zwittergent 3-12, Teepol HB7 a Span 85.
69. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že detergent prítomný v množstve od približne 0,05 do 0,5 %.
-70. Spôsob podľa nároku 69, vyznačujúci sa tým, že množstvo detergentu je približne 0,2 %.
71. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že obsahuje činidlo podporujúce tvorbu miciel, ktorého rovnováha na rozhraní hydrofilno-lipofilnej látky sa pohybuje v rozsahu 0 až 2.
72. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že činidlo podporujúce tvorbu miciel je vybraté z týchto činidiel: poloxamér, Pluronic L62LF, Pluronic L101, Pluronic L64, PEG1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic701, Tetronic 901, Tetronic 1301 a Tetronic 130R1.
73. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, . že množstvo činidla podporujúceho tvorbu miciel je od 0,5 do 10 %.
74 . Spôsob podľa nároku 71, vyznačujúci sa tým, že množstvo činidla podporujúceho tvorbu miciel je od í 1,25 do 5 %. 75. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že teplota topenia oleja je nižšia ako 60 °C. 76. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že olej je
vybratý zo skupiny tvorenej: skvalénom, eikozánom, tetratetrakontánom, pristánom, glycerolom a rastlinnými olejmi.
77. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že množstvo oleja je v rozsahu 1 až 10 %.
78. Spôsob podľa nároku 77, vyznačujúci sa tým, že množstvo oleja je v rozsahu 2,5 až 5 %.
‘79. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že primes obsahuje menej ako 20 μς muramyl dipeptidu.
80. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že primes neobsahuje muramyl dipeptid.
81. Spôsob podľa nároku 81, vyznačujúci sa tým, že detergent je polysorbát 80 a činidlo podporujúce tvorbu miciel je poloxamér 401.
82. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že olej je skvalán.
83. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že detergent je vybratý ž detergentov Tween 20, Tween 40 a Tween 80, olej je vybratý zo skupiny tvorenej skvalánom, eikozánom, olivovým olejom a pristanom a činidlo podporujúce tvorbu miciel je vybraté zo skupiny tvorenej Pluronicóm L62LF a poloxamérom 401.
84. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že častice v primesi majú veľkosť od 250 do 300 nm.
85. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že častice v kompozícii majú veľkosť od 250 do 300 nm.
SK713-97A 1994-12-07 1995-11-29 Pharmaceutical compositions inducting cytotoxic t-lymphocyte response SK71397A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/351,001 US5709860A (en) 1991-07-25 1994-12-07 Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
PCT/US1995/015433 WO1996017863A1 (en) 1994-12-07 1995-11-29 Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK71397A3 true SK71397A3 (en) 1997-11-05

Family

ID=23379172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK713-97A SK71397A3 (en) 1994-12-07 1995-11-29 Pharmaceutical compositions inducting cytotoxic t-lymphocyte response

Country Status (33)

Country Link
US (2) US5709860A (sk)
EP (1) EP0801656A4 (sk)
JP (1) JPH10510264A (sk)
CN (2) CN1109046C (sk)
AP (1) AP661A (sk)
AR (1) AR002255A1 (sk)
AU (1) AU699044B2 (sk)
BG (1) BG63262B1 (sk)
BR (1) BR9509872A (sk)
CA (1) CA2204738A1 (sk)
CZ (1) CZ293439B6 (sk)
EE (1) EE03569B1 (sk)
FI (1) FI972431A (sk)
GE (1) GEP20012556B (sk)
HK (1) HK1008226A1 (sk)
HU (1) HUP9800946A2 (sk)
IS (1) IS4479A (sk)
LT (1) LT4308B (sk)
LV (1) LV11866B (sk)
MD (1) MD1586G2 (sk)
MX (1) MX9704097A (sk)
NO (1) NO972521L (sk)
NZ (1) NZ298582A (sk)
OA (1) OA10736A (sk)
PL (1) PL183954B1 (sk)
RO (1) RO120065B1 (sk)
RU (1) RU2201253C2 (sk)
SI (1) SI9520148A (sk)
SK (1) SK71397A3 (sk)
TJ (1) TJ384B (sk)
TW (1) TW487575B (sk)
UA (1) UA49814C2 (sk)
WO (1) WO1996017863A1 (sk)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197311B1 (en) * 1991-07-25 2001-03-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
EP0671926B1 (en) * 1992-08-11 2002-11-13 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory peptides
MY131805A (en) * 1997-09-18 2007-09-28 Biogen Idec Inc Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis.
US6013258A (en) * 1997-10-09 2000-01-11 Zycos Inc. Immunogenic peptides from the HPV E7 protein
US6183746B1 (en) 1997-10-09 2001-02-06 Zycos Inc. Immunogenic peptides from the HPV E7 protein
FR2771640B1 (fr) * 1997-12-03 2000-02-11 Inst Nat Sante Rech Med Micelles mixtes de lipopeptides pour l'induction d'une reponse immunitaire et leurs utilisations a des fins therapeutiques
AU3344299A (en) * 1998-04-20 1999-11-08 Shionogi & Co., Ltd. Th2-migration promoters containing w/o emulsions
US20010033839A1 (en) * 1999-10-04 2001-10-25 Emilio Barbera-Guillem Vaccine and immunotherapy for solid nonlymphoid tumor and related immune dysregulation
WO2000049655A1 (en) * 1999-02-18 2000-08-24 Seiko Epson Corporation Semiconductor device, circuit board, method of manufacturing circuit board, and electronic device
CA2366908A1 (en) * 1999-03-24 2000-09-28 The Secretary Of State For Defence Vaccine composition
US20050100928A1 (en) * 1999-09-16 2005-05-12 Zycos Inc., A Delaware Corporation Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
FR2805163A1 (fr) * 2000-02-21 2001-08-24 Pf Medicament Utilisation d'un detergent de type zwittergent pour la preparation d'une composition pharmaceutique destinee a etre administree par voie nasale
US7767197B2 (en) * 2000-06-22 2010-08-03 Endo Pharmaceuticals Colorado LLC Delivery vehicle composition and methods for delivering antigens and other drugs
FR2814957B1 (fr) * 2000-10-06 2002-12-20 Aventis Pasteur Composition vaccinale et procede de stabilisation
WO2003104429A2 (en) * 2002-06-10 2003-12-18 Idec Pharmaceuticals Corporation Genes overexpressed by ovarian cancer and their use in developing novel therapeutics
AU2003254792A1 (en) * 2002-08-02 2004-02-23 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Bacterial cell wall skeleton component preparaion
BR0314629A (pt) 2002-09-19 2005-08-02 Us Gov Health & Human Serv Polipeptìdeos de p. ariasi polipeptìdeos de p. perniciosus e métodos e uso
AU2003284239B2 (en) * 2002-10-21 2008-08-21 Eisai Inc. Compositions and methods for treating human papillomavirus-mediated disease
US7485306B2 (en) 2002-10-29 2009-02-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Lutzomyia longipalpis polypeptides and methods of use
US20080032384A1 (en) * 2004-04-22 2008-02-07 Takehiko Nomura Pharmaceutical Preparation Containing Bacterial Cell Wall Skeleton
WO2008039171A2 (en) 2005-08-08 2008-04-03 Oregon Health & Science University Inactivating pathogens with hydrogen peroxide for vaccine production
US20100130425A1 (en) 2005-09-09 2010-05-27 Oregon Health & Science University Use of toll-like receptor ligands in treating excitotoxic injury, ischemia and/or hypoxia
US7732166B2 (en) * 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
CN101438166A (zh) 2006-03-14 2009-05-20 俄勒冈健康科学大学 产生针对结核病的免疫应答的方法
JP2009536818A (ja) 2006-04-20 2009-10-22 ザ ヘンリー エム． ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドヴァンスメント オブ ミリタリー メディシン インコーポレイテッド 志賀毒性１型タンパク質に基づく方法および組成物
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
US8968995B2 (en) * 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
DK2918598T3 (en) 2007-02-28 2019-04-29 The Govt Of U S A As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health And Human Services Brachyury polypeptides and methods of use
WO2010017209A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Membrane proximal region of hiv gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine
US8664183B2 (en) 2009-02-27 2014-03-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services SPANX-B polypeptides and their use
JP2012526286A (ja) 2009-05-07 2012-10-25 オンコヘルス コーポレーション ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）およびｈｐｖ関連癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニング、および診断のための高度または≧ｃｉｎ２の同定
ES2594485T3 (es) 2009-10-07 2016-12-20 Uvic Industry Partnerships Inc. Vacunas que comprenden transgenes sensibles al calor
WO2011047340A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine
US9173930B2 (en) 2009-11-20 2015-11-03 Oregon Health & Science University Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection
WO2011084598A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Oncohealth Corporation High throughput cell-based hpv immunoassays for diagnosis and screening of hpv-associated cancers
WO2011112599A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary. Department Of Health & Human Services Immunogenic pote peptides and methods of use
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CN102125698A (zh) * 2010-11-29 2011-07-20 昆明理工大学 具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型的建立方法
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
ES2855110T3 (es) 2011-07-18 2021-09-23 The Us Secretary Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Métodos y composiciones para la inhibición de una patología asociada a poliomavirus
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
WO2013152352A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Live, attenuated rubella vector to express vaccine antigens
PL2850431T3 (pl) 2012-05-16 2018-09-28 Immune Design Corp. Szczepionki przeciwko HSV-2
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
EP2895191B1 (en) 2012-09-14 2019-06-05 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Brachyury protein, adenoviral vectors encoding brachyury protein, and their use
WO2014062778A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bavarian Nordic, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
WO2015089469A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Multi-epitope tarp peptide vaccine and uses thereof
US9931393B2 (en) 2013-12-20 2018-04-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunogenic JC polyomavirus compositions and methods of use
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
WO2017024000A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Brachyury deletion mutants, non-yeast vectors encoding brachyury deletion mutants, and their use
CN109196094A (zh) * 2016-03-17 2019-01-11 伯克利之光生命科技公司 微流体装置中t淋巴细胞的选择和克隆
AU2017261705B2 (en) 2016-05-10 2024-04-18 Najit Technologies, Inc. Inorganic polyatomic oxyanions for protecting against antigenic damage during pathogen inactivation for vaccine production
US11235046B2 (en) 2017-11-04 2022-02-01 Nevada Research & Innovation Corporation Immunogenic conjugates and methods of use thereof
CA3120324A1 (en) 2018-12-04 2020-06-11 The Rockefeller University Hiv vaccine immunogens
TW202214294A (zh) 2020-09-30 2022-04-16 美商碩騰服務公司 具有ｈｙａＣ及ｎａｎＰ缺失之新穎多殺性巴斯德氏菌株及疫苗

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4117113A (en) * 1974-06-25 1978-09-26 National Research Development Corporation Immunological preparations
GB1502774A (en) * 1974-06-25 1978-03-01 Nat Res Dev Immunological preparations
US4772466A (en) * 1983-08-22 1988-09-20 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccines comprising polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
US4770874A (en) * 1983-08-22 1988-09-13 Syntex (U.S.A.) Inc. Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
JPS6147500A (ja) * 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
US5114708A (en) * 1985-06-18 1992-05-19 Emory University Method for stimulating growth in animals
US5234683A (en) * 1985-06-18 1993-08-10 Emory University Method of stimulating the immune system
US4877611A (en) * 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
CA1337395C (en) * 1986-10-20 1995-10-24 Rae Lyn Burke Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine
US4778784A (en) * 1987-01-07 1988-10-18 Baylor College Of Medicine Cyclic peptide and method of use for inducing an immunological response to hepatitis B virus
US4963354A (en) * 1987-01-21 1990-10-16 Genentech, Inc. Use of tumor necrosis factor (TNF) as an adjuvant
ATE149091T1 (de) * 1987-11-03 1997-03-15 Syntex Inc Einen tetra-polyol enthaltendes impfstoff- adjuvans
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
HU212924B (en) * 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
DE4018442A1 (de) * 1990-06-08 1991-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante dna und verfahren zur herstellung chimaerer antikoerper
AU1025692A (en) * 1991-02-06 1992-08-13 Ciba-Geigy Ag Novel chimeric antiidiotypic monoclonal antibodies
HU220295B (hu) * 1991-07-25 2001-11-28 Idec Pharmaceuticals Corp. Antigénkészítmények és ezek alkalmazása citotoxikus T-limfocita reakciók indukálására
DE4443414A1 (de) * 1994-12-07 1996-06-13 Basf Ag Benzopyranfarbstoffe und deren Zwischenprodukte
US7735069B2 (en) 2006-02-09 2010-06-08 International Business Machines Corporation Creating software debug breakpoints activated by specific call patterns
US8919787B1 (en) 2010-10-08 2014-12-30 James Timothy Wilcher Reciprocating tool attachment assembly and methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP0801656A1 (en) 1997-10-22
RU2201253C2 (ru) 2003-03-27
IS4479A (is) 1997-05-07
EP0801656A4 (en) 2004-06-30
MD970199A (en) 1999-02-28
EE9700100A (et) 1997-10-15
RO120065B1 (ro) 2005-08-30
WO1996017863A1 (en) 1996-06-13
BR9509872A (pt) 1997-11-25
NO972521L (no) 1997-08-06
GEP20012556B (en) 2001-10-25
AP661A (en) 1998-08-19
FI972431A0 (fi) 1997-06-06
UA49814C2 (uk) 2002-10-15
CN1175260A (zh) 1998-03-04
CA2204738A1 (en) 1996-06-13
LV11866B (en) 1998-01-20
TW487575B (en) 2002-05-21
US5709860A (en) 1998-01-20
JPH10510264A (ja) 1998-10-06
CN1109046C (zh) 2003-05-21
HK1008226A1 (en) 1999-05-07
AR002255A1 (es) 1998-03-11
US5695770A (en) 1997-12-09
CZ174197A3 (en) 1997-10-15
LT4308B (lt) 1998-03-25
SI9520148A (sl) 1998-06-30
FI972431A (fi) 1997-06-06
OA10736A (en) 2002-12-11
LV11866A (lv) 1997-10-20
BG63262B1 (bg) 2001-07-31
TJ384B (en) 2004-07-08
MD1586G2 (ro) 2001-10-31
BG101656A (en) 1998-02-27
LT97115A (en) 1997-11-25
MX9704097A (es) 1998-07-31
CZ293439B6 (cs) 2004-04-14
NO972521D0 (no) 1997-06-03
PL183954B1 (pl) 2002-08-30
HUP9800946A2 (hu) 1998-07-28
AP9701056A0 (en) 1997-10-31
AU4410496A (en) 1996-06-26
PL320612A1 (en) 1997-10-13
CN1515319A (zh) 2004-07-28
MD1586F2 (en) 2001-01-31
EE03569B1 (et) 2001-12-17
NZ298582A (en) 1999-10-28
AU699044B2 (en) 1998-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK71397A3 (en) Pharmaceutical compositions inducting cytotoxic t-lymphocyte response
FI108114B (fi) Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi
US20060057162A1 (en) Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
KR100478617B1 (ko) 세포독성t-림프구반응을유도하는방법