TW487575B - Pharmaceutical composition for induction of cytotoxic T-lymphocyte responses - Google Patents
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487575 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明背景 本發明係雷喬亨里（Syamal Raychaudhuri)與羅茲德（ William H. Rastetter )所著之標題”具細胞毒性之τ-淋巴細 胞反應之謗發”；於1991年7月25日申請之美國系列編號 07/73 5,069的部份接績案，本發明係有關於對謗發人體或 者馴養的或農耕的動物之細胞毒性τ_細胞調介反應上有用 的方法與組合物。 細跑毒性Τ-細胞(CTLs)係被認爲是反應多樣的病毒感染 與腫瘤的或癌的成長之主要宿主防禦機制。此等細胞利用 辨認與在感染的或轉形的細胞上之不同的分子（稱作類別 I MHC分子）相聯的抗原片段，以去除受感染或轉形的 细胞。利用在特定的細胞之内細胞質裝載某些可溶的抗原 可實驗上地謗發CTLs。對於特定的具細胞毒性τ-淋巴細胞 謗發作用而言，僅以可溶的抗原免疫通常地係不足的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 可謗發CTL反應之一種方法係包含使用重組的工程技術 ，以將有問題之抗原的重要成份嵌入一種良性的傳染物之 染色體組中。此項策略之目的係藉由將該宿主蒙受一種溫 和的，自我限制的感染以產生對該需要的表位（epitope) 之抗原特定的細胞毒性T-淋巴細胞反應。使用牛痘，脊髓 灰質炎、腺性一與逆轉綠-病毒，以及例如Listeria與BCG 等之〃田囷之飲合載體已經有欽述。舉例而言，Takahashi 等人 85Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3105, 1988記述使用表 現HIV gp 160外鞘基因之重組型牛痘病毒，作爲一種謗發 具細胞毒性T -淋巴細胞之有潛力工具。 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（2 ) 可謗發一種細胞居間的反應之第二種方法包括佐劑 (adjuvant)之使用。當此技藝似乎充滿該佐劑用途之議論時 ，是否謗發細胞居間的免疫性以及是否該細胞居間的免疫 性包括一種具細胞毒性T-淋巴細胞反應，對該技藝而言仍 不明白。然而，下列係本領域中之不同發表文獻的代表。 斯托維（Stover)等人；35 1, Nature 456，1991 (不公認係 本申請案之先前技藝）記述使用含有卢-半乳糖苷酶基因 之重組BCG之抗半乳糖甞酶的一種CTL反應。使用不 完全的弗洛伊德氏佐劑（Freud、adjuvants)和-半乳糖替 酶無法偵測該樣反應。 米歇爾（Mitchell)等，8 J. Clinical Oncology 856? 1990 (其不公認係本發明之先前技藝）記述轉移黑色瘤 (metastastic melanoma)病患之治療；其係以一種稱作"丹投 (DETOX)"的佐劑和異基因的（allogeneic)黑瘤溶解物投藥五 次長達六週之久，於該等病患之一小部份之中，發現溶細 胞的T細胞之增加。該等作者記述增強細胞毒性T -淋巴細 胞生產程度之必要性，以及建議含白血球介質素-2 (Interleukin-2)之佐劑之一種混合治療，以及以環磷醯胺 之前治療以降低可能存在之腫瘤特定的T -抑制因子（T-suppressor)細胞之程度。丹投係包含來自Salmonella minnesota之去毒性的内毒素（單嶙醯基脂質A (monophosphoryl lipid A)) ? Mycobacterium phlei之細胞壁 骨幹，角鯊缔油（squalene oil)和乳化劑。 艾利森（Allison)和葛哥弟斯（Gregoriadis)， 11 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1· ，項再填· 裝· 訂 ΙΦ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 )
Immunology Today 427，1990 (其不認爲係本發明之先前 的技藝）加註”授權可使用"於人體疫苗之唯一佐劑係鋁鹽（ 明蓉），其係不會一貫地謗出細胞居間的免疫性。艾利斯和 葛哥弟斯陳述π因此發展具有弗洛伊德氏之完全佐劑之效 力，但不具有其不同的副作用（例如肉芽瘤）之佐劑係有 需要的。”他們且繼續言及三種可能策略存在；舉例而言 :脂質體（liposome)之使用；佐劑之使用，稱作免疫刺激 複合物（ISCOMs，其係包含皀苷（saponin)或奎爾A (Quil A)(—種含二碳水化合物鏈之三萜系化合物），膽固醇和 磷脂醯膽鹼）；其係授權可使用於馬類之一種流行性感冒 疫苗（莫林（Morein)等人 ’ Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press，153);以及含魚鯊烯或魚鯊烷（有 或沒有一種普洛尼克（pluronic agent)和胞壁醯基雙肽 (muramyl dipeptide (MDP))之乳劑（SAF)之使用。SAF 係 被認爲可於老鼠中謗出細胞居間的免疫性；即使”長久認 爲次單元抗原不能謗出細胞毒性T-細胞（CTL)反應。，’ 田卡哈許（Takahashi)等人，344 Nature 873，1990，記述 藉由使用以單劑皮下的免疫法之ISCOMs，於老鼠中得第 二類限制的助手型和細胞毒性的T -淋巴細胞謗發反應，他 們陳述弗洛伊德氏佐劑、不完全的弗洛伊氏佐劑、和磷酸 鹽缓衝的食鹽水不能謗發對抗所關心標的之具細胞毒性τ -淋巴細胞活性。與外源的可溶蛋白質抗原之其他形式之結 果相反的，他們已顯示利用ISCOMs之外源的完整蛋白質 免疫法未引發抗原特定的MHC第一類限制的CD8+ CD4- -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） --------^批衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) CTL係可能的，他們也述及所記載的實驗建議，藉由使用 含HIV蛋白質tISC〇Ms以謗出人體CTL係可能的，並且 基於ISCOM的疫苗可完成利用一純的蛋白質以謗發CTL 與抗體等二者之長久追尋的目的。 拜聯(Byars)與艾利森，5 Vaccines, 223, 1987 記述 SAF-1之用途；其係包含吐溫80，普洛尼克L121 (PLURONIC L121)和角鯊缔或角鯊烷，有或沒有胞壁醯基雙肽，並且 建議’他們的數據顯示含胞壁醯基雙肽之調配物將有益於 人體與獸醫疫苗。該佐劑之激發劑注射（Booster shots)係 不含該胞壁醯基雙肽，該胞壁醯基雙肽係認爲較使用不含 胞壁醯基雙肽之佐劑顯著增加抗體之產生。利用皮膚測驗 以遲缓型超過敏性測量細胞居間的免疫性，以測定T _助手 型細胞謗發作用。當於該佐劑中含有胞壁醯基雙肽時，該 超高敏性係較強且較持續的。類似的佐劑可見於艾利森等 人，美國專利4,770,874 (其陳述胞壁醯基雙肽和複合的 多元醇（pluronic polyol)之組合，對謗出抗卵白蛋白之一 種強力的細胞居間的和體液的反應上係必須的）；艾利森 等，美國專利4,772,466 :曼飛-可伯（Murphy-C〇rb)等， 246, Science 1293，1989 (其陳述含胞壁醯基雙肽之組合 型佐劑之使用，可增強該免疫反應之體液的與細胞的裝備 等二者之謗發作用。）；艾利森和拜耳茲87 Vaccines 56, 1987 (其陳述以SAF (含胞壁醯基雙肽）誘出間 的免疫性；其係利用遲緩型超過敏性，利用對抗原之丁_細 胞增殖反應，利用白血介素-2之產生，以及利用產生該 ^ 批衣------1T------ ^ J > (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -7- 487575 A7 B7 五、發明説明（5 ) 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 免疫抗原之標的細胞之特定的生殖地限制溶解等方式表現 );艾利森和拜耳茲，感染性疾病之免疫藥理學：非專一 性抗性之免疫佐劑與調節劑(Immunopharmacology of Infectious Diseases · Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-specific Resistance) 19 1-20 1，1987莫根（Morgan)等，29 J. Medical Virology 74, 1989 ;肯尼（Kenney)等，121 L Immunological Methods 1 57，1989 艾利森和拜耳茲 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (其中顯示銘鹽和礦物油 乳劑可增加抗體形成，但非細胞間的免疫性；以及顯示胞 壁醯基雙肽調配物可謗出細胞居間的免疫性）；拜耳茲等 ，8 Vaccine49? 1990 (不公認係本發明之先前的技藝，其 陳述他們的佐劑調配物顯著地增加體液的反應，以及以較 小的程度增強對流行性感冒血球凝集素（haemagglutinin) 抗原之細胞居間的反應）；艾利森和拜耳茲，28Molecular Immmunology 279，1991 (不公認係本發明之先前的技藝 ;其陳述該胞壁酿基雙肽的功能係謗發細胞激素（cytokines) 的表現與增加主要組織相容性（major histocompatibility; MHC)基因之表現；以及可獲得較其它佐劑爲佳的抗體和 細胞反應；並且可望確定類似的策略對人體是否具有效力 ) » 艾利森和拜耳兹，Technology Advanced in Vaccine
Development 401, 1988 (其記述使用SAF之細胞居間的免 疫性）；伊披斯坦（Epstein)等人，4 Advance Drug Delivery Reviews 223，1990 (其提供使用於疫苗製劑之不 同佐劑的一篇綜論）；艾利森和拜耳茲，95[ -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210、乂29?公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 B7 五、發明説明（6 )
Immunological Methods 157, 1986(其陳述將該胞壁醯基雙 肽加入該佐劑，可顯著地增加對不同抗原之細胞居間的反 應；包括單株免疫球蛋白和病毒抗原）；以及莫根等人， 29 J. Medical Virology 74, 1989 (其記述 SAF-1 用以製備 伊披斯坦一巴爾（Epstein-Barr)病毒疫苗之用途）。 跨可（Kwak)等人，Idiotype Networks in Biology and Medicine，Elsevier Science Publishers，163 頁，1990 (不公 認係本發明之先前技藝）記述使用不含胞壁醯基雙肽的 SAF作爲於人體中之一種B -細胞淋巴瘤遺傳型之佐劑。 特定而地，含普洛尼克L121，角鯊烷以及於磷酸鹽缓衝食 鹽水之0.4%吐溫80的乳液係與該遺傳型共同投藥，他們 陳述佐劑之添加應可進一步增大體液的反應，並且也可促 進細胞反應之謗發。 其他免疫製劑包括脂質體（艾利森等，美國專利 4,053,585 和 4,117，113 );環肽類（君斯曼（Dreesman)等， 美國專利4,778,784 );弗洛伊德氏完全的佐劑（阿舍森 (Asherson)等；22Immunology 465, 1972 ;伯曼（Berman)等 ， 2 International J. Cancer5 39,1967;艾利森， 18Immunopotentiation 73, 1973;和艾利森 Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247? 1973 ) ;ISCOMs ( 拉的維（Letvin)等，87Vaccines 209，1987 ) •，含有由礦物 油、一種介面活性劑和吐溫80形成的非離子性阻斷聚合物 試劑之佐劑（罕德（Hunter)和班尼的（Bennett)，133 JL Immunology 3167，1984;和罕德等，127J. Immunology -9- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^^裝 訂 » X > (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) 1244，198 1);由礦物油和乳化劑（含或不含滅死的分支查 桿菌）組成的佐劑（山崔茲一彭斯可朵 （Sanchez-Pescador)等，141 J. Immunology 1720，1988);以及其它 的佐劑；例如胞壁醯基三肽之一種親脂性的衍生物，及與 重組蛋白質共價結合之一種胞壁醯基雙肚。 發明摘述 本發明已發現一種安全且有利的方法和組合物；藉其可 謗發人體與經馴養或農業上重要的動物中之CTL反應。該 方法包括使用一種抗原調配物（其對動物具有少些或無毒 性）以及缺乏一種免疫刺激肽（例如胞壁醯基雙肽），其 之存在可減低該需要的細胞反應。此外，該方法係簡易使 用，並且藉由重組基因技術使現存的細胞免疫，而不須廣 泛的活體内工作以改變該等現存的細胞。本發明係驚人的 •，因爲藉由缺乏免疫刺激肽或類似物之該一種抗原調配物 之使用，可謗發該一種CTL反應係不可預期的，本發明者 之發現使得該樣抗原調配物可用於廣泛範圍的疾病狀態， 或者當作一種預防劑。舉例而言；可使用該樣抗原調配物 投藥於病毒疾病之治療（其中一 CTL反應爲重要）；例如 HI V感染或流行性感冒之治療方面；其也可擴大的用於細 菌感染，癌症、寄生性感染及其類似等方面之治療。作爲 一種預防劑，含一適當抗原之該抗原調配物係有用於相當 前述的病毒疾病之病毒感染之預防；特別地係HIV感染之 預防法，而且也於有癌症危險之病患之預防法；舉例如於 初期腫瘤之切除後。 -10- -----------^^裝------訂------ * X * 、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度（CNS ) A4規格（210χ^^ 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 因此，本發明之第一特色係一種用以謗發於人體或經馴 養（例如貓或狗）或農耕上重要的動物（例如馬、牛或豬 )之對抗除B -細胞淋巴瘤抗原或蛋白蛋白以外之抗原的 一種CTL反應之方法。該方法包括供給該ctl反應需要的 抗原’以及供給包含、由、或本質地由安定用的清潔劑、 膠微粒形成劑和生物可分解的且生物相容的油脂組成之一 種無毒性抗原調配物等步驟。本抗原調配物較佳地缺乏任 何免疫刺激肽成份，或者有相當低程度之該一種成份使該 需要的細胞反應不會減低。此調配物較佳地呈一種安定的 油水乳劑形式提供。即選擇每一該等不同的成份使得該乳 劑將維持於一種乳劑狀態至少一個月期間，且較佳地超過 一年，而沒有相之分離。於本方法，將該抗原與抗原調配 物混合一起以形成一種混合物（較佳地利用微流體化作用 )，而且以一用量足夠謗發該動物之CTL反應將混合物投 藥予該動物，該投藥僅須一次。 π安定用的清潔劑”係意謂一種清潔劑其可使該乳劑之成 份維持呈一種安定的乳劑。該等清潔劑包括聚山梨酸酯， 80(吐溫）（山梨糖醇-單-9-十八烯酸酯·聚（氧-1，2 -乙二烷 基（ethanediyl);由 ICI Americas，Wilmington，DE 製造）’ 吐溫 40，吐溫 20，吐溫60，士德劑 3-12(Zwittergent3-12) 提波HB7 (TEEPOL HB7)，和斯班85(Span 85)。經常地以 一用量約0.05至0.5%，較佳地係約0.2%提供這些清潔劑 〇 ”膠微粒形成劑”係意謂一種試劑其能夠安定含其它成份 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（9 ) 的該乳液以使形成一種膠微粒樣的結構。該等試劑較佳地 引起在注射部位之一些刺激作用，以便添新巨噬細胞以增 加該細胞反應，該等試劑之實例包括聚合物介面活性劑（ 吞己述於BASF Wyandotte publications，如斯摩卡（Schmolka)， 54 J- Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977，和罕德等，129】. Immunoj 1244, 1981 ;該二者在此納入本文爲參考文獻） ，複合劑 L62LF，L101 和 L64，L121，PEG1000，以及 TETRONIC 1501，150R1，701，901，1301 與 130R1。該等試 劑之化學結構爲此藝所熟知的。較佳地選擇具有一親水性 —親脂性平衡値（hydrophile-lipophile balance，HLB)介於 0與2之間之試劑’其如罕德—班尼的，133 Journal of Immunology 3167, 1984所定義的。較佳地以一用量介於 〇·5與10%間，最佳地一用量介於丨.25與5 %間提供該試 劑。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 選擇該油脂係促進在油水乳劑中之該抗原的滯留，即， 提供該需要的抗原一種媒劑（vehicle)，而且較佳地具有溶 點低於65°C以使乳液在室溫（約20°C至256C )下，或者一 旦該乳劑溫度被降至室溫時形成，該等油脂之實例包括角 黨缔、角黨燒’二十碳燒，四十四碳燒，甘油、和花生油 或其它植物油。該油脂係較佳地以一用量介於1與10%之 間，最較佳地以一用量介於2.5與5 %之間供應。該油脂 爲生物可分解的且生物可相容的係重要的，以使該生物體 過時能分解該油脂，並且以使無不利的作用（例如肉芽瘤） 係因使用該油脂而顯著的。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（i〇 ) 在上述的調配物中缺乏一種肽成份，特別地一種胞壁醯 基雙肽（MDP)是重要的。假如提供大於每一正常人體調配 物投藥約20微克之用量則該一種肽將干擾CTL反應謗發作 用。不管他們對免疫系統之體液部份之顯然的刺激作用， 該抗原調配物完全缺乏該等肽係較佳的。即雖然該等肽可 增強該體液反應，本發明已發現當希望。具細胞毒性T ·淋 巴細胞反應時，他們係不利的。 於其他相關的特色方面，該抗原調配物係自該等上述三 種成份之其中僅二種而形成，並且與除了蛋白蛋白（或其 它白蛋白，如HSA，BSA和卵白蛋白）之任一需要的抗原（其 包括蛋白質，多肽、與它的具有免疫性的片段）一起使用 以謗發於上述動物或人體之CTL反應。 本發明相信上述調配物在使用於人體方面較先前的調配 物（包括ISCOMS，DETOX，與S AF)顯著有利。不像該等調 配物，本調配物包括一膠微粒形成劑以及不具有肽，細胞 壁骨幹或細菌細胞成份。本調配物也誘發一種CTL反應； 其不發生於該等先前的調配物或者與該等調配物比較係顯 著地增強的。 ”無毒的”係意謂於受治療的動物或人體中些許或沒有發 現該抗原調配物之副作用。習於醫學或獸醫技藝中之人士 將認爲此名稱具有廣泛的意義。舉例而言，實質地健康動 物或人體能忍受僅僅微小的毒性，但是遭受末期疾病之人 體（具有預期壽命少於約三年者）實質地可忍受較多的毒性 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇><297公釐） — .1:------φ 裝----II ^------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（U ) 於較隹的具體實施例中該抗原調配物基本上由該清潔劑 、試劑和油脂之其中二者或三者所組成；該方法基本上由 一種單獨投藥該混合物（抗原加上抗原調配物）予該人體或 該動物所組成；該人體或動物係感染一種病毒，並且遭受 該病毒感染之一個或以上的徵狀（如相關領域之醫生所普 通定義者）之苦；而且該抗原調配物對該人體或動物係無 毒的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於其它較佳的具體實施例中，該抗原係選自HIV抗原之 具抗原性片段：gpl60, gag, pol, Nef，Tat，與Rev ;瘧疾抗 原·· C,S蛋白質與鐮刀狀體（Sporozoite )表面蛋白質2 ; B 型肝炎表面抗原：Pre-Sl，Pre_S2, HBc Ag與HBe Ag ;流行 性感冒抗原·· HA，HP與ΝΑ ; A型肝炎表面抗原；疱疹 (Herpes)病毒抗原；EBV gp340, EBV gp85, HSV gB，HSV gD，HSV gH, HSV早期蛋白質產物，巨噬細胞病毒 (cytomegalovirus) gB，巨嗤細胞病毒gH，與IE蛋白質gp72; 呼吸合胞體（syncytial)病毒抗原：F蛋白質，G蛋白質， 與N蛋白質；以及腫瘤抗原；癌CEA，癌相關之黏液素， 癌p21，癌p53，黑色瘤MPG，黑色瘤p97，與癌Neii腫 瘤基因產物，癌p53基因產物，稱爲MAGE之黑瘤抗原， 輿存在於多樣惡性腫瘤中之突變ρ2 1 ras蛋白質。 於相關的特色中，本發明包括一種組合物；其包含’由 或本質地由與上述之一種抗原調配物混合的一種抗原組合 ，並且該抗原係選自上列的抗原部份。 於其它相關的特色色中，本發明包括利用投藥包含與一 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 種上述抗原調配物混合的一種適宜的抗原（如選自上列那 些抗原）之組合物以治療病患之方法；該病患感染ΗI v病 母’遭受癌疾之苦’遭受流行性感冒之苦，遭受肝炎之苦 ，遭受一種癌症之苦，感染疱疹病毒或者感染呼吸合胞體 病毒。 以下列之本發明較佳具體實施例説明和申請專利範園， 將使本發明之其它特色與優點表現。 發明説明 首先簡單説明圖式： 圖式 第1A-1C及4A-4C圖爲比較以不同卵蛋白調配物誘發 CTL數據之圖示。於所有圖式中之Ε:Τ代表效應元對標的 之比例。 弟2Α和2Β圖爲比較以不同々-半乳糖菩酶調配物謗發 CTL數據之圖式； 第3圖爲比較以存於脂質體中和存於抗原調配物中之卵 蛋白謗發CTL數據之圖式； 第5和6圖爲表示CD4和CD8細胞用盡對CTL謗發作用 之數據圖式； 第7圖爲表示gpl20謗發CTL數據之圖式， 第8圖爲表示以含普洛尼克（Pluronic)和吐溫與抗原之漏 合物謗發CTL數據之圖式； 第9圖爲表示以含角鯊烷和普洛尼克與抗原之混合物謗 發CTL數據之圖式； -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 琴 -訂· 487575 A7 B7 五、發明説明（13 ) 第1 0圖爲表示以含角鯊烷和普洛尼克與抗原之混合物謗 發CTL數據之圖式； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1 1圖爲表示有不同抗原調配物〇 VA作用在CTL反應之 圖式； 第1 2圖爲以不同抗原調配物誘發猴子抗gp 120111b抗體 之圖TF ; 第13圖爲經可溶E7蛋白質於佐劑的單一免疫1〇天後HOPE2細 胞之抗癌活性，及 第14圖爲經可溶E7蛋白質於佐劑的二次免疫1〇及19天後 HOPE2細胞之抗癌活性。 抗原調配物 可使用於本發明之抗原調配物係大概地如前述。一般熟 於此藝者將認爲相當的調配物係容易製備的而且預期具有 誘發CTL反應之相當的特徵，使用相當於下述實例中之技 術可容易地測試該等調配物之特性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 接著爲本發明之實例；其係使用由存於磷酸鹽緩衝的食 鹽水（111^(18丁？）中之約2.5%角鯊烷、5%普洛尼克酸及吐 溫8 0組成的一種抗原調配物（AF)。特定言之，該AF乳劑 包含1 50毫克鯊坡，37_5毫克普羅沙美（poloxamer) 401 ( 普洛尼克Lm ) ，6毫克聚山梨酸酯80 (吐溫8〇 )， 0.184毫克氣化鉀，0·552毫克單鹼磷酸鉀，7.36毫克氣化 鈉，3.3毫克二驗磷酸鈉（無水），每一毫升水，ρΗ7· 4 。利用標準技術（Microfluidics Model Ml 10F)-回壓（backpressure) 模數在 ll-14,000psi並逐漸恢復至 大氣壓 ，冷卻並 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 A7 B7 五、發明説明（14 ) 裝於濕冰中微液化本乳劑。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於其它實例中，將抗原與微液化的角鯊烷（S )，普洛尼 克劑（P)和吐溫80(T)混合物混合以達到最終濃度分別爲0.2 %吐溫80，1.25 %普洛尼克與5 %角鯊烷複合劑。爲了測 定一種抗原特定免疫反應謗發作用所須之次成份，以與該 三種成份之混合物相同的濃度製備角鯊烷-吐溫80，普洛 尼克-吐溫80或甲鯊烷-普洛尼克。也個別製備普洛尼克、 角鯊烷或吐溫80以測定個別成份對該CTL謗發作用之影 響。也製備取代吐溫80之吐溫20，吐溫40或士德劑之取代 物以測定於該^系統中之不同吐溫衍生物對CTL謗發作 用之影響。於該三種成份調配物中之角鯊烷取代物係利用 Eicosone或Triacontone，並且於該相同的三種成份調配物 中之共聚物普洛尼克之取代物係利用PEG1000，Pleuronic 複合劑L62LF和Tetronics 1501與150R1製成。作爲二種成 份調配物，將於不同組合中之不同類似物混合，並且測試 ova特定的CTL謗發作用。他們係膽固醇-吐溫80，角鯊 烷-吐溫20，Pristane-吐溫80或橄欖油·吐溫80之混合物。 爲一項安定性研究，將該角鯊烷-吐80之微液化混合物與 葡萄糖混合以成爲最終濃度5 %。於所有實例中該等賦形 劑之組合係於一微液化器中混合以形成一種安定的乳劑。 於一些實驗中，將二種成份的調配物與不同濃度之MDP 混合，以謗發CTL與體液反應。表1記述使用於本研究之 不同調配物的範圍廣泛列表。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 A7 B7 五、發明説明（15 ) 表 k種或二種成份系統中之不同取代物效應 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 三種成份調配物之取代物 吐溫40(Τ) 吐溫20(Τ) Τ1501(Ρ) T150R1(P) 普洛尼克L62LF(P) 二十碳烷（S) PEGIOOO(P) Triacontane(S) 士德劑（T) 二種成份調配物之取代物 _ ΡΤ SP 膽固醇（S)+吐溫80 角鯊烷+吐溫29(T) Pristane(S) +吐溫 80 橄欖油（S) +吐溫80 一種成分調配物 普洛尼克L121 角鯊烷 吐溫80 在 Ε:Τ 100:1時 致死百分比 84 66 48 0 0 47 氺 氺 本 * 7645260654269ooo 角鯊烷+吐溫80 + 5%葡萄糖 86 *CTL試驗會重覆 辛代斯（Syntex)佐劑調配物（微液化的；S AFm)係使用作-18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（16 ) 一種佐劑對照組並且由二部份組成，第一部份由含有最終 濃度5%角鯊坑，1.25%普洛尼克和0.2%吐溫之；^酸鹽 緩衝的食鹽水組成（賦形劑或I-SAF)，第二部份由 釀胞壁釀基-L _蘇胺酿基-D-異越釀胺酸（Thr-MDP，分支 桿菌屬細胞壁成份之一種衍生物）組成。爲了免疫之目的 ，將抗原與微流液賦形劑（第一部份）混合以獲得一均質 的乳劑。將MDP加入以形成S AFm，並且概略地迴旋攪動 。於該混合物中之MDP濃度係不同的，以測定對CTL誘 發作用之最適濃度。當作一種佐劑對照組，亦以根據該製 造商手册（Pierce Chemical，Rockford，IL )與明蓉混合之可 溶性抗原，或以完全的弗溶伊德氏佐劑（CFA)來免疫老藏 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 IM.--··----•裝丨， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
I 該抗原調配物係用以謗發老鼠之細胞毒性τ —淋巴細胞 反應。習於該項技藝之人士將認爲此一老鼠模式顯示相當 的實驗或治療將類似地謗發於人體，經馴養的或農耕的動 物中之細胞毒性Τ -淋巴細胞反應。不需過分的實驗，以對 於習於該項技藝之人士所熟悉的標準方法，可經驗地測定 有利產生該需要的細胞反應之抗原調配物與抗原之用量。 因此’如果需要將此類混合物治療之副作用減到最小，則 習於該項技藝者可測定該混合物之最小用量以適合投藥予 人體、馴養的或農耕的動物以謗發CTL反應，因而謗發抗 一需要的抗原之免疫性。於正常使用下，以許多標準方法 之任一種注射該混合物，但是特佳的係在一部位（其將使 該乳劑維持一種安定形式長達數日或數週之久）之肌内注 -19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 __B7_ 五、發明説明（17 ) 射。· 方法 除非有另外的加註，下文之該等實例中係使用下列之材 料和方法。 老鼠 雌性 C57BL/6 (H-2b)和 BALB/c (H-2b)老鼠係購自 Harlen Sprague (San Diego, California) 0 抗原 卵白蛋白(ova，級數 VII，Sigma Chemical Co.，St.Louis， MO)係以天然的形式使用。0 -半乳糖甞酶（0 -gal，級數 VIII; BRL)係以天然的形式與在1 M NaOH煮沸2分鐘以產 生一種強驗代謝物方式使用。重組gp 120係購自American Biotechnology 〇 腫瘤細胞和轉感染物 使用的腫瘤細胞係la·系線EL4 (C57BL/6, H-2b胸腺瘤） 和 p815 (DBA/2，H-2d 肥大細胞瘤（mastocytoma))。由 ova_ 產生的EL4轉感染物（transfectant)，EG7-ova，先前地係由 沐耳（Moore)等人，54Cell 777, 1988敘述。利用含10毫克 經 PstI線性化的 pCHl 10 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc·， Piscataway，NJ)和1毫克經pVuI線形化的pSV2 neo，將存 於1毫升磷酸鹽緩衝的食鹽水（PBS)中之107 P815細胞進 行電穿孔作用（帚升（Southern)等人，1 J. Mol. Appl. Genet. 327, I982)，接著利用400微升/毫升抗生素〇418篩選以 衍生得A -gal-產生的轉感染物。藉由以編碼-gal基因（ -20- 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) M規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝_ 訂 經濟部中央檩準局員工消費合作杜印製 487575 A7 B7 五、發明説明（18 ) 融入IgM重鏈之第三和第四表現序列（exon)之質體轉感染 BALB/C融合瘤Igm 662，而衍生得C3-4轉感染物（拉米希 (Rammensee)等，30 Immunogenetics 296, 1989)。表現 8?1601111)之3丁3纖維母細胞（15-12)係來自犯11之德曼博 士（Dr. Germain) (Bethesda，MD)。經 Kb轉感染的 L 細胞系 係來自卡棒博士（Dr. Carbone)，MonashUniversity，Australia 。經Dd與Ld轉感染的L細胞系係來自泰得漢森博士（Dr. Ted Hensen)，WashingtonUniversity，St. Louis 0 免疫作用 如沐耳等人（同上）和卡棒（Carbone)等人，J. Exp.Med. 169 _·603, 1989所述，在細胞質的裝填之後，以200微升25 X 1〇6脾細胞懸浮液靜脈内免疫老鼠。爲抗原調配物 或# -gal·抗原調配物之免疫，將每隻老鼠於足趾和尾端皮 下地注射30微克每一種蛋白質抗原，每一劑注射於終體積 200微升中，含有67微升微流體化的抗原調配物（以下列 標準方法製作）和30微克蛋白質抗原。該終體積係以HBSS 凑成（參見懷德克（Whittaker)手册（Welkersville，MD))。 MDP係於濃度介於0與300微克之間供給，視情況，以存 於CFA或於明礬中總體積爲200微升之可溶的抗原免疫老 鼠。 效應元群之活體外刺激作用 將來自正常的或經免疫老鼠（至少14日前己引發的）之脾 細胞（30χ 106)在37。(：，7%C02/空氣下，於24槽培養盟中 ，以 1·5 X 106 EG7-ova(以 20,000rad 照射）（爲—反應）或 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Ϊ·
、1T 487575 A7 ____B7 _ 五、發明説明（19 ) 與 1·5χ 106 C3-4 細胞（以 20,000rad 照射）（爲 0 -gal反應） 培養。於添加10%胎中血清（FCS)，2mM麩醯胺酸，慶大 黴素（gentamycin)和2 X l〇-5M 2 —氫硫基乙醇之由IMDM 培養基組成的完全培養基中完成所有組織培養，參見懷德 克手册（Welkersville，MD)。爲活體外細胞用盡實驗，將於 活體内準備的或者於活體外刺激的脾細胞以單株抗體 (111八68)111^172(抗-€04)或〇1八68 3.168(抗-€08)處理以去 除 CD4+ 或 CD8+T細胞（沙米朵（Sarmiento)等，125 L Immunol. 2665，1980與希里弟各（Ceredig)等，3 14 Nature 98, 1985)。該 mAb RL 172和 mAb 3.168 係獲自在 Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla，CA 之斯班的博士 (Dr. Jonathan Sprent) 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將來自正常的或經免疫老鼠之脾細胞（30 x 106)(其至少 21日前已引發的）與1·5χ 106 15-12細胞（每10s細胞以200 微克絲裂黴素C處理45分鐘）培養，或者與存於含有10% 前篩選的 FCS (ICN Flow ; ICN Biochemicals，Inc·，Costa Mesa, CA), 2mM麩醯胺酸，慶大黴素和2χ10·5Μ 2 —氫硫 基乙醇之完全 IMDM培養基（Irvine Scientific, Santa Ana, CA)中之500微克18111b肽（包含Balb/c老鼠之主要CTL表 位（epitope))培養。爲活體外之肽刺激作用，將脾細胞培 養於含有5%ConA上層液之完全IMDM中。 爲細胞用盡實驗，將活體内準備的或活體外刺激的脾細 胞在低毒性的兔子補體（Cederlane Laboratories，Ltd·， Hornby Ontario，Canada)存在下，以 mAbs RL。172 (抗 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 487575 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 0〇4)或111八匕8 3.168(抗-€〇8)處理，以去除€〇 +或€〇8+丁 細胞（22, 23)。該mAb RL 172和mAb 3.168係來自斯班的 博士（前述者）。 細胞毒性分析 以100微居里[51Cr]酪酸鈉標記標的細胞（IX 106)60分鐘 ，對於肽脈衝的標的物，在標的標記51Cr期間，將50微升 之1毫克/毫升肽溶液（存於HBSS)加入，清洗之後，將1〇4 經標記的標的和效應元細胞之系列稀釋液在37°C下培養於 200微升RP10中4小時。收集100微升上層液並且測定該 比溶解（specific lysis)表示成：比溶解百分比二100 X {CTL 之釋放-自然發生的釋放）/(最大的釋放-自然發生的釋放）} 。於所有實驗中，於缺少細胞毒性T -淋巴細胞（CTL)之自 然發生的釋放係小於以清潔劑引起的最大釋放之2 5 %。 測定老鼠和猴子之抗體反應 將96 —槽U底培養皿（Costar，Cambridge，Μ A)之每一槽 塗覆存於50微升HBSS中之150微微克ova或gp 120，且在 4 “C過夜培養。爲測定老鼠抗-gp 120與抗-ova之抗體反應 ，培養皿以1 % BS A封塞（blocked) 1小時，將系列稀釋 的血清以每槽25微升體積加入且培養2小時。清洗培養皿 且將50微升存於1 % BSA中之與HRPO(SBT，Alabama)共軛 之山羊抗老鼠IgG之1 : 1000稀釋液加入每槽。培養1小 時之後，清洗培養m且將100微升受質加入每槽。在10至 15分鐘之後讀取該〇d4G5。爲測定猴子抗gpl20之抗體反 應，所有步驟係相同的，惟該封塞培養皿和血清稀釋等二 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X Μ公釐） I ^--------------IT------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（21 ) 步驟係於5 %正常的山羊血清（於漢克氏（Hank，s)平衡的鹽 溶液）中完成。 肽合成 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用Applied Biosystems 430A合成儀藉固相法胜肽合成技術 裝配合成肽；其係相對於卵白蛋白胺基酸序列253-276 253-276)(序列表第 1 號：EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER ;其 中該標準單字母符號係表示每一胺基酸），髓磷脂鹼性蛋 白質（myelin basicprotein)之胺基酸序列84-102(序列表第2 號：DENPVVHFFKNIVTPRTPP)與 gpl20IIIb之胺基酸序列 301-322 (18111b序列）之合成肽。藉預先形成的對稱酐偶合 胺基酸，但除天冬醯胺酸、麩醯胺酸和精胺酸係偶合爲羥 基苯並三唑酯類。以接著凱塞（Kaiser)等人之方法（34 Biochem, 595, 1970)之茚滿三酮（ninhydrin)反應偵測偶合效 率（Coupling efficiency)。利用接著湯姆（Tam)等人 21 J. Am. Chem. Soc· 6442,1983記述之”低一高”方法之HF，將該等 肽自該支撑物釋出，而且以10%乙酸自樹脂萃取出該等泰 。在冷凍乾燥之後·以Sephadex G-25管柱將肽去蘭，具 以Vydac製備型〇 18管柱之逆相層析法HPLC純化該等肽之 樣本。將純化的肽（98% )以終濃度10毫克/毫升溶解於 HBSS，並且於完全培養基中稀釋至所希望濃度。 CNBr 降解 於100mM三氟乙酸溶液中以100倍莫耳過量之溴化氰處 理蛋白質樣本（如々-半乳糖甞酶）。令反應於室溫（約20°C ) 下攪動反應18小時。接著該前述的反應時間，將該肽片段 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（22 ) 利用SEP-PAK C-18裝置（Waters)自該反應物分離，以95% 乙腈溶析，以及冷凍乾燥。 驗性降解 以1 N NaOH處理蛋白質樣本（如0 -半乳糖甞酶）且煮沸 2分鐘，而且利用一種C-18 SEP-PAK裝置（Water)將該產 生的肽片段與反應物分離，以及用95 %乙腈溶析並且冷凍 乾燥。 實例1 :第I類限制的CTL引發 沐耳等人，113 UCLA Symp. Mol· Cell· Biol. 1989卡棒和 班維（Bevan)，171 J. Exp. Medicine 377, 1990 證明以細胞質 地裝載可溶的^之脾細胞免疫的老鼠，係爲引發ova特 定第I類限制的CTL反應。該表現的EL4轉感染物 EG7-〇va係使用於活體内準備的脾淋巴細胞之活體外刺激作用 ，而且也用作爲ova特定的CTL居間的致死作用之標的。本研 究也證明藉由EG7-^_轉感染物或細胞質地裝載^之脾細胞 謗發的CD8+效應元，辨認H-2Kb内由肽^1 258_276所吻合之 決定基，溶解EG7-^i，並且也致死塗覆有^ 258-276之 EL4細胞。因此爲了評估是否可利用可溶的抗原謗發内原性第 I類限制的CD8+T細胞途徑，則使用上述系統以測定是否可使 用某些抗原調配物，以產生可溶的抗原進入第I類限制的途輕。 a)ova 利用含或不含抗原調配物之不同用量的^(30微克-1毫克/老 鼠）將C57BL/6老鼠免疫一次。其係於尾端皮下地注射|鼠。在 該免疫之後至少兩週將脾細胞自該免疫老鼠中取出，龙真以 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I I 裝 II 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（23 ) EG7-ova轉感染物進行活體外刺激。ova濃度在低如30微克係與 1毫克劑量具相同效力。因此，以來自30微克ova-引發的老鼠 之脾細胞例行地完成CTL研究。在以EG7_^活體外培養5日 之後，以能夠溶解EG7-ova之ova特定的效應元之存在下評估 所謗發者" 以存於HBSS之可溶^ (1毫克）注射之老鼠，顯示不具 CTL謗發事實（第1A圖）。然而以存於如上述之抗原調配物 (於該等圖示中表示作AF )中之30微克ova免疫的老鼠顯 示顯著的轉感染物特定的CTL反應（第1C圖）。況且，由經 ova-AF免疫的脾細胞所致死的EG7-5^之程度，與ova-裝 載的脾細胞免疫的老鼠之程度係可比較的（第1B圖）。 藉由/?-半乳糖甞酶免疫的老鼠之脾細胞，當以EG7-ova 刺激時缺乏出現活體外次級的CTL反應，可表示活體内謗 發的CTL特定性係抗原特定的。沒有觀察到〇va#定的 CTL謗發。 b)· β —半乳糖甞酶 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用其它可溶的蛋白質抗原，#-gal，可獲得類似的結果。爲 分析>5 -gal特定的CTL反應，使用的標的係baLB/C衍生的卢-gal-表現的C3-4轉感染物。以可溶的々_gai免疫BALB/C老鼠產 生背景CTL反應。因此，爲了特定CTL反應之測定，將收獲延 遲於收獲脾淋巴細胞之前至少八週，並且於該等放射的C3-4轉 感染物存在之下培養5日。 第2 B圖證明存於A F之3 0微克半乳糖甞酶謗發強烈的特定抗轉 感染物之CTL反應。在效應元對標的（E : T)之比例爲3:1時， -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ297公董） 487575 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 五、發明説明（24 ) 經-gal-AF免疫之老鼠表現約80%之特定C3-4致死。然而， 利用分離自A-gal(於HBSS)之效應元免疫的老鼠，在以相同的 E:T比例時，僅達到20。/〇致死該相同的標的（第2A圖）。因爲EL4 或P815皆未表現第Η類MHC基因產物，且溶解物皆沒有表現同 系的限制作用，因此這些^和A-gal特定的效應元係第I類 MHC限制的。 爲證明該抗原調配物之用途，以包囊於兩種形式的脂質體（其 中一種係一種pH敏感的脂質體）中的可溶^^來免疫老鼠。一週 之後，如上述地將脾細胞活體外刺激並且測試抗51Cr—標記的 EG7-ova或EL4。第3圖表示一種代表性的結果；其證明於脂 質體中的ova不能引發老鼠之本質的CTL謗發作用，當〇va於 明礬中免疫時，發現類似的結果。 實例2 : CTL之表位辨認 卡棒和班維（同前述）證明，利用EG7-ova轉感染物和利用細 胞質地ova裝載的脾細胞等所謗發的CTL，辨認塗覆有肽ova 258-276之EL4細胞。爲了證明存於AF之可溶卵白蛋白是否謗 發類似的CTL反應，將脾細胞製備自免疫老鼠，且以EG7-ova 活體外刺激。測試該等效應元之抗EL4細胞；該等細胞塗覆有 肽ova 253-276或者有衍生自髓磷脂鹼性蛋白質之一種肽對照組 (ΜΒΡ 84·102)。該等結果證明^-AF謗發的CTL具有與那些 爲轉感染物或爲細胞質地装載^所謗發者類似的特定性（第1A ，1B與1C圖）。^-AF引發的效應元細胞有效地溶解Ε<37·〇va ，以及塗覆有50微克/108細胞之^1肽的未轉感染的EL4細胞 ，但是不會溶解覆有50微克/108細胞之MBP肽之EL4細胞。 -27- (請先閱讀背面之注意事 今 ▼項再填· 裝—— :寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) M規格（21〇X 297公釐） 487575 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（25 於半乳糖甞酶系統，卡棒和班維（同前述）顯示表現々义“的 轉感染物和細胞質地裝載可溶半乳糖苷酶之脾細胞，謗發 CTL ;其溶解表現/j-gai的轉感染物和覆有經鹼降解的半乳 糖甞酶之未轉感染的P815細胞。可溶的半乳糖甞酶當於AF* 免疫時，謗發類似的特定性之CTL。 實例3 : CTL效應元俾細胞 下述顯示存於AF之可溶的蛋白質抗原謗發CD8+效應元τ細胞 。活體外以放射的轉感染物，培養來自經免疫老鼠之脾細胞5日 ’之後，採收細胞且利用單株抗CD4或抗CD8之抗體加上補體 ，以用盡CD4+或CD8+T細胞。然後測試已用盡族群於ova系統 之抗51Cr_EG7-^，或者於A-gal系統之抗51Cr-Pl3.l。該等數 據表示於第四圖，且顯示於ova系統，C〇8 + T細胞之去除作用 廢除了具細胞溶解的活性，該活性係該全部效應元細胞群所賦與 的。然而，CD4+T細胞群之去除作用對該EG7·^的溶解不具 任何影響。 類似地，於卢-gal系統，CD8 + T細胞之去除作用廢除点-ga!· 抗原調配物免疫的脾細胞之細胞溶解活性（數據未顯示）。 實例4 :存於AF之可溶ova引發CD8+T細胞 爲了證明ova-AF活體内引發CD8+T細胞群，且對活體外的次 級反應係重要的，將CD4+或CD8+細胞群自ova-AF免疫的老藏 和自天然的老鼠等之脾臟中去除。之後於活體外利用單獨的 EG7-ova ’或者於來自ova-AF免疫老鼠之CD4+和CD8+T細胞 組合物中，或者於各種來自ova-AF免疫老鼠之CD4+或CD8 + T 細胞與來自天然老鼠之CD4+或CD8+細胞之組合物中刺激這些處 -28 - 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26 ) 理過的細胞群。第5圖顯示對活體外顯現次級的CTL反應而言， 引發的CD8+細胞係必要的。這些數據也指示對活體外之有效次 級CTL反應而言需要CD4+T細胞。就引發作用而言，CD4+細 胞係不需要的。相似地，CD8+T細胞須要活體外- gal特定 次級C T L反應之表現。 上述實例證明抗原調配物對謗發抗可溶蛋白質抗原之第I類限 制的CTL反應之影響。該抗原調配物調節可溶抗原謗發的CTL 引發作用’且活性方面係類似於被轉感染物所謗發者和被脾細胞 (細胞質地裝載可溶0Va或点-gal)所謗發者。於卵白蛋白系統中 ’ EG7-ova ’細胞質地裝載〇va之脾細胞，和ova-AF绣發:〇) 第I類限制的CD8+CTL ; (b) CTL，其辨認以^ 253-276合 成肽敏感化之標的物；以及僅一免疫作用之後的長效CTL。 於半乳糖甞酶系統中，該々-gai-AF謗發CTL ;其辨認β _ gal表現的轉感染物C3-4，以及以經鹼性降解的A -gal敏感化之 未轉感染的P815細胞。其類似於利用細胞質地裝載A -半乳糖甞 酶之脾細胞免疫所謗發的CTL。由抗原調配物謗發ova特定的 CTL係獨一的，因爲包囊於pH敏感的脂質體中的或者於明礬中 之^ (沒有顯示數據）皆沒有謗發活體内CTL反應。 這些實例顯示在人類醫療方面，與不同癌症和病毒疾病之謗發 CTL的疫苗發展方面，上述抗原調配物及其相等物係有用的。 實例5 本項係一種特別的實例，以顯示上述AF在由HI V之可溶 gpl20產生第I類限制的ctl引發作用方面上之用途。 於由Balb/c纖維母細胞衍生的3T3細胞系中產生表現gpl6〇 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNsJ^4規格（2i〇x297公釐） " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) r裝· 訂 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（27 ) IIIB的細胞系（15-12)。其係獲自德曼博士（Dr· Ron Germain) 和伯左夫斯基博士（Dr. JayBerzofsky)，National Institute of Health，Bethesda，M.D.該gpl6〇的細胞系係用於活體内引發的 脾淋巴細胞之活體外刺激作用’而且也作爲SP160特定CTL锈 發反應之標的物。以每一老鼠10微克SP160(含或不含AF)免疫 Balb/e老鼠一次。於尾端皮下地注射老氣。免疫後二週’將脾細 胞自該免疫老鼠中取出並且利用經照射的gp160轉感染物活體 外刺激。活體外培養5曰之後，藉由能夠溶解gpl60轉感染物（ 而非未轉感染的細胞系）之特定效應元之存在評估引發作用。該 等結果係表示於表7，其中以AF與gpl20賦與CTL反應。 下列實例證明含僅一種或二種成份之本發明抗原調配物之用途 ，這些實例證明以該等上述三種成份之中的僅僅二種可謗發 CTL-反應。 β : CTL謗發作用所須之重要成份之測定 爲了測定是否所有上述的成份對抗原特定C.TL謗發作用係必 須的，以存在於上述AF之該等三種成份其中的二種（以PBS取代 該第三種成份）之不同組合物之微液化的調配物中的即蛋白免疫 老鼠，使用的二種成份組合物係如下：存於PBS之角鯊烷/吐溫 ，存於PBS之角鯊烷/普洛尼克或者存於PBS之普洛尼克/吐溫 。包括另一組實驗；其中利用調配於一種成份系統即，僅僅負繁 烷於PBS，普洛尼克於PBS或吐溫於PBS而已）中之〇va免疫老 鼠。改良上面三個成分抗原調配物以同時排除一成份組成於PBS 中〇 上述抗原調配物包含：0·300公克吐溫80(AldHeh，WI)> -30 -
(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·
、1T
Lp 487575 A7 B7 五、發明説明（28 ) 1.875公克普洛尼克[121(8八8?，旧)和7.5公克角鯊燒 (Aldrich，WI)，添加PBS 至50毫升。 二種成份調配物係：角鯊燒/吐溫：0·300公克吐溫80與7.5 公克角鯊烷，添加PBS至50毫升’普洛尼克/吐溫：i·875公克 普洛尼克L121與〇·3〇〇公克吐溫80 ’添加PBS至5〇毫升’普洛 尼克/角鯊坑：I·875公克普洛尼克L121與7·5公克角鯊坡’添 加PBS至50毫升。 之後，將該等樣本經過微液化器（model 110Τ， Micorofluidics Corp·)處理，以及裝瓶且於4°C下儲存直到使用 稱重卵蛋白(〇va, Sigma，MO)並且製作存於HBSS(懷德肯， 如前）中之〇·3毫克/毫升溶液。將該0.3毫克/毫升的原料溶液與 下列用量之該等二種成份調配物組合：5份卵白蛋白〇.3毫克/毫 升溶液，3.3份2成份調配物和1·7份HBSS。 攪動該調配物並且放置於冰上直到注射，剛妤注射之前才組合 所有溶液。 以尾基部皮下地注射方式，使每一隻老鼠接受2〇〇微升之一種 調配物（含有30微升0Va)。在脾臟採收之前，讓老鼠休息至少二 至四週。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -------；---^裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在免疫之後二週，製備脾細胞並且以經照射的EG7-ova作活體 外的刺激。在培養5日之後，以一種4小時MCr釋出分析法測試抗 WCr-EG?·^^或WCr_EL4，以測定ova特定的CTL之存在。表 示於第6至8圖的數據證明調配物於微流體化的二種成份系統中 的卵白蛋白能活體内引發ova特定的CTLs。 -31 -
經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 我們更進一步地評估該等個別的成份，在與蛋白質抗原組合時 ’其謗發CTL能力之貢獻。爲了免疫作用之目的，將可溶抗原 與微流體化賦形劑混合，以獲得一種安定的均質乳劑（其粒子大 小介於250-300毫微米之範園）。爲了進一步定義角鯊烷·吐溫 普洛尼克（STP)調配物中之負責CTL謗發作用的該等成份， 我們以存於角鯊烷-吐溫8〇(ST)普洛尼克，普洛尼克-吐溫80(PT) 混合物或角鯊烷-普洛尼克（SP)混合物中的^或者作爲一種對 照組之存於角鯊烷（S)，吐溫80(Τ)或複合劑（Ρ)中的ova免疫老鼠 。作爲佐劑對照組；也以ova-S AFm (含70微克MDP )或ova-明礬免疫老鼠。爲了作爲陽性對照組，利用細胞質地装載可溶 的脾細胞免疫老鼠。也使用其它的組合物與取代物，且結果 表示於表1。 爲了 CTL引發研究之偵測，免疫老鼠一次。免疫兩週後，脾細 胞與經照射EG7-ova (ova表現EL4細胞天且對51Cr_EG7-ova 或51Ct-EL4細胞測試。該等結果（圖11)證明與STP或ST組合 的30微克ova於老鼠中引發第I類限制的CTL反應。利用存於 STP之ova或者利用存於ST之ova之ova特定CTL引發作用， 似乎較利用細胞質地裝載可溶之脾細胞所謗發者爲佳。存於 PT或存於SP之^可謗發老鼠^特定的CTL反應，但卻係不 一致的和不佳的。不似SAFm，將MDP加入ST調配物不能危害 老鼠之該^特定的CTL謗發作用（表2)。當老鼠係以與個別的 成份（S，P或T)混合之^所免疫時，和當老鼠係以^-SAFm 或明礬所免疫時等二者皆沒有發生^L特定的CTL謗發作 用。利用存於（a)HBSS，（b)SAFm或（c)吸附於明蓉之1耄克之 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） 裝 訂 * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 _____B7_ 五、發明説明（3〇 ) 多的^所免疫的老鼠，不能謗出^特定的CTL。 秦_2 以ST+MDP不會阻斷ova特定的CTL反應之謗發作用 _免疫老鼠之細胞毒性％# ova-ST-MDP ova-ST-MDP 刺激元 標的物** ova-ST ova-ST 300微克老鼠72微克老鼠 BG7-ova EG7-ova 100:1 0 100 82 76 33:1 0 86 67 62 11:1 0 33 39 25 3:1 0 6 13 3 1:1 0 0 0 0 3:1 0 0 0 0 ---------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 *老鼠係以存於不同調配物中之30微克^：免疫 **利用減去未表現抗原的細胞系之致死百分比計算％細胞毒性 實例7 :爲ova特定的抗體生產所必須的成份 利用存於HBSS，STP，ST，PT或SP中的30微克ova將老鼠在二 週間隔下受免疫三次。當作一種陽性對照組，也以_-SAFm免 疫老鼠，因爲已知SAFm能誘發強烈的抗體反應。在第二次和第 三次免疫之後七日，將老鼠取血且測試血清之ova特定的抗體反 應。結果列示於表3。他們顯示以存於STP，ST或於SAFm中之 ova免疫的老鼠，在三次免疫之後，表現類似的抗ova反應。 訂 -33- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（31 ) 表 3 30微克0va/動物調配物 抗-ova抗體反應之謗發 反應的老鼠數量/ 注射的老鼠總數量fl/競錄杳效僧、 HESS 0/3 <1/20, <1/20, <1/20 STP 3/3 <1/4860, >1/4860, <1/4860 ST 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860 PT NA ΝΑ, ΝΑ, NA SP NA ΝΑ, ΝΑ, NA SAF-M 3/3 1/4860, 1/4860, 1/4860 *N/A ;不合適 f例8 : HIV gpl20特定的CTL後爹作用 使用HIV gpl20 IIIB作爲第二種抗原系統，以測定其於STP ，ST或於MP-T中之CTL诱發作用。利用存於jjBSS，STP， PT或於ST中之1微克gp 120 Illb免疫老鼠。作爲一種對照組； 利用存於SAFm或CFA (完全的弗洛伊德氏佐劑）或含MPL(單 磷醯基脂質A)及TDM(海藻糖二黴菌物）<RIBI佐劑系統中i微 克gpl20 Illb使老鼠免疫。在該免疫後3週，製備脾細胞並以經 絲狀黴素處理的轉感染物細胞15_12或者以18111b肽進行活體外 刺激，在培養5日之後，測試產生的效應元細胞之抗牛痘： gpl60 IIIB，或者以經母系牛痘感染的P815細胞作爲標的物。 該等結果證明gpl20-角鯊烷-吐溫80調配物非gpl20-角鯊烷-吐 溫80普洛尼克調配物謗發老鼠之gp 120特定的CTL反應（表4 ) -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297^7 I 裝 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（32 ) 表 4 謗發老鼠之gpl 20特定的CTL反應 用*免疫的老鼠之細胞毒性％ 刺激物 標的物# 18IIIb/IL2 vac:^120 Ε-Τ gpl20-HESS gpl20-ST gpl20-STP 100:1 23 42 jsjA1 2 3 33:1 23 38 ΝΑ 11:1 0 0 ΝΑ 3:1 0 35 ΝΑ 18IIIb/IL2 15-12 100:1 33:1 11:1 3:1 ο ο ο ο 0 5 7 8 5 3 2 1 ο ο ο ο ---------^-裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 18IIIb/IL2 3T3+18IIIb 100:1 33:1 11:1 3:1 ο 59595729 -訂 100:1 35 84 ΝΑ 33:1 19 65 ΝΑ 11:1 12 37 ΝΑ 3:1 0 22 ΝΑ 1:1 0 0 ΝΑ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 15-12 1 利用存於不同調配物之1微克gpl20lll免疫老鼠 2 利用減去未表現抗原的細胞系之致死百分比計算％細胞毒性 3 不適合 簠誘發老鼠之gpi2〇特定的體液反應
爲了謗發gpl20特定的體液反應，利用1微克gp 120111b以二 週間隔期將老鼠免疫三次。取該等動物之血以及測試IgG抗體之 存在（利用固相ELISA分析法偵測gpl20IIIb)。結果證明 gpl20-ST比 gpi2〇-HBSS，gpl20-SAFm(表 5)或 gpl20-STP -35- 代張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 A7 B7 反應的老鼠數量/ 1微克gpl20/動物調配生注射的老鼠總數量(1/稀釋血清效價） 0/3 <1/20, <1/20, <1/20 1/3 <1/20, >1/4860, <1/20 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860 2/3 <1/20, 1/540, 1/540 2/3 1/180, >1/4860, 1/540 五、發明説明（33 ) 更佳 表_5^ 謗發抗_gpl20抗體反應
HESS STP ST PT SP
SAF-M 宜則L0」..爸土 2 0特定的抗體反應 利用 gpl20-SAFm，gpl20-STP，gpl20-ST或者 gpl20-HBSS使猴子（每組二隻）免疫。作爲一種對照組，藉由含即16〇 Illb之重組牛痘免疫一組猴子。猴子係以二週間隔期免疫並且在 第二次免疫之後二週和三週採血。系列地稀釋每一隻猴子之免疫 前和免疫的血清，並且如上述於材料與方法中之ELISa方法分 析抗gpl20活性。該等數據（第12圖）顯示以gpl2〇-STP或 gpl20-SAFm免疫的猴子誘發猴子類似反應。以gpi2〇__sT免疫 的一隻猴子謗發的抗gpl2〇反應，類似於該gpl20-SAFm或 gpl20-SPT免疫組。以gpl2〇_ST免疫的一隻猴子在二次免疫之 後並不能誘發強烈的抗-gpl2〇反應。 實例16 E7之活體内活性 1.供免疫用之重組HPV 16 Ε7蛋白質之產·生 a)PCR及Ε7基因之選殖 I. II — — 裝 II 訂 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經 濟 部 t 央 準 局 員 工 消 費 合 社 印 製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 B7 五、發明説明（34 ) 由Dr· Karen Vousden (Ludwig研究所）編碼衍生自癌細胞 系Caski之E7基因所獲質體選殖HPV 16 E7基因。以PCR及 使用編碼Bam HI及Sal I選殖位址侧邊所接51及3·基因之引 子放編碼區。將E7 PCR產物接入pGEX-4T-l表現載體 (Pharmacia Biotech)產生pGEX.E7表現質體。用 pGEX.E7表 現質體轉移感染大腸桿菌XL1-藍（層聚基因（stratagene))。 由所獲純種系質體所得E7序列與CaSki細胞所得E7序列相 同〇 b)細胞表現E7之純化的產生 pGEX.E7細菌表現質體編碼麩胱甘肽-S-轉移酶（GST)融 含蛋白質，其係在胺端GST，凝血酶蛋白酶裂解位址及羧 端E7蛋白質所組成。產生及純化E7蛋白質係如pGEX-4T_l 載體（Pharmacia Biotech)廠商之產品資料文件所述。簡言 之，藉加入異丙基b-D-硫代半乳糖甞酶至培養皿謗使含 pGEX.E7表現質體之細菌表現融合蛋白質。收成細胞並藉 輕微音波振盪加以融解細胞。將溶菌產物用於麩胱甘肽瓊 脂醣4B(Pharmacia Biotech)。融合蛋白連接至基質後，沖 洗樹脂以移除非特異性結合蛋白質。用凝血酶消化已結合 融合蛋白質以從GST融合伴體釋出E7蛋白質。 以SDS-PAGE分析E7蛋白質製劑且以Bradford分析法 (BioRad)鑑定E7蛋白質濃度。每毫升細菌培養物得到9毫 克可溶E7蛋白質。 2.X21 E7轉染物之產生 HPV16 E7蛋白質之編碼序列（見上述）業已插入IDEC所擁 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦ 項再填· 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 B7 五、發明説明（35 ) 有的眞核表現質體INPEP4。於此載體中，以巨噬細胞病毒 啓動子/增強子之轉錄元件控制E7表現。此外，E7編碼序 列前三個核甞酸已移去並用免疫球蛋白輕鏈引導子序列替 換，該序列直接置於上游及E7編碼區域之框。内轉染至老 鼠細胞X21個別G418抗性純系後以E7訊息產生之RNA印跡 分析來檢。查每一純系展現可測E7訊息。然後由彼等純系 中二個4E7及1C7(分別爲HOPE1及HOPE2)進行細胞融解物 之蛋白質印跡分析並證實E7蛋白質產生。 3.E7/AF可溶抗原免疫之活體内活性 C3H背景之雌鼠(H]1^，Harlan Sprague Dawley)用於此等 研究。依”看護及使用實驗室動物之指南"（DHHS出版NIH 86-23, Bethesda，MD:NIH，1985)維護動物且任意接食物及 水。E7轉染細胞系HOPE 於這些研究中。以活體外 連續代維持腫瘤細胞系。 此細胞系業已顯示維持E7胞漿抗原表現，如同以蛋白質 印跡分析，接著重複活體外數代來偵測。以皮下注射 150,000活體外歷經數代細胞引發腫瘤於協同性€311老鼠中 〇 二星期時以2個垂直方向測量腫瘤。依下式計算腫瘤體 積（V): V(毫米3) = (LxW2)除以2 其中： L =最長軸，以毫米測量 W二垂直軸（毫米） -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 487575 A7 B7 五、發明説明（36 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表6數據係如腫瘤老鼠（帶腫瘤老鼠數/注射動物之總數） 。圖13及14之數據如各治療組或控制組之正中腫瘤大小（ 亳米3)。各治療組與未接受治療之控制組相較。治療開始 於HOPE2細胞接種1〇天後，此時大多數腫瘤係可觸知的（ 約50至75毫米3)。用溶解E7蛋白質於AF或明礬佐劑對老鼠 免疫（皮下注射0 · 2爱升總量）引發治療。免疫前，直接將af 與溶於Hanks平衡鹽水溶液之E7蛋白質（HBSS)混合60秒使 各老鼠接受30微克或90微克E7蛋白質於〇·2毫升。依製造 商指示將明礬(Pierce化學公司）與Ε7蛋白質混合使各老鼠接 受90微克E7蛋白質於〇.2毫升。第二治療組動物9天後接受 第二次免疫作用（腫瘤細胞接種19天後）。如上述接種前立 刻製備Booster免疫作用。 此實驗中（表6 : Xp # 2 3 3 )，腫瘤細胞接種4 1天後，僅 4/8及5/8老鼠（接受可溶E7於aF(分別爲30微克或90微克） <單一注射已有可測得腫瘤。相反地，已用E 7蛋白質於明 蓉（8/8)免疫之所有老鼠已積極生長腫瘤。另外，如圖 所示’和控制組（未治療）或明礬治療組相較僅在用E 7蛋白 質於aF免疫之治療組觀察到有顯著腫瘤生長受到抑制。腫 瘤生長抑制（圖13)或增加腫瘤退化率（表6)未在接受E7於 明礬單一注射之老鼠身上察覺出。 雖然接受E7於明礬二次注射之老鼠察覺有一些腫瘤生長 減緩，但在腫瘤被激起10及19天後（表6及圖14)接受二次 免疫作用之治療組亦察覺有相似結果。 結果指出帶腫瘤老鼠數目減少而測出顯著抗腫瘤活性及 -39- 尽、，氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐 ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 487575 A7 _ B7五、發明説明（37 ) 接著可溶E 7於AF之免疫作用察筧腫瘤生長抑制。相反地 ，用單一或雙重注射可溶E 7蛋白質於明礬免疫的所有動物 均長腫瘤。總而言之，用可溶E 7蛋白質於AF之免疫作用 導致腫瘤細胞生長受到顯著抑制而未察筧於使用可溶E 7於 明礬免疫作用。 表6 :可溶於E7於佐劑免疫作用之抗腫瘤活性 實驗抵號 治療 劑量(微克/老鼠） 腫瘤動物& 4 1天 223 控制組 7/8 223 E7 於AF 30微克X lb 4/8 223 E7 於 AF 90微克X 1 5/8 223 E7於明礬 90微克xl 8/8 223 E7 於 AF 30微克x2c 3/8 223 E7 於AF 90微克X 2 1/4 223 E7於明礬 90微克X 2 8/8 a .帶有腫瘤之老鼠數/受接種總數 b .所有免疫作用開始於植入1 0天後 c.第二次免疫作用（x2)於植入10天後 其它具體實施例係於下列申請專利範圍内。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Jf •項再填. 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
Claims (1)
- 六、申請專利範圍 1 ··一種包含人類乳頭狀瘤病毒（HP V)抗原之組合物，其包 含於一種微液化抗原調配物中，包含： (a) —種安定用的清潔劑， (b ) —種膠微粒形成劑，和 (c ) 一種生物可分解與生物可相容的油脂，其中該Hp v 抗原係選自HPV16 E6抗原、HPV 18 E7抗原、HPV 6 E4 抗原、HPV 6 L1抗原、HPV11 E4抗原及HPV11 L1抗 原’以及其被調配成一種安定的油水型乳劑且實質上缺 少一種免疫刺激的肽且其中該組合物投與至選自人體、 馬養動物及農耕動物能誘發對抗乳頭狀瘤病毒抗原之特 定細胞毒性τ -淋巴細胞反應。 2 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係選 用供性病濕疣之治療。 3 ·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中該組合物適合 前列腺癌之治療。 4 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該抗原調配物 對該人或馴養的動物或農耕或的動物係無毒的。 5 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該微液化抗原 1周配物基本上包括該清潔劑，形成劑及油脂。 6 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中安定用的清潔 劑選自聚山梨酸酯80，吐溫（TWEEN)20、吐溫40，吐溫 60 ’ 士德劑（Zwittergent)3-12，提波（TEEPOL)HB7，和斯 斑（SPAN)85。 7 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中所提供清潔劑 A4^(21〇X 297/1¾) ； %/575.量約為Ο · Ο 5至0.5 %。 8 ·根據申請專利範圍第9項之組合物，其中該清潔劑之量 約 0.2%。 9 ·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中膠微粒形成劑 包括介於0至2間親水性一親脂性平衡值。 10·根據申請專利範圍第1項之組合物’其中膠微粒形成劑 選自普沙美（Poloxamer)401 、 普洛克尼 (Pluronic)L62LF、普洛尼克 L101、普洛尼克 L64、 PEG1000、特聰尼克（Tetronic)1501、特聰尼克 150R1、 特聰尼克70 1、特聰尼克90 1、特聰尼克13〇 1及特聰尼克 130R1 。 11.根據申請專利範固第1項之組合物，其中膠微粒形成劑 量範固介於0.5至10%間。 12·根據申請專利範圍第11項之組合物，其中膠微粒形成劑 量範圍介於1.25至5%間。 13·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中油脂呈現溶解 溫度少於60°C。 14·根據申請專利範圍第13項之組合物，其中油脂選自角黨 晞、角鯊烷、二十碳烷、四十四碳烷、姥鮫烷 (pristane)、甘油及蔬菜油。- 15.根據申請專利範圍第1項之組合物、其中油脂量範圍介 於1至10%間。 16·根據申請專利範圍第1 5項之組合物，其中油脂量範圍介 於2.5至5%間。 ___^__一 本紙張尺度t國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) ' '— 圍 申請專利範 17夫 艮據申請專利範圍.第1項之組合物，包括少於2〇微克胞 壁醯基二肽。 18·根據申請專利範圍第17項之組合物，不包括任何胞壁醯 ~*月太。 19·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中清潔劑係聚山 梨酸醋80且微粒形成劑係普羅沙美40 i。 2〇·根據申請專利範圍第19項，其中油脂係角鯊烷。 1 ·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中清潔劑選自吐 溫20、吐溫4〇及吐溫8〇 ;油脂選自角鯊烷、二十碳烷及 姥起燒且膠微粒形成劑選自普洛尼克L62LF及普羅沙美 401 〇 22·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中組合物顆粒大 小範圍為250至300毫微米。 L ___-3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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