CN108611369B - 表达限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠 - Google Patents

表达限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠 Download PDF

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Abstract

本发明提供遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠表达由有限数量的轻链可变结构域表征的免疫球蛋白轻链库。提供小鼠，其呈现2种人轻链可变的基因段的选择，使得由小鼠表达的免疫球蛋白轻链包含2种人轻链可变的基因段之一。提供使用本文所述的小鼠制造具有通用轻链的双特异性抗体的方法，包括人轻链可变区。提供制造适合用于多特异性结合蛋白，例如，双特异性抗体的人可变区的方法，及宿主细胞。

Description

表达限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠
本申请是2014年3月13日提交的同名发明专利申请201480013894.6的分案申请。
【相关申请的交叉引用】
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年3月13日提交的美国专利申请系列No.13/798,455的权利，该申请通过引用以其整体在此合并。
【序列表】
本申请参考以电子形式作为ascii.txt文件于2014年3月13日提交的命名为“2010794-0550_ST25”的序列表。该.txt文件在2014年3月11日产生及具有33kb尺寸。
【技术领域】
提供遗传修饰的小鼠，其表达具有与多样的人可变/小鼠恒定重链结合的常见人可变/小鼠恒定轻链的抗体。提供自小鼠的B细胞的人可变区基因序列制造人双特异性抗体的方法。
【背景技术】
抗体一般包含同源二聚体重链组分，其中各重链单体与同一轻链结合。期望具有异源二聚体重链组分的抗体(例如,双特异性抗体)作为治疗性抗体。但制造具有可令人满意地与双特异性抗体的各重链结合的适合的轻链组分的双特异性抗体遇到了问题。
在一方法中，轻链可通过观测全部轻链可变结构域的利用统计学，鉴定在人抗体中最常采用的轻链，及轻链与不同特异性的2个重链体外配对来选择。
在另一方法中，轻链可通过观察噬菌体展示库(例如,包含人轻链可变区序列的噬菌体展示库,例如,人scFv库)中的轻链序列及自所述库选择最通常使用的轻链可变区来选择。然后可在2种不同重目标链上测试轻链。
在另一方法中，轻链可通过使用目标重链的重链可变序列作为探针检定轻链可变序列的噬菌体展示库来选择。与两个重链可变序列结合的轻链可选择为用于所述重链的轻链。
在另一方法中，候选轻链可与重链的同源轻链比对，及在轻链中制造修饰，以更紧密匹配对于两个重链的同源轻链共同的序列特征。如果需要最小化免疫原性机会，修饰优选产生存在于已知道的人轻链序列的序列，使得蛋白水解处理不可能基于本领域知道的评定免疫原性的似然性的参数和方法(即,电子以及湿测定)产生T细胞表位。
全部以上方法依赖于包含许多先验遏制，例如，序列同一性，与特定预选择的重链结合的能力，等的体外方法。本领域需求不依赖于操作体外条件，而代之以采用更以生物学方式能感觉的方法制造包括常见轻链的人表位-结合蛋白的组合物和方法。
【发明概述】
提供表达人免疫球蛋白重和轻链可变结构域的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠具有限制的轻链可变的库。提供产生与多样的亲和性-成熟的人重链可变结构域库结合及随多样的亲和性-成熟的人重链可变结构域库表达的人轻链可变结构域的生物学系统。提供制造包含免疫球蛋白可变结构域的结合蛋白的方法，包括用目标抗原免疫具有限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠，及在特异性结合目标抗原的结合蛋白中采用小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列。方法包括制造适合于在制造多-特异性抗原-结合蛋白中使用的人免疫球蛋白重链可变结构域的方法。
提供遗传加工的小鼠，其选择源于未重排的人重链可变区基因段的库的适合的亲和性-成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述亲和性-成熟的人重链可变结构域与源于1种人轻链可变区基因段的单人轻链可变结构域结合及随源于1种人轻链可变区基因段的单人轻链可变结构域表达。也提供呈现2种人轻链可变区基因段的选择的遗传加工的小鼠。在多方面，1或2个基因段包括人Vκ1-39和/或人Vκ3-20。
提供遗传加工的小鼠，其自人轻链可变区基因段的限制的库表达人轻链可变结构域，或单人轻链可变结构域的限制的库。在一些实施方式中，提供的小鼠被遗传加工而包括单未重排的人轻链可变区基因段(或2个人轻链可变区基因段)，其重排而形成重排的人轻链可变区基因(或2个重排的轻链可变区基因)，所述基因表达单轻链(或表达2个轻链之任一个或二者)。重排的人轻链可变结构域能与由小鼠选择的多个亲和性-成熟的人重链配对，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。
提供遗传加工的小鼠，其自人轻链可变区序列的限制的库表达人轻链可变结构域，或单人轻链可变结构域的限制的库。在一些实施方式中，提供的小鼠被遗传加工而包括表达单轻链(或表达2个可变区之任一或二者)的可变区的单V/J人轻链序列(或2V/J序列)。轻链包含能与由小鼠克隆选择的多个亲和性-成熟的人重链配对的可变序列，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其包含能与人J基因段(选自1个或多个JL段)重排及编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域的单人免疫球蛋白轻链可变(VL)区基因段。在另一方面，提供遗传修饰的小鼠，其包含不多于2个人VL基因段，各能与人J基因段重排(选自1个或多个JL段)及编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域。在一些实施方式中，2个人VL基因段在小鼠的基因组中并置。在一些实施方式中，2个人VL基因段处于小鼠基因组中的不同座位(例如,杂合子,在第1轻链等位基因包含第1人VL段,及在第2轻链等位基因包含第2个人VL段,其中所述第1和第2个人VL段不同)。在一些实施方式中，2个人VL基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段。在一实施方式中，人JL基因段选自：Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4，Jκ5和其配对组合。在各种实施方式中，提供的遗传加工的小鼠不能表达含有内源性VL基因段的免疫球蛋白轻链。例如，在一些实施方式中，提供的遗传加工的小鼠含有灭活和/或去除内源性VL基因段的部分或全部的遗传修饰。
在一实施方式中，单人VL基因段可操作地连接于选自下列的人JL基因段：Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4和Jκ5，其中所述单人VL基因段能重排而形成编码具有1个或更多人JL基因段之任何的轻链可变区基因的序列。
在一实施方式中，提供的遗传修饰的小鼠包含不包含内源性小鼠VL基因段的免疫球蛋白轻链座位，其能重排而形成免疫球蛋白轻链基因，其中所述VL座位含有能重排而编码轻链基因的VL区的单人VL基因段。在特定实施方式中，人VL基因段是人Vκ1-39Jκ5基因段或人Vκ3-20Jκ1基因段。在一些实施方式中，提供的遗传修饰的小鼠包含不包含内源性小鼠VL基因段的VL座位，其能重排而形成免疫球蛋白轻链基因，其中所述VL座位包含不多于2个能重排而编码轻链基因的VL区的人VL基因段。在一些特定实施方式中，不多于2个人VL基因段选自：人Vκ1-39基因段，人Vκ3-20基因段，及其组合。在一些特定实施方式中，不多于2个人VL基因段是人Vκ1-39Jκ5基因段和人Vκ3-20Jκ1基因段。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其包含编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域的单重排的(V/J)人免疫球蛋白轻链可变(VL)区(即,VL/JL区)。在另一方面，小鼠包含不多于2个能编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域的重排的人VL区。
在一实施方式中，VL区是重排的人Vκ1-39/J序列或重排的人Vκ3-20/J序列。在一实施方式中，人重排的VL/JL序列的JL段选自Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4和Jκ5。在特定实施方式中，VL区是人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列。在特定实施方式中，小鼠具有人Vκ1-39Jκ5序列和人Vκ3-20Jκ1序列。
在一实施方式中，人VL基因段可操作地连接于人或小鼠前导序列。在一实施方式中，前导序列是小鼠前导序列。在特定实施方式中，小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在特定实施方式中，前导序列可操作地连接于未重排的人VL基因段。在特定实施方式中，前导序列可操作地连接于重排的人VL/JL序列。
在一实施方式中，VL基因段可操作地连接于免疫球蛋白启动子序列。在一实施方式中，启动子序列是人启动子序列。在特定实施方式中，人免疫球蛋白启动子是人Vκ3-15启动子。在特定实施方式中，启动子可操作地连接于未重排的人VL基因段。在特定实施方式中，启动子可操作地连接于重排的人VL/JL序列。
在一实施方式中，轻链座位包含在5’(VL基因段的转录方向)侧接人免疫球蛋白启动子及在3’侧接与人J段重排的人VL基因段的前导序列，及编码包含内源性小鼠轻链恒定区的反向嵌合轻链的VL结构域(CL)。在特定实施方式中，VL基因段处于小鼠Vκ座位，及小鼠CL是小鼠Cκ。
在一实施方式中，轻链座位包含在5’(VL基因段的转录方向)侧接人免疫球蛋白启动子及在3’侧接重排的人VL区的前导序列(VL/JL序列)，及编码包含内源性小鼠轻链恒定区的反向嵌合轻链的VL结构域(CL)。在特定实施方式中，重排的人VL/JL序列处于小鼠κ(κ)座位，及小鼠CL是小鼠Cκ。
在一实施方式中，修饰的小鼠的VL座位是κ轻链座位，及κ轻链座位包含小鼠κ内含子增强子，小鼠κ3’增强子，或内含子增强子和3’增强子。
在一实施方式中，小鼠包含无功能免疫球蛋白λ(λ)轻链座位。在特定实施方式中，λ轻链座位包含1个或更多座位序列的缺失，其中所述1个或更多缺失致使λ轻链座位不能重排而形成轻链基因。在另一实施方式中，λ轻链座位的VL基因段的全部或基本上全部被删除。
在一实施方式中，小鼠制造包含体细胞地突变的源于人VL基因段的VL结构域的轻链。在一实施方式中，轻链包含体细胞地突变的源于人VL基因段VL结构域，及小鼠Cκ区。在一实施方式中，小鼠不表达λ轻链。
在一实施方式中，遗传修饰的小鼠能体细胞地超突变人VL区序列。在特定实施方式中，小鼠包含包含源于能重排及编码VL结构域的人VL基因段的重排的免疫球蛋白轻链基因的细胞，及重排的免疫球蛋白轻链基因包含体细胞地突变的VL结构域。
在一实施方式中，小鼠包含表达包含体细胞地突变的与小鼠Cκ连接的人VL结构域的轻链的细胞，其中所述轻链与包含体细胞地突变的源于人VH基因段的VH结构域的重链结合，且其中所述重链包含小鼠重链恒定区(CH)。在特定实施方式中，重链包含小鼠CH1，小鼠铰链，小鼠CH2，及小鼠CH3。在特定实施方式中，重链包含人CH1，铰链，小鼠CH2，及小鼠CH3。
在一实施方式中，小鼠包含内源性小鼠VH基因段被1个或更多人VH基因段取代，其中所述人VH基因段可操作地连接于小鼠CH区基因，使得小鼠重排人VH基因段及表达包含人VH结构域和小鼠CH的反向嵌合免疫球蛋白重链。在一实施方式中，90～100％的未重排的小鼠VH基因段被至少1个未重排的人VH基因段取代。在特定实施方式中，全部或基本上全部的内源性小鼠VH基因段被至少1个未重排的人VH基因段取代。在一实施方式中，取代是被至少19，至少39，或至少80或81个未重排的人VH基因段取代。在一实施方式中，取代是被至少12个有功能的未重排的人VH基因段，至少25个有功能的未重排的人VH基因段，或至少43个有功能的未重排的人VH基因段取代。在一实施方式中，小鼠包含全部小鼠DH和JH段被至少1个未重排的人DH段和至少1个未重排的人JH段取代。在一实施方式中，至少1个未重排的人DH段选自1-1，D1-7，1-26，2-8，2-15，3-3，3-10，3-16，3-22，5-5，5-12，6-6，6-13，7-27，及其组合。在一实施方式中，至少1个未重排的人JH段选自1，2，3，4，5，6，及其组合。在特定实施方式中，1个或更多人VH基因段选自1-2，1-8，1-24，1-69，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，3-53，4-31，4-39，4-59，5-51，6-1人VH基因段，及其组合。
在一实施方式中，小鼠包含表达特异性结合目标抗原的结合蛋白的B细胞，其中所述结合蛋白包含源于人Vκ1-39/Jκ5重排或人Vκ3-20/Jκ1重排的轻链，且其中所述细胞包含源于选自下列的人VH基因段的重排的重排的免疫球蛋白重链基因：1-69，2-5，3-13，3-23，3-30，3-33，3-53，4-39，4-59和5-51基因段。在一实施方式中，1个或更多人VH基因段与选自1，2，3，4，5和6的人重链JH基因段重排。在一实施方式中，1个或更多人VH和JH基因段与选自1-1，1-7，1-26，2-8，2-15，3-3，3-10，3-16，3-22，5-5，5-12，6-6，6-13和7-27的人DH基因段重排。在特定实施方式中，轻链基因具有1，2，3，4或5个或更多体细胞超突变。
在一实施方式中，小鼠包含B细胞，所述B细胞包含重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述序列包含选自下列的VH/DH/JH区：2-5/6-6/1，2-5/3-22/1，3-13/6-6/5，3-23/2-8/4，3-23/3-3/4，3-23/3-10/4，3-23/6-6/4，3-23/7-27/4，3-30/1-1/4，3-30/1-7/4，3-30/3-3/3，3-30/3-3/4，3-30/3-22/5，3-30/5-5/2，3-30/5-12/4，3-30/6-6/1，3-30/6-6/3，3-30/6-6/4，3-30/6-6/5，3-30/6-13/4，3-30/7-27/4，3-30/7-27/5，3-30/7-27/6，3-33/1-7/4，3-33/2-15/4，4-39/1-26/3，4-59/3-16/3，4-59/3-16/4，4-59/3-22/3，5-51/3-16/6，5-51/5-5/3，5-51/6-13/5，3-53/1-1/4，1-69/6-6/5和1-69/6-13/4。在特定实施方式中，B细胞表达包含与小鼠重链恒定区融合的人免疫球蛋白重链可变区及与小鼠轻链恒定区融合的人免疫球蛋白轻链可变区的结合蛋白。
在一实施方式中，重排的人VL区是人Vκ1-39Jκ5序列，及小鼠表达反向嵌合轻链，其包含：(i)源于人VL/JL序列的VL结构域及(ii)小鼠CL；其中所述轻链结合于反向嵌合重链，其包含：(i)小鼠CH及(ii)体细胞地突变的源于选自下列的人VH基因段的人VH结构域：1-2，1-8，1-24，1-69，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，3-53，4-31，4-39，4-59，5-51，6-1人VH基因段，及其组合。在一实施方式中，小鼠表达体细胞地突变的轻链。在一实施方式中CL是小鼠Cκ。在特定实施方式中，人VH基因段选自：2-5，3-13，3-23，3-30，4-59，5-51和1-69基因段。在特定实施方式中，体细胞地突变的人VH结构域包含源于选自下列的DH段的序列：1-1，1-7，2-8，3-3，3-10，3-16，3-22，5-5，5-12，6-6，6-13和7-27。在特定实施方式中，体细胞地突变的人VH结构域包含源于选自1，2，3，4，5和6的JH段的序列。在特定实施方式中，体细胞地突变的人VH结构域由重排的选自下列的人VH/DH/JH序列编码：2-5/6-6/1，2-5/3-22/1，3-13/6-6/5，3-23/2-8/4，3-23/3-3/4，3-23/3-10/4，3-23/6-6/4，3-23/7-27/4，3-30/1-1/4，3-30/1-7/4，3-30/3-3/4，3-30/3-22/5，3-30/5-5/2，3-30/5-12/4，3-30/6-6/1，3-30/6-6/3，3-30/6-6/4，3-30/6-6/5，3-30/6-13/4，3-30/7-27/4，3-30/7-27/5，3-30/7-27/6，4-59/3-16/3，4-59/3-16/4，4-59/3-22/3，5-51/5-5/3，1-69/6-6/5和1-69/6-13/4。
在一实施方式中，重排的人VL区是人Vκ3-20Jκ1序列，及小鼠表达反向嵌合轻链，其包含：(i)VL结构域源于重排的人VL/JL序列，及(ii)小鼠CL；其中所述轻链结合于反向嵌合重链，其包含：(i)小鼠CH，及(ii)体细胞地突变的源于选自下列的人VH基因段的人VH：1-2，1-8，1-24，1-69，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，3-53，4-31，4-39，4-59，5-51，6-1人VH基因段，及其组合。在一实施方式中，小鼠表达体细胞地突变的轻链。在一实施方式中CL是小鼠Cκ。在特定实施方式中，人VH基因段选自：3-30，3-33，3-53，4-39和5-51基因段。在特定实施方式中，体细胞地突变的人VH结构域包含源于选自下列的DH段的序列：1-1，1-7，1-26，2-15，3-3，3-16和6-13。在特定实施方式中，体细胞地突变的人VH结构域包含源于选自3，4，5和6的JH段的序列。在特定实施方式中，体细胞地突变的人VH结构域由重排的选自下列的人VH/DH/JH序列编码：3-30/1-1/4，3-30/3-3/3，3-33/1-7/4，3-33/2-15/4，4-39/1-26/3，5-51/3-16/6，5-51/6-13/5和3-53/1-1/4。
在一实施方式中，小鼠包含重排的人Vκ1-39Jκ5序列和重排的人Vκ3-20Jκ1序列，及小鼠表达反向嵌合轻链，其包含：(i)源于人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列的VL结构域，及(ii)小鼠CL；其中所述轻链结合于反向嵌合重链，其包含：(i)小鼠CH，及(ii)体细胞地突变的源于选自下列的人VH基因段的人VH：1-2，1-8，1-24，1-69，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，3-53，4-31，4-39，4-59，5-51，6-1人VH基因段，及其组合。在一实施方式中，小鼠表达体细胞地突变的轻链。在一实施方式中CL是小鼠Cκ。
在一实施方式中，90～100％的内源性未重排的小鼠VH基因段被至少1个未重排的人VH基因段取代。在特定实施方式中，全部或基本上全部的内源性未重排的小鼠VH基因段被至少1个未重排的人VH基因段取代。在一实施方式中，取代是被至少18，至少39，至少80，或81个未重排的人VH基因段取代。在一实施方式中，取代是被至少12个有功能的未重排的人VH基因段，至少25个有功能的未重排的人VH基因段，或至少43个未重排的人VH基因段取代。
在一实施方式中，遗传修饰的小鼠是C57BL株，在特定实施方式中选自C57BL/A，C57BL/An，C57BL/GrFa，C57BL/KaLwN，C57BL/6，C57BL/6J，C57BL/6ByJ，C57BL/6NJ，C57BL/10，C57BL/10ScSn，C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在特定实施方式中，遗传修饰的小鼠是上述的129株和上述的C57BL/6株的杂种。在另一特定实施方式中，小鼠是上述的129株的杂种，或上述的BL/6株的杂种。在特定实施方式中，129株的杂种是129S6(129/SvEvTac)株。
在一实施方式中，小鼠表达反向嵌合抗体，其包含轻链，所述轻链包含小鼠Cκ和体细胞地突变的源于重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列的人VL结构域，及重链，所述重链包含小鼠CH和体细胞地突变的源于选自下列的人VH基因段的人VH结构域：1-2，1-8，1-24，1-69，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，3-53，4-31，4-39，4-59，5-51，及6-1人VH基因段，其中所述小鼠不表达完全小鼠抗体及不表达完全人抗体。在一实施方式中，小鼠包含κ轻链座位，所述κ轻链座位包含内源性小鼠κ轻链基因段被重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列取代，及包含全部或基本上全部内源性小鼠VH基因段被人VH基因段的完全或基本上完全库取代。
一方面，提供源于本文所述的小鼠的一群抗原-特异性抗体，其中所述抗体包含源于人Vκ1-39/Jκ5重排或人Vκ3-20/Jκ1重排的轻链基因，且其中所述抗体包含源于选自下列的人VH基因段的重排的重排的免疫球蛋白重链基因：1-2，1-3，1-8，1-18，1-24，1-46，1-58，1-69，2-5，2-26，2-70，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-16，3-20，3-21，3-23，3-30，3-33，3-43，3-48，3-53，3-64，3-72，3-73，4-31，4-34，4-39，4-59，5-51，及6-1人VH基因段。在一实施方式中，1个或更多人VH基因段与选自1，2，3，4，5和6的人重链JH基因段重排。在特定实施方式中，轻链具有1，2，3，4或5个或更多体细胞超突变。
在一实施方式中，轻链具有1，2，3或4个体细胞超突变。在一实施方式中，轻链基因具有1或2个突变。在各种实施方式中，轻链基因能沿着其序列引起多个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排和轻链具有至少1个或不多于4个体细胞超突变。在一实施方式中，轻链包含至少2个体细胞超突变。在一实施方式中，轻链包含至少3个体细胞超突变。在一实施方式中，轻链包含至少4个体细胞超突变。在特定实施方式中，至少1个该体细胞超突变存在于轻链的1个或更多框架区(FW)。在特定实施方式中，至少1个该体细胞超突变存在于轻链的一个或更多互补决定区(CDR)。在特定实施方式中，至少1个该体细胞超突变存在于轻链的1个或更多FW和/或1个或更多CDR。在各种实施方式中，框架区选自框架1(FW1)，框架2(FW2)，框架3(FW3)，和/或其组合。在各种实施方式中，CDR选自CDR1、CDR2、CDR3，和/或其组合。
在一实施方式中，重链在1个或更多FW或1个或更多CDR中包含至少1个突变。在一实施方式中，重链在1个或更多FW和1个或更多CDR中包含至少1个突变。在一实施方式中，重链在1个或更多FW和1个或更多CDR中包含至少2个突变。在一实施方式中，重链在1个或更多FW和1个或更多CDR中包含至少3个突变。在一实施方式中，重链在1个或更多FW和1个或更多CDR中包含至少4个突变。在一实施方式中，重链在1个或更多FW和1个或更多CDR中包含至少5个或多于5个突变；在特定实施方式中，重链在2个FW中包含至少5个或多于5个突变；在特定实施方式中，重链在1个FW及1个CDR中包含至少5个或多于5个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约9％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于FW1的至少1个突变；在一实施方式中，至少9％的轻链包含存在于FW1的1个突变。在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约25％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于CDR1的至少1个或不多于2个突变；在一实施方式中，至少19％的轻链具有存在于CDR1的1个突变；在一实施方式中，至少5％的轻链具有存在于CDR1的2个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约20％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有至少1个或不多于存在于FW2的3个突变；在一实施方式中，至少17％的轻链具有存在于FW2的1个突变；在一实施方式中，至少1％的轻链具有存在于FW2的2个突变；在一实施方式中，至少1％的轻链具有存在于FW2的3个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约10％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于CDR2的至少1个或不多于2个突变；在一实施方式中，至少10％的轻链具有存在于CDR2的1个突变；在一实施方式中，至少1％的轻链具有存在于CDR2的2个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约29％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有至少1个或不多于存在于FW3的4个突变；在一实施方式中，至少21％的轻链具有存在于FW3的1个突变；在一实施方式中，至少5％的轻链具有存在于FW3的2个突变；在一实施方式中，至少2％的轻链具有存在于FW3的3个突变；在一实施方式中，至少2％的轻链具有存在于FW3的4个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约37％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于CDR3的至少1个或不多于4个突变；在一实施方式中，至少27％的轻链具有存在于CDR3的1个突变；在一实施方式中，至少8％的轻链具有存在于CDR3的2个突变；在一实施方式中，至少1％的轻链具有存在于CDR3的3个突变；在一实施方式中，至少1％的轻链具有存在于CDR3的4个突变。
在一实施方式中，提供一群源于本文所述的小鼠的抗原-特异性抗体，其中所述抗体包含源于人Vκ1-39/Jκ5重排的轻链，和约9％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于FW1的1个或更多突变，约25％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于CDR1的1个或更多突变，约20％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于FW2的1个或更多突变，约10％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于CDR2的1个或更多突变，约29％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于FW3的1个或更多突变，及约37％的源于Vκ1-39/Jκ5的轻链具有存在于CDR3的1个或更多突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约35％的重链具有存在于FW1的至少1个突变；在一实施方式中，至少25％的重链具有存在于FW1的1个突变；在一实施方式中，至少9％的重链具有存在于FW1的2个突变；在一实施方式中，至少1％的重链具有存在于FW1的3个突变；在一实施方式中，至少1％的重链具有多于存在于FW1的5个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约92％的重链具有存在于CDR1的至少1个或不多于4个突变；在一实施方式中，至少92％的重链具有存在于CDR1的至少1，至少2，至少3，或至少4个突变；在一实施方式中，至少26％的重链具有存在于CDR1的1个突变；在一实施方式中，至少44％的重链具有存在于CDR1的2个突变；在一实施方式中，至少19％的重链具有存在于CDR1的3个突变；在一实施方式中，至少3％的重链具有存在于CDR1的4个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约66％的重链具有存在于FW2的至少1个或不多于3个突变；在一实施方式中，至少66％的重链具有存在于FW2的至少1，至少2，或至少3个突变；在一实施方式中，至少35％的重链具有存在于FW2的1个突变；在一实施方式中，至少23％的重链具有存在于FW2的2个突变；在一实施方式中，至少8％的重链具有存在于FW2的3个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约70％的重链具有存在于CDR2的至少1个或不多于4个突变；在一实施方式中，至少70％的重链具有存在于CDR2的至少2，至少3，或至少4个突变；在一实施方式中，至少34％具有存在于CDR2的1个突变；在一实施方式中，至少20％的重链具有存在于CDR2的2个突变；在一实施方式中，至少12％的重链具有存在于CDR2的3个突变；在一实施方式中，至少5％的重链具有存在于CDR2的4个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约91％的重链具有存在于FW3的至少1或达5个或更多突变；在一实施方式中，至少91％的重链具有存在于FW3的至少2，至少3，至少4，或至少5个或更多突变；在一实施方式中，至少19％的重链具有存在于FW3的1个突变；在一实施方式中，至少33％的重链具有存在于FW3的2个突变；在一实施方式中，至少22％的重链具有存在于FW3的3个突变；在一实施方式中，至少11％的重链具有存在于FW3的4个突变；在一实施方式中，至少7％的重链具有存在于FW3的5个或更多突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ1-39/Jκ5重排，和约63％的重链具有存在于CDR3的至少1个或不多于2个突变；在一实施方式中，至少63％的重链具有存在于CDR3的1个突变；在一实施方式中，至少54％的重链具有存在于CDR3的1个突变；在一实施方式中，至少9％的重链具有存在于CDR3的2个突变。
在一实施方式中，提供一群源于本文所述的小鼠的抗原-特异性抗体，其中所述抗体包含源于人Vκ1-39/Jκ5重排的轻链，和至少35％的重链具有存在于FW1的1个或更多突变，约92％的重链具有存在于CDR1的1个或更多突变，约66％的重链具有存在于FW2的1个或更多突变，约70％的重链具有存在于CDR2的1个或更多突变，约91％的重链具有存在于FW3的1个或更多突变，及约63％的重链具有存在于CDR3的1个或更多突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和轻链基因具有至少1个或不多于2个体细胞超突变；在一实施方式中，轻链基因具有至少2，至少3，至少4个或更多体细胞超突变。在特定实施方式中，突变存在于轻链的1个或更多框架区。在特定实施方式中，突变存在于轻链的一个或更多CDR区。在特定实施方式中，突变存在于轻链的1个或更多框架区和/或1个或更多CDR区。在各种实施方式中，框架区选自框架1(FW1)，框架2(FW2)，框架3(FW3)，和/或其组合。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约10％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于FW1的至少1个突变；在一实施方式中，至少10％的轻链在FW1中具有1个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约53％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于CDR1的至少1个或不多于2个突变；在一实施方式中，至少27％的轻链在CDR1中具有1个或更多个突变；在一实施方式中，约54％的轻链具有存在于CDR1的1个或2个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约6％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于FW2的至少1个或不多于2个突变；在一实施方式中，至少6％的轻链具有存在于FW2的至少1个突变；在一实施方式中，至少3％的轻链具有存在于FW2的1个突变；在一实施方式中，至少3％的轻链具有存在于FW2的2个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和至少约3％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于CDR2的至少1个突变；在一实施方式中，至少3％的轻链在CDR2中具有1个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约17％或更多源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于FW3的至少1个或不多于2个突变；在一实施方式中，至少20％的轻链具有存在于FW3的1个突变；在一实施方式中，至少17％的轻链具有存在于FW3的2个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和至少43％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于CDR3的至少1个突变；在一实施方式中，至少43％的轻链在CDR3中具有1个突变。
在一实施方式中，提供一群源于本文所述的小鼠的抗原-特异性抗体，其中所述抗体包含源于人Vκ3-20/Jκ1重排的轻链，和约10％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于FW1的1个或更多突变，约53％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于CDR1的1个或更多突变，约6％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于FW2的1个或更多突变，约3％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于CDR2的1个或更多突变，约37％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于FW3的1个或更多突变，及约43％的源于Vκ3-20/Jκ1的轻链具有存在于CDR3的1个或更多突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约43％的重链具有存在于FW1的至少1个或不多于2个突变；在一实施方式中，至少41％的重链具有存在于FW1的至少1个突变；在一实施方式中，约41％的重链具有存在于FW1的1个突变；在一实施方式中，约2％的重链具有存在于FW1的2个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约92％的重链具有存在于CDR1的至少1个或不多于4个突变；在一实施方式中，至少43％的重链具有存在于CDR1的至少1个突变；在一实施方式中，至少25％的重链具有存在于CDR1的至少2个突变；在一实施方式中，至少15％的重链具有存在于CDR1的至少3个突变；在一实施方式中，至少10％的重链具有存在于CDR1的4个或更多突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约46％的重链具有存在于FW2的至少1个或不多于3个突变；在一实施方式中，至少34％的重链具有存在于FW2的至少1个突变；在一实施方式中，至少10％的重链具有存在于FW2的2个或更多突变；在一实施方式中，至少2％的重链具有存在于FW2的3个或更多突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约84％的重链具有存在于CDR2的至少1或达5个或多于5个突变；在一实施方式中，至少39％的重链具有存在于CDR2的1个或更多突变；在一实施方式中，至少18％的重链具有存在于CDR2的2个或更多突变；在一实施方式中，至少21％的重链具有存在于CDR2的3个或更多突变；在一实施方式中，至少3％的重链具有存在于CDR2的4个或更多突变；在一实施方式中，至少2％的重链具有存在于CDR2的5个或更多突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约92％的重链具有存在于FW3的至少1或达5或多于5个突变；在一实施方式中，至少21％的轻链具有存在于FW3的至少1个突变；在一实施方式中，至少20％的重链具有存在于FW3的至少2个突变；在一实施方式中，至少13％的重链具有存在于FW3的至少3个突变；在一实施方式中，至少20％的重链在FW3中具有至少4个突变；在一实施方式中，至少18％的重链在FW3中具有至少5个突变。
在一实施方式中，轻链源于人Vκ3-20/Jκ1重排，和约7％的重链具有存在于CDR3的至少1个突变；在一实施方式中，约7％的重链在CDR3中具有1个突变。
在一实施方式中，提供一群源于本文所述的小鼠的抗原-特异性抗体，其中所述抗体包含源于人Vκ3-20/Jκ1重排的轻链，和约43％的重链具有存在于FW1的1个或更多突变，约92％的重链具有存在于CDR1的1个或更多突变，约46％的重链具有存在于FW2的1个或更多突变，约84％的重链具有存在于CDR2的1个或更多突变，约92％的重链具有存在于FW3的1个或更多突变，及约7％的重链具有存在于CDR3的1个或更多突变。
一方面，提供从重排的免疫球蛋白轻链序列表达免疫球蛋白轻链的小鼠，其中所述重排的免疫球蛋白轻链序列存在于小鼠种系，其中所述免疫球蛋白轻链包含人可变序列。在一实施方式中，小鼠种系包含与存在于包含重排的轻链序列的每小鼠的B细胞的全部非-替代品轻链序列源于相同的V段和相同的J段的重排的免疫球蛋白轻链序列。
在一实施方式中，小鼠种系缺乏有功能的未重排的免疫球蛋白轻链V基因段。在一实施方式中，小鼠种系缺乏有功能的未重排的免疫球蛋白轻链J基因段。
在一实施方式中，小鼠种系包含不多于1，不多于2，或不多于3种重排的(V/J)轻链序列。
在一实施方式中，重排的V/J序列包含κ轻链序列。在特定实施方式中，κ轻链序列是人κ轻链序列。在特定实施方式中，κ轻链序列选自人Vκ1-39/J序列，人Vκ3-20/J序列，及其组合。在特定实施方式中，κ轻链序列是人Vκ1-39/Jκ5序列。在特定实施方式中，κ轻链序列是人Vκ3-20/Jκ1序列。
在一实施方式中，小鼠还在其种系中包含选自下列的序列：相对于重排的免疫球蛋白轻链序列5’的小鼠κ内含子性增强子，小鼠κ3’增强子，及其组合。
在一实施方式中，小鼠包含未重排的人VH基因段，未重排的人DH基因段，及未重排的人JH基因段，其中所述VH，DH和JH基因段能重排而形成与重链恒定基因序列可操作地连接的免疫球蛋白重链可变的基因序列。在一实施方式中，小鼠包含多个人VH，DH和JH基因段。在特定实施方式中，人VH，DH和JH基因段在内源性小鼠免疫球蛋白重链座位取代内源性小鼠VH，DH和JH基因段。在特定实施方式中，小鼠包含全部或基本上全部有功能的小鼠VH，DH和JH基因段被全部或基本上全部有功能的人VH，DH和JH基因段取代。
在一实施方式中，小鼠表达包含小鼠恒定序列的免疫球蛋白轻链。在一实施方式中，小鼠表达包含人恒定序列的免疫球蛋白轻链。
在一实施方式中，小鼠表达免疫球蛋白重链，其包含选自下列的小鼠序列：CH1序列，铰链序列，CH2序列，CH3序列，及其组合。
在一实施方式中，小鼠表达免疫球蛋白重链，其包含选自下列的人序列：CH1序列，铰链序列，CH2序列，CH3序列，及其组合。
在一实施方式中，小鼠种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列处于内源性小鼠免疫球蛋白轻链座位。在特定实施方式中，小鼠种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列在内源性小鼠免疫球蛋白轻链座位取代全部或基本上全部小鼠轻链V和J序列。
一方面，提供小鼠，其包含由各包含非-替代品轻链序列的B细胞表征的B细胞群，其序列包含从单人V基因段和单人J基因段产生的重排的轻链基因，其中所述小鼠种系中的仅轻链可变序列是自单人V段和单人J段产生的重排的序列，且其中包含重排的轻链基因的各B细胞还包含编码同源人重链可变结构域的基因，且其中所述重排的轻链基因包含至少1，至少2，至少3，或至少4个体细胞超突变。
在一些实施方式中，提供小鼠，其成熟B细胞群的特征在于，各成熟B细胞在其表面包含非-替代品轻链序列，其序列包含通过2个人VL基因段之一及不多于5个人JL基因段之一的重排产生的重排的轻链基因，其中所述小鼠种系中的仅轻链可变序列(VLJL序列)是通过2个人VL基因段之一及不多于5个人JL基因段之一的重排产生的重排的序列，且其中各包含重排的轻链基因的B细胞还包含编码同源人重链可变结构域的基因，且其中所述重排的轻链基因包含至少1，至少2，至少3，至少4，或5个或更多体细胞超突变。在一些实施方式中，重排的轻链基因包含1，2，3，4或5个体细胞超突变。在一些实施方式中，本文所述的小鼠已被目标抗原免疫，及，在一些实施方式中，成熟B细胞群富集结合目标抗原的B细胞。
在一些实施方式中，提供小鼠，其成熟B细胞群的特征在于，各成熟B细胞在其表面包含非-替代品轻链序列，其序列包含通过2个人VL基因段之一及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人JL基因段之一的重排产生的重排的轻链基因，其中所述VL基因段基本上由2个不同的VL基因段组成和VL座位包含2个或更多(例如,2,3,4或5)个人JL基因段，且其中各包含重排的轻链基因的B细胞还包含编码同源人重链可变结构域的基因，且其中所述重排的轻链基因包含至少1，至少2，至少3，至少4，或5个或更多体细胞超突变。在一些实施方式中，重排的轻链基因包含1，2，3，4或5个体细胞超突变。在一些实施方式中，本文所述的小鼠已被目标抗原免疫，及在一些实施方式中，成熟B细胞群富集结合目标抗原的B细胞。
一方面，提供源于本文所述的小鼠的多能，诱导的多能，或全能细胞。在特定实施方式中，细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
一方面，提供源于本文所述的小鼠的组织。在一实施方式中，组织源于本文所述的小鼠的脾脏，淋巴结或骨髓。
一方面，提供源于本文所述的小鼠的核。在一实施方式中，核来自不是B细胞的二倍体细胞。
一方面，提供从本文所述的小鼠分离的小鼠细胞。在一实施方式中，细胞是ES细胞。在一实施方式中，细胞是淋巴细胞。在一实施方式中，淋巴细胞是B细胞。在一实施方式中，B细胞表达包含源于人基因段的可变结构域的嵌合重链；及源于重排的人Vκ1-39/J序列，重排的人Vκ3-20/J序列，或其组合的轻链；其中所述重链可变结构域融合到小鼠恒定区，和轻链可变结构域融合到小鼠或人恒定区。
一方面，提供杂交瘤，其中所述杂交瘤由本文所述的小鼠的B细胞制造。在特定实施方式中，B细胞来自本文所述的已被用包含目标表位的免疫原免疫的小鼠，及B细胞表达结合目标表位的结合蛋白，结合蛋白具有体细胞地突变的人VH结构域和小鼠CH，及具有源于重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL结构域和小鼠CL。
一方面，提供小鼠胚胎，其中所述胚胎包含源于本文所述的小鼠的供体ES细胞。
一方面，提供靶向载体，参照载体的5’及3’小鼠同源性臂，在转录方向自5’至3’包含：5’小鼠同源性臂，人或小鼠免疫球蛋白启动子，人或小鼠前导序列，及选自重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL区，及3’小鼠同源性臂的序列。在一实施方式中，5’及3’同源性臂使载体靶向存在于小鼠Cκ基因的5’及近端的增强子序列的5’的序列。在一实施方式中，启动子是人免疫球蛋白可变区基因段启动子。在特定实施方式中，启动子是人Vκ3-15启动子。在一实施方式中，前导序列是小鼠前导序列。在特定实施方式中，小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。
一方面，如上述提供靶向载体，但在5’小鼠同源性臂处，人或小鼠启动子在5’侧接定点重组酶识别位点(SRRS)，及在3’小鼠同源性臂处，人VL区在3’侧接SRRS。
一方面，由本文所述的小鼠制造的反向嵌合抗体，其中所述反向嵌合抗体包含轻链，其包含人VL和小鼠CL，及重链，其包含人VH和小鼠CH。
一方面，提供制造抗体的方法，包括在单细胞中表达(a)与人CH基因序列融合的本文所述的免疫的小鼠的第1VH基因序列；(b)与人CL基因序列融合的本文所述的免疫的小鼠的VL基因序列；及，(c)将细胞维持在对于表达完全人抗体足够的条件下，及分离抗体。在一实施方式中，细胞包含与人CH基因序列融合的本文所述的第2次免疫的小鼠的第2VH基因序列，第1VH基因序列编码识别第1表位的VH结构域，及第2VH基因序列编码识别第2表位的VH结构域，其中所述第1表位和第2表位不同。
一方面，提供制造表位-结合蛋白的方法，包括使本文所述的小鼠暴露于包含目标表位的免疫原，维持小鼠在对于小鼠产生特异性结合目标表位的免疫球蛋白分子足够的条件下，及分离特异性结合目标表位的免疫球蛋白分子；其中所述表位-结合蛋白包含重链，其包含体细胞地突变的人VH和小鼠CH，其与包含小鼠CL和源于重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL的轻链结合。
一方面，提供表达表位-结合蛋白的细胞，其中所述细胞包含：(a)人核苷酸序列，其编码源于重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL结构域，其中所述人核苷酸序列融合(直接或通过接头)于人免疫球蛋白轻链恒定区cDNA序列(例如,人κ恒定区DNA序列)；及(b)第1人VH核苷酸序列，其编码源于第1人VH核苷酸序列的人VH结构域，其中所述第1人VH核苷酸序列融合(直接或通过接头)于人免疫球蛋白重链恒定区cDNA序列；其中所述表位-结合蛋白识别第1表位。在一实施方式中，表位-结合蛋白以小于10-6M，小于10-8M，小于10-9M，小于10-10M，小于10-11M，或小于10-12M的解离常数结合第1表位。
在一实施方式中，细胞包含编码第2个人VH结构域的第2人核苷酸序列，其中所述第2人序列融合(直接或通过接头)于人免疫球蛋白重链恒定区cDNA序列，且其中所述第2个人VH结构域不特异性识别第1表位(例如,显示例如,10-6M,10-5M,10-4M,或更高的解离常数)，且其中所述表位-结合蛋白识别第1表位和第2表位，且其中所述第1和第2免疫球蛋白重链各与(a)的同一轻链结合。
在一实施方式中，第2VH结构域以小于10-6M，小于10-7M，小于10-8M，小于10-9M，小于10-10M，小于10-11M，或小于10-12M的解离常数结合第2表位。
在一实施方式中，表位-结合蛋白包含第1免疫球蛋白重链和第2免疫球蛋白重链，各与同一源于选自人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1的重排的人VL区的轻链结合，其中所述第1免疫球蛋白重链以nM～pM范围内的解离常数结合第1表位，第2免疫球蛋白重链以nM～pM范围内的解离常数结合第2表位，第1表位和第2表位不同，第1免疫球蛋白重链不结合第2表位或以相比μM范围更弱的解离常数(例如,毫摩尔每升范围)结合第2表位，第2免疫球蛋白重链不结合第1表位或以相比μM范围更弱的解离常数(例如,毫摩尔每升范围)结合第1表位，及VL，第1免疫球蛋白重链的VH，及第2免疫球蛋白重链的VH中的1个或更多被体细胞地突变。
在一实施方式中，第1免疫球蛋白重链包含蛋白A-结合残基，及第2免疫球蛋白重链缺乏蛋白A-结合残基。
在一实施方式中，细胞选自表达病毒核酸序列的CHO，COS，293，HeLa，及视网膜细胞(例如,PERC.6TM细胞)。
一方面，提供反向嵌合抗体，包含人VH和小鼠重链恒定区，人VL和小鼠轻链恒定区，其中所述抗体由包括用包含表位的免疫原免疫本文所述的小鼠的方法制造，及抗体特异性结合免疫小鼠的免疫原的表位。在一实施方式中，VL结构域被体细胞地突变。在一实施方式中，VH结构域被体细胞地突变。在一实施方式中，VL结构域和VH结构域被体细胞地突变。在一实施方式中，VL被连接到小鼠Cκ结构域。
一方面，提供小鼠，其包含在内源性小鼠重链座位取代全部或基本上全部小鼠VH基因段的人VH基因段；不多于1个或2个选自重排的Vκ1-39/J和其重排的Vκ3-20/J或组合的重排的人轻链VL/JL序列，取代全部小鼠轻链基因段；其中所述人重链可变的基因段被连接到小鼠恒定基因，及重排的人轻链序列被连接到人或小鼠恒定基因。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含在内源性小鼠免疫球蛋白重链座位取代全部或基本上全部小鼠免疫球蛋白VH基因段的人免疫球蛋白VH基因段；不多于2个未重排的人免疫球蛋白VL基因段和2个或更多(例如,2,3,4或5)个未重排的人免疫球蛋白JL基因段或5人免疫球蛋白JL基因段，取代全部小鼠免疫球蛋白轻链基因段；其中所述人免疫球蛋白VH基因段被连接到小鼠免疫球蛋白恒定基因，及未重排的人免疫球蛋白VL和JL基因段被连接到人或非-人免疫球蛋白恒定基因。在一些实施方式中，非-人恒定基因是小鼠免疫球蛋白恒定基因。在一些实施方式中，非-人免疫球蛋白恒定基因是大鼠免疫球蛋白恒定基因。
一方面，包含全部或基本上全部小鼠重链可变的基因段被人重链可变的基因段取代，及不多于1个或2个重排的人轻链VL/JL序列的小鼠ES细胞，其中所述人重链可变的基因段被连接到小鼠免疫球蛋白重链恒定基因，及重排的人轻链VL/JL序列被连接到小鼠或人免疫球蛋白轻链恒定基因。在特定实施方式中，轻链恒定基因是小鼠恒定基因。
在一些实施方式中，提供小鼠ES细胞，其包含全部或基本上全部小鼠免疫球蛋白VH基因段被人免疫球蛋白VH基因段取代和不多于2个未重排的人免疫球蛋白VL基因段和2个或更多(例如,2,3,4或5)个未重排的人免疫球蛋白JL基因段，其中所述人免疫球蛋白VH基因段被连接到小鼠免疫球蛋白重链恒定基因，及未重排的人免疫球蛋白VL和JL基因段被连接到非-人或人免疫球蛋白轻链恒定基因。在一些特定实施方式中，非-人免疫球蛋白轻链恒定基因是小鼠免疫球蛋白恒定基因。在一些特定实施方式中，小鼠包含5个未重排的免疫球蛋白JL基因段。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于至少1个，及在一些实施方式中全部，小鼠VL基因段被1个人VL基因段或不多于2个人VL基因段取代。在一些实施方式中，小鼠的人VL基因段能重排为2个或更多人JL基因段之一而编码抗体的免疫球蛋白VL结构域。在一些实施方式中，本文所述的小鼠的轻链座位的人VL基因段可操作地连接于2个或更多(例如,2,3,4或5)个人JL基因段。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之前不含有编码内源性VL基因段的核苷酸序列。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之前不含有编码内源性JL基因段的核苷酸序列。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之前不含有编码内源性VL和JL基因段的核苷酸序列。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之后不含有编码内源性VL基因段的核苷酸序列。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之后不含有编码内源性JL基因段的核苷酸序列。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之后不含有编码内源性VL和JL基因段的核苷酸序列。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之前含有不多于2个人VL基因段和2个或更多(例如,2,3,4或5)个人JL基因段。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之前含有不多于2个人VL基因段和5个人JL基因段。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之后含有不多于2个人VL基因段和5个或更少(例如,5,4,3,2或1)个人JL基因段。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之后含有不多于2个人VL基因段及1，2，3，4或5个人JL基因段。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之后含有1个人VL基因段和5个或更少(例如,5,4,3,2或1)人JL基因段。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之后含有1个人VL基因段及1，2，3，4或5个人JL基因段。
在各种实施方式中，人VL和JL基因段是人Vκ和Jκ基因段。在各种实施方式中，人Vκ段选自人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段。在一些实施方式中，人Vκ段是人Vκ1-39和人Vκ3-20。在一些实施方式中，人Jκ段选自Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4，Jκ5基因段，及其组合。在一些实施方式中，人Jκ基因段是人Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4和Jκ5。
在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构不同于图19的参照结构在于，其在重排之前含有与图1，图2，图3或图9的结构基本上相同的结构。在一些实施方式中，提供小鼠，其包含轻链座位，其结构在重排之前与图1，图2，图3或图9的结构相同。
一方面，提供由本文所述的小鼠制造的抗原-结合蛋白。在特定实施方式中，抗原-结合蛋白包含与小鼠恒定区融合的人免疫球蛋白重链可变区，及源于Vκ1-39基因段或Vκ3-20基因段的人免疫球蛋白轻链可变区，其中所述轻链恒定区是小鼠恒定区。
一方面，提供由自本文所述的小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列制造的完全人抗原-结合蛋白，其中所述抗原-结合蛋白包含完全人重链，所述完全人重链包含源于本文所述的小鼠的序列的人可变区，及包含Vκ1-39或Vκ3-20的完全人轻链。在一实施方式中，轻链可变区包含1个至5个体细胞突变。在一实施方式中，轻链可变区是在小鼠的B细胞中与重链可变区配对的同源轻链可变区。
在一实施方式中，完全人抗原-结合蛋白包含第1重链和第2重链，其中所述第1重链和第2重链包含独立地源于本文所述的小鼠的非-同一可变区，且其中与源于Vκ1-39基因段或Vκ3-20基因段的人轻链结合的各第1和第2重链自宿主细胞表达。在一实施方式中，第1重链包含特异性结合第1抗原的第1表位的第1重链可变区，及第2重链包含特异性结合第2抗原的第2表位的第2重链可变区。在特定实施方式中，第1抗原和第2抗原不同。在特定实施方式中，第1抗原和第2抗原是相同的，及第1表位和第2表位不同；在特定实施方式中，第1表位与结合蛋白的第1分子结合不阻断第2表位与结合蛋白的第2分子的结合。
一方面，源于本文所述的小鼠的人免疫球蛋白序列的完全人结合蛋白包含第1免疫球蛋白重链和第2免疫球蛋白重链，其中所述第1免疫球蛋白重链包含与第2免疫球蛋白重链的可变区不同的第1可变区，且其中所述第1免疫球蛋白重链包含野生型蛋白A结合决定子，及第2重链缺乏野生型蛋白A结合决定子。在一实施方式中，第1免疫球蛋白重链在分离条件下结合蛋白A，及第2免疫球蛋白重链在分离条件下不结合蛋白A或以第1免疫球蛋白重链结合蛋白A的至多10分之一，百分之一或千分之一结合蛋白A。在特定实施方式中，第1和第2重链是IgG1同种型，其中所述第2重链包含选自95R(EU435R)，96F(EU 436F)，及其组合的修饰，且其中所述第1重链缺乏该修饰。
一方面，提供制造双特异性抗原-结合蛋白的方法，包含使本文所述的第1小鼠暴露于包含第1表位的第1目标抗原，使本文所述的第2小鼠暴露于包含第2表位的第2目标抗原，使第1和第2小鼠各产生针对目标抗原的免疫应答，在第1小鼠中鉴定结合第1目标抗原的第1表位的第1人重链可变区，在第2小鼠中鉴定结合第2目标抗原的第2表位的第2人重链可变区，制造编码结合第1目标抗原的第1表位的第1重链的第1完全人重链基因，制造编码结合第2目标抗原的第2表位的第2重链的第2完全人重链基因，在表达源于人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段的单完全人轻链的细胞中表达第1重链和第2重链而形成双特异性抗原-结合蛋白，及分离双特异性抗原-结合蛋白。
在一实施方式中，第1抗原和第2抗原不同。
在一实施方式中，第1抗原和第2抗原相同，及第1表位和第2表位不同。在一实施方式中，第1重链可变区与第1表位的结合不阻断第2重链可变区与第2表位的结合。
在一实施方式中，人轻链当与第1重链配对时特异性结合第1抗原的第1表位和当与第2重链配对时特异性结合第2抗原的第2表位。
在一实施方式中，第1抗原选自可溶性抗原和细胞表面抗原(例如,肿瘤抗原)，及第2抗原包含细胞表面受体。在特定实施方式中，细胞表面受体是免疫球蛋白受体。在特定实施方式中，免疫球蛋白受体是Fc受体。在一实施方式中，第1抗原和第2抗原是相同的细胞表面受体，及第1重链与第1表位的结合不阻断第2重链与第2表位的结合。
在一实施方式中，轻链的轻链可变结构域包含2至5个体细胞突变。在一实施方式中，轻链可变结构域是在用第1或第2重链可变结构域第1次或第2次免疫的小鼠的B细胞中表达的体细胞地突变的同源轻链。在一实施方式中，所述细胞的轻链包含种系序列。
在一实施方式中，第1完全人重链带有减小其与蛋白A的亲和性的氨基酸修饰，及第2完全人重链不包含减小其与蛋白A的亲和性的修饰。
一方面，提供制备特异性结合第1和第2抗原的双特异性抗体的方法，其中所述方法包括(a)鉴定编码特异于第1抗原的第1人重链可变(VH)结构域的第1核酸序列；(b)鉴定编码特异于第2抗原的第2人重链可变(VH)结构域的第2核酸序列；(c)提供编码人轻链可变(VL)区的第3核酸序列，其当与(a)的VH区配对时特异性结合第1抗原，及当与(b)的VH区配对时特异性结合第2抗原；(d)培养包含第1，第2和第3核酸序列的宿主细胞而允许第1和第2个人VH区和人VL区表达而形成双特异性抗体；及(d)回收所述双特异性抗体。在多方面，第1和第2抗原彼此不同。在多方面，从免疫的表达来自重排的免疫球蛋白轻链序列的人免疫球蛋白VL区的小鼠分离第1和第2核酸序列，其中所述重排的免疫球蛋白序列在小鼠种系中。
在一实施方式中，人VL区源于包含人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段的重排的人轻链序列。在特定实施方式中，重排的人轻链序列是种系序列(即,在V基因段序列内不包含体细胞超突变)。
在一实施方式中，从表达来自小鼠种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列的人免疫球蛋白VL区的小鼠分离第3核酸序列。在一实施方式中，重排的免疫球蛋白轻链序列包含人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段。在特定实施方式中，重排的免疫球蛋白轻链序列包含人Vκ1-39基因段。在一实施方式中，人免疫球蛋白VL区自修饰的内源性免疫球蛋白轻链座位表达。
在一实施方式中，第1和第2抗原存在于一个分子上。在一实施方式中，第1和第2抗原存在于不同分子上。在各种实施方式中，第1或第2核酸序列包含减小编码的重链与蛋白A的亲和性的修饰。
在一实施方式中，第1或第2核酸序列包含重排的人重链可变区序列，其包含选自下列的人重链基因段：VH1-2，VH1-3，VH1-8，VH1-18，VH1-24，VH1-46，VH1-58，VH1-69，VH2-5，VH2-26，VH2-70，VH3-7，VH3-9，VH3-11，VH3-13，VH3-15，VH3-20，VH3-21，VH3-23，VH3-30，VH3-33，VH3-43，VH3-48，VH3-53，VH3-64，VH3-72，VH3-73，VH4-31，VH4-34，VH4-39，VH4-59，VH5-51和VH6-1。在特定实施方式中，重链基因段是VH2-5，VH3-23或VH3-30。
一方面，提供制备特异性结合第1和第2抗原的双特异性抗体的方法，其中所述方法包括(a)鉴定编码特异于第1抗原的第1人重链可变(VH)结构域的第1核酸序列；(b)鉴定编码特异于第2抗原的第2人重链可变(VH)结构域的第2核酸序列；(c)提供编码源于人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段的人轻链可变(VL)区的第3核酸序列，其当与(a)的VH区配对时特异性结合第1抗原，及当与(b)的VH区配对时特异性结合第2抗原；(d)培养包含第1，第2和第3核酸序列的宿主细胞而允许第1和第2个人VH区和人VL区的表达而形成双特异性抗体；及(d)回收所述双特异性抗体。在多方面，第1和第2抗原彼此不同。在多方面，从免疫的表达来自源于人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段的重排的免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白VL区的小鼠分离第1和第2核酸序列，其中所述重排的人Vκ1-39或Vκ3-30基因段在小鼠种系中。
在一实施方式中，第3核酸序列是种系序列(即,在V基因段序列内不包含体细胞超突变)。在一实施方式中，从表达源于来自小鼠种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列的人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段的人免疫球蛋白VL区的小鼠分离第3核酸序列。在特定实施方式中，第3核酸序列在互补测定区(CDR)和/或框架区(FWR)中包含2至5个体细胞超突变。在一实施方式中，人免疫球蛋白VL区自修饰的内源性免疫球蛋白轻链座位表达。
在一实施方式中，第1和第2抗原存在于一个分子上。在一实施方式中，第1和第2抗原存在于不同分子上。在一实施方式中，第1或第2核酸序列包含减小编码的重链与蛋白A的亲和性的修饰。
在一实施方式中，第1或第2核酸序列包含重排的人重链可变区序列，其包含选自下列的人重链基因段：VH1-2，VH1-3，VH1-8，VH1-18，VH1-24，VH1-46，VH1-58，VH1-69，VH2-5，VH2-26，VH2-70，VH3-7，VH3-9，VH3-11，VH3-13，VH3-15，VH3-20，VH3-21，VH3-23，VH3-30，VH3-33，VH3-43，VH3-48，VH3-53，VH3-64，VH3-72，VH3-73，VH4-31，VH4-34，VH4-39，VH4-59，VH5-51和VH6-1。在特定实施方式中，重链基因段是VH2-5，VH3-23或VH3-30。
一方面，提供制造双特异性抗体的方法，包括使本文所述的小鼠暴露于目标抗原，允许小鼠产生针对目标抗原的免疫应答，鉴定结合目标抗原的第1表位的第1人重链可变区，鉴定结合目标抗原的第2表位的第2人重链可变区，制造编码结合目标抗原的第1表位的第1重链的第1完全人重链基因，制造编码结合目标抗原的第2表位的第2重链的第2完全人重链基因，在表达源于人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段的单完全人轻链的细胞中表达第1重链和第2重链而形成双特异性抗体，及分离双特异性抗原-结合蛋白。
在一实施方式中，第1表位和第2表位不同。在一实施方式中，第1重链可变区与第1表位的结合不阻断第2重链可变区与第2表位的结合。在一实施方式中，第1和第2重链能同时结合第1和第2表位。
在一实施方式中，双特异性抗体同时结合第1和第2表位。在一实施方式中，双特异性抗体独立地结合第1表位和第2表位。
在一实施方式中，双特异性抗体对抗原的结合应答是第1重链可变区对抗原的结合应答的约2倍。在一实施方式中，双特异性抗体对抗原的结合应答是第2重链可变区对抗原的结合应答的约2倍。在一实施方式中，双特异性抗体对抗原的结合应答与第1重链可变区及或第2重链可变区对抗原的结合应答约相同，或约等同。
在一实施方式中，抗原选自可溶性抗原，细胞表面抗原(例如,肿瘤抗原)和细胞表面受体。在特定实施方式中，细胞表面受体是免疫球蛋白受体。在特定实施方式中，免疫球蛋白受体是Fc受体。
在一实施方式中，轻链的轻链可变结构域包含2至5个体细胞突变。在一实施方式中，轻链可变结构域是在用第1或第2重链可变结构域免疫的小鼠的B细胞中表达的体细胞地突变的同源轻链。
在一实施方式中，第1完全人重链带有减小其对蛋白A的亲和性的氨基酸修饰，及第2完全人重链不包含减小其对蛋白A的亲和性的修饰。
在各种实施方式中，增强制造双特异性抗体的方法通过采用常见轻链以与双特异性抗体的各重链可变区配对。在各种实施方式中，相比采用原同源轻链，采用本文所述的常见轻链减少缺少双特异性的免疫球蛋白的不适当的物种数。在各种实施方式中，由包含常见轻链的单特异性抗体鉴定双特异性抗体的重链可变区。在各种实施方式中，双特异性抗体的重链可变区包含在小鼠B细胞之内体内重排的人重链可变的基因段，所述小鼠B细胞已之前加工为表达限制的人轻链库，或单人轻链，与人重链同源及，响应暴露于目标抗原，产生含有多个与1个或2个之一的可能的人轻链可变区同源的人重链可变区的嵌合抗体库，其中所述嵌合抗体特异于目标抗原。
在多方面，提供制备双特异性抗体的方法，双特异性抗体包含：(1)第1多肽和第2多肽，其中所述第1和第2多肽各包括多聚化结构域(例如,免疫球蛋白Fc结构域)允许第1和第2多肽形成二聚体，及促进第1和第2多肽之间稳定的相互作用的多聚化结构域，且其中多聚化结构域之一带有减小其对蛋白A的亲和性的氨基酸修饰和其他多聚化结构域缺乏修饰，(2)在各第1和第2多肽中的结合结构域，各结合结构域包含可变的重链和可变的轻链，其中所述第1多肽的可变的轻链和第2多肽的可变的轻链具有共同氨基酸序列，常见序列与至少80％，至少85％，优选至少90％，更优选至少95％和最优选100％序列同一性的各多肽的原轻链具有氨基酸序列同一性。在各种实施方式中，可变的轻链源于人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段。在各种实施方式中，可变的轻链是重排的人轻链序列。在各种实施方式中，可变的轻链从本文所述的小鼠分离。
在各种实施方式中，所述方法包括下列步骤：(i)培养包含编码第1多肽，第2多肽，及常见轻链的核酸的宿主细胞，其中所述核酸被表达；及(ii)自宿主细胞培养物回收双特异性抗体；在一实施方式中，编码第1多肽的核酸或编码第2多肽的核酸带有减小其对蛋白A的亲和性的氨基酸修饰。在一实施方式中，编码第1多肽，第2多肽，及常见轻链的核酸存在于单载体或分离的载体中。在一实施方式中，宿主细胞用于根据在前段落制造双特异性抗体。
一方面，提供制备双特异性抗体的方法，包含(a)选择第1核酸，其编码自本文所述的小鼠分离的第1人重链可变区；(b)选择第2核酸，其编码自相同的或分离的本文所述的小鼠分离的第2人重链可变区；(c)提供第3核酸，其编码自本文所述的小鼠分离的人轻链可变区或源于本文所述的重排的人轻链可变区；(c)向宿主细胞导入第1，第2和第3核酸，及培养宿主细胞从而发生所述第1，第2和第3核酸的表达；及(d)回收从细胞培养形成的双特异性抗体。
在一实施方式中，第1和第2人重链可变区被体细胞地突变。在特定实施方式中，第1和第2人重链可变区独立地源于选自下列的重排的人VH基因段：1-2，1-3，1-8，1-18，1-24，1-46，1-58，1-69，2-5，2-26，2-70，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-16，3-20，3-21，3-23，3-30，3-33，3-43，3-48，3-53，3-64，3-72，3-73，4-31，4-34，4-39，4-59，5-51，及6-1人VH基因段。在一实施方式中，第1和第2人重链可变区独立地源于选自下列的重排的人VH基因段：2-5，3-30和3-23。在一实施方式中，第1人重链可变区源于人VH2-5基因段和第2人重链可变区源于人VH3-30基因段。在一实施方式中，第1人重链可变区源于人VH3-30基因段和第2人重链可变区源于人VH3-23基因段。在一实施方式中，第1人重链可变区源于人VH3-23基因段和第2人重链可变区源于人VH3-30基因段。
在一实施方式中，在步骤(c)之前修饰第1或第2核酸，其中修饰所述第1或第2核酸，使得其具有减小的对蛋白A的亲和性。
在一实施方式中，从本文所述的小鼠分离第3核酸。在一实施方式中，第3核酸包含2至5个体细胞突变。在一实施方式中，第3核酸编码源于人Vκ1-39基因段的人轻链可变区。在一实施方式中，第3核酸编码源于人Vκ3-20基因段的人轻链可变区。
在一实施方式中，第3核酸源于重排的人轻链可变区。在一实施方式中，重排的人轻链可变区包含源于人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段的序列。在一实施方式中，重排的人轻链可变区包含种系人Vκ1-39序列(即,在V基因段序列内不包含体细胞超突变)。在一实施方式中，重排的人轻链可变区包含种系人Vκ3-20序列。
在各种实施方式中，提供制备双特异性抗体的方法，其合并包含源于在其种系中缺乏重排的人轻链序列的修饰的小鼠的可变结构域的第1人重链，其中所述第1人重链与包含源于人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段的重排的人轻链可变区的同源人轻链配对。在各种实施方式中，由本文所述的免疫的小鼠鉴定与第1人重链具有不同特异性的第2人重链。如描述于在前段落将编码2个重链和常见轻链的核酸导入宿主细胞，从而发生全部3个链的表达，及自细胞培养物回收双特异性抗体。
在一实施方式中，将小鼠用用于产生第1人重链可变结构域的相同的抗原免疫。在一实施方式中，将小鼠用用于产生第1人重链可变结构域的不同抗原免疫。
一方面，提供选择可与单人轻链配对而制造双特异性抗体的人重链的方法，包括编码双特异性抗体的核酸和包含所述核酸的宿主细胞。
一方面，提供相比不期望的产物诸如单特异性抗体，增加细胞培养物中期望的双特异性抗体的量的方法，其中将双特异性抗体的重链之一修饰为减小其对蛋白A的亲和性。
一方面，提供分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(a)编码结合第1抗原的第1人重链可变区的第1核酸序列，其中所述第1核酸序列从用表达来自小鼠种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列的人免疫球蛋白VL区第1抗原免疫的小鼠分离；(b)编码结合第2抗原的第2人重链可变区的第2核酸序列，其中所述第2核酸序列从用表达来自小鼠种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列的人免疫球蛋白VL区的第2抗原免疫的小鼠分离；(c)编码人轻链可变区的第3核酸序列，其当与(a)的重链可变区配对时特异性结合第1抗原，及当与(b)的重链可变区配对时特异性结合第2抗原。
在多方面，第1和第2抗原彼此不同。在多方面，第1，第2和第3核酸序列的表达导致特异性结合第1和第2抗原的双特异性抗体的形成。
在一实施方式中，人VL区源于包含人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段的重排的人轻链序列。在特定实施方式中，重排的人轻链序列是种系序列(即,在可变结构域内不包含体细胞超突变)。在一实施方式中，第3核酸序列从表达来自重排的免疫球蛋白轻链序列的人免疫球蛋白VL区的小鼠分离，其中所述重排的人轻链序列存在于小鼠种系。在一实施方式中，重排的免疫球蛋白轻链序列包含人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段。在特定实施方式中，人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段在互补测定区(CDR)或框架区(FWR)中包含至少1个体细胞超突变。在特定实施方式中，第1，第2和第3核酸序列从表达源于来自重排的免疫球蛋白轻链序列的人Vκ1-39或人Vκ3-20基因段的人免疫球蛋白VL区的小鼠分离，其中所述重排的免疫球蛋白轻链序列存在于小鼠种系。
在各种实施方式中，小鼠不含有内源性轻链可变区基因段，其能重排而形成免疫球蛋白轻链。
在一实施方式中，人免疫球蛋白VL区自修饰的内源性免疫球蛋白轻链座位表达。在一实施方式中，第1和第2抗原存在于1个分子上。在一实施方式中，第1和第2抗原存在于不同分子上。在一实施方式中，第1或第2核酸序列包含减小编码的重链与蛋白A的亲和性的修饰。
在一实施方式中，第1或第2核酸序列包含重排的人重链可变区序列，其包含选自下列的人重链基因段：VH1-2，VH1-3，VH1-8，VH1-18，VH1-24，VH1-46，VH1-58，VH1-69，VH2-5，VH2-26，VH2-70，VH3-7，VH3-9，VH3-11，VH3-13，VH3-15，VH3-20，VH3-21，VH3-23，VH3-30，VH3-33，VH3-43，VH3-48，VH3-53，VH3-64，VH3-72，VH3-73，VH4-31，VH4-34，VH4-39，VH4-59，VH5-51和VH6-1。在特定实施方式中，重链基因段是VH2-5，VH3-23或VH3-30。
一方面，提供根据本发明制造的包含人重链可变结构域的抗体或双特异性抗体。在另一方面，提供使用本文所述的小鼠而制造完全人抗体或完全人双特异性抗体的用途。
一方面，本文所述的遗传修饰的小鼠，胚胎或细胞包含κ轻链座位，其保留内源性调控或控制元件，例如，小鼠κ内含子性增强子，小鼠κ3’增强子，或内含子性增强子和3’增强子，其中所述调控或控制元件辅助κ轻链座位的表达的序列的体细胞突变和亲和性成熟。
一方面，提供小鼠，其包含由具有源于不多于1个，或不多于2个，重排的或未重排的免疫球蛋白轻链V和J基因段的免疫球蛋白轻链表征的B细胞群，其中所述小鼠呈现与包含免疫球蛋白轻链V和J基因段的野生型补体的小鼠约相同的κ:λ轻链比。
在一实施方式中，免疫球蛋白轻链源于不多于1个或不多于2个重排的免疫球蛋白轻链V和J基因段。在特定实施方式中，轻链源于不多于1个重排的免疫球蛋白轻链V和J基因段。在一实施方式中，免疫球蛋白轻链从2个未重排的免疫球蛋白VL基因段之一及1，2，3，4或5个免疫球蛋白JL基因段之一产生。在一实施方式中，免疫球蛋白轻链从2个未重排的免疫球蛋白VL基因段之一及1个免疫球蛋白JL基因段产生。
一方面，提供表达源于不多于1个或不多于2个人Vκ/Jκ序列的免疫球蛋白轻链的本文所述的小鼠，其中所述小鼠包含全部或基本上全部内源性小鼠重链可变区基因段被1个或更多人重链可变区基因段的取代，及小鼠呈现约1～约20的(a)表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞与(b)表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞的比。
在一实施方式中，小鼠表达源于人Vκ1-39Jκ5序列的单κ轻链，及表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞的比是约1～约20；在一实施方式中，该比是约1～至少约66；在特定实施方式中，该比是约1～66。
在一实施方式中，小鼠表达源于人Vκ3-20Jκ5序列的单κ轻链，及表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞的比是约1～约20；在一实施方式中，该比是约1～约21。在特定实施方式中，该比是1～20或1～21。
在一些实施方式中，本发明提供表达与由2个人Vκ基因段之一与1，2，3，4或5个人Jκ基因段的重排达到的序列相同的免疫球蛋白轻链的小鼠。
在一些实施方式中，提供表达从2个人Vκ基因段之一及1，2，3，4或5个人Jκ基因段之一的重排产生的免疫球蛋白轻链的小鼠，其中所述小鼠包含全部或基本上全部内源性免疫球蛋白VH基因段被1个或更多人免疫球蛋白VH，1个或更多DH，及1个或更多JH基因段取代，及小鼠呈现约1～约15的(a)表达具有λ轻链的免疫球蛋白的骨髓中的B细胞与(b)表达具有κ轻链的免疫球蛋白的骨髓中的B细胞的比。在一些实施方式中，重排包括人Vκ1-39基因段。在一些实施方式中，重排包括人Vκ3-20基因段。在一些实施方式中，内源性免疫球蛋白VH基因段的取代在内源性免疫球蛋白VH座位。在一些实施方式中，2个人Vκ基因段在内源性免疫球蛋白Vκ座位，及在一些实施方式中，2个人Vκ基因段取代全部或基本上全部小鼠免疫球蛋白Vκ基因段。在一些实施方式中，2个人Vκ基因段在内源性免疫球蛋白Vκ座位，及在一些实施方式中，2个人Vκ基因段取代全部或基本上全部小鼠免疫球蛋白Vκ和Jκ基因段。在各种实施方式中，2个人Vκ基因段可操作地连接于2个或更多(例如,2,3,4,5)个人Jκ基因段。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人Jκ基因段之一的重排产生的轻链，及表达具有λ轻链的免疫球蛋白的骨髓中未成熟的B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的未成熟的B细胞的比是约1～约13。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人Jκ基因段之一的重排产生的轻链，及表达具有λ轻链的免疫球蛋白的骨髓中成熟B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的未成熟的B细胞的比是约1～约7。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人Jκ基因段之一的重排产生的轻链，及在骨髓中具有约2.5×104～约1.5×105细胞的范围内，包括，例如约2.5×104，3.0×104，3.5×104，4.0×104，4.5×104，5.0×104，5.5×104，6.0×104，6.5×104，7.0×104，7.5×104，8.0×104，8.5×104，9.0×104，9.5×104，1.0×105或1.5×105细胞的原B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.88×104细胞的原B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约6.42×104细胞的原B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约9.16×104细胞的原B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.19×105细胞的原B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的骨髓中的例示原B细胞通过CD19、CD43、c-kit和/或其组合的表达表征(例如,CD19+,CD43+,c-kit+)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人Jκ基因段之一的重排产生的轻链，及在骨髓中具有约1×106～约2×106细胞范围内，包括，例如，约1.0×106，1.1×106，1.2×106，1.3×106，1.4×106，1.5×106，1.6×106，1.7×106，1.8×106，1.9×106或2.0×106细胞的前B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.25×106细胞的前B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.46×106细胞的前B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.64×106细胞的前B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.03×106细胞的前B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的骨髓中的例示前B细胞通过CD19、CD43、c-kit和/或其组合的表达表征(例如,CD19+,CD43-,c-kit-)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人Jκ基因段之一的重排产生的轻链，及在骨髓中具有约5×105～约7×105细胞范围内，包括，例如，约5.0×105，5.1×105，5.2×105，5.3×105，5.4×105，5.5×105，5.6×105，5.7×105，5.8×105，5.9×105，6.0×105，6.1×105，6.2×105，6.3×105，6.4×105，6.5×105，6.6×105，6.7×105，6.8×105，6.9×105或7.0×105细胞的未成熟的B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约5.33×105细胞的未成熟的B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约5.80×105细胞的未成熟的B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约5.92×105细胞的未成熟的B细胞群；在一些实施方式中，小鼠在骨髓中包含约6.67×105细胞的未成熟的B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的骨髓中的例示未成熟的B细胞通过IgM、B220和/或其组合的表达表征(例如,IgM+,B220int)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人Jκ基因段之一的重排产生的轻链，及在骨髓中具有约3×104～约1.5×105细胞范围内，包括，例如约3.0×104，3.5×104，4.0×104，4.5×104，5.0×104，5.5×104，6.0×104，6.5×104，7.0×104，7.5×104，8.0×104，8.5×104，9.0×104，9.5×104，1.0×105或1.5×105细胞的成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约3.11×104细胞的成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.09×105细胞的成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.16×105细胞的成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.44×105细胞的成熟B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的骨髓中的例示成熟B细胞通过IgM、B220和/或其组合的表达表征(例如,IgM+,B220hi)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人Vκ1-39基因段或人Vκ3-20基因段及2个或更多(例如,2,3,4或5)个人Jκ基因段之一的重排产生的轻链，及在骨髓中具有约1×106～约3×106细胞范围内，包括，例如约1.0×106，1.1×106，1.2×106，1.3×106，1.4×106，1.5×106，1.6×106，1.7×106，1.8×106，1.9×106，2.0×106，2.1×106，2.2×106，2.3×106，2.4×106，2.5×106，2.6×106，2.7×106，2.8×106，2.9×106或2.0×106细胞的总B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.59×106细胞的总B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.75×106细胞的总B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.13×106细胞的总B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.55×106细胞的总B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的骨髓中的例示总B细胞通过CD19、CD20和/或其组合的表达表征(例如,CD19+)。
一方面，提供表达单重排的κ轻链的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含功能性λ轻链座位，且其中所述小鼠表达包含表达源于相同的单重排的κ轻链的κ轻链的Igκ+细胞的B细胞群。在一实施方式中，该小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分率为约与野生型小鼠中相同。在特定实施方式中，该小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分率是约2～约6％。在特定实施方式中，该小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分率，其中所述单重排的κ轻链源于Vκ1-39Jκ5序列，是约2～约3；在特定实施方式中，百分率是约2.6。在特定实施方式中，该小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分率，其中所述单重排的κ轻链源于Vκ3-20Jκ1序列，是约4～约8；在特定实施方式中，百分率是约6。
在一些实施方式中，提供表达包含重排的人免疫球蛋白Vκ/Jκ序列的免疫球蛋白轻链的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含功能免疫球蛋白λ轻链座位，且其中所述小鼠包含脾B细胞群，所述脾B细胞群包含约1～约8的Igλ+B细胞与Igκ+B细胞的比；在一些实施方式中，约1～约5。在一些实施方式中，重排的人免疫球蛋白Vκ/Jκ序列通过2个人免疫球蛋白Vκ基因段之一及1，2，3，4或5个人免疫球蛋白Jκ基因段之一的重排产生。在一些实施方式中，重排的人免疫球蛋白Vκ/Jκ序列通过人免疫球蛋白Vκ1-39基因段和选自Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4，Jκ5及其组合的人免疫球蛋白Jκ基因段的重排产生。在一些实施方式中，重排的人免疫球蛋白Vκ/Jκ序列通过人免疫球蛋白Vκ3-20基因段和选自Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4，Jκ5及其组合的人免疫球蛋白Jκ基因段的重排产生。
在一些实施方式中，本发明的小鼠以约2×106～约7×106细胞的范围内，包括，例如约2.0×106，2.5×106，3.0×106，3.5×106，4.0×106，4.5×106，5.0×106，5.5×106，6.0×106，6.5×106或7.0×106细胞包含CD19+脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约2.74×106细胞的CD19+脾B细胞群；一些实施方式，本发明的小鼠包含约4.30×106细胞的CD19+脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约5.53×106细胞的CD19+脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约6.18×106细胞的CD19+脾B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠以约1×106～约4×106细胞的范围内，包括，例如约1.0×106，1.5×106，2.0×106，2.5×106，3.0×106，3.5×106，4.0×106细胞包含CD19+，IgDhi，IgMlo脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.30×106细胞的CD19+，IgDhi，IgMlo脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约2.13×106细胞的CD19+，IgDhi，IgMlo脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约3.15×106细胞的CD19+，IgDhi，IgMlo脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约3.93×106细胞的CD19+，IgDhi，IgMlo脾B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠以约9×105～约2×106细胞的范围内，包括，例如约9.0×105，9.25×105，9.5×105，9.75×105，1.0×106，1.25×106，1.50×106，1.75×106，2.0×106细胞包含CD19+，IgDlo，IgMhi脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约9.52×105细胞的CD19+，IgDlo，IgMhi脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.23×106细胞的CD19+，IgDlo，IgMhi脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.40×106细胞的CD19+，IgDlo，IgMhi脾B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.42×106细胞的CD19+，IgDlo，IgMhi脾B细胞群。
在一些实施方式中，提供遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含免疫球蛋白κ轻链座位，其包含2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和2个或更多(例如,2,3,4或5)个未重排的人Jκ基因段，且其中所述小鼠包含与包含免疫球蛋白κ轻链V和J基因段的野生型补体的小鼠约相同的包含移行(例如,T1,T2和T3)B细胞群的外周脾B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的脾脏中的例示移行B细胞群(例如,T1,T2和T3)通过IgM，CD23，CD93，B220和/或其组合的表达表征。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2×106～约7×106细胞范围内，包括，例如约2.0×106，2.5×106，3.0×106，3.5×106，4.0×106，4.5×106，5.0×106，5.5×106，6.0×106，6.5×106或7.0×106细胞的T1B细胞群(例如,CD93+,B220+,IgMhi,CD23-)；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.16×106细胞的T1B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.63×106细胞的T1B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.91×106细胞的T1B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约6.83×106细胞的T1B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1×106～约7×106细胞范围内，包括，例如约1.0×106，1.5×106，2.0×106，2.5×106，3.0×106，3.5×106，4.0×106，4.5×106，5.0×106，5.5×106，6.0×106，6.5×106或7.0×106细胞的T2B细胞群(例如,CD93+,B220+,IgMhi,CD23+)；在一些实施方式中，本发明的小鼠小鼠在脾脏中包含约1.30×106细胞的T2B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.46×106细胞的T2B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.24×106细胞的T2B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约6.52×106细胞的T2B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1×106～约4×106细胞范围内，包括，例如约1.0×106，1.5×106，2.0×106，2.5×106，3.0×106，3.5×106或4.0×106细胞的T3B细胞群(例如,CD93+,B220+,IgMlo,CD23+)；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.08×106细胞的T3B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.35×106细胞的T3B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.37×106细胞的T3B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.63×106细胞的T1B细胞群。
在一些实施方式中，提供遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含免疫球蛋白κ轻链座位，其包含2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和1，2，3，4或5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段，且其中所述小鼠包含与包含免疫球蛋白Vκ和Jκ基因段的野生型补体的小鼠约相同的包含边缘区域和边缘区域前体B细胞群的外周脾B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的脾脏中的例示边缘区域B细胞群通过IgM，CD21/35，CD23，CD93，B220和/或其组合的表达表征。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1×106～约3×106细胞范围内，包括，例如，约1.0×106，1.5×106，2.0×106，2.5×106或3.0×106细胞的边缘区域B细胞群(例如,CD93-,B220+,IgMhi,CD21/35hi,CD23-)；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.47×106细胞的边缘区域B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.49×106细胞的边缘区域B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.26×106细胞的边缘区域B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.33×106细胞的边缘区域B细胞群。
在一些实施方式中，提供遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含免疫球蛋白κ轻链座位，其包含2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和1，2，3，4或5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段，且其中所述小鼠包含与包含免疫球蛋白Vκ和Jκ基因段的野生型补体的小鼠约相同的包含滤泡(例如,FO-I和FO-II)B细胞群的外周脾B细胞群。本文所述的遗传修饰的小鼠的脾脏中的例示滤泡B细胞群(例如,FO-I和FO-II)通过IgM，IgD，CD21/35，CD93，B220和/或其组合的表达表征。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3×106～约1.5×107细胞范围内，包括，例如约3.0×106，3.5×106，4.0×106，4.5×106，5.0×106，5.5×106，6.0×106，6.5×106，7.0×106，7.5×106，8.0×106，8.5×106，9.0×106，9.5×106，1.0×107或1.5×107细胞的滤泡1型B细胞群(例如,CD93-,B220+,CD21/35int,IgMlo,IgDhi)；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.57×106细胞的滤泡1型B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约6.31×106细胞的滤泡1型B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约9.42×106细胞的滤泡1型B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.14×107细胞的滤泡1型B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1×106～约2×106细胞范围内，包括，例如，1.0×106，1.25×106，1.5×106，1.75×106或2.0×106细胞的滤泡2型B细胞群(例如,CD93-,B220+,CD21/35int,IgMint,IgDhi)；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.14×106细胞的滤泡2型B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.45×106细胞的滤泡2型B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.80×106细胞的滤泡2型B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.06×106细胞的滤泡2型B细胞群。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠表达源于人Vκ和Jκ基因段的单重排的κ轻链，其中所述小鼠表达包含源于单重排的κ轻链序列的单κ轻链的B细胞群，其中所述遗传修饰的小鼠未致使对体细胞超突变抗性。在一实施方式中，在小鼠的B细胞表达的至少90％的κ轻链呈现至少1～约5个体细胞超突变。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其被修饰为表达源于不多于1个，或不多于2个，重排的κ轻链序列的单κ轻链，其中所述小鼠呈现由野生型小鼠呈现的κ轻链利用或由包含κ轻链基因段的野生型库的相同的株的小鼠呈现的κ轻链利用的约2倍或更高，至少约3倍或更高，或至少约4倍或更高的κ轻链利用。在特定实施方式中，小鼠自不多于1个重排的κ轻链序列表达单κ轻链。在更特定实施方式中，重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一实施方式中，重排的κ轻链序列是Vκ1-39Jκ5序列。在一实施方式中，重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其表达源于不多于1个，或不多于2个，重排的κ轻链序列的单κ轻链，其中所述小鼠呈现由带有完全或基本上完全人κ轻链座位的小鼠呈现的相同的κ轻链利用的约100倍或更高，至少约200倍或更高，至少约300倍或更高，至少约400倍或更高，至少约500倍或更高，至少约600倍或更高，至少约700倍或更高，至少约800倍或更高，至少约900倍或更高，至少约1000倍或更高的κ轻链利用。在特定实施方式中，小鼠带有完全或基本上完全人κ轻链座位缺乏有功能的未重排的小鼠κ轻链序列。在特定实施方式中，小鼠表达单κ轻链自不多于1重排的κ轻链序列。在一实施方式中，小鼠包含1拷贝的重排的κ轻链序列(例如,杂合子)。在一实施方式中，小鼠包含2拷贝的重排的κ轻链序列(例如,纯合子)。在更特定实施方式中，重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一实施方式中，重排的κ轻链序列是Vκ1-39Jκ5序列。在一实施方式中，重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其表达源于不多于1个，或不多于2个，重排的轻链序列的单轻链，其中遗传修饰的小鼠中的所述轻链呈现由带有完全或基本上完全轻链座位的小鼠呈现的相同的重排的轻链的表达的至少10倍～约1,000倍，100倍～约1,000倍，200倍～约1,000倍，300倍～约1,000倍，400倍～约1,000倍，500倍～约1,000倍，600倍～约1,000倍，700倍～约1,000倍，800倍～约1,000倍，或900倍～约1,000倍的表达水平。在一实施方式中，轻链包含人序列。在特定实施方式中，人序列是κ序列。在一实施方式中，人序列是λ序列。在一实施方式中，轻链是完全人轻链。
在一实施方式中，表达水平通过定量转录的轻链序列的mRNA，及将其与带有完全或基本上完全轻链座位的小鼠的转录的轻链序列比较来表征。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其表达源于不多于1个，或不多于2个，重排的κ轻链序列的单κ轻链，其中所述小鼠，在用抗原免疫后，呈现与用相同的抗原免疫的野生型小鼠相当的血清滴度。在特定实施方式中，小鼠自不多于1个重排的κ轻链序列表达单κ轻链。在一实施方式中，血清滴度由总免疫球蛋白表征。在特定实施方式中，血清滴度由IgM特定滴度表征。在特定实施方式中，血清滴度由IgG特定滴度表征。在更特定实施方式中，重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一实施方式中，重排的κ轻链序列是Vκ1-39Jκ5序列。在一实施方式中，重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其表达一群抗原-特异性抗体，其中抗原-特异性抗体群的全部免疫球蛋白轻链包含源于相同的单人VL基因段的人轻链可变(VL)区和免疫球蛋白重链包含源于多个人VH基因段之一的人重链可变(VH)区。
在各种实施方式中，人VH基因段选自VH1-2，VH1-3，VH1-8，VH1-18，VH1-24，VH1-46，VH1-58，VH1-69，VH2-5，VH2-26，VH2-70，VH3-7，VH3-9，VH3-11，VH3-13，VH3-15，VH3-20，VH3-21，VH3-23，VH3-30，VH3-33，VH3-43，VH3-48，VH3-53，VH3-64，VH3-72，VH3-73，VH4-31，VH4-34，VH4-39，VH4-59，VH5-51和VH6-1。
在各种实施方式中，相同的单人VL基因段选自人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段。在各种实施方式中，全部免疫球蛋白轻链包含选自Jκ和Jλ基因段的人轻链J(JL)基因段。在特定实施方式中，人JL基因段选自人Jκ1和Jκ5基因段。在各种实施方式中，小鼠缺乏选自小鼠免疫球蛋白VL基因段，小鼠免疫球蛋白JL基因段，及其组合的序列。在各种实施方式中，人VL区可操作地连接于人，小鼠或大鼠免疫球蛋白轻链恒定(CL)区。在特定实施方式中，人VL区可操作地连接于小鼠Cκ区。在特定实施方式中，人VL区可操作地连接于大鼠Cκ区。
在各种实施方式中，人VL区自内源性免疫球蛋白轻链座位表达。在各种实施方式中，人VH区可操作地连接于人，小鼠或大鼠免疫球蛋白重链恒定(CH)区。在各种实施方式中，(CH)区包含选自下列的人序列：CH1，铰链，CH2，CH3，CH4，和/或其组合。在各种实施方式中，人VH区自内源性免疫球蛋白重链座位表达。
一方面，提供遗传修饰的小鼠，其表达多个与单轻链结合的免疫球蛋白重链。在一实施方式中，重链包含人序列。在各种实施方式中，人序列选自可变序列，CH1，铰链，CH2，CH3，及其组合。在一实施方式中，单轻链包含人序列。在各种实施方式中，人序列选自可变序列，恒定序列，及其组合。在一实施方式中，小鼠包含残缺的内源性免疫球蛋白座位及自转基因或染色体外附加体表达重链和/或轻链。在一实施方式中，小鼠包含在一些或全部内源性小鼠重链基因段(即,V,D,J)和/或一些或全部内源性小鼠重链恒定序列(例如,CH1,铰链,CH2,CH3,或其组合)，和/或一些或全部内源性小鼠轻链序列(例如,V,J,恒定,或其组合)的内源性小鼠座位被1个或更多人免疫球蛋白序列取代。
一方面，提供适合于制造具有相同的轻链的抗体的小鼠，其中小鼠中制造的全部或基本上全部抗体随相同的轻链表达。在一实施方式中，轻链自内源性轻链座位表达。
一方面，提供制造用于人抗体的轻链的方法，包括自本文所述的小鼠获得轻链序列和重链序列，及在制造人抗体中采用轻链序列和重链序列。在一实施方式中，人抗体是双特异性抗体。
一方面，提供用本文所述的加工的轻链鉴定能结合目标抗原的人重链可变结构域的方法，其中所述方法包括提供源于能结合抗原的第1抗体的重链可变结构域，用种系轻链序列修复重链可变结构域，及转染细胞，从而各表达而形成第2抗体，使第2抗体暴露于抗原，及测量第2抗体与抗原的结合。
在一实施方式中，第1抗体的轻链包含人Vκ1-39序列。在一实施方式中，第1抗体的轻链包含人Vκ3-20序列。在一实施方式中，种系轻链序列包含人Vκ1-39或Vκ3-20序列。在各种实施方式中，第2抗体与抗原的结合通过第1抗体与抗原结合的比较测定。
本文所述的任何实施方式和方面可结合另一个使用，除非另外指示或自情景明显。其他实施方式会由本领域技术人员通过以下描述而明显。
【附图说明】
图1例证用人Vκ1-39Jκ5基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因段的靶向策略。
图2例证用人Vκ3-20Jκ1基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因段的靶向策略。
图3例证用人VpreB/Jλ5基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因段的靶向策略。
图4显示来自野生型小鼠(WT)，对于加工的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区纯合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HO)和对于加工的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区纯合的小鼠(Vκ3-20Jκ1HO)的外周血的CD19+B细胞(y-轴)的百分率。
图5A显示在使用特异于对于内源性Vκ和Jκ基因段被人Vκ和Jκ基因段取代纯合的小鼠(Hκ)，野生型小鼠(WT)，及对于加工的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区杂合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HET)中加工的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区(Vκ1-39Jκ5连接探针)和人Vκ1-39基因段(Vκ1-39探针)的连接的探针的定量PCR测定中源于Vκ1-39的轻链的相对mRNA表达(y-轴)。信号标准化到小鼠Cκ的表达。N.D.：未检测。
图5B显示在使用特异于对于内源性Vκ和Jκ基因段被人Vκ和Jκ基因段取代纯合的小鼠(Hκ)，野生型小鼠(WT)，及对于加工的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区纯合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HO)中的加工的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区(Vκ1-39Jκ5连接探针)和人Vκ1-39基因段(Vκ1-39探针)的连接的探针的定量PCR测定中源于Vκ1-39的轻链的相对mRNA表达(y-轴)。信号标准化到小鼠Cκ的表达。
图5C显示使用特异于对于内源性Vκ和Jκ基因段被人Vκ和Jκ基因段取代纯合的小鼠(Hκ)，野生型小鼠(WT)，及对于加工的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区杂合(HET)和纯合(HO)的小鼠中的加工的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区(Vκ3-20Jκ1连接探针)和人Vκ3-20基因段(Vκ3-20探针)的连接的探针的定量PCR测定中源于Vκ3-20的轻链的相对mRNA表达(y-轴)。信号标准化到小鼠Cκ的表达。
图6A显示用β-半乳糖苷酶免疫的野生型(WT；N＝2)和对于加工的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区纯合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HO；N＝2)中的IgM(左)和IgG(右)滴度。
图6B显示用β-半乳糖苷酶免疫的野生型(WT；N＝5)和对于加工的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区纯合的小鼠(Vκ3-20Jκ1HO；N＝5)中的总免疫球蛋白(IgM,IgG,IgA)滴度。
图7A显示从来自各亲本单特异性抗体的重链可变区构建的单特异性抗体(亲本-1和亲本-2)和双特异性抗体(双特异性)的示意图。指示了双特异性抗体中的常见轻链可变区(黑色)。
图7B显示2种亲本单克隆抗体(亲本-1和亲本-2)对目标抗原的结合特征，以及由来自各单特异性亲本抗体的重链可变区与常见轻链配对构建的双特异性抗体的结合特征的示意图。指示双特异性抗体独立地(左下部)或同时与目标抗原的2个不同表位结合的能力(右下部)。
图8显示300nM双特异性(darkened条)和单特异性(striped及灰条)抗体与BIACORETM单元(RU)中捕获的单体抗原E表面结合的条形图。指示单克隆亲本-1抗体(P1Ab)，单克隆亲本-2(P2Ab)和双特异性抗体(BsAb)。
图9显示2种遗传修饰的内源性免疫球蛋白轻链(例如,κ轻链)座位。上部座位(DLC-5J)含有加工的人DNA片段(条纹线)，其含有2个人Vκ基因段和5个人Jκ基因段。下部座位(DLC-1J)含有加工的人DNA片段(条纹线)，其含有2个人Vκ基因段及1个人Jκ基因段。各座位能重排而形成可操作地连接于内源性轻链恒定区的人Vκ区(例如,Cκ)。显示免疫球蛋白启动子(箭标以上座位)，前导序列外显子(实心箭标)，及2个人Vκ基因段(空心箭标)在上游(5’)侧接含有Frt重组位点的新霉素盒。由与各基因段并置的空卵圆指示用各人基因段(Vκ和Jκ)加工的重组信号序列。
图10A，在上图中，显示对于来自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的B和T细胞(分别CD19+和CD3+)染色的骨髓的代表性的等值线图。下图显示就来自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的CD19+选通及对于ckit+和CD43+染色的骨髓的代表性的等值线图。在下图的等值线图上注意到原及前B细胞。
图10B显示自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的股骨收获的骨髓中原(CD19+CD43+ckit+)和前(CD19+CD43-ckit-)B细胞的数。
图11A显示对于就来自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的单态选通的骨髓的代表性的等值线图。在各等值线图上注意到未成熟的，成熟和原/前B细胞。
图11B显示自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的股骨分离的骨髓中B(CD19+)，未成熟的B(B220intIgM+)和成熟B(B220hiIgM+)细胞的总数。
图12A显示对于就来自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的单态选通的骨髓的代表性的等值线图。在各等值线图上注意到未成熟的，成熟和原/前B细胞。
图12B显示就对于自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的股骨分离的Igλ和Igκ表达染色的未成熟的(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞选通的骨髓的代表性的等值线图。
图13A，在上图中，显示就来自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的单态选通及对于B和T细胞(分别CD19+和CD3+)染色的脾细胞的代表性的等值线图。下图显示就来自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的CD19+选通及对于免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的脾细胞的代表性的等值线图。在各等值线图上注意到成熟(对于WT是54，对于DLC-5J是56.9)和移行(对于WT是23.6，对于DLC-5J是25.6)B细胞。
图13B显示从野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)收获的脾脏中CD19+B细胞，移行B细胞(CD19+IgMhiIgDlo)和成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)的总数。
图14A显示就来自野生型小鼠(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的CD19+选通的Igλ+和Igκ+脾细胞的代表性的等值线图。
图14B显示自野生型(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)收获的脾脏中B细胞(CD19+)，Igκ+B细胞(CD19+Igκ+)和Igλ+B细胞(CD19+Igλ+)的总数。
图15A显示对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠中的外周B细胞发育。第1(最左)等值线图显示就指示未成熟的(39.6)和成熟(57.8)B细胞的CD19+选通的CD93+和B220+脾细胞。第2(中上)等值线图显示指示T1(33.7；IgD-IgM+CD21loCD23-)，T2(21.2；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)和T3(29.1)B细胞群的未成熟的B细胞中的IgM+和CD23+表达。第3(中下)等值线图显示指示引起边缘区域B细胞的小群(14.8)和引起滤泡(FO)B细胞的第2群(70.5)的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。第4(右上部)等值线图显示指示边缘区域(90.5；MZ)和边缘区域前体(7.3；IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B细胞群的成熟B细胞中的B220+和CD23+表达。第5(右下部)等值线图显示指示FO-I(79.0；IgDhiIgMloCD21midCD23+)和FO-II(15.1；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B细胞群的成熟B细胞中的IgD+和IgM+表达。显示各选通的区内的细胞的百分率。
图15B显示野生型小鼠中的外周B细胞发育。第1(最左)等值线图显示就指示未成熟的(31.1)和成熟(64.4)B细胞的CD19+选通的CD93+和B220+脾细胞。第2(中上)等值线图显示指示T1(28.5；IgD-IgM+CD21loCD23-)，T2(28.7；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)和T3(30.7)B细胞群的未成熟的B细胞中的IgM+和CD23+表达。第3(中下)等值线图显示指示引起边缘区域B细胞的小群(7.69)和引起滤泡(FO)B细胞的第2群(78.5)的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。第4(右上部)等值线图显示指示边缘区域(79.9；MZ)和边缘区域前体(19.4；IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B细胞群的成熟B细胞中的B220+和CD23+表达。第5(右下部)等值线图显示指示FO-I(83.6；IgDhiIgMloCD21midCD23+)和FO-II(13.1；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B细胞群的成熟B细胞中的IgD+和IgM+表达。显示各选通的区内的细胞的百分率。
图16显示野生型(WT)和对于2个人Vκ和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)的收获的脾脏中移行，边缘区域和滤泡B细胞群总数。
图17显示使用特异于对于内源性Vκ和Jκ基因段被人Vκ和Jκ基因段取代纯合的小鼠(Hκ)，野生型小鼠(WT)，对于2个人Vκ基因段和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)和对于2个人Vκ基因段及1个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-1J)中的Vκ3-20或Vκ1-39基因段的探针的定量PCR测定中源于Vκ3-20的和源于Vκ1-39的轻链的骨髓(y-轴)的相对mRNA表达。信号标准化到小鼠Cκ的表达。ND：未检测。
图18显示使用特异于对于内源性Vκ和Jκ基因段被人Vκ和Jκ基因段取代纯合的小鼠(Hκ)，野生型小鼠(WT)，对于2个人Vκ基因段和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)和对于2个人Vκ基因段及1个人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-1J)中的Vκ3-20或Vκ1-39基因段的探针的定量PCR测定中源于Vκ3-20的和源于Vκ1-39的轻链的全脾脏(y-轴)中的相对mRNA表达。信号标准化到小鼠Cκ的表达。ND：未检测。
图19显示在重排前(上部)及在重排后(下部)小鼠中免疫球蛋白κ轻链等位基因的V和J基因段的重组的一般例证和轻链座位的结构。如显示的该重排仅是几种可能的重排事件之一。
【发明详述】
本发明不限于描述的特定方法，及实验条件，像这样方法和条件可改变。需知，本文所用的术语是仅旨在描述特定实施方式，及不旨在限制，由于本发明的范围由权利要求定义。
除非另外定义，本文所用的全部术语和短语包括本领域认可的术语和短语的含义，除非明显相反指示或自使用术语或短语的情景显而易见。尽管类似或相当于本文所述的那些的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，现在描述特定方法和材料。在此提及的全部出版物通过引用以它们的整体合并。
术语"抗体"，如本文所用，包括包含4个多肽链，由二硫键互连接的2个重(H)链和2个轻(L)链的免疫球蛋白分子。各重链包含重链可变(VH)区和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含3个结构域，CH1，CH2和CH3。各轻链包含轻链可变(VL)区和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可还亚分为称为互补决定区(CDR)的高可变性区，其散在于称为框架区(FR)的更保守区。各VH和VL包含3个CDR和4个FR，以下列顺序自氨基-端向羧基-端排列：FR1、CDR1，FR2、CDR2，FR3、CDR3，FR4(重链CDR可缩写为HCDR1，HCDR2和HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1，LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和性”抗体指称对于其靶向表位具有约10-9M或更低(例如,约1×10-9M,1×10-10M,1×10-11M,或约1×10-12M)的KD的抗体。在一实施方式中，KD由表面等离子体共振，例如，BIACORETM测量；在另一实施方式中，KD由ELISA测量。
短语“双特异性抗体”指称能选择性地结合2个或更多表位的抗体。双特异性抗体包括2个不同单克隆抗体的片段(图7A)和通常包含2个不同的源于2个不同单克隆抗体的重链，各重链特异性结合在2个不同分子上(例如,在2个不同免疫原上的不同表位；见图7B,左下部)或在相同的分子上(例如,在相同的免疫原上的不同表位；见图7B,右下部)的不同表位。如果双特异性抗体能选择性地结合2个不同表位(第1表位和第2表位)，第1重链对第1表位的亲和性通常会是至少1～2或3或4个或更多数量级少于第1重链对第2表位的亲和性，反之亦然。由双特异性抗体特异性地结合的表位可在相同或不同的靶上(例如,在相同的或不同蛋白；见图7B)。例示双特异性抗体包括具有特异于肿瘤抗原的第1重链和特异于细胞毒性标志物，例如，Fc受体(例如,FcγRI,FcγRII,FcγRIII,等)或T细胞标志物(例如,CD3,CD28,等)的第2重链的抗体。而且，第2重链可变区可被具有不同期望的特异性的重链可变区取代。例如，具有特异于肿瘤抗原的第1重链和特异于毒素的第2重链的双特异性抗体可配对，由此将毒素(例如,肥皂草毒蛋白,长春花生物碱,等)递送至肿瘤细胞。其他例示双特异性抗体包括具有特异于活化受体(例如,B细胞受体,FcγRI,FcγRIIA,FcγRIIIA,FcαRI,T细胞受体,等)的第1重链和特异于抑制性受体(例如,FcγRIIB,CD5,CD22,CD72,CD300a,等)的第2重链的那些。该双特异性抗体可构建用于与细胞活化关联的病情(例如过敏和哮喘)的治疗剂。双特异性抗体可，例如，通过组合识别相同或不同的免疫原的不同表位的重链来制造(图7B)。例如，编码识别相同或不同的免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可与编码相同的或不同重链恒定区的核酸序列融合，及该序列可在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型双特异性抗体具有各具有3个重链CDR的2个重链，之后是(N-端至C-端)CH1结构域，铰链，CH2结构域，及CH3结构域，及免疫球蛋白轻链，其不赋予表位-结合特异性，但可与各重链结合，或可与各重链结合及可结合1个或更多由重链表位-结合区结合的表位，或可与各重链结合及致使1个或2个重链与1个或2个表位结合。
术语“细胞”包括适宜于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物细胞(单-细胞或多-细胞)，细菌细胞(例如,大肠埃希氏菌(E.coli)株，芽孢杆菌属(Bacillus spp.)物种,链霉菌属(Streptomyces spp.)物种,等)，分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞，真菌细胞，酵母细胞(例如,啤酒糖酵母(S.cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(S.pombe)，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)，甲醇毕赤酵母(P.methanolica)，等)，植物细胞，昆虫细胞(例如,SF-9,SF-21,杆状病毒-感染的昆虫细胞,粉斑夜蛾(Trichoplusiani)，等)，非-人动物细胞，人细胞或细胞融合诸如，例如，杂交瘤或细胞杂交瘤。在一些实施方式中，细胞是人，猴，猿，仓鼠，大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，细胞是真核生物细胞及选自以下细胞：CHO(例如,CHO K1,DXB-11CHO,Veggie-CHO)，COS(例如,COS-7)，视网膜细胞，Vero，CV1，肾(例如,HEK293,293EBNA,MSR 293,MDCK,HaK,BHK)，HeLa，HepG2，WI38，MRC5，Colo205，HB 8065，HL-60，(例如,BHK21)，Jurkat，Daudi，A431(表皮)，CV-1，U937，3T3，L细胞，C127细胞，SP2/0，NS-0，MMT 060562，Sertoli细胞，BRL 3A细胞，HT1080细胞，骨髓瘤细胞，肿瘤细胞和细胞系源于上述的细胞。在一些实施方式中，细胞包含1个或更多病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如,PER.C6TM细胞)。
短语“互补决定区”，或术语“CDR”，包括由正常(即,在野生型动物中)在免疫球蛋白分子(例如,抗体或T细胞受体)的轻或重链可变区中的2个框架区之间呈现的生物的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列。CDR可由，例如，种系序列或重排的或未重排的序列，及，例如，由幼稚的或成熟B细胞或T细胞编码。CDR可体细胞地突变(例如,自在动物的种系中编码的序列改变)，人源化和/或用氨基酸取代，添加或缺失修饰。在一些环境(例如,对于CDR3)中，CDR可由2个或更多序列(例如,种系序列)编码，所述序列不是连续的(例如,在未重排的核酸序列中)，但是在B细胞核酸序列中连续的，例如，作为剪接或连接序列的结果(例如,V-D-J重组而形成重链CDR3)。
术语"保守性”，当用于描述保守性氨基酸取代，包括氨基酸残基被具有具有类似化学性质(例如,电荷或疏水性)的侧链R基的另一氨基酸残基取代。一般而言，保守性氨基酸取代基本上不会改变蛋白的目标官能性质，例如，可变区以期望的亲和性特异性结合靶向表位的能力。具有有类似化学性质的侧链的氨基酸组的例包括脂肪族侧链诸如甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链诸如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳族侧链诸如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；碱性侧链诸如赖氨酸，精氨酸和组氨酸；酸性侧链诸如天冬氨酸和谷氨酸；及，含有硫的侧链诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸取代组包括，例如，缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸，苯丙氨酸/酪氨酸，赖氨酸/精氨酸，丙氨酸/缬氨酸，谷氨酸酸/天冬氨酸酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守性氨基酸取代可为蛋白中的任何天然残基被丙氨酸取代，如用于，例如，丙氨酸扫描诱变。在一些实施方式中，制造在Gonnet等人(1992)Exhaustive Matching of theEntire Protein Sequence Database,Science 256:1443-45中公开的PAM250对数-似然性矩阵中具有阳性值的保守性取代，通过引用在此合并。在一些实施方式中，取代是中度保守性取代，其中所述取代在PAM250对数-似然性矩阵中具有非负值。
在一些实施方式中，免疫球蛋白轻链或重链中的残基位置不同在于1个或更多保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，免疫球蛋白轻链或其功能片段(例如,允许自,例如,B细胞表达和分泌的片段)中的残基位置不同于其氨基酸序列列在本文，但不同在于1个或更多保守性氨基酸取代的轻链。
短语“表位-结合蛋白”包括具有至少1个CDR及能选择性地识别表位，例如，能以约1μM或更低(例如,约1×10-6M,1×10-7M,1×10-9M,1×10-9M,1×10-10M,1×10-11M,或约1×10-12M的KD)的KD结合表位的蛋白。治疗性表位-结合蛋白(例如,治疗性抗体)常需要nM或pM范围内的KD。
短语“功能片段”包括可被表达，分泌的表位-结合蛋白的片段及以μM，nM或pM范围的KD特异性结合表位。特异性识别包括具有至少在μM范围，nM范围，或pM范围的KD。
术语“种系”包括参照非-体细胞地突变的细胞，例如，非-体细胞地突变的B细胞或前-B细胞或造血细胞中的免疫球蛋白核酸序列。
短语“重链”，或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物的免疫球蛋白重链恒定区序列。重链可变结构域包括3个重链CDR和4个FR区，除非另外特别说明。重链片段包括CDR、CDR和FR，及其组合。典型重链，在可变结构域之后(自N-端至C-端)具有，CH1结构域，铰链，CH2结构域，及CH3结构域。重链的功能片段包括能特异性识别表位(例如,以μM,nM或pM范围的KD识别表位)，能自细胞表达及分泌，及包含至少1个CDR的片段。
术语“同一性”，当关联序列使用时，包括由可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的本领域知道的许多不同算法测定的同一性。在本文所述的一些实施方式中，同一性通过使用ClustalW v.1.83(慢)比对，采用10.0的打开空位罚分，0.1的延伸空位罚分，及使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM10.0.2,MacVector Inc.,2008)测定。关于序列同一性比较的序列长度会依赖于特定序列，但在轻链恒定区的情况中，长度应含有对于折叠为能自身-结合而形成规范轻链恒定区，例如，能形成2个包含β链的β折叠片和能与人或小鼠的至少1个CH1结构域相互作用的轻链恒定区足够的长度的序列。在CH1结构域的情况中，序列长度应含有对于折叠为能形成2个包含β链的β折叠片和能与小鼠或人的至少1轻链恒定区相互作用的CH1结构域足够的长度的序列。
短语“免疫球蛋白分子”包括2个免疫球蛋白重链和2个免疫球蛋白轻链。重链可为相同或不同，及轻链可为相同或不同。
短语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链序列，及除非另外特别说明，包括人κ和λ轻链和VpreB，以及替代品轻链。轻链可变(VL)结构域一般包括3个轻链CDR和4个框架(FR)区，除非另外特别说明。一般而言，全长轻链自氨基末端至羧基末端包括，包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的VL结构域，及轻链恒定区。轻链包括，例如，不选择性地结合由它们出现的表位-结合蛋白选择性地结合的第1或第2表位的那些。轻链也包括结合及识别，或辅助重链结合及识别，由它们出现的表位-结合蛋白选择性地结合的1个或更多表位的那些。常见轻链是源于重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列，及包括体细胞地突变的(例如,亲和性突变的)版本的那些。
短语“μM范围”旨在表示1～999μM；短语“nM范围”旨在表示1～999nM；短语“pM范围”旨在表示1～999pM。
短语“体细胞地突变的”包括参照来自经历了类-切换的B细胞的核酸序列，其中类-切换的B细胞中的免疫球蛋白可变区(例如,重链可变结构域或包括重链CDR或FR序列)的所述核酸序列不同于在类-切换之前B细胞中的核酸序列，诸如，例如，未经历类-切换的B细胞和经历了类-切换的B细胞之间的CDR或框架核酸序列差异。“体细胞地突变的”包括参照不同于不是亲和性-成熟的B细胞的对应免疫球蛋白可变区序列(即,种系细胞的基因组中的序列)的来自亲和性-成熟的B细胞的核酸序列。短语“体细胞地突变的”也包括参照在B细胞暴露于目标表位之后来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中所述核酸序列不同于在B细胞暴露于目标表位之前的对应核酸序列。短语“体细胞地突变的”指称来自已在动物，例如，具有人免疫球蛋白可变区核酸序列的小鼠中，响应免疫原挑战产生的抗体的序列，及其来自在该动物中固有地可操作的选择过程。
术语“未重排的”，参照核酸序列，包括存在于动物细胞种系中的核酸序列。
短语“可变结构域”包括在序列中自N-端至C-端(除非另外指示的)包含以下氨基酸区的免疫球蛋白轻或重链的氨基酸序列(根据期望修饰)：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
【通用轻链】
用于制造有用的多特异性表位-结合蛋白，例如，双特异性抗体的现有努力已受常共享常见范例的各种问题阻碍：序列的体外选择或操作以合理地加工，或通过试错加工，对于配对异源二聚体双特异性人免疫球蛋白的适合的形式。不幸的是，最如果并非所有体外加工方法为个体分子大大地提供，如果完全适合的特别固定。另一方面，尚未实现采用复合生物选择能导致人治疗剂的适当的配对的体内方法。
含有随机插入小鼠基因组的人免疫球蛋白座位，可变和恒定区的小鼠为本领域所知。该小鼠的初始株含有有限数量的人免疫球蛋白基因段。特别是，一些含有人免疫球蛋白轻链基因段的株含有1，3或4个人免疫球蛋白VL基因段和5个人免疫球蛋白JL基因段(Tayloret al.1992,Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295；Fishwild et al.1996,NatureBiotechnology 14:845-851；Lonberg et al.1994,Nature 368:856-859；Green etal.1994,Nature Genetics 7:13-21；Green and Jakobovits 1998,J.Exp.Med.188(3):483-495；Green 1999,J.Immunol.Methods 231:11-23)。这些含有仅少数人免疫球蛋白VL基因段作为随机插入小鼠基因组的完全人转基因的部分的小鼠展示缓和的B细胞数，损伤的B细胞发育和其他免疫缺陷。如由B细胞上人Cκ的表面表达检测的人免疫球蛋白VL基因的表达相比野生型少于内源性κ轻链。意外地，本发明提供小鼠，当小鼠在内源性免疫球蛋白κ轻链座位加工而含有1个或2个人免疫球蛋白Vκ基因段时，其B细胞数和发育几乎是野生型(例如,实施例2和14,表3,25和26,及图4,10A-18)。而且，在一些实施方式中，由本发明提供的小鼠，能响应抗原产生几种含有人VH和VL结构域的高-亲和性反向嵌合抗体，其中所述VL结构域各含有2个可能的人VL基因段之一及5个可能的人JL基因段之一(例如,见实施例5～10,12和14)。由此，与用人免疫球蛋白轻链小座位(即,有限数量的人免疫球蛋白基因段)加工的小鼠初步株相反，目前提供的含有有限数量的人免疫球蛋白VL基因段(1个或2个)及，在一些实施方式中，2个或更多(例如,2,3,4或5)个人免疫球蛋白JL基因段的加工的小鼠意外地呈现正常B细胞数，正常免疫球蛋白轻链表达，及正常B细胞发育。而且，作为限制的免疫球蛋白轻链库的结果，该提供的小鼠也显示无减少的或损伤的能力而产生针对多种抗原的稳健的免疫应答。因此，提供小鼠，其包含人源化的VL座位，其包含不多于2个未重排的人免疫球蛋白VL基因段和2个或更多(例如,2,3,4或5)个人免疫球蛋白JL基因段(或不多于2个重排的人VLJL段)及其在数量上呈现野生型B细胞群，及呈现野生型B细胞发育。
一般而言，天然小鼠序列常不是人治疗剂序列的良好源。原因至少是，产生与常见人轻链配对的小鼠重链免疫球蛋白可变区具有限制的实践实用性。会在试错过程中期望更多体外加工努力，以试着人源化小鼠重链可变序列的同时希望保留表位特异性和亲和性而维持与常见人轻链偶联的能力，具有不确定的结果。在该过程结束时，最终产物可维持一些特异性和亲和性，及与常见轻链结合，但人中的最终免疫原性会可能保持深刻的风险。
因此，对于制造人治疗剂适合的小鼠会在内源性小鼠重链可变区基因段处包括人重链可变区基因段的适宜地大的库。人重链可变区基因段应能与内源性小鼠重链恒定区重排及重组而形成反向嵌合重链(即,包含人可变结构域和小鼠恒定区的重链)。重链应能类切换及体细胞超突变从而重链可变结构域的适宜地大的库是对于小鼠可利用的，以选择可与人轻链可变区的限制的库结合的重链。
选择对于多个重链常见的轻链的小鼠具有实践实用性。在各种实施方式中，在仅可表达常见轻链的小鼠中表达的抗体会具有可与同一或基本上同一轻链结合及随同一或基本上同一轻链表达的重链。这在制造双特异性抗体中是特别有用的。例如，可将该小鼠用第1免疫原免疫而产生表达特异性结合第1表位的抗体的B细胞。可将该小鼠(或遗传相同的小鼠)用第2免疫原免疫而产生表达特异性结合第2表位的抗体的B细胞。可从B细胞克隆可变的重链区，及在细胞中随相同的重链恒定区，及相同的可变的轻链区(例如,常见轻链)表达而制造双特异性抗体，其中已由小鼠选择所述双特异性抗体的可变的重链组分，以与可变的轻链(或常见轻链)组分结合及随可变的轻链(或常见轻链)组分表达。
发明人加工了产生会适宜地与重链的多样的家族配对的免疫球蛋白轻链的小鼠，包括重链，其可变区自种系序列，例如，亲和性成熟的或体细胞地突变的可变区离开。在各种实施方式中，将小鼠作成使人轻链可变结构域与包含体细胞突变的人重链可变结构域配对，由此致使适合用作人治疗剂的高亲和性结合蛋白可行的途径。
遗传加工的小鼠，通过生物之内的抗体选择的长和复杂过程，在使多样集的人重链可变结构域与有限数量的人轻链选项配对中作出生物学适当的选择。为了实现此，将小鼠加工为呈现结合广泛多样性的人重链可变结构域选项的有限数量的人轻链可变结构域选项。用免疫原攻击之后，小鼠最大化其库中溶液数，以发展针对免疫原的抗体，大大地或单独受其库中数或轻链选项限制。在各种实施方式中，此包括允许小鼠达到会虽然如此与相对大类的人重链可变结构域相容的轻链可变结构域的适合的和相容的体细胞突变，包括尤其是体细胞地突变的人重链可变结构域。
为了达到轻链选项的限制的库，将小鼠加工为致使其能力无功能或基本上无功能而制造，或重排，天然小鼠轻链可变结构域。此可，例如，通过删除小鼠的轻链可变区基因段达到。然后可由选择的外源适合的人轻链可变区基因段修饰内源性小鼠座位，以使得外源人可变区基因段可与内源性小鼠轻链恒定区基因组合及形成重排的反向嵌合轻链基因(人可变,小鼠恒定)的方式可操作地连接于内源性小鼠轻链恒定区。在各种实施方式中，轻链可变区能被体细胞地突变。在各种实施方式中，为最大化轻链可变区获取体细胞突变的能力，使适当的增强子保留在小鼠中。例如，在修饰小鼠κ轻链座位而用人κ轻链基因段取代内源性小鼠κ轻链基因段中，小鼠κ内含子增强子和小鼠κ3’增强子被功能性地维持，或未被破坏。
提供遗传加工的小鼠，其表达与多样的反向嵌合(人可变,小鼠恒定)重链结合的反向嵌合(人可变,小鼠恒定)轻链的限制的库。在各种实施方式中，删除内源性小鼠κ轻链基因段及用单(或2)重排的人轻链区取代，可操作地连接于内源性小鼠Cκ基因。在用于最大化重排的人轻链区的体细胞超突变的实施方式中，维持小鼠κ内含子增强子和小鼠κ3’增强子。在各种实施方式中，小鼠也包含无功能性λ轻链座位，或其缺失或致使座位不能制造λ轻链的缺失。
提供遗传加工的小鼠，其在各种实施方式中，包含缺少内源性小鼠轻链VL和JL基因段及包含重排的人轻链可变区的轻链可变区座位，在一实施方式中，重排的人VL/JL序列，可操作地连接于小鼠恒定区，其中所述座位能经历体细胞超突变，且其中所述座位表达包含与小鼠恒定区连接的人VL/JL序列的轻链。由此，在各种实施方式中，座位包含与正常，或野生型，体细胞超突变水平相关的小鼠κ3’增强子。
在各种实施方式中，当用目标抗原免疫时，遗传加工的小鼠产生呈现随1个或2个重排的轻链表达及发挥功能的人免疫球蛋白重链可变区的多样性的重排的B细胞，包括实施方式，其中1个或2个轻链包含人轻链可变区，其包含，例如，1～5个体细胞突变。在各种实施方式中，如此表达的人轻链能与任何在小鼠中表达的人免疫球蛋白重链可变区结合及随在小鼠中表达的人免疫球蛋白重链可变区表达。
除了包含有限的免疫球蛋白轻链库(例如,单人VL基因段或不多于2个人VL基因段及,1个人JL基因段或,任选地,2个或更多人JL基因段)的本文所述的遗传加工的小鼠之外，本文也提供的是其他包含单人VL基因段或不多于2个人VL基因段的遗传修饰的非-人动物。在一些实施方式中，该非-人动物包含由重排的人VLJL序列组成的单重排的人VL区。在一些实施方式中，该非-人动物包含不多于2个人VL基因段和2个或更多(例如，2，3，4或5)个人JL基因段。在各种实施方式中，人基因段可操作地连接于非-人轻链恒定区，例如，小鼠大鼠轻链恒定区。
该非-人动物可选自：小鼠，大鼠，兔，猪，牛类(例如,牛,公牛,水牛)，鹿，绵羊，山羊，鸡，猫，狗，雪貂，灵长类动物(例如,狨猴,恒河猴)。对于适合的可遗传修饰的ES细胞不是容易可利用的非-人动物，采用其他方法而制造包含本文所述的遗传修饰的非-人动物。该方法包括，例如，修饰非-ES细胞基因组(例如,成纤维细胞或诱导的多能细胞)及采用核转移将修饰的基因组转移至适合的细胞，例如，卵母细胞，及在适合的条件下在非-人动物中孕育修饰的细胞(例如,修饰的卵母细胞)而形成胚胎。
在一些实施方式中，本发明的非-人动物是哺乳动物。在一些实施方式中，本发明的非-人动物是小哺乳动物，例如，跳鼠超科(Dipodoidea)或鼠超科(Muroidea)的小哺乳动物。在一些实施方式中，本发明的遗传修饰的动物是啮齿动物。在一些实施方式中，本发明的啮齿动物选自小鼠，大鼠，及仓鼠。在一些实施方式中，本发明的啮齿动物选自鼠超科(Muroidea)。在一些实施方式中，本发明的遗传修饰的动物来自选自下列的科：暮鼠科(Calomyscidae)(例如,小鼠-样仓鼠)，仓鼠科(Cricetidae)(例如,仓鼠,新大陆大鼠和小鼠,田鼠)，鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠,沙鼠,棘鼠,鬃鼠)，马岛鼠科(Nesomyidae)(登鼠,岩鼠,白尾鼠,马拉加西大鼠和小鼠)，刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如,棘榛睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如,鼹鼠,竹鼠,及鼢鼠)。在一些特定实施方式中，本发明的遗传修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科(Muridae))，沙鼠，棘鼠，及鬃鼠。在一些特定实施方式中，本发明的遗传修饰的小鼠来自鼠科(Muridae)的成员。在一些实施方式中，本发明的非-人动物是啮齿动物。在一些特定实施方式中，本发明的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方式中，本发明的非-人动物是小鼠。
在一些实施方式中，本发明的非-人动物是啮齿动物，其为选自C57BL/A，C57BL/An，C57BL/GrFa，C57BL/KaLwN，C57BL/6，C57BL/6J，C57BL/6ByJ，C57BL/6NJ，C57BL/10，C57BL/10ScSn，C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL株小鼠。在一些特定实施方式中，本发明的小鼠是129株，其选自下列株：129P1，129P2，129P3,129×1，129S1(例如,129S1/SV,129S1/SvIm)，129S2，129S4，129S5，129S9/SvEvH，129S6(129/SvEvTac)，129S7，129S8，129T1，129T2(见,例如,Festing等人,1999,Mammalian Genome 10:836；Auerbach等人,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032)。在一些特定实施方式中，本发明的遗传修饰的小鼠是上述的129株和上述的C57BL/6株的杂种。在一些特定实施方式中，本发明的小鼠是上述的129株的杂种，或上述的BL/6株的杂种。在一些特定实施方式中，本文所述的129株杂种是129S6(129/SvEvTac)株。在一些实施方式中，本发明的小鼠是BALB株，例如，BALB/c株。在一些实施方式中，本发明的小鼠是BALB株和另一上述的株的杂种。
在一些实施方式中，本发明的非-人动物是大鼠。在一些特定实施方式中，本发明的大鼠选自威斯塔大鼠，LEA株，Sprague Dawley株，Fischer株，F344，F6和Dark剌鼠。在一些特定实施方式中，本文所述的大鼠株是选自下列的2个或更多株的杂种：威斯塔，LEA，Sprague Dawley，Fischer，F344，F6和Dark剌鼠。
【结合多于一个表位的表位-结合蛋白】
本文所述的组合物和方法可用于制造以高亲和性结合多于1个表位的结合蛋白，例如，双特异性抗体。本发明的优势包括选择适宜地高结合(例如,亲和性成熟的)重链免疫球蛋白链(各会与单轻链结合)的能力。
已报道几种自重组细胞培养物制造双特异性抗体片段的技术。但是，双特异性结合蛋白的合成和表达具有问题，部分由于与鉴定可与2个不同重链结合及随2个不同重链表达的适合的轻链关联的问题，及部分由于分离问题。在各种实施方式中，本文所述的组合物和方法通过增加组分的稳定性/相互作用而提供不需要特定修饰而维持传统免疫球蛋白结构的全长双特异性抗体的优势(图7A)。在各种实施方式中，该修饰被证明麻烦，及作为双特异性抗体技术的开发和它们在人疾病的治疗中的潜在用途的障碍。由此，在各种实施方式中，通过提供具有添加的多特异性性质的天然的免疫球蛋白结构(即,全长)，全长双特异性抗体维持之前的双特异性片段缺乏的它们的关键效应子功能，及还提供展示更长半衰期的重要药代动力学参数的治疗剂。
本文所述的方法和组合物允许遗传修饰的小鼠选择，通过另外天然的过程，适合的轻链，其可与多于1个重链结合及随多于1个重链表达，所述重链包括体细胞地突变(例如,亲和性成熟)的重链。可鉴定来自表达具有反向嵌合重链(即,人可变和小鼠恒定)的亲和性成熟的抗体的本文所述的免疫的小鼠的适合的B细胞的人VL和VH序列，及在具有适合的人恒定区基因序列(例如,人IgG1)的表达载体中框内克隆。可制备2种该构建体，其中各构建体编码结合不同表位的人重链可变结构域。在种系序列中或来自其中所述序列已被体细胞地突变的B细胞的人VL(例如,人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1)之一可与适合的人恒定区基因(例如,人κ恒定基因)框内融合。可将这3种完全人重和轻构建体放入适合的表达用细胞。细胞会表达2种主要种类：具有同一轻链的同源二聚体重链，及具有同一轻链的异源二聚体重链。为了允许这些主要种类的轻易的分离，将重链之一修饰为忽略蛋白A-结合决定子，导致来自异源二聚体结合蛋白的同源二聚体结合蛋白的差异亲和性。解决此问题的组合物和方法描述于2010年6月25日提交的作为US 2010/0331527A1公开的名为“Readily IsolatedBispecific antibodies with Native Immunoglobulin Format”的USSN 12/832,838，将其通过引用在此合并。
一方面，提供本文所述的表位-结合蛋白，其中人VL和VH序列源于本文所述的已被用包含目标表位的抗原免疫的小鼠。
在一实施方式中，提供表位-结合蛋白，其包含第1和第2多肽，第1多肽自N-端至C-端包含选择性地结合第1表位的第1表位-结合区，之后是包含选自IgG1，IgG2，IgG4，及其组合的人IgG的第1CH3区的恒定区；及，第2多肽自N-端至C-端包含选择性地结合第2表位的第2表位-结合区，之后是包含选自IgG1，IgG2，IgG4，及其组合的人IgG的第2CH3区的恒定区，其中所述第2CH3区包含减少或消除第2CH3结构域与蛋白A的结合的修饰。
在一实施方式中，第2CH3区包含H95R修饰(由IMGT外显子编号；H435R由EU编号)。在另一实施方式中，第2CH3区还包含Y96F修饰(IMGT；Y436F由EU)。
在一实施方式中，第2CH3区来自修饰的人IgG1，及还包含选自下列的修饰：D16E，L18M，N44S，K52N，V57M和V82I(IMGT；D356E,L358M,N384S,K392N,V397M和V422I由EU)。
在一实施方式中，第2CH3区来自修饰的人IgG2，及还包含选自下列的修饰：N44S，K52N和V82I(IMGT；N384S,K392N和V422I由EU)。
在一实施方式中，第2CH3区来自修饰的人IgG4，及还包含选自下列的修饰：Q15R，N44S，K52N，V57M，R69K，E79Q和V82I(IMGT；Q355R,N384S,K392N,V397M,R409K,E419Q和V422I由EU)。
一种制造结合多于1个表位的表位-结合蛋白的方法旨在根据本发明用包含目标第1表位的抗原免疫第1小鼠，其中所述小鼠包含不含有能重排及形成轻链的内源性小鼠VL的内源性免疫球蛋白轻链可变区座位，其中在内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区座位是可操作地连接于小鼠内源性轻链恒定区基因的单重排的人VL区，及重排的人VL区选自人Vκ1-39Jκ5和人Vκ3-20Jκ1，及内源性小鼠VH基因段已在全体或部分被人VH基因段取代，使得由小鼠制造的免疫球蛋白重链仅或基本上是包含人可变结构域和小鼠恒定区的重链。当免疫时，该小鼠会制造反向嵌合抗体，包含仅2个人轻链可变结构域之一(例如,人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1之一)。一旦鉴定B细胞编码结合目标表位的VH，可检索VH(及,任选地,VL)的核苷酸序列(例如,由PCR)及与适合的人免疫球蛋白恒定区框内克隆进表达构建体。此过程可重复以鉴定结合第2表位的第2VH结构域，及可检索第2VH基因序列及框内克隆进表达载体至第2适合的免疫球蛋白恒定区。第1和第2免疫球蛋白恒定区可为相同或不同的同种型，及免疫球蛋白恒定区之一(但非其他)可如本文所述或如US 2010/0331527A1所述修饰，及相比同源二聚体表位-结合蛋白，表位-结合蛋白可在适合的细胞中表达和基于其对于蛋白A的差异亲和性分离，例如，描述于US2010/0331527A1。
在一实施方式中，提供制造双特异性表位-结合蛋白的方法，包括自本文所述的小鼠鉴定第1亲和性-成熟的(例如,包含1个或更多体细胞超突变)人VH核苷酸序列(VH1)，自本文所述的小鼠鉴定第2亲和性-成熟的(例如,包含1个或更多体细胞超突变)人VH核苷酸序列(VH2)，如描述于US 2010/0331527A1，与缺少蛋白A-决定子修饰的人重链框内克隆VH1而用于形成重链1(HC1)，如描述于US 2010/0331527A1，与包含蛋白A-决定子的人重链框内克隆VH2而形成重链2(HC2)，将包含HC1的表达载体和包含HC2的相同或不同的表达载体导入细胞，其中所述细胞也表达与人轻链恒定区融合的包含人Vκ1-39/人Jκ5或人Vκ3-20/人Jκ1的人免疫球蛋白轻链，允许细胞表达包含由VH1编码的VH结构域和由VH2编码的VH结构域的双特异性表位-结合蛋白，及相比单特异性同源二聚体表位-结合蛋白，基于其结合蛋白A的差异能力分离双特异性表位-结合蛋白。在特定实施方式中，HC1是IgG1，及HC2是包含修饰H95R(IMGT；H435R由EU)和还包含修饰Y96F(IMGT；Y436F由EU)的IgG1。在一实施方式中，由VH1编码的VH结构域，由VH2编码的VH结构域，或二者，被体细胞地突变。
【随常见人VL表达的人VH基因】
随它们的同源轻链，或选自人Vκ1-39/Jκ5，人Vκ3-20/Jκ1或人VpreB/Jλ5的人轻链中的至少一种表达来自针对4种不同抗原产生的亲和性-成熟的抗体的各种人可变区(见实施例1)。对于针对各抗原的抗体，来自不同基因家族的体细胞地突变的高亲和性重链与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1区成功地配对，及自表达重和轻链的细胞分泌。对于Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1，源于以下人VH基因家族的VH结构域有利地表达：1-2，1-8，1-24，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，4-31，4-39，4-59，5-51和6-1。由此，被加工为表达来自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1中的1个或2个的人VL结构域的有限的库的小鼠会产生来自被修饰为用人VH基因段取代小鼠VH基因段的VH座位的体细胞地突变的人VH结构域的多样的群。
被遗传加工为表达与单重排的轻链(例如,Vκ1-39/J或Vκ3-20/J)结合的反向嵌合(人可变,小鼠恒定)免疫球蛋白重链的小鼠，当用目标抗原免疫时，产生包含多样性的人VH重排及表达具有关于它们阻断抗原与其配体的结合的能力，及关于它们结合抗原变体的能力方面的多样的性质的多样性的高-亲和性抗原-特异性抗体的B细胞(见实施例5～10)。
由此，本文所述的小鼠和方法在制造及选择人免疫球蛋白重链可变结构域中有用，所述重链可变结构域包括体细胞地突变的人重链可变结构域，自多样性的重排产生，呈现广泛的亲和性(包括呈现约nM或小的KD)，广泛的特异性(包括结合相同的抗原的不同表位)，及与相同的或基本上相同的人免疫球蛋白轻链可变区结合及随相同的或基本上相同的人免疫球蛋白轻链可变区表达。
【具有常见轻链的完全人双特异性抗体】
作为在各种实施方式中的第1步骤，各编码人重链可变结构域的第1和第2核酸序列(及形成双特异性抗体的任何其他核酸序列)选自具有期望的特征诸如，例如，能结合不同表位(见图7A和7B)，具有不同亲和性，等的亲本单克隆抗体。正常情况下，编码人重链可变结构域的核酸序列从免疫的小鼠分离，如本文所述，以允许与适宜于人施用的人重链恒定区融合。可通过达到导入向双特异性抗体添加另外的功能性的突变来制造对序列的进一步修饰，所述另外的功能性包括，例如，增加血清半衰期(例如,见美国7,217,797)和/或增加抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(例如,见美国6,737,056)。向抗体的恒定区导入突变为本领域所知。此外，可在细胞培养中重组制造部分双特异性抗体，和可由上述那些技术制造分子的其他部分。
已描述几种用于产生抗体的技术。例如，在各种实施方式中，在本文所述的小鼠中产生嵌合抗体。抗体可自免疫的小鼠的B细胞(例如,见U.S.2007/0280945A1)和/或可用于制造杂交瘤的免疫的小鼠的B细胞(Kohler和Milstein,1975,Nature 256:495-497)直接分离。编码来自本文所述的小鼠的抗体(人重和/或轻链)的DNA容易通过使用常规技术分离及测序。源于本文所述的小鼠的杂交瘤和/或B细胞作为该DNA的优选的源。一旦分离，可将DNA放入表达载体，然后将其转染进不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。DNA也可例如，通过在鼠序列处取代为人重和轻链恒定区的编码序列来修饰。
在各种实施方式中，在DNA分离和选择编码具有期望的特异性/亲和性的第1和第2人重链可变结构域的第1和第2核酸序列，及编码人轻链结构域的第3核酸序列(自在本文描述的小鼠分离的种系重排的序列或轻链序列)之后，使3种编码分子的核酸序列表达而使用本领域广泛可利用的重组技术形成双特异性抗体。常常，选择的表达系统会涉及哺乳动物细胞表达载体和宿主，从而使双特异性抗体适当糖基化(例如,在包含被糖基化的抗体结构域的双特异性抗体的情况中)。但是，分子也可在原核生物表达系统中产生。正常情况下，会将宿主细胞用在单载体或独立的载体上编码第1人重链可变结构域，第2人重链可变结构域，人轻链结构域的DNA转化。但是，在独立的表达系统中表达第1人重链可变结构域，第2人重链可变结构域，及人轻链结构域(双特异性抗体组分)及体外偶联表达的多肽也是可能的。在各种实施方式中，人轻链结构域包含种系序列。在各种实施方式中，人轻链结构域随轻链结构域的轻链可变序列包含不多于1，不多于2，不多于3，不多于4，或不多于5个体细胞超突变。
在各种实施方式中，将编码2个重链和单人轻链的核酸(例如,cDNA或基因组DNA)插入用于进一步克隆(DNA的扩增)和/或用于表达的可复制的载体。许多载体是可利用的，及通常包括，但不限于，以下1种或更多：信号序列，复制原点，1个或更多标志物基因，增强子元件，启动子和转录终止序列。可个别或基于宿主细胞选择或实验确定的其他标准选择各组分。各组分的几例为本领域所知。
表达及克隆载体通常含有被宿主生物识别及可操作地连接于编码双特异性抗体的各或全部组分的核酸序列的启动子。熟知由各种潜在宿主细胞识别的大量的启动子。通过由限制酶消化自源DNA移出启动子及向载体插入分离的启动子序列来将这些启动子可操作地连接于编码双特异性抗体的DNA。
真核生物宿主细胞(酵母,真菌,昆虫,植物,动物,人或有核化的细胞自其他多细胞生物)中使用的表达载体也可含有对于转录终止及稳定化mRNA必需的序列。该序列通常是自真核生物或病毒DNA或cDNA的5’及，偶尔3’，非翻译区可利用的。这些区在编码双特异性抗体组分的mRNA的未翻译的部分含有作为多聚腺苷酸化的片段转录的核苷酸段。对于各种实施方式适合的表达载体包括为在哺乳动物细胞中编码双特异性抗体的DNA的瞬时表达而提供的那些。一般而言，瞬时表达涉及使用表达载体，其能在宿主细胞中有效复制，使得宿主细胞蓄积许多拷贝的表达载体，及进而，合成高水平的由表达载体编码的期望的多肽。瞬时表达系统，包含适合的表达载体和宿主细胞，允许由克隆的DNA编码的多肽的方便的阳性鉴定，以及相对于具有第1或第2人重链可变结构域的同源二聚体的亲本抗体具有期望的结合特异性/亲和性或期望的凝胶迁移特征的双特异性抗体的快速筛选。
在各种实施方式中，一旦编码双特异性抗体的组分的DNA组装为上述期望的载体，将它们导入对于表达和回收适合的宿主细胞。转染宿主细胞可通过使用对于选择的宿主细胞适当的本领域知道的标准技术(例如,电穿孔,核微注射,与完整细胞的细菌原生质体融合,或聚阳离子,例如,聚凝胺,聚鸟氨酸,等)实现。
选择宿主细胞，在各种实施方式中，其最佳适合含有组分的表达载体及允许双特异性抗体物种的最有效和有利的产生。表达用的例示宿主细胞包括原核生物和真核生物细胞(单-细胞或多-细胞)，细菌细胞(例如,大肠埃希氏菌(E.coli)株，芽孢杆菌属(Bacillusspp.)物种,链霉菌属(Streptomyces spp.)物种,等)，分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞，真菌细胞，酵母细胞(例如,啤酒糖酵母(S.cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(S.pombe)，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)，甲醇毕赤酵母(P.methanolica)，等)，植物细胞，昆虫细胞(例如,SF-9,SF-21,杆状病毒-感染的昆虫细胞,粉斑夜蛾(Trichoplusia ni)，等)，非-人动物细胞，人细胞或细胞融合诸如，例如，杂交瘤或细胞杂交瘤。在各种实施方式中，细胞是人，猴，猿，仓鼠，大鼠或小鼠细胞。在各种实施方式中，细胞是真核生物细胞选自CHO(例如,CHOK1,DXB-11CHO,Veggie-CHO)，COS(例如,COS-7)，视网膜细胞，Vero，CV1，肾(例如,HEK293,293EBNA,MSR 293,MDCK,HaK,BHK)，HeLa，HepG2，WI38，MRC 5，Colo205，HB 8065，HL-60，(例如,BHK21)，Jurkat，Daudi，A431(表皮)，CV-1，U937，3T3，L细胞，C127细胞，SP2/0，NS-0，MMT060562，Sertoli细胞，BRL 3A细胞，HT1080细胞，骨髓瘤细胞，肿瘤细胞和细胞系源于上述的细胞。在各种实施方式中，细胞包含1个或更多病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如,PER.C6TM细胞)。
可在各种培养基中培养用于产生双特异性抗体的哺乳动物宿主细胞。可商购的培养基诸如Ham氏F10(Sigma)，最小必要的培养基((MEM)，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，及Dulbeccols改良的Eagle氏培养基((DMEM)，Sigma)适宜于培养宿主细胞。培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素,转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠,磷酸钙及镁)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCINTM)，微量元素(定义为通常以μM范围内的终浓度存在的无机化合物)，及葡萄糖或相当的能源。如本领域技术人员知道，也可以适当的浓度包括任何其他补充物。培养条件，诸如温度，pH，等，在各种实施方式中，是之前随为表达选择的宿主细胞使用的那些，及会对于本领域技术人员显而易见。
在各种实施方式中，双特异性抗体自培养基作为分泌的多肽回收，尽管其也可当无分泌信号地直接产生时自宿主细胞裂解物回收。如果双特异性抗体是膜结合的，其可使用适合的去污剂溶液(例如,Triton-X 100)从膜释放。优选地，本文所述的双特异性抗体涉及使用第1免疫球蛋白CH3结构域和第2免疫球蛋白CH3结构域，其中所述第1和第2免疫球蛋白CH3结构域彼此不同在于至少1个氨基酸，且其中至少1个氨基酸差异相比缺少氨基酸差异的双-特异性抗体，减少双特异性抗体与蛋白A的结合(见美国2010/0331527A1；通过引用在本文合并)。在一实施方式中，第1免疫球蛋白CH3结构域结合蛋白A和第2免疫球蛋白CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，诸如H95R修饰(由IMGT外显子编号；H435R由EU编号)。第2CH3可还包含Y96F修饰(由IMGT；Y436F由EU)。可第2CH3之内发现的进一步修饰在IgG1抗体的情况中包括：D16E，L18M，N44S，K52N，V57M和V82I(由IMGT；D356E,L358M,N384S,K392N,V397M和V422I由EU)；在IgG2抗体情况中包括N44S，K52N和V82I(IMGT；N384S,K392N和V422I由EU)；及在IgG4抗体的情况中包括Q15R，N44S，K52N，V57M，R69K，E79Q和V82I(由IMGT；Q355R,N384S,K392N,V397M,R409K,E419Q和V422I由EU)。上述双-特异性抗体形式上的变异涵盖在本发明的范围之内。
因为双特异性抗体的双性质(即,可特异于一个多肽的不同表位或可含有特异于多于1种靶多肽的抗原-结合结构域,见图7B；见也,例如,Tutt等人,1991,J.immunol.147:60-69；Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22:238-244)，它们提供许多对于治疗性应用有用的优势。例如，双特异性抗体可用于重定向的细胞毒性(例如,杀灭肿瘤细胞)，用作疫苗佐剂，用于向凝块递送溶血栓剂，用于在靶位点(例如,肿瘤)转变酶活化的药物前体，用于治疗感染性疾病，使免疫复合物靶向细胞表面受体，或用于向肿瘤细胞递送免疫毒素。
本文所述的双特异性抗体也可用于几种治疗性和非-治疗性和/或诊断检定方法，诸如，酶免疫测定，2-位点免疫测定，各种疾病(例如,癌)的体外或体内免疫诊断，竞争性结合测定，直接及间接夹层测定，及免疫沉淀测定。双特异性抗体的其他用途会对于本领域技术人员显而易见。
提供下列实施例，以向本领域普通技术人员描述如何制造及使用本发明的方法和组合物，及未旨在限制发明人认为它们的发明的范围。已努力确保关于使用的数(例如,量,温度,等)的精确度，但一些实验误差和偏差应被计入。除非另外指示，份是重量份，分子量是平均分子量，温度以摄氏度表示，及压力处于或接近大气压。
实施例
提供下列实施例，以为本领域普通技术人员描述如何制造及使用本发明的方法和组合物，及不旨在限制发明人认为它们的发明的范围。已努力确保关于使用的数(例如,量,温度,等)的精确度，但应计入一些实验误差和偏差。除非另外指示，温度以摄氏度表示，压力处于或接近大气压，份是重量份，及分子量是平均分子量。
【实施例1.与选择的人VL区结合的人VH区的鉴定】
构建体外表达系统，以测定是否单重排的人种系轻链可与来自抗原特异性人抗体的人重链共表达。
知道在遗传修饰的小鼠中产生人抗体的方法(见例如,US6,596,541,RegeneronPharmaceuticals,
Figure BDA0001655669980000711
)。
Figure BDA0001655669980000712
技术涉及产生具有包含可操作地连接于内源性小鼠恒定区座位的人重和轻链可变区的基因组的遗传修饰的小鼠，使得小鼠响应抗原性刺激产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。编码自
Figure BDA0001655669980000713
小鼠产生的抗体重和轻链的可变区的DNA完全是人的。起初，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。如下所述，就期望特征，包括亲和性，选择性，表位，等表征及选择抗体。用期望的人恒定区取代小鼠恒定区而产生含有非-IgM同种型，例如，野生型或修饰的IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的完全人抗体。尽管选择的恒定区可根据特定用途改变，高亲和性抗原-结合及靶向特异性特征在于可变区。
将
Figure BDA0001655669980000714
小鼠用促进血管发生的生长因子(抗原C)免疫，和分离抗原-特异性人抗体，及对于V基因利用使用本领域认可的标准技术测序。选择的抗体在人重和轻链恒定区上克隆，和选择69个重链用于与3个人轻链之一配对：(1)连接于人κ恒定区的同源κ轻链，(2)连接于人κ恒定区的重排的人种系Vκ1-39Jκ5，或(3)连接于人κ恒定区的重排的人种系Vκ3-20Jκ1。在CHO-K1细胞中使用标准技术共转染各重链和轻链对。在ELISA测定中，由抗-人IgG检测上清液中抗体的存在。为各重链/轻链对测定抗体滴度(ng/ml)，和将用不同重排的种系轻链的滴度与用亲本抗体分子(即,与同源轻链配对的重链)获得的滴度比较，和计算天然滴度的百分率(表1)。VH：重链可变的基因。ND：在当前实验条件下未检测到表达。
表1
Figure BDA0001655669980000721
Figure BDA0001655669980000731
Figure BDA0001655669980000741
在类似实验中，将
Figure BDA0001655669980000742
小鼠用几种不同抗原免疫，及就它们与不同重排的人种系轻链配对的能力测试抗原特异性人抗体的选择的重链(如上所述)。此实验中使用的抗原包括胆甾醇稳态中涉及的酶(抗原A)，调控葡萄糖稳态中涉及的血清激素(抗原B)，促进血管发生的生长因子(抗原C)和细胞-表面受体(抗原D)。抗原特异性抗体从各免疫组的小鼠分离，和克隆及测序重链和轻链可变区。自重和轻链的序列，测定V基因利用，及使选择的重链与它们的同源轻链或重排的人种系Vκ1-39Jκ5区配对。在CHO-K1细胞中共转染各重/轻链对，和在ELISA测定中，由抗-人IgG检测上清液中抗体的存在。为各重链/轻链配对测定抗体滴度(μg/ml)，及将用不同重排的人种系轻链的滴度与用亲本抗体分子(即,与同源轻链配对的重链)获得的滴度比较，和计算天然滴度的百分率(表2)。VH：重链可变的基因。Vκ：κ轻链可变的基因。ND：在当前实验条件下未检测到表达。
表2
Figure BDA0001655669980000743
Figure BDA0001655669980000751
自这些实验获得的结果展示，来自不同基因家族的体细胞地突变的，高亲和性重链能与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1区配对，及自细胞作为正常抗体分子分泌。如显示于表1，相比亲本抗体的同源轻链，对于约61％(69中的42)重链，当与重排的人Vκ1-39Jκ5轻链配对时抗体滴度增加，和约29％(69中的20)重链，当与重排的人Vκ3-20Jκ1轻链配对时抗体滴度增加。对于约20％(69中的14)的重链，相比亲本抗体的同源轻链，两个重排的人种系轻链赋予表达的增加。如显示于表2，相比亲本抗体的同源轻链，重排的人种系Vκ1-39Jκ5区赋予几种特异于一系列不同类的抗原的重链表达的增加。相比亲本抗体的同源轻链，约35％(15/43)的重链抗体滴度增加多于2倍。对于2种重链(315和316)，相比亲本抗体增加大于10倍。在全部显示相对于亲本抗体的同源轻链的增加表达的重链之内，家族3(VH3)重链相比其他重链可变区基因家族过表达。此展示人VH3重链与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1轻链配对的有利的关系。
【实施例2.重排的人种系轻链座位的产生】
通过使用
Figure BDA0001655669980000761
技术制造各种重排的人种系轻链靶向载体(见,例如,US专利No.6,586,251和Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering ofthe mouse genome coupled with high-resolution expression analysis,NatureBiotech.21(6)：652～659)，以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)克隆302g12和254m04(Invitrogen)。使用这2种BAC克隆，将基因组构建体加工为含有单重排的人种系轻链区，及插入之前修饰为删除内源性κ可变及接合基因段的内源性κ轻链座位。
重排的人种系轻链靶向载体的构建。通过使用本领域认可的标准分子生物学技术制造3种不同重排的人种系轻链区。用于构建这3个区的人可变的基因段包括重排的人Vκ1-39Jκ5序列，重排的人Vκ3-20Jκ1序列和重排的人VpreBJλ5序列。
由新DNA合成(Integrated DNA Technologies)制造含有小鼠Vκ3-7基因的外显子1(编码前导序列肽)和内含子1的DNA段。包括达天然存在的BlpI限制酶位点的5’非翻译区的部分。自人基因组BAC库PCR扩增人Vκ1-39和Vκ3-20基因的外显子。正向引物具有含有小鼠Vκ3-7基因的内含子1的剪接受体位点的5’延伸。用于人Vκ1-39序列的PCR的反向引物包括编码人Jκ5的延伸，然而用于人Vκ3-20序列的PCR的反向引物包括编码人Jκ1的延伸。人VpreBJλ5序列由新DNA合成(Integrated DNA Technologies)制造。自质粒pBS-296-HA18-PISceIPCR扩增包括剪接供体位点的部分人Jκ-Cκ内含子。正向PCR引物包括编码人Jκ5，Jκ1或Jλ5序列的部分的延伸。反向引物包括之前加工为内含子的PI-SceI位点。
由重叠延伸PCR将小鼠Vκ3-7外显子1/内含子1，人可变的轻链外显子，及人Jκ-Cκ内含子片段接在一起，用BlpI和PI-SceI消化，及连接进质粒pBS-296-HA18-PISceI，其含有来自人Vκ3-15可变的基因段的启动子。质粒pBS-296-HA18-PISceI之内的loxed潮霉素盒被侧接NotI和AscI位点的FRTed潮霉素盒取代。此质粒的NotI/PI-SceI片段被连接到修饰的小鼠BAC 254m04，其含有小鼠Jκ-Cκ内含子的部分，小鼠Cκ外显子，及小鼠κ座位下游的约75kb的基因组序列，其提供用于在小鼠ES细胞中同源重组的3’同源性臂。然后将此BAC的NotI/AscI片段连接进修饰的小鼠BAC 302g12，其含有FRTed新霉素盒和用于在小鼠ES细胞中同源重组的内源性κ座位上游的约23kb的基因组序列。
重排的人种系Vκ1-39Jκ5靶向载体(图1)。在用于克隆进靶向载体的加工的轻链插入子的5’及3’端导入限制酶位点：在5’端导入AscI位点和在3’端导入PI-SceI位点。在5’AscI位点和3’PI-SceI位点之内，靶向构建体自5’至3’包括：含有自小鼠BAC克隆302g12获得的内源性小鼠κ轻链座位5’的序列的5’同源性臂，FRTed新霉素抗性基因，包括人Vκ3-15启动子的基因组序列，小鼠Vκ3-7可变的基因段的前导序列，小鼠Vκ3-7可变的基因段的内含子序列，重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的开放阅读框，含有部分人Jκ-Cκ内含子的基因组序列，及含有自小鼠BAC克隆254m04获得的内源性小鼠Jκ5基因段3’的序列的3’同源性臂(图1,中)。内源性小鼠κ轻链座位上游和最3’Jκ基因段下游的基因和/或序列(例如,内源性3’增强子)未由靶向构建体修饰(见图1)。加工的人Vκ1-39Jκ5座位的序列显示于SEQ ID NO:1。
重排的人种系Vκ1-39Jκ5区靶向插入BAC DNA由聚合酶链反应(PCR)，使用位于重排的人种系轻链区之内的序列的引物确认。简言之，用引物ULC-m1F(AGGTGAGGGTACAGATAAGT GTTATGAG；SEQ ID NO:2)和ULC-m1R(TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA；SEQID NO:3)确认小鼠Vκ3-7前导序列3’的内含子序列。用引物1633-h2F(GGGCAAGTCAGAGCATTAGC A；SEQ ID NO:4)和1633-h2R(TGCAAACTGG ATGCAGCATA G；SEQ ID NO:5)确认重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的开放阅读框。新霉素盒用引物neoF(GGTGGAGAGG CTATTCGGC；SEQ ID NO:6)和neoR(GAACACGGCG GCATCAG；SEQ ID NO:7)确认。然后使用靶向的BAC DNA电穿孔小鼠ES细胞而产生用于产生表达重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的嵌合小鼠的修饰的ES细胞。
阳性ES细胞克隆由TAQMANTM筛选及使用特异于插入内源性座位的加工的Vκ1-39Jκ5轻链区的探针的核型分析确认。简言之，在新霉素标志物基因之内结合的探针neoP(TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG；SEQ ID NO:8)，在小鼠Vκ3-7前导序列3’的内含子序列之内结合的探针ULC-m1P(CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC；SEQ ID NO:9)，及在重排的人种系Vκ1-39Jκ5开放阅读框之内结合的探针1633h2P(ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT；SEQID NO:10)。然后使用阳性ES细胞克隆移植雌性小鼠而生产表达种系Vκ1-39Jκ5轻链区的一窝幼仔。
或者，用表达FLP的构建体转染带有重排的人种系Vκ1-39Jκ5轻链区的ES细胞，以便移出由靶向构建体导入的FRTed新霉素盒。任选地，由培育表达FLP重组酶的小鼠来移出新霉素盒(例如,US 6,774,279)。任选地，新霉素盒保留在小鼠中。
重排的人种系Vκ3-20Jκ1靶向载体(图2)。以类似样式，通过使用靶向构建体制造表达重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的加工的轻链座位，所述靶向构建体自5’至3’包括，含有自小鼠BAC克隆302g12获得的内源性小鼠κ轻链座位5’的序列的5’同源性臂，FRTed新霉素抗性基因，包括人Vκ3-15启动子的基因组序列，小鼠Vκ3-7可变的基因段的前导序列，小鼠Vκ3-7可变的基因段的内含子序列，重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的开放阅读框，含有部分人Jκ-Cκ内含子的基因组序列，及含有自小鼠BAC克隆254m04获得的内源性小鼠Jκ5基因段3’的序列的3’同源性臂(图2,中)。加工的人Vκ3-20Jκ1座位的序列显示于SEQ ID NO:11。
重排的人种系Vκ3-20Jκ1区靶向插入BAC DNA由聚合酶链反应(PCR)，使用位于重排的人种系Vκ3-20Jκ1轻链区之内的序列的引物确认。简言之，小鼠Vκ3-7前导序列3’的内含子序列用引物ULC-m1F(SEQ ID NO:2)和ULC-m1R(SEQ ID NO:3)确认。重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的开放阅读框用引物1635-h2F(TCCAGGCACC CTGTCTTTG；SEQ ID NO:12)和1635-h2R(AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT；SEQ ID NO:13)确认。新霉素盒用引物neoF(SEQ IDNO:6)和neoR(SEQ ID NO:7)确认。然后使用靶向的BAC DNA电穿孔小鼠ES细胞而产生用于产生表达重排的人种系Vκ3-20Jκ1轻链的嵌合小鼠的修饰的ES细胞。
阳性ES细胞克隆由TAQMANTM筛选及使用特异于插入内源性κ轻链座位的加工的Vκ3-20Jκ1轻链区的探针的核型分析确认。简言之，在新霉素标志物基因之内结合的探针neoP(SEQ ID NO:8)，在小鼠Vκ3-7前导序列之内结合的探针ULC-m1P(SEQ ID NO:9)，及在人Vκ3-20Jκ1开放阅读框之内结合的探针1635h2P(AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG；SEQ ID NO:14)。然后使用阳性ES细胞克隆移植雌性小鼠。一窝幼仔表达人种系Vκ3-20Jκ1轻链区。
或者，带有人种系Vκ3-20Jκ1轻链区的ES细胞可用表达FLP的构建体转染，以便移出由靶向构建体导入的FRTed新霉素盒。任选地，新霉素盒可由培育表达FLP重组酶的小鼠来移出(例如,US6,774,279)。任选地，新霉素盒保留在小鼠中。
重排的人种系VpreBJλ5靶向载体(图3)。以类似样式，通过使用靶向构建体制造表达重排的人种系VpreBJλ5区的加工的轻链座位，所述靶向构建体自5’至3’包括，含有自小鼠BAC克隆302g12获得的内源性小鼠κ轻链座位5’的序列的5’同源性臂，FRTed新霉素抗性基因，包括人Vκ3-15启动子的基因组序列，小鼠Vκ3-7可变的基因段的前导序列，小鼠Vκ3-7可变的基因段的内含子序列，重排的人种系VpreBJλ5区的开放阅读框，含有部分人Jκ-Cκ内含子的基因组序列，及含有自小鼠BAC克隆254m04获得的内源性小鼠Jκ5基因段3’的序列的3’同源性臂(图3,中)。加工的人VpreBJλ5座位的序列显示于SEQ ID NO:15。
重排的人种系VpreBJλ5区靶向插入BAC DNA由聚合酶链反应(PCR)，使用位于在重排的人种系VpreBJλ5区轻链区之内的序列的引物确认。简言之，小鼠Vκ3-7前导序列3’的内含子序列用引物ULC-m1F(SEQ ID NO:2)和ULC-m1R(SEQ ID NO:3)确认。重排的人种系VpreBJλ5区的开放阅读框用引物1616-h1F(TGTCCTCGGC CCTTGGA；SEQ ID NO:16)和1616-h1R(CCGATGTCAT GGTCGTTCCT；SEQ ID NO:17)确认。新霉素盒用引物neoF(SEQ ID NO:6)和neoR(SEQ ID NO:7)确认。然后使用靶向的BAC DNA电穿孔小鼠ES细胞而产生用于产生表达重排的人种系VpreBJλ5轻链的嵌合小鼠的修饰的ES细胞。
阳性ES细胞克隆由TAQMANTM筛选及使用特异于插入内源性κ轻链座位的加工的VpreBJλ5轻链区的探针核型分析确认。简言之，在新霉素标志物基因之内结合的探针neoP(SEQ ID NO:8)，在小鼠IgVκ3-7前导序列之内结合的探针ULC-m1P(SEQ ID NO:9)，及在人VpreBJλ5开放阅读框之内结合的探针1616h1P(ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT；SEQ ID NO:18)。然后使用阳性ES细胞克隆移植雌性小鼠而生产一窝表达种系轻链区的幼仔。
或者，将带有重排的人种系VpreBJλ5轻链区的ES细胞用表达FLP的构建体转染，以便移出由靶向构建体导入的FRTed新霉素盒。任选地，由培育表达FLP重组酶的小鼠移出新霉素盒(例如,US 6,774,279)。任选地，新霉素盒保留在小鼠中。
【实施例3.表达单重排的人轻链的小鼠的产生】
将上述靶向的ES细胞用作供体ES细胞，及由
Figure BDA0001655669980000811
方法导入8-细胞阶段小鼠胚胎(见,例如,US专利No.7,294,754和Poueymirou等人。(2007)F0generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1)：91～99.独立地带有加工的人种系Vκ1-39Jκ5轻链区,Vκ3-20Jκ1轻链区或VpreBJλ5轻链区的
Figure BDA0001655669980000812
通过使用检测独特重排的人种系轻链区的存在的等位基因测定(Valenzuela等人,见上)的修饰的基因分型鉴定。
对幼仔进基因分型，及选择对于独特重排的人种系轻链区杂合或纯合的幼仔用于表征重排的人种系轻链区的表达。
流氏细胞术.由常见轻链小鼠的脾细胞和外周血中免疫球蛋白κ和λ表达的分析确认常见轻链小鼠的正常抗体库中重排的人轻链区的表达。通过使用标准方法自野生型(n＝5)，Vκ1-39Jκ5常见轻链杂合子(n＝3)，Vκ1-39Jκ5常见轻链纯合子(n＝3)，Vκ3-20Jκ1常见轻链杂合子(n＝2)，及Vκ3-20Jκ1常见轻链纯合子(n＝2)小鼠收获的脾脏和外周血制造细胞悬浮液，及用CD19+，Igλ+和Igκ+使用荧光标记的抗体(BD Pharmigen)染色。
简言之，将1×106细胞与抗-小鼠CD16/CD32(克隆2.4G2,BD Pharmigen)在冰上温育10分钟，之后用以下抗体混剂在冰上标记30分钟：APC缀合的抗-小鼠CD19(克隆1D3,BDPharmigen)，PerCP-Cy5.5缀合的抗-小鼠CD3(克隆17A2,BioLegend)，FITC缀合的抗-小鼠Igκ(克隆187.1,BD Pharmigen)，PE缀合的抗-小鼠Igλ(克隆RML-42,BioLegend)。染色之后，洗涤细胞及在2％甲醛中固定。在LSRII流式细胞仪上实施数据获取及用FlowJo分析。选通：总B细胞(CD19+CD3-)，Igκ+B细胞(Igκ+Igλ-CD19+CD3-)，Igλ+B细胞(Igκ-Igλ+CD19+CD3-)。自血和脾细胞样品收集的数据展示类似结果。表3显示来自是Igλ+，Igκ+或Igλ+Igκ+的各组的1个代表性的小鼠的外周血的百分率阳性CD19+B细胞。来自野生型(WT)和对于Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1常见轻链纯合的小鼠的外周血中CD19+B细胞的百分率显示于图4。
表3
Figure BDA0001655669980000821
常见轻链表达。在杂合和纯合小鼠中，使用定量PCR测定(例如.TAQMANTM)分析各常见轻链(Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1)的表达。
简言之，自野生型，对于小鼠重链和κ轻链可变区座位被对应人重链和κ轻链可变区座位(Hκ)的取代纯合的小鼠，以及对于各重排的人轻链区纯合和杂合的小鼠(Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1)的脾脏，使用小鼠CD19微珠(Miltenyi Biotec)，根据生产商的说明书纯化CD19+B细胞。自CD19+B细胞，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)，根据生产商的说明书纯化总RNA，和通过使用无RNA酶的DNA酶柱上处理(Qiagen)移出基因组RNA。使用第1链cDNA合成试剂盒(Invitrogen)将200ng mRNA反转录为cDNA，和用Taqman通用PCR Master Mix(AppliedBiosystems)扩增得到的cDNA。通过使用ABI 7900序列检测系统(Applied Biosystems)，使用跨(1)用于两个常见轻链的Vκ-Jκ连接，(2)Vκ基因单独(即Vκ1-39和Vκ3-20)，及(3)小鼠Cκ区的引物和Taqman MGB探针实施全部反应。表4显示为此测定采用的引物和探针的序列。相对表达标准化至小鼠Cκ区的表达。结果显示于图5A，5B和5C。
表4
Figure BDA0001655669980000831
抗原特定常见轻链抗体。将在内源性小鼠κ轻链座位带有Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1常见轻链的常见轻链小鼠用β-半乳糖苷酶免疫，和测量抗体滴度。
简言之，将β-半乳糖苷酶(Sigma)在titermax佐剂(Sigma)中，按照生产商的方向乳化。将野生型(n＝7)，Vκ1-39Jκ5常见轻链纯合子(n＝2)和Vκ3-20Jκ1常见轻链纯合子(n＝5)由用100μgβ-半乳糖苷酶/Titermax皮下注射来免疫。小鼠由以3周间隔皮下注射2次50μgβ-半乳糖苷酶/Titermax来追施。在第2追施之后，自麻醉的小鼠使用向血清分离管(BDBiosciences)按照生产商的指引眶后放血来收集血。为了测量抗-β-半乳糖苷酶IgM或IgG抗体，将ELISA板(Nunc)用1μg/mLβ-半乳糖苷酶于4℃包被过夜。在用PBS阻断之前，将过量抗原用1％BSA于室温洗掉1小时。将血清的系列稀释加入板，及在洗涤之前于室温温育1小时。然后将板用HRP缀合的抗-IgM(Southern Biotech)或抗-IgG(Southern Biotech)于室温温育1小时。另一洗涤之后，将板用TMB底物(BD Biosciences)显影。用1N硫酸停止反应，和通过使用Victor×5板读取器(Perkin Elmer)对OD450读数。数据用GraphPad Prism分析，和作为血清稀释计算信号，其是背景的2倍以上。结果显示于图6A和6B。
如显示于此例，Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1常见轻链小鼠的脾和外周隔室中κ/λB细胞的比展示接近野生型模式(表3和图4)。但是，VpreBJλ5常见轻链小鼠，展示更少外周B细胞，其中约1～2％表达加工的人轻链区(数据未显示)。相比含有小鼠Vκ和Jκ基因段被人Vκ和Jκ基因段完全取代的内源性κ轻链座位，Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1重排的人轻链区自内源性κ轻链座位的表达水平提升(图5A,5B和5C)。VpreBJλ5重排的人轻链区的表达水平展示在杂合和纯合小鼠中自内源性κ轻链座位的类似高表达(数据未显示)。此展示，在与小鼠λ，κ或二者内源性轻链座位的直接竞争中，相比野生型水平表达，单重排的人VL/JL序列可自内源性κ轻链座位更佳产生，及引起正常脾和血B细胞频度。而且，具有人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1序列的加工的κ轻链座位的存在被小鼠良好耐受，及呈现通过在免疫应答的体液组分中表达轻链库的实质性部分来以野生型样式发挥功能(图6A和6B)。
【实施例4.表达单重排的人种系轻链的小鼠的培育】
此例描述可培育为本文所述的常见轻链小鼠中的任何一种的几种其他遗传修饰的小鼠株，以产生多种带有个多遗传修饰的免疫球蛋白座位的遗传修饰的小鼠株。
内源性Igλ敲除(KO)。为了优化加工的轻链座位的利用，将带有重排的人种系轻链区之一的小鼠培育为在内源性λ轻链座位中含有缺失的另一小鼠。以此方式，获得的后代会表达，作为它们的仅轻链，如在实施例2中描述的重排的人种系轻链区。由本领域认可的标准技术及，替代性地，由商业种畜(例如,Jackson实验室)实施培育。就独特轻链区的存在和内源性小鼠λ轻链的缺失筛选带有加工的轻链座位和内源性λ轻链座位的缺失的小鼠株。
人源化的内源性重链座位。使带有加工的人种系轻链座位的小鼠与含有内源性小鼠重链可变的基因座位被人重链可变的基因座位取代的小鼠繁殖(见US 6,596,541；
Figure BDA0001655669980000851
小鼠,Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)。
Figure BDA0001655669980000852
小鼠包含基因组，所述基因组包含可操作地连接于内源性小鼠恒定区座位的人重链可变区，使得小鼠响应抗原性刺激而产生包含人重链可变区和小鼠重链恒定区的抗体。分离编码抗体重链的可变区的DNA及可操作地连接于编码人重链恒定区的DNA。然后在能表达完全人抗体重链的细胞中表达所述DNA。
获得带有内源性小鼠VH座位被人VH座位取代和在内源性κ轻链座位带有单重排的人种系VL区的小鼠。在用目标抗原免疫后获得含有体细胞地突变的重链(人VH和小鼠CH)及单人轻链(人VL和小鼠CL)的反向嵌合抗体。鉴定表达抗体的B细胞的VH和VL核苷酸序列，及通过在适合的表达系统中融合VH和VL核苷酸序列与人CH和CL核苷酸序列来制造完全人抗体。
【实施例5.自表达人重链及重排的人种系轻链区的小鼠产生抗体】
在将含有加工的人轻链区的小鼠培育为各种期望的含有其他内源性Ig座位的修饰和缺失的株(如描述于实施例4)之后，可将选择的小鼠用目标抗原免疫。
一般而言，含有单重排的人种系轻链区之一的
Figure BDA0001655669980000853
小鼠用抗原攻击，及自动物血清回收淋巴细胞(诸如B细胞)。使淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合而制备永生杂交瘤细胞系，及对该杂交瘤细胞系进行筛选及选择而鉴定产生特异于用于免疫的抗原的含有人重链可变和重排的人种系轻链的抗体的杂交瘤细胞系。分离编码重链和轻链的可变区的DNA，及连接于重链和轻链的期望同型恒定区。由于内源性小鼠序列和存在于内源性座位的任何其他顺式作用元件的存在，各抗体的单轻链可被体细胞地突变。此向包含单轻链和多样的重链序列的抗原-特异性库添加另外的多样性。得到的克隆的抗体序列随后在细胞，诸如CHO细胞中表达。或者，自抗原-特异性淋巴细胞直接鉴定编码抗原-特异性嵌合抗体或轻和重链的可变结构域的DNA。
起初，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。如上所述，就期望特征，包括亲和性，选择性，表位，等表征及选择抗体。小鼠恒定区被期望的人恒定区取代而产生含有体细胞地突变的人重链和源于本发明的重排的人种系轻链区的单轻链的完全人抗体。适合的人恒定区包括，例如野生型或修饰的IgG1或IgG4。
将含有内源性小鼠重链座位被人VH，DH和JH基因段取代和内源性小鼠κ轻链座位被加工的种系Vκ1-39Jκ5人轻链区或加工的种系Vκ3-20Jκ1人轻链区取代的
Figure BDA0001655669980000861
小鼠的分离的同群(以上描述的)用人细胞-表面受体蛋白(抗原E)免疫。将抗原E以每3～4天6次连续注射直接施用到小鼠的后足垫。在注射之前，将2～3μg的抗原E与10μg的CpG寡核苷酸(Cat#tlrl-modn-ODN1826寡核苷酸；InVivogen,San Diego,CA)和25μg的Adju-Phos(磷酸铝凝胶佐剂,Cat#H-71639-250；Brenntag Biosector,Frederikssund,丹麦)混合。在最终抗原召回之前给出总共6次注射，其在处死之前3～5天给出。收集在第4和第6次注射之后的出血，及由标准抗原-特异性免疫测定监测抗体免疫应答。
当达到期望的免疫应答时，收获脾细胞及与小鼠骨髓瘤细胞融合而保存它们的活力及形成杂交瘤细胞系。筛选及选择杂交瘤细胞系而鉴定产生抗原E-特异性常见轻链抗体的细胞系。使用此技术获得几种抗-抗原E-特异性常见轻链抗体(即,具有人重链可变结构域,相同的人轻链可变结构域,及小鼠恒定区的抗体)。
或者，不与骨髓瘤细胞融合而直接自抗原-阳性B细胞分离抗-抗原E常见轻链抗体，如描述于美国2007/0280945A1，通过引用以其整体在本文特别合并。使用此方法，获得几种完全人抗-抗原E常见轻链抗体(即,具有人重链可变结构域,加工的人Vκ1-39Jκ5轻链或加工的人Vκ3-20Jκ1轻链区,及人恒定区的抗体)。
以下所示部分详细描述根据此例的方法产生的例示抗-抗原E常见轻链抗体的生物学性质。
【实施例6.抗原-特异性常见轻链抗体中的重链基因段利用】
为了分析产生的人抗-抗原E常见轻链抗体的结构，克隆及测序编码重链抗体可变区的核酸。自抗体的核酸序列及预测的氨基酸序列，为自含有加工的人Vκ1-39Jκ5轻链或加工的人Vκ3-20Jκ1轻链区的免疫的
Figure BDA0001655669980000872
小鼠获得的选择的常见轻链抗体的重链可变区(HCVR)鉴定基因利用。结果显示于表5和6，其展示由于各种重排，当采用表达来自仅源于人Vκ1-39-或人Vκ3-20的轻链的轻链的小鼠时，本发明的小鼠产生来自各种人重链基因段的抗原-特异性常见轻链抗体。2，3，4和5个家族的人VH基因段与各种人DH段和人JH段重排而产生抗原-特异性抗体。
表5
Figure BDA0001655669980000871
Figure BDA0001655669980000881
表6
Figure BDA0001655669980000882
Figure BDA0001655669980000891
【实施例7.由LUMINEXTM测定确定抗原-特异性常见轻链抗体的阻断能力】
在基于珠的测定中，就它们阻断抗原E的天然的配体(配体Y)与抗原E的结合的能力测试针对抗原E产生的98种人常见轻链抗体。
将抗原E的细胞外结构域(ECD)缀合于2myc表位标签和6×组氨酸标签(抗原E-mmH)，和在MES缓冲剂中以20μg/mL的浓度胺-偶联于羧基化的微球。将混合物于室温温育2小时，之后是用1M Tris pH8.0珠灭活，之后在含0.05％(v/v)吐温-20的PBS中洗涤。然后将珠用含有2％(w/v)BSA(Sigma-Aldrich Corp.,St.louis,MO)的PBS(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)阻断。在96-孔滤板中，将含有抗原E-特异性常见轻链抗体的上清液在缓冲剂中1:15稀释。制备含有与抗体上清液具有相同的介质组分的模拟物上清液的阴性对照。将抗原E-标记的珠加入上清液，及于4℃温育过夜。以0.06nM的终浓度加入生物素化的-配体Y蛋白，及于室温温育2小时。用缀合于链霉亲和素(Moss Inc,Pasadena,MD)的R-藻红蛋白测定结合于抗原E-myc-myc-6His标记的珠的生物素化的-配体Y的检测，之后是在基于LUMINEXTM流式细胞术的分析仪中测量。自全部样品减去无配体Y的样品的背景平均荧光强度(MFI)。通过各样品的背景-减去的MFI除以调整的阴性对照值，乘以100及自100减去得到的值来计算百分率阻断。
在类似实验中，就它们阻断抗原E与配体Y-标记的珠的结合的能力测试针对抗原E产生的相同的98种人常见轻链抗体。
简言之，将配体Y以在MES缓冲剂中稀释的20μg/mL的浓度胺-偶联于羧基化的微球。混合及于室温温育2小时，之后将珠用1M Tris pH8灭活，然后在含0.05％(v/v)吐温-20的PBS中洗涤。然后将珠用含有2％(w/v)BSA(Sigma-Aldrich Corp.,St.louis,MO)的PBS(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)阻断。在96-孔滤板中，将含有抗原E-特异性常见轻链抗体的上清液在缓冲剂中1:15稀释。制备含有与抗体上清液具有相同的介质组分的模拟物上清液的阴性对照。以0.42nM的终浓度加入生物素化的-抗原E-mmH，及于4℃温育过夜。然后向抗体/抗原E混合物添加配体Y-标记的珠，及于室温温育2小时。用缀合于链霉亲和素(Moss Inc,Pasadena,MD)的R-藻红蛋白测定结合于配体Y-珠的生物素化的-抗原E-mmH的检测，之后是在基于LUMINEXTM流式细胞术的分析仪中测量。自全部样品减去无抗原E的样品的背景平均荧光强度(MFI)。通过各样品的背景-减去的MFI除以调整的阴性对照值，乘以100及自100减去得到的值来计算百分率阻断。
表7和8显示在2个LUMINEXTM测定中测试的全部98种抗-抗原E常见轻链抗体的百分率阻断。ND：未在当前实验条件下测定。
表7
Figure BDA0001655669980000901
Figure BDA0001655669980000911
Figure BDA0001655669980000921
表8
Figure BDA0001655669980000922
Figure BDA0001655669980000931
在上述第1LUMINEXTM实验中，就它们阻断配体Y与抗原E-标记的珠结合的能力测试80种含有Vκ1-39Jκ5加工的轻链的常见轻链抗体。在这80种常见轻链抗体中，68种展示>50％阻断，而12种展示<50％阻断(6种是25～50％阻断及6种是<25％阻断)。对于18种含有Vκ3-20Jκ1加工的轻链的常见轻链抗体，12种展示>50％阻断，而6种展示<50％阻断(3种是25～50％阻断及3种是<25％阻断)配体Y与抗原E-标记的珠的结合。
在上述第2LUMINEXTM实验中，就它们阻断抗原E与配体Y-标记的珠的结合的能力测试含有Vκ1-39Jκ5加工的轻链的相同的80种常见轻链抗体。在这80种常见轻链抗体中，36种展示>50％阻断，而44种展示<50％阻断(27种是25～50％阻断及17种是<25％阻断)。对于18种含有Vκ3-20Jκ1加工的轻链的常见轻链抗体而言，1种展示>50％阻断，17种展示<50％阻断(5种是25～50％阻断及12种是<25％阻断)抗原E与配体Y-标记的珠的结合。
表7和8的数据建立，描述于表5和6的重排产生了以改变功效程度阻断配体Y与其同源受体抗原E的结合的抗-抗原E-特异性常见轻链抗体，其与包含具有对于抗原E的重叠及非-重叠表位特异性的抗体的表5和6的抗-抗原E常见轻链抗体一致。
【实施例8.由ELISA确定阻断抗原-特异性常见轻链抗体的能力】
在ELISA测定中，就它们阻断抗原E与配体Y-包被的表面结合的能力测试针对抗原E产生的人常见轻链抗体。
将配体Y以在PBS中稀释的2μg/mL的浓度包被于96-孔板，及过夜温育，之后在含0.05％吐温-20的PBS中洗涤4次。然后将板用含有0.5％(w/v)BSA(Sigma-Aldrich Corp.,St.louis,MO)的PBS(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)于室温阻断1小时。在分离板中，将含有抗-抗原E常见轻链抗体的上清液在缓冲剂中1:10稀释。将具有抗体的相同的组分的模拟物上清液用作阴性对照。以0.150nM的终浓度加入抗原E-mmH(以上描述的)，及于室温温育1小时。然后向含有配体Y的板添加抗体/抗原E-mmH混合物，及于室温温育1小时。用缀合于抗-五-His抗体(Qiagen,Valencia,CA)的辣根过氧化物酶(HRP)测定与配体Y结合的抗原E-mmH的检测，及由标准比色应答，使用由硫酸中和的四甲基联苯胺(TMB)底物(BDBiosciences,San Jose,CA)显影。在OD450读取吸光度0.1s。自全部样品减去无抗原E的样品的背景吸光度。通过各样品的背景-减去的MFI除以调整的阴性对照值，乘以100及自100减去得到的值来计算百分率阻断。
表9和10显示在ELISA测定中测试的全部98种抗-抗原E常见轻链抗体的百分率阻断。ND：未在当前实验条件下测定。
表9
Figure BDA0001655669980000941
Figure BDA0001655669980000951
表10
Figure BDA0001655669980000952
Figure BDA0001655669980000961
如在此例中描述，在就它们阻断抗原E与配体Y-包被的表面结合的能力测试的含有Vκ1-39Jκ5加工的轻链的80种常见轻链抗体中，22种展示>50％阻断，58种展示<50％阻断(20种是25～50％阻断及38种是<25％阻断)。对于含有Vκ3-20Jκ1加工的轻链的18种常见轻链抗体而言，1种展示>50％阻断，17种展示<50％阻断(5种是25～50％阻断及12种是<25％阻断)抗原E与配体Y-包被的表面的结合。
这些结果也与包含具有对于抗原E的重叠及非-重叠表位特异性的抗体的抗原E-特异性常见轻链抗体库一致。
【实施例9.对于抗原-特异性常见轻链抗体的BIACORETM亲和性确定】
通过SPR(表面等离子体共振)，使用BIACORETM T100仪器(GE医疗保健)测定选择的抗体上清液的平衡解离常数(KD)。通过使用HBS-EP(10mM Hepes,150mM NaCl,0.3mM EDTA,0.05％表面活性P20,pH7.4)作为运行和样品缓冲剂，于25℃获得全部数据。在之前用高密度的抗-人Fc抗体使用标准胺偶联化学衍生的CM5传感器芯片表面自粗产物上清液样品捕获抗体。在捕获步骤期间，将上清液以3μL/min的流速注射过抗-人Fc表面总共3分钟。捕获步骤之后是以35μL/min的流速注射电泳缓冲液或100nM浓度的分析物2分钟。监测抗原自捕获的抗体的解离6分钟。由短暂注射10mM甘氨酸，pH1.5移出捕获的抗体。全部传感图通过自分析物传感图减去来自缓冲剂注射的传感图来双重参照，由此去除通过抗体自捕获表面的解离导致的伪像。各抗体的结合数据用质量运输使用BIAcore T100评估软件v2.1拟合1:1结合模型。结果显示于表11和12。
表11
Figure BDA0001655669980000971
Figure BDA0001655669980000981
表12
Figure BDA0001655669980000982
包含表5和6中显示的重排的常见轻链抗体的结合亲和力改变，几乎全部呈现nM范围的KD。亲和性数据与由描述于表5和6的高-亲和性，克隆选择的，及体细胞地突变的重排的可变结构域的组合的结合得到的常见轻链抗体一致。结合之前显示的数据，描述于表5和6的常见轻链抗体包含呈现对抗原E上的1个或更多表位的特异性的一批多样的，高-亲和性抗体。
【实施例10.由LUMINEXTM测定确定抗原-特异性常见轻链抗体的结合特异性】
就它们与抗原E的ECD和抗原E ECD变体结合的能力测试选择的抗-抗原E常见轻链抗体，所述变体包括食蟹猴直系同原物(Mf抗原E)(其不同于人蛋白大致10％的其氨基酸残基)；自ECD的C-末端缺少最后10个氨基酸的抗原E的缺失突变体(抗原E-ΔCT)；及在怀疑的与配体Y相互作用的位置含有丙氨酸取代的2种突变体(抗原E-Ala1和抗原E-Ala2)。抗原E蛋白在CHO细胞中产生，和各含有myc-myc-His C-端标签。
为了结合研究，通过与用抗-myc单克隆抗体(MAb 9E10,杂交瘤细胞系CRL-1729TM；ATCC,Manassas,VA)共价包被的1×106微球(LUMINEXTM)珠于室温温育2小时来从1mL的培养基捕获抗原EECD蛋白或变体蛋白(以上描述的)。然后在使用之前将珠用PBS洗涤。将含有抗-抗原E常见轻链抗体的上清液在缓冲剂中1:4稀释，及添加到96-孔滤板。将无抗体的模拟物上清液用作阴性对照。然后将含有捕获的抗原E蛋白的珠添加到抗体样品(每孔3000珠)，及于4℃温育过夜。次日，洗涤样品珠及用缀合了R-藻红蛋白的抗-人IgG抗体检测结合的常见轻链抗体。用基于LUMINEXTM流式细胞术的分析仪测量珠(对于与各抗原E蛋白结合的各抗体样品计数大致100珠)的荧光强度，及记录每珠/抗体相互作用至少100计数的珠的中位荧光强度(MFI)。结果显示于表13和14。
表13
Figure BDA0001655669980000991
Figure BDA0001655669980001001
Figure BDA0001655669980001011
表14
Figure BDA0001655669980001012
抗-抗原E常见轻链抗体上清液呈现与连接于抗原E-ECD的珠结合的高特异性。对于这些珠，阴性对照模拟物上清液当与抗原E-ECD珠样品组合时导致可忽略信号(<10MFI)，然而含有抗-抗原E常见轻链抗体的上清液呈现强结合信号(98种抗体上清液是2627的平均MFI；91/98的抗体样品是MFI>500)。
作为选择的抗-抗原E常见轻链抗体鉴定抗原E的ECD上的不同表位的能力的量度，测定抗体与变体的相对结合。为天然抗原E-ECD结合研究，向上述抗-myc LUMINEXTM珠捕获全部4种抗原E变体，及测定相对结合比(MFI变体/MFI抗原 E-ECD)。对于表12和13中显示的98个测试的常见轻链抗体上清液，各变体的平均比(MFI变体/MFI抗原 E-ECD)不同，可能反映珠上蛋白的不同捕获量(抗原E-ΔCT,抗原E-Ala1,抗原E-Ala2和Mf抗原E的平均比分别是0.61,2.9,2.0和1.0)。对于各蛋白变体，98个测试的常见轻链抗体的子集的结合显示大大减小的结合，指示对表征给定变体的突变的灵敏度。例如，常见轻链抗体样品中的19个以<8％的MFI变体/MFI抗原 E-ECD结合Mf抗原E。由于此组中的许多包括高或中度高亲和性抗体(5个KD<5nM,15个KD<50nM)，此组的更低信号源于对于天然抗原E-ECD和给定变体之间的序列(表位)差异而非自更低亲和性的灵敏度是可能的。
这些数据建立，描述于表5和6的常见轻链抗体表示一个多样的组的特异性识别抗原E上的多于1个表位的抗原-E-特异性常见轻链抗体。
【实施例11.常见轻链抗体中的轻链改组】
就用种系Vκ1-39Jκ5或种系Vκ3-20Jκ1加工的轻链修复重链之后与抗原E结合测试选择的抗原-特异性常见轻链抗体的重链(如描述于实施例1)。
简言之，用种系Vκ1-39或种系Vκ3-20加工的轻链转染抗原E-特异性常见轻链抗体(Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1)的247种重链，及就与抗原E结合由LUMINEXTM测定再筛选(如描述于实施例7和实施例10)。与抗原E结合由BIACORETM确认(如描述于实施例9)。结果显示于表15。
如显示于此例，特异于抗原E的28种常见轻链抗体能当用轻链的种系形式修复时与抗原E结合。
表15
Figure BDA0001655669980001021
Figure BDA0001655669980001031
【实施例12.常见轻链抗体中的重链基因利用和体细胞超突变频度】
Figure BDA0001655669980001032
小鼠(例如,US 6,596,541和US 7,105,348)中产生的抗体的重和轻链序列(>6000)用由多-抗原免疫方案，采用加工的轻链小鼠获得的常见轻链抗体的重和轻链序列(>600)编译(以上描述的)，以比较抗体链的重链基因段利用和体细胞超突变频度。
重链基因利用.就重链基因段利用分析从用人细胞-表面受体(抗原E)，2种人细胞-表面糖蛋白的异源二聚体(抗原F)，人细胞因子受体(抗原G)和人肿瘤分化抗原(抗原H)免疫的含有内源性小鼠重链座位被人VH，DH和JH基因段取代和内源性小鼠κ轻链座位被加工的种系Vκ1-39Jκ5人轻链区或加工的种系Vκ3-20Jκ1人轻链区取代的
Figure BDA0001655669980001033
小鼠(如描述于实施例2)获得的重和轻链序列，和记录VH和JH基因段。结果显示于表16～18。表16～18中的百分率表示四舍五入的值，及在一些情况中，当加在一起时可不等于100％。
表16显示来自
Figure BDA0001655669980001034
小鼠的抗体(VI)，来自
Figure BDA0001655669980001035
小鼠的具有同源Vκ1-39轻链的抗体(VI-Vκ1-39)，来自Vκ1-39加工的轻链小鼠的抗体(Vκ1-39)，来自
Figure BDA0001655669980001036
小鼠的具有同源Vκ3-20轻链的抗体(VI-Vκ3-20)，及来自Vκ3-20加工的轻链小鼠的抗体(Vκ3-20)的百分率重链家族利用。表17显示来自
Figure BDA0001655669980001037
小鼠的抗体(VI)，来自
Figure BDA0001655669980001038
小鼠的具有同源Vκ1-39轻链的抗体(VI-Vκ1-39)，来自Vκ1-39加工的轻链小鼠的抗体(Vκ1-39)，来自
Figure BDA0001655669980001039
小鼠的具有同源Vκ3-20轻链的抗体(VI-Vκ3-20)，及来自Vκ3-20加工的轻链小鼠的抗体(Vκ3-20)的百分率VH和JH基因利用。表18显示来自自各免疫组(抗原E,F,G和H)的Vκ1-39加工的轻链小鼠(Vκ1-39小鼠)的抗体的百分率VH基因利用和来自自选择的免疫组(抗原E和G)的Vκ3-20加工的轻链小鼠(Vκ3-20小鼠)的抗体的百分率VH基因利用。
如显示于此例，由VH家族III亚组(VH3-7,VH3-9,VH3-11,VH3-13,VH3-20,VH3-23,VH3-30,VH3-33和VH3-48)的优势表征在Vκ1-39Jκ5-加工的轻链小鼠中测试的抗原的重链基因利用。其他VH家族亚组的可注意的利用由VH1-18，VH1-69，VH2-5，VH4-59和VH6-1的利用表征。对于在Vκ3-20Jκ1加工的轻链小鼠中测试的抗原，重链基因利用由VH家族III，VH家族IV和VH家族V亚组(VH3-11,VH3-30,VH3-33,VH4-39,VH4-59和VH5-51)的优势表征。其他VH家族亚组的可注意的利用由VH1-18，VH1-69，VH2-70和VH6-1的利用表征。
体细胞超突变频度。将来自在
Figure BDA0001655669980001041
小鼠和加工的轻链小鼠(以上描述的)中产生的抗体的重和轻链根据为各重和/或轻链展示的重和轻链基因利用，与种系序列比对。计算各序列的重和轻链的各框架区(FW)和互补决定区(CDR)的氨基酸变化。结果显示于表19～22。表21～24中的百分率表示四舍五入的值，及在一些情况中当加在一起时可不等于100％。
表19显示自
Figure BDA0001655669980001042
小鼠的抗体重链，自Vκ1-39加工的轻链小鼠(Vκ1-39小鼠)的抗体重链和自Vκ3-20加工的轻链小鼠(Vκ3-20小鼠)的抗体重链的各FW和CDR区中观察的氨基酸(AA)变化的数。表20显示自
Figure BDA0001655669980001043
小鼠的抗体轻链，自Vκ1-39加工的小鼠(Vκ1-39小鼠)的抗体轻链和自Vκ3-20加工的小鼠(Vκ3-20小鼠)的抗体轻链的各FW和CDR区中观察的氨基酸(AA)变化的数。表21显示来自用于选择的免疫组(抗原E,F和H)的Vκ1-39加工的轻链小鼠(Vκ1-39小鼠)的抗体重链的各FW和CDR区中观察的氨基酸(AA)变化的数。表22显示来自用于选择的免疫组(抗原E和G)的Vκ3-20加工的轻链小鼠(Vκ3-20小鼠)的抗体重链的各FW和CDR区中观察的氨基酸(AA)变化的数。
表16
Figure BDA0001655669980001044
Figure BDA0001655669980001051
表17
Figure BDA0001655669980001052
Figure BDA0001655669980001061
Figure BDA0001655669980001062
表18
Figure BDA0001655669980001063
Figure BDA0001655669980001071
表19
Figure BDA0001655669980001072
Figure BDA0001655669980001073
Figure BDA0001655669980001074
Figure BDA0001655669980001081
表20
Figure BDA0001655669980001082
Figure BDA0001655669980001083
Figure BDA0001655669980001084
表21
Figure BDA0001655669980001085
Figure BDA0001655669980001091
Figure BDA0001655669980001092
Figure BDA0001655669980001093
表22
Figure BDA0001655669980001094
Figure BDA0001655669980001095
Figure BDA0001655669980001101
【实施例13.具有通用轻链的双特异性抗体的结合亲和性】
自区选择的单特异性抗-抗原E常见轻链抗体的克隆的人重链可变(描述于实施例5)，使用本领域知道的标准物重组DNA技术构建完全人双特异性抗体。表23显示来自选择的亲本单特异性抗体的人重链(HC-1和HC-2)的配对；各对随种系重排的人Vκ1-39/Jκ1轻链采用而用于各双特异性抗体的构建。
通过使用实时表面等离子体共振生物传感器测定，在BIACORETM2000仪器(GEHealthcare)上测定双特异性或亲本单特异性抗-抗原E抗体与抗原E的细胞外结构域(ECD)的结合。使用EDC-NHS化学经抗-c-myc-特异性单克隆抗体(克隆#9E10)衍生的CM5BIACORETM传感器表面用于捕获抗原E(抗原E-mmh)的C-端myc-myc-六组氨酸标记的ECD。在BIACORETM传感器表面捕获约190RU的抗原E-mmh，之后以50μl/min的流速注射300nM和50nM浓度的不同双特异性或亲本单特异性抗-抗原E抗体。实验在HBST电泳缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％v/v表面活性剂P20)中于25℃实施。在抗体注射结束之前3s记录与300nM浓度的抗原E-mmh表面结合的抗体量及标绘。
表24和图8显示为各双特异性抗体(BsAb)和单特异性亲本抗体(PAb-1,PAb-2)观察的结合应答(BIACORETM单元；RU)。由于在饱和下条件在同一抗原E-mmh表面注射各抗体，结合应答反映与抗原捕获表面结合的各抗体的结合化学计量。
如显示于此例，各双特异性抗体的观察到的结合应答是各亲本单特异性抗体的结合应答的大致2倍(表24和图8)，展示使用抗原-特异性单克隆抗体的重链和常见轻链的双特异性抗体的功能性构建，其中双特异性抗体分子中的各Fab臂同时与细胞表面受体的细胞外结构域上的不同表位结合(抗原E；见图7B,左下部)。
表23
Figure BDA0001655669980001111
表24
Figure BDA0001655669980001112
【实施例14.表达2种人轻链的小鼠的产生和分析】
使用以上在实施例2中所述方法，构建含有2个人Vκ基因段(例如,人Vκ1-39和人Vκ3-20基因段)的2种另外的加工的轻链座位(图9)。1种加工的轻链座位含有未重排的构型(DLC-5J)的2个人Vκ基因段和5个人Jκ基因段。第2加工的轻链座位含有未重排的构型(DLC-1J)的2个人Vκ基因段和1人Jκ基因段。对于2种另外的加工的轻链座位中的每一种，人基因段在3’侧接重组信号序列，允许B细胞中人基因段的体内重排。
将独立地含有可操作地连接于小鼠序列(即,内源性免疫球蛋白κ轻链座位的上游和下游序列)的各加工的轻链座位的修饰的BACDNA克隆由PCR，使用位于含有2个人Vκ基因段的各加工的轻链座位之内的序列的引物确认，之后电穿孔到ES细胞而产生表达2个人Vκ基因段之任何的小鼠(如上所述)。将含有上述加工的轻链座位之任何的阳性ES细胞克隆由TAQMANTM筛选及使用特异于加工的轻链座位的探针的核型分析确认(如上所述)。然后使用确认的ES细胞克隆移植雌性小鼠而生产一窝表达与小鼠Cκ结构域融合的人轻链可变结构域的幼仔，在本文指称为双轻链(DLC)小鼠。
或者，带有加工的轻链座位的ES细胞可用表达FLP的构建体转染，以便移出由靶向构建体导入的FRTed新霉素盒。任选地，由培育为表达FLP重组酶的小鼠移出新霉素盒(例如,US 6,774,279)。任选地，新霉素盒保留在小鼠中。
流氏细胞术.由脾细胞和骨髓制备物的流式细胞术分析确认DLC小鼠中的B细胞群和B细胞发育。通过使用标准方法(以上描述的)制造来自对于2个人Vκ基因段和5个人Jκ基因段纯合的小鼠(n＝4)，对于2个人Vκ基因段和1人Jκ基因段纯合的小鼠(n＝4)，及野生型小鼠(n＝4)的细胞悬浮液，及用荧光标记的抗体(如描述于实施例3)染色。
简言之，将1×106细胞与抗-小鼠CD16/CD32(克隆2.4G2,BD Pharmigen)在冰上温育10分钟，之后用以下抗体混剂在冰上标记30分钟：APC-H7缀合的抗-小鼠CD19(克隆1D3,BD Pharmigen)，太平洋蓝缀合的抗-小鼠CD3(克隆17A2,BioLegend)，FITC缀合的抗-小鼠Igκ(克隆187.1,BD Pharmigen)或抗-小鼠CD43(克隆1B11,BioLegend)，PE缀合的抗-小鼠Igλ(克隆RML-42,BioLegend)或抗-小鼠c-kit(克隆2B8,BioLegend)，PerCP-Cy5.5缀合的抗-小鼠IgD(BioLegend)，PE-Cy7缀合的抗-小鼠IgM(克隆II/41,eBioscience)，APC缀合的抗-小鼠B220(克隆RA3-6B2,eBioscience)。染色之后，洗涤细胞及在2％甲醛中固定。在LSRII流式细胞仪上实施数据获取，及用FlowJo(Tree Star,Inc.)分析。选通：总B细胞(CD19+CD3-)，Igκ+B细胞(Igκ+Igλ-CD19+CD3-)，Igλ+B细胞(Igκ-Igλ+CD19+CD3-)。骨髓隔室的结果显示于图10A～图12B。脾隔室的结果显示于图13A～图16。
如显示于此例，DLC-5J小鼠在脾和骨髓隔室中展示正常B细胞群(图10A～16)。DLC-5J小鼠在骨髓隔室之内展示未成熟的，成熟和前/原B细胞群，其与野生型同窝动物中观察到的基本上相同。实际上，DLC-5J座位能与内源性λ轻链座位竞争而产生与在野生型小鼠中观察到的基本上相同的κ:λ比(图14B)。而且，DLC-5J小鼠与通过在脾隔室中各种阶段的B细胞的进展展示正常外周B细胞发育(例如,未成熟的,成熟,T1,T2T3,边缘区域前体,边缘区域,滤泡-I,滤泡-II,等)，与在野生型小鼠中观察到的基本上相同的方式发生(图15A～16)。相反，相比加工的κ轻链，DLC-1J小鼠展示更低B细胞总数和增加的λ轻链利用(数据未显示)。
双轻链表达。在纯合小鼠中，使用定量PCR测定，根据在实施例3中分析两个人Vκ基因段的表达。简言之，自野生型小鼠，对于小鼠重链和κ轻链可变的座位被对应人重链和κ轻链可变区座位(Hκ)取代纯合的小鼠，以及对于含有2个人Vκ基因段及5个人Jκ基因段(DLC-5J)或1个人Jκ基因段(DLC-1J)的加工的κ轻链座位纯合的小鼠的骨髓和全脾脏纯化CD19+B细胞。相对表达标准化至小鼠Cκ区的表达(n＝3～5只小鼠/组)。结果显示于图17和图18。
在DLC-5J和DLC-1J小鼠的骨髓和脾脏中检测到含有重排的人Vκ3-20或人Vκ1-39基因段的轻链的表达(图17和图18)。在骨髓隔室中，2株DLC小鼠中源于人Vκ3-20的和源于人Vκ1-39的轻链的表达相比包含小鼠Vκ和Jκ基因段被对应人Vκ和Jκ基因段取代的小鼠显著地更高(Hκ；图17)。观察到源于人Vκ3-20的轻链表达是Hκ小鼠中的约6倍(DLC-5J)～15倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠在骨髓隔室中展示DLC-5J小鼠的约2倍的源于人Vκ3-20的轻链的表达。观察到源于人Vκ1-39的轻链表达是Hκ小鼠中的约6倍(DLC-5J)～13倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠在骨髓隔室中展示DLC-5J小鼠的约2倍的源于人Vκ1-39的轻链的表达。
在脾隔室中，2株DLC小鼠中源于人Vκ3-20的和源于人Vκ1-39的轻链的表达相比Hκ小鼠显著地更高(图18)。观察到源于人Vκ3-20的轻链表达是Hκ小鼠的约4倍(DLC-5J)和8倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠在脾隔室中展示DLC-5J小鼠的约2倍的源于人Vκ3-20的轻链的表达。观察到源于人Vκ1-39的轻链表达是Hκ小鼠中的约4倍(DLC-5J)～5倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠在脾隔室中展示与DLC-5J小鼠类似的源于人Vκ1-39的轻链表达。
DLC-5J小鼠中的人VL/JL利用.就脾B细胞中的人Vκ/Jκ基因段利用，由反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)分析对于2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段纯合的小鼠(DLC-5J)。
简言之，收获来自纯合DLC-5J(n＝3)和野生型(n＝2)小鼠的脾脏及放入网格阵列的10mL的含有10％热-灭活的胚胎牛类血清的RPMI 1640(Sigma)，使用结霜的玻璃载玻片产生单细胞悬浮液。将脾细胞用离心机沉淀(以1200rpm运行5分钟)，和使红细胞在5mL的ACK裂解缓冲剂(GIBCO)中裂解3分钟。将脾细胞用PBS(IrvineScientific)稀释，用0.7μm细胞粗滤器过滤，及再次离心而沉淀细胞，之后是在1mL的PBS中重悬浮。
从沉淀的脾细胞，使用AllPrep DNA/RNA小型试剂盒(Qiagen)，根据生产商的说明书分离RNA。对脾细胞RNA，使用5’RACE(cDNA端的快速扩增)系统，用特异于小鼠Cκ基因的引物，根据生产商的说明书(Invitrogen)实施RT-PCR。特异于小鼠Cκ基因的引物是3’mIgκCRACE1(AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC；SEQ ID NO:34)和mIgκC3’-1(CTCACTGGAT GGTGGGAAGATGGA；SEQ ID NO:35)。将PCR产物凝胶-纯化，及克隆进
Figure BDA0001655669980001141
2.1-
Figure BDA0001655669980001142
载体(
Figure BDA0001655669980001143
TA
Figure BDA0001655669980001144
试剂盒,Invitrogen)，及用M13正向(GTAAAACGAC GGCCAG；SEQ IDNO:36)和M13反向(CAGGAAACAG CTATGAC；SEQ ID NO:37)位于载体之内侧接克隆位点的位置的引物测序。对于来自各脾脏样品的10个克隆进行测序。将序列与来自IMGT/V-QUEST参照目录组的小鼠和人免疫球蛋白组比较，以测定Vκ/Jκ利用。表25显示来自各脾细胞样品的RT-PCR克隆中观察到的选择的克隆的Vκ/Jκ组合。表26显示来自DLC-5J纯合小鼠的选择的RT-PCR克隆的人Vκ/人Jκ和人Jκ/小鼠Cκ连接的氨基酸序列。小写字母指示在重组期间自N和/或P添加得到的可变区或非-模板添加的氨基酸序列中的突变。
如显示于此例，对于可操作地连接于小鼠Cκ基因的2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段(DLC-5J)纯合的小鼠能有效地重组人Vκ基因段与多个人Jκ基因段而产生限制的免疫球蛋白轻链库。在表25中显示的DLC-5J纯合小鼠中的重排之中，对于Vκ1-39/Jκ2(1)，Vκ1-39/Jκ3(1)，Vκ3-20/Jκ1(7)，Vκ3-20/Jκ2(4)和Vκ3-20/Jκ3(1)观察到独特人Vκ/Jκ重排。而且，该独特重排通过自发育期间人Vκ和Jκ基因段的突变和/或重组得到的轻链的CDR3区之内的独特氨基酸的存在展示接合多样性(表26)。全部重排显示功能性连读为小鼠Cκ(表26)。
总之，这些数据展示，在全部方面，被加工为呈现不多于2个人VL基因段的选择，二者均能重排(例如,与1个或更多及,在一些实施方式中,达5个人JL基因段)及编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域的小鼠具有几乎是野生型的B细胞数和发育。该小鼠产生一批具有免疫球蛋白轻链的抗体，所述免疫球蛋白轻链具有存在于收集物中的2种可能的人VL基因段之一。此抗体收集物由小鼠响应抗原挑战产生，及相关于反向嵌合(人可变/小鼠恒定)重链的多样性。
表25
Figure BDA0001655669980001151
Figure BDA0001655669980001161
表26
Figure BDA0001655669980001162
本说明书还包括下列内容：
1.小鼠，其包含：
与小鼠或大鼠轻链恒定区可操作地连接的不多于2个人VL基因段和2个或更多人JL基因段；以及
与非-人恒定区可操作地连接的1个或更多人VH、1个或更多人DH及1个或更多人JH基因段；
其中所述人基因段能重排及编码抗体的人可变结构域，且
其中所述小鼠不包含内源性VL基因段，其能重排而形成免疫球蛋白轻链。
2.实施方式1的小鼠，其中所述轻链恒定区是大鼠Cκ区。
3.实施方式1的小鼠，其中所述轻链恒定区是小鼠Cκ区。
4.实施方式1～3之任一项的小鼠，其中2个人VL基因段与小鼠或大鼠轻链恒定区可操作地连接。
5.前述实施方式之任一项的小鼠，其中2～5个人JL基因段与小鼠或大鼠轻链恒定区可操作地连接。
6.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠包含5个人JL基因段。
7.实施方式6的小鼠，其中所述5个人JL基因段是人Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
8.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述不多于2个人VL基因段选自人Vκ1-39基因段，人Vκ3-20基因段，或其组合。
9.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述不多于2个人VL基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段。
10.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述不多于2个人VL基因段和2个或更多人JL基因段存在于内源性轻链座位。
11.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述1个或更多人VH、1个或更多人DH及1个或更多人JH基因段与小鼠恒定区可操作地连接。
12.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠包含功能性λ轻链座位。
13.实施方式1～11之任一项的小鼠，其中所述小鼠包含无功能性λ轻链座位。
14.前述实施方式之任一项的小鼠，其中与小鼠或大鼠轻链恒定区可操作地连接的不多于2个人VL基因段和2个或更多人JL基因段存在于座位，所述座位以下列顺序包含：2个人Vκ段，其为人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段，及人Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
15.前述实施方式之任一项的小鼠，其中小鼠包含图9的DLCJ-5J座位。
16.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠在骨髓中以约2.5×104～约1.5×105细胞的范围内包含由CD19+、CD43+、c-kit+表达表征的原B细胞群。
17.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠在骨髓中以约1×106～约2×106细胞的范围内包含由CD19+、CD43-、c-kit-表达表征的前B细胞群。
18.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠在骨髓中以约5×105～约7×105细胞的范围内包含由IgM+、B220int表达表征的未成熟的B细胞群。
19.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠在骨髓中以约3×104～约1.5×105细胞的范围内包含由IgM+、B220hi表达表征的成熟B细胞群。
20.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠在骨髓中以约1×106～约3×106细胞的范围内包含总CD19+B细胞群。
21.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约2×106～约7×106细胞的范围内包含CD19+脾B细胞群。
22.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约1×106～约4×106细胞的范围内包含CD19+，IgDhi，IgMlo脾B细胞群。
23.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约9×105～约2×106细胞的范围内包含CD19+，IgDlo，IgMhi脾B细胞群。
24.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约2×106～约7×106细胞的范围内包含由CD93+B220+IgMhi CD23-表达表征的移行T1脾B细胞群。
25.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约1×106～约7×106细胞的范围内包含由CD93+B220+IgMhi CD23+表达表征的移行T2脾B细胞群。
26.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约1×106～约4×106细胞的范围内包含由CD93+B220+IgMlo CD23+表达表征的移行T3脾B细胞群。
27.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约1×106～约3×106细胞的范围内包含由CD93-B220+IgMhi CD21/35hi CD23-表达表征的边缘区域脾B细胞群。
28.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约3×106～约1.5×107细胞的范围内包含由CD93-B220+CD21/35int IgMlo IgDhi表达表征的滤泡1型(FO-I)脾B细胞群。
29.前述实施方式之任一项的小鼠，其中所述小鼠以约1×106～约2×106细胞的范围内包含由CD93-B220+CD21/35int IgMint IgDhi表达表征的滤泡2型(FO-II)脾B细胞群。
30.前述实施方式之任一项的小鼠的分离的细胞。
31.实施方式30的细胞，其中所述细胞是胚胎干(ES)细胞。
32.小鼠胚胎，其包含实施方式31的ES细胞。
33.实施方式30的细胞，其中所述细胞是B细胞。
34.杂交瘤，其用实施方式33的B细胞制造。
35.实施方式1～29之任一项的小鼠用于产生抗体或鉴定编码人重链可变区的核酸序列的用途。
36.制造结合目标抗原的抗体的方法，其包括
用目标抗原免疫实施方式1～29之任一项的小鼠，
自小鼠获得免疫球蛋白可变区基因序列，以及
采用免疫球蛋白可变区基因序列而产生结合抗原的抗体。
37.实施方式36的方法，还包括：
在单细胞中表达：
(a)已被免疫的实施方式1～29之任一项的小鼠的第1VH基因序列，其中VH基因序列与人CH基因序列融合；以及
(b)VL基因序列，其中VL基因序列与人CL基因序列融合；
将细胞维持在对于表达完全人抗体足够的条件下；以及
自细胞分离抗体。
38.实施方式37的方法，其中细胞包含已被免疫的实施方式1～29之任一项的小鼠的第2VH基因序列，其中VH基因序列与人CH基因序列融合，其中第1VH基因序列编码识别第1表位的VH结构域，及第2VH基因序列编码识别第2表位的VH结构域，其中所述第1表位和第2表位不同，且其中所述第1和第2VH结构域与由VL基因序列编码的VL结构域相互作用。
39.实施方式1～29之任一项的小鼠用于制造人双特异性抗体的用途。
40.制造人双特异性抗体的方法，其中所述方法包括免疫实施方式1～29之任一项的小鼠，及使用来自小鼠的B细胞的人可变区基因序列制造双特异性抗体。
41.实施方式40的方法，其中所述方法包括：
(a)鉴定实施方式1～29之任一项的小鼠的克隆选择的淋巴细胞，其中小鼠已被免疫及被允许发展针对目标抗原的免疫应答，其中淋巴细胞表达特异性结合目标抗原的抗体；
(b)自淋巴细胞或抗体获得编码特异性结合目标抗原的人重链可变区的核苷酸序列；及，
(c)在制造双特异性抗体中采用(c)的核苷酸序列。
42.实施方式41的方法，其中为第1目标抗原第1次实施步骤(a)～(c)而产生第1人重链可变区序列，及为第2目标抗原第2次实施步骤(a)～(c)而产生第2人重链可变区序列，且其中所述第1人重链可变区序列与第1人重链恒定区融合表达而形成第1人重链，第2人重链可变区序列与第2人重链恒定区融合表达而形成第2人重链，其中所述第1和第2人重链在自Vκ1-39或Vκ3-20基因段表达的单人轻链存在下表达。
43.实施方式42的方法，其中所述方法包括：
(a)从来自下列的B细胞克隆可变重区：
●实施方式1～29之任一项的小鼠，其已被用第1免疫原免疫；以及
●相同的小鼠，或遗传上相同的不同小鼠，其已被用第2免疫原免疫
(b)在细胞中表达具有相同的重链恒定区的(a)的可变重区和相同的轻链而制造双特异性抗体。
44.实施方式43的方法，其中所述第1人重链包含消除或基本上减小第1人重链与蛋白A的亲和性的修饰，及第2人重链保留结合蛋白A的能力，其中消除或基本上减小第1人重链与蛋白A的亲和性的修饰选自95R(EU 435R)，96F(EU 436F)，及其组合。
45.实施方式1～29之任一项的小鼠用于选择人免疫球蛋白重链可变结构域基因段的用途。
46.实施方式1～29之任一项的小鼠，其已被免疫。
47.产生抗体的方法，其包括用抗原免疫实施方式1～29之任一项的小鼠，及从得到的由小鼠针对抗原产生的抗体获得重链可变区氨基酸序列，或编码核苷酸序列，及在制造抗体中利用所述重链可变区氨基酸或核酸序列。
48.实施方式47的方法，其中所述方法包括：
(a)自针对抗原的不同表位的2种不同抗体鉴定重链可变区氨基酸序列，或编码核苷酸序列，该小鼠已被免疫；或者
(b)用不同抗原免疫相同的小鼠，或实施方式1～29之任一项的其他小鼠，然后从由小鼠产生的特异于第2抗原的抗体鉴定重链可变区序列氨基酸序列，或编码核苷酸序列，
其中方法还包括使用2个不同重链可变区而产生双特异性抗体。
49.实施方式47或48的方法，其中方法还包括也自所述抗体或2种抗体鉴定轻链可变区序列。
50.实施方式49的方法，其中所述方法包括也采用在由所述方法产生的抗体中鉴定的轻链重链可变区。
序列表
<110> BABB, Robert
MCWHIRTER, John
MACDONALD, Lynn
STEVENS, Sean
DAVIS, Samuel
BUCKLER, David R.
HOSIAWA, Karolina A.
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<120> 表达限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠
<130> 2010794-0550
<150> 13/798,455
<151> 2013-03-13
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60
tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120
atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180
cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240
atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300
ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360
gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420
acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480
tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540
aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600
gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660
atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720
attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780
aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840
ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900
gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960
gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020
gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080
tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140
accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200
aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260
agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320
ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380
aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440
accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500
catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560
caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620
caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680
tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740
acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800
gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860
cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920
gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980
agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040
ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100
gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160
ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220
ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280
aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340
atcattccag gtgccagatg tgacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 2400
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 2460
aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 2520
ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 2580
accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 2640
acccctccga tcaccttcgg ccaagggaca cgactggaga ttaaacgtaa gtaatttttc 2700
actattgtct tctgaaattt gggtctgatg gccagtattg acttttagag gcttaaatag 2760
gagtttggta aagattggta aatgagggca tttaagattt gccatgggtt gcaaaagtta 2820
aactcagctt caaaaatgga tttggagaaa aaaagattaa attgctctaa actgaatgac 2880
acaaagtaaa aaaaaaaagt gtaactaaaa aggaaccctt gtatttctaa ggagcaaaag 2940
taaatttatt tttgttcact cttgccaaat attgtattgg ttgttgctga ttatgcatga 3000
tacagaaaag tggaaaaata cattttttag tctttctccc ttttgtttga taaattattt 3060
tgtcagacaa caataaaaat caatagcacg ccctaagatc tagatgcatg ctcgagtgcc 3120
atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagat 3155
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
gaacacggcg gcatcag 17
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
ccattatgat gctccatgcc tctctgttc 29
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
atcagcagaa accagggaaa gcccct 26
<210> 11
<211> 3166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60
tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120
atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180
cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240
atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300
ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360
gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420
acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480
tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540
aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600
gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660
atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720
attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780
aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840
ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900
gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960
gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020
gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080
tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140
accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200
aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260
agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320
ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380
aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440
accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500
catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560
caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620
caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680
tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740
acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800
gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860
cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920
gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980
agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040
ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100
gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160
ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220
ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280
aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340
atcattccag gtgccagatg tataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca 2400
ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta 2460
gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct 2520
atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga 2580
cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc 2640
agcagtatgg tagctcacct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta 2700
agtaattttt cactattgtc ttctgaaatt tgggtctgat ggccagtatt gacttttaga 2760
ggcttaaata ggagtttggt aaagattggt aaatgagggc atttaagatt tgccatgggt 2820
tgcaaaagtt aaactcagct tcaaaaatgg atttggagaa aaaaagatta aattgctcta 2880
aactgaatga cacaaagtaa aaaaaaaaag tgtaactaaa aaggaaccct tgtatttcta 2940
aggagcaaaa gtaaatttat ttttgttcac tcttgccaaa tattgtattg gttgttgctg 3000
attatgcatg atacagaaaa gtggaaaaat acatttttta gtctttctcc cttttgtttg 3060
ataaattatt ttgtcagaca acaataaaaa tcaatagcac gccctaagat ctagatgcat 3120
gctcgagtgc catttcatta cctctttctc cgcacccgac atagat 3166
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
tccaggcacc ctgtctttg 19
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
aagtagctgc tgctaacact ctgact 26
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
aaagagccac cctctcctgc aggg 24
<210> 15
<211> 3187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60
tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120
atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180
cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240
atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300
ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360
gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420
acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480
tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540
aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600
gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660
atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720
attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780
aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840
ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900
gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960
gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020
gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080
tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140
accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200
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agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320
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accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500
catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560
caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620
caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680
tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740
acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800
gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860
cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920
gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980
agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040
ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100
gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160
ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220
ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280
aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340
atcattccag gtgccagatg tgttgtggtc ctcagccggt gctgcatcag ccgccggcca 2400
tgtcctcggc ccttggaacc acaatccgcc tcacctgcac cctgaggaac gaccatgaca 2460
tcggtgtgta cagcgtctac tggtaccagc agaggccggg ccaccctccc aggttcctgc 2520
tgagatattt ctcacaatca gacaagagcc agggccccca ggtcccccct cgcttctctg 2580
gatccaaaga tgtggccagg aacagggggt atttgagcat ctctgagctg cagcctgagg 2640
acgaggctat gtattactgt gctatgcata actcagtgac gcatgtgttt ggcagcggga 2700
cccagctcac cgttttaagt aagtaatttt tcactattgt cttctgaaat ttgggtctga 2760
tggccagtat tgacttttag aggcttaaat aggagtttgg taaagattgg taaatgaggg 2820
catttaagat ttgccatggg ttgcaaaagt taaactcagc ttcaaaaatg gatttggaga 2880
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aaaggaaccc ttgtatttct aaggagcaaa agtaaattta tttttgttca ctcttgccaa 3000
atattgtatt ggttgttgct gattatgcat gatacagaaa agtggaaaaa tacatttttt 3060
agtctttctc ccttttgttt gataaattat tttgtcagac aacaataaaa atcaatagca 3120
cgccctaaga tctagatgca tgctcgagtg ccatttcatt acctctttct ccgcacccga 3180
catagat 3187
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
tgtcctcggc ccttgga 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
ccgatgtcat ggtcgttcct 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
acaatccgcc tcacctgcac cct 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
agcagtctgc aacctgaaga ttt 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
gtttaatctc cagtcgtgtc cctt 24
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
cctccgatca ccttc 15
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
aaaccaggga aagcccctaa 20
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
atgggacccc actttgca 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
ctcctgatct atgctgcat 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
cagcagactg gagcctgaag a 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
tgatttccac cttggtccct t 21
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
tagctcacct tggacgtt 18
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
ctcctcatct atggtgcatc ca 22
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gacccactgc cactgaacct 20
<210> 30
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
ccactggcat ccc 13
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
tgagcagcac cctcacgtt 19
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
gtggcctcac aggtatagct gtt 23
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
aagaagcaca cgactgaggc ac 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<210> 39
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120
<210> 40
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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<210> 41
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg
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100 105 110
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
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100 105 110
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115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Phe Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
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<210> 44
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg His Leu
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100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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115
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120
<210> 47
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120
<210> 49
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ile
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120

Claims (78)

1.制造结合目标抗原的抗体的方法，其包括：
(a)用目标抗原免疫小鼠，其中所述小鼠在其种系基因组中包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段，
其中所述2个未重排的人Vκ基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jκ基因段是人Jκ1基因段、人Jκ2基因段、人Jκ3基因段、人Jκ4基因段和人Jκ5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中
所述小鼠的未重排的人重链基因段能重排而产生免疫球蛋白重链可变区序列，和
所述小鼠的未重排的人κ轻链基因段能重排而产生免疫球蛋白κ轻链可变区序列，且
其中所述小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vκ基因段，
(b)获得分别编码特异性地结合目标抗原的抗体的免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域的免疫球蛋白重链可变区序列和免疫球蛋白κ轻链可变区序列，及
(c)采用所述免疫球蛋白重链可变区序列和免疫球蛋白κ轻链可变区序列而产生结合所述抗原的抗体。
2.制造结合目标抗原的抗体的方法，其包括下列步骤：
(a)用目标抗原免疫小鼠，其中所述小鼠在其种系基因组中包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段，
其中所述2个未重排的人Vκ基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jκ基因段是人Jκ1基因段、人Jκ2基因段、人Jκ3基因段、人Jκ4基因段和人Jκ5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排而分别产生免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白κ轻链可变结构域；
其中当用所述抗原免疫时，所述小鼠产生抗体，
其中所述抗体各包含可操作地连接于小鼠重链恒定区的人重链可变结构域和可操作地连接于轻链恒定区的人轻链可变结构域；且
其中所述小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vκ基因段；及
(b)测定特异性地结合所述抗原且被所述遗传修饰的小鼠产生的抗体的人重链可变结构域序列，和测定特异性地结合所述抗原且被所述遗传修饰的小鼠产生的抗体的人κ轻链可变结构域序列；及
(c)采用所述免疫球蛋白重链可变结构域序列和免疫球蛋白κ轻链可变结构域序列而产生结合所述抗原的抗体。
3.权利要求1的方法，其中采用所述免疫球蛋白重链可变区序列和免疫球蛋白κ轻链可变区序列包含：
采用可操作地连接于人重链恒定区序列的(b)的免疫球蛋白重链可变区序列，和
采用可操作地连接于人轻链恒定区序列的(b)的免疫球蛋白κ轻链可变区序列。
4.权利要求3的方法，其中采用所述可操作地连接于人重链恒定区序列的(b)的人重链可变区序列包含表达所述(b)的人重链可变区序列和所述人重链恒定区序列。
5.权利要求3的方法，其中采用所述可操作地连接于人轻链恒定区序列的(b)的人κ轻链可变区序列包含表达所述(b)的人κ轻链可变区序列和所述人轻链恒定区序列。
6.权利要求2的方法，其中采用所述人重链可变结构域序列和κ轻链可变结构域序列包含
采用可操作地连接于人重链恒定区序列的(b)的人重链可变结构域序列，和
采用可操作地连接于人轻链恒定区序列的(b)的人κ轻链可变结构域序列。
7.权利要求3或6的方法，其中采用所述可操作地连接于人重链恒定区序列的(b)的人重链可变结构域序列包含表达编码所述(b)的人重链可变结构域序列和所述人重链恒定区序列的核苷酸序列。
8.权利要求3或6的方法，其中采用所述可操作地连接于人轻链恒定区序列的(b)的人κ轻链可变结构域序列包含表达编码所述(b)的人κ轻链可变结构域序列和所述人轻链恒定区序列的核苷酸序列。
9.权利要求1或2的方法，其中所述小鼠种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段可操作地连接于小鼠轻链恒定区序列。
10.权利要求9的方法，其中所述小鼠轻链恒定区序列是小鼠Ck区序列。
11.权利要求9的方法，其中所述小鼠种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段存在于内源性免疫球蛋白轻链座位。
12.权利要求11的方法，其中所述小鼠种系基因组以下列顺序包含：所述人Vk1-39基因段、所述人Vk3-20基因段、所述人Jk1基因段、所述人Jk2基因段、所述人Jk3基因段、所述人Jk4基因段和所述人Jk5基因段。
13.权利要求1或2的方法，其中所述小鼠种系基因组中的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段存在于内源性免疫球蛋白重链座位。
14.权利要求13的方法，其中所述小鼠不包含能重排而形成免疫球蛋白重链可变区的内源性小鼠免疫球蛋白VH基因段。
15.权利要求1或2的方法，其中所述小鼠包含无功能免疫球蛋白λ轻链座位。
16.制造抗体的方法，其包括：
(1)在单细胞中表达：
(a)编码第1免疫球蛋白重链的第1核酸序列，所述第1核酸序列包含可操作地连接于人重链恒定区序列的第1人重链可变区序列，
其中所述第1人重链可变区序列获自第1小鼠的B细胞，
其中所述第1小鼠已用包括第1表位的第1目标抗原免疫，且所述第1小鼠在其种系基因组中包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段，
其中所述2个未重排的人Vk基因段是人Vk1-39基因段和人Vk3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jk基因段是人Jk1基因段、人Jk2基因段、人Jk3基因段、人Jk4基因段和人Jk5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述第1小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻链可变结构域；
其中所述第1小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vk基因段；且
其中所述第1人重链可变区序列编码随κ轻链可变结构域识别所述第1表位的第1人重链可变结构域；及
(b)编码免疫球蛋白轻链的第2核酸序列，所述第2核酸序列包含可操作地连接于人轻链恒定区序列的人κ轻链可变区序列，其中所述人κ轻链可变区序列包含：人Vk1-39基因段、人Vk3-20基因段或其体细胞地超突变的形式；
(2)在足以表达完全人抗体的条件下维持所述细胞；及
(3)分离所述抗体。
17.权利要求16的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段可操作地连接于小鼠轻链恒定区序列。
18.权利要求17的方法，其中所述第1小鼠的小鼠轻链恒定区序列是小鼠Ck区序列。
19.权利要求17的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段存在于内源性免疫球蛋白轻链座位。
20.权利要求19的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组以下列顺序包含：所述人Vk1-39基因段、所述人Vk3-20基因段、所述人Jk1基因段、所述人Jk2基因段、所述人Jk3基因段、所述人Jk4基因段和所述人Jk5基因段。
21.权利要求16的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组中的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段存在于内源性免疫球蛋白重链座位。
22.权利要求21的方法，其中所述第1小鼠不包含能重排而形成重链可变区的内源性小鼠VH基因段。
23.权利要求16的方法，其中所述第1小鼠包含无功能免疫球蛋白λ轻链座位。
24.权利要求16～23之任一项的方法，
其中所述细胞包含编码第2免疫球蛋白重链的第3核酸序列，所述第3核酸序列包含可操作地连接于人重链恒定区序列的第2人重链可变区序列，
其中所述第2人重链可变区序列获自第2小鼠的B细胞，
其中所述第2小鼠已用包括第2表位的第2目标抗原免疫，且所述第2小鼠在其种系基因组中包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段，
其中所述2个未重排的人Vk基因段是人Vk1-39基因段和人Vk3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jk基因段是人Jk1基因段、人Jk2基因段、人Jk3基因段、人Jk4基因段和人Jk5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述第2小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻链可变结构域；且
其中所述第2人重链可变区序列编码随κ轻链可变结构域识别所述第2表位的第2人重链可变结构域，其中所述第1表位和所述第2表位不相同，且
其中所述第1和所述第2人免疫球蛋白重链与由所述第2核酸序列编码的人免疫球蛋白轻链配对。
25.权利要求24的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段可操作地连接于小鼠轻链恒定区序列。
26.权利要求25的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段存在于内源性免疫球蛋白轻链座位。
27.权利要求26的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组以下列顺序包含：所述人Vk1-39基因段、所述人Vk3-20基因段、所述人Jk1基因段、所述人Jk2基因段、所述人Jk3基因段、所述人Jk4基因段和所述人Jk5基因段。
28.权利要求25的方法，其中所述第2小鼠的小鼠轻链恒定区序列是小鼠Ck区序列。
29.权利要求24的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组中的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段存在于内源性免疫球蛋白重链座位。
30.权利要求29的方法，其中所述第2小鼠不包含能重排而形成免疫球蛋白重链可变区的内源性小鼠VH基因段。
31.权利要求24的方法，其中所述第2小鼠包含无功能免疫球蛋白λ轻链座位。
32.权利要求24的方法，其中
所述第1目标抗原和所述第2目标抗原是相同的目标抗原，且
所述第1和所述第2表位是相同的抗原上的不同表位。
33.权利要求24的方法，其中所述第1小鼠和所述第2小鼠是相同的小鼠。
34.权利要求24的方法，其中
所述第1和/或第2小鼠的种系基因组中的人Vκ1-39基因段是人种系Vκ1-39基因段，且
所述第1和/或第2小鼠的种系基因组中的人Vκ3-20基因段是人种系Vκ3-20基因段。
35.权利要求24的方法，其中所述第2核酸序列包含选自SEQ ID NO：38-49的hVκ/hJκ/mCκ连接序列。
36.权利要求24的方法，其中由所述方法制造的抗体是双特异性抗体。
37.产生宿主细胞的方法，其包括向宿主细胞导入：
(a)编码第1免疫球蛋白重链的第1核酸序列，所述第1核酸序列包含可操作地连接于人重链恒定区序列的第1人重链可变区序列，
其中所述第1人重链可变区序列获自第1小鼠的B细胞，且
其中所述第1小鼠已用包括第1表位的第1目标抗原免疫，且所述第1小鼠在其种系基因组中包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段，
其中所述2个未重排的人Vk基因段是人Vk1-39基因段和人Vk3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jk基因段是人Jk1基因段、人Jk2基因段、人Jk3基因段、人Jk4基因段和人Jk5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述第1小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻可变结构域；
其中所述第1小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vk基因段；且
其中所述第1人重链可变区序列编码随κ轻链可变结构域识别所述第1表位的第1人重链可变结构域；及
(b)编码免疫球蛋白轻链的第2核酸序列，所述第2核酸序列包含可操作地连接于人轻链恒定区序列的人κ轻链可变区序列，其中所述人κ轻链可变区序列包含：人Vk1-39基因段、人Vk3-20基因段或其体细胞地超突变的形式。
38.权利要求37的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段可操作地连接于小鼠轻链恒定区序列。
39.权利要求38的方法，其中所述第1小鼠的小鼠轻链恒定区序列是小鼠Ck区序列。
40.权利要求38的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段存在于内源性免疫球蛋白轻链座位。
41.权利要求40的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组以下列顺序包含：所述人Vk1-39基因段、所述人Vk3-20基因段、所述人Jk1基因段、所述人Jk2基因段、所述人Jk3基因段、所述人Jk4基因段和所述人Jk5基因段。
42.权利要求37的方法，其中所述第1小鼠的种系基因组中的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段存在于内源性免疫球蛋白重链座位。
43.权利要求42的方法，其中所述第1小鼠不包含能重排而形成重链可变区的内源性小鼠VH基因段。
44.权利要求37的方法，其中所述第1小鼠包含无功能免疫球蛋白λ轻链座位。
45.权利要求37～44之任一项的方法，
其中所述宿主细胞包含编码第2免疫球蛋白重链的第3核酸序列，所述第3核酸序列包含可操作地连接于人重链恒定区序列的第2人重链可变区序列，
其中所述第2人重链可变区序列获自第2小鼠的B细胞，
其中所述第2小鼠已用包括第2表位的第2目标抗原免疫，且所述第2小鼠在其种系基因组中包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段，
其中所述2个未重排的人Vk基因段是人Vk1-39基因段和人Vk3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jk基因段是人Jk1基因段、人Jk2基因段、人Jk3基因段、人Jk4基因段和人Jk5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述第2小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻链可变结构域；且
其中所述第2人重链可变区序列编码随κ轻链可变结构域识别所述第2表位的第2人重链可变结构域，
其中所述第1表位和所述第2表位不相同，且
其中所述第1和所述第2人免疫球蛋白重链与由所述第2核酸序列编码的人免疫球蛋白轻链配对。
46.权利要求45的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段可操作地连接于小鼠轻链恒定区序列。
47.权利要求46的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段存在于内源性免疫球蛋白轻链座位。
48.权利要求47的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组以下列顺序包含：所述人Vk1-39基因段、所述人Vk3-20基因段、所述人Jk1基因段、所述人Jk2基因段、所述人Jk3基因段、所述人Jk4基因段和所述人Jk5基因段。
49.权利要求46的方法，其中所述第2小鼠的小鼠轻链恒定区序列是小鼠Ck区序列。
50.权利要求45的方法，其中所述第2小鼠的种系基因组中的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段存在于内源性免疫球蛋白重链座位。
51.权利要求50的方法，其中所述第2小鼠不包含能重排而形成免疫球蛋白重链可变区的内源性小鼠VH基因段。
52.权利要求45的方法，其中所述第2小鼠包含无功能免疫球蛋白λ轻链座位。
53.权利要求45的方法，其中
所述第1目标抗原和所述第2目标抗原是相同的目标抗原，且
所述第1和所述第2表位是相同的抗原上的不同表位。
54.权利要求47的方法，其中所述第1小鼠和所述第2小鼠是相同的小鼠。
55.权利要求45的方法，其中
所述第1和/或第2小鼠的种系基因组中的人Vκ1-39基因段是人种系Vκ1-39基因段，且
所述第1和/或第2小鼠的种系基因组中的人Vκ3-20基因段是人种系Vκ3-20基因段。
56.权利要求45的方法，其中所述第2核酸序列包含选自SEQ ID NO：38-49的hVκ/hJκ/mCκ连接序列。
57.权利要求45的方法，其中所述宿主细胞表达双特异性抗体。
58.产生人免疫球蛋白重链可变区序列和κ轻链可变区序列的方法，其包括：
(a)用抗原免疫遗传修饰的小鼠，
其中当用所述抗原免疫时，所述小鼠产生抗体，且
其中所述小鼠具有种系基因组，所述种系基因组包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段，
其中所述2个未重排的人Vκ基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jκ基因段是人Jκ1基因段、人Jκ2基因段、人Jκ3基因段、人Jκ4基因段和人Jκ5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻可变结构域，且
其中所述小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vκ基因段，及
(b)测定编码特异性地结合所述抗原且被所述遗传修饰的小鼠产生的抗体的人重链可变结构域和κ轻链可变结构域的人免疫球蛋白重链可变区序列和κ轻链可变区序列。
59.产生抗体的人重链可变结构域序列和κ轻链可变结构域序列的方法，其包括：
(a)用抗原免疫遗传修饰的小鼠，
其中当用所述抗原免疫时，所述小鼠产生抗体，且
其中所述小鼠具有种系基因组，所述种系基因组包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段，
其中所述2个未重排的人Vκ基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jκ基因段是人Jκ1基因段、人Jκ2基因段、人Jκ3基因段、人Jκ4基因段和人Jκ5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻可变结构域，且
其中所述小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vκ基因段，及
(b)测定特异性地结合所述抗原且被所述遗传修饰的小鼠产生的抗体的人重链可变结构域序列和κ轻链可变结构域序列。
60.权利要求59的方法，其中测定人重链可变结构域序列和κ轻链可变结构域序列包含测定编码所述人重链可变结构域序列和κ轻链可变结构域序列的核苷酸序列。
61.权利要求58或59的方法，其中所述小鼠种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段可操作地连接于小鼠轻链恒定区序列。
62.权利要求61的方法，其中所述小鼠轻链恒定区序列是小鼠Ck区序列。
63.权利要求61的方法，其中所述小鼠种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段存在于内源性免疫球蛋白轻链座位。
64.权利要求63的方法，其中所述小鼠种系基因组以下列顺序包含：所述人Vk1-39基因段、所述人Vk3-20基因段、所述人Jk1基因段、所述人Jk2基因段、所述人Jk3基因段、所述人Jk4基因段和所述人Jk5基因段。
65.权利要求58或59的方法，其中所述小鼠种系基因组中的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段存在于内源性免疫球蛋白重链座位。
66.权利要求65的方法，其中所述小鼠不包含能重排而形成免疫球蛋白重链可变区的内源性小鼠免疫球蛋白VH基因段。
67.权利要求58或59的方法，其中所述小鼠包含无功能免疫球蛋白λ轻链座位。
68.制造编码完全人重链和完全人κ轻链的核苷酸序列的方法，其包括下列步骤：
(a)用抗原免疫遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠具有种系基因组，所述种系基因组包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段，
其中所述2个未重排的人Vκ基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jκ基因段是人Jκ1基因段、人Jκ2基因段、人Jκ3基因段、人Jκ4基因段和人Jκ5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻可变结构域，且
其中所述小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vκ基因段，及
(b)测定分别编码特异性结合所述抗原且被所述遗传修饰的小鼠产生的抗体的人重链可变结构域和κ轻链可变结构域的人重链可变区序列和κ轻链可变区序列；及
(c)将所述人重链可变区序列可操作地连接于人重链恒定区序列而形成编码完全人重链的核苷酸序列和将所述人κ轻链可变区序列可操作地连接于人κ轻链恒定区序列而形成编码完全人κ轻链的核苷酸序列。
69.制造完全人重链和完全人κ轻链的方法，其包括下列步骤：
(a)用抗原免疫遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠具有种系基因组，所述种系基因组包含：
(i)可操作地连接于轻链恒定区序列的2个未重排的人Vκ基因段和5个未重排的人Jκ基因段，
其中所述2个未重排的人Vκ基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段，且
其中所述5个未重排的人Jκ基因段是人Jκ1基因段、人Jκ2基因段、人Jκ3基因段、人Jκ4基因段和人Jκ5基因段；及
(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区序列的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段；
其中所述小鼠的未重排的人重链基因段和未重排的人κ轻链基因段能重排且分别编码抗体的人重链可变结构域和人κ轻可变结构域，且
其中所述小鼠不包含能重排而形成轻链可变区序列的内源性Vκ基因段，及
(b)测定特异性地结合所述抗原且被所述遗传修饰的小鼠产生的抗体的人重链可变结构域序列和κ轻链可变结构域序列；及
(c)将所述人重链可变结构域序列可操作地连接于人重链恒定区序列而形成完全人重链和将所述人κ轻链可变结构域序列可操作地连接于人κ轻链恒定区序列而形成完全人κ轻链。
70.权利要求69的方法，其中测定人重或κ轻链可变结构域序列包含测定分别编码所述人重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列的核苷酸序列。
71.权利要求69的方法，其中将所述人重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列分别可操作地连接于人重或轻链恒定区序列包含将编码所述人重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列的核苷酸序列分别可操作地连接于编码所述人重链恒定区序列和轻链恒定区序列的核苷酸序列。
72.权利要求68或69的方法，其中所述小鼠种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段可操作地连接于小鼠轻链恒定区序列。
73.权利要求72的方法，其中所述小鼠轻链恒定区序列是小鼠Ck区序列。
74.权利要求68或69的方法，其中所述小鼠种系基因组中的2个未重排的人Vk基因段和5个未重排的人Jk基因段存在于内源性免疫球蛋白轻链座位。
75.权利要求74的方法，其中所述小鼠种系基因组以下列顺序包含：所述人Vk1-39基因段、所述人Vk3-20基因段、所述人Jk1基因段、所述人Jk2基因段、所述人Jk3基因段、所述人Jk4基因段和所述人Jk5基因段。
76.权利要求68或69的方法，其中所述小鼠种系基因组中的一个或多个未重排的人VH基因段、一个或多个未重排的人DH基因段和一个或多个未重排的人JH基因段存在于内源性免疫球蛋白重链座位。
77.权利要求76的方法，其中所述小鼠不包含能重排而形成免疫球蛋白重链可变区的内源性小鼠免疫球蛋白VH基因段。
78.权利要求68或69的方法，其中所述小鼠包含无功能免疫球蛋白λ轻链座位。
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