CN111019953A - 组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物 - Google Patents

组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物 Download PDF

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Abstract

本申请提供了经基因修饰的非人动物，其中所述非人动物在免疫后表达能够pH依赖地与抗原结合的抗体库。本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述动物表达来源于人源免疫球蛋白轻链可变基因区段有限的库的人源免疫球蛋白轻链可变结构域，所述经基因修饰的非人动物在其种系序列中包含组氨酸修饰。本申请提供了制备非人动物的方法，所述动物表达包含由引入免疫球蛋白轻链核苷酸序列的组氨酸密码子编码的组氨酸残基的抗体。

Description

组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修 饰的非人动物
本申请是申请号为201480061443.X的中国发明专利申请(其申请日为2014年9月18日，发明名称为“组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物”)的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2014/056285的中国国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2013年9月18日，申请号为14/030,424的美国申请的优先权。
发明领域
本申请提供了经基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述动物表达能够以pH依赖的方式与抗原结合的抗体。本申请提供了对非人动物的免疫球蛋白轻链可变区序列进行修饰的方法，其中所述修饰包含在所述轻链可变区基因中的残基(例如编码互补性决定区(CDR)中的一个或多个氨基酸的核苷酸)形成突变，以便于在体内表达含有轻链结构域的抗体，所述抗体显示出pH依赖的抗原结合。本申请还提供了制备pH依赖的抗原结合的抗体的方法。
发明背景
抗体通常包含同源二聚体的重链组分，其中各重链单体均与相同的轻链结合。具有异源二聚体重链组分(例如双特异性抗体)的抗体是理想的治疗性抗体。但是制备具有能够令人满意地与双特异性抗体各个重链结合的适宜的轻链组分的双特异性抗体已被证明是存在问题的。
在一种方法中，可以通过测定所有轻链可变结构域使用情况的统计数据、鉴定在人源抗体中使用频率最高的轻链并在体外将该轻链与具有不同特异性的两条重链配对来选择轻链。
在另一种方法中，可以通过观察噬菌体展示文库(例如含有人源轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人源scFv文库)中的轻链序列并从该文库中选择最常用的轻链可变区来选择轻链。然后可以在两条不同的目标重链上对所述轻链进行检测。
在另一种方法中，可以通过使用两条目标重链的重链可变序列作为探针检测轻链可变序列的噬菌体展示文库来选择轻链。可以选择与两条重链可变序列均结合的轻链作为所述重链的轻链。
在另一种方法中，可以将候选轻链与所述重链对应的轻链进行比对，并且在所述轻链中进行修饰以使其与两条重链对应轻链的共有序列特征更相近。如果需要将免疫源性的可能性最小化，则所述修饰优选地生成存在于公知的人源轻链序列中的序列，以使得基于用于评估免疫源性可能性的本领域公知的参数和方法(即计算机模拟(in silico)分析法和湿分析法)，蛋白水解加工不太可能生成T细胞表位。
上述所有方法都依赖于体外方法，所述方法包含多种先验限制，例如序列一致性、与特定的预选重链的结合能力等。本领域需要某种组合物和方法，所述组合物和方法不依赖于体外条件操作、取而代之的是使用在生物学上更为明智的方法以制备包含共有轻链的人源表位结合蛋白。
此外，治疗性抗体例如双特异性治疗性抗体具有一些局限性，因为其通常需要较高剂量以达到所需的疗效。这部分是由于抗体-抗原复合物被内化进入核内体(endosome)并且在称为靶介导清除的过程中被靶向到溶酶体降解。因此，本领域需要某种方法和组合物，所述方法和组合物导致更有效的抗体再循环例如双特异性抗体再循环，并通过促进在核内体隔室中抗体-抗原复合物的解离但不损害抗体与抗原的特异性和亲和性来阻止抗体降解。
发明概述
在一个方面，本发明提供了用于生成抗体或抗体可变结构域的生物系统，所述抗体或抗体可变结构域在中性pH下结合靶抗原但是在酸性pH下(例如pH 5.0-6.0)显示出与相同抗原降低的结合。所述生物系统包含非人动物，例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，所述非人动物具有包含一个或多个组氨酸修饰的重排的轻链序列(例如重排的V-J)。在各种方面，所述一个或多个组氨酸修饰在轻链CDR3密码子中。在各种方面，所述非人动物包含人源或人源化的重链免疫球蛋白基因座。在各种方面，所述非人动物包含内源性非人源重链可变基因区段被一个或多个人源重链VH、DH和JH区段取代，其中所述人源区段与非人源免疫球蛋白恒定区可操作地连接。在各种方面，本申请提供了具有通用轻链的非人动物，所述轻链含有具有非组氨酸残基被组氨酸残基取代的轻链可变结构域。在各种实施方式中，这些组氨酸修饰的通用轻链的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)被称为组氨酸通用轻链小鼠、组氨酸-ULC小鼠或HULC小鼠。
因此，在一个方面，本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述非人动物在其种系中含有免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含含有人源VL和JL区段序列的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区序列与免疫球蛋白轻链恒定区基因序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是内源性免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人动物缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链基因座在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。
在一个实施方式中，所述动物在其种系中还含有免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述序列含有与免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接的人源VH、DH和JH区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是非人源重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人源重链恒定区基因序列是内源性免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因座在内源性免疫球蛋白重链基因座。
在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码互补性决定区(CDR)的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码CDR3的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述取代是针对一个、两个、三个、四个或更多个CDR3密码子。在一个方面，包含在免疫球蛋白轻链基因座中的所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段的Vκ序列是种系Vκ1-39或Vκ3-20序列，但是进行了组氨酸修饰。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因区段。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5基因序列，并且所述Vκ1-39/Jκ5基因序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置上表达组氨酸。在另一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ3-20/Jκ1基因序列，并且所述Vκ3-20/Jκ1基因序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置上表达组氨酸。
在一个方面，本申请所述的非人动物包含对目标抗原生成应答的B细胞群，所述B细胞群富含抗体，所述抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，在酸性pH下t1/2与在中性pH下相比降低约30倍或更多。在一个实施方式中，此类富集是至少约2倍。
在一个实施方式中，所述动物表达含有人源免疫球蛋白轻链可变结构域的抗体，所述结构域在由免疫球蛋白轻链可变区基因序列中的至少一个被取代的密码子编码的氨基酸位置上具有至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基的取代。在一个实施方式中，所述动物表达尽管存在体细胞超突变但是在所表达的人源免疫球蛋白轻链可变结构域中保留了至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基取代的抗体。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。因此，在一个方面，本申请还提供了一种经基因修饰的小鼠，所述小鼠在其种系中含有免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含含有人源VL和JL区段序列的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区。
在一个实施方式中，在所述小鼠种系中的所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区基因序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列选自大鼠或小鼠的免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是小鼠序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链基因座在内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。
在另一个实施方式中，所述小鼠在其种系中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列，所述序列含有与免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接的人源VH、DH和JH区段。在一个方面，所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是大鼠或小鼠重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因座在内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座。
在一个方面，所述小鼠包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，其中所述取代在编码CDR的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述取代在CDR3密码子中，例如在一个、两个、三个、四个或更多个CDR3密码子中。在一个实施方式中，所述小鼠的免疫球蛋白轻链基因座包含来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，例如所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因序列。在一个实施方式中，所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5基因序列，并且所述Vκ1-39/Jκ5序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置上表达组氨酸。在一个实施方式中，这种取代被设计为在位置105、106、108和111取代为组氨酸。在另一个实施方式中，这种取代被设计为在位置106、108和111取代为组氨酸。
在另一个实施方式中，所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ3-20/Jκ1基因序列，并且所述Vκ3-20/Jκ1序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置上表达组氨酸。在一个实施方式中，这种取代被设计为在位置105、106、107和109取代为组氨酸。在另一个实施方式中，这种取代被设计为在位置105、106和109取代为组氨酸。
在一个实施方式中，本申请所述的小鼠包含对目标抗原生成应答的B细胞群，所述B细胞群富含抗体，所述抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，在酸性pH下t1/2与在中性pH下相比降低约30倍或更多。在一个实施方式中，此类抗体的富集是至少约2倍。
在一个实施方式中，本申请所述的小鼠表达对目标抗原生成应答的抗原特异性抗体群，其中所有抗体包含：(a)免疫球蛋白轻链可变结构域，所述结构域来源于相同单一重排的人源轻链可变区基因序列，所述序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，和(b)免疫球蛋白重链，所述重链含有来源于人源重链V、D和J区段库的重链可变结构域。
本申请还提供了非人源基因座例如小鼠基因座，所述基因座包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，所述序列含有人源VL和JL区段序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述基因座包含在非人动物的种系中。在一个实施方式中，所述基因座包含来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段(例如来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因序列)的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列。在一个实施方式中，其中在所述基因座中存在的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于重排的Vκ1-39/Jκ5序列，设计所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在另一个实施方式中，其中在所述基因座中存在的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于重排的Vκ3-20/Jκ1序列，设计至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。在各种实施方式中，可以使用下文所述的用于制备经基因修饰的非人动物的方法来生成本申请所述的非人源基因座。
在另一个方面，本申请提供了用于制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系中包含经基因修饰的免疫球蛋白轻链基因座，其中所述方法包括修饰非人动物的基因组，以便在免疫球蛋白轻链基因座中缺失内源性免疫球蛋白轻链V和J区段或使得内源性免疫球蛋白轻链V和J区段不具有功能，并且在所述基因组中放置单一重排的人源轻链可变区基因序列，所述序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。在一个实施方式中，这种方法生成经基因修饰的非人动物，所述非人动物包含富含对目标抗原表现出pH依赖性结合的抗体的B细胞群。在一个实施方式中，位于基因组中的所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20，例如重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因序列。因此，在所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ1-39/Jκ5的实施方式中，设计至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ3-20/Jκ1，设计至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。
在另一个方面，本申请提供了生成与目标抗原以pH依赖性方式结合的抗体的方法，所述方法包括：(a)生成如本申请所述的小鼠(例如在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座的小鼠，所述基因座包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，所述序列含有人源VL和JL区段序列和在其重排的轻链可变区序列中具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代)，(b)使用目标抗原免疫所述小鼠，和(c)选择在中性pH下以所需的亲和性与目标抗原结合而在酸性pH下与抗原结合降低的抗体。在一个实施方式中，所述方法生成的抗体在酸性pH和37℃下显示出的t1/2为约2分钟或更短。在一个实施方式中，所述方法生成的抗体在酸性pH下显示出的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在其他方面，本申请提供了生成与目标抗原以pH依赖性方式结合的抗体的其他方法。一个这种方法包括(a)选择与目标抗原以所需的亲和性结合的第一抗体，(b)修饰所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，(c)在细胞中表达所述第一抗体的免疫球蛋白重链和所述经修饰的免疫球蛋白轻链，并且(d)选择在所述细胞中表达的第二抗体，所述抗体在中性pH下针对目标抗原保留了所需的亲和性并且在酸性pH下针对目标抗原的结合降低。在一个实施方式中，所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列。在一个实施方式中，在非人动物例如小鼠中生成的所述第一抗体含有来源于单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链序列，并且所述免疫球蛋白轻链的修饰在所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区序列中制备。在一个实施方式中，在非人动物例如小鼠中生成的所述第一抗体还含有来源于人源VH、DH和JH区段库的免疫球蛋白重链序列。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列选自Vκ1-39/Jκ5和Vκ3-20/Jκ1基因序列。在一个实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列是Vκ1-39/Jκ5，在所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列中的修饰在CDR3密码子中的选自105、106、108、111及其组合的位置制备。在一个实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列是Vκ3-20/Jκ1，在所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列中的修饰在CDR3密码子中的选自105、106、107、109及其组合的位置制备。
在一个实施方式中，本申请所述的生成显示出以pH依赖的方式与目标抗原结合的抗体的所述方法所得到的抗体在酸性pH下显示出的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，生成所述抗体的所述方法所得到的抗体在酸性pH和37℃下显示出的t1/2为约2分钟或更短。
在其他不同的方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，例如小鼠，其包含与小鼠或大鼠轻链恒定区可操作地连接的有限的轻链可变基因区段库，例如不超过两个人源VL基因区段，和一个或多个，例如两个或多个，人源JL基因区段，以及与非人源恒定区可操作地连接的一个或多个人源VH、一个或多个人源DH和一个或多个人源JH基因区段；其中所述人源基因区段能够重排并且编码抗体的人源可变结构域，以及其中所述小鼠还不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链的内源性VL基因区段。在一个实施方式中，所述轻链恒定区是大鼠或小鼠恒定区，例如大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一个实施方式中，所述小鼠包含五个人源Jκ基因区段，例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段选自人源Vκ1-39、Vκ3-20及其组合，例如所述两个人源VL基因区段是Vκ1-39和Vκ3-20。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个)人源JL基因区段存在于内源性轻链基因座上，例如内源性κ轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠包含功能性的λ轻链基因座。在另一个实施方式中，所述小鼠包含非功能性的λ轻链基因座。在一个实施方式中，所述一个或多个人源VH、一个或多个人源DH和一个或多个人源JH基因座与小鼠或大鼠重链恒定区序列可操作地连接。
在一些实施方式中，本申请还提供了一种非人源基因座，所述非人源基因座还包含与免疫球蛋白恒定区序列(例如非人源免疫球蛋白恒定区序列，例如大鼠或小鼠序列)可操作地连接的有限的人源可变基因区段库，例如包含不超过两个人源VL基因区段和一个或多个，例如两个或多个，人源JL基因区段的非人基因座。在一个实施方式中，所述基因座包含五个人源Jκ基因区段，例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段选自Vκ1-39和Vκ3-20及其组合(例如不超过两个人源VL基因区段是Vκ1-39和Vκ3-20)。在不同实施方式中，可以使用本申请通篇描述的用于制备基因修饰的非人动物的方法生成本申请所述的非人源基因座。因此，本申请还提供了一种制备基因修饰的非人动物的方法，所述基因修饰的非人动物包含与免疫球蛋白恒定区序列(例如非人源免疫球蛋白恒定区序列，例如大鼠或小鼠序列)可操作地连接的有限的人源可变基因区段库，例如包含不超过两个人源VL基因区段和一个或多个，例如两个或多个，人源JL基因区段。
在不同方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达由两个人源Vκ基因区段中的一个和1、2、3、4或5个人源Jκ基因区段中的一个重排产生的免疫球蛋白轻链，其中所述小鼠包含全部或基本上全部内源性的免疫球蛋白VH基因区段被一个或多个人源免疫球蛋白VH、一个或多个DH和一个或多个JH基因区段的取代，以及所述小鼠显示出(a)在骨髓中表达具有λ轻链的免疫球蛋白的B细胞与(b)在骨髓中表达具有κ轻链的免疫球蛋白的B细胞的比例为约1至约15。在一些实施方式中，所述重排包括人源Vκ1-39基因区段。在一些实施方式中，所述重排包括人源Vκ3-20基因区段。在一些实施方式中，所述内源性免疫球蛋白VH基因区段的取代在内源性免疫球蛋白VH基因座。在一些实施方式中，所述两个人源Vκ基因区段在内源性免疫球蛋白Vκ基因座，以及在一些实施方式中，所述两个人源Vκ基因区段取代全部或基本上全部的小鼠免疫球蛋白Vκ基因区段。在一些实施方式中，所述两个人源Vκ基因区段在内源性免疫球蛋白Vκ基因座，以及在一些实施方式中，所述两个人源Vκ基因区段取代全部或基本上全部小鼠免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段。在不同实施方式中，所述两个人源Vκ基因区段与两个或多个(例如2、3、4、5)人源Jκ基因区段可操作地连接。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人源Vκ1-39基因区段或人源Vκ3-20基因区段与两个或多个(例如2、3、4或5)人源Jκ基因区段中的一个重排产生的轻链，并且在骨髓中表达具有λ轻链的免疫球蛋白的未成熟B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的未成熟B细胞的比例为约1至约13。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人源Vκ1-39基因区段或人源Vκ3-20基因区段与两个或多个(例如2、3、4或5)人源Jκ基因区段中的一个重排产生的轻链，并且在骨髓中表达具有λ轻链的免疫球蛋白的成熟B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的未成熟B细胞的比例为约1至约7。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人源Vκ1-39基因区段或人源Vκ3-20基因区段与两个或多个(例如2、3、4或5)人源Jκ基因区段中的一个重排产生的轻链，并且在骨髓中具有范围为约2.5x104至约1.5x105个细胞的pro B细胞群，包括例如约2.5x104、3.0x104、3.5x104、4.0x104、4.5x104、5.0x104、5.5x104、6.0x104、6.5x104、7.0x104、7.5x104、8.0x104、8.5x104、9.0x104、9.5x104、1.0x105或1.5x105个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.88x104个细胞的pro B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约6.42x104个细胞的pro B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约9.16x104个细胞的pro B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.19x105个细胞的pro B细胞群。如本申请所述的基因修饰小鼠骨髓中的示例性pro B细胞的特征为表达CD19、CD43、c-kit和/或其组合(例如CD19+、CD43+、c-kit+)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人源Vκ1-39基因区段或人源Vκ3-20基因区段与两个或多个(例如2、3、4或5)人源Jκ基因区段中的一个重排产生的轻链，并且在骨髓中具有范围为约1x106至约2x106个细胞的pre B细胞群，包括例如约1.0x106、1.1x106、1.2x106、1.3x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.7x106、1.8x106、1.9x106或2.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.25x106个细胞的pre B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.46x106个细胞的pre B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.64x106个细胞的pre B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.03x106个细胞的pre B细胞群。如本申请所述的基因修饰小鼠骨髓中的示例性pre B细胞的特征为表达CD19、CD43、c-kit和/或其组合(例如CD19+、CD43-、c-kit-)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人源Vκ1-39基因区段或人源Vκ3-20基因区段与两个或多个(例如2、3、4或5)人源Jκ基因区段中的一个重排产生的轻链，并且在骨髓中具有范围为约5x105至约7x105个细胞的未成熟B细胞群，包括例如约5.0x105、5.1x105、5.2x105、5.3x105、5.4x105、5.5x105、5.6x105、5.7x105、5.8x105、5.9x105、6.0x105、6.1x105、6.2x105、6.3x105、6.4x105、6.5x105、6.6x105、6.7x105、6.8x105、6.9x105或7.0x105个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约5.33x105个细胞的未成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约5.80x105个细胞的未成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约5.92x105个细胞的未成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约6.67x105个细胞的未成熟B细胞群。如本申请所述的基因修饰小鼠骨髓中的示例性未成熟B细胞的特征为表达IgM、B220和/或其组合(例如IgM+、B220int)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人源Vκ1-39基因区段或人源Vκ3-20基因区段与两个或多个(例如2、3、4或5)人源Jκ基因区段中的一个重排产生的轻链，并且在骨髓中具有范围为约3x104至约1.5x105个细胞的成熟B细胞群，包括例如约3.0x104、3.5x104、4.0x104、4.5x104、5.0x104、5.5x104、6.0x104、6.5x104、7.0x104、7.5x104、8.0x104、8.5x104、9.0x104、9.5x104、1.0x105或1.5x105个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约3.11x104个细胞的成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.09x105个细胞的成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.16x105个细胞的成熟B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.44x105个细胞的成熟B细胞群。如本申请所述的基因修饰小鼠骨髓中的示例性成熟B细胞的特征为表达IgM、B220和/或其组合(例如IgM+、B220hi)。
在一些实施方式中，本发明的小鼠表达通过人源Vκ1-39基因区段或人源Vκ3-20基因区段与两个或多个(例如2、3、4或5)人源Jκ基因区段中的一个重排产生的轻链，并且在骨髓中具有范围为约1x106至约3x106个细胞的总B细胞群，包括例如约1.0x106、1.1x106、1.2x106、1.3x106、1.4x106、1.5x106、1.6x106、1.7x106、1.8x106、1.9x106、2.0x106、2.1x106、2.2x106、2.3x106、2.4x106、2.5x106、2.6x106、2.7x106、2.8x106、2.9x106或2.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.59x106个细胞的总B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约1.75x106个细胞的总B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.13x106个细胞的总B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在骨髓中包含约2.55x106个细胞的总B细胞群。如本申请所述的基因修饰小鼠骨髓中的示例性总B细胞的特征为表达CD19、CD20和/或其组合(例如CD19+)。
在一些实施方式中，提供了一种基因修饰的小鼠，所述基因修饰的小鼠表达包含重排的人源免疫球蛋白Vκ/Jκ序列的免疫球蛋白轻链，其中所述小鼠包含功能性的免疫球蛋白λ轻链基因座，和其中所述小鼠包含脾脏B细胞群，所述脾脏B细胞群包含Igλ+B细胞与Igκ+B的比例为约1至约8；在一些实施方式中，约1至约5。在一些实施方式中，所述重排的人源免疫球蛋白Vκ/Jκ序列通过两个人源免疫球蛋白Vκ基因区段中的一个和1、2、3、4或5个人源免疫球蛋白Jκ基因区段中的一个重排产生。在一些实施方式中，所述重排的人源免疫球蛋白Vκ/Jκ序列通过人源免疫球蛋白Vκ1-39基因区段和选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其组合的人源免疫球蛋白Jκ基因区段重排产生。在一些实施方式中，所述重排的人源免疫球蛋白Vκ/Jκ序列通过人源免疫球蛋白Vκ3-20基因区段和选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其组合的人源免疫球蛋白Jκ基因区段重排产生。
在一些实施方式中，本发明的小鼠包含范围为约2x106至约7x106个细胞的CD19+脾脏B细胞群，包括例如约2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106或7.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约2.74x106个细胞的CD19+脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约4.30x106个细胞的CD19+脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约5.53x106个细胞的CD19+脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约6.18x106个细胞的CD19+脾脏B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠包含范围为约1x106至约4x106个细胞的CD19+、IgDhi、IgMlo脾脏B细胞群，包括例如约1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.30x106个细胞的CD19+、IgDhi、IgMlo脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约2.13x106个细胞的CD19+、IgDhi、IgMlo脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约3.15x106个细胞的CD19+、IgDhi、IgMlo脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约3.93x106个细胞的CD19+、IgDhi、IgMlo脾脏B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠包含范围为约9x105至约2x106个细胞的CD19+、IgDlo、IgMhi脾脏B细胞群，包括例如约9.0x105、9.25x105、9.5x105、9.75x105、1.0x106、1.25x106、1.50x106、1.75x106、2.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约9.52x105个细胞的CD19+、IgDlo、IgMhi脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.23x106个细胞的CD19+、IgDlo、IgMhi脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.40x106个细胞的CD19+、IgDlo、IgMhi脾脏B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠包含约1.42x106个细胞的CD19+、IgDlo、IgMhi脾脏B细胞群。
在一些实施方式中，提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包含免疫球蛋白κ轻链基因座，所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含两个未经重排的人源免疫球蛋白Vκ基因区段和两个或多个(例如2、3、4或5)未经重排的人源Jκ基因区段，和其中所述小鼠包含含有过渡性(例如T1、T2和T3)B细胞群的外周脾脏B细胞群，其与包含免疫球蛋白κ轻链V和J基因区段野生型补体的小鼠大致相同。如本申请所述的基因修饰小鼠脾脏中的示例性过渡性B细胞群(例如T1、T2和T3)的特征为表达IgM、CD23、CD93、B220和/或其组合。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含范围为约2x106至约7x106个细胞的T1 B细胞群(例如CD93+、B220+、IgMhi、CD23-)，包括例如约2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106或7.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.16x106个细胞的T1 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.63x106个细胞的T1 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.91x106个细胞的T1 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约6.83x106个细胞的T1 B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含范围为约1x106至约7x106个细胞的T2 B细胞群(例如CD93+、B220+、IgMhi、CD23+)，包括例如约1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106或7.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.30x106个细胞的T2 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.46x106个细胞的T2 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.24x106个细胞的T2B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约6.52x106个细胞的T2 B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含范围为约1x106至约4x106个细胞的T3 B细胞群(例如CD93+、B220+、IgMlo、CD23+)，包括例如约1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106或4.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.08x106个细胞的T3 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.35x106个细胞的T3 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.37x106个细胞的T3 B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.63x106个细胞的T3 B细胞群。
在一些实施方式中，提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包含免疫球蛋白κ轻链基因座，所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含两个未经重排的人源免疫球蛋白Vκ基因区段和1、2、3、4或5个未经重排的人源免疫球蛋白Jκ基因区段，和其中所述小鼠包含含有边缘区和边缘区前体B细胞群的外周脾脏B细胞群，其与包含免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段野生型补体的小鼠大致相同。如本申请所述的基因修饰小鼠脾脏中的示例性边缘区B细胞群的特征为表达IgM、CD21/35、CD23、CD93、B220和/或其组合。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含范围为约1x106至约3x106个细胞的边缘区B细胞群(例如CD93-、B220+、IgMhi、CD21/35hi、CD23-)，包括例如约1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106或3.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.47x106个细胞的边缘区B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.49x106个细胞的边缘区B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.26x106个细胞的边缘区B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.33x106个细胞的边缘区B细胞群。
在一些实施方式中，提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包含免疫球蛋白κ轻链基因座，所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含两个未经重排的人源免疫球蛋白Vκ基因区段和1、2、3、4或5个未经重排的人源免疫球蛋白Jκ基因区段，和其中所述小鼠包含含有滤泡(例如FO-I和FO-II)B细胞群的外周脾脏B细胞群，其与包含免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段野生型补体的小鼠大致相同。如本申请所述的基因修饰小鼠脾脏中的示例性滤泡B细胞群(例如FO-I和FO-II)的特征为表达IgM、IgD、CD21/35、CD93、B220和/或其组合。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含范围为约3x106至约1.5x107个细胞的1型滤泡B细胞群(例如CD93-、B220+、CD21/35int、IgMlo、IgDhi)，包括例如约3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106、7.0x106、7.5x106、8.0x106、8.5x106、9.0x106、9.5x106、1.0x107或1.5x107个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约3.57x106个细胞的1型滤泡B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约6.31x106个细胞的1型滤泡B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约9.42x106个细胞的1型滤泡B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.14x107个细胞的1型滤泡B细胞群。
在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含范围为约1x106至约2x107个细胞的2型滤泡B细胞群(例如CD93-、B220+、CD21/35int、IgMint、IgDhi)，包括例如约1.0x106、1.25x106、1.5x106、1.75x106或2.0x106个细胞；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.14x106个细胞的2型滤泡B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.45x106个细胞的2型滤泡B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约1.80x106个细胞的2型滤泡B细胞群；在一些实施方式中，本发明的小鼠在脾脏中包含约2.06x106个细胞的2型滤泡B细胞群。
在一些其他不同的方面，本申请还提供了一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接的至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段，其中所述至少一个人源VL基因区段的每一个包含至少一个不是由相应人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述非人动物不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链的内源性VL基因区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是非人源轻链恒定区序列，例如内源性免疫球蛋白轻链恒定区序列，例如大鼠或小鼠序列。在一个实施方式中，所述动物在其种系中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含与免疫球蛋白重链恒定区序列可操作地连接的含有人源VH、DH和JH基因区段的未经重排的重链可变区序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区序列是非人源免疫球蛋白重链恒定区序列，例如内源性非人源重链恒定区序列，例如大鼠或小鼠序列。在一个实施方式中，所述至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段存在于内源性免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区是Cκ区。在一个实施方式中，所述至少一个人源VL基因区段包含至少一个由相应人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述取代是在CDR3密码子中，例如三个或四个非组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述至少一个人源VL基因区段是两个人源VL基因区段，例如人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一个实施方式中，所述动物表达包含由至少一个人源VL基因片段编码的氨基酸序列的抗体和所述抗体在由至少一个所述人源VL基因区段的组氨酸密码子编码的氨基酸位置保留至少一个组氨酸残基。
在一个实施方式中，本申请还提供了一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含有限的人源轻链可变区基因区段库，例如有限的人源VL和JL基因区段库，其中所述有限的人源轻链可变基因区段库包含至少一个不是由相应的人源种系序列编码的组氨酸密码子。在一个实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含不超过两个人源VL基因区段和一个或多个，例如两个或多个，人源JL基因区段，其中不超过两个人源VL基因区段的每一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段和所述一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。在不同实施方式中，所述人源VL基因区段和人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述动物不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链的内源性VL基因区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是非人源免疫球蛋白恒定区序列，例如啮齿动物序列，例如小鼠或大鼠序列。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性序列。在另一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是人序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是Cκ序列。在一个实施方式中，所述非人动物在其种系中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含与免疫球蛋白重链恒定区序列可操作地连接的含有人源VH、DH和JH基因区段的未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区序列是非人源免疫球蛋白重链恒定区序列，例如啮齿动物序列，例如大鼠或小鼠序列。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。在一个实施方式中，所述重链恒定区序列是人源免疫球蛋白重链恒定区序列。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段存在于内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。
在一个实施方式中，本发明的非人动物包含一个或多个，例如两个或多个人源JL基因区段，和所述一个或多个，例如两个或多个人源JL基因区段是五个人源Jκ区段，例如人源Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段选自人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述不超过两个VL基因区段中的每一个包含至少一个由相应的人源种系VL区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述取代是一个、两个、三个或四个密码子(例如三个或四个密码子)。在一个实施方式中，所述取代是在CDR3密码子中。在所述实施方式中，其中所述不超过两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含至少一个由相应的人源种系VL区段编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含三个或四个组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述三个或四个取代是在CDR3区中。在一个实施方式中，其中所述取代是人源Vκ1-39基因区段的三个非组氨酸密码子，所述取代被设计为在位置106、108和111表达组氨酸。在另一个实施方式中，其中所述取代是人源Vκ1-39基因区段的四个非组氨酸密码子，所述取代被设计为在位置105、106、108和111表达组氨酸。在另一个实施方式中，其中所述取代是人源Vκ3-20基因区段的三个非组氨酸密码子，所述取代被设计为在位置105、106和109表达组氨酸。在又一个实施方式中，其中所述取代是人源Vκ3-20基因区段的四个非组氨酸密码子，所述取代被设计为在位置105、106、107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。在一个实施方式中，所述动物表达包含由所述不超过两个人源VL基因区段中的一个编码的氨基酸序列的抗体并且所述抗体在由引入人源VL基因区段的至少一个组氨酸密码子编码的氨基酸位置保留至少一个组氨酸残基。在一个实施方式中，所述动物表达对抗原产生应答的抗原特异性抗体群，其中在所述群中的所有抗体包含(a)来源于所述不超过两个VL基因区段和一个或多个例如两个或多个JL基因区段重排的免疫球蛋白轻链可变结构域，其中所述不超过两个人源VL基因区段的每一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子，和(b)包含来源于人源重链V、D和J区段库的人源重链可变结构域的免疫球蛋白重链。
在一个实施方式中，本申请所述的动物包含对目标抗原产生应答的B细胞群，所述B细胞群富含显示在酸性pH下与中性pH相比解离半衰期(t1/2)减少至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍的抗体。在一个实施方式中，所富含的此类抗体显示出t1/2减少至少约2倍。
本申请还提供了一种产生显示出与目标抗原pH依赖性结合的抗体的方法，所述方法包括产生本申请所述的非人动物(例如包含至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段的非人动物；例如包含有限的人源轻链可变区基因区段库的非人动物；例如在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座的非人动物，所述免疫球蛋白轻链基因座包含不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段——其中所述人源VL基因区段的每一个存在于所述动物的种系中，其包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子)，使用目标抗原免疫所述动物，和选择在中性pH下以所需亲和性与目标抗原结合而在酸性pH下显示出与目标抗原结合降低的抗体。
本申请还提供了一种制备在其种系中包含基因修饰的免疫球蛋白轻链基因座的非人动物的方法，所述方法包括(a)修饰所述非人动物的基因组以缺失或在免疫球蛋白轻链基因座产生非功能性的内源性免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段，和(b)在所述非人动物的基因组中安置免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段，以使得所述免疫球蛋白轻链可变区序列与免疫球蛋白恒定区序列可操作地连接；其中所述至少一个人源VL基因区段的每一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述人源VL基因区段和JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链可变区是在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述至少一个人源VL基因区段是两个人源VL基因区段，并且所述两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。在一些实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一个实施方式中，这种方法得到的非人动物包含富含对目标抗原显示出pH依赖性结合的抗体的B细胞群。
在一些实施方式中，本申请还提供了一种非人源免疫球蛋白轻链基因座，所述非人源免疫球蛋白轻链基因座包含与免疫球蛋白恒定区序列可操作地连接的至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段，其中至少一个人源VL基因区段的每一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方式中，本申请还提供了一种非人源免疫球蛋白轻链基因座，所述非人源免疫球蛋白轻链基因座包含有限的人源可变基因区段库，例如包含与免疫球蛋白恒定区序列(例如非人源免疫球蛋白恒定区序列，例如大鼠或小鼠序列)可操作地连接的不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段的非人源基因座，其中不超过两个人源VL基因区段的每一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述基因座包含五个人源Jκ基因区段，例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。在一个实施方式中，具有组氨酸修饰的所述不超过两个人源VL基因区段是Vκ1-39和Vκ3-20。在不同实施方式中，可以使用本申请通篇描述的用于制备基因修饰的非人动物的方法产生本申请所述的非人源基因座。因此，本申请还提供了一种制备基因修饰的非人动物的方法，所述基因修饰的非人动物包含至少一个VL基因区段和至少一个JL基因区段；包含有限的人源可变基因区段库；或者包含与免疫球蛋白恒定区序列(例如非人源免疫球蛋白恒定区序列，例如大鼠或小鼠序列)可操作地连接的不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段，并且其中每个人源VL基因区段包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。
本申请所述的任何实施方式和方面均可以彼此结合使用，除非另有说明或从上下文是显而易见的。通过随后的描述，其他实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简述
图1显示了来自各种抗原特异性抗体(A-K抗体，分别对应于SEQ ID NO:136-146)的人源Vκ1-39来源的轻链的氨基酸比对。位于各条轻链序列中的组氨酸(H)残基以粗体标示。在上述比对中显示出了不同的轻链区(框架和CDR)。
图2显示了在人源Vκ1-39来源的轻链CDR3区中通过诱变工程改造的组氨酸残基的组合和位置。包含了相应的核酸序列。通过诱变引入的组氨酸残基和相应的核酸残基以粗体表示。氨基酸位置(105、106等)基于Lefranc等，(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55-77中所述的独特编号，并且其也可见于国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的网站。
图3显示了以ng/mL计的在CHO细胞上清液中检测到的抗体表达的水平，所述CHO细胞经过编码五(1-5)条不同重链和Vκ1-39来源的轻链的核酸转染，所述轻链具有在CDR3中的所示位置(见X轴)经工程改造的组氨酸残基。
图4中的western印迹显示了在CHO细胞上清液中含有组氨酸工程改造的轻链的所选定的抗原特异性人源抗体的表达情况。
图5A-5E显示了在中性(7.4)和酸性(5.75)pH下来自抗原特异性抗体的选定的重链(1-5)与多种组氨酸工程改造的轻链配对的结合动力学。显示了多种动力学参数，包含ka、kd、KD和t1/2。NB＝未结合。
图6显示了包含母体通用轻链或组氨酸修饰的通用轻链与所示重链(2、3和6)配对的抗体的动力学参数(KD和t1/2)。在一些抗体中组氨酸取代导致较强的pH依赖性。在CDR3中的组氨酸取代将序列105QQSYSTP111(SEQ ID NO:3)转化为括号中组氨酸修饰的CDR3序列。注意NB＝未检测到结合(KD>10微摩)。
图7显示了经工程改造将组氨酸残基引入重排的人源Vκ1-39/Jκ5轻链序列的CDR3中时使用的选定的诱变引物的序列和性质(GC含量％，N，错配％，Tm)。在序列表中使用的这些引物的SEQ ID NO包含在下表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图8A-8B显示构建靶向载体的一般策略，所述载体用于经工程改造将组氨酸残基引入来源于Vκ1-39/Jκ5可变区的重排的人源轻链可变区序列以制备表达含有经修饰的人源轻链的抗体的经基因修饰的小鼠。图8C-8D显示了将用于ULC-H105/106/108/111取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠；而图8E-8F显示了将用于ULC-H106/108/111取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠。该图并未按照比例显示。除非另有明示，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人源序列。
图9显示了来自针对组氨酸通用轻链(HULC)为杂合子的小鼠(具有4个His取代-HULC 1927小鼠；具有3个取代-HULC 1930小鼠)和来自野生型小鼠的二次取血针对免疫原的抗血清滴度。
图10是对来自杂合子HULC(1927vs 1930)和WT小鼠的杂交瘤融合得到的抗原阳性克隆总数和显示出pH敏感性抗原结合的抗原阳性克隆数的比较。针对各种小鼠类型的图中均包含两只小鼠的数据(“小鼠1”和“小鼠2”)。
图11A-11C显示了来自表面等离子体共振结合实验的传感图，在实验中使来自杂合子HULC或WT小鼠的单克隆抗体(AA、BB、CC、DD、HH、GG、NN和OO)在中性pH(pH 7.4)下与免疫原结合，随后转移至pH 7.4或6.0的缓冲液中进行解离相。在各图中的各条线表示各抗体在不同浓度下的结合应答。所有实验均在25℃进行。解离半衰期值(t1/2)标注于各传感图的上方，t1/2的变化倍数列于各传感图的右侧。抗体AA、BB、CC、DD、HH和GG来自于使用His取代的轻链的杂合子HULC 1927小鼠，NN来自于使用WT轻链的杂合子HULC 1927小鼠和OO来自于WT小鼠(详见表4)。
图12显示了在人源Vκ3-20来源的轻链的CDR3区中通过诱变工程改造的组氨酸残基的位置。通过诱变引入的组氨酸残基和相应的示例性核酸残基以粗体表示。氨基酸位置(105、106等)基于Lefranc等，(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55-77中所述的独特编号，并且其也可见于国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的网站。。
图13显示了经工程改造将组氨酸残基引入重排的人源Vκ3-20/Jκ1轻链序列的CDR3中时使用的选定的诱变引物的序列和性质(GC含量％，N，错配％，Tm)。在序列表中使用的这些引物的SEQ ID NO包含在下表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图14A-14B显示了构建靶向载体的一般策略，所述载体用于经工程改造将组氨酸残基引入来源于Vκ3-20/Jκ1轻链可变区的重排的人源轻链可变区序列以制备表达含有经修饰的人源轻链的抗体的经基因修饰的小鼠。图14C显示了将用于ULC-Q105H/Q106H/Y107H/S109H取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠；而图14D显示了将用于ULC-Q105H/Q106H/S109H取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠。该图并未按照比例显示。除非另有明示，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人源序列。
图15是小鼠中免疫球蛋白κ轻链等位基因的V和J基因区段重组以及重排前(上图)和重排后(下图)所述轻链基因座结构的一般性说明。此处显示的重排仅是若干可能的重排事件之一。该图并未按照比例显示。
图16A是两个通用轻链基因座的示意性表示，一个包含重排的人源Vκ1-39/Jκ5可变区序列(上图)，和一个包含重排的人源Vκ3-20/Jκ1可变区序列(下图)。该图并未按照比例显示。除非另有说明，实心的图形表示小鼠序列，空心的图形表示人序列。图16B显示了两个基因修饰的双轻链(DLC)基因座的示例。上面的基因座(DLC-5J)含有经工程改造的人源DNA片段，其含有两个人源Vκ基因区段和五个人源Jκ基因区段。下面的基因座(DLC-1J)含有经工程改造的人源DNA片段，其含有两个人源Vκ基因区段和一个人源Jκ基因区段。每个基因座能够重排以形成与内源性轻链恒定区(例如Cκ)可操作地连接的人源Vκ区。图中显示了免疫球蛋白启动子(P，基因座上方的空心箭头)、先导外显子(L，短的空心箭头)和两个人源Vκ基因区段(长的空心箭头)，所有的上游(5’)翼侧为含有Frt重组位点的新霉素表达盒。与每个人源基因区段(Vκ和Jκ)工程改造的重组信号序列以与各基因区段并列的空心椭圆表示。DLC-5J基因座含有与五个Jκ基因区段中的每一个并列的RSS。在大部分实施方式中，除非另有说明，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人序列。该图并未按照比例显示。
图17A-17C显示了构建工程改造免疫球蛋白κ基因座的靶向载体的一般性策略，所述免疫球蛋白κ基因座包含两个人源Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和一个人源Jκ区段(Jκ5)，以及小鼠增强子和IgκC臂。图17D显示了将该靶向载体引入ES细胞和生成具有其的杂合子小鼠；图17E显示了使用FLP酶在ES细胞中缺失选择性表达盒。在大部分实施方式中，除非另有说明，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人序列。该图并未按照比例显示。
图18A-18D显示了经工程改造的含有两个人源Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和一个人源Jκ区段的免疫球蛋白κ基因座部分的核苷酸序列(SEQ ID NO:82)；所述核苷酸跨所述经工程改造的人序列并且在5’和3’两端包含内源性小鼠序列的约100个碱基对。图18D底部解释了用于描述不同序列的不同字体。
图19A-19B显示了构建工程改造免疫球蛋白κ基因座的靶向载体的一般性策略，所述免疫球蛋白κ基因座包含两个人源Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和五个人源Jκ区段，以及小鼠增强子和IgκC臂。图19C显示了将该靶向载体引入ES细胞和生成具有其的杂合子小鼠；图19D显示了使用FLP酶在ES细胞中缺失选择性表达盒。在大部分实施方式中，除非另有说明，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人序列。该图并未按照比例显示。
图20A-20D显示了经工程改造的含有两个人源Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和五个人源Jκ区段的免疫球蛋白κ基因座的核苷酸序列(SEQ ID NO:83)；所述核苷酸跨所述经工程改造的序列并且在5’和3’两端包含内源性小鼠序列的约100个碱基对。图20D底部解释了用于描述不同序列的不同字体。
图21A的上部显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)骨髓的B细胞和T细胞(分别为CD19+和CD3+)染色的典型等高线图。下部显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)的骨髓进行CD19+门控并且针对ckit+和CD43+进行染色的典型等高线图。在下部的等高线图中标注了Pro和Pre B细胞。
图21B显示了从野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)股骨收集的骨髓中Pro(CD19+CD43+ckit+)和Pre(CD19+CD43–ckit–)B细胞的数量。
图22A显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)的骨髓进行单峰门控并针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的典型等高线图。在各等高线图中标注了未成熟的、成熟的和pro/pre B细胞。
图22B显示了从野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)股骨分离的骨髓中B细胞(CD19+)、未成熟B细胞(B220intIgM+)和成熟B细胞(B220hiIgM+)的总数。
图23A显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)的骨髓进行单峰门控并针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的典型等高线图。在各等高线图中标注了未成熟的、成熟的和pro/pre B细胞。
图23B显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)股骨分离的骨髓进行未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞门控并针对Igλ和Igκ的表达进行染色的典型等高线图。
图24A的上部显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯纯合子(DLC-5J)的脾细胞进行单峰门控并针对B细胞和T细胞(分别为CD19+和CD3+)进行染色的典型等高线图。下部显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)的脾细胞进行CD19+门控并且针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)进行染色的典型等高线图。在各等高线图中标注了成熟(WT为54，DLC-5J为56.9)和过渡期(WT为23.6，DLC-5J为25.6)B细胞。
图24B显示了从野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)收集的脾脏中CD19+B细胞、过渡期B细胞(CD19+IgMhiIgDlo)和成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)的总数。
图25A显示了来自野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)的进行CD19+门控的Igλ+和Igκ+脾细胞的典型等高线图。
图25B显示了从野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)收集的脾脏中B细胞(CD19+)、Igκ+B细胞(CD19+Igκ+)和Igλ+B细胞(CD19+Igλ+)的总数。
图26A显示了在针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子中外周B细胞的发育。第一个(最左侧)等高线图显示了CD19+门控的CD93+和B220+脾细胞，其表示未成熟(39.6)和成熟(57.8)B细胞。第二个(中间上图)等高线图显示了在未成熟B细胞中IgM+和CD23+的表达，其表示T1(33.7；IgD-IgM+CD21loCD23-)、T2(21.2；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)和T3(29.1)B细胞群。第三个(中间下图)等高线图显示了成熟B细胞CD21+(CD35+)和IgM+的表达，其表示产生边缘区B细胞的小群(14.8)和产生滤泡(FO)B细胞的另一个群(70.5)。第四个(右侧上图)等高线图显示了在成熟B细胞中B220+和CD23+的表达，其表示边缘区(90.5；MZ)和边缘区前体(7.3；IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B细胞群。第五个(右侧下图)等高线图显示了在成熟B细胞中IgD+和IgM+的表达，其表示FO-I(79.0；IgDhiIgMloCD21midCD23+)和FO-II(15.1；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B细胞群。图中显示了在各门控区域中的细胞百分率。
图26B显示了在野生型小鼠中外周B细胞的发育。第一个(最左侧)等高线图显示了CD19+门控的CD93+和B220+脾细胞，其表示未成熟(31.1)和成熟(64.4)B细胞。第二个(中间上图)等高线图显示了在未成熟B细胞中IgM+和CD23+的表达，其表示T1(28.5；IgD-IgM+CD21loCD23-)、T2(28.7；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)和T3(30.7)B细胞群。第三个(中间下图)等高线图显示了成熟B细胞CD21+(CD35+)和IgM+的表达，其表示产生边缘区B细胞的小群(7.69)和产生滤泡(FO)B细胞的另一个群(78.5)。第四个(右侧上图)等高线图显示了在成熟B细胞中B220+和CD23+的表达，其表示边缘区(79.9；MZ)和边缘区前体(19.4；IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B细胞群。第五个(右侧下图)等高线图显示了在成熟B细胞中IgD+和IgM+的表达，其表示FO-I(83.6；IgDhiIgMloCD21midCD23+)和FO-II(13.1；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B细胞群。图中显示了在各门控区域中的细胞百分率。
图27显示了从野生型小鼠(WT)和针对两个人源Vκ和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)收集的脾脏中过渡期、边缘区和滤泡B细胞群的总数。
图28显示了在使用针对在内源性Vκ和Jκ基因区段被人源Vκ和Jκ基因区段(Hκ)取代的小鼠纯合子(VELOCIMMUNETM小鼠的人源轻链)、野生型(WT)小鼠、针对两个人源Vκ基因区段和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)和针对两个人源Vκ基因区段和一个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-1J)中的Vκ3-20或Vκ1-39基因区段具有特异性的探针进行的定量PCR测定中，在Vκ3-20来源和Vκ1-39来源轻链的骨髓中(y轴)的相对mRNA表达。将信号归一化为小鼠Cκ的表达。ND：未检测。
图29显示了在使用针对在内源性Vκ和Jκ基因区段被人源Vκ和Jκ基因区段(Hκ)取代的小鼠纯合子(VELOCIMMUNETM小鼠的人源轻链)、野生型(WT)小鼠、针对两个人源Vκ基因区段和五个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)和针对两个人源Vκ基因区段和一个人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-1J)中的Vκ3-20或Vκ1-39基因区段具有特异性的探针进行的定量PCR测定中，在Vκ3-20来源和Vκ1-39来源轻链的全脾中(y轴)的相对mRNA表达。将信号归一化为小鼠Cκ的表达。ND：未检测。
图30显示了用于将四个组氨酸残基工程化引入人源Vκ1-39和Vκ3-20轻链序列的CDR3的选定诱变引物的序列和性质(％GC含量，N，％错配，Tm)。在序列表中使用的这些引物的SEQ ID NO包括在下表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图31A显示了将靶向载体引入ES细胞并且生成具有其的杂合子小鼠，所述靶向载体包含分别具有四个组氨酸残基(****)取代的两个人源Vκ轻链区段和五个人源Jκ；图31B显示了使用FLPo酶在ES细胞中缺失选择性表达盒。在大部分实施方式中，除非另有说明，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人序列。该图并未按照比例显示。
图32显示了用于将三个组氨酸残基工程化引入人源Vκ1-39和Vκ3-20轻链序列的CDR3的选定诱变引物的序列和性质(％GC含量，N，％错配，Tm)。在序列表中使用的这些引物的SEQ ID NO包括在下表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图33A显示了将靶向载体引入ES细胞并且生成具有其的杂合子小鼠，所述靶向载体包含分别具有三个组氨酸残基(***)取代的两个人源Vκ轻链区段和五个人源Jκ；图33B显示了使用FLPo酶在ES细胞中缺失选择性表达盒。在大部分实施方式中，除非另有说明，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人序列。该图并未按照比例显示。
图34A显示了由人源种系Vκ3-20序列(下部序列)编码的氨基酸序列与在小鼠中表达的示例性IgMκ轻链可变序列的氨基酸翻译的比对，所述小鼠包含两个Vκ区段(Vκ3-20和Vκ1-39)，其均在CDR3序列中被3个组氨酸残基取代(上部序列)；比对表明在小鼠中表达的IgMκ链可变序列保留了引入种系序列中的全部三个组氨酸取代。图34B由人源种系Vκ1-39序列(在各比对中的下部序列)编码的氨基酸序列与在小鼠中表达的示例性IgMκ轻链可变序列的氨基酸翻译的比对，所述小鼠包含两个Vκ区段(Vκ3-20和Vκ1-39)，其均在CDR3序列中被3个组氨酸残基取代(在各比对中的上部序列)；上部的比对表明在小鼠中表达的IgMκ链可变序列保留了引入种系序列中的全部三个组氨酸修饰，下部的比对表明在小鼠中表达的IgMκ链可变序列保留了引入种系序列中的三个组氨酸修饰中的两个。在一些实施方式中，引入Vκ的最后位置的组氨酸可能会在V-J重排过程中丢失。
发明详述
定义
本发明提供了经基因修饰的非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)，所述非人动物在其基因组，例如其种系中，包含编码显示出pH依赖性抗原结合的人源抗体分子的核苷酸序列，例如包含编码显示出pH依赖性抗原结合的抗体的重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链核苷酸序列，例如包含有限的人源VL和JL基因区段库的免疫球蛋白轻链的核苷酸序列，其重排和编码显示出pH依赖性抗原结合的抗体；包含这些的胚胎、细胞和组织；其制备方法；及其使用方法。除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包含所述术语和短语在本领域中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见的。
在本申请中使用的术语“抗体”包含免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子含有四条多肽链，互相之间通过二硫键连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。各条重链包含重链可变结构域和重链恒定区(CH)。所述重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各条轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定区(CL)。所述重链和轻链可变结构域可以进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其散布在更为保守的称为框架区(FR)的区域中。各条重链和轻链可变结构域包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和性”抗体指针对其靶向表位具有约10-9M或更低(例如约1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M或约1x 10-12M)的KD的抗体。在一个实施方式中，KD通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)测定；在另一个实施方式中，KD通过ELISA测定。
短语“双特异性抗体”包含能够选择性地结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体通常包含两条不同的重链，各条重链特异性地结合不同的表位——在两个不同的分子上(例如在两个不同的免疫原上的不同表位)或在相同分子上(例如在相同免疫原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性地结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链针对所述第一表位的亲和性将通常比第一重链针对所述第二表位的亲和性低至少1至2或3或4或更多个数量级，反之亦然。双特异性抗体特异性结合的表位可以在相同或不同的靶点上(例如在相同或不同的蛋白上)。示例性的双特异性抗体包含具有特异性针对肿瘤抗原的第一重链和特异性针对细胞毒性标记物例如Fc受体(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII等)或T细胞标记物(例如CD3、CD28等)的第二重链的那些。而且，所述第二重链可变结构域可以被具有不同的所需特异性的重链可变结构域取代。例如，可以将具有特异性针对肿瘤抗原的第一重链和特异性针对毒素的第二重链的双特异性抗体配对，以便将毒素(例如皂草素、长春花碱等)递送至肿瘤细胞。其他示例性的双特异性抗体包含具有特异性针对活化受体(例如B细胞受体、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcαRI、T细胞受体等)的第一重链和特异性针对抑制受体(例如FcγRIIB、CD5、CD22、CD72、CD300a等)的第二重链的那些。可以构建这种双特异性抗体用于治疗与细胞活化相关的病情(例如过敏和哮喘)。可以通过例如将识别相同免疫原上不同表位的重链组合来制备双特异性抗体。例如，可以将编码识别相同免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列与编码相同或不同的重链恒定区的核酸序列融合，并且可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达这种序列。典型的双特异性抗体具有两条重链，每条重链具有三个重链CDR，后接(N-末端至C-末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不具有表位结合特异性但是能够与每条重链结合、或者能够与各重链结合并且能够结合与重链表位结合区结合的一个或多个表位、或者能够与各重链结合并且能够使一条或全部两条重链结合于一个或全部两个表位。类似地，术语“三特异性抗体”包括能够选择性地结合三个或更多个表位的抗体。
术语“细胞”包含适于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包含那些原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体杂交瘤。在一些实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方式中，所述细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
短语“互补性决定区”或术语“CDR”包含由生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个框架区之间。CDR可以由例如种系序列或者重排的或未经重排的序列来编码，以及可以由例如由初始的(naive)或者成熟的B细胞或T细胞来编码。CDR可以是体细胞突变的(例如不同于在动物种系中编码的序列)、人源化的和/或使用氨基酸取代、加入或缺失修饰的。在一些情况下(例如针对CDR3)，CDR可由两条或更多条序列(例如种系序列)编码，所述序列(例如在未经重排的核酸序列中)不是邻近的，但是在B细胞核酸序列中是邻近的，例如作为所述序列剪接或连接的结果(例如V-D-J重组以形成重链CDR3)。
当用于描述保守的氨基酸取代时，术语“保守的”包含氨基酸残基被另一个具有带有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基的氨基酸残基取代。在通常情况下，保守的氨基酸取代不会实质(substantially)改变目标蛋白的功能性性质，例如可变区以所需的亲和性特异性结合靶标表位的能力。具有带有相似化学性质侧链的氨基酸基团的例子包含脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬酰胺和谷胺酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基团包含例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸取代可以是蛋白中的任意天然残基被丙氨酸取代，例如在丙氨酸扫描诱变中所使用的。在一些实施方式中，制备在PAM250对数似然性矩阵中具有正值的保守取代，如Gonnet等，(1992)Exhaustive Matching of theEntire Protein SequenceDatabase(全蛋白序列数据库的穷尽匹配),Science 256:1443-45所公开的，其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述取代是适度的保守取代，其中所述取代在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值。
在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或重链中的残基位置相差一个或多个保守的氨基酸取代。在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或其功能性片段(例如能够由例如B细胞表达和分泌的片段)中的残基位置与在本申请中列出的轻链氨基酸序列不相同，而是相差一个或多个保守的氨基酸取代。
短语“表位结合蛋白”包含具有至少一个CDR并且能够选择性地识别表位的蛋白，例如能够以约1微摩或更低的KD(例如KD为约1x 10-6M、1x 10-7M、1x 10-9M、1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M或约1x 10-12M)结合表位。治疗性表位结合蛋白(例如治疗性抗体)通常要求KD在纳摩或皮摩范围内。
短语“功能性片段”包含能够被表达、分泌和以在微摩、纳摩或皮摩范围内的KD特异性与表位结合的表位结合蛋白的片段。特异性识别包含具有至少在微摩范围、纳摩范围或皮摩范围内的KD。
术语“种系”涉及免疫球蛋白核酸序列时包含能够传递给后代的核酸序列。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包含免疫球蛋白重链序列，所述序列包含来自任意生物体的免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有明示，重链可变结构域包含三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包含CDR、CDR和FR及其组合。典型的重链在可变结构域之后(从N-末端到C-末端)具有CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能性片段包含能够特异性识别表位(例如具有以在微摩、纳摩或皮摩范围内的KD识别所述表位)、能够由细胞表达和分泌并且包含至少一个CDR的片段。重链可变结构域由可变区基因序列编码，所述序列通常包含来源于在种系中存在的VH、DH和JH区段库的VH、DH和JH区段。各种生物体V、D和J重链区段的序列、位置和命名可见于IMGT数据库，其为国际免疫遗学传信息系统的网站。
术语“一致性”当与序列一起使用时包含由本领域公知的能够用于测定核苷酸和/或氨基酸序列一致性的多种不同算法来测定的一致性。在本申请所述的一些实施方式中，使用空位开放(open gap)罚分为10.0和空位拓展(extend gap)罚分为0.1的ClustalWv.1.83(慢(slow))比对和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM 10.0.2,MacVector公司,2008)来测定一致性。用于序列一致性比较的序列的长度取决于特定的序列，但是在轻链恒定结构域的情况下，所述长度应包含折叠为轻链恒定结构域的足够长度的序列，所述结构域能够自结合以形成典型的轻链恒定结构域，例如能够形成两个含有β链的β片层并且能够与人源或小鼠的至少一个CH1结构域相互作用。在CH1结构域的情况下，所述序列的长度应含有折叠为CH1结构域的足够长度的序列，所述结构域能够形成两个含有β链的β片层并且能够与小鼠或人源的至少一个轻链恒定结构域相互作用。
短语“免疫球蛋白分子”包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链。所述重链可以是相同的或不同的，所述轻链可以是相同的或不同的。
短语“轻链”包含来自任何生物体的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另有明示，所述轻链序列包含人源κ和λ轻链和VpreB，以及替代轻链。除非另有明示，轻链可变结构域通常包含三个轻链CDR和四个框架(FR)区。在通常情况下，全长的轻链从氨基末端到羧基末端包含含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变结构域和轻链恒定区。轻链可变结构域由轻链可变区基因序列编码，所述序列通常包含来源于种系中存在的V和J区段库的VL和JL区段。各种生物体V和J轻链区段的序列、位置和命名可见于IMGT数据库www.imgt.org。轻链包含例如不选择性结合第一或第二表位的那些，所述第一或第二表位与包含该轻链的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包含结合和识别、或者辅助重链结合和识别一个或多个表位的那些，所述一个或多个表位与包含该轻链的表位结合蛋白选择性结合。常见的或通用轻链包含来源于人源Vκ1-39Jκ5基因或人源Vκ3-20Jκ1基因的那些，并且包含其体细胞突变(例如亲和性成熟)的版本。双轻链(DLC)包括来源于轻链基因座的那些，所述轻链基因座包含不超过两个人源Vκ区段，例如人源Vκ1-39基因区段和人源Vκ3-20基因区段，并且包括其体细胞突变(例如亲和性突变)的版本。
短语“微摩范围”旨在表示1-999微摩；短语“纳摩范围”旨在表示1-999纳摩；短语“皮摩范围”旨在表示1-999皮摩。
短语“体细胞突变的”包含指来自已经过类别转换的B细胞的核酸序列，其中在经过类别转换的B细胞中的免疫球蛋白可变区的核酸序列(例如编码重链可变结构域或包含重链CDR或FR序列的核苷酸序列)与在类别转换前的B细胞中的核酸序列不同，例如未经过类别转换的B细胞与已经过类别转换的B细胞之间在CDR或框架核酸序列中存在差异。“体细胞突变的”包含指来自亲和性成熟的B细胞的核酸序列，所述序列与在未经过亲和性成熟的B细胞中相应的免疫球蛋白可变区序列(即，在种系细胞基因组中的序列)不同。短语“体细胞突变的”还包含指将B细胞与目标表位接触后来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中所述核酸序列不同于在将所述B细胞与目标表位接触前相应的核酸序列。短语“体细胞突变的”指来自抗体的序列，所述抗体在具有人源免疫球蛋白可变区核酸序列的动物例如小鼠中针对免疫原攻击生成并且由在这种动物中固有的选择过程产生。
术语“未经重排的”涉及核酸序列时包含在动物细胞种系中存在的核酸序列。
短语“可变结构域”包含免疫球蛋白轻链或重链(根据需要进行了修饰)的氨基酸序列，所述序列从序列的N-末端至C-末端(除非另有明示)包含下述氨基酸区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语“可操作地连接”指所述组件以预期的方式与功能可操作地连接的关系。在一个例子中，编码蛋白的核酸序列可以与调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接，以保持适宜的转录调节。在一个例子中，免疫球蛋白可变区(或V(D)J区段)核酸序列可以与免疫球蛋白恒定区的核酸序列可操作地连接，以使得在所述序列之间适宜的重组为免疫球蛋白重链或轻链序列。
术语“取代”涉及基因取代时指在内源性基因座上放置外源性遗传物质，以便使用直系同源的或同源的核酸序列取代全部或部分内源性基因。
在本申请中使用的“功能性”例如涉及功能性多肽时包含保持至少一种通常与天然蛋白相关的生物活性的多肽。在另一个例子中，功能性免疫球蛋白基因区段可以包含能够生成重排以生产重排的免疫球蛋白基因序列的可变基因区段。
“中性pH”包含在约7.0至约8.0之间的pH，例如在约7.0至约7.4之间的pH，例如在约7.2至约7.4之间，例如生理pH。“酸性pH”包含6.0或更低的pH，例如在约5.0至约6.0之间的pH，在约5.75至约6.0之间的pH，例如核内体和溶酶体隔室的pH。
在免疫球蛋白轻链基因中经工程改造的组氨酸残基
发明人发现能够通过在轻链序列的一个或多个位置修饰免疫球蛋白轻链可变区来制备非人动物，所述非人动物表达能够以pH依赖的方式与抗原结合的抗体。本申请描述了在非人动物的种系中进行修饰以使得所述动物在抗体的CDR中表达组氨酸的方法。具体而言，本申请描述了在小鼠种系中的免疫球蛋白轻链可变序列中进行修饰的方法。例如轻链的可变区序列通常在可变区序列显示出体细胞超突变，并且在一些情况下，这种突变能够导致组氨酸残基的取代(参见例如图1)。这种突变甚至能够发生在互补性决定区(CDR)，该区域是负责抗原结合的可变结构域的区域。在一些情况下，这种突变能够导致抗体显示出pH依赖性抗原结合，例如与在中性pH下的抗原结合相比在酸性pH下抗原结合降低。这种pH依赖性抗原结合是理想的，因为其可以使抗体在细胞外与抗原结合，并且当内化进入内体时，释放抗原并再循环回表面以与其他抗原结合，以避免靶点介导的清除。已经报道了通过使用随机his扫描诱变以引入组氨酸残基实现这种作用、在抗-IL-6R抗体中工程改造生成pH依赖的结合性质的方法(US 2011/0111406A1)。然而，抗体残基的随机诱变可以导致抗体与抗原亲和性的降低。对非人动物基因修饰以便在抗体序列中表达组氨酸取代能够生成对目标抗原生成应答的高亲和性抗体，所述抗体因为一个或多个组氨酸修饰也将显示出pH依赖性的抗原结合。
因此，在各种实施方式中，本申请提供了经基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述非人动物在其基因组例如在其种系中包含含有修饰的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，以使得在动物中表达能够以pH依赖的方式与抗原结合的抗体。在一个实施方式中，所述非人动物包含在人源免疫球蛋白轻链可变区序列(例如VL和/或JL区段序列)中的修饰，所述修饰包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(例如至少一个由相应的人源种系VL和/或JL区段序列编码的非组氨酸密码子)(在一些情况下，也可以称为“组氨酸取代”，“组氨酸密码子取代”等)。在一个实施方式中，所述动物包含种系修饰，其使得在轻链的CDR1、CDR2、CDR3、N末端、环4以及甚至框架区具有组氨酸取代以增加pH依赖性抗体的产生。在一个实施方式中，所述动物包含在人源免疫球蛋白轻链互补性决定区(CDR；例如CDR1、CDR2和/或CDR3)的核苷酸序列中非组氨酸密码子(例如至少一个由相应的人源种系VL和/或JL区段序列编码的非组氨酸密码子)被组氨酸密码子的至少一个取代。在一个实施方式中，所述取代在CDR3密码子中。在一个实施方式中，所述轻链是κ轻链。在一个实施方式中，所述动物表达免疫球蛋白轻链，例如轻链CDR，例如轻链CDR3，其包含至少一个氨基酸被组氨酸的取代。在另一个实施方式中，所述轻链是λ轻链。在另一个实施方式中，所述小鼠在κ和λ轻链中包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
组氨酸残基由两种不同的密码子CAT和CAC(脱氧核糖核酸残基)编码。因此，非组氨酸密码子可以被CAT或CAC取代。所述取代是在密码子中进行工程改造，在种系配置(即非体细胞突变的状态)中的所述密码子不编码组氨酸残基。因而，所述核苷酸序列包含至少一个组氨酸密码子，其不是由相应的人源种系轻链可变基因区段(例如相应的人源种系VL和/或JL基因区段)编码。
在不同实施方式中，可以采用不同方法设计在所述基因修饰非人动物轻链序列中的组氨酸修饰。在一些实施方式中，可以将组氨酸取代限制为仅需要单一核苷酸改变的那些位置。在一些实施方式中，可以在人工序列(例如人工的DH区段，已鉴定抗体的N加入等)中制备组氨酸修饰并且可以将这些人工序列插入轻链序列中。
在一个实施方式中，轻链是通用轻链(也称为共有轻链)。如在美国专利申请号13/022,759、13/093,156、13/412,936、13/488,628和13/798,310(美国申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300、2013/0045492和2013/0185821，其均通过引用并入本申请)中所述，选择针对多种重链的共有轻链的非人动物(例如小鼠)具有实用价值。在各种实施方式中，在仅含有共有轻链的非人动物中表达的抗体将具有能够与相同或基本相同的轻链结合和表达的重链。这在制备双特异性抗体中特别有用。例如，可以使用第一免疫原对这种动物进行免疫以生成表达与第一表位特异性结合的抗体的B细胞。可以使用第二免疫原对所述动物(或基因相同的动物)进行免疫以生成表达与第二表位特异性结合的抗体的B细胞。可变重链区可以从所述B细胞中克隆，并且在细胞中与相同的重链恒定区和相同的轻链(例如共有轻链)表达以制备双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的重链组分已由动物选择以便与相同的轻链组分结合和表达。在所述的各种实施方式中，基因工程改造小鼠的可变区是人源可变区。
在另一个实施方式中，轻链来源于受限制的(有限的)轻链可变区段库，例如包含不超过两个人源VL基因区段(例如双轻链或“DLC”)的轻链可变区段库。如在以美国专利公开号2013/0198880公开的美国专利申请号13/798,455中更加详细地描述的，此类有限的轻链可变区段库导致生成有限的轻链库，其还有助于生成用于制备双特异性或其他多特异性抗体的抗体组分。
在一些实施方式中，双轻链小鼠可以显示出更加多样的轻链库。在一些实施方式中，所述双轻链小鼠允许更高产出的结合抗体，并且在限制多样性的同时增加与在包含单一重排轻链可变区的小鼠(例如通用轻链小鼠)中生成的重链的成功配对。在一些实施方式中，所述轻链本身可以显示出抗原结合性质。在一些实施方式中，可以诱导所述小鼠产生显示出存在于其轻链中的抗原特异性的抗体(例如通过限制所述小鼠的免疫球蛋白重链库，例如通过使用包含单一重排的重链可变区的基因座取代所述小鼠的重链基因座)。在一些实施方式中，在此类动物中生产的抗体将通过其轻链结合对特定的第一表位(例如效应抗原、细胞毒性分子、Fc受体、毒素、激活或抑制性受体、T细胞标记物、免疫球蛋白转运体等)具有特异性。可以将此类来源于双轻链小鼠的表位特异性人源轻链与来源于具有有限的轻链库的小鼠(例如ULC小鼠)的人源重链共表达，其中基于其与第二表位(例如在不同抗原上的第二表位)的结合能力对所述重链进行选择。
因此，此前经过工程改造的小鼠能够生成将适于与相当多样的重链家族配对的免疫球蛋白轻链，所述重链包含从种系序列偏离的人源可变区的重链，所述可变区例如亲和性成熟或体细胞突变的可变区。在各种实施方式中，所述小鼠被设计为使人源轻链可变结构域与包含体细胞突变的人源重链可变结构域配对，从而使获得适用于人用疗法的高亲和性结合蛋白的途径成为可能。
通过生物体内长期和复杂的抗体选择过程，基因工程改造的小鼠在多种多样的人源重链可变结构域与有限数量的人源轻链选择的配对方面做出了生物学上适宜的选择。为了达到这个目的，将小鼠进行工程改造以使其展现有限数量的人源轻链可变结构域选择与广泛多样的人源重链可变结构域选择的结合。当使用免疫原攻击时，所述小鼠将其库中解决方案的数量最大化以发展针对免疫原的抗体，这主要或单独受限于其库中轻链选择的数量。在各种实施方式中，这包含使小鼠获得轻链可变结构域的适宜的和相容的体细胞突变，尽管如此其将与相对较多多样性的人源重链可变结构域相容，所述人源重链可变结构域尤其包含体细胞突变的人源重链可变结构域。
在美国申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300、2013/0045492、2013/0185821和2013/0198880中所述的工程改造的共有轻链或有限的轻链库小鼠包含编码有限的轻链选择库(例如共有或通用的轻链“ULC”，所述共有或通用的轻链“ULC”包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，例如包含不超过两个人源VL区段的轻链，例如包含两个人源VL区段的双轻链“DLC”)的核酸序列。为获得这种有限的库，对小鼠进行工程改造以使其不具有或基本上不具有制备或重排天然的小鼠轻链可变结构域的能力。在一个方面，这是通过例如缺失小鼠的轻链可变区基因区段来实现的。如此前所描述的，随后可以通过将选择的外源性适宜的人源轻链可变区基因区段与所述内源性小鼠轻链恒定结构域可操作地连接从而对所述内源性小鼠基因座进行修饰，通过这种方式以使得所述外源性人源可变区基因区段能够与所述内源性小鼠轻链恒定区基因组合并且形成重排的反向嵌合的轻链基因(人源可变区，小鼠恒定区)。在各种实施方式中，所述轻链可变区是能够进行体细胞突变。在各种实施方式中，为使所述轻链可变区能力最大化以获得体细胞突变，在小鼠中保留适宜的一个或多个增强子。在一个方面，在修饰小鼠κ轻链基因座以使用人源κ轻链基因区段取代内源性小鼠κ轻链基因区段中，所述小鼠的κ内含子增强子(intronicenhancer)和小鼠κ3’增强子保持有功能或不被破坏。
因此，本申请提供了基因工程改造的小鼠，所述小鼠表达与多样的反向嵌合(人源可变区，小鼠恒定区)重链结合的有限的反向嵌合(人源可变区，小鼠恒定区)轻链库。在各种实施方式中，所述内源性小鼠κ轻链基因区段缺失并且被单一(或两个)重排的人源轻链区取代，所述人源轻链区与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接。在不同实施方式中，将所述内源性小鼠κ轻链基因区段缺失并被单一人源VL区段取代，所述单一人源VL区段能够与人源轻链J区段(选自一个或多个JL区段)重排并且编码免疫球蛋白轻链的人源可变结构域，其中所述单一VL和一个或多个JL区段与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接。在其他不同实施方式中，所述内源性小鼠κ轻链基因区段缺失并且被不超过两个人源VL区段取代，所述人源VL区段能够与人源轻链J区段(选自一个或多个JL区段，例如两个或多个JL区段)重排并且编码免疫球蛋白轻链的人源可变结构域，其中所述不超过两个VL基因区段和一个或多个JL区段与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接。在其他实施方式中，所述κ轻链基因区段(例如人源VL和JL基因区段)与人源Cκ基因可操作地连接。在将所述重排的人源轻链区的体细胞超突变最大化的实施方式中，所述小鼠的κ内含子增强子和所述小鼠的κ3’增强子被保留。在各种实施方式中，所述小鼠还包含不具有功能的λ轻链基因座或将其缺失，或包含使所述基因座不能生成λ轻链的缺失。在一些特定的实施方式中，所述具有受限制的轻链库的基因工程改造小鼠的基因座基本上与图16A和16B中描述的基因座是相同的。
在包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的基因工程改造的小鼠中，例如包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列(例如包含不超过两个人源VL区段的轻链)的ULC小鼠，例如包含两个人源VL区段的DLC小鼠，所述免疫球蛋白轻链基因座不同于野生型免疫球蛋白轻链基因座。
在一些实施方式中，包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的小鼠(例如ULC小鼠，例如DLC小鼠)的轻链基因座结构不同于图15中的对照结构，因为在其中至少一个，和在一些实施方式中的全部，小鼠VL基因区段被一个人源VL基因区段或者不超过两个人源VL基因区段取代。在一些实施方式中，存在于所述种系中的单一人源VL基因区段被重排为人源JL基因区段。在一些实施方式中，小鼠的人源VL基因区段能够重排为两个或多个人源JL基因区段中的一个以编码抗体的免疫球蛋白VL结构域。在一些实施方式中，如本申请所述的小鼠轻链基因座的人源VL基因区段与两个或多个(例如两个、三个、四个或五个)人源JL基因区段可操作地连接。
在一些实施方式中，包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的小鼠(例如ULC小鼠，例如DLC小鼠)的轻链基因座结构不同于图15中的对照结构，因为在其中不含有重排前编码内源性VL基因区段的核苷酸序列。在一些实施方式中，此类小鼠的轻链基因座的结构不同于图15中的对照结构，因为在其中不含有重排前编码内源性JL基因区段的核苷酸序列。在一些实施方式中，此类小鼠轻链基因座的结构不同于图15的对照结构，因为在其中不含有重排前编码内源性VL和JL基因区段的核苷酸序列。
在一些实施方式中，包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的小鼠(例如ULC小鼠，例如DLC小鼠)的轻链基因座结构不同于图15中的对照结构，因为在其中不含有重排后编码内源性VL基因区段的核苷酸序列。在一些实施方式中，此类小鼠的轻链基因座的结构不同于图15中的对照结构，因为在其中不含有重排后编码内源性JL基因区段的核苷酸序列。在一些实施方式中，此类小鼠轻链基因座的结构不同于图15的对照结构，因为在其中不含有重排后编码内源性VL和JL基因区段的核苷酸序列。
在一些实施方式中，包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的小鼠(例如ULC小鼠，例如DLC小鼠)的轻链基因座结构不同于图15中的对照结构，因为在其中重排前含有不超过两个人源VL基因区段和一个或多个，例如两个或多个(例如两个、三个、四个或五个)人源JL基因区段。在一些实施方式中，此类小鼠的轻链基因座不同于图15中的对照结构，因为在其中重排前含有不超过两个人源VL基因区段和五个人源JL基因区段。
在一些实施方式中，包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的小鼠(例如ULC小鼠，例如DLC小鼠)的轻链基因座结构不同于图15中的对照结构，因为在其中重排后含有不超过两个人源VL基因区段和五个或更少的(例如5、4、3、2或1)人源JL基因区段。在一些实施方式中，此类小鼠的轻链基因座不同于图15的对照结构，因为在其中重排后含有不超过两个人源VL基因区段和一个、两个、三个、四个或五个人源JL基因区段。在一个实施方式中，包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的小鼠(例如ULC小鼠，例如DLC小鼠)的轻链基因座结构不同于图15中的对照结构，因为在其中重排后含有一个人源VL和五个或更少的(例如5、4、3、2或1)人源JL基因区段。
在不同实施方式中，人源VL和JL基因区段是人源Vκ和Jκ基因区段。在不同实施方式中，人源Vκ区段选自人源Vκ1-39基因区段和人源Vκ3-20基因区段。在一些实施方式中，人源Vκ区段是人源Vκ1-39和人源Vκ3-20。在一些实施方式中，人源Jκ区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5基因区段及其组合。在一些实施方式中，人源Jκ基因区段是人源Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
在一些实施方式中，包含编码有限的轻链选项库的核酸序列的小鼠(例如ULC小鼠，例如DLC小鼠)的轻链基因座结构不同于图15中的对照结构，因为在其中重排前含有基本上与图16A和16B相同的结构(例如图8C、8E、14C、14D、17E、19D、31和33的结构)。在一些实施方式中，提供了一种包含轻链基因座的小鼠，重排前其结构与图16A和16B的结构相同。
含有人源免疫球蛋白基因座，可变和恒定区随机插入所述小鼠基因组中的小鼠是本领域公知的。此类小鼠的初始品系含有有限数量的人源免疫球蛋白基因区段。特别地，少数含有人源免疫球蛋白轻链基因区段的品系含有一个、三个或四个人源免疫球蛋白VL基因区段和五个人源免疫球蛋白JL基因区段(Taylor等，1992,Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295；Fishwild等，1996,Nature Biotechnology 14:845-851；Lonberg等，1994,Nature 368:856-859；Green等，1994,Nature Genetics 7:13-21；Green和Jakobovits 1998,J.Exp.Med.188(3):483-495；Green 1999,J.Immunol.Methods 231:11-23)。这些小鼠仅含有少量人源免疫球蛋白VL基因区段，其作为全人源转基因部分随机插入所述小鼠的基因组，所述小鼠基因组已证实其B细胞数量较低、B细胞发育受损和存在其他免疫缺陷。根据对B细胞上人源Cκ表面表达的检测，与野生型相比，人源免疫球蛋白可变区基因的表达低于内源性κ轻链。令人吃惊的是，具有有限的轻链选项库的小鼠，如经工程改造以便在内源性免疫球蛋白κ轻链基因座含有一个或两个人源免疫球蛋白Vκ基因区段的小鼠，显示出B细胞的数量和发育与野生型接近(参见例如美国专利申请公开号2013/0198880和本申请的实施例)。而且，在一些实施方式中，这些小鼠能够产生对抗原产生应答的若干高亲和性反向嵌合抗体，所述抗体含有人源可变轻链和重链结构域，其中所述可变轻链结构域的每个分别含有两个可能的人源VL基因区段之一和五个可能的人源JL基因区段之一(参见例如美国专利申请公开号2013/0198880和本申请的实施例)。因而，与具有人源免疫球蛋白轻链微基因座(即有限数量的人源免疫球蛋白基因区段)工程化改造的小鼠初级品系不同的是，含有有限数量的人源免疫球蛋白VL基因区段(一个或两个)，和在一些实施方式中，两个或多个(例如2、3、4或5)人源免疫球蛋白JL基因区段的小鼠令人吃惊的显示出正常的B细胞数量、正常的免疫球蛋白轻链表达和正常的B细胞发育。而且，作为含有有限的免疫球蛋白轻链库的结果，此类小鼠还显示出对多种抗原激发出免疫应答的能力没有降低或受损。因而，在一些实施方式中，含有人源化可变轻链基因座的小鼠显示出野生型B细胞群的数量并显示出野生型B细胞的发育，所述人源化可变轻链基因座含有不超过两个未重排的人源免疫球蛋白VL基因区段和两个或多个(例如2、3、4或5)人源免疫球蛋白JL基因区段，或者不超过两个重排的人源VLJL区段。
通用轻链小鼠或具有有限的轻链库的小鼠(例如双轻链小鼠)针对各种抗原生成的抗体能够利用多样的重链可变区序列库，所述重链可变区序列库含有多样的VH、DH和JH区段库。在这种基因工程改造的小鼠中生成的抗体在设计双特异性治疗性抗体中是有用的；然而，与任何其他抗体一样，各个双特异性抗体在血浆中的生命周期中仅可以与一个靶点结合；所述抗体内化进入内体并且被靶向至溶酶体中降解。研究显示MHC-I类样Fcγ受体FcRn能够通过从分选内体再循环回细胞表面进而挽救免疫球蛋白不被溶酶体降解。Simister和Mostov(1989)An Fc receptor structurally related to MHC class Iantigens(在结构上与MHC I类抗原相关的Fc受体).Nature 337:184-87。如上文所解释的，为提高抗体再循环的效率，对抗体序列进行进一步修饰是有益的，所述修饰例如使得在酸性pH下(例如内体的pH)的抗原结合降低而在中性pH下(例如生理pH)保持抗体-抗原的亲和性和特异性的修饰。本申请所述的非人动物是有益的，其中在轻链序列中用组氨酸残基取代非组氨酸残基，因为所述动物基于通用轻链或受限制的轻链库(例如DLC)形式能够生成的高亲和性抗体还显示出pH依赖性结合，例如在酸性pH下与在中性pH下相比显示出与抗原的结合降低。
因此，在一个实施方式中，本申请提供了非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述非人动物在其基因组例如在其种系中包含来自有限的人源轻链可变基因区段库的有限的人源轻链可变区库或单一人源轻链可变区，其中所述一个或多个人源轻链可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一些实施方式中，本申请提供的非人动物被基因工程改造以包含单一未经重排的人源轻链可变区基因区段(或两个人源轻链可变区基因区段)，所述基因区段重排以形成重排的人源轻链可变区基因(或两个重排的轻链可变区基因)，所述基因表达单一的轻链(或表达一条或全部两条轻链)，其中所述一个或多个轻链可变区基因包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。由这些组氨酸取代的一个或多个轻链可变区基因编码的重排的人源轻链可变结构域能够与由动物选择的多条亲和性成熟的人源重链配对，其中所述重链可变区与不同表位特异性地结合。在各种实施方式中，所述至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基的取代结果生成重排的人源轻链，当所述轻链与同源重链表达时以pH依赖的方式与其抗原结合。
本申请提供了基因工程改造的动物，所述动物表达来自有限的人源轻链可变区基因序列库的有限的人源轻链可变结构域库或单一人源轻链可变结构域，其中所述可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一些实施方式中，本申请提供的动物被基因工程改造以包含单一V/J人源轻链序列(或两个V/J序列)，所述序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代并表达单一轻链的可变区(或表达一个或全部两个可变区)。在一个方面，包含可变序列的轻链能够与由动物克隆选择的多个亲和性成熟的人源重链配对，其中所述重链可变区与不同表位特异性地结合。在一个实施方式中，所述抗体与其抗原以pH依赖性的方式结合。在一个实施方式中，所述单一V/J人源轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1。在一个实施方式中，所述两个V/J序列是Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1。在一个实施方式中，所述Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列是重排的V/J序列。
在一个方面，本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述动物包含单一的人源免疫球蛋白轻链VL基因区段，所述基因区段能够与人源JL基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并编码免疫球蛋白轻链的人源可变结构域，其中所述单一的人源免疫球蛋白轻链VL基因区段和/或人源JL基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(例如至少一个由相应的人源种系VL和/或JL基因区段编码的非组氨酸密码子被组氨酸取代)。在另一个方面，本申请提供了经基因修饰的小鼠，所述小鼠包含不超过两个人源VL基因区段，各个区段均能够与人源JL基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并且编码免疫球蛋白轻链的人源可变结构域，其中不超过两个VL基因区段和/或JL基因区段的每个包含至少一个非组氨酸残基被组氨酸密码子的取代(例如至少一个由相应的人源种系VL和/或JL基因区段编码的非组氨酸密码子被组氨酸取代)。在一些实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段选自由人源Vκ1-39基因区段、人源Vκ3-20基因区段及其组合组成的组。在某些实施方式中，所述不超过两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39基因区段和人源Vκ3-20基因区段。
在一个方面，提供了一种基因修饰的小鼠，所述基因修饰的小鼠包含单一重排的(V/J)人源免疫球蛋白轻链可变区(即VL/JL区)，其编码人源免疫球蛋白轻链的可变结构域，其中所述单一重排的可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在另一个方面，所述小鼠包含不超过两个重排的人源可变区，其能够编码人源免疫球蛋白轻链的可变结构域，其中所述不超过两个重排的可变区的每一个包含至少一个组氨酸密码子取代。
因此，本申请还提供了一种经基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组例如在其种系中包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，所述序列包含人源VL和JL序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(例如至少一个由相应的人源种系VL和/或JL基因区段编码的非组氨酸密码子被组氨酸取代)。在一个方面，除了一个或多个组氨酸取代以外，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于人源种系VL和JL基因序列。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链是人源免疫球蛋白κ链。因此，在一个实施方式中，所述人源VL基因序列选自Vκ1-39和Vκ3-20。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含重排的Vκ1-39/J或Vκ3-20/J序列。在一个实施方式中，所述人源JL基因序列选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在一个实施方式中，所述人源JL序列选自Jκ1和Jκ5。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1(例如除了一个或多个组氨酸取代以外)。在一个替代实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链是人源λ链。
而且，在一个实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其基因组中例如在其种系中包含有限的库，例如不超过两个，未经重排的人源VL基因区段和一个或多个，例如两个或多个(例如2、3、4或5)，未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和/或人源JL基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子例如在种系序列中存在的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在另一个实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其基因组中例如在其种系中包含有限的库，例如不超过两个，未经重排的人源VL基因区段和一个或多个，例如两个或多个(例如2、3、4或5)，未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子例如在相应的人源种系序列中存在的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。因而，在一个方面，在动物种系中的可变基因区段序列是人源种系VL和/或JL基因序列，但是组氨酸取代除外。在重排时，以对所述重排的轻链序列进行设计以含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的方式定位组氨酸取代。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链是人源免疫球蛋白κ链。因此，在一个实施方式中，所述人源VL基因序列选自Vκ1-39和Vκ3-20。因此，在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物在其基因组中例如在其种系中包含未经重排的人源Vκ1-39和未经重排的人源Vκ3-20基因区段以及一个或多个例如两个或多个未经重排的人源JL区段(例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和/或Jκ5基因区段)，其中所述Vκ1-39和Vκ3-20基因区段能够与所述人源JL区段进行重排，并且其中在所述种系中存在的每个可变区基因区段序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，例如在所述种系序列中存在的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在另一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物在其基因组中例如在其种系中包含未经重排的人源Vκ1-39和未经重排的人源Vκ3-20基因区段以及一个或多个例如两个或多个未经重排的人源JL区段(例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和/或Jκ5基因区段)，其中所述Vκ1-39和Vκ3-20基因区段能够与所述人源JL区段重排，并且其中每个Vκ1-39和Vκ3-20基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，以及任选地，所述JL区段还可以包含组氨酸取代。在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物包含Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。因而，在一个实施方式中，在κ轻链基因座的VL和任选地JL序列基本上是种系序列，但是组氨酸取代除外。
在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码轻链可变结构域的互补性决定区(CDR)的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码轻链可变结构域的CDR1、CDR2或CDR3的核苷酸序列中。在一个特定的实施方式中，所述取代在编码CDR3的核苷酸序列中。
在一个方面，所述取代是在人源轻链可变区基因序列的CDR3密码子中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述取代是针对一个、两个、三个、四个或更多个CDR3密码子。在一个实施方式中，其中所述非人动物包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区，其是Vκ1-39Jκ5可变区，或者所述非人动物包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段，其中的一个是Vκ1-39基因区段，在所述Vκ1-39序列中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代包含位置为在编码CDR3的免疫球蛋白轻链基因序列中的取代，其被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106、108和111表达组氨酸。在另一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，组氨酸取代的CDR3区的核酸和氨基酸序列在图2的序列比对中进行了描述并且如SEQ ID NO:4-33所示。在一个实施方式中，野生型CDR3的核酸和氨基酸序列(图2所示)分别如SEQ ID NO:2和3所示。组氨酸取代的CDR3序列的核酸和氨基酸序列的其他实施方式出现在整个说明书和序列表中，并且应该是本领域技术人员知晓的。
在所述实施方式中，其中所述非人动物包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区，其是Vκ3-20Jκ1可变区，或者所述非人动物包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段，其中之一是Vκ3-20基因区段，在Vκ3-20序列中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代包含在编码CDR3区的免疫球蛋白轻链基因序列中的位置的取代，所述取代被设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和109表达组氨酸。在另一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106、107和109表达组氨酸。示例性的组氨酸取代的CDR3区的核酸和氨基酸序列在图12的序列比对中进行了描述并且如SEQ ID NO:76-79所示。野生型CDR3的核酸和氨基酸序列(图12所示)分别如SEQ ID NO:74和75所示。组氨酸取代的CDR3序列的核酸和氨基酸序列的其他实施方式出现在整个说明书和序列表中，并且应该是本领域技术人员知晓的。
氨基酸位置(105、106等)基于Lefranc等，(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55-77中所述的独特编号，并且其也可见于www.imgt.org。
在一个实施方式中，所述人源VL基因区段与人源或非人源前导序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述前导序列是非人源前导序列。在一个特定的实施方式中，所述非人源前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在一个特定的实施方式中，所述前导序列与未经重排的人源VL基因区段可操作地连接。在一个特定的实施方式中，所述前导序列与重排的人源VL/JL序列可操作地连接。因此，在一个特定的实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的单一重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1可变区基因序列与小鼠Vκ3-7前导序列可操作地连接。在另一个特定的实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的所述未经重排的人源Vκ1-39和/或Vκ3-20基因区段与小鼠Vκ3-7前导序列可操作地连接。在又一个实施方式中，所述未经重排的人源Vκ1-39和/或Vκ3-20基因区段与人源Vκ前导序列可操作地连接。在一个实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的所述未经重排的人源Vκ1-39基因区段与人源Vκ1-39前导序列连接，和包含至少一个组氨酸取代的所述未经重排的人源Vκ3-20基因区段与人源Vκ3-20前导序列连接。
在一个实施方式中，所述VL基因区段与免疫球蛋白启动子序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述启动子序列是人源启动子序列。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白启动子是人源Vκ3-15启动子。在另一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白启动子是人源Vκ1-39或Vκ3-20启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子与未经重排的人源VL基因区段可操作地连接。在一个特定的实施方式中，所述启动子与重排的人源VL/JL序列可操作地连接。因此，在一个特定的实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的单一重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1可变区基因序列与人源Vκ3-15启动子可操作地连接。在另一个特定的实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的所述未经重排的人源Vκ1-39和/或Vκ3-20基因区段的每个分别与所述人源Vκ3-15启动子可操作地连接的。在另一个特定的实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的所述未经重排的人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段分别与人源Vκ1-39和Vκ3-20启动子连接。
在一个实施方式中，所述轻链基因座包含(a)5’翼侧(相对于VL基因区段的转录方向)为人源免疫球蛋白启动子和(b)3’翼侧为与人源JL区段重排并且包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代的人源VL基因区段的前导序列；以及所述轻链基因座编码免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含反向嵌合轻链的可变结构域和内源性非人源轻链恒定区(CL)。在一个特定的实施方式中，所述VL和JL基因区段在非人源Vκ基因座，并且所述非人源CL是非人源Cκ(例如小鼠Cκ)。在一个特定的实施方式中，所述可变区序列与非人源恒定区序列例如非人源Cκ基因序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性非人源序列。在另一个特定的实施方式中，所述CL是人源Cκ。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠和所述Cκ基因序列是小鼠Cκ基因序列。在一个实施方式中，与人源JL区段重排并且包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的所述人源VL基因区段是在内源性非人源(例如小鼠)免疫球蛋白轻链基因座(κ基因座)。所述基因座示例性的实施方式参见图31A和33A。
在一个实施方式中，所述轻链基因座包含(a)5’翼侧(相对于VL基因区段的转录方向)为人源免疫球蛋白启动子和(b)3’翼侧为重排的人源可变区序列(VL/JL序列)的前导序列，所述轻链基因座包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且所述轻链基因座编码免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含反向嵌合轻链的可变结构域和内源性非人源轻链恒定区(CL)。在一个特定的实施方式中，所述重排的人源VL/JL序列在非人源κ基因座，并且所述非人源CL是非人源Cκ。在一个特定的实施方式中，所述重排的人源可变区序列与所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列例如非人源Cκ基因序列可操作地连接，所述重排的人源可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性非人源序列。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠并且所述Cκ基因序列是小鼠Cκ基因序列。在一个实施方式中，所述CL是人源CL。在一个实施方式中，包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列是在内源性非人源(例如小鼠)免疫球蛋白轻链基因座(κ基因座)。所述基因座的示例性实施方式见图8C、8E、14C和14D。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的非人动物是小鼠，并且所述小鼠的可变区基因座是κ轻链基因座，并且所述κ轻链基因座包含小鼠κ内含子增强子、小鼠κ3’增强子或者内含子增强子和3’增强子两者。
在一个实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)包含不具有功能的免疫球蛋白λ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述λ轻链基因座包含所述基因座的一个或多个序列的缺失，其中所述一个或多个缺失使得所述λ轻链基因座不能重排形成轻链基因。在另一个实施方式中，所述λ轻链基因座的全部或基本上全部的VL基因区段缺失。在一个实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，所述轻链可变区系列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且所述非人动物缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区，例如内源性未经重排的轻链可变区。在一个实施方式中，所述重排的、组氨酸取代的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列取代内源性未经重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列。在另一个实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)包含不超过两个人源VL和一个或多个例如两个或多个人源JL区段，其中不超过两个人源VL以及任选地一个或多个例如两个或多个人源JL区段的每一个包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，以及其中所述动物缺乏功能性的内源性非人源轻链可变区；在一个实施方式中，所述组氨酸取代的序列取代内源性未经重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列。在另一个实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)包含不超过两个人源VL和一个或多个例如两个或多个人源JL区段，其中所述不超过两个人源VL和/或人源JL区段的每一个包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，以及其中所述动物缺乏功能性内源性非人源轻链可变区；在一个实施方式中，所述组氨酸取代的序列取代内源性未经重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列。
在一个实施方式中，所述动物生成包含来源于人源可变区序列的体细胞突变的可变结构域的轻链，所述体细胞突变的可变结构域包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述轻链包含来源于人源可变区序列的体细胞突变的可变结构域和非人源或人源Cκ区，所述体细胞突变的可变结构域包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述非人动物不表达λ轻链。
本领域技术人员将理解尽管将至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基的取代通过基因工程改造进入人源免疫球蛋白轻链可变区，但是由于体细胞超突变，并不是在经基因修饰的非人动物中生成的所有抗体均在一个或多个工程改造的位置携带一个或多个组氨酸残基。然而，在非人动物中生成的广泛的抗体库将能够选择体内生成抗原特异性抗体，所述抗体对目标抗原具有高亲和性同时保留引入种系的组氨酸修饰，并且优选地显示出pH依赖性抗原结合。
因此，在一个实施方式中，所述动物保留通过在其可变区基因中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代引入的至少一个组氨酸。在一个实施方式中，所述动物在其体细胞突变的轻链可变结构域中保留引入其可变区基因的全部或基本上全部的组氨酸取代。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物在其基因组例如在其种系中还包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区包含VH、DH和JH基因区段序列。在一个实施方式中，所述VH、DH和JH基因区段序列是人源VH、DH和JH基因区段序列，并且所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区是人源重链可变区。在一个实施方式中，所述人源VH、DH和JH基因区段序列与非人源重链恒定区序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述非人源重链恒定区序列是内源性非人源重链恒定区序列。在另一个实施方式中，所述重链恒定区序列是人源重链恒定区序列。在一个实施方式中，所述人源重链基因区段序列在内源性非人源免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，在非人动物中包含的所述人源免疫球蛋白重链可变区序列还包含至少一个由相应的种系序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
在一个实施方式中，本申请所述的非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含非人源轻链恒定区序列。在一个实施方式中，所述非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含人源轻链恒定区序列。
在一个实施方式中，本申请所述的非人动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含选自下组的非人源序列：CH1序列、铰链序列、CH2序列、CH3序列及其组合。
在一个实施方式中，所述非人动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含选自下述的人源序列：CH1序列、铰链序列、CH2序列、CH3序列及其组合。
在所述动物包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区的实施方式中，所述免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代，或者其中所述动物包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个(例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(或者其中每个未经重排的人源VL和/或人源JL基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代)，在所述动物种系中的所述可变区序列或人源VL和JL区段在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。在一个特定的实施方式中，在所述动物种系中包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的所述重排的免疫球蛋白轻链序列，取代了在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座的全部或基本上全部的内源性非人源轻链V和J区段序列。在另一个特定的实施方式中，在所述动物种系中的所述不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个(例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段取代在所述内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座的全部或基本上全部的内源性非人源轻链V和J区段序列，其中各个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(或者其中各个未经重排的人源VL和/或JL基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代)。
在一个实施方式中，所述非人动物包含内源性VH基因区段被一个或多个人源VH基因区段取代，其中所述人源VH基因区段与非人源CH区基因可操作地连接，以使得所述非人动物重排所述人源VH基因区段并且表达包含人源VH结构域和非人源CH的反向嵌合免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，90-100％的未经重排的非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个特定的实施方式中，全部或基本上全部(例如90-100％)的内源性非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少19个、至少39个或者至少80个或81个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少12个具有功能的未经重排的人源VH基因区段、至少25个具有功能的未经重排的人源VH基因区段或至少43个具有功能的未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述非人动物包含全部非人源DH和JH区段被至少一个未经重排的人源DH区段和至少一个未经重排的人源JH区段取代。在一个实施方式中，所述非人动物包含全部非人源DH和JH区段被全部未经重排的人源DH区段和全部未经重排的人源JH区段取代。
非人动物例如小鼠，所述非人动物在其基因组中(例如在其种系中)包含有限的人源免疫球蛋白轻链可变区库(例如单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区(例如Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1)，例如如本申请所述不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个)人源JL基因区段)和多样性的未经重排的人源VH、DH和JH区段库，所述人源免疫球蛋白轻链可变区具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，所述非人动物能够生成由来源于未经重排的人源VH、DH和JH区段的各种置换的重链可变区序列编码的抗原结合蛋白，其中在所述重链可变序列中存在的所述VH、DH和JH区段来源于所述动物的基因组中存在的全部或基本上全部具有功能的人源VH、DH和JH区段。本申请所述的基因修饰动物的细胞例如B细胞中表达的重链可变结构域序列的各种可用的可能性(即来源于各种具有功能的人源V、D和J区段的组合)在美国申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300、2013/0045492、2013/0185821和2013/0198880中所述，其均通过引用并入本申请。在各种实施方式中，在所述非人动物的种系中包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列或不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段(其包含如本申请所述的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代)和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列。在一些实施方式中，本申请所述的非人动物能够生成由其双轻链基因座编码的表位结合蛋白。
在一个实施方式中，包含组氨酸取代的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的所述非人动物包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列中一个或全部两个的一个拷贝，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在另一个实施方式中，所述非人动物包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列中的一个或全部两个的两个拷贝，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。因此，所述非人动物针对一个或全部两个重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列是纯合子或杂合子，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
在另一个实施方式中，包含不超过两个组氨酸取代的人源VL基因区段和一个或多个JL区段(例如两个或多个JL区段)的非人源动物是这样的，其两个组氨酸取代的人源VL基因区段在所述动物的基因组中是并列的。在一些实施方式中，所述非人源动物包含一个拷贝的所述基因座，其中所述两个组氨酸取代的人源VL基因区段是并列的；在其他实施方式中，所述非人动物包含两个拷贝的所述基因座，其中所述两个组氨酸取代的人源VL基因区段是并列的。因而，在一些实施方式中，所述非人动物是针对免疫球蛋白轻链基因座的纯合子或杂合子，所述免疫球蛋白轻链基因座包含不超过两个并列的人源VL基因区段。在一些实施方式中，所述两个组氨酸取代的人源VL基因区段在所述动物基因组中的不同基因座(例如杂合子，包含在第一轻链等位基因的第一组氨酸取代的人源VL区段，和在第二轻链等位基因的第二组氨酸取代的人源VL区段，其中所述第一和第二人源VL区段是不同的)。在一些实施方式中，所述动物针对未经重排的人源免疫球蛋白重链可变基因座也是杂合子或纯合子。在一些实施方式中，所述两个人源组氨酸取代的VL基因区段是人源Vκ1-39基因区段和人源Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述人源JL基因区段选自由Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其配对组合组成的组。在不同的实施方式中，所提供的基因工程改造的非人动物不能表达含有内源性VL基因区段的免疫球蛋白轻链。例如，在一些实施方式中，所提供的基因工程改造的非人动物含有不具有活性的基因修饰和/或除去部分或全部内源性的VL基因区段。
除了在其基因组中包含免疫球蛋白轻链可变区基因序列(例如具有有限的轻链可变基因区段库的免疫球蛋白轻链可变区序列，例如单一重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列，例如包含不超过两个VL基因区段和一个或多个JL基因区段的序列)的经基因修饰的非人动物以外，所述免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代(例如在轻链的CDR3中)，本申请还提供了经基因修饰的非人动物，所述非人动物包含具有一个或多个组氨酸密码子的加入/插入的免疫球蛋白轻链可变区基因序列，以使得所表达的可变结构域包含加入的一个或多个氨基酸，如果不是体细胞超突变的，则所述氨基酸是组氨酸。在一个实施方式中，可以通过将人源组氨酸取代的DH序列插入所述小鼠的人源轻链基因座引入此类组氨酸密码子加入。而且，本申请所述的在其轻链可变结构域中包含组氨酸修饰的动物还可以在其重链可变结构域中含有组氨酸修饰，例如动物还可以在人源重链可变结构域中含有组氨酸修饰。
包含如本申请所述的具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列的经基因修饰的非人动物可以选自下组：小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、犬、雪貂、灵长类(例如狨猴、恒河猴)。对于合适的经基因修饰的ES细胞是不易获得的非人动物而言，使用与本申请所描述的那些方法不同的方法来制备包含经基因修饰的非人动物。这种方法包含例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导性多能细胞)和使用核转移将所述经修饰的基因组转移至适宜的细胞例如卵母细胞，并且在适宜条件下在非人动物中妊娠所述经修饰的细胞(例如经修饰的卵母细胞)以形成胚胎。在另一个实施方式中，本申请所述的非人动物可以通过四倍体互补产生。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科(Dipodoidea)总科或鼠科(Muroidea)总科的。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠科总科。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一个特定的实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠和黄冠鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定的实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其是C57BL品系的小鼠，选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一个实施方式中，所述小鼠是选自下组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等，(1999)Revised nomenclature for strain 129mice(129小鼠品系经修订的命名法),Mammalian Genome 10:836，亦参见Auerbach等(2000)Establishment andChimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem CellLines(129/SvEv-和C57BL/6-来源的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析))。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在另一个特定实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合物或前述BL/6品系的混合物。在一个特定实施方式中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在又一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系和另一个前述品系的混合物。
在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合物：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。
因此，在一个实施方式中，所述经基因修饰的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述经基因修饰的非人动物是大鼠或小鼠。在一个实施方式中，所述动物是小鼠。因此，在一个实施方式中，本申请提供了经基因修饰的小鼠，所述小鼠在其基因组中例如在其种系中包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区，所述人源免疫球蛋白轻链可变区包含人源VL和JL基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个由相应的人源种系序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区(例如缺乏具有功能的未经重排的V和J基因区段序列)。在一个实施方式中，具有一个或多个组氨酸密码子取代的所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区是Vκ1-39/Jκ或Vκ3-20/Jκ可变区。在一个实施方式中，所述J区段序列选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在一个实施方式中，所述J区段是Jκ1或Jκ5。在一个实施方式中，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代是在编码CDR3区的核苷酸序列中。在一个实施方式中，其中所述重排的可变区序列是Vκ1-39/Jκ5序列，所述一个或多个组氨酸取代被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达。在另一个实施方式中，其中所述重排的可变区序列是Vκ3-20/Jκ1序列，所述一个或多个组氨酸取代被设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达。在一个实施方式中，具有一个或多个取代的组氨酸密码子的所述重排的免疫球蛋白轻链可变区与内源性小鼠免疫球蛋白恒定区基因序列(例如Cκ基因序列)可操作地连接。在一个实施方式中，所述小鼠在其基因组中例如在其种系中还包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区包含人源VH、DH和JH区段。在一个实施方式中，所述人源VH、DH和JH区段与内源性小鼠免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接。在各种实施方式中，在所述小鼠的种系中包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
而且，在一些实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述基因修饰的小鼠在其基因组例如在其种系中包含有限的库，例如不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个(例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和/或人源JL基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，例如在相应的人源种系序列中存在的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。在一些实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述基因修饰的小鼠在其基因组例如在其种系中包含有限的库，例如不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个(例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代，例如在相应的人源种系序列中存在的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏功能性的未经重排的内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区(例如缺乏功能性的未经重排的内源性免疫球蛋白V和J基因区段序列)。在一个实施方式中，所述不超过两个未经重排的人源VL基因区段是Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述J区段序列是选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代是在编码CDR3区的核苷酸序列中。在一个实施方式中，其中所述未经重排的VL区段是Vκ1-39基因区段，所述组氨酸取代被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达。在另一个实施方式中，其中所述未经重排的VL区段是Vκ3-20区段，所述组氨酸取代被设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达。在一个实施方式中，包含含有组氨酸密码子取代的不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段的免疫球蛋白轻链可变区序列与内源性小鼠免疫球蛋白恒定区基因序列(例如Cκ基因序列)可操作地连接。在一个实施方式中，包含含有组氨酸密码子取代的不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段的免疫球蛋白轻链可变区序列与人源免疫球蛋白恒定区基因序列(例如Cκ基因序列)可操作地连接。在一个实施方式中，所述小鼠在其基因组例如在其种系中还包含含有人源VH、DH和JH区段的未经重排的免疫球蛋白重链可变区。在一个实施方式中，人源VH、DH和JH区段与内源性小鼠免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接。在另一个实施方式中，人源VH、DH和JH区段与人源免疫球蛋白重链恒定区序列可操作地连接。在不同的实施方式中，在所述小鼠的种系中包含免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列，所述免疫球蛋白轻链可变区序列包含含有组氨酸密码子取代的不超过两个人源VL基因区段和一个或多个例如一个或两个人源JL基因区段。
本申请还提供了用于生成本申请所述的经基因修饰的非人动物例如小鼠的靶向载体。在一个方面，本申请提供了一种靶向载体，所述靶向载体包含：5’小鼠同源臂、人源或小鼠免疫球蛋白启动子、人源或小鼠前导序列、人源可变区和3’小鼠同源臂，所述人源可变区选自重排的人源Vκ1-39Jκ5或重排的人源Vκ3-20Jκ1并且包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述5’和3’同源臂将所述载体靶向至相对于增强子序列的5’端，所述增强子序列在所述小鼠Cκ基因的5’端和近端。。在另一个实施方式中，所述靶向载体包含5’小鼠同源臂、后接翼侧为重组位点的选择性表达盒、人源或小鼠免疫球蛋白启动子、人源或小鼠前导序列、人源可变区、后接包含小鼠增强子和恒定区(Cκ)序列的3’小鼠同源臂，所述人源可变区选自重排的人源Vκ1-39Jκ5或重排的人源Vκ3-20Jκ1并且包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
在另一个方面，本申请提供了一种靶向载体，所述靶向载体包含：5’小鼠同源臂；人源可变区，所述人源可变区包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个，例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因区段序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，例如在所述人源种系序列中存在至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，和其中每个未经重排的VL基因区段与人源或小鼠前导序列和人或小鼠启动子可操作地连接；以及3’小鼠同源臂。在一个实施方式中，所述5’和3’同源臂将所述载体靶向至相对于增强子序列的5’端，所述增强子序列在所述小鼠Cκ基因的5’端和近端。。在另一个实施方式中，所述靶向载体包含：5’小鼠同源臂，其后接翼侧为重组位点的选择性表达盒；人源可变区，所述人源可变区包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个，例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因区段序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，例如在所述种系序列中存在的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，和其中每个未经重排的VL基因区段与人源或小鼠前导序列和人或小鼠启动子可操作地连接；后接3’小鼠同源臂，所述3’小鼠同源臂包含小鼠增强子和恒定区(Cκ)序列。
选择性表达盒是插入靶向构建体的核苷酸序列，以便于选择具有整合了目标构建体的细胞(例如细菌细胞，ES细胞等)。多种适宜的选择性表达盒是本领域公知的。通常，在存在特定抗生素(例如Neo、Hyg、Pur、CM、Spec等)的条件下选择性表达盒能够得到阳性选择。此外，选择性表达盒的翼侧可以是重组位点，这使得在使用重组酶处理后可以将选择性表达盒去除。常用的重组位点是loxP和Frt，其分别由Cre和Flp酶识别，但其他的也是本领域公知的。
在一个实施方式中，所述启动子是人源免疫球蛋白可变区基因区段启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是人源Vκ3-15启动子。在另一个实施方式中，所述启动子是人源Vκ1-39或Vκ3-20启动子。在一个实施方式中，所述前导序列是小鼠前导序列。在一个特定的实施方式中，所述小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在另一个实施方式中，所述前导序列是人源前导序列。在一个特定的实施方式中，所述人源前导序列是人源Vκ1-39或Vκ3-20前导序列。包含单一重排的人源可变区的所述靶向载体的示例性实施方式见于图8B和14B。包含含有不超过两个未经重排的人源VL基因区段和多个人源JL基因区段的人源可变区的所述靶向载体的示例性实施方式见图31A和33A。
在一个方面，本申请提供了如上文所述的靶向载体，但是在5’小鼠同源臂的位置，人源或小鼠启动子的5’翼侧是位点特异性重组酶识别位点(SRRS)，并且在3’小鼠同源臂的位置，人源VL区的3’翼侧是SRRS。
本申请还提供了制备如本申请所述的经基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的方法。在一个方面，如实施例中所述，用于制备如本申请所述的经基因修饰的非人动物的方法利用靶向载体，通过使用
Figure BDA0002313130650000541
技术、将所述构建体引入ES细胞并且使用
Figure BDA0002313130650000542
技术将靶向ES细胞克隆引入小鼠胚胎来制备。可以使用多种分子生物学技术例如位点定向突变或从头DNA合成将组氨酸修饰引入所述靶向载体。在基因靶向完成后，筛选经基因修饰的非人动物的ES细胞以确证成功整合了外源性目标核苷酸序列或表达外源性多肽。多种技术是本领域技术人员所公知的，所述技术包括(但不限于)Southern印迹、长PCR、定量PCR(例如使用
Figure BDA0002313130650000543
的实时PCR)、荧光原位杂交、Northern印迹、流式细胞术、Western分析、免疫细胞化学、免疫组织化学等。在一个例子中，可以通过使用Valenzuela等，(2003)High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659中所述的改进的等位基因实验来筛选小鼠等位基因的缺失和/或人源等位基因的获得，从而鉴定携带目标基因修饰的非人动物(例如小鼠)。在经基因修饰的动物中鉴定特异性核苷酸或氨基酸序列的其他实验是本领域技术人员公知的。
因此，在一个实施方式中，生成经基因修饰的非人动物的方法包括使用人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列(包含人源VL和JL基因区段)取代在所述动物中的免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述人源免疫球蛋白可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代发生在编码CDR区例如CDR3区的核苷酸序列中。
在一个实施方式中，生成如本申请所述的经基因修饰的非人动物的方法包括使用单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列取代在所述动物中的免疫球蛋白轻链可变区基因序列，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含人源VL和JL基因区段序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区基因序列包含至少一个不是由相应的人源种系序列编码的组氨酸，例如其中所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，例如至少一个由相应的人源种系序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述取代在CDR密码子中。在一个实施方式中，所述取代是针对1个、2个、3个、4个或更多个CDR3密码子。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列是基于选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1的人源种系重排的轻链可变区序列。因此，在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于Vκ1-39Jκ5，设计至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于Vκ3-20κ1，设计至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。
在又一个实施方式中，所述生成本申请所述的基因修饰的非人动物的方法包括使用免疫球蛋白轻链可变基因序列(包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个，例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因序列包含至少一个不是由相应的人源种系可变基因区段编码的组氨酸，例如在所述人源种系序列中存在的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代)取代在所述动物中的免疫球蛋白轻链可变区基因序列。在一个实施方式中，所述取代在CDR密码子中。在一个实施方式中，所述取代是一个、两个、三个、四个或更多个CDR3密码子。在一个实施方式中，所述不超过两个未经重排的人源VL基因区段是Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述未经重排的人源JL区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其组合。因而，在一个实施方式中，其中所述未经重排的人源VL基因区段是Vκ1-39，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，其中所述未经重排的人源VL基因区段是Vκ3-20，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。
在另一个实施方式中，生成本申请所述的非人动物(即包含本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白轻链基因座)的方法包括修饰非人动物的基因组，以便在免疫球蛋白轻链基因座中缺失内源性免疫球蛋白轻链V和J区段或使其不具有功能，并且(1)将单一重排的人源轻链可变区基因序列置于基因组中，所述单一重排的人源轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代或者(2)将免疫球蛋白轻链可变基因序列置于基因组中，所述免疫球蛋白轻链可变基因序列包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个，例如2、3、4或5)未经重排的人源JL基因区段，其中每个未经重排的人源VL和任选地人源JL基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代(或者其中每个人源VL和/或人源JL基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代)。在一个实施方式中，所述方法生成经基因修饰的非人动物，所述非人动物包含富含显示出与目标抗原以pH依赖的结合的抗体的B细胞群。
在一些实施方式中，生成本申请所述的经基因修饰的非人动物的方法包括在所述动物中使用人源免疫球蛋白轻链可变基因区序列取代免疫球蛋白轻链可变区基因序列，所述人源免疫球蛋白轻链可变基因区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代，所述动物还包含使用人源免疫球蛋白重链可变区基因序列取代内源性非人源免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述人源免疫球蛋白重链可变区基因序列包含如上文所述的各个或人源VH、DH和JH序列库中的至少一个。在一个实施方式中，为了生成某种非人动物，所述非人动物包含内源性免疫球蛋白轻链可变区基因序列被人源轻链可变区基因序列取代和内源性非人源免疫球蛋白重链可变区基因序列被人源免疫球蛋白重链可变区基因序列取代，所述人源轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，将具有轻链可变区基因序列取代的动物与具有重链可变区基因序列取代的动物繁殖。
发明人目前提供了基因工程改造的非人动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)，所述非人动物表达抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含通用轻链例如人源通用轻链(例如来源于单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区的轻链)，或具有有限的或受限制的可变区段库的轻链(例如包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个)未经重排的人源JL基因区段)，所述轻链包含一个或多个组氨酸修饰，其中所述抗原结合蛋白显示出与靶抗原以pH依赖性的抗原结合。在一些实施方式中，所述动物被基因工程改造以包含含有一个或多个组氨酸修饰的轻链CDR3。在各种实施方式中，所述轻链CDR3包含在一簇中的两个、三个或四个或者更多个组氨酸残基。
在一个实施方式中，本申请提供了基因工程改造的非人动物(例如小鼠或大鼠)，所述非人动物包含B细胞群，所述B细胞群的特征为与野生型动物相比在免疫球蛋白轻链例如免疫球蛋白可变结构域(例如免疫球蛋白CDR)中存在增多的组氨酸。在一个实施方式中，组氨酸存在增多约2至4倍。在一个实施方式中，组氨酸增多约2至10倍。
在一个实施方式中，本申请提供了基因工程改造的非人动物，所述非人动物包含抗原特异性抗体群，所述抗原特异性抗体由于在轻链可变区基因序列中有密码子修饰而表达一个或多个组氨酸残基，并且显示出pH依赖性的靶抗原结合。在一个实施方式中，这些动物包含B细胞群，与在本申请所述的免疫球蛋白轻链可变区中不包含至少一个由人源种系序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的动物中生成的抗原特异性抗体群相比，所述B细胞富含显示出pH依赖性结合性质(例如在酸性pH与在中性pH相比，解离半衰期(t1/2)降低)的抗体例如抗原特异性抗体。在一个实施方式中，在本申请所述的基因工程改造的动物中生成的显示出pH依赖性抗原结合性质的抗原特异性抗体的富集程度，与在轻链可变区中包含组氨酸取代的相似动物相比高约2倍，例如高约5倍，例如高约10倍。在一个实施方式中，所述富集是约2-3倍。因此，本发明的经基因修饰的动物富含具有改善的抗体再循环性质的抗体，这是为了减少靶点介导的清除以及降低基于这种在体内生成的抗体形式而开发的治疗性抗原结合蛋白的剂量和/或给药频率所需要的。
因此，本申请提供了在本申请所述经基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白显示出pH依赖性抗原结合。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是抗体，例如抗原特异性抗体。在一个实施方式中，所述抗体包含轻链，所述轻链包含来源于重排的人源免疫球蛋白轻链可变基因区段的人源轻链可变结构域，在所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变基因区段的种系基因序列中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代，并且其中所述抗体在其表达的人源轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代。在另一个实施方式中，所述抗体包含轻链，所述轻链包含来源于单一重排的人源轻链可变区基因序列的人源轻链可变结构域，其中所述单一重排的轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且其中所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗体包含来源于人源Vκ1-39/J或Vκ3-20/J(例如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1)重排的轻链，其中所述人源Vκ1-39J或Vκ3-20J基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，和其中所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留至少一个组氨酸取代。在另一个实施方式中，所述抗体包含轻链，所述轻链包含来源于在种系基因座中存在的轻链可变区基因序列重排的人源轻链可变结构域，其中在所述种系基因座中存在的轻链可变区基因序列包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个)未经重排的人源JL基因区段，并且每个未经重排的人源VL基因区段和任选地人源JL基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且其中所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代。在一些实施方式中，所述抗体包含来源于与J区段重排的人源Vκ1-39或Vκ3-20，其中该重排的人源Vκ1-39Jκ或Vκ3-20Jκ基因序列包含含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且其中所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代。在一些实施方式中，所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了全部或基本上全部的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗体在其轻链可变结构域中保留所有组氨酸取代的至少50％、至少66％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％。在一个实施方式中，所述取代是在编码轻链可变区基因序列的CDR3的核苷酸序列中三个非组氨酸密码子被三个组氨酸密码子取代，并且所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了全部三个组氨酸取代。在另一个实施方式中，所述取代是在编码所述轻链可变区基因序列CDR3的核苷酸序列中三个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留两个或三个组氨酸取代。在一个实施方式中，所述取代是在编码轻链可变区基因序列的CDR3的核苷酸序列中四个非组氨酸密码子被四个组氨酸密码子取代，并且所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了三个或四个组氨酸取代。在其他实施方式中，所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留一个、两个、三个、四个和可达全部的组氨酸修饰。
在一个实施方式中，所述抗体的轻链还包含非人源轻链恒定区氨基酸序列，例如内源性轻链恒定区氨基酸序列。此外，在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成的所述抗体例如抗原特异性抗体还包含重链，所述重链包含来源于重排的人源重链V、D和J区段的人源重链可变结构域。人源重链V、D和J区段可以选自在内源性非人源重链基因座存在的人源重链区段库，所述区段例如在至少一个具有功能的V、在至少一个具有功能的D和在至少一个具有功能的J区段，例如达到具有功能的人源V、D和J区段的完整的库。示例性的人源重链可变区段的可能性的重排可以收集自IMGT数据库中的具有功能的人源V、D和J区段列表，以及收集自美国申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192309和2013/0045492，其通过引用并入本申请。而且，在一个实施方式中，所述抗体的重链包含非人源重链恒定区氨基酸序列，例如内源性非人源重链恒定区氨基酸序列。在一个实施方式中，所述非人源重链恒定区包含CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在一个实施方式中，所述抗体是IgG、IgE、IgD、IgM或IgA同种型。
因此，在一个实施方式中，本申请提供了在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(a)来源于人源Vκ1-39向Jκ重排(例如Vκ1-39Jκ5重排)的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，其中所述轻链在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代，和(b)非人源(例如小鼠)轻链恒定区氨基酸序列，其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(a)来源于人源V、D和J区段重排的重链可变结构域，其中所述V、D和J区段选自在所述动物中存在的人源V、D和J区段库，和(b)非人源(例如小鼠)重链恒定区氨基酸序列。在一个实施方式中，所述人源V、D和J区段库包含至少一个具有功能的V、至少一个具有功能的D和至少一个具有功能的J区段，例如达到具有功能的人源V、D和J区段的完整的库。在一个实施方式中，所述重链和轻链恒定结构域是内源性重链和轻链恒定结构域。在一个实施方式中，所述重链和轻链可变结构域是体细胞突变的结构域。在一个实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了引入种系序列的至少一个组氨酸取代。在一些实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了引入种系序列的全部或基本上全部的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白显示出pH依赖性的抗原结合性质。
在另一个实施方式中，本申请提供了在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(a)来源于人源Vκ3-20向Jκ重排(例如Vκ3-20Jκ1重排)的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，其中所述轻链在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代，和(b)非人源(例如小鼠)轻链恒定区氨基酸序列，其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(a)来源于人源V、D和J区段重排的重链可变结构域，其中所述V、D和J区段选自在所述动物中存在的人源V、D和J区段库，和(b)非人源(例如小鼠)重链恒定区氨基酸序列。在一个实施方式中，所述人源V、D和J区段库包含至少一个具有功能的V、至少一个具有功能的D和至少一个具有功能的J区段，例如达到具有功能的人源V、D和J区段的完整的库。在一个实施方式中，所述重链和轻链恒定区是内源性重链和轻链恒定区。在一个实施方式中，所述重链和轻链可变结构域是体细胞突变的结构域。在一个实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了引入种系序列的至少一个组氨酸取代。在一些实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了引入种系序列的全部或基本上全部的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白显示出pH依赖性的抗原结合性质。
在一个实施方式中，本申请还提供了本申请所述的经基因修饰的动物的B细胞，所述B细胞在其种系中包含本申请所述的组氨酸修饰的人源轻链可变区序列，例如组氨酸修饰的单一重排的人源轻链可变区序列或者组氨酸修饰的人源轻链可变区序列，所述组氨酸修饰的人源轻链可变区序列包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个)未经重排的人源JL基因区段，如本申请所述的，并表达本申请所述的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，在B细胞中表达的所述抗原结合蛋白(例如抗体)保留了引入种系中的至少一个组氨酸残基，并且显示出pH依赖性的抗原结合性质。在一些实施方式中，在B细胞中表达的所述抗原结合蛋白(例如抗体)保留了引入种系中的全部或基本上全部的组氨酸残基，并且显示出pH依赖性的抗原结合性质。
在各种实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物包含人源轻链可变区基因序列例如组氨酸修饰的单一重排的人源轻链可变区基因序列(例如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1序列)，或者组氨酸修饰的人源轻链可变区序列，所述组氨酸修饰的人源轻链可变区序列包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段和一个或多个(例如两个或多个)未经重排的人源JL基因区段，所述人源轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(或者引入种系序列中的加入的组氨酸密码子)。这些加入或取代生成了包含B细胞群的非人动物，所述B细胞群富含针对其抗原具有pH依赖性结合性质的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，在本申请所述的非人动物中针对抗原刺激生成的抗原结合蛋白(例如抗体)显示出pH依赖性的抗原结合，同时在中性pH下显示出针对抗原的高亲和性，所述中性pH例如约7.0至约8.0之间的pH，例如约7.0至约7.4之间的pH，例如约7.2至约7.4之间的pH，例如生理pH。在一个实施方式中，在中性pH下所述抗原结合蛋白对其抗原的亲和性以解离常数(KD)计低于10-6M、例如低于10-8M、例如低于10-9M、例如低于10-10M、例如低于10-11M、例如低于10-12M。
在一个实施方式中，在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白(例如抗体)在酸性pH下(例如pH 6.0或更低、例如pH在约5.0至约6.0之间、pH约5.75至约6.0之间，例如内体或溶酶体隔室的pH)与中性pH相比，显示出与其抗原降低的结合。在一个实施方式中，在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白(例如抗体)在酸性pH下显示出与抗原没有结合，而在中性pH下保持与抗原的结合。在一个实施方式中，在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下所述抗原结合蛋白的解离半衰期(t1/2)相比，降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白在酸性pH和37℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白在酸性pH和37℃下具有的t1/2为短于约1min。在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白在酸性pH和25℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白在酸性pH和25℃下具有的t1/2为短于约1min。
动力学参数如平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)可以由动力学速率常数计算：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝ln2/(60*kd)。
在一个实施方式中，在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白(例如抗体)显示出与FcRn分子增加的结合。如上文所述，FcRn是在内体隔室内存在的受体，所述受体能够在酸性pH下结合免疫球蛋白并且将免疫球蛋白再循环回表面。筛选在本申请所述的经基因修饰的非人动物中的抗体分子为选择具有下述三个有益参数的抗体提供了独特的机会：对抗原具有高亲和性、pH依赖性抗原结合(在酸性pH下具有较弱的抗原结合)和与FcRn增强的结合。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物包含对抗原生成应答的B细胞群并且所述B细胞群富含抗原结合蛋白例如抗体，当将所述抗原结合蛋白重新制成治疗剂时，与在其人源轻链可变区基因序列中不包含一个或多个组氨酸修饰的非人动物中针对相同抗原应答生成的等价B细胞群相比，以治疗剂量给予对象时显示出增加的血清半衰期。因此，在一个实施方式中，在本申请所述的经基因修饰的非人动物中针对目标抗原应答生成的抗原结合蛋白例如抗体，当将所述抗原结合蛋白重新制成治疗剂并以治疗剂量给予对象时，与在其人源轻链可变区基因序列中不包含一个或多个组氨酸修饰的非人动物中针对相同抗原应答生成的抗原结合蛋白(当将所述抗原结合蛋白重新制成治疗剂并且以相同的治疗剂量给予时)的血清半衰期相比，显示出增加的血清半衰期。在一些实施方式中，血清半衰期的增加是约2倍，例如约5倍、例如约10倍、例如约15倍、例如约20倍或更高。
在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述的非人动物的多能细胞、诱导型多能细胞或全能细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是胚胎干(ES)细胞。
在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述的非人动物的组织。在一个实施方式中，所述组织来源于如本申请所述的非人动物的脾脏、淋巴结或骨髓。
在一个方面，本申请提供了来源于如申请所述的非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述细胞核来自不是B细胞的二倍体细胞。
在一个方面，本申请所提供了分离自如本申请所述的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的非人细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是淋巴细胞。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述B细胞表达嵌合重链，所述嵌合重链包含来源于人源重链基因区段的可变结构域；和轻链，所述轻链来源于具有至少一个在所述种系中的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的重排的人源Vκ1-39/J序列，具有至少一个在所述种系中的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的重排的人源Vκ3-20/J序列或其组合，其中所述轻链包含在种系中编码的至少一个氨基酸被组氨酸的取代；其中所述重链可变结构域与非人源或人源重链恒定区融合，并且所述轻链可变结构域与非人源或人源轻链恒定区融合。在另一个实施方式中，所述B细胞表达嵌合的重链，所述嵌合的重链包含来源于人源重链基因区段的可变结构域；和轻链，所述轻链来源于人源Vκ1-39向人源J序列的重排，其具有至少一个在所述种系中的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，或者来源于人源Vκ3-20向人源J序列的重排，其具有至少一个在所述种系中的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，其中所述轻链包含至少一个在所述种系中编码的氨基酸被组氨酸的取代；其中所述重链可变结构域与非人源或人源重链恒定区融合和所述轻链可变结构域与非人源或人源轻链恒定区融合。
在一个方面，本申请提供了杂交瘤，其中所述杂交瘤由如本申请所述的非人动物的B细胞制备。在一个特定的实施方式中，所述B细胞来自如本申请所述的小鼠，所述小鼠已使用包含目标表位的免疫原免疫，并且所述B细胞表达与目标表位结合的结合蛋白，所述结合蛋白具有体细胞突变的人源可变重链结构域和小鼠CH，并且具有来源于(1)重排的人源Vκ1-39Jκ5、(2)人源Vκ1-39向人源J的重排、(3)重排的人源Vκ3-20Jκ1或(4)人源Vκ3-20向人源J的重排的人源可变轻链结构域，其均在所述种系中携带至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，和小鼠CL；其中所述人源轻链结构域包含至少一个在种系中编码的氨基酸被组氨酸的取代。
本申请还提供了一种细胞，所述细胞表达在本申请所述的非人动物中生成的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
在一个方面，本申请提供了一种非人胚胎，其中所述胚胎包含来源于如本申请所述的非人动物的供体ES细胞。
本申请所述的非人动物对生成表达在CDR3中具有组氨酸的抗体的B细胞是有用的。在CDR3中安置组氨酸的动物在通常情况下对制备抗体是有用的，并且对于开发在中性pH或中性pH附近以足够的亲和性结合靶点、但是在酸性pH下不结合或较弱地结合相同靶点的抗体是特别有用的。
所述非人动物对生成抗体的可变区是有用的，所述抗体的可变区能够用于制备例如通过在CDR3中包含组氨酸的人源免疫球蛋白可变结构域来结合其靶点的人用治疗性结合蛋白。在较低pH下改变的结合将在一些情况下提供更快的周转，因为治疗剂将在细胞表面上结合靶点、内化进入内体，并且在内体中更容易或更迅速地从靶点上解离，这样所述治疗剂能够再循环并与靶点上的其他分子(例如在其他细胞或同一细胞上)结合。在一些情况下，这将导致能够以更低的剂量给予治疗剂，或以更低的频率给予治疗剂。这对于出于安全性或毒性原因不希望频繁地给药或以超过一定剂量给药是特别有用的。其结果是，当给予对象时所述抗体治疗剂的血清半衰期将增加。
所述非人动物(例如啮齿动物例如小鼠或大鼠)在用于在动物中增加B细胞数量的方法中是有用的，所述B细胞显示出具有在其中含有一个或多个组氨酸的CDR3的抗体可变区。所述非人动物对于生成将显示出pH依赖性抗原结合的抗体序列是有用的。所述非人动物对于从单一免疫生成更大数量的抗体序列是有用的，其中所述抗体将显示出pH依赖性抗原结合。
抗原结合蛋白和生成抗原结合蛋白的方法
在一个方面，本申请还提供了由本申请所述的经基因修饰的非人动物使用本领域中使用的标准方法来生成人源抗原结合蛋白(例如抗体)的方法，所述人源抗原结合蛋白显示出pH依赖性的抗原结合。
多种用于生产抗体的技术已有描述。例如，在各种实施方式中，在如本申请所述的小鼠中生产嵌合抗体。能够直接从经免疫的小鼠的B细胞中分离抗体(参见例如U.S.2007/0280945A1)和/或经免疫的小鼠的B细胞能够用于制备杂交瘤(Kohler和Milstein,1975,Nature 256:495-497)。编码来自如本申请所述的非人动物的抗体(人源重链和/或轻链)的DNA使用常规技术易于分离和测序。来源于如本申请所述的非人动物的杂交瘤和/或B细胞是这种DNA的优选来源。一旦分离，可以将所述DNA放入表达载体中，然后将所述载体转染进入不另外生成免疫球蛋白的宿主细胞中，以获得在重组的宿主细胞中单克隆抗体的合成。所述DNA还可以被修饰，例如通过使用人源重链和轻链恒定结构域的编码序列取代非人源序列。因此，一旦具有所需特性例如亲和性、表位、pH依赖性抗原结合等的抗体的核酸序列被确定，则使用所需的人源恒定区序列取代非人源恒定区基因序列以生成含有非IgM同种型例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的全人源抗体。
因此，在一个实施方式中，本申请提供了生成显示出pH依赖性抗原结合性质的抗体的方法，所述方法包括生成如本申请所述的非人动物(例如小鼠)，使用目标抗原免疫小鼠，使非人动物针对所述抗原激发免疫应答，并且在所述非人动物中选择显示出pH依赖性抗原结合性质的抗原特异性抗体，例如与在中性pH相比在酸性pH下显示出与所述抗原更弱的结合。
本申请还提供了制备多特异性抗原结合蛋白(例如双特异性或三特异性抗原结合蛋白)的方法。这些是能够以高亲和性与一个以上的表位结合的分子。本发明的优点包含能够选择适宜的高度结合的(例如亲和性成熟的)重链免疫球蛋白链的能力，所述各个重链免疫球蛋白链将均与单一轻链结合。此外，本发明的优点包含能够生成显示出pH依赖性抗原结合的多特异性(例如双特异性或三特异性)抗原结合蛋白。使用下文所述的双特异性抗体的不同方面还可以适用于三特异性或其他多特异性抗体。
由于双特异性抗体的双重性质(即，可以对一个多肽的不同表位具有特异性或可以含有针对一个以上的靶多肽具有特异性的抗原结合结构域，参见例如Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,Trends Biotechnol.22:238-244)，双特异性抗体提供了多种针对治疗性应用的有用的优点。例如，所述双特异性抗体能够作为疫苗佐剂用于重新定向细胞毒性(例如杀死肿瘤细胞)，用于向凝块递送血栓溶解剂，作为在靶位点(例如肿瘤)的转化酶活化的前药，用于治疗感染性疾病，将免疫复合物靶向至细胞表面受体或者用于向肿瘤细胞递送免疫毒素。
本申请所述的双特异性抗体还能够用于多种治疗性和非治疗性和/或诊断测定方法，如酶免疫测定、双位点免疫测定、各种疾病(例如癌症)的体外或体内免疫诊断、竞争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定。所述双特异性抗体的其他用途对本领域技术人员而言将是显而易见的。
数种用于从重组细胞培养物制备双特异性抗体片段的技术已有报道。然而，双特异性结合蛋白的合成和表达还存在问题，部分是由于与能够与两种不同的重链结合和表达的适宜轻链的鉴定相关的问题，部分是由于分离的问题。在各种实施方式中，本申请所述的组合物和方法提供了全长双特异性抗体的优点，所述双特异性抗体不需要一个或多个特定修饰以通过增加组分的稳定性/相互作用来维持常规免疫球蛋白结构。在各种实施方式中，一个或多个这种修饰已证实是繁琐的并且是发展双特异性抗体技术及其在治疗人类疾病中的潜在用途中的障碍。因此，在各种实施方式中，通过提供具有附加的多特异性性质的天然的免疫球蛋白结构(即全长)，全长双特异性抗体维持了此前的双特异性片段缺乏的关键的效应器功能，并且还提供了治疗剂，所述治疗剂显示出具有更长半衰期的重要的药代动力学参数。
本申请所述的方法和组合物允许针对经基因修饰的小鼠通过其他天然的过程来选择能够与一个以上的重链结合和表达的适宜的轻链，所述重链包含体细胞突变的(例如亲和性成熟的)重链，其中所述轻链还赋予了所述抗原结合蛋白pH依赖性的抗原结合性质。来自如本申请所述的经免疫小鼠的适宜B细胞的人源重链和轻链可变区序列能够被鉴定并且克隆进入具有适宜的人源恒定区基因序列(例如人源IgG1)的表达载体的框架中，所述经免疫的小鼠表达具有反向嵌合重链(即人源可变区和小鼠恒定区)的亲和性成熟的抗体。可以制备两个这种构建体，其中各构建体均编码与不同表位结合的人源重链可变结构域。含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的一个所述人源轻链可变区(例如人源Vκ1-39/J或人源Vκ3-20/J，例如Vκ1-39Jκ5或人源Vκ3-20Jκ1)能够在框架中与适宜的人源轻链恒定区基因(例如人源κ恒定基因)融合。这三个全长的人源重链和轻链构建体能够置于用于表达的适宜细胞中。所述细胞将表达两个主要种类：具有相同轻链的同源二聚的重链和具有相同轻链的异源二聚的重链。为了使得这些主要种类易于分离，对一条所述重链进行修饰以缺失蛋白A结合决定簇，以使得同源二聚的结合蛋白与异源二聚的结合蛋白具有不同的亲和性。解决这个问题的组合物和方法在2010年6月25日提交的名称为“ReadilyIsolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format(具有天然免疫球蛋白形式的易于分离的双特异性抗体)”的USSN 12/832,838中进行了描述，其公开号为US 2010/0331527A1，其通过引用并入本申请。一旦包含具有相同的轻链的异源二聚的重链的物质被选择，则可以筛选这种双特异性抗原结合蛋白以确认其pH依赖性抗原结合性质的保留情况。
或者，可以利用来源于小鼠的抗原特异性轻链制备双特异性或三特异性抗体，所述小鼠包含双轻链基因座，例如含有不超过两个人源VL和一个或多个(例如两个或多个)人源JL基因区段序列的轻链基因座，和有限的人源重链库(例如单一重排的人源重链可变区)。此类抗原特异性、组氨酸修饰、反向嵌合的(人源可变的，小鼠恒定的)轻链能够用于衍生抗原特异性轻链可变区序列，所述抗原特异性轻链可变区序列能够在框架中克隆进入具有适宜的人源轻链恒定区序列的表达载体。来源于包含通用轻链基因座(例如含有单一重排的轻链可变区基因序列的轻链基因座)的小鼠的抗原特异性人源重链可变区(对与抗原特异性轻链相同或不同抗原上的不同表位具有特异性)能够在框架中克隆进入含有人源重链恒定区序列的表达载体，并且所述抗原特异性人源轻链和重链能够在适宜的细胞中共表达以获得双特异性或三特异性人源抗体。或者，可以在框架中将预先选定的抗原特异性重链(例如来自含有来源于与在所述双轻链小鼠基因座中使用的一个相同的可变区基因区段的轻链的抗体的重链)克隆进入含有人源重链恒定区序列的表达载体，并且所述抗原特异性人源轻链和重链能够在适宜细胞中共表达以获得双特异性或三特异性人源抗体。在一个实施方式中，此类抗体显示出pH依赖性抗原结合，例如由于在所述轻链中存在组氨酸取代。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的表位结合蛋白，其中人源轻链和重链可变区序列来源于本申请所述的已被包含目标表位的抗原进行免疫的动物。
在一个实施方式中，本申请提供了包含第一和第二多肽的表位结合蛋白，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含与第一表位选择性结合的第一表位结合区，后接恒定区，所述恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3区；并且第二多肽从N-末端到C-末端包含与第二表位选择性结合的第二表位结合区，后接恒定区，所述恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3区，其中所述第二CH3区包含降低或消除所述第二CH3结构域与蛋白A结合的修饰。各种此类修饰在例如美国申请公开号2010/0331527和2011/0195454中进行了描述，其通过引用并入本申请。
一种用于制备与一个以上表位结合并且显示出pH依赖性表位结合性质的表位结合蛋白的方法是使用包含第一目标表位的抗原对根据本发明的第一小鼠进行免疫，其中所述小鼠包含(1)内源性免疫球蛋白轻链可变区基因座，所述基因座不含有能够重排并且形成轻链的内源性小鼠轻链可变区基因序列，其中在所述内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因座的是与所述小鼠内源性轻链恒定区基因可操作地连接的单一重排的人源轻链可变区，并且在一些实施方式中，所述重排的人源轻链可变区选自含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的人源Vκ1-39Jκ5和人源Vκ3-20Jκ1，以及(2)已全部或部分被人源VH基因区段取代的内源性小鼠VH基因区段，以使得由所述小鼠制备的免疫球蛋白重链仅仅是或基本上是包含人源可变结构域和小鼠恒定结构域的重链。当免疫时，这种小鼠将制备反向嵌合抗体，所述抗体仅含有两种人源轻链可变结构域(例如人源Vκ1-39Jκ5或人源Vκ3-20Jκ1中的一种，例如含有至少一个氨基酸被组氨酸的取代)中的一种。通常地，在所述反向嵌合抗体中将保留引入种系序列中的至少一些取代的组氨酸残基。一旦编码与目标表位结合的重链可变结构域并表达显示出pH依赖性抗原结合性质的抗体的B细胞被鉴定，则能够回收(例如通过PCR)所述重链可变区(以及任选地轻链可变区)的核苷酸序列并且将其克隆进入具有适宜的人源免疫球蛋白重链恒定区序列的表达构建体的框架中。可以重复该过程以鉴定与第二表位结合的第二重链可变结构域，并且可以回收第二重链可变区基因序列并将其克隆进入具有第二适宜的人源免疫球蛋白重链恒定区序列的表达载体的框架中。由恒定区基因序列编码的所述第一和第二免疫球蛋白恒定结构域可以是相同的或不同的同种型，并且可以根据本申请或在US 2010/0331527A1中所描述的对一个所述免疫球蛋白恒定结构域(而不是另一个)进行修饰，并且表位结合蛋白可以在适宜的细胞中表达并基于与同源二聚的表位结合蛋白相比对蛋白A不同的亲和性将其分离，例如如US 2010/0331527A1中所描述的。
因此，在各种实施方式中，在将DNA分离并且对编码具有所需的特异性/亲和性的所述第一和第二人源重链可变结构域的所述第一和第二核酸序列、以及编码人源轻链结构域(分离自如本申请所述的非人动物的种系重排的序列或轻链序列)并包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的第三核酸序列进行选择后，使用在本领域中广泛使用的重组技术来表达编码所述分子的所述三个核酸序列以形成所述双特异性抗体。通常，可供选择的表达系统涉及哺乳动物细胞表达载体和宿主，以使得所述双特异性抗体适宜的糖基化(例如在双特异性抗体的情况下含有糖基化的抗体结构域)。然而，还能够在原核表达系统中生产所述分子。在通常情况下，使用在单一载体或独立的多个载体上的编码所述第一人源重链可变结构域、所述第二人源重链可变结构域、所述人源轻链结构域的DNA转化所述宿主细胞。然而，也可以在独立的表达系统中表达所述第一人源重链可变结构域、第二人源重链可变结构域和人源轻链结构域(所述双特异性抗体的成分)并且在体外偶联所表达的多肽。在各种实施方式中，所述人源轻链结构域来源于具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代(例如在CDR密码子中)的种系序列。在各种实施方式中，所述人源轻链结构域在所述轻链结构域的轻链可变序列中包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个体细胞超突变。在一些实施方式中，所述体细胞超突变不改变引入所述轻链可变区种系序列中的至少一个组氨酸残基的存在。
在各种实施方式中，编码两条重链和具有至少一个非组氨酸被组氨酸取代的单一人源轻链的一个或多个所述核酸(例如cDNA或基因组DNA)被插入用于进一步克隆(DNA的扩增)和/或表达的可复制载体中。可利用多种载体，并且所述载体通常包括但不限于下组中的一种或多种：信号序列、复制原点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。可以单独地或基于宿主细胞的选择或实验确定的其他标准来挑选各种成分。各种成分的若干例子是本领域公知的。
表达和克隆载体通常含有启动子，所述启动子被宿主生物体识别并且与编码所述双特异性抗体的各个或全部成分的核酸序列可操作地连接。被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过限制性酶消化从来源DNA中除去启动子并将分离的启动子序列插入载体，将这些启动子与双特异性抗体编码DNA可操作地连接。
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还可以含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这种序列通常从真核或病毒DNA或cDNA的非翻译区的5'端和偶尔3'端获得。这些区域含有被转录为在编码双特异性抗体成分的mRNA非翻译部分中的多聚腺苷酸片段的核苷酸区段。针对各种实施方式的适宜的表达载体包含在哺乳动物细胞中提供瞬时表达编码所述双特异性抗体DNA的那些。在通常情况下，瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，以使得所述宿主细胞累积所述表达载体的很多拷贝并且转而合成高含量的由所述表达载体编码的所需的多肽。包含适宜的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统能够方便地对由克隆的DNA编码的多肽进行阳性鉴定，以及能够迅速筛选与具有所述第一或第二人源重链可变结构域的同源二聚体的母体抗体相比具有所需的结合特异性/亲和性或所需的凝胶迁移特性的双特异性抗体。
在各种实施方式中，一旦编码所述双特异性抗体成分的DNA被组装进入如本申请所述的一个或多个所需的载体，则其被引入用于表达和回收的适宜的宿主细胞。可以使用适于所选择的宿主细胞的本领域公知的标准技术来实现转染宿主细胞(例如电穿孔、核显微注射、与完整细胞的细菌原生质体融合或聚阳离子例如聚凝胺、聚鸟氨酸等)。
在各种实施方式中，选择最适于含有所述成分的表达载体的并且能够最高效和最有利地生产双特异性抗体种类的宿主细胞。用于表达的示例性宿主细胞包含那些原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体杂交瘤。在各种实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在各种实施方式中，所述细胞是选自下组的真核细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在各种实施方式中，所述细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
可以在多种培养基中培养用于生产所述双特异性抗体的哺乳动物宿主细胞。市售的培养基如Ham F10(西格玛公司(Sigma))、基本必须培养基((MEM)，西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和达尔贝科改良的伊格尔培养基((DMEM)，西格玛公司)适于培养所述宿主细胞。培养基可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM)、微量元素(定义为通常在终浓度中以微摩范围存在的无机化合物)和葡萄糖或等效的能量源。还可以以本领域技术人员公知的适宜浓度包含任意其他的添加剂。在各种实施方式中，培养条件如温度、pH等是与选择用于表达的宿主细胞此前使用的那些并且对本领域技术人员而言将是显而易见的。
所述双特异性抗体可以作为分泌多肽从培养基中回收，尽管当直接生产而无分泌信号时其也可以从宿主细胞的裂解物中回收。如果所述双特异性抗体是膜结合的，则可以使用适宜的去垢剂(例如Triton-X 100)使其从膜上释放。
分离后，针对与一个、优选地全部两个抗原的pH依赖性结合的能力来筛选双特异性抗体，所述双特异性抗体包含两个人源重链和来源于包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代序列的重排的人源轻链可变区基因序列的单一的人源轻链，所述序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1。能够通过多种本领域可用和下述实施例中描述的技术(例如BIACORETM测定)确定在中性和酸性pH下双特异性抗体与其抗原结合能力的不同(例如结合能力显示出在酸性pH下与中性pH下相比t1/2降低)。
本申请还提供了一种利用来源于包含具有组氨酸修饰的不超过两个人源VL和一个或多个例如两个或多个人源JL基因区段的小鼠的轻链以及来源于相同或不同小鼠(例如通用轻链小鼠)的重链制备结合蛋白的类似方法，所述结合蛋白结合一个以上表位并且显示出pH依赖性表位结合性质，并且从本公开中将是显而易见的。简言之，可以使用目标抗原将本申请所述的小鼠(例如包含双轻链基因座的小鼠)人源化和可以对来自B细胞的与目标表位结合的轻链和/或重链可变结构域进行鉴定，以及在框架中将所述核苷酸序列克隆进入包含适宜恒定区的载体；重复相同过程以获得其他目标可变结构域，并且如上文中更加详细描述的在适宜细胞系中共表达可变结构域。
生成具有pH依赖性抗原结合的抗原结合蛋白的其他方法
本申请提供了在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的各种方法。本申请还提供了在体外生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的方法。这种方法可以涉及在经基因修饰的非人动物中体内生成抗原结合蛋白的各种成分，然后将其在生物体外修饰和重新组装，作为在哺乳动物细胞培养中表达的蛋白复合物。
在一个实施方式中，生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的方法利用了抗原结合蛋白序列(例如抗体序列)，所述抗原结合蛋白序列在含有有限的轻链可变区V和J区段(例如人源轻链可变区V和J区段)库的小鼠、“通用轻链”或“共有轻链”小鼠(“ULC”小鼠)中生成，所述小鼠如在美国申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300、2013/0045492和2013/0185821中描述的小鼠，其均通过引用并入本申请。在一个实施方式中，生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的方法利用了抗原结合蛋白序列，所述抗原结合蛋白序列在含有单一重排的人源轻链可变区基因序列的小鼠中生成。在一个实施方式中，所述方法利用了在小鼠中生成的抗原结合蛋白，所述小鼠含有选自人源Vκ1-39Jκ5和人源Vκ3-20Jκ1的单一重排的人源轻链可变区基因序列。在另一个实施方式中，生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的方法利用在有限的可变基因区段小鼠(例如双轻链小鼠)中生成的抗原结合蛋白序列。
在一个实施方式中，用于生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白(例如抗体)的方法包括选择与目标抗原结合的第一抗体(例如以所需的亲和性与目标抗原结合)，修饰所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，在细胞中表达所述第一抗体的免疫球蛋白重链和经修饰的免疫球蛋白轻链，并且选择在所述细胞中表达的第二抗体，所述第二抗体在中性pH下保持与目标抗原的结合(例如保持针对目标抗原的所需的亲和性)并且在酸性pH下显示出与目标抗原降低的结合。
在一个实施方式中，用于生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白(例如抗体)的方法包括选择来自抗体(例如从非人动物(例如小鼠，例如ULC小鼠)获得)的免疫球蛋白重链，所述抗体包含具有单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链，其中所述抗体与目标抗原结合(例如以所需的亲和性与目标抗原结合)；修饰所述免疫球蛋白轻链的核酸序列以使得所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代；在其可变结构域中表达所选择的免疫球蛋白重链和含有至少一个氨基酸被组氨酸取代的免疫球蛋白轻链；并且选择在中性pH下保持与目标抗原的结合(例如保持针对目标抗原的所需的亲和性)而在酸性pH下显示出与目标抗原降低的结合的抗体。在各种实施方式中，所述免疫球蛋白重链来源于重排的人源重链可变基因区段(人源V、D和J区段)。
在一个实施方式中，用于生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白(例如抗体)的方法包括(1)使用目标抗原来免疫非人动物例如小鼠，所述非人动物包含单一重排的人源轻链可变区基因序列和未经重排的人源重链可变基因区段(V、D和J区段)库，并且使得小鼠生成针对所述抗原的免疫应答，(2)在所述非人动物中例如在所述小鼠中选择以所需的亲和性与目标抗原结合的抗体，(3)从所述非人动物例如从所述小鼠中分离以所需的亲和性与目标抗原结合的所述抗体的免疫球蛋白重链的核苷酸序列，(4)确定所述重链的核苷酸序列，(5)修饰含有所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区的免疫球蛋白轻链的核苷酸序列，以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，(6)在细胞中表达以所需亲和性与目标抗原结合的所述抗体的免疫球蛋白重链和含有所述组氨酸修饰的免疫球蛋白轻链，和(7)确定在细胞中表达的所述抗体是否在中性pH下保持与抗原结合而在酸性pH下显示出降低的结合。在一个实施方式中，在细胞中表达的所述抗体在中性pH下显示出针对所述抗原有所需的亲和性。在各种实施方式中，所述免疫球蛋白重链来源于人源重链可变基因区段(人源V、D和J区段)的重排。在另一个实施方式中，本申请还提供了一种生成具有pH依赖性结合性质的抗原结合蛋白的类似方法，其中替代了免疫包含单一重排的人源轻链可变区序列的小鼠，所述方法包括免疫包含有限的轻链可变基因区段库的小鼠，例如包含不超过两个人源VL基因区段和多个例如两个或多个人源JL基因区段的小鼠。
在一个实施方式中，含有单一重排的人源轻链可变区基因序列的所述小鼠是在例如美国申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300、2013/0045492和2013/0185821中描述的通用轻链或共有轻链“ULC”小鼠。在一个实施方式中，所述单一重排的人源轻链可变区基因序列选自人源Vκ1-39Jκ5和人源Vκ3-20Jκ1序列。
在一个实施方式中，所述目标抗原选自可溶性抗原、细胞表面抗原(例如肿瘤抗原)和细胞表面受体。在特定的实施方式中，所述细胞表面受体是免疫球蛋白受体。在特定的实施方式中，所述免疫球蛋白受体是Fc受体。
在一个实施方式中，以解离常数(KD)表示的抗体针对抗原的所需的亲和性在中性pH下低于10-6M，例如低于10-8M，例如低于10-9M，例如低于10-10M，例如低于10-11M，例如低于10-12M。
如上文所解释的，在一个实施方式中，所述ULC小鼠包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变基因序列，并且表达针对所述抗原生成应答的抗体，其中抗体针对所述抗原的亲和性主要由抗体的重链所介导。这些小鼠包含人源重链可变(V、D和J)区段库，所述区段重排以编码抗体的人源重链可变结构域，所述抗体还包含来源于单一重排的人源轻链可变序列的轻链。在一个实施方式中，在与抗原接触后，这些小鼠利用多样性的人源重链可变(V、D和J)区段库生成对所述抗原具有亲和性和特异性的抗体。因此，在与所述抗原接触后，可以将在所述ULC小鼠中生成的所述抗体的免疫球蛋白重链的核苷酸序列分离并利用其生成所需的还含有来源于单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链(例如具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列)的结合蛋白。
在所述ULC小鼠的一个实施方式中，90-100％的未经重排的非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在特定的实施方式中，全部或基本上全部(例如90-100％)的内源性非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少19个、至少39个或者至少80个或81个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代是被至少12个具有功能的未经重排的人源VH基因区段、至少25个具有功能的未经重排的人源VH基因区段或者至少43个具有功能的未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述非人动物包含全部非人源DH和JH区段被至少一个未经重排的人源DH区段和至少一个未经重排的人源JH区段取代。在一个实施方式中，所述非人动物包含全部非人源DH和JH区段被全部未经重排的人源DH区段和全部未经重排的人源JH区段取代。因此，所述ULC小鼠利用多样性的人源可变区基因区段(V、D和J区段)库来生成对目标抗原生成应答的抗体。
一旦与目标抗原以所需亲和性结合的抗体的重链被确定，分离所述重链的核苷酸序列并对其进行测序。将所述序列克隆进入在适合的宿主细胞(例如真核细胞(例如CHO细胞))中表达的载体中。在一个实施方式中，所述人源重链恒定区的序列被克隆至从小鼠中(例如从ULC小鼠中)分离的人源重链可变区序列的下游。
在一个实施方式中，生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的方法包括修饰所述免疫球蛋白轻链的核苷酸序列，特别是所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区的序列，以使其包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。用于修饰核苷酸序列的各种技术是本领域公知的，例如定点诱变。此外，可以从头合成含有所需组氨酸突变的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代包含导致一个、两个、三个、四个或更多个组氨酸残基的表达的取代。在一个实施方式中，所述一个或多个取代导致三个或四个组氨酸残基的表达。在一个实施方式中，所述一个或多个取代在免疫球蛋白轻链可变区中。在一个实施方式中，所述一个或多个取代在CDR密码子(例如CDR1、CDR3和/或CDR3密码子)中。在一个实施方式中，所述一个或多个取代在CDR3密码子中。
在一个实施方式中，其中所述免疫球蛋白轻链核酸序列包含Vκ1-39Jκ5基因序列并且所述一个或多个取代在CDR3密码子中，所述取代导致在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，包含多个组氨酸取代的Vκ1-39Jκ5CDR3区的氨基酸和核酸序列如图2所示并包含在序列表中。
在一个实施方式中，其中所述免疫球蛋白轻链核酸序列包含Vκ3-20Jκ1基因序列并且所述一个或多个取代在CDR3密码子中，所述取代导致在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、106、107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置106和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、106和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置105、107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代导致在位置106、107和109表达组氨酸。包含多个组氨酸取代的Vκ3-20Jκ1CDR3区的所选择的氨基酸和核酸序列如图12所示并包含在序列表中。
一旦所述免疫球蛋白轻链的序列(例如人源免疫球蛋白轻链可变结构域)被修饰以使得在所需位置包含组氨酸残基，则所述轻链的核苷酸序列被克隆进在适合的宿主细胞(例如真核细胞(例如CHO细胞))中表达的载体中。在一个实施方式中，所述人源轻链恒定区的序列被克隆至所述经修饰的人源可变区核苷酸序列的下游。
在一个实施方式中，在适合的宿主细胞(例如真核宿主细胞(例如CHO细胞))中共表达含有编码经修饰的人源免疫球蛋白轻链和所选择的人源免疫球蛋白重链的核苷酸序列的载体以生成抗原结合蛋白。多种能够用于表达的宿主细胞是本领域所公知的并且在整个本说明书中提及。
在所述宿主细胞中生成的抗原结合蛋白(例如抗体)可以分泌进入细胞上清液，针对正确的表达和在中性pH下对原始抗原的亲和性对所述抗原结合蛋白进行筛选。还可以从细胞裂解物中回收所述抗原结合蛋白，或者如果是膜结合的，则使用合适的去垢剂(例如Triton-X)使所述抗原结合蛋白从膜上释放。可以对具有所需特性的所述抗原结合蛋白进行纯化。
在一个实施方式中，含有一个或多个组氨酸修饰的所述抗原结合蛋白保持了对所述抗原的亲和性，所述亲和性与不包含一个或多个组氨酸修饰的相同(原始)抗原结合蛋白对所述抗原的亲和性相当。在一个实施方式中，以解离常数(KD)表示的所述组氨酸修饰的抗原结合蛋白对所述目标抗原的亲和性在中性pH下低于10-6M，例如低于10-8M，例如低于10-9M，例如低于10-10M，例如低于10-11M，例如低于10-12M。
在一个实施方式中，含有本申请所述的组氨酸修饰的所述抗原结合蛋白(例如抗体)显示出pH依赖性的抗原结合性质。在一个实施方式中，含有组氨酸修饰的所述抗原结合蛋白与没有所述组氨酸修饰的等价抗原结合蛋白(除组氨酸修饰外氨基酸序列相同的抗原结合蛋白)相比具有增加的pH依赖性性质。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在中性pH下保持与所述抗原的结合(例如在中性pH下保持针对所述抗原的所需的亲和性)，但在酸性pH下显示出降低的结合。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白(例如抗体)在酸性pH下显示出不与所述抗原结合，但在中性pH下保持与所述抗原的结合。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH下具有的解离半衰期(t1/2)与所述抗原结合蛋白在中性pH下具有的解离半衰期(t1/2)相比，降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和37℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和37℃下具有的t1/2为短于约1min。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和25℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和25℃下具有的t1/2为短于约1min。
在一个实施方式中，将含有本申请所述的组氨酸修饰的抗原结合蛋白(例如抗体)以治疗剂量给予对象后与将不含组氨酸修饰的抗原结合蛋白(例如不含组氨酸修饰的原始抗原结合蛋白)以等价的治疗剂量给予后相比，显示出增加的血清半衰期。在一些实施方式中，在给予一个剂量的含有本申请所述的组氨酸修饰的抗原结合蛋白后的血清半衰期与给予相同剂量的不含组氨酸修饰的抗原结合蛋白后的血清半衰期相比增加约2倍，例如约5倍、例如约10倍、例如约15倍、例如约20倍或更高。在一个实施方式中，血清半衰期是至少约1天，例如至少约2天、例如至少约7天、例如至少约14天、例如至少约30天、例如至少约60天。
除了用于生成上文所述的具有pH依赖性的抗原结合性质的抗原结合蛋白的体外方法以外，本申请还提供了通过所述方法生成的抗原结合蛋白例如抗体。此外，可以利用所述方法生成多特异性(例如双特异性)抗原结合蛋白，所述生成是通过选择在与小鼠共有(通用)轻链结合的两种不同的人源免疫球蛋白重链、确定所述重链的核苷酸序列、修饰通用轻链以包含如上文所述的组氨酸取代、并且在宿主细胞中共表达两条人源重链和单一的组氨酸修饰的通用轻链来完成。用于生成上文所述的抗原结合蛋白的各个步骤均可以用于生成双特异性抗原结合蛋白的方法。经确证针对所述一个或多个抗原具有所需的亲和性和pH依赖性抗原结合性质的双特异性抗原结合蛋白可以被纯化。因此，本申请提供了包含两条人源重链和单一的人源轻链的双特异性抗体，所述人源轻链包含由人源可变区基因(例如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1可变区基因)编码的人源轻链可变结构域序列，所述人源可变区基因包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
在一些实施方式中，本申请还提供了利用在双轻链小鼠中生成的轻链例如抗原特异性轻链生成具有pH依赖性结合性质的抗原结合蛋白的方法；以及由所述方法生成的抗原结合蛋白，例如抗体。此类方法和由所述方法生成的抗体从本说明书中将是显而易见的。
在一些实施方式中，本申请还提供了用于制备包含人源免疫球蛋白重链和含有组氨酸取代的人源免疫球蛋白轻链的抗原结合蛋白的构建体。本申请还提供了表达本申请所述的抗原结合蛋白(例如抗体)的宿主细胞。
本申请还包括以下实施方式：
实施方式1.一种重组免疫球蛋白轻链核酸序列，所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接的至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段，
其中所述两个未经重排的人源VL基因区段中的至少一个包含至少一个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系VL基因区段编码，和
其中所述至少两个未经重排的人源VL基因区段和所述至少一个未经重排的人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。
实施方式2.根据实施方式1所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中各个人源VL基因区段包含至少一个由相应的人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
实施方式3.根据实施方式1所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列。
实施方式4.根据实施方式3所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是小鼠或大鼠序列。
实施方式5.根据实施方式1所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区是Cκ区。
实施方式6.根据实施方式2所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述取代是在CDR3编码序列中。
实施方式7.根据实施方式6所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述取代是三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式8.根据实施方式1所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段。
实施方式9.根据实施方式8所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述两个未经重排的人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。
实施方式10.根据实施方式9所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含至少一个由相应的人种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式11.根据实施方式10所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式12.根据实施方式11所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置106、108和111表达组氨酸。
实施方式13.根据实施方式11所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段的四个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置105、106、108和111表达组氨酸。
实施方式14.根据实施方式11所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106和109表达组氨酸。
实施方式15.根据实施方式11所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段四个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106、107和109表达组氨酸。
实施方式16.根据实施方式1所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列，所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含五个人源Jκ基因区段，其中所述五个人源Jκ基因区段是Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5区段。
实施方式17.一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含根据实施方式1-16中任意一项所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列。
实施方式18.根据实施方式17所述的基因修饰的非人动物，其中所述动物不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链的内源性VL基因区段。
实施方式19.根据实施方式17所述的基因修饰的非人动物，其中所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列是在内源性免疫球蛋白轻链基因座中。
实施方式20.根据实施方式19所述的基因修饰的非人动物，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性免疫球蛋白轻链恒定区序列。
实施方式21.根据实施方式17所述的基因修饰的非人动物，在其种系中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含与免疫球蛋白重链恒定区序列可操作地连接的含有人源VH、DH和JH基因区段的未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列。
实施方式22.根据实施方式21所述的基因修饰的非人动物，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列是非人免疫球蛋白重链恒定区序列。
实施方式23.根据实施方式22所述的基因修饰的非人动物，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是小鼠或大鼠序列。
实施方式24.根据实施方式22所述的基因修饰的非人动物，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。
实施方式25.根据实施方式17所述的基因修饰的非人动物，其中所述动物是啮齿动物。
实施方式26.根据实施方式25所述的基因修饰的非人动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
实施方式27.根据实施方式26所述的基因修饰的非人动物，其中所述啮齿动物是小鼠。
实施方式28.根据实施方式17所述的基因修饰的非人动物，其中所述动物表达包含由至少两个人源VL基因区段中的一个编码的氨基酸序列的抗体和所述抗体在由所述人源VL基因区段的至少一个组氨酸密码子编码的氨基酸位置保留至少一个组氨酸残基。
实施方式29.根据实施方式17所述的基因修饰的非人动物，其中所述动物表达对抗原产生应答的抗原特异性抗体群，其中在所述群中的所有抗体包含：
来源于至少两个VL基因区段和一个或多个JL基因区段重排的免疫球蛋白轻链可变结构域，和
包含来源于人源重链V、D和J区段库的人源重链可变结构域的免疫球蛋白重链。
实施方式30.根据实施方式17所述的基因修饰的非人动物，其中所述动物包含对目标抗原产生应答的B细胞群，所述B细胞群富含与中性pH相比在酸性pH下显示出解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或者至少约30倍的抗体。
实施方式31.根据实施方式30所述的动物，其中所述富含的抗体显示出t1/2降低至少约2倍。
实施方式32.一种产生显示出pH依赖性地与目标抗原结合的抗体的方法，所述方法包括：
使用目标抗原免疫根据实施方式17中任意一项所述的动物，
选择在中性pH下以所需的亲和性与目标抗原结合而在酸性pH下显示出与目标抗原降低的结合的B细胞或结合蛋白。
实施方式33.一种制备在其种系中包含基因修饰的免疫球蛋白轻链基因座的非人动物的方法，所述方法包括：
修饰所述非人动物的基因组以在免疫球蛋白轻链基因座缺失或产生无功能的内源性免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段，和
在所述非人动物的基因组中放置免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段，以使得所述免疫球蛋白轻链可变区序列与免疫球蛋白恒定区序列可操作地连接，
其中各个人源VL基因区段中的至少一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子，和
其中至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。
实施方式34.根据实施方式33所述的方法，其中所述方法使得所述非人动物包含富含显示出与目标抗原pH依赖性结合的抗体的B细胞群。
实施方式35.根据实施方式33所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链可变区是在所述内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座中。
实施方式36.根据实施方式35所述的方法，其中所述动物是啮齿动物。
实施方式37.根据实施方式36所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
实施方式38.根据实施方式33所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含不超过两个人源VL基因区段。
实施方式39.根据实施方式38所述的方法，其中所述两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。
实施方式40.根据实施方式39所述的方法，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含至少一个由相应的人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式41.根据实施方式40所述的方法，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式42.根据实施方式41所述的方法，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段三个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置106、108和111表达组氨酸。
实施方式43.根据实施方式41所述的方法，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段四个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置105、106、108和111表达组氨酸。
实施方式44.根据实施方式41所述的方法，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段三个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106和109表达组氨酸。
实施方式45.根据实施方式41所述的方法，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段四个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106、107和109表达组氨酸。
实施方式46.根据实施方式33所述的方法，其包含五个人源Jκ基因区段，其中所述五个人源Jκ基因区段是Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5区段。
实施方式47.一种分离的细胞，所述分离的细胞在其基因组中包含根据实施方式1-16中的任意一项所述的重组免疫球蛋白轻链核酸序列。
实施方式48.根据实施方式47所述的分离的细胞，其中所述细胞不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链的内源性VL基因区段。
实施方式49.根据实施方式47所述的分离的细胞，其中所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列在内源性免疫球蛋白轻链基因座中。
实施方式50.根据实施方式49所述的分离的细胞，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性免疫球蛋白轻链恒定区序列。
实施方式51.根据实施方式47所述的分离的细胞，在其基因组中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含与免疫球蛋白重链恒定区序列可操作地连接的含有人源VH、DH和JH基因区段的未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列。
实施方式52.根据实施方式51所述的分离的细胞，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列是非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。
实施方式53.根据实施方式52所述的分离的细胞，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是小鼠或大鼠序列。
实施方式54.根据实施方式52所述的分离的细胞，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是内源性的非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。
实施方式55.根据实施方式47所述的分离的细胞，其中所述细胞是啮齿动物细胞。
实施方式56.根据实施方式55所述的分离的细胞，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
实施方式57.根据实施方式55所述的分离的细胞，其中所述啮齿动物是小鼠。
实施方式58.一种来源于根据实施方式17-31中任意一项所述的非人动物的细胞或组织。
实施方式59.根据实施方式58所述的细胞，其中所述细胞是胚胎干细胞或B细胞。
实施方式60.一种来源于根据实施方式33-46中任意一项制备的非人动物的细胞或组织。
实施方式61.根据实施方式60所述的细胞，其中所述细胞是胚胎干细胞或B细胞。
实施方式62.一种靶向载体，所述靶向载体包含5’鼠源性同源臂；包含至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段的人源可变区核酸序列，以及3’鼠源性同源臂；
其中所述两个未经重排的人源VL基因区段的至少一个包含至少一个不是由相应的人种系VL基因区段编码的组氨酸密码子，
其中所述至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域，
其中各个未经重排的人源VL基因区段与人或小鼠前导序列和人或小鼠启动子可操作地连接，
和其中所述同源臂将所述载体导向内源性鼠源性免疫球蛋白轻链基因座，以使得所述人源可变区核酸序列与内源性鼠源性轻链恒定区序列可操作地连接。
实施方式63.根据实施方式62所述的靶向载体，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区是Cκ区。
实施方式64.根据实施方式62所述的靶向载体，其中各个人源VL基因区段包含至少一个由相应的人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式65.根据实施方式62所述的靶向载体，其中所述取代在CDR3编码序列中。
实施方式66.根据实施方式64所述的靶向载体，其中所述取代是三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式67.根据实施方式61所述的靶向载体，所述靶向载体包含不超过两个人源VL基因区段。
实施方式68.根据实施方式67所述的靶向载体，其中两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。
实施方式69.根据实施方式68所述的靶向载体，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含至少一个由相应的人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式70.根据实施方式69所述的靶向载体，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
实施方式71.根据实施方式70所述的靶向载体，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段三个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置106、108和111表达组氨酸。
实施方式72.根据实施方式70所述的靶向载体，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段四个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置105、106、108和111表达组氨酸。
实施方式73.根据实施方式70所述的靶向载体，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段三个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106和109表达组氨酸。
实施方式74.根据实施方式70所述的靶向载体，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段四个非组氨酸密码子的取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106、107和109表达组氨酸。
实施方式75.根据实施方式62所述的靶向载体，其包含五个人源Jκ基因区段，其中所述五个人源Jκ基因区段是Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5区段。
实施方式76.一种根据实施方式32所述的方法产生的显示出与目标抗原pH依赖性结合的结合蛋白。
实施方式77.一种核酸，所述核酸包含编码根据实施方式76所述的结合蛋白的免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。
实施方式78.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方式77所述的核酸。
实施方式79.一种根据实施方式32所述的方法产生的显示出与目标抗原pH依赖性结合的B细胞。
实施方式80.一种产生显示出与目标抗原pH依赖性结合的结合蛋白的方法，所述方法包括：
在细胞中共表达：
(i)第一免疫球蛋白重链，所述第一免疫球蛋白重链包含第一抗体的重链可变结构域，其中所述第一抗体
(a)与目标抗原在中性pH下以所需的亲和性结合，
(b)在基因修饰的非人动物中产生，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含重组免疫球蛋白轻链核酸序列，所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域的至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段，和
(c)包含由所述至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段中的一个编码的轻链组分
(ii)免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含由免疫球蛋白轻链核苷酸序列编码的轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链核苷酸序列
(a)来源于编码所述第一抗体的轻链组分的所述至少两个人源VL基因区段和所述至少一个人源JL基因区段中的一个，和
(b)经修饰以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，以及
选择在所述细胞中表达的第二抗体，所述第二抗体包含所述第一免疫球蛋白重链和所述免疫球蛋白轻链，其在中性pH下保留了对目标抗原所需的亲和性并且在酸性pH下对目标抗原显示出降低的结合。
实施方式81.根据实施方式80所述的方法，其中所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段。
实施方式82.根据实施方式81所述的方法，其中所述两个未经重排的人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。
实施方式83.根据实施方式80所述的方法，其中所述第二抗体包含全人源重链和全人源轻链。
实施方式84.根据实施方式80所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链核苷酸序列还包含至少一个密码子，所述密码子编码不是由种系核酸序列编码的体细胞突变。
实施方式85.根据实施方式84所述的方法，其中所述第二抗体包含全人源第一免疫球蛋白重链和全人源免疫球蛋白轻链。
实施方式86.一种根据实施方式80所述的方法产生的对目标抗原显示出pH依赖性结合的结合蛋白。
实施方式87.一种产生显示出与目标抗原pH依赖性结合的结合蛋白的方法，所述方法包括：
在细胞中共表达：
(i)第一免疫球蛋白重链，所述第一免疫球蛋白重链包含第一抗体的第一重链可变结构域，其中所述第一抗体在中性pH下以所需的亲和性与第一目标抗原结合，
(ii)第二免疫球蛋白重链，所述第二免疫球蛋白重链包含第二抗体的第二重链可变结构域，其中所述第二抗体在中性pH下以所需的亲和性与第二目标抗原结合，
其中所述第一和第二抗体
(a)在基因修饰的非人动物中产生，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含重组免疫球蛋白轻链核酸序列，所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域的至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段，和
(b)包含由所述至少两个未经重排的人源VL基因区段和所述至少一个未经重排的人源JL基因区段中的一个编码的相同轻链组分
(iii)免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含由免疫球蛋白轻链核苷酸序列编码的轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链核苷酸序列
(a)来源于编码所述第一和第二抗体的轻链组分的所述至少两个人源VL基因区段和所述至少一个JL基因区段中的一个，和
(b)经修饰以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，以及选择在所述细胞中表达的第三抗体，所述第三抗体包含所述第一免疫球蛋白重链、所述第二免疫球蛋白重链和所述免疫球蛋白轻链，其中所述第三抗体在中性pH下保留了对目标抗原所需的亲和性并且在酸性pH下对目标抗原显示出降低的结合。
实施方式88.根据实施方式87所述的方法，其中所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含不超过两个未经重排的人源VL基因区段。
实施方式89.根据实施方式88所述的方法，其中所述两个未经重排的人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。
实施方式90.根据实施方式87所述的方法，其中所述第三抗体包含全人源重链和全人源轻链。
实施方式91.根据实施方式87所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链核苷酸序列还包含至少一个密码子，所述密码子编码不是由种系核酸序列编码的体细胞突变。
实施方式92.根据实施方式91所述的方法，其中所述第三抗体包含全人源第一免疫球蛋白重链和全人源免疫球蛋白轻链。
实施方式93.一种根据实施方式87所述的方法产生的对目标抗原显示出pH依赖性结合的结合蛋白。
实施例
本发明提供下述实施例以便向本领域的普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而不是旨在限定发明人所认为的发明的范围。作出努力以确保所使用的数量(例如量、温度等)的准确度，但是应考虑一些实验误差和偏差。实施例没有包含对本领域的普通技术人员所熟知的常规方法(分子克隆技术等)的详细描述。除非另有明示，份数以重量份计、分子量以平均分子量表示、温度以摄氏度表示，并且压力为处于或接近大气压。
实施例1：在抗原特异性人源轻链中的组氨酸残基的鉴定
在例如美国专利申请号13/022,759、13/093,156和13/412,936(公开号分别为2011/0195454、2012/0021409和2012/0192300)中描述了共有轻链小鼠(例如Vκ1-39或Vκ3-20共有轻链小鼠)的生成和在这些小鼠中抗原特异性抗体的生成，其全部内容通过引用并入本申请。简言之，使用
Figure BDA0002313130650000871
技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659)制备重排的人源种系轻链靶向载体以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)克隆，并且对基因组构建体进行工程改造以使其含有单一重排的人源种系轻链区并将所述基因组构建体插入内源性κ轻链基因座，所述基因座此前已被修饰以缺失内源性κ可变和连接基因区段。然后使用靶向的BAC DNA电转染小鼠ES细胞以形成用于生成嵌合小鼠的经修饰的ES细胞，所述嵌合小鼠表达重排的人源种系Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1区。使用经靶向的ES细胞作为供体ES细胞并且通过
Figure BDA0002313130650000881
法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0generation mice that areessentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses(基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞并且能够进行直接的表型分析的F0代小鼠)Nature Biotech.25(1):91-99)将所述ES细胞引入8-细胞阶段的小鼠胚胎中。通过使用改良的等位基因测定(Valenzuela等，如上文所述)进行基因分型来鉴定独立地携带经工程改造的人源种系Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1轻链区的
Figure BDA0002313130650000882
所述等位基因测定检测独特的重排的人源种系轻链区的存在情况。
将携带经工程改造的人源种系轻链基因座的小鼠(ULC小鼠)与含有内源性小鼠重链可变基因座被人源重链可变基因座取代的小鼠(参见US 6,596,541；
Figure BDA0002313130650000883
小鼠，瑞恩泽制药公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.))繁殖。使用目标抗原刺激含有单一重排的人源种系轻链区的
Figure BDA0002313130650000884
小鼠，并且对含有通用轻链(例如Vκ1-39Jκ5)的抗体进行分离和测序。
对来自抗原特异性人源抗体的含有Vκ1-39的所选定轻链的氨基酸序列(A-K，分别对应于SEQ ID NO:136-146)进行比对。对所选定的若干抗原特异性人源抗体的人源Vκ1-39来源的轻链CDR中的组氨酸突变进行了鉴定(图1)。种系Vκ1-39的氨基酸序列如上述比对并如SEQ ID NO:1所示，Vκ1-39Jκ5完整可变结构域的氨基酸序列如SEQID NO:80所示。
实施例2：组氨酸取代的人源通用轻链抗体的工程改造和表征
实施例2.1：组氨酸残基的工程改造以进入种系人源重排的轻链中
使用经特别设计以便在人源Vκ1-39Jκ5轻链的Q105、Q106、Y108和P111位置引入经工程改造的组氨酸残基的定点诱变引物，将组氨酸残基工程改造进入重排的人源Vκ1-39Jκ5轻链。使用本领域公知的分子技术(例如QuikChange II XL定点诱变试剂盒，安捷伦科技公司(Agilent Technologies))进行定点诱变。在CDR3中经工程改造的残基的位置如图2所示，在图2中描述的组氨酸取代的CDR3的核酸序列如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32(对应于如SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33所示的氨基酸序列)所示。种系重排的Vκ1-39Jκ5CDR3的核酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和3所示。
实施例2.2：组氨酸工程改造的轻链的构建和表达
构建含有根据实施例2制备的种系工程改造的组氨酸残基的人源Vκ1-39来源的轻链并将其与特异性针对人源细胞表面受体的多种人源重链(标记为1-5)配对以分析在CHO细胞中的表达。与组氨酸取代的Vκ1-39来源的轻链配对的五条特异性针对人源细胞表面受体的人源重链来源于具有单一重排的人源轻链(人源Vκ1-39/Jκ5重排的轻链；参见US2011/0195454A1)的小鼠。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：针对具有所示的组氨酸修饰的轻链和5条不同的重链，使用Fc ELISA对由CHO细胞分泌的抗体进行检测。所述轻链和重链序列(除了所述修饰以外)在具有单一重排的人源轻链(例如人源Vκ1-39/Jκ5重排的轻链；参见US2011/0195454A1)的小鼠中生成。捕获抗体是山羊抗人IgG，并且检测抗体是山羊抗人(Fcγ特异性)-HRP。结果如图3所示。ULC+重链：特定的重链和未经修饰的人源Vκ1-39来源的轻链。如图3所示，在所有的突变体中均检测到了表达。
蛋白免疫印迹。通过western印迹对CHO细胞上清液中配对的抗原特异性重链和组氨酸工程改造的轻链的表达进行进一步分析。样品在4-12％的tris甘氨酸凝胶上进行电泳。使用选定的重链(重链3)的结果如图4所示。ULC指重排的人源Vκ1-39来源的轻链(如上文所述)。
实施例2.3：组氨酸工程改造的轻链的结合亲和性的测定
通过使用BIACORETM T200仪器(通用电气医疗集团(GE Healthcare))的SPR(表面等离子体共振)测定选定抗体上清液中的平衡解离常数(KD)、解离半衰期(t1/2)和其他动力学参数。在pH 7.4和pH 5.75下测定动力学。结果如图5A-5E所示。
使用实时表面等离子体共振生物传感器(Biacore T200)获得在中性pH(pH 7.4)和在酸性pH(pH 5.75)下抗体与免疫原结合的动力学结合性质(例如ka、kd、KD、t1/2等)的数值。使用小鼠抗-人Fc抗体将Biacore CM5传感器芯片衍生化(derivatize)以便从上清液中捕获抗体。然后将单一浓度(50nM)的免疫原以30μl/min的流速注射至捕获抗体的表面。监测2.5分钟抗体-抗原的结合，然后监测8分钟抗原从捕获抗体上的解离。使用Biacore T200评估软件1.0版通过将数据处理并拟合至与物质转运模型1:1的结合以测定动力学结合(Ka)和解离(Kd)速率常数。由动力学速率常数计算平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。
如图5所示，在抗体与细胞表面受体的结合试验中，在与抗原特异性人源重链配对的、具有组氨酸修饰的共有轻链(具有组氨酸修饰的CDR3的Vκ1-39/Jκ5轻链)的5个抗体中有2个抗体显示出在pH 7.4和pH 5.75下以不同的亲和性与所述抗原(例如与细胞表面受体)结合。在pH 7.4下保持结合但在pH 5.75下显示出降低的结合或没有可检测的结合的、具有组氨酸修饰的抗体是所需要的。与在pH 7.4下相比，在pH 5.75下显示出降低的t1/2的具有组氨酸修饰的抗体是所需要的。
对含有组氨酸修饰的共有轻链和3种抗原特异性重链(标记为2、3和6)的3种抗体在不同pH下的抗原结合数据进一步汇总于图6。与在pH 7.4下相比，在pH 5.75下这些抗体显示出显著降低的抗原结合，如例如在pH 5.75下t1/2降低或没有检测到结合所示。
实施例3：包含人源组氨酸取代的Vκ1-39Jκ5通用轻链的基因修饰小鼠的工程改造和表征
实施例3.1：用于在重排的人源轻链可变区中工程改造组氨酸残基的靶向载体的构建
使用由本领域公知的标准分子克隆技术制备的靶向载体来制备基因修饰的小鼠，所述小鼠含有具有工程改造进入人源轻链CDR区的组氨酸残基的重排的人源轻链基因。
Figure BDA0002313130650000901
技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659)制备多种重排的人源种系轻链靶向载体以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)DNA以含有单一重排的人源种系轻链区，并将所述靶向载体插入内源性κ轻链基因座，所述基因座此前以被修饰以缺失内源性κ可变和连接基因区段。所述重排的人源种系轻链区在轻链序列中的一个或多个核苷酸位置被修饰以编码在所述种系序列的相应位置正常情况下不存在的组氨酸残基。将所述靶向载体电穿孔进入小鼠胚胎干(ES)细胞并且使用定量PCR检测(例如TAQMANTM)确证。
特别地，构建这些靶向载体的策略如图8A-8F所示。使用如图7所示的定点诱变引物通过定点诱变(QuickChange II XL试剂盒)对生成用于共有(通用)轻链小鼠(在例如US2011/0195454A1中描述的“ULC小鼠”)的靶向载体所使用的质粒进行修饰，从而在CDR3区中使用组氨酸残基取代Q105、Q106、Y108和P111或者Q106、Y108和P111，所述质粒含有pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+小鼠Vκ3-7前导+人源Vκ1-39Jκ5(该工程改造步骤见图8A)。对所得到的载体(H105/106/108/111和H106/108/111)进行进一步修饰并且连接至含有小鼠Igκ恒定区、小鼠增强子、小鼠3’同源臂和SPEC表达盒的载体(图8B)。进一步的修饰将连接引入携带5’小鼠臂并含有Frt-Ub-NEO-Frt表达盒的载体(图8B)。将所得到的靶向载体电穿孔进入含有小鼠Igκ可变基因座(含有κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中(图8C-8F)。
通过改良的等位基因测定(Valenzuela等)使用对插入内源性κ轻链基因座的工程改造的Vκ1-39Jκ5轻链区具有特异性的探针对阳性ES细胞克隆进行确证。在该测定中使用的引物和探针如下表1中和序列表中所示；所述探针的位置如图8C-8F所示。
表1：ES细胞筛选使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650000911
Figure BDA0002313130650000921
通过使用表达FLP的质粒转染ES细胞来缺失由靶向构建体引入的NEO选择性表达盒(图8C和8E)。任选地，可以通过与表达FLP重组酶的小鼠(例如US 6,774,279)繁殖除去新霉素表达盒。任选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
使用上文所述的经靶向的ES细胞作为供体ES细胞并且通过
Figure BDA0002313130650000922
法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0 generation mice that areessentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses(基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞并且能够进行直接的表型分析的F0代小鼠)Nature Biotech.25(1):91-99)将所述ES细胞引入8-细胞阶段的小鼠胚胎。由如上文所述的经靶向的ES细胞来制备独立地携带经工程改造的人源轻链基因的
Figure BDA0002313130650000923
所述经工程改造的人源轻链基因含有突变进入所述序列的一个或多个位置的组氨酸残基。
对胎仔进行基因分型并选择针对经工程改造的组氨酸修饰的人源轻链为杂合子的胎仔以表征所述轻链的表达和所表达的抗体的结合能力。用于对特定含有具有三个(H106/108/111；“1930”)或四个(H105/105/108/111；“1927”)组氨酸修饰的通用轻链基因的小鼠进行基因分型的引物和探针列于下表2和如序列表中所示。在其通用轻链中含有组氨酸修饰的小鼠在本申请中称为“HULC”小鼠(组氨酸通用轻链小鼠)。
表2：基因分型使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650000924
Figure BDA0002313130650000931
实施例3.2：在具有人源组氨酸取代的通用轻链的小鼠中对抗原免疫应答的分析
使用细胞表面受体(“抗原A”)作为免疫原免疫小鼠，所述小鼠针对利用在CDR3中具有4个组氨酸取代的Vκ1-39和Jκ5预先排列的人源к轻链的表达是杂合子(在下文中表示为“HULC 1927”)或针对利用在CDR3中具有3个组氨酸取代的Vκ1-39和Jκ5预先排列的人源к轻链的表达是杂合子(在下文中表示为“HULC 1930”)，或者是纯合的WT小鼠。在免疫接种开始前从小鼠中收集免疫前的血清。初始激发免疫时，通过足跖(f.p.)以25μl的体积给予混合了10μg CpG寡核苷酸作为佐剂(英杰公司(Invivogen))的2.35μg蛋白免疫原。随后，通过相同的途径在第3、6、11、13、17、20天时共计6次对小鼠进行加强免疫，使用2.35μg抗原A以及10μg CpG和25μg Adju-Phos(邦泰公司(Brenntag))作为佐剂。分别在第15天和第22天在第4次和第6次加强免疫后对小鼠进行取血。对其抗血清进行检测以测定针对抗原A的抗体效价。
通过标准的ELISA来测定针对免疫原的抗体血清效价。为进行ELISA，使用含2μg/ml抗原A的磷酸盐缓冲液(PBS，欧文科学公司(Irvine Scientific))在4℃下将96孔微孔板(赛默菲公司(Thermo Scientific))涂层过夜。次日，使用洗板机(分子装置公司(Molecular Devices))用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS-T，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))洗板4次。然后使用250μl含0.5％牛血清白蛋白(BSA，西格玛奥德里奇公司)的PBS封闭板并在室温下孵育1小时。然后使用PBS-T洗板4次。来自经免疫小鼠的血清或免疫前的血清以初始1:300或1:1000的比例使用0.5％BSA-PBS三倍系列稀释，以一式两份加入已封闭的板中，然后在室温下孵育1小时。留出最后两孔空白作为二抗对照(本底对照)。在洗板机中再使用PBS-T洗板4次。然后以1:5000/1:10,000的稀释度将山羊抗小鼠IgG-Fc-辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch))加入板中并在室温下孵育1小时。然后使用PBS-T洗板8次并使用TMB/H2O2作为底物显色。将所述底物孵育20min并使用2N硫酸(H2SO4,VWR公司,cat#BDH3500-1)或1N磷酸(JT Baker公司,Cat#7664-38-2)终止反应。在分光光度计(Victor，铂金埃尔默公司(Perkin Elmer))中450nm下读板。使用Graphpad PRISM软件计算抗体的效价。
通过注射免疫原在小鼠中诱导的免疫应答以抗体效价表示，将效价定义为在抗原结合吸光度比本底高两倍时最高血清稀释度的倒数。因此，该数值越高，针对所述免疫原产生的体液免疫应答越强。在两个品系的HULC小鼠和在WT小鼠中所述免疫原诱导的抗体效价非常高，在这些品系之间未观察到显著差异(图9)。
实施例3.3：pH敏感性单克隆抗体的生成
当在这两个品系的HULC小鼠和在WT小鼠中针对所述免疫原均达到所需的免疫应答时，从各小鼠品系中收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤细胞，使所述杂交瘤细胞在96孔板中生长。在生长10天后，通过免疫原特异性ELISA对含有各杂交瘤细胞的孔的上清液进行筛选以鉴定阳性抗原结合样品。对于ELISA而言，使用1ug/mL抗-myc多克隆抗体(诺伟思生物制品公司(Novus Biologicals)，#NB600-34)在4℃下将96孔微孔板涂层过夜以固定带有myc标签的抗原，随后使用含有0.5％(w/v)BSA的PBS溶液封闭。洗板，以1μg/mL的浓度将抗原溶液加入板中并使抗原溶液在室温下与已涂层的板结合1小时。随后，以1:50的稀释度将来自杂交瘤细胞的上清液加入所述孔中并使其在室温下结合1小时。使用与HRP(杰克逊免疫研究公司，#115-035-164)偶联的抗小鼠IgG多克隆抗体检测与板结合的抗体。将TMB底物加入板(BD生物科学公司(BD Biosciences)，#51-2606KC/51-2607KC)中并根据生产厂商推荐的方案对比色信号进行显色。在Victor Wallac板式分析仪上在450nm记录吸光度。使用实时表面等离子体共振生物传感器(Biacore 4000)对确定为OD等于或大于0.5(具有OD为约0.1的基线)的抗原阳性样品进行亲和性筛选。
记录在中性pH(pH 7.4)和在酸性pH(pH 6.0)下抗体与所述免疫原结合的动力学结合参数(例如ka、kd、KD、t1/2等)。使用多克隆的山羊抗小鼠Fc抗体将Biacore CM4传感器芯片衍生化(derivatize)以便从上清液中捕获抗体。然后将单一浓度(100nM)的免疫原以30μl/min的流速注射至捕获抗体的表面。监测1.5分钟抗体-抗原的结合，然后监测2.5分钟抗原从捕获抗体上的解离。使用Biacore 4000评估软件1.0版通过将数据处理和拟合至与物质转运模型1:1的结合以测定动力学结合(Ka)和解离(Kd)速率常数。由动力学速率常数计算平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝ln2/(60*kd)。选择一系列与在pH 7.4下相比在pH 6.0下显示出降低的结合的样品(pH敏感性)以及一系列在pH7.4和pH 6.0之间显示出无显著的速率改变的对照样品(pH不敏感的对照)以克隆生产。图10显示了对来自HULC和WT小鼠的抗原阳性总数和显示出pH敏感性抗原结合的抗原阳性数量的比较。
在抗原阳性中，有18个和7个分别分离自两个杂合子HULC1927小鼠和两个HULC1930的克隆，以及有1个来自WT小鼠的克隆被制成单克隆。对单克隆杂交瘤的上清液进行中性和低pH下的抗原解离速率(解离率)分析，并使用细胞球团(pellet)进行轻链可变结构域DNA测序。
实施例3.4：在基于人源Vκ1-39Jκ5的组氨酸通用轻链小鼠的CDR3区中的测序和体细胞超突变
使用来自HULC和WT小鼠单克隆杂交瘤的细胞球团进行轻链可变结构域DNA测序。在被制成单克隆(参见上述的实施例3.3)并测序的26个克隆中，确证有15个使用HULC或WT小鼠的轻链(MM和NN，见表4)。14个克隆来源于HULC杂合子小鼠(1927或1930小鼠)以及1个来源于WT小鼠(OO，见表4)。
在来源于HULC杂合子小鼠的14个抗原阳性样品中，12个单克隆抗体利用其相应的HULC轻链，而2个利用WT小鼠轻链。如表3中所示在全部中仅有一个利用HULC的抗体保留了全部的所引入的组氨酸突变(以斜体表示的抗体)。对克隆AA的测序产生了2个不同的HULC序列，这在表3中以两个条目表示。
表3：在来自利用HULC轻链的克隆的轻链序列中保守的组氨酸插入和体细胞超突变的数量
Figure BDA0002313130650000951
Figure BDA0002313130650000961
实施例3.5：在基于人源Vκ1-39Jκ5的组氨酸通用轻链小鼠中产生的单克隆抗体的pH依赖性结合
为了进一步评估分离自HULC和WT小鼠的单克隆抗体的pH依赖性结合特性，进行结合实验，在实验中在中性pH下观察了抗体/抗原的结合相和在中性或酸性pH下观察了抗体/抗原的解离相。
使用多克隆的兔抗小鼠Fc抗体将Biacore CM4传感器芯片衍生化(derivatize)。将单克隆抗体上清液捕获于抗小鼠Fc传感器的表面上。将50nM(一式两份)和16.7nM的两个浓度的免疫原以30μl/min的流速注射至捕获单克隆抗体的表面。在pH 7.4下监测4分钟抗体-抗原的结合，然后在pH 7.4或6.0下监测15分钟抗原从捕获的单克隆抗体上的解离。使用Scrubber 2.0版曲线拟合软件处理和拟合数据以测定解离(kd)速率常数并且如表4所示。由解离速率常数计算解离半衰期(t1/2)：t1/2(min)＝(ln2/kd)/60，并且如表4所示。显示表4中所列的若干抗体在各种pH条件下的结合/解离特性的传感图在图11的图片中显示。在各图中的各条线表示在各抗体的不同浓度下的结合应答。所有实验均在25℃下进行。解离半衰期的值(t1/2)见上述的各传感图。应答以RU计。
表4：在中性和低pH下单克隆的HULC或WT抗体与其免疫原结合的解离(kd)速率常数和解离半衰期(t1/2)
Figure BDA0002313130650000971
*由于抗原结合信号较低不能确定kd和t1/2值
实施例4：含有组氨酸取代的人源Vκ3-20Jκ1通用轻链的经基因修饰的小鼠的工程改造
如在例如美国专利申请号13/022,759、13/093,156、13/412,936和13/488,628(公开号分别为2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300和2013/0045492)和在上述的实施例1中描述的生成含有共有Vκ3-20Jκ1轻链的小鼠。所述种系通用Vκ3-20Jκ1轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示。
将组氨酸取代引入Vκ3-20Jκ1通用轻链靶向载体，并且使用与在上述针对Vκ1-39Jκ5组氨酸修饰的通用轻链小鼠(HULC 1927和1930)的实施例3中所描述的类似策略由所述靶向载体生成小鼠。
简言之，用于生成组氨酸修饰的Vκ3-20Jκ1通用轻链靶向载体的策略总结于图14A-14D。使用如图13所示的定点诱变引物通过定点诱变(QuickChange Lightning试剂盒)对生成用于共有(通用)轻链小鼠(在例如US2011/0195454A1中描述的“ULC小鼠”)的靶向载体所使用的质粒进行修饰，从而在CDR3区中使用组氨酸残基取代Q105、Q106、Y107和S109或者Q105、Q106和S109(见图12中的比对)，所述质粒含有pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+小鼠Vκ3-7前导+人源Vκ3-20Jκ1(该工程改造步骤见图14A)。对所得到的载体(H105/106/107/109和H105/106/109)进行进一步修饰并且连接至含有小鼠Igκ恒定区、小鼠增强子、小鼠3’同源臂和SPEC表达盒的载体(图14B)。进一步的修饰涉及到连接引入携带5’小鼠臂并含有Frt-UB-NEO-Frt表达盒的载体(图14B)。将所得到的靶向载体电穿孔进入含有小鼠Igκ可变基因座(含有κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中(图14C-14D)。
通过改良的等位基因测定(Valenzuela等)使用对插入内源性κ轻链基因座的工程改造的Vκ3-20κJ1轻链区具有特异性的探针对阳性ES细胞克隆进行确证。在该测定中使用的引物和探针如下表5中和序列表中所示；所述探针的位置如图14C-14D所示。
表5：ES细胞筛选使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650000981
Figure BDA0002313130650000991
通过使用表达FLP的质粒转染ES细胞来缺失由靶向构建体引入的NEO选择性表达盒(图14C和14D)。任选地，可以通过与表达FLP重组酶的小鼠(例如US6,774,279)繁殖除去新霉素表达盒。任选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
使用上文所述的经靶向的ES细胞作为供体ES细胞并且通过
Figure BDA0002313130650000992
法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0 generation mice that areessentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses(基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞并且能够进行直接的表型分析的F0代小鼠)Nature Biotech.25(1):91-99)将所述ES细胞引入8-细胞阶段的小鼠胚胎。由如上文所述的经靶向的ES细胞来制备独立地携带经工程改造的人源轻链基因的
Figure BDA0002313130650000993
所述经工程改造的人源轻链基因含有突变进入所述序列的一个或多个位置的组氨酸残基。
对胎仔进行基因分型并选择针对经工程改造的组氨酸修饰的人源轻链为杂合子的胎仔以表征所述轻链的表达和所表达的抗体的结合能力。用于对特定含有具有三个(H105/106/109；“6183”)或四个(H105/105/108/111；“6181”)组氨酸修饰的通用轻链基因的小鼠进行基因分型的引物和探针列于下表6和如序列表中所示。在其通用轻链中含有组氨酸修饰的小鼠在本申请中称为“HULC”小鼠(组氨酸通用轻链小鼠)。
表6：基因分型使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650001001
使用目标抗原免疫小鼠并对其生成具有pH依赖性结合的抗体的能力进行检测。
实施例5：含有组氨酸取代的人源通用轻链(HULC)的小鼠的繁殖
本实施例描述了若干其他经基因修饰的小鼠品系，所述其他经基因修饰的小鼠品系能够与本申请所述的任意一种人源HULC小鼠繁殖以形成含有多个经基因修饰的免疫球蛋白基因座的多个基因修饰的小鼠品系。
内源性Igλ的敲除(KO)。为了优化经工程改造的轻链基因座的使用情况，可以将上文所述的任意一种HULC动物(例如含有Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1组氨酸取代的通用轻链)与在内源性λ轻链基因座中含有缺失的另一种小鼠繁殖。在这种方法中，作为其唯一的轻链，所获得的后代将表达如上述实施例3和4中所述的重排的组氨酸取代的人源种系轻链区。通过本领域公知的标准技术进行繁殖，或者委托商业繁殖机构(例如杰克逊实验室公司(TheJackson Laboratory))进行繁殖。针对独特轻链区的存在和内源性小鼠λ轻链的缺失筛选携带经工程改造的组氨酸取代的轻链基因座和内源性λ轻链基因座缺失的小鼠品系。
人源化内源性重链基因座。将携带经工程改造的人源种系轻链基因座的小鼠(HULC小鼠)与含有内源性小鼠重链可变基因座被人源重链可变基因座取代的小鼠(参见US6,596,541和US 8,502,018；
Figure BDA0002313130650001011
小鼠，瑞恩泽制药公司)繁殖。
Figure BDA0002313130650001012
小鼠包含基因组，所述基因组含有与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人源重链可变区，以使得所述小鼠针对抗原刺激应答产生含有人源重链可变结构域和小鼠重链恒定区的抗体。
获得了携带内源性小鼠重链可变区基因座被人源重链可变区基因座取代并且在内源性κ轻链基因座具有组氨酸取代的单一重排的人源轻链可变区的小鼠。在使用目标抗原免疫接种后，获得了含有体细胞突变的重链(人源重链可变结构域和小鼠CH)和组氨酸取代的单一人源轻链(HULC，人源轻链可变结构域和小鼠CL)的反向嵌合抗体。使用本领域公知的或上文所述的抗体分离和筛选方法鉴定在这种小鼠中生产的pH依赖性人源抗体。鉴定了表达所述抗体(例如pH敏感性抗体)的B细胞的可变轻链和重链核苷酸序列，并且通过在适宜的表达系统中将可变重链和轻链区核苷酸序列分别与人源CH和CL核苷酸序列融合来制备全人源抗体。
实施例6：在包含组氨酸取代的人源通用轻链(HULC)和人源重链可变结构域的小鼠中生成的抗体的pH依赖性结合
将携带经工程改造的Vκ1-39/Jκ5ULC(1633)或Vκ1-39/Jκ5的小鼠(所述小鼠包含4个组氨酸取代(HULC 1927)或3个组氨酸取代(HULC 1930))与包含内源性小鼠重链可变区基因座被人源可变区基因座取代的小鼠(参见US 6,596,541和US 8,502,018，
Figure BDA0002313130650001013
小鼠，Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)繁殖。获得了针对人源重链可变区基因座和经工程改造的ULC(标示为“ULC 1633ho/人源重链ho”)、包含4个组氨酸取代的Vκ1-39/Jκ5(标示为“HULC 1927ho/人源重链ho”)或包含3个组氨酸取代的Vκ1-39/Jκ5(标示为“HULC 1930ho/人源重链ho”)的小鼠纯合子。
随后，使用细胞因子受体(“抗原B”)免疫接种针对在上文所述的轻链和重链基因座修饰的基因工程改造的小鼠纯合子。使用3只ULC 1633ho/人源重链ho、7只HULC1927ho/人源重链ho和6只HULC 1930ho/人源重链ho小鼠免疫接种。
处死小鼠并收集脾细胞。裂解除去红细胞，随后将收集得到的脾细胞成团。使用能够鉴定和分离抗原阳性B细胞的试剂混合物孵育重悬的脾细胞。利用流式细胞术分析细胞。分选各IgG阳性、IgM阴性和抗原阳性B细胞并接种在384孔板单独的孔中。对个体B细胞进行PCR检测以扩增抗原特异性重链和轻链可变结构域。将扩增得到的重链和轻链可变结构域克隆进入抗体载体，所述抗体载体分别含有人源IgG1重链恒定区和轻链恒定区。将具有来自相同B细胞的重链和轻链可变序列的纯化的重组质粒共转染并在CHO宿主细胞系中表达。
使用实时表面等离子体共振生物传感器(Biacore 4000)对表达的抗体进行亲和性筛选。记录在中性pH(pH 7.4)和在酸性pH(pH 6.0)下抗体与免疫原结合的动力学结合参数(例如ka、kd、KD、t1/2等)。使用单克隆小鼠抗-人Fc抗体对Biacore CM4传感器芯片进行衍生化以捕获上清液中的抗体。然后以30μl/min的流速将单一浓度(100nM)的免疫原注射至抗体捕获表面。监测1.5分钟抗体与抗原的结合，然后监测2.5分钟抗原与所捕获抗体的解离。通过使用Biacore 4000评估软件(1.0版)处理并将数据拟合为与质量转运模型1:1结合确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。利用动力学速率常数计算平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝ln2/(60*kd)。
将Biacore结合物定义为具有可检测KD的任意抗体。在这项实验中将pH依赖性结合物定义为具有在pH 7.4下t1/2与在pH 6.0下t1/2的比值大于约2的任意抗体。
如下表7所示，与1633ULC小鼠相比，在1927和1930HULC小鼠中，显示出pH依赖性抗原结合的抗体百分率增加2-3倍。
表7：在HULC小鼠中产生的pH依赖性抗体的百分率
Figure BDA0002313130650001021
Figure BDA0002313130650001031
实施例7：包含两个人源V区段的小鼠的生成和分析
实施例7.1：生成包含两个人源V区段的小鼠的靶向载体的构建
构建含有两个人源Vκ基因区段(例如人源Vκ1-39和人源Vκ3-20基因区段)的两个经工程改造的轻链基因座(图16B)。一个经工程改造的轻链基因座含有未经重排配置的两个人源Vκ基因区段和五个人源Jκ基因区段(DLC-5J)。另一个经工程改造的轻链基因座含有未经重排配置的两个人源Vκ基因区段和一个人源Jκ基因区段(DLC-1J)。对于两个附加的经工程改造的轻链基因座中的每一个而言，在所述人源基因区段3’翼侧具有重组信号序列以使得所述人源基因区段能够在B细胞中进行体内重排。
DLC-1J小鼠的工程改造和生成。生成轻链基因座的工程改造步骤如图17所示，所述轻链基因座包含两个人源Vκ基因区段(Vκ1-39和Vκ3-20)和一个人源Jκ基因区段(Jκ5)，也称为DLC-1J。特别地，利用PCR从BAC模板(Invitrogen)扩增人源Vκ1-39和Vκ3-20序列，将含有重组信号序列(rss)的扩增序列和人源Jκ5区段一起经由四步连接克隆进入含有UB潮霉素选择性表达盒的质粒中(图17A)。5’和3’臂的连接如图17B和17C所示。
所得到的靶向构建体如图16B所示(下图；DLC-1J)，重组信号序列(RSS)以清楚的椭圆形表示。利用PCR使用位于含有两个人源Vκ基因区段的经工程改造的轻链基因座中的序列内的引物确证与小鼠序列(即所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的上游和下游序列)可操作地连接的经工程改造的DLC-1J轻链基因座的经修饰的BAC DNA克隆，随后电穿孔进入ES细胞，所述ES细胞包含所述小鼠Igκ可变基因座(含有κ可变和接合基因区段)的缺失(图17D)以形成表达所述两个人源Vκ基因区段的任意一个的小鼠。利用TaqmanTM筛选确证含有经工程改造的DLC-1J轻链基因座的阳性ES细胞克隆并使用特异性针对经工程改造的DLC-1J轻链基因座的探针进行核型分析。DLC-1J ES细胞的ES细胞筛选使用的引物和探针序列如下表8所示并且包括在序列表中。
表8：ES细胞筛选使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650001041
然后使用经确证的ES细胞克隆植入雌性小鼠以产生包含DLC-1J轻链基因座并且表达与小鼠Cκ结构域融合的人源轻链可变结构域的一窝幼崽。幼崽基因分型使用的引物和探针序列列于上表8。经工程改造的DLC-1J基因座序列，包括所插入的经工程改造序列上游和下游的约100个小鼠核苷酸参见图18并且如SEQ ID NO:82所示。
可以使用表达FLP的构建体转染携带经工程改造的轻链基因座的ES细胞以除去由所述靶向构建体引入的FRTed新霉素表达盒(见图17E)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠繁殖除去所述新霉素表达盒(例如US 6,774,279)。任选地，在所述小鼠中保留所述新霉素表达盒。
DLC-5J小鼠的工程改造和生成。为了生成包含两个人源Vκ基因区段(Vκ1-39和Vκ3-20)和五个人源Jκ基因区段(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5)的轻链基因座，也称为DLC-5J，将含有全部5个人源Jκ的2000个碱基对的扩增序列连接至如图17B所示(中间)含有两个人源Vκ基因区段和一个人源Jκ的载体(见图19A)。涉及3’和5’臂连接的后续工程改造步骤如图19B所示。
所得到的靶向构建体如图16B所示(上图；DLC-5J)，重组信号序列(RSS)以清楚的椭圆形表示。利用PCR使用位于含有两个人源Vκ基因区段的经工程改造的轻链基因座中的序列的引物确证与小鼠序列(即所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的上游和下游序列)可操作地连接的经工程改造的DLC-5J轻链基因座的经修饰的BAC DNA克隆，随后电穿孔进入ES细胞，所述ES细胞包含所述小鼠Igκ可变基因座(含有κ可变和接合基因区段)的缺失(图19C)以形成表达所述两个人源Vκ基因区段的任意一个的小鼠。利用TaqmanTM筛选确证含有经工程改造的DLC-5J轻链基因座的阳性ES细胞克隆并使用特异性针对经工程改造的DLC-5J轻链基因座的探针进行核型分析。DLC-5J ES细胞的ES细胞筛选使用的引物和探针序列如下表9所示并且包括在序列表中。
表9：ES细胞筛选使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650001051
Figure BDA0002313130650001061
然后使用经确证的ES细胞克隆植入雌性小鼠以产生包含DLC-5J轻链基因座并且表达与小鼠Cκ结构域融合的人源轻链可变结构域的一窝幼崽。幼崽基因分型使用的引物和探针序列列于上表9。经工程改造的DLC-5J基因座序列，包括所插入的经工程改造序列上游和下游的约100个小鼠核苷酸参见图20并且如SEQ ID NO:83所示。
可以使用表达FLP的构建体转染携带经工程改造的轻链基因座的ES细胞以除去由所述靶向构建体引入的FRTed新霉素表达盒(见图19D)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠繁殖除去所述新霉素表达盒(例如US 6,774,279)。任选地，在所述小鼠中保留所述新霉素表达盒。
实施例7.2：包含两个人源V区段的小鼠的表征
流式细胞术。通过对脾细胞和骨髓制备物进行流式细胞术分析验证在DLC小鼠中的B细胞群和B细胞发育。使用标准方法制备两个人源Vκ基因区段和五个人源Jκ基因区段小鼠纯合子(n＝4)、两个人源Vκ基因区段和一个人源Jκ基因区段小鼠纯合子(n＝4)以及野生型小鼠(n＝4)的细胞悬液并使用荧光标记的抗体对其进行染色。
简言之，将1x106个细胞与抗小鼠CD16/CD32抗体(克隆2.4G2，BD Pharmigen)在冰上孵育10分钟，随后使用下述抗体混合物在冰上标记30分钟：与APC-H7偶联的抗小鼠CD19抗体(克隆1D3，BD Pharmigen)、与太平洋蓝偶联的抗小鼠CD3抗体(克隆17A2，BioLegend)、与FITC偶联的抗小鼠Igκ抗体(克隆187.1，BDPharmigen)或抗小鼠CD43抗体(克隆1B11，BioLegend)、与PE偶联的抗小鼠Igλ抗体(克隆RML-42，BioLegend)或抗小鼠c-kit抗体(克隆2B8，BioLegend)、与PerCP-Cy5.5偶联的抗小鼠IgD抗体(BioLegend)、与PE-Cy7偶联的抗小鼠IgM抗体(克隆II/41，eBioscience)、与APC偶联的抗小鼠B220抗体(克隆RA3-6B2，eBioscience)。染色后，洗涤细胞并在2％的甲醛中固定。在LSRII流式细胞仪上进行数据采集并使用FlowJo(Tree Star,Inc.)进行分析。门控：总B细胞(CD19+CD3-)、Igκ+B细胞(Igκ+Igλ-CD19+CD3-)、Igλ+B细胞(Igκ-Igλ+CD19+CD3-)。骨髓区间的结果见图21A-23B。脾脏区间的结果见图24A-27。
如本实施例中所示，DLC-5J小鼠在脾脏和骨髓区间中显示出正常的B细胞群(图21A-27)。DLC-5J小鼠在骨髓区间中显示出未成熟的、成熟的和pre/pro B细胞群，其与在野生型同窝中观察到的基本一致。事实上，DLC-5J基因座能够与内源性λ轻链基因座竞争以产生基本上与在野生型小鼠中观察到的相同的κ:λ比值(图25B)。而且，作为在脾脏区间中B细胞在不同阶段的进展(例如未成熟、成熟、T1、T2、T3、边缘区前体、边缘区、滤泡-I、滤泡-II等)，DLC-5J小鼠以与在野生型小鼠中观察到的基本相同的方式显示出正常的B细胞发育(图26A-27)。而相反的是，DLC-1J小鼠显示出减少的B细胞总数和与经工程改造的κ轻链相比增加的λ轻链使用(数据未显示)。
双轻链的表达。使用定量PCR测定在纯合子小鼠中分析两种人源Vκ基因区段的表达。简言之，从野生型小鼠、使用相应的人源重链和κ轻链可变区基因座(Hκ)取代小鼠重链和κ轻链可变基因座的小鼠纯合子以及针对含有两个人源Vκ基因区段和五个人源Jκ基因区段(DLC-5J)或一个人源Jκ基因区段(DLC-1J)的经工程改造的κ轻链基因座的小鼠纯合子的骨髓和整个脾脏中纯化CD19+B细胞。将相关表达归一化为小鼠Cκ区的表达(n＝每组3至5只小鼠)。结果见图28和图29。
在DLC-5J和DLC-1J小鼠的骨髓和脾脏中检测含有重排的人源Vκ3-20或人源Vv1-39基因区段的轻链的表达(图28和图29)。在骨髓区间中，与包含小鼠Vκ和Jκ基因区段被相应的人源Vκ和Jκ基因区段取代的小鼠相比，在这两个品系的DLC小鼠中人源Vκ3-20来源和人源Vκ1-39来源轻链的表达都明显更高(Hκ；图28)。所观察到的人源Vκ3-20来源轻链的表达比在Hκ小鼠中的高约6倍(DLC-5J)至15倍(DLC-1J)。在骨髓区间中，DLC-1J小鼠显示出的人源Vκ3-20来源轻链的表达比DLC-5J小鼠的高约2倍。所观察到的人源Vκ1-39来源轻链的表达比在Hκ小鼠中的高约6倍(DLC-5J)至13倍(DLC-1J)。在骨髓区间中，DLC-1J小鼠显示出的人源Vκ1-39来源轻链的表达比DLC-5J小鼠高约2倍。
在脾脏区间中，与Hκ小鼠相比，在这两个品系的DLC小鼠中人源Vκ3-20来源和人源Vκ1-39来源轻链的表达明显更高(图29)。所观察到的人源Vκ3-20来源轻链的表达比在Hκ小鼠中的高约4倍(DLC-5J)和8倍(DLC-1J)。在脾脏区间中，DLC-1J小鼠显示出人源Vκ3-20来源轻链的表达比DLC-5J小鼠的高约2倍。所观察到的人源Vκ1-39来源轻链的表达比在Hκ小鼠中的高约4倍(DLC-5J)至5倍(DLC-1J)。在脾脏区间中，DLC-1J小鼠显示出人源Vκ1-39来源轻链的表达与DLC-5J小鼠相似。
在DLC-5J小鼠中人源VL/JL的使用。利用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)针对在脾脏B细胞中人源Vκ/Jκ基因区段的使用对针对两个未经重排的人源Vκ基因区段和五个未经重排的人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)进行分析。
简言之，收集纯合子DLC-5J(n＝3)和野生型(n＝2)小鼠的脾脏并在10mL含有10％热灭活胎牛血清的RPMI 1640(Sigma)中使用磨砂载玻片过筛以形成单细胞悬液。使用离心机使脾细胞成团(1200rpm 5分钟)并且在5mL ACK裂解缓冲液(GIBCO)中裂解红细胞3分钟。使用PBS(Irvine Scientific)稀释脾细胞，使用0.7μm细胞筛过滤并再次离心将细胞成团，随后将其在1mL PBS中重悬。
根据生产厂商的说明，使用AllPrep DNA/RNA微量试剂盒(Qiagen)从成团的脾细胞中分离RNA。在脾细胞RNA上根据生产厂商的说明(Invitrogen)使用针对小鼠Cκ基因具有引物特异性的5’RACE(cDNA末端的快速扩增)系统进行RT-PCR。针对小鼠Cκ基因的特异性引物为3’mIgκC RACE1(AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC；SEQ ID NO:90)和mIgκC3’-1(CTCACTGGAT GGTGGGAAGA TGGA；SEQ ID NO:91)。对PCR产物进行凝胶纯化并克隆进入
Figure BDA0002313130650001091
载体(
Figure BDA0002313130650001092
TA
Figure BDA0002313130650001093
试剂盒，Invitrogen)以及使用位于所述载体中克隆位点翼侧位置的M13正向(GTAAAACGAC GGCCAG；SEQ ID NO:92)和M13反向(CAGGAAACAGCTATGAC；SEQ ID NO:93)引物测序。对来自各个脾脏样品的10个克隆进行测序。将序列与IMGT/V-QUEST对照目录集中的小鼠和人免疫球蛋白集合进行比较以确定Vκ/Jκ的使用。表10显示了在来自各个脾细胞样品的RT-PCR克隆中观察到的针对所选定克隆的Vκ/Jκ组合。表11显示了来自DLC-5J纯合子小鼠的所选定RT-PCT克隆的人源Vκ/人源Jκ和人源Jκ/小鼠Cκ接合的氨基酸序列。小写字母表示在重组过程中N和/或P的添加产生的可变区或非模板添加的氨基酸序列中的突变。
如本实施例所示，针对与所述小鼠Cκ基因可操作地连接的两个未经重排的人源Vκ基因区段和五个未经重排的人源Jκ基因区段的小鼠纯合子(DLC-5J)能够有效地将这两个人源Vκ基因区段与多个人源Jκ基因区段重组以产生有限的免疫球蛋白轻链库。在表10所示的DLC-5J纯合子小鼠的重排中，所观察到的独特的人源Vκ/Jκ重排为Vκ1-39/Jκ2(1)、Vκ1-39/Jκ3(1)、Vκ3-20/Jκ1(7)、Vκ3-20/Jκ2(4)和Vκ3-20/Jκ3(1)。而且，此类独特的重排显示了轻链CDR3区中存在的独特氨基酸的接合多样性(表11)，其是发育过程中人源Vκ和Jκ基因区段的突变和/或重组所致。所有重排显示了向小鼠Cκ中的功能性阅读(表11)。
总之，这些数据表明经工程改造存在不超过两个人源VL基因区段的选择的小鼠具有的B细胞数及其发育在各方面与野生型接近，所述不超过两个人源VL基因区段均能够重排(例如与一个或多个和在一些实施方式中高达五个人源JL基因区段)和编码免疫球蛋白轻链的人源VL结构域。此类小鼠产生一系列具有免疫球蛋白轻链的抗体，所述免疫球蛋白轻链具有在该系列中存在的两个可能的人源VL基因区段中的一个。该系列抗体由对抗原攻击产生应答的小鼠产生并且与多种多样的反向嵌合(人源可变/小鼠恒定)重链相关。
表10：在脾细胞样品中观察到的Vκ/Jκ重组
Figure BDA0002313130650001101
表11：DLC-5J纯合子小鼠的人源Vκ/人源Jκ和人源Jκ/小鼠Cκ接合的氨基酸序列
Figure BDA0002313130650001111
实施例8：包含两个组氨酸取代的人源轻链的小鼠的生成和表征
实施例8.1：包含分别含有四个组氨酸取代的两个Vκ区段的小鼠的工程改造和生成
如上文针对Vκ1-39和Vκ3-20的ULC小鼠的描述将组氨酸取代引入双轻链基因座。简言之，将图19A(下部)中描述的DLC序列进行位点定向诱变，首先修饰Vκ1-39序列，随后修饰Vκ3-20序列，使用图30中所示的引物。所得到的双轻链序列含有Vκ1-39区段，其在种系序列位置105、106、108和111的引入了组氨酸，Vκ3-20区段，其在种系序列位置105、106、107和109的引入了组氨酸，以及全部五个Jκ区段(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5)。随后的工程改造步骤包括将携带FRT-UB-NEO-FRT表达盒的5’臂以及携带小鼠Igκ增强子和恒定区的3’臂连接。将该靶向载体电穿孔进入ES细胞，所述ES细胞包含小鼠Igκ可变基因座(包括κ可变和接合基因区段)的缺失，如图31A所示(在该图中省略了重组信号序列RSS)。通过如上文所述的等位基因修饰测定筛选被靶向的ES细胞，使用检测上述表1、5、8和9中所述区域的引物和探针(特别地，1633h2、1635h2、neo、Jxn 1-39/3-20、mIgKd2和mIgKp15)，以及下表12中所列的两个附加引物和探针集中的引物和探针。这两个附加的引物和探针集的序列包括在序列表中。
表12：ES细胞筛选使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650001121
然后使用经确证的ES细胞克隆植入雌性小鼠，以获得一窝幼崽，所述幼崽包含在两个存在的VL区段序列的每一个中均具有四个组氨酸修饰的DLC-5J轻链基因座，并且表达与小鼠Cκ结构域融合的人源轻链可变结构域。与ES细胞筛选使用的相同序列中的一些也用于幼崽的基因分型。
可以使用表达FLP(例如FLPo)的构建体转染携带经工程改造的轻链基因座的ES细胞以除去通过靶向构建体引入的FRTed新霉素表达盒(参见图31B，在该图中省去了RSS)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠繁殖除去所述新霉素表达盒(例如US 6,774,279)。任选地，在所述小鼠中保留所述新霉素表达盒。
实施例8.2：包含分别含有三个组氨酸取代的两个Vκ区段的小鼠的工程改造和生成
将三个组氨酸取代引入双轻链小鼠的每个Vκ1-39和Vκ3-20中。简言之，对图19A(下部)所示的DLC序列进行位点定向诱变，使用图32中所示的引物首先修饰Vκ1-39序列，随后修饰Vκ3-20序列。所得到的双轻链序列含有Vκ1-39区段，其在种系序列位置106、108和111的引入了组氨酸，Vκ3-20区段，其在种系序列位置105、106和109的引入了组氨酸，以及全部五个Jκ区段(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5)。随后的工程改造步骤包括将携带FRT-UB-NEO-FRT表达盒的5’臂以及携带小鼠Igκ增强子和恒定区的3’臂连接。将该靶向载体电穿孔进入ES细胞，所述ES细胞包含小鼠Igκ可变基因座(包括κ可变和接合基因区段)的缺失，如图33A所示(在该图中省略了重组信号序列RSS)。通过如上文所述的等位基因修饰测定筛选被靶向的ES细胞，使用检测上述表1、5、8和9中所述区域的引物和探针(特别地，1633h2、1635h2、neo、Jxn 1-39/3-20、mIgKd2和mIgKp15)，以及下表13中所列的两个附加引物和探针集中的引物和探针。这两个附加的引物和探针集的序列包括在序列表中。
表13：ES细胞筛选使用的引物和探针
Figure BDA0002313130650001131
然后使用经确证的ES细胞克隆植入雌性小鼠，以获得一窝幼崽，所述幼崽包含在两个存在的VL区段序列的每一个中均具有四个组氨酸修饰的DLC-5J轻链基因座，并且表达与小鼠Cκ结构域融合的人源轻链可变结构域。与ES细胞筛选使用的相同序列中的一些也用于幼崽的基因分型。
可以使用表达FLP(例如FLPo)的构建体转染携带经工程改造的轻链基因座的ES细胞以除去通过靶向构建体引入的FRTed新霉素表达盒(参见图33B，在该图中省去了RSS)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠繁殖除去所述新霉素表达盒(例如US6,774,279)。任选地，在所述小鼠中保留所述新霉素表达盒。
实施例8.3：包含人源组氨酸取代的双轻链的小鼠的繁殖
将携带经工程改造的人源组氨酸取代的双轻链基因座的小鼠与含有内源性λ轻链基因座缺失的小鼠繁殖，以生成表达作为其唯一的轻链的来源于所述双轻链基因座的经工程改造的组氨酸取代的轻链的后代。
将携带经工程改造的人源组氨酸取代的双轻链基因座的小鼠与含有内源性小鼠重链可变基因座被人源重链可变基因座取代的小鼠(参见US 6,596,541和US 8,502,018；
Figure BDA0002313130650001141
小鼠，Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)繁殖。
与本申请所述的相似的繁殖是在上述实施例7中所描述的对双轻链小鼠的设置。
对这些繁殖方法以及对从所述人源可变轻链和重链区生成全人源抗体的更加详细的描述见上述实施例5。
实施例8.4：在从包含每个含有三个组氨酸取代的两个Vκ区段的小鼠获得的免疫球蛋白轻链中组氨酸修饰的检测
使用逆转录酶RCR(RT-PCR)和高通量筛选从脾脏B细胞mRNA制备Vκ扩增子。
简言之，从五个杂合子小鼠中收集脾脏并使用载玻片在1xPBS(Gibco)中匀浆，所述小鼠包含每个含有三个组氨酸取代的两个Vκ区段(Vκ1-39和Vκ3-20)(小鼠的κ基因座如图33所示)和内源性小鼠重链。在离心机中将细胞成团(500xg，5分钟)，并且在ACK裂解缓冲液(Gibco)中将红细胞裂解3分钟。使用1xPBS洗涤细胞并使用0.7μm的细胞过滤器过筛。使用针对CD19的MACS磁阳性选择(Miltenyi Biotec)从脾细胞中分离B-细胞。使用RNeasyPlus试剂盒(Qiagen)从成团的B细胞中分离总RNA。使用Oligotex Direct mRNA微量试剂盒(Qiagen)从总RNA中分离PolyA+mRNA。
利用5’RACE使用SMARTer Pico cDNA合成试剂盒(Clontech)从脾脏B细胞中制备双链cDNA。使用Invitrogen的Superscript II和dNTP代替Clontech的逆转录酶和dNTP。使用对IgK恒定区具有特异性的引物和SMARTer 5’RACE引物从cDNA扩增免疫球蛋白轻链库(表14)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)净化PCR产物。使用相同的5’RACE引物和对IgK恒定区具有特异性的嵌套3’引物进行第二轮PCR(表15)。使用SizeSelect E-凝胶系统(Invitrogen)纯化第二轮的PCR产物。使用加入454个适体和条形码的引物进行第三轮PCR。使用Agencourt AMPure XP小珠纯化第三轮的PCR产物。使用KAPA文库定量试剂盒(KAPABiosystems)通过SYBR-qPCR对经纯化的PCR产物进行定量。使用454GS Junior TitaniumSeries Lib-A emPCR试剂盒(Roche Diagnostics)对混合文库进行乳液PCR(emPCR)并根据生产厂商的方案使用Roche 454 GS Junior仪器进行双向测序。
表14：第一轮的PCR引物
Figure BDA0002313130650001151
表15：第二轮的PCR引物
Figure BDA0002313130650001152
对于生物信息分析而言，根据样品条形码的最佳匹配对454个序列读数进行分类并对其质量进行调整。根据使用本地安装的igblast(NCBI,v2.2.25+)对重排的Ig序列与人源种系V和J区段数据库进行的比对对序列进行注释。当检测到具有相等得分的多个最佳命中时将序列标记为不明确的并从分析中去除。开发一组perl脚本以便分析结果并在mysql数据库中储存数据。将κ轻链的CDR3区定义为保守的C密码子与FGXG基序之间。
图34表示由人源种系IGKV3-20(图34A)或IGKV1-39(图34B)序列编码的氨基酸序列与从在包含组氨酸修饰的DLC-5J的小鼠(包含含有Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的轻链可变基因座，每个区段具有如上文所述的三个组氨酸修饰)中产生的有效重排抗体中获得的示例性Vκ序列的氨基酸翻译的比对。序列读数显示大多数有效重排的轻链保留了引入其种系CDR3中的至少一个组氨酸。在一些例子中，在所有包含Vκ3-20序列的有效重排的人源轻链的大部分中保留了至少一个组氨酸残基，引入其种系CDR3中的全部三个组氨酸修饰均保留(见图34A)。在一些例子中，在包含Vκ1-39序列的有效重排的人源轻链中保留了至少一个组氨酸残基，约50％的轻链保留了引入其种系CDR3中的全部三个组氨酸(参见图34B，上部比对)，同时约50％的轻链保留了引入其种系CDR3中的三个组氨酸中的两个(参见图34B，下部比对)。在一些例子中，V区段序列最末位的组氨酸可能由于V-J重排缺失。
本申请公开的本发明的59个非限制性实施方式如下文所示。
1.一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座含有与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接的至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段，
其中每个人源VL基因区段包含至少一个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系VL基因区段编码，和
其中所述至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。
2.根据实施方式1所述的动物，其中所述动物不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链的内源性VL基因区段。
3.根据实施方式1所述的动物，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列。
4.根据实施方式3所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是小鼠或大鼠序列。
5.根据实施方式3所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性免疫球蛋白轻链恒定区序列。
6.根据实施方式1所述的动物，在其种系中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含与免疫球蛋白重链恒定区序列可操作地连接的未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列包含人源VH、DH和JH基因区段。
7.根据实施方式6所述的动物，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列是非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。
8.根据实施方式7所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是小鼠或大鼠序列。
9.根据实施方式7所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。
10.根据实施方式1所述的动物，其中所述至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段存在于所述内源性免疫球蛋白轻链基因座。
11.根据实施方式1所述的动物，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区是Cκ区。
12.根据实施方式1所述的动物，其中每个人源VL基因区段包含至少一个由相应的人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
13.根据实施方式12所述的动物，其中所述取代在CDR3密码子中。
14.根据实施方式13所述的动物，其中所述取代是三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
15.根据实施方式1所述的动物，其中所述至少一个人源VL基因区段是两个人源VL基因区段。
16.根据实施方式15所述的动物，其中两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。
17.根据实施方式1所述的动物，其中所述动物是啮齿动物。
18.根据实施方式17所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
19.根据实施方式18所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠。
20.根据实施方式1所述的动物，其中所述动物表达包含由所述至少一个人源VL基因区段编码的氨基酸序列的抗体和所述抗体在由所述人源VL基因区段的至少一个组氨酸密码子编码的氨基酸位置保留至少一个组氨酸残基。
21.根据实施方式1所述的动物，其中所述动物包含对目标抗原生成应答的B细胞群，所述B细胞群富含抗体，所述抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
22.根据实施方式21所述的动物，其中所富含的抗体显示出t1/2降低至少约2倍。
23.一种基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接的不超过两个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段，
其中所述不超过两个人源VL基因区段的每一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子，和
其中所述人源VL基因区段和JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。
24.根据实施方式23所述的动物，其中所述动物不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链的内源性VL基因区段。
25.根据实施方式23所述的动物，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列。
26.根据实施方式25所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是小鼠或大鼠序列。
27.根据实施方式25所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性免疫球蛋白轻链恒定区序列。
28.根据实施方式23所述的动物，在其种系中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含与免疫球蛋白重链恒定区序列可操作地连接的未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列包含人源VH、DH和JH基因区段。
29.根据实施方式28所述的动物，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列是非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。
30.根据实施方式29所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是小鼠或大鼠序列。
31.根据实施方式29所述的动物，其中所述非人源免疫球蛋白重链恒定区序列是内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区序列。
32.根据实施方式23所述的动物，其中所述不超过两个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段存在于所述内源性免疫球蛋白轻链基因座。
33.根据实施方式23所述的动物，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区是Cκ区。
34.根据实施方式23所述的动物，其中所述动物包含五个人源Jκ区段，和所述五个人源Jκ区段是人源Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5区段。
35.根据实施方式23所述的动物，其中所述不超过两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段。
36.根据实施方式23所述的动物，其中所述不超过两个人源VL基因区段的每一个包含至少一个由相应的人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
37.根据实施方式36所述的动物，其中所述取代在CDR3密码子中。
38.根据实施方式37所述的动物，其中所述取代是三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
39.根据实施方式35所述的动物，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含至少一个由相应的人源种系VL基因区段序列编码的非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
40.根据实施方式39所述的动物，其中所述人源Vκ1-39和Vκ3-20基因区段的每一个包含三个或四个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
41.根据实施方式40所述的动物，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段的三个非组氨酸密码子取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置106、108和111表达组氨酸。
42.根据实施方式40所述的动物，其中所述取代是所述人源Vκ1-39基因区段的四个非组氨酸密码子取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ1-39基因区段的位置105、106、108和111表达组氨酸。
43.根据实施方式40所述的动物，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段的三个非组氨酸密码子取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106和109表达组氨酸。
44.根据实施方式40所述的动物，其中所述取代是所述人源Vκ3-20基因区段的四个非组氨酸密码子取代，并且所述取代被设计为在所述人源Vκ3-20基因区段的位置105、106、107和109表达组氨酸。
45.根据实施方式40所述的动物，其中所述动物是啮齿动物。
46.根据实施方式45所述的动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
47.根据实施方式46所述的动物，其中所述啮齿动物是小鼠。
48.根据实施方式23所述的动物，其中所述动物表达抗体，所述抗体包含由所述不超过两个人源VL基因区段中的一个编码的氨基酸序列，并且所述抗体在由所述人源VL基因区段的至少一个组氨酸密码子编码的氨基酸位置保留至少一个组氨酸残基。
49.一种生成对目标抗原显示出pH依赖性结合的抗体的方法，所述方法包括：
生成实施方式1所述的动物，
使用目标抗原免疫所述动物，和
选择在中性pH下与目标抗原以所需的亲和性结合而在酸性pH下显示出与目标抗原结合降低的抗体。
50.根据实施方式23所述的动物，其中所述动物表达对抗原产生应答的抗原特异性抗体群，其中在所述群中的所有抗体包含：
来源于所述不超过两个VL基因区段与一个或多个JL基因区段重排的免疫球蛋白轻链可变结构域，其中所述不超过两个人源VL基因区段中的每一个包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子，和
免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含来源于人源重链V、D和J区段库的人源重链可变结构域。
51.根据实施方式23所述的动物，其中所述动物包含对目标抗原生成应答的B细胞群，所述B细胞群富含抗体，所述抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
52.根据实施方式51所述的动物，其中所富含的抗体显示出t1/2降低至少约2倍。
53.一种制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系中包含基因修饰的免疫球蛋白轻链基因座，所述方法包括：
修饰所述非人动物的基因组以缺失或在免疫球蛋白轻链基因座生成非功能性的内源性免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段，和
在所述非人动物的基因组中放置免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段，以使得所述免疫球蛋白轻链可变区序列与免疫球蛋白恒定区序列可操作地连接，
其中每个人源VL基因区段包含至少一个不是由相应的人源种系VL基因区段编码的组氨酸密码子，和
其中所述至少一个人源VL基因区段和至少一个人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。
54.根据实施方式53所述的方法，其中所述方法使得在所述非人动物中包含富含显示出pH依赖性地与目标抗原结合的抗体的B细胞群。
55.根据实施方式53所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链可变区在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。
56.根据实施方式53所述的方法，其中所述动物是啮齿动物。
57.根据实施方式56所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
58.根据实施方式53所述的方法，其中所述至少一个人源VL基因区段是两个人源VL基因区段。
59.根据实施方式58所述的方法，其中所述两个人源VL基因区段是人源Vκ1-39基因区段和Vκ3-20基因区段。
等价物
本领域技术人员使用不超过常规实验技术将理解或能够确定本申请所述的发明特定实施方式的多种等价物。这些等价物旨在被包含在下述权利要求中。
在本申请通篇引用的所有非专利文献、专利申请和专利的全部内容均通过引用整体并入本申请。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
J·麦克沃克
L·麦克唐纳
A·J·莫菲
<120> 组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物
<130> 8825A-WO
<140> 待定
<141> 2014-09-18
<150> 14/030,424
<151> 2013-09-18
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<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 57
agtctgcaac ctgaagattt tgc 23
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 58
cccttggccg aaggtgat 18
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 60
gattttgcag tgtattactg tcagcagtat ggtagctcac cttggacgtt cggc 54
<210> 61
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 61
gattttgcag tgtattactg tcatcaccat ggtcactcac cttggacgtt cggc 54
<210> 62
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 62
gccgaacgtc caaggtgagt gaccatggtg atgacagtaa tacactgcaa aatc 54
<210> 63
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 63
gcagtgtatt actgtcatca ctatggtcac tcaccttgga cgttcgg 47
<210> 64
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 64
ccgaacgtcc aaggtgagtg accatagtga tgacagtaat acactgc 47
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 65
aaagagccac cctctcctgc aggg 24
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 66
tccaggcacc ctgtctttg 19
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 67
aagtagctgc tgctaacact ctgact 26
<210> 68
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 68
ctgtcatcac catgg 15
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 69
gcagactgga gcctgaagat ttt 23
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 70
ccgaacgtcc aaggtgagtg 20
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 71
tactgtcatc actatgg 17
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 72
gcagactgga gcctgaagat tt 22
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 73
ccgaacgtcc aaggtgagtg 20
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<400> 74
cag cag tat ggt agc tca cct 21
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
1 5
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 75
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
1 5
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<400> 76
cat cac cat ggt cac tca cct 21
His His His Gly His Ser Pro
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 77
His His His Gly His Ser Pro
1 5
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<400> 78
cat cac tat ggt cac tca cct 21
His His Tyr Gly His Ser Pro
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 79
His His Tyr Gly His Ser Pro
1 5
<210> 80
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 81
caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 50
<210> 82
<211> 9652
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 82
gcaccacttc gtcgcagcgc aggctttggt ctcccttgtc cgtgcggcgc acgcccaccg 60
agtttacgca ccagcacacc gaggtctggt tggtaccgaa gttcctattc cgaagttcct 120
attctctaga aagtatagga acttctcgcg cgtctggcct ccgaggcctc cgcgccgggt 180
tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctgccacgt cagacgaagg 240
gcgcagcgag cgtcctgatc cttccgcccg gacgctcagg acagcggccc gctgctcata 300
agactcggcc ttagaacccc agtatcagca gaaggacatt ttaggacggg acttgggtga 360
ctctagggca ctggttttct ttccagagag cggaacaggc gaggaaaagt agtcccttct 420
cggcgattct gcggagggat ctccgtgggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc 480
gccgggtgtg gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt 540
ggatcgctgt gatcgtcact tggtgagtag cgggctgctg ggctggccgg ggctttcgtg 600
gccgccgggc cgctcggtgg gacggaagcg tgtggagaga ccgccaaggg ctgtagtctg 660
ggtccgcgag caaggttgcc ctgaactggg ggttgggggg agcgcagcaa aatggcggct 720
gttcccgagt cttgaatgga agacgcttgt gaggcgggct gtgaggtcgt tgaaacaagg 780
tggggggcat ggtgggcggc aagaacccaa ggtcttgagg ccttcgctaa tgcgggaaag 840
ctcttattcg ggtgagatgg gctggggcac catctgggga ccctgacgtg aagtttgtca 900
ctgactggag aactcggttt gtcgtctgtt gcgggggcgg cagttatggc ggtgccgttg 960
ggcagtgcac ccgtaccttt gggagcgcgc gccctcgtcg tgtcgtgacg tcacccgttc 1020
tgttggctta taatgcaggg tggggccacc tgccggtagg tgtgcggtag gcttttctcc 1080
gtcgcaggac gcagggttcg ggcctagggt aggctctcct gaatcgacag gcgccggacc 1140
tctggtgagg ggagggataa gtgaggcgtc agtttctttg gtcggtttta tgtacctatc 1200
ttcttaagta gctgaagctc cggttttgaa ctatgcgctc ggggttggcg agtgtgtttt 1260
gtgaagtttt ttaggcacct tttgaaatgt aatcatttgg gtcaatatgt aattttcagt 1320
gttagactag taaattgtcc gctaaattct ggccgttttt ggcttttttg ttagacgtcg 1380
agctctagat tgggaacccg ggtctctcga attgttgaca attaatcatc ggcatagtat 1440
atcggcatag tataatacga caaggtgagg aactaaacca tccaccatga ttgaacaaga 1500
tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 1560
acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 1620
ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 1680
gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 1740
tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 1800
tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 1860
gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 1920
tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 1980
cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 2040
cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 2100
attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 2160
ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 2220
tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 2280
aagatccgct gtaagtctgc agaaattgat gatctattaa acaataaaga tgtccactaa 2340
aatggaagtt tttcctgtca tactttgtta agaagggtga gaacagagta cctacatttt 2400
gaatggaagg attggagcta cgggggtggg ggtggggtgg gattagataa atgcctgctc 2460
tttactgaag gctctttact attgctttat gataatgttt catagttgga tatcataatt 2520
taaacaagca aaaccaaatt aagggccagc tcattcctcc cactcatgat ctatagatct 2580
atagatctct cgtgggatca ttgtttttct cttgattccc actttgtggt tctaagtact 2640
gtggtttcca aatgtgtcag tttcatagcc tgaagaacga gatcagcagc ctctgttcca 2700
catacacttc attctcagta ttgttttgcc aagttctaat tccatcagac ctcgacctgc 2760
agcccctaga gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcct 2820
agggtttcac cggtggcgcg ccgagagagg aaagagagca gcgataccga aaatgtcctc 2880
agcgagaagc taccacagag gatgaatgga gatcaagccc acgtggaaac atgggaaaat 2940
gtctcagtat ttttccacct aagaagggag ggagatgggg tatgtataca cctccctgtc 3000
ctcactgatt gagggctttc cgagaggatg ctcattccag gtgctgtgat aggccatgtg 3060
tacaggcagg gctgccttct ccagcttcag atagagcagt gaggaaaaga tatggccatg 3120
gggggtcagc agaagtacag caaagggaaa agggaaaggg tagcaagagt gacaactata 3180
ttcacccccc ccacacacac acacacacac acgaaattgt gtattgcaat ccagaactgc 3240
ttctctctga acctaaatct tagcaagcag tttaccagta actgcccttg aaattcaggc 3300
ccctggaaag gagcaggggg ttgtgtacag gctataccac agcagtctgc ccacccttag 3360
tgatgcatga gtaatgctcc ctggactccc caggttctag tcttctcatg tcgatgtagt 3420
tgattccact tcccttgctg cacaaccagg ctgggatgcc tgggcagagg cagacatgtg 3480
aggtataggg gttcaaatct gtttccaagt tttatccagc ttcaaagcat ttctccgtgt 3540
acatgagcgg tggcttgaca ggagatggag actctctttc ctggatgtga ggcaaggagg 3600
caggcgtctg agtcaggatg atgtccctac tcactgctaa agagaaaagt ggctttgatg 3660
gtgcagggca gggaaatgca ctgagtggtc gccaccctca cagaagagaa agtgttcact 3720
gacctggcct ttccccaggg cctctccctc ccattgcttt ccagaaagcc atgatttttg 3780
agagccacac ctgaacactc acaaacatta tggtgggaaa agcagatcag agcattaggc 3840
aagttgcatt accttggcct tcttcctttg gagacaattg atgtggggtt ctagattgac 3900
ccagagtttc aagtttatcc tgattcaggc ttcaacagct ggaggaagaa acagagatgt 3960
tttttgaagt aaacagatct agcattacta atcaaccctt catactgatg acctatggga 4020
aataataccc aagggcagaa aaatgggcag aataagggga gccccaaacc aagacgaagc 4080
tgctgcccat tgagaccctg ggtattacag agacctatag ctctggataa tggaagatct 4140
atgagtggca caggcgctga ggaatcacag catcattatc gtgcatctgc agggaattgc 4200
ttgtaaatat actggtaatt acaaatgttt aaggtcacta caaatacttt ggagtgtatt 4260
aaatatgctt ctgataaaga ctgtttttct cacatgaaac aatgggaacc atgtgacaat 4320
cacagaggtg ttgttactat agcaaaaggg attgttactc tccacatccc tttaagtaac 4380
ttgaaggcct gatagaccca ccctctaaga cttcattaga cattccctac gaatggttat 4440
actctcctgt atactcccaa tacaactcta aaatatatta ttccatatag tccttaggtt 4500
tgtattaaag tttgactttt ttccttcaaa atatctcttg tcacaacagc ggctctagag 4560
agaaatacat tccctccagg caaatctatg ctgcgctggt ctgacctggg accctgggga 4620
cattgcccct gtgctgagtt actaagatga gccagccctg cagctgtgct cagcctgccc 4680
catgccctgc tgattgattt gcatgttcca gagcacagcc ccctgccctg aagacttttt 4740
tatgggctgg tcgcaccctg tgcaggagtc agtctcagtc aggacacagc atggacatga 4800
gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtaag gatggagaac 4860
actaggaatt tactcagcca gtgtgctcag tactgactgg aacttcaggg aagttctctg 4920
ataacatgat taatagtaag aatatttgtt tttatgtttc caatctcagg tgccagatgt 4980
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 5040
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 5100
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 5160
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 5220
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcccac agtgttacaa 5280
gtcataacat aaacctccaa ggaagcagat gtgtgaggac gagccacccc agatgctcct 5340
cctggtgcct ccatctgctg agagcatttc tcaaactcag tcaggttttg aaagtcattg 5400
ggagactttt gtagagggga ccagggaggc tcctctgaac tctaagcctc ttttgccccg 5460
gatccgatca ggaaaatagc aaccgagtga ctggactatt aaagcatccc ctctgtggag 5520
aaaaggacta tggcaacagc ttgccaccta taagagacaa atatgtcact cagctggatg 5580
ctgggtctac catgaccacc cttgagatga acttatgcca tgtttttgga tgcccactga 5640
gactttgctt tgaccaagga aagttcttta ctgcccaaat gacgtcaatg gacacactct 5700
catgggacat gatggatttt ccatacacct tgttatccaa aggccaatgg atctatttaa 5760
tgctagaaca gctgactcac acggcaactg aagagtgtac atcagggcaa cctgctagta 5820
gagtggtacc ccatctgact acagcaattg gacattaaac actgcactgc agagcaaggg 5880
aaagacggca cggaggtgca ggttgaaaaa cactgagttg agtgaggaag aagttgggca 5940
aggccagttt cctgatagag ctgccactgt gaaatcccaa actcagtgtt tccaatcatt 6000
tttttccttt tatagtgatg ttcttggggg tgttgcagtt taggccacca tgataaccca 6060
gacaggcctc ctaactctaa ttggatggaa tgattcccct gggtgccttc tatgggttcc 6120
acaggatcaa gaaatatcag ggtgttaatt tccttctgct ggtaggaggg tcatctgatt 6180
cctccattag ggtggatgac gttatcagac atgtcaattt tctacagtac ttgacctgcc 6240
ttctagaact ggacaaccga gggtgaaagg actggatcaa gcaacaatgg caatgggtgc 6300
ccaaagaggt agtagtctca gaacagggag agacagactg agtccctcca ctaactcagc 6360
ccaacacctg tggatgagta ggggatgcct gagatcctgg ggtggatggg aggtggggca 6420
ctgatctgtc aatctgcttt ttcttcaagg atcaggcagc agagacccag aagcttcatg 6480
tctttgtaag gctcttccaa gccaacacag ataatttgac aaaacactgt atctgcatcc 6540
cagacctcac cctgtcacag actgaagtgg ttgtttcatc ctactaaggg taaactatac 6600
cagctataca gaataaaaag actggatagt ttagaggatc acccaagaaa tagttctttg 6660
cctgcatgga caaaaccatc ttctgtcttt agggaaatgg tatcactacc ctgaggattt 6720
ggagcccagg tctcacttat ctgtgcagtt gtgaaagtcc tcacacccac agtgctgagg 6780
ttaattgaat gttactcttt taatttctgc aaagaatgag acagcttctg gaccctcagg 6840
aaagatcact aacaagtaaa tacaagtata tccggaagat aaagttgtaa tagactcttc 6900
ctttcaacct gatccatcat gcatttaggg agctgactgg gcacaagttg gagcagaaag 6960
agaaaaatga aaccacagcc ttctattttg tttctaacag acttgtacca aacattctgt 7020
ggctcaatct aggtgatggt gagacaagag gacacagggg ttaaattctg tggccgcagg 7080
ggagaagttc taccctcaga ctgagccaac ggccttttct ggcctgatca cctgggcatg 7140
ggctgctgag agcagaaagg ggaggcagat tgtctctgca gctgcaagcc cagcacccgc 7200
cccagctgct ttgcatgtcc ctcccagccg ccctgcagtc cagagcccat atcaatgcct 7260
gggtcagagc tctggagaag agctgctcag ttaggaccca gagggaacca tggaaacccc 7320
agcgcagctt ctcttcctcc tgctactctg gctcccaggt gaggggaaca tgggatggtt 7380
ttgcatgtca gtgaaaaccc tctcaagtcc tgttacctgg caactctgct cagtcaatac 7440
aataattaaa gctcaatata aagcaataat tctggctctt ctgggaagac aatgggtttg 7500
atttagatta catgggtgac ttttctgttt tatttccaat ctcagatacc accggagaaa 7560
ttgtgttgac gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga gccaccctct 7620
cctgcagggc cagtcagagt gttagcagca gctacttagc ctggtaccag cagaaacctg 7680
gccaggctcc caggctcctc atctatggtg catccagcag ggccactggc atcccagaca 7740
ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga ctggagcctg 7800
aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtagctc acctcccaca gtgattcagc 7860
ttgaaacaaa aacctctgca agaccttcat tgtttactag attataccag ctgcttcctt 7920
tacagatagc tgctgcaatg acaactcaat tttagcatct cttctctgct tgggcatttt 7980
ggggatctta aaaaagtaat cccttgatat atttttgact ctgattcctg catttttcct 8040
cagaccaaga tggacagcca ggtttaagca cagtttcaca gtaatggcca ctggatcaga 8100
tttacatcag tggatgtcag taaaggtccc aaccagagcc ataaggcaac aacaatagca 8160
acaaataatc aaaattggaa aagaagaatt aaagctgtca taattcactg atgaaggatt 8220
gtgtgcagat aaaattcaaa tttgtctaca gagaaactac taaaattgac atgagaaata 8280
gaaaatcatt agattcaaga tcaatttatt aattcataga ttcaaaaatc aatttcattt 8340
ctgcataata aaaaatgcta aaaattaaca ttataaaaca aacacaccat ttacaaaaac 8400
atcaaagtat caattattta aaaaaaatag actaaataca ctgacgtctc cagaatatta 8460
ttttgaaaaa taaaagaaaa cctaagtaaa tagaaattca gttcaaagac tgaatgtctc 8520
agtactataa aaatgtcaat tcttcaaaga ttaaaatatt gattacatat aagaaaaatc 8580
aaaatcctaa agtatactcc aatttaaatt aagaagctaa tctaaatatt atatgggaat 8640
gtcaaggatg tagaatagcc acagtgaacc tgaagaaaca ccaaaatgag aacttccagt 8700
gcctgaatac ctggaatata gtgtgggtgg cagtatggtg atggtgagat cagaagttta 8760
aaaatttgca aacgtgctta tttttggaaa taatcactac gcagatgtag ccaaaccctc 8820
ttcaactgtg gcgtacgctc aggtcaattc caaagagtac cagattcttt caaaaagtca 8880
gatgagtaag ggatagaaaa ttagttcatc ttaaggaaca gccaagcgct agccagttaa 8940
gtgaggcatc tcaattgcaa gattttctct gcatcggtca ggttagtgat attaacagcg 9000
aaaagagatt tttgttaagg ggaaagtaat taagttaaca ctgtggatca ccttcggcca 9060
agggacacga ctggagatta aacgtaagta atttttcact attgtcttct gaaatttggg 9120
tctgatggcc agtattgact tttagaggct taaataggag tttggtaaag attggtaaat 9180
gagggcattt aagatttgcc atgggttgca aaagttaaac tcagcttcaa aaatggattt 9240
ggagaaaaaa agattaaatt gctctaaact gaatgacaca aagtaaaaaa aaaaagtgta 9300
actaaaaagg aacccttgta tttctaagga gcaaaagtaa atttattttt gttcactctt 9360
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 83
gcaccacttc gtcgcagcgc aggctttggt ctcccttgtc cgtgcggcgc acgcccaccg 60
agtttacgca ccagcacacc gaggtctggt tggtaccgaa gttcctattc cgaagttcct 120
attctctaga aagtatagga acttctcgcg cgtctggcct ccgaggcctc cgcgccgggt 180
tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctgccacgt cagacgaagg 240
gcgcagcgag cgtcctgatc cttccgcccg gacgctcagg acagcggccc gctgctcata 300
agactcggcc ttagaacccc agtatcagca gaaggacatt ttaggacggg acttgggtga 360
ctctagggca ctggttttct ttccagagag cggaacaggc gaggaaaagt agtcccttct 420
cggcgattct gcggagggat ctccgtgggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc 480
gccgggtgtg gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt 540
ggatcgctgt gatcgtcact tggtgagtag cgggctgctg ggctggccgg ggctttcgtg 600
gccgccgggc cgctcggtgg gacggaagcg tgtggagaga ccgccaaggg ctgtagtctg 660
ggtccgcgag caaggttgcc ctgaactggg ggttgggggg agcgcagcaa aatggcggct 720
gttcccgagt cttgaatgga agacgcttgt gaggcgggct gtgaggtcgt tgaaacaagg 780
tggggggcat ggtgggcggc aagaacccaa ggtcttgagg ccttcgctaa tgcgggaaag 840
ctcttattcg ggtgagatgg gctggggcac catctgggga ccctgacgtg aagtttgtca 900
ctgactggag aactcggttt gtcgtctgtt gcgggggcgg cagttatggc ggtgccgttg 960
ggcagtgcac ccgtaccttt gggagcgcgc gccctcgtcg tgtcgtgacg tcacccgttc 1020
tgttggctta taatgcaggg tggggccacc tgccggtagg tgtgcggtag gcttttctcc 1080
gtcgcaggac gcagggttcg ggcctagggt aggctctcct gaatcgacag gcgccggacc 1140
tctggtgagg ggagggataa gtgaggcgtc agtttctttg gtcggtttta tgtacctatc 1200
ttcttaagta gctgaagctc cggttttgaa ctatgcgctc ggggttggcg agtgtgtttt 1260
gtgaagtttt ttaggcacct tttgaaatgt aatcatttgg gtcaatatgt aattttcagt 1320
gttagactag taaattgtcc gctaaattct ggccgttttt ggcttttttg ttagacgtcg 1380
agctctagat tgggaacccg ggtctctcga attgttgaca attaatcatc ggcatagtat 1440
atcggcatag tataatacga caaggtgagg aactaaacca tccaccatga ttgaacaaga 1500
tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 1560
acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 1620
ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 1680
gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 1740
tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 1800
tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 1860
gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 1920
tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 1980
cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 2040
cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 2100
attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 2160
ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 2220
tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 2280
aagatccgct gtaagtctgc agaaattgat gatctattaa acaataaaga tgtccactaa 2340
aatggaagtt tttcctgtca tactttgtta agaagggtga gaacagagta cctacatttt 2400
gaatggaagg attggagcta cgggggtggg ggtggggtgg gattagataa atgcctgctc 2460
tttactgaag gctctttact attgctttat gataatgttt catagttgga tatcataatt 2520
taaacaagca aaaccaaatt aagggccagc tcattcctcc cactcatgat ctatagatct 2580
atagatctct cgtgggatca ttgtttttct cttgattccc actttgtggt tctaagtact 2640
gtggtttcca aatgtgtcag tttcatagcc tgaagaacga gatcagcagc ctctgttcca 2700
catacacttc attctcagta ttgttttgcc aagttctaat tccatcagac ctcgacctgc 2760
agcccctaga gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcct 2820
agggtttcac cggtggcgcg ccgagagagg aaagagagca gcgataccga aaatgtcctc 2880
agcgagaagc taccacagag gatgaatgga gatcaagccc acgtggaaac atgggaaaat 2940
gtctcagtat ttttccacct aagaagggag ggagatgggg tatgtataca cctccctgtc 3000
ctcactgatt gagggctttc cgagaggatg ctcattccag gtgctgtgat aggccatgtg 3060
tacaggcagg gctgccttct ccagcttcag atagagcagt gaggaaaaga tatggccatg 3120
gggggtcagc agaagtacag caaagggaaa agggaaaggg tagcaagagt gacaactata 3180
ttcacccccc ccacacacac acacacacac acgaaattgt gtattgcaat ccagaactgc 3240
ttctctctga acctaaatct tagcaagcag tttaccagta actgcccttg aaattcaggc 3300
ccctggaaag gagcaggggg ttgtgtacag gctataccac agcagtctgc ccacccttag 3360
tgatgcatga gtaatgctcc ctggactccc caggttctag tcttctcatg tcgatgtagt 3420
tgattccact tcccttgctg cacaaccagg ctgggatgcc tgggcagagg cagacatgtg 3480
aggtataggg gttcaaatct gtttccaagt tttatccagc ttcaaagcat ttctccgtgt 3540
acatgagcgg tggcttgaca ggagatggag actctctttc ctggatgtga ggcaaggagg 3600
caggcgtctg agtcaggatg atgtccctac tcactgctaa agagaaaagt ggctttgatg 3660
gtgcagggca gggaaatgca ctgagtggtc gccaccctca cagaagagaa agtgttcact 3720
gacctggcct ttccccaggg cctctccctc ccattgcttt ccagaaagcc atgatttttg 3780
agagccacac ctgaacactc acaaacatta tggtgggaaa agcagatcag agcattaggc 3840
aagttgcatt accttggcct tcttcctttg gagacaattg atgtggggtt ctagattgac 3900
ccagagtttc aagtttatcc tgattcaggc ttcaacagct ggaggaagaa acagagatgt 3960
tttttgaagt aaacagatct agcattacta atcaaccctt catactgatg acctatggga 4020
aataataccc aagggcagaa aaatgggcag aataagggga gccccaaacc aagacgaagc 4080
tgctgcccat tgagaccctg ggtattacag agacctatag ctctggataa tggaagatct 4140
atgagtggca caggcgctga ggaatcacag catcattatc gtgcatctgc agggaattgc 4200
ttgtaaatat actggtaatt acaaatgttt aaggtcacta caaatacttt ggagtgtatt 4260
aaatatgctt ctgataaaga ctgtttttct cacatgaaac aatgggaacc atgtgacaat 4320
cacagaggtg ttgttactat agcaaaaggg attgttactc tccacatccc tttaagtaac 4380
ttgaaggcct gatagaccca ccctctaaga cttcattaga cattccctac gaatggttat 4440
actctcctgt atactcccaa tacaactcta aaatatatta ttccatatag tccttaggtt 4500
tgtattaaag tttgactttt ttccttcaaa atatctcttg tcacaacagc ggctctagag 4560
agaaatacat tccctccagg caaatctatg ctgcgctggt ctgacctggg accctgggga 4620
cattgcccct gtgctgagtt actaagatga gccagccctg cagctgtgct cagcctgccc 4680
catgccctgc tgattgattt gcatgttcca gagcacagcc ccctgccctg aagacttttt 4740
tatgggctgg tcgcaccctg tgcaggagtc agtctcagtc aggacacagc atggacatga 4800
gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtaag gatggagaac 4860
actaggaatt tactcagcca gtgtgctcag tactgactgg aacttcaggg aagttctctg 4920
ataacatgat taatagtaag aatatttgtt tttatgtttc caatctcagg tgccagatgt 4980
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 5040
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 5100
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 5160
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 5220
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcccac agtgttacaa 5280
gtcataacat aaacctccaa ggaagcagat gtgtgaggac gagccacccc agatgctcct 5340
cctggtgcct ccatctgctg agagcatttc tcaaactcag tcaggttttg aaagtcattg 5400
ggagactttt gtagagggga ccagggaggc tcctctgaac tctaagcctc ttttgccccg 5460
gatccgatca ggaaaatagc aaccgagtga ctggactatt aaagcatccc ctctgtggag 5520
aaaaggacta tggcaacagc ttgccaccta taagagacaa atatgtcact cagctggatg 5580
ctgggtctac catgaccacc cttgagatga acttatgcca tgtttttgga tgcccactga 5640
gactttgctt tgaccaagga aagttcttta ctgcccaaat gacgtcaatg gacacactct 5700
catgggacat gatggatttt ccatacacct tgttatccaa aggccaatgg atctatttaa 5760
tgctagaaca gctgactcac acggcaactg aagagtgtac atcagggcaa cctgctagta 5820
gagtggtacc ccatctgact acagcaattg gacattaaac actgcactgc agagcaaggg 5880
aaagacggca cggaggtgca ggttgaaaaa cactgagttg agtgaggaag aagttgggca 5940
aggccagttt cctgatagag ctgccactgt gaaatcccaa actcagtgtt tccaatcatt 6000
tttttccttt tatagtgatg ttcttggggg tgttgcagtt taggccacca tgataaccca 6060
gacaggcctc ctaactctaa ttggatggaa tgattcccct gggtgccttc tatgggttcc 6120
acaggatcaa gaaatatcag ggtgttaatt tccttctgct ggtaggaggg tcatctgatt 6180
cctccattag ggtggatgac gttatcagac atgtcaattt tctacagtac ttgacctgcc 6240
ttctagaact ggacaaccga gggtgaaagg actggatcaa gcaacaatgg caatgggtgc 6300
ccaaagaggt agtagtctca gaacagggag agacagactg agtccctcca ctaactcagc 6360
ccaacacctg tggatgagta ggggatgcct gagatcctgg ggtggatggg aggtggggca 6420
ctgatctgtc aatctgcttt ttcttcaagg atcaggcagc agagacccag aagcttcatg 6480
tctttgtaag gctcttccaa gccaacacag ataatttgac aaaacactgt atctgcatcc 6540
cagacctcac cctgtcacag actgaagtgg ttgtttcatc ctactaaggg taaactatac 6600
cagctataca gaataaaaag actggatagt ttagaggatc acccaagaaa tagttctttg 6660
cctgcatgga caaaaccatc ttctgtcttt agggaaatgg tatcactacc ctgaggattt 6720
ggagcccagg tctcacttat ctgtgcagtt gtgaaagtcc tcacacccac agtgctgagg 6780
ttaattgaat gttactcttt taatttctgc aaagaatgag acagcttctg gaccctcagg 6840
aaagatcact aacaagtaaa tacaagtata tccggaagat aaagttgtaa tagactcttc 6900
ctttcaacct gatccatcat gcatttaggg agctgactgg gcacaagttg gagcagaaag 6960
agaaaaatga aaccacagcc ttctattttg tttctaacag acttgtacca aacattctgt 7020
ggctcaatct aggtgatggt gagacaagag gacacagggg ttaaattctg tggccgcagg 7080
ggagaagttc taccctcaga ctgagccaac ggccttttct ggcctgatca cctgggcatg 7140
ggctgctgag agcagaaagg ggaggcagat tgtctctgca gctgcaagcc cagcacccgc 7200
cccagctgct ttgcatgtcc ctcccagccg ccctgcagtc cagagcccat atcaatgcct 7260
gggtcagagc tctggagaag agctgctcag ttaggaccca gagggaacca tggaaacccc 7320
agcgcagctt ctcttcctcc tgctactctg gctcccaggt gaggggaaca tgggatggtt 7380
ttgcatgtca gtgaaaaccc tctcaagtcc tgttacctgg caactctgct cagtcaatac 7440
aataattaaa gctcaatata aagcaataat tctggctctt ctgggaagac aatgggtttg 7500
atttagatta catgggtgac ttttctgttt tatttccaat ctcagatacc accggagaaa 7560
ttgtgttgac gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga gccaccctct 7620
cctgcagggc cagtcagagt gttagcagca gctacttagc ctggtaccag cagaaacctg 7680
gccaggctcc caggctcctc atctatggtg catccagcag ggccactggc atcccagaca 7740
ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga ctggagcctg 7800
aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtagctc acctcccaca gtgattcagc 7860
ttgaaacaaa aacctctgca agaccttcat tgtttactag attataccag ctgcttcctt 7920
tacagatagc tgctgcaatg acaactcaat tttagcatct cttctctgct tgggcatttt 7980
ggggatctta aaaaagtaat cccttgatat atttttgact ctgattcctg catttttcct 8040
cagaccaaga tggacagcca ggtttaagca cagtttcaca gtaatggcca ctggatcaga 8100
tttacatcag tggatgtcag taaaggtccc aaccagagcc ataaggcaac aacaatagca 8160
acaaataatc aaaattggaa aagaagaatt aaagctgtca taattcactg atgaaggatt 8220
gtgtgcagat aaaattcaaa tttgtctaca gagaaactac taaaattgac atgagaaata 8280
gaaaatcatt agattcaaga tcaatttatt aattcataga ttcaaaaatc aatttcattt 8340
ctgcataata aaaaatgcta aaaattaaca ttataaaaca aacacaccat ttacaaaaac 8400
atcaaagtat caattattta aaaaaaatag actaaataca ctgacgtctc cagaatatta 8460
ttttgaaaaa taaaagaaaa cctaagtaaa tagaaattca gttcaaagac tgaatgtctc 8520
agtactataa aaatgtcaat tcttcaaaga ttaaaatatt gattacatat aagaaaaatc 8580
aaaatcctaa agtatactcc aatttaaatt aagaagctaa tctaaatatt atatgggaat 8640
gtcaaggatg tagaatagcc acagtgaacc tgaagaaaca ccaaaatgag aacttccagt 8700
gcctgaatac ctggaatata gtgtgggtgg cagtatggtg atggtgagat cagaagttta 8760
aaaatttgca aacgtgctta tttttggaaa taatcactac gcagatgtag ccaaaccctc 8820
ttcaactgtg gcgtacgcac ctgctcgaaa agggagttga gcttcagcag ctgacccagg 8880
actctgttcc cctttggtga gaagggtttt tgttcagcaa gacaatggag agctctcact 8940
gtggtggacg ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa cgtgagtaga atttaaactt 9000
tgcttcctca gttgtctgtg tcttctgttc cctgtgtcta tgaagtgatc tataagctga 9060
ctctgcaatc agcctctgat atccttcagg gaaaagataa agataagtct gtagtcaaac 9120
tcgagaattg attgcacatt ttctttgaag agcaagcaag attcagtcat tgggtgagaa 9180
taacttgtct aagtaatagc ttcagaaatg tcctggggaa cataacatgt tctggacaga 9240
gccttggtca attgtcagaa agggagtttt tgtataggag ggaagttaag aggaaccatt 9300
gtgtgtacac ttttggccag gggaccaagc tggagatcaa acgtaagtac ttttttccac 9360
tgattcttca ctgttgctaa ttagtttact ttgtgttcct ttgtgtggat tttcattagt 9420
cggatgccag ggatctaaca aacttcattc ccaggttagg tacagaggag gggaaattgt 9480
tccacaggaa gctagcttgt ggctaatttt taagatttct aaatcaaaat aacttcattg 9540
ggggaaagag gcttgctgag ctttcaggga ggtttttgta aagggaaaag ttaagacgaa 9600
tcactgtgat tcactttcgg ccctgggacc aaagtggata tcaaacgtaa gtacatctgt 9660
ctcaattatt cgtgagattt tagtgccatt gtatcatttg tgcaagtttt gtgatatttt 9720
ggttgaataa acctggtgac ccagaagtaa atagcaggac accagaaaat gaacttaaaa 9780
agctgagcaa atagacgaat cattgggttt gagaggagaa taggattcat gggggaaatg 9840
gggaagaaat agctagattt ttctctgaac aagcagccta tctcatatga ttggcttcaa 9900
gagaggtttt tgttgagggg aaagggtgag atccctcact gtggctcact ttcggcggag 9960
ggaccaaggt ggagatcaaa cgtaagtgca ctttcctaat gctttttctt ataaggtttt 10020
aaatttggag cgtttttgtg tttgagatat tagctcaggt caattccaaa gagtaccaga 10080
ttctttcaaa aagtcagatg agtaagggat agaaaattag ttcatcttaa ggaacagcca 10140
agcgctagcc agttaagtga ggcatctcaa ttgcaagatt ttctctgcat cggtcaggtt 10200
agtgatatta acagcgaaaa gagatttttg ttaaggggaa agtaattaag ttaacactgt 10260
ggatcacctt cggccaaggg acacgactgg agattaaacg taagtaattt ttcactattg 10320
tcttctgaaa tttgggtctg atggccagta ttgactttta gaggcttaaa taggagtttg 10380
gtaaagattg gtaaatgagg gcatttaaga tttgccatgg gttgcaaaag ttaaactcag 10440
cttcaaaaat ggatttggag aaaaaaagat taaattgctc taaactgaat gacacaaagt 10500
aaaaaaaaaa gtgtaactaa aaaggaaccc ttgtatttct aaggagcaaa agtaaattta 10560
tttttgttca ctcttgccaa atattgtatt ggttgttgct gattatgcat gatacagaaa 10620
agtggaaaaa tacatttttt agtctttctc ccttttgttt gataaattat tttgtcagac 10680
aactataaaa atcaatagca cgccctaaga tctagatgca tgctcgagtg ccatttcatt 10740
acctctttct ccgcacccga catagataaa gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg 10800
gcccggtacc acgtggcata cagtgtcaga ttttctgttt atcaagctag tgagattagg 10860
ggcaaaa 10867
<210> 84
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 84
tcttttgccc cggatccgat cag 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 85
gggaggctcc tctgaactct aag 23
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 86
gtccagtcac tcggttgcta t 21
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 87
cttcaactgt ggcgtacgca cc 22
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 88
acgcagatgt agccaaaccc t 21
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 89
cagctgctga agctcaactc 20
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 90
aagaagcaca cgactgaggc ac 22
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 91
ctcactggat ggtgggaaga tgga 24
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 92
gtaaaacgac ggccag 16
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 93
caggaaacag ctatgac 17
<210> 94
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
35
<210> 95
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
35
<210> 96
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
20 25 30
Ala Pro Thr Val Ser Ile
35
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
35
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Asp Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
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35
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
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35
<210> 101
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
35
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
1 5 10 15
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1 5 10 15
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp
20 25 30
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35
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1 5 10 15
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20 25 30
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caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcccac agtgttacaa g 51
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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<223> 合成的
<400> 133
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<223> 合成的
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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1 5 10 15
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
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<220>
<223> 合成的
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1 5 10 15
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<220>
<223> 合成的
<400> 138
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu His Pro
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<220>
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<220>
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
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<220>
<223> 合成的
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu His Pro
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 142
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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<220>
<223> 合成的
<400> 143
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Tyr
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
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100 105
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 144
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile His Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 108
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<220>
<223> 合成的
<400> 145
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 146
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met
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100 105

Claims (1)

1.一种重组免疫球蛋白轻链核酸序列，所述重组免疫球蛋白轻链核酸序列包含与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接的至少两个未经重排的人源VL基因区段和至少一个未经重排的人源JL基因区段，
其中所述两个未经重排的人源VL基因区段中的至少一个包含至少一个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系VL基因区段编码，和
其中所述至少两个未经重排的人源VL基因区段和所述至少一个未经重排的人源JL基因区段能够重排并且编码抗体的人源轻链可变结构域。
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